KR20220088278A - 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 eb-amdk19 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 eb-amdk19 균주를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 투여하면 비만, 대사성 질환, 및 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있고, 오를리스타트로 인한 부작용을 완화 또는 예방할 수 있다.

Description

오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 포함하는 조성물 {Composition Comprising Orlistat and Akkermansia muciniphila EB-AMDK19}
본 발명은 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 약 3억의 성인 인구가 비만환자이고, 약 17억 인구가 과체중이라고 보고되어 있다. 삼성경제연구소 보고서에 따르면, 2011년 국내 성인 비만으로 인해 발생한 직·간접적인 사회 비용이 3조 4000억 원에 육박하는 것으로 추정되고 있으며, 이와 함께 비만인 사람은 정상 체중인 사람에 비해 고혈압, 당뇨병, 이상지혈증 발생 위험이 2배 이상 높아 보건의료비 지출이 증가한다고 한다. 미국의 경우 2006년을 기준으로 비만인 사람들이 정상체중인 사람보다 의료비를 42% 더 지급하는 것으로 나타났으며, 당뇨병 환자의 80%, 비알콜성지방간 환자의 69% 이상이 비만 환자인 것으로 알려져 있다. 또한, 비만 세포에서는 염증성 신호인자들을 분비하기 때문에 비만인 사람들은 염증성 질환의 발생 위험이 정상인에 비해 높다고 한다.
비만 치료제로 대표적인 것은 지방흡수억제제인 오를리스타트(orlistat)이다. 그러나 오를리스타트는 지방에 용해되는 비타민의 흡수를 억제하고 지방변, 빈번한 배변, 대변 실금, 급성 신부전증 등의 부작용이 있다.
따라서 이러한 부작용을 억제 또는 완화할 수 있는 조성물 또는 이러한 부작용이 없는 비만 치료제가 필요할 것이며, 단지 비만을 예방하는 차원이 아니라 대사성 질환, 염증성 질환까지 도움이 될 수 있는 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2008-0102832호(2008.11.26) 대한민국 등록특허공보 제10-2128287호(2020.06.24)
일 양상은 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라 (Akkermansia muciniphila)를 포함하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라 (Akkermansia muciniphila)를 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비만, 대사성 질환, 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 일시적 또는 영구적으로 비만, 대사성 질환, 염증성 질환의 증상을 완화하거나, 증상의 원인을 제거하거나, 또는 상기 질병이나 병태의 증상의 발현을 방지하거나 늦추는 것을 의미한다.
일 양상은 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 오를리스타트는 분자식은 C29H53NO5이고, 화학식은 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 0.5-1 μm 크기의 타원형 세포로 단구균 또는 쌍구균일 수 있다. 상기 아커만시아 뮤시니필라 균주는 혐기성 세균이고, 운동성이 없으며, 그람-음성(Gram-negative)이고, 내생포자를 형성하지 않는, 점액-분해 세균(mucin-degrading bacteria)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주일 수 있다. 상기 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 특성은 등록특허공보 제10-2128287호를 참고할 수 있다.
상기 아커만시아 뮤시니필라의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조 방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 오를리스타트 억제제의 부작용을 완화하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 부작용을 완화하는 것은 복부 팽만감, 지방변, 신장 내 염증, 신장 내 섬유화 중 하나 이상의 증상을 완화하는 효과가 있는 것일 수 있다. 상기 완화는 부작용으로 나타나는 증상을 개선 또는 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 고지방식이를 섭취한 마우스에 상기 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여 했을 때, 오를리스타트 투여한 마우스 대비 장 팽창이 완화되고, 변 내 중성지방이 감소한 것을 확인했으며, 신장 내 염증 및 섬유화가 감소된 것을 확인하였다.
상기 조성물은 오를리스타트 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 단독 효과보다 더 현저한 항비만 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 고지방식이를 섭취한 마우스에 상기 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하였을 때, 고지방식이로 인해 비만이 유도된 마우스 대비 몸무게, 간, 비장, 장간막지방, 피하지방의 증가율이 감소하는 것을 확인하였다.
상기 약학적 조성물은 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 각각의 형태로 따로 섭취하거나, 용매에 녹여 함께 섭취하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형으로 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전부, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
다른 양상은 오를리스타트와 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 오를리스타트, 아커만시아 뮤시니필라 및 약학적 조성물에 관한 설명은 상기에 기재된 설명과 동일하다.
일 구체예에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주일 수 있다. 상기 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 특성은 등록특허공보 제10-2128287호를 참고할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지혈증, 지방간, 당뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 마우스에 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하면 혈중 인슐린 농도, GTP 농도 및 간 내 중성지방, 간 내 콜레스테롤 농도가 오를리스타트 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 단독 투여한 것보다 더욱 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 마우스에 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하면 오를리스타트 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 단독 투여한 것보다 내당능이 정상 식이한 마우스만큼 개선되는 것을 확인하였다.
또 다른 양상은 오를리스타트와 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 오를리스타트, 아커만시아 뮤시니필라 및 약학적 조성물에 관한 설명은 상기에 기재된 설명과 동일하므로, 명세서의 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
일 구체예에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주일 수 있다. 상기 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 특성은 등록특허공보 제10-2128287호를 참고할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 염증성 질환은 대장염, 신장염, 간염인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 마우스에 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하였을 때, 오를리스타트 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 단독 투여한 마우스 보다 염증 사이토카인 IL-6, TLR2, TLR4의 수치가 더욱 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서, 마우스에 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하였을 때, 오를리스타트 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 단독 투여한 마우스 보다 간 내 섬유화를 감소시키는 것을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서, 마우스에 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주를 병용 투여하였을 때, 오를리스타트로 인한 신장염에서 염증을 감소시키는 것을 확인하였다.
또 다른 양상은 오를리스타트와 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 오를리스타트와 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 개체에 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지혈증, 지방간, 당뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증일 수 있다.
또 다른 양상은 오를리스타트와 아커만시아 뮤시니필라를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 염증성 질환은 대장염, 신장염, 간염인 것일 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여하면 비만, 대사성 질환 및 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 투여하면 오를리스타트로 인한 부작용을 완화 또는 예방할 수 있다.
도면 내 Normal은 정상 식이 그룹, HFD는 비만 유도 그룹, Orlistat는 오를리스타트 투여 그룹, EB-AMDK19는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주 투여 그룹, ORL+EB-AMDK19는 오를리스타트 및 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주 투여 그룹을 의미한다.
도 1의 A는 각 그룹의 체중 변화를 나타내는 그래프이고, B는 12주 후 각 그룹의 체중 증가율을 나타내는 그래프이다.
도 2의 A는 각 그룹의 먹이 섭취량을 나타낸 데이터이고, B는 각 그룹의 섭취한 칼로리를 나타낸 데이터이다.
도 3은 각 그룹의 간의 무게를 비교한 데이터이다.
도 4는 각 그룹의 비장의 무게를 비교한 데이터이다.
도 5는 각 그룹에서 A는 장간막지방, B는 피하지방의 무게 차이를 본 데이터이다.
도 6은 각 그룹의 내당능을 비교한 그래프이다.
도 7은 각 그룹에서 내당능을 비교한 그래프로, A는 포도당 투여 직전, B는 포도당 투여 후 30분의 혈당을 측정한 것이다.
도 8은 각 그룹에서 인슐린의 농도를 비교한 데이터이다.
도 9는 각 그룹에서 GPT 농도를 비교한 데이터이다.
도 10은 각 그룹에서 간 내 지질생화학적 지표를 분석한 데이터로, A는 간 내 중성지방, B는 간 내 총 콜레스테롤을 비교한 데이터이다.
도 11은 각 그룹의 간에서 지방세포 관련 인자인 LPL 발현 농도를 확인한 데이터이다.
도 12은 간 내 지방 축적 정도를 염색하여 확인한 데이터이다.
도 13는 간 내 섬유화 정도를 염색하여 확인한 데이터이다.
도 14은 각 그룹의 장점막에서 IL-6의 발현을 비교한 데이터이다.
도 15는 각 그룹의 장점막에서 TLR2의 발현을 비교한 데이터이다.
도 16은 각 그룹의 장점막에서 TLR4의 발현을 비교한 데이터이다.
도 17는 각 그룹의 소장 및 대장의 모양을 비교한 사진이다.
도 18는 각 그룹의 분변에서 중성지방의 양을 비교한 그래프이다
도 19의 A는 각 그룹 신장의 염증 여부를 염색하여 본 데이터이고, B는 면역화학염색에서 F4/80 항체를 통해 염증 수치를 그래프로 비교한 데이터이다.
도 20의 A는 각 그룹 신장의 섬유화 정도를 염색하여 본 데이터이고, B는 그 수치를 그래프로 비교한 데이터이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 분리 및 시료 준비
건강한 한국인(여성, 35세, BMI 23.3)의 분변으로부터 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19(KCTC 13761BP)를 분리하였다. 분리한 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19(이하 'EB-AMDK19')는 25% 글리세롤, 0.05% 시스테인을 포함하고 있는 PBS 150 ㎕ 당 1×108 CFU의 농도로 제조하였다. 오를리스타트(Xenical, Orlistat 120 mg, Roche, USA)는 시중에 판매하는 것을 구매하여 사용하였다.
실시예 2. 동물실험 마우스 준비 및 모델 제작
동물실험은 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee :IACUC)에 의해 승인된 프로토콜을 준수하여 실험하였다. 실험동물은 8 주령 수컷 마우스 C57BL을 구입하여 일주일 동안 22℃, 상대습도 40~60%, 12시간 명암주기 환경에서 적응기간을 가졌다. 그 후, 12주간 실험을 하였다. 실험 동물은 무작위로 9마리를 한 그룹으로 하여 하기 표 1과 같이 5개 그룹으로 나누었다.
정상 식이 그룹인 실험군 Ⅰ은 10% fat 사료를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 실험군 Ⅰ 외 다른 실험군들은 고지방 사료(60 kcal fat; Research Diets Inc. NJ, USA)를 섭취하도록 하였고, 음용수는 모든 실험군이 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험군 Ⅲ은 오를리스타트 10 mg/kg(150 ㎕)를 매일 경구 투여하였다. 실험군 Ⅳ는 EB-AMDK19 생균을 1×108 CFU를, 실험군 Ⅴ는 EB-AMDK19 생균을 1×108 CFU를 150㎕을 경구 투여 후 오를리스타트 10 mg/kg 150㎕을 추가로 매일 경구 투여하였다. 또한, 투여에 따른 스트레스 등의 영향을 배제하기 위해 실험군 Ⅰ 및 Ⅱ은 이와 동일한 양의 인산완충식염수(25% 글리세롤, 0.05% 시스테인/PBS)를 매일 경구 투여하였다.
실험군 Ⅰ 정상 식이 그룹
실험군 Ⅱ 실험식이 공급 비만 유도 그룹
실험군 Ⅲ 실험식이 공급 및 오를리스타트(10 mg/kg, 150 ㎕) 투여 그룹
실험군 Ⅳ 실험식이 공급 및 EB-AMDK19(생균 1×108 CFU) 투여 그룹
실험군 Ⅴ 실험식이 공급 및 EB-AMDK19(생균 1×108 CFU), 오를리스타트(10 mg/kg, 150 ㎕) 투여 그룹
실시예 3. 체중 및 먹이섭취 변화 확인
12주간 상기 실시예 2와 같이 식이 및 투여하면서 매 주마다 각 실험군의 체중 및 체지방을 측정하였고, 12주 후 체지방 증가 정도를 측정하였다.
그 결과 도 1에서 보이는 바와 같이, 고지방 사료만 섭취한 비만 유도 그룹 대비 오를리스타트와 EB-AMDK19 균주 투여 그룹, EB-AMDK19 균주 투여 그룹, 오를리스타트 투여 그룹에서 체중이 유의미하게 감소하였다. 또한, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹은 12주 후 무게 증가율이 오를리스타트 또는 EB-AMDK19 균주 단독 투여 그룹의 무게 증가율 대비 유의미하게 감소하였다.
반면 도 2에서 보이는 바와 같이, 각 그룹의 먹이섭취량은 정상 식이 그룹이 다른 그룹 대비 상대적으로 높았으나 유의미한 차이가 없었다. 또한, 섭취한 칼로리는 정상 식이 그룹 대비 고지방식이를 섭취한 다른 그룹이 상대적으로 높았으나 유의미한 차이가 없었다.
따라서 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 병용 투여하였을 때, 먹이섭취량 또는 섭취 칼로리 대비 무게 증가율이 감소된다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 조직 및 체지방 무게 변화
12주 후 실험 종료시에 CO2로 마취한 상태에서 간, 비장, 장간막 지방, 피하지방을 적출하여 생리 식염수로 세척하고 수분을 제거한 후 중량을 측정하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 정상 식이 그룹의 간 조직 무게 대비 비만 유도 그룹의 간 조직 무게가 유의미하게 증가한 것을 확인하였으며, 비만 유도 그룹과 같이 고지방식이를 섭취하였으나 오를리스타트, EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹에서는 비만 유도 그룹 대비 간 조직 무게가 감소한 것을 확인하였다.
또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 정상 식이 그룹의 비장 조직 무게 대비 비만 유도 그룹의 비장 조직 무게가 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 고지방식이를 섭취하고 오를리스타트를 투여한 그룹은 비만 유도 그룹 대비 미세하게 감소하였으나 유의미하게 감소가 아님을 확인하였다. 반면, 비만 유도 그룹과 같이 고지방식이를 섭취하였으나 EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹에서는 비만 유도 그룹 대비 비장 조직 무게가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
아울러, 도 5에서 보는 바와 같이, 정상 식이 그룹의 장간막 지방 및 피하지방 무게 대비 비만유도 그룹의 장간막 지방 및 피하지방 무게가 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 고지방식이를 섭취하고 오를리스타트를 투여한 그룹은 비만 유도 그룹 대비 미세하게 감소하였으나 유의미하게 감소가 아님을 확인하였다. 반면, 비만 유도 그룹과 같이 고지방식이를 섭취하였으나 EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹에서는 비만 유도 그룹 대비 장간막 지방 및 피하지방 무게가 유의미하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, EB-AMDK19 균주 단독 투여 그룹보다 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹에서 더 현저히 장간막 지방 및 피하지방의 무게를 감소한다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 내당능변화 측정
아커마시아 뮤니시필라 EB-AMDK19 균주의 투여가 내당증에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 실험 수행 12주 후 마우스를 18시간 금식시키고 포도당(Glucose 2 g/kg)을 경구로 투여하였다. 포도당 투여 직전과 투여 후 30, 60, 90 및 120분 후에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 혈당측정기로 측정하였다.
도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 포도당 투여 30분 후 모든 투여 그룹에서 비만 유도 그룹보다 혈당량의 증가량 및 수치가 낮았으며, 그 중 오를리스타트 투여 그룹과 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹에서는 정상 그룹과 비슷할 정도로 유의미하게 혈당량 수치가 낮다는 것을 확인하였다.
실시예 6. 혈중 지질생화학적 지표 분석
상기 실시예 5에서 18시간 금식시킨 후, 각 실험동물로부터 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청(plasma)으로 인슐린(insulin) 수치와 간 기능 지표인 GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 측정하였다. 인슐린 농도는 인슐린 ELISA 키트(Morinaga, Japan)를 사용하여 측정하였고, GPT 농도는 아산제약에서 구입한 개별 측정 키트를 사용하여 정량 하였다.
도 8에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹에서는 정상 그룹 대비 인슐린 수치가 증가한 것을 확인하였고, 그 외 실험 그룹인 오를리스타트, EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹은 인슐린 수치가 정상 그룹 수치까지 현저히 감소한 것을 확인하였다.
또한, 도 9에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹에서는 정상 그룹 대비 GPT 수치가 증가한 것을 확인하였다. 반면, 오를리스타트, EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹은 정상 그룹의 수치보다 더 적은 수치까지 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 간 내 지질생화학적 지표 분석
모든 실험을 마치고, 마우스에서 간을 적출한 후, 간 내 중성지방(Triglyceride: TG) 및 총 콜레스테롤(Total cholesterol: TC)의 수치를 분석하였다. 간조직 30 mg에 120 ㎕의 PBS를 넣고, 호모게나이저를 이용하여 분쇄 후, 클로로포름 320 ㎕와 메탄올 160 ㎕를 넣어 혼합물을 만들었다. 상기 혼합물을 상온에서 하룻동안 쉐이킹 인큐베이터로 섞어준 후 2000 rpm으로 원심분리하고 상층액만 따로 분리하여 용매를 증발시켰다. 그 후 상기 용매를 증발시킨 상층액을 1 ㎖의 이소프로판올(isopropanol)로 녹인 후, TG, TC 측정키트(아산제약, 한국)을 사용하여 확인하였다.
도 10에서 보는 바와 같이, 정상 그룹 대비 비만 유도 그룹에서 중성지방 및 총 콜레스테롤 수치가 높아지는 것을 확인하였다. 반면, 오를리스타트, EB-AMDK19 균주, 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주를 투여한 그룹은 비만 유도 그룹 대비 유의미한 정도로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 간에서 총 콜레스테롤과 중성지방의 농도가 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주 투여 그룹에서 가장 낮은 것을 확인하였다. 따라서 오를리스타트 및 EB-AMKD19 균주 투여가 간세포 손상을 감소시키고 비만 치료를 위한 당과 지질대사를 개선하는데 도움을 준다는 것을 확인하였다.
실시예 8. 간 내 항비만 및 염증 지표 분석
간에서의 지방증 관련 단백질 발현에 대한 영향을 평가하기 위해서, 하기 표 2의 프라이머로 실시간 PCR을 진행하여 지방간 관련 매개체인 LPL의 mRNA 발현을 분석하였다. RNA는 제조사의 지침에 따라 TRI 시약(Sigma, USA)을 이용하여 세포 단층으로부터 추출하고, cDNA는 M-MLV cDNA 합성 키트(Enzynomics, Korea)를 이용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 합성하였다. PCR은 Quant Studio 3 real time PCR system(Applied Biosystems, USA)로 pre-incubation(for UDG)은 50℃에서 4분, 95℃에서 10분, 그리고 40 싸이클은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 수행하였다. 이후 데이터는 QuantStudio Design & Analysis Software v1.4.3에 내장된 프로그램을 이용하여 delta CT 방법으로 분석하였다.
서열번호 타깃 프라이머 서열
서열번호 1 LPL F: 5'-CTC TGT ATG GCA CAG TGG CT-3'
서열번호 2 LPL R: 5'-TCC ACC TCC GTG TAA ATC AA-3'
도 11에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹에서는 정상 그룹 대비 지방세포 분화 관련 인자인 LPL이 높게 발현되는 것을 확인하였다. 비만 유도 그룹 외 모든 실험 그룹에서는 정상 그룹만큼 지방세포 분화 관련 인자들의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹이 다른 그룹에 비해 LPL 발현을 더욱 감소한다는 것을 확인하였다.
간 내 지방 축적의 정도와 섬유화 정도를 보기 위하여, 적출한 간을 약 5 μm로 조직 절편으로 만든 후 파라핀으로 포매하고 hematoxtlin & eosin(H&E) 또는 시리어스 레드(Sirius Red)염색을 통해 형태학적 변화의 차이를 관찰하였다.
도 12에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹에서는 정상 그룹 대비 지방 세포의 개수가 현저히 증가되었으며, 지방 세포의 크기도 다양한 것을 확인하였다. 또한, 오를리스타트 투여 그룹의 경우에는 지방 세포 개수는 감소하였으나, 지방 세포의 크기가 정상군 대비 큰 것을 확인하였다. EB-AMDK19 균주 투여 그룹의 경우에는 비만 유도 그룹 대비 지방 세포의 크기나 수가 감소하였으나, 지방 세포의 크기가 정상 식이 그룹 대비 큰 것들이 관찰되었다. 반면, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주를 병용 투여한 그룹의 경우 정상 식이 그룹과 유사하게 지방 세포의 개수나 크기가 줄어든 것을 확인하였다.
도 13에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹에서는 섬유화가 증가되는 반면, 오를리스타트 투여 그룹, EB-AMDK19 투여 그룹에서는 비만 유도 그룹 대비 섬유화 정도가 감소되었다. 또한, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주를 병용 투여한 그룹의 경우, 오를리스타트 또는 EB-AMDK19 단독 투여 그룹 대비 더 현저히 섬유화가 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 9. 대장 내 항염증 지표 분석
대장에서의 염증 관련 단백질 발현에 대한 영향을 평가하기 위해서, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여, 실시간 PCR을 진행하였다. 대장의 염증 관련 매개체 IL-6, TLR2, TLR4를 확인하였다.
서열번호 타깃 프라이머 서열
서열번호 3 IL-6 F: 5'-TCC TAC CCC AAT TTC CAA TGC-3'
서열번호 4 IL-6 R: 5'-CAT AAC GCA CTA GGT TTG CCG-3'
서열번호 5 TLR2 F: 5'-AAG GAG GTG CGG ACT GTT TC-3'
서열번호 6 TLR2 R: 5'-GAG CCA AAG AGC TCG TAG C-3'
서열번호 7 TLR4 F: 5'-CCT CTG CCT TCA CTA CAG AGA CTT T-3'
서열번호 8 TLR4 R: 5'-TGT GGA AGC CTT CCT GGA TG-3'
도 14 내지 도 16에서 보는 바와 같이, 비만 유도 그룹이 정상 그룹 대비 염증인자인 IL-6, TLR2, TLR4의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 그 외 모든 실험 그룹에서는 비만 유도 그룹 대비 염증 인자의 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 특히, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹이 오를리스타트 또는 EB-AMDK19 균주 투여 그룹보다 더욱 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 10. 오를리스타트 약물 부작용 예방 효과 확인
실시예 10-1. 대장 및 소장의 장내 모양 변화 확인
오를리스타트 복용시 발생할 수 있는 부작용 중 복부 팽만감, 기름변, 대변절박, 대변실금, 장내 출혈 등의 완화를 확인하기 위하여, 각 실험 그룹 마우스의 대장과 소장 조직을 분리하여 장 모양을 관찰하였다.
도 17에서 보는 바와 같이, 오를리스타트를 투여한 그룹 외 모든 그룹에서 장내 출혈 또는 장내 팽창이 관찰되지 않았으나, 오를리스타트를 투여한 그룹에서는 묽은 변과 장내 팽창이 발생한 것을 확인하였다. EB-AMDK19 균주 투여 그룹은 장내 변화에 영향을 미치지 않았고, 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹에서도 묽은 변 및 장내 팽창이 관찰되지 않았다는 점에서 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 병용 투여시 오를리스타트의 부작용을 완화시켜주는 것을 확인하였다.
실시예 10-2. 분변 내 중성지방 함유량 측정
오를리스타트는 리파아제 작용을 억제하여 중성지방이 흡수되지 못하고 분변으로 배출하도록 하는 역할을 한다. 따라서, 오를리스타트의 부작용 중 하나인 분변에서 보이는 지방변 완화를 확인하기 위하여, 각 실험 그룹 마우스에서 24시간 동안 관찰되는 분변에서의 중성지방의 농도를 ELISA kit(아산제약, 한국)를 사용하여 관찰하였다.
도 18에서 보는 바와 같이, 오를리스타트 투여 그룹의 경우 분변 내의 중성지방이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 그 외 모든 그룹에서 분변 내 중성지방이 감소된 것을 확인하였다. 이는 EB-AMDK19 균주는 분변의 중성지방 감소에 영향을 주지 않는다는 것과 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹에서는 오를리스타트의 부작용인 분변의 증가된 중성지방을 감소하는 효과가 있다는 것을 확인한 것이다.
실시예 10-3. 신장에서의 항염증 및 섬유화 지표 분석
오를리스타트가 신장에 미치는 부작용 완화 정도를 확인하기 위하여, 신장의 절단면 면역조직화학법(IHC), Sirius red 염색법을 수행하여 신장염과 섬유화 정도를 관찰하였다. 마우스에서 분리한 신장 조직을 파라핀으로 포매하고, 약 5μm 조직 절편으로 만든 후 각각의 염색을 통해 형태학적 변화의 차이를 관찰하였다. 각각의 염색을 통한 신장 손상의 정도는 Image J 프로그램을 통해 백분율(%)로 환산하여 나타내었다.
도 19에서 보는 바와 같이, 오를리스타트 투여 그룹에서는 염증이 높은 수치로 나타나는 것이 확인되는 반면, 그 외 모든 그룹에서는 오를리스타트 투여 그룹 대비 감소된 수치를 확인하였다. 이는 고지방 식이 및 EB-AMDK19 균주 투여는 신장 내 염증 발생 유무에는 영향을 주지 않는다는 것과 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 병용 투여는 오를리스타트 부작용인 신장 내 염증의 정도를 완화하는 효과가 있다는 것을 나타내는 것이다.
또한, 도 20에서 보는 바와 같이, 오를리스타트를 투여한 그룹 외 모든 그룹에서는 신장의 섬유화가 적게 일어나는 것을 확인하였다. 오를리스타트를 투여한 그룹에서는 신장에서의 섬유화가 넓게 나타났으며, EB-AMDK19 균주 투여 그룹과 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주 투여 그룹에서는 신장의 섬유화가 적은 면적으로 나타난다는 것이 확인되었다. 신장 섬유화는 만성신부전증의 특징으로 옥산살칼슘(Calcium oxalate, CaOx)이 신장에 쌓여서 사구체를 손상시키고 섬유화가 진행되는 것으로 알려져 있다. 이를 통해, 오를리스타트를 복용하면 발생하는 부작용 중 하나인 신부전증을 오를리스타트 및 EB-AMDK19 균주의 병용 투여로 신장 섬유화를 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
<110> Enterobiome Co., Ltd. <120> Composition Comprising Orlistat and Akkermansia muciniphila EB-AMDK19 <130> PN200398 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer(Forward) <400> 1 ctctgtatgg cacagtggct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer(Backward) <400> 2 tccacctccg tgtaaatcaa 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer(Forward) <400> 3 tcctacccca atttccaatg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer(Backward) <400> 4 cataacgcac taggtttgcc g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 primer(Forward) <400> 5 aaggaggtgc ggactgtttc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 primer(Backward) <400> 6 gagccaaaga gctcgtagc 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 primer(Forward) <400> 7 cctctgcctt cactacagag acttt 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR4 primer(Backward) <400> 8 tgtggaagcc ttcctggatg 20

Claims (2)

  1. 오를리스타트(Orlistat) 및 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)를 포함하는 대장염 또는 신장염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)는 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) EB-AMDK19 균주인,
    대장염 또는 신장염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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