KR20100041137A

KR20100041137A - Ｎ1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-ｎ2-치환된 바이구아나이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100041137A
Application number: KR1020080100171A
Authority: KR
Inventors: 김성욱; 전성수; 천혜경; 김광록; 이상달; 정원훈; 이종철
Original assignee: 한올바이오파마주식회사; 한국화학연구원
Priority date: 2008-10-13
Filing date: 2008-10-13
Publication date: 2010-04-22
Also published as: WO2010044581A3; KR101083300B1; US20110207810A1; WO2010044581A2; US8642647B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체는 기존 약물에 비해 적은 복용량으로도 우수한 혈당강하 작용과 지질저하 작용을 나타내어 당뇨병, 인슐린 비의존성 당뇨병, 비만 및 동맥 경화 등의 대사성 증후군, 또는 유전자 P53이 결여된 암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다:

화학식 1

상기 식에서,

R은 C₁-C₈알킬, 알릴, C₁-C₈알콕시알킬, C₃-C₇사이클로알킬, C₃-C₇사이클로알킬C₁-C₃알킬, 임의로 치환된 페닐 또는 페닐C₁-C₃알킬, 임의로 치환된 나프틸 또는 나프틸C₁-C₃알킬, 플루오레닐 또는 아다만틸기이다.

Description

Ｎ1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-Ｎ2-치환된 바이구아나이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물{N1-BENZO[1,3]DIOXOL-5-YLMETHYL-N2-SUBSTITUTED BIGUANIDE DERIVATIVES, METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME}

본 발명은 기존 약물에 비해 적은 복용량으로도 우수한 혈당강하 작용과 지질저하 작용을 나타내는 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 지속적인 고혈당 증상을 특징으로 하는 질환으로, 탄수화물 대사 이상과 지질 대사 이상이 주요 병태이며, 고혈당으로 인한 혈류장애와 당이용 저하로 인한 전신적 합병증이 악화되어가는 질환이다. 이러한 당뇨병 병태는 인슐린의 결핍 또는 인슐린의 내성 때문에 유발되며, 인슐린 내성으로 인해 발생되는 당뇨병을 제2형 당뇨병이라 한다.

제2형 당뇨병은 인슐린 수용체가 감소하거나 수용체를 통한 신호 전달체계의 결함으로 인해 인슐린이 세포속으로 당을 운반해주는 기능을 발휘하지 못하게 된 상태, 즉, 인슐린이 내성을 일으킨 상태로 인해 유발되며, 고인슐린혈중(hyperinsulinemia)으로 인한 직접적인 혈관 파괴 및 대사증후군(metabolic syndrome)을 악화시킨다.

이러한 제2형 당뇨병을 치료하기 위하여 많은 종류의 당뇨병 약물이 사용되어 왔다. 그러나 바이구아나이드계 메트포르민(metformin)을 제외한 다른 약물들은 혈당강하 작용에는 일부 효과가 있으나, 시력 상실, 심장 마비, 뇌졸중, 신부전, 말초신경 장애, 족부 궤양등의 중대한 합병증을 예방하기엔 그 효능이 부족하였다. 예를 들면, 설포니우레아(sulfonyurea)계 약물은 췌장에서 인슐린을 강제로 분비시켜 혈당을 강하시키는 약물로, 그 약물 효과가 빨리 사라지며 지질대사를 비정상화시켜 동맥경화, 체중증가, 저혈당으로 인한 뇌손상을 유발한다는 단점이 있다. 또한, 글리타존(glitazone)계 약물은 주로 지방 조직에 대한 인슐린 내성 문제만을 해결하여 메트포르민과 병용요법을 실시해야 하며, 망막혈관 파괴 등의 부작용을 유발하므로 사용상 매우 주의를 요하는 단점이 있다.

반면 메트포르민은 인슐린과 동일한 작용을 지닌 약효군으로 저혈당을 유발하지 않고, 지방조직, 간조직 및 근육 조직 모두에서 인슐린 내성문제를 해결하며, 우수한 혈당강하 및 당화헤모글로빈수치 저하 작용을 나타낸다. 또한, AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 고혈당을 정상화시키고 지질 상태를 개선시키며 월경 불순, 배란 및 임신을 정상화시키고, 지방간을 치료하며 심지어 암을 예방한다고 보고된다.

하지만 메트포르민은 1일 3회 투약하는 것이 일반적이며, 1회 용량이 약 500mg 이상이므로 이를 1일 1회용으로 서방화 하려면 메트포르민을 약 1,500mg 이상 함유하는 정제가 요구되는데, 이 경우 정제의 크기가 너무 커서 복용하는데 어려움이 있다. 또한, 현재 시판되는 지속성 제제의 경우 1정에 메트포르민을 약 750mg만 함유하기 때문에 투약 시 2정 이상을 복용해야 하는 문제가 있다. 이에 우수한 혈당강하 및 지질저하 작용을 발휘하여 1일 필요한 약물의 용량을 감소시킬 수 있는 제제의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

본 발명의 목적은 기존 약물에 비해 적은 복용량으로도 우수한 혈당강하 작용과 지질저하 작용을 나타내는 신규 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병, 인슐린 비의존성 당뇨병, 비만 및 동맥 경화 등의 대사성 증후군, 또는 유전자 P53이 결여된 암의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체 화합물, 또는 그의 약 학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

상기 식에서,

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체 화합물은 적은 복용량으로도 우수한 혈당강하 작용과 지질저하 작용을 나타낼 수 있어 당뇨병, 인슐린 비의존성 당뇨병, 비만 및 동맥 경화 등의 대사성 증후군, 또는 유전자 P53이 결여된 암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물에 있어서, "C₁-C₈알킬은 선형 또는 분지형 알킬기를 포함하며, 이의 바람직한 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸을 들 수 있다.

본원에 사용된 "C₁-C₈알콕시알킬"은 메톡시메틸, 메톡시에틸, 메톡시에톡시에톡시에틸, 에톡시메틸 및 옥틸록시메틸 등을 들 수 있다.

본원에 사용된 "C₃-C₇사이클로알킬"의 바람직한 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 들 수 있다.

본원에 사용된 "C₃-C₇사이클로알킬C₁-C₃알킬"의 바람직한 예로는 사이클로프로판메틸, 사이클로부탄메틸, 사이클로펜탄메틸, 사이클로헥산메틸, 사이클로프로판에틸, 사이클로부탄에틸, 사이클로펜탄에틸, 사이클로헥산에틸, 사이클로프로판프로필, 사이클로부탄프로필, 사이클로펜탄프로필 및 사이클로헥산프로필을 들 수 있다.

본원에 사용된 "임의로 치환된 페닐 또는 페닐C₁-C₃알킬"의 바람직한 예로는 치환되지 않거나 치환기로 치환된 벤질, 페닐, 나프틸, 1-페닐에틸, 2-페닐에틸, 1-페닐프로필, 2-페닐프로필 및 3-페닐프로필을 포함한다. 상기 치환기는 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 3개로 각각 동일하거나 상이할 수 있으며, 이 치환기들은 페닐에 화학적으로 허용되는 임의의 위치에 치환될 수 있다. 상기 치환기의 예로는 할로겐 원자, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆할로알킬기, C₁-C₆사이클로알킬기, C₆-C₁₀아릴기, C₆-C₁₀아릴옥시기, C₁-C₆알콕시기, C₁-C₆할로알콕시기, C₃-C₆사이클로알킬옥시기, C₁-C₇알카노일기, 카르복실기, 카르바모일기, 알킬아미노기, C₂-C₇술폰산기, 술폰아미도기 및 C₁-C₆알킬티오기를 들 수 있다.

본원에 사용된 "임의로 치환된 나프틸 또는 나프틸C₁-C₃알킬"의 바람직한 예로는 치환되지 않거나 치환기로 치환된 1-나프틸메틸, 2-나프틸메틸, 1-나프틸에틸 및 2-나프틸에틸을 들 수 있으며, 이때 치환기는 상기 "페닐 또는 페닐C₁-C₃알킬"의 치환기와 동일하다.

상기 화학식 1에 있어서, 더욱 바람직하게는 R은 에틸, 사이클로헥실, 1-나프틸, tert-부틸, 벤질, 헥실, 에틸페닐, 2-에틸-4-클로로페닐, 옥틸, 3-트리플루오로메틸페닐, 4-메틸벤질, 2,5-다이메톡시페닐, 2-플루오레닐, 4-플루오로페닐, 4-메톡시페닐, 프로필, 메틸, 알릴, 사이클로펜틸, 사이클로헵틸, 사이클로프로판메틸, 이소프로필, 이소부틸, 3,4,5-트리메톡시페닐, 4-헥실페닐, 3,5-다이메톡시페닐, 1-아다만틸, 4-페녹시페닐, 메톡시에틸, 4-브로모페닐, 4-tert-부틸페닐, 3,5-다이클로로페닐, 4-바이페닐, 4-브로모벤질, 4-메톡시벤질, 사이클로프로필, 부틸, 펜틸, 3-브로모페닐, 3-메틸페닐, 4-플루오로벤질, 3,4-다이플루오로벤질, 페닐 또는 메톡시에톡시에톡시에틸이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 유기산, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염; 및 무기산, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염이 포함된다. 상기 언급된 산 부가염은 예를 들어, a) 상기 화학식 1의 화합물 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 하나를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시켜 혼합시키거나, 또는 c) 화학식 1의 화합물 및 산을 용매 또는 수화 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염의 제조방법에 적용하여 제조할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물이 카르복실기 및 술폰산기와 같은 산성기를 갖는 경우, 화합물은 양쪽이온성 염이 되며, 그러한 염은 알칼리 금속염(예: 나트륨염 및 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(예: 칼슘염 및 마그네슘염 등), 무기산계 염(예: 알루미늄염 및 암모늄염 등), 및 염기성 부가염(예: 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민계 염)일 수 있다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물의 염은 염기성 아미노산계 염(예: 아르기닌, 라이신 및 오르니틴계 염) 및 산성 아미노산계 염(예: 아스파르트산계 염)일 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물의 염은 바람직 하게는 약학적으로 허용 가능한 염이며, 더욱 바람직하게는 산 부가염, 더욱더 바람직하게는 아세테이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 메탄술포네이트, 말로네이트 또는 옥살레이트이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조방법은 예를 들어,

1) 하기 화학식 2의 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 R-이소티오시아네이트(RNCS)와 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 얻는 단계; 및

2) 하기 화학식 4의 화합물을 산화수은의 존재 하에 구아니딘 용액 중에서 반응시키는 단계를 포함한다:

화학식 1

상기 식에서, R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

또 다른 방법으로서, 본 발명의 화학식 1의 화합물은

1) 하기 화학식 2의 화합물을 카본다이설파이드와 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 에틸클로로포메이트와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 얻는 단계;

2) 하기 화학식 3의 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 NH₂R과 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 얻는 단계; 및

3) 하기 화학식 4의 화합물을 산화수은의 존재 하에 구아니딘 용액 중에서 반응시키는 단계를 포함한다.

화학식 1

화학식 2

화학식 4

상기 식에서, R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 제조방법들은 예를 들어 하기 반응식 1로 나타내어질 수 있으며, 이를 단계별로 설명하면 다음과 같다:

상기 식에서, R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 1의 화합물의 제조방법에서, 중간체로 사용되는 화학식 4의 티오우레아 화합물은 (A) 치환체 R기를 보유한 이소티오시아네이트(RNCS)가 상용으로 구입 가능한 경우, 화학식 2의 피페로닐 아민 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 RNCS와 반응시키거나, 또는 (B) 치환체 R기를 보유한 RNCS가 상용으로 구입 불가능한 경우, 화학식 2의 피페로닐 아민 화합물을 카본다이설파이드와 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 에틸클로로포메이트와 반응시켜 화학식 3의 이소티오시아네이트 화합물로 변환시킨 후, 화학식 3의 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 NH₂R과 반응시켜 얻을 수 있다.

이때, 상기 반응에서 출발물질로 사용되는 화학식 2의 화합물은 상업적으로 시판되는 화합물을 사용하거나, 공지의 방법에 의해 쉽게 합성할 수 있다.

상기 화학식 4의 티오우레아 화합물 제조시 단계 (1), (1′) 및 (2)에서 사용되는 염기로는 예를 들어 트리에틸아민, 트리메틸아민 또는 다이이소프로필에틸 등을 사용할 수 있고, 유기용매로는 예를 들어 다이클로로메탄, 다이클로로에탄 또는 다이메틸포름아마이드 등을 사용할 수 있다. 반응온도는 0℃ 내지 실온까지의 범위이다. 상기 단계 (1) 및 (1′) 에서 카본다이설파이드, 염기 및 에틸클로로포메이트의 양은 각각 화학식 2의 화합물에 대해 약 1 내지 2몰 당량으로 사용할 수 있으며, 상기 단계 (2)에서 염기의 사용량은 화학식 3의 화합물에 대해 약 1 내지 2몰 당량으로 사용할 수 있다.

상기 단계 (3)에서는 상기 단계 (2)에서 얻은 화학식 4의 티오우레아 화합물을 산화수은과 적당한 유기용매(예: 에틸알콜, 메틸알콜 또는 다이메틸 포름아미드) 중에 용해시킨 후 1M 구아니딘 에탄올 용액을 가하여 환류시킨다. 이때, 산화수은의 양은 화합물 4에 대해 약 1 내지 2몰 당량이며 1M 구아니딘 에탄올 용액은 화합물 4에 대해 1 내지 3몰 당량이며, 반응온도는 실온에서 사용한 용매의 환류온도까지의 범위(예를 들어, 다이메틸 포름아미드의 경우 실온 내지 100℃까지) 이다. 반응이 완결되면 여과한 후 예를 들어 염산 등의 산을 이용하여 반응용액의 pH를 바람직하게 약 4 내지 5 정도로 조절하여 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 얻을 수 있다.

이렇게 얻어진 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은 기존 약물에 비해 적은 복용량으로도 혈당강하 작용과 지질저하 작용을 나타내기 때문에 대사성 증후군의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 대사성 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 대사성 증후군의 예로는 인슐린 비의존성 당뇨병, 비만, 동맥경화 등이 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 유전자 P53이 결여된 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 그 자체로 또는 1종 이상의 첨가제를 포함하는 약학 조성물로 투여될 수 있다.

상기 첨가제는 예를 들어 안정화제, 결합제, 기제, 당의제, 부형제, 붕해제, 용해보조제, 점도조절제, 코팅제, 현탁화제, pH조절제, 등장화제, 광택화제, 유화제, 감미제, 교미제, 습윤제, 연질캡슐기제, 경질캡슐기제, 가소제, 보존제, 항산화제, 용제, 활택제, 점착제, 계면활성제, 차광제, 착색제, 분산제, 무통화제, 완충제, 청량화제, 용해제로부터 투여경로 및 배합목적에 따라 선택되거나 조합되어 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 특정 용도 및 요구하는 목적에 적합하도록 당업자가 실시할 수 있는 제형화 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구로, 예를 들어 정제, 산제, 과립제, 환제, 트 로키제, 캡슐제 또는 내용액제의 형태로 투여될 수 있다. 또한 비경구로, 예를 들어 주사제, 좌제, 연고제, 외용액제, 페이스트제, 카타플라스마제, 리니멘트제 또는 첩부제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염의 경구투여를 위한 적당한 투여 수준은 바람직하게는 1일 1회 60kg인 성인 남성을 기준으로 kg당 0.5 내지 150mg 범위이다. 그러나 이는 환자의 연령 및 증세, 투여경로 등의 다양한 인자에 따라 변화할 수 있으며, 경우에 따라 상기 투여량 범위보다 적은 양 또는 많은 양으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 구성 및 작용의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-에틸 바이구아나이드 염산염의 제조

(1-1) 1-(벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸)-3-에틸티오우레아의 제조

에틸 이소티오시아네이트(1.3 g, 15.0 mmol)를 피페로닐아민(1.8 mL, 15.0 mmol)이 다이클로로메탄(150 mL)에 녹아있는 용액에 천천히 적가하였다. 상기 혼합용액에 트리에틸아민(5.7 mL, 30.0 mmol)을 적가한 후 상온에서 2시간 동안 교반 하였다. 반응의 종결을 확인한 후, 반응용액에 1N HCl으로 반응용액의 pH를 약 7로 맞춘 후 물을 첨가하여 다이클로로메탄으로 추출하였다. 얻은 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography) (에틸아세테이트:헥산=1:3)로 정제하여 표제 화합물을 얻었다(3.1 g, 88%).

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ 6.82 (s, 1H), 6.79 (s, 2H), 6.00 (s, 2H), 5.79-6.02 (m, 2H), 4.56-4.57 (m, 2H), 3.38-3.42 (m, 2H), 1.19 (t, 3H, J=7.5)

(1-2) N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-에틸 바이구아나이드 염산염의 제조

상기 단계 (1-1)에서 얻은 화합물(1.2 g, 5.10 mmol)을 에탄올(15 mL)에 녹인 후, 이 용액에 산화수은(Mercuric oxide(II), 2.2 g, 10.2 mmol)을 첨가하였다. 혼합용액에 1M 구아니딘 에탄올 용액(15 mL, 15.3 mmol)을 천천히 적가한 후 12시간 동안 환류시켰다. 반응용액을 냉각시킨 후, 셀라이트 필터(celite filter)를 이용하여 반응용액을 여과시키고 여액에 2N HCl을 가하여 pH를 약 4 내지 5 사이로 적정하였다. 용액을 농축한 후, 얻은 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(다이클로로메탄:메탄올=9:1)로 정제하여 표제 화합물을 얻었다 (0.24 g, 16%).

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.86-6.89 (m, 3H), 5.97 (s, 2H), 4.21 (s, 2H), 3.04-3.13 (m, 2H), 1.04-1.08 (m, 3H) ; Mass (ESI) m/z 264.6 (M⁺)

상기 실시예 1의 단계 (1-1)에서 에틸 이소티오시아네이트 대신에 목적 화합물에 상응하는 이소티오시아네이트 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법에 의해 하기 실시예 3 내지 6, 9, 16, 17, 39, 40 및 45의 화합물을 제조하였다.

실시예 10: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3-트리플루오르메틸페닐) 바이구아나이드 염산염

(10-1): 5-(이소티오시아네이토메틸)벤조[1,3]다이옥솔의 제조

피페로닐아민(4.89 mL, 39.31 mmol) 및 트리에틸아민(5.00 mL, 39.31 mmol)을 1,2-다이클로로에탄(25 mL)에 용해시킨 후, 혼합용액을 0℃로 냉각한 다음, 여기에 1,2-다이클로로에탄(50 mL)에 카본다이설파이드(2.36 mL, 39.31 mmol)를 녹인 용액을 15분에 걸쳐 적가하였다. 혼합용액을 실온으로 올린 다음 다시 0℃로 냉각하고, 여기에 에틸클로로포메이트(4.27 mL, 31.39 mmol)를 적가하였다. 이 혼합물을 상온에서 약 1 내지 2시간 동안 교반시킨 후, 반응용액에 물(150 mL)을 가하고 2N 수산화나트륨 용액(75 mL)을 첨가한 다음, 이를 다이클로로메탄으로 추출하였다. 추출액을 물과 소금물로 씻은 후, 황산나트륨으로 건조시키고 농축하여 노란색의 표제 화합물을 액체로 얻었다(6.06 g, 수율: 80 %).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.81 (s, 1H), 6.74 (s, 2H), 5.94 (s, 2H), 4.77 (d, 2H, J = 5.4 Hz)

(10-2) 1-(벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸)-3-(3-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아의 제조

상기 단계 (10-1)에서 얻은 화합물(2.9 g, 15.0 mmol)과 3-플루오로메틸아닐린(1.3 mL, 10.2 mmol)을 사용한 것을 제외하고 실시예 1의 단계 (1-1)과 동일한 방법으로 수행하여 표제 화합물을 얻었다(3.0 g, 85%).

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ 7.30-7.53 (m, 4H), 6.82 (s, 1H), 6.76 (s, 2H), 5.95 (s, 2H), 4.76 (d, 2H, J = 8.4)

(10-3) N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3-트리플루오르메틸페닐) 바이구아나이드 염산염의 제조

상기 단계 (10-2)에서 얻은 화합물 (1,8 g, 5.10 mmol)을 사용한 것을 제외하고 실시예 1의 단계 (1-2)와 동일한 방법으로 수행하여 표제 화합물을 얻었다(0.27 g, 14%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.30-7.70 (m, 4H), 6.75-6.90 (m, 3H), 5.96 (s, 2H), 4.43 (br s, 2H)

상기 실시예 10의 단계 (10-2)에서 3-플루오로메틸아닐린 대신에 목적 화합물에 상응하는 아닐린 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일한 방법에 의해 하기 실시예 2, 7, 8, 11 내지 15, 18 내지 38, 41 내지 44 및 46의 화합물을 제조하였다.

실시예 2: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-사이클로헥실 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.74-6.88 (m, 3H), 5.96 (s, 2H), 4.19-4.21 (d , 2H, J=5.7), 2.45 (m, 1H), 1.51-1.80 (m, 6H), 1.08-1.15 (m, 4H) ; mp 85.4-90.4℃

실시예 3: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(1-나프틸) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.44-7.56 (m, 4H), 6.78-6.86 (m, 6H), 5.97 (s, 2H), 4.30-4.34 (d, 2H, J=5.5); Mass (ESI) m/z 396.0 (M⁺) ; mp 196.1-198.6℃

실시예 4: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-t-부틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.75-6.93 (m, 3H), 5.98 (s, 2H), 4.06-4.10 (d, 2H, J=5.5) ; Mass (ESI) m/z 356.6 (M⁺) ; mp 204.4-217.0℃

실시예 5: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-벤질 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.25-7.32 (m, 5H), 6.74-6.88 (m, 3H), 5.98 (s, 2H), 4.33-4.34 (m, 2H), 4.22-4.25 (m, 2H) ; mp 109.2-112.6℃

실시예 6: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-헥실 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.79-6.81 (m, 3H), 5.91 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 3.01-3.03 (m, 2H), 1.37-1.41 (m, 2H), 1.10-1.20 (m, 6H), 0.79-0.80 (3H) ; mp 198.0-204.0℃

실시예 7: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(펜에틸)바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.20-7.31 (m, 5H), 6.69-6.87 (m, 3H), 6.02 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.28-3.30 (m, 2H), 2.75-2.80 (m, 2H) ; Mass (ESI) m/z 292.6 (M⁺) ; mp 160.2-165.4℃

실시예 8: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(2-에틸-4-클로로)페닐 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.70-7.76 (m, 1H), 7.20-7.43 (m, 5H), 6.82-6.93 (m, 2H), 6.58-6.74 (m, 4H), 5.98 (s, 2H), 4.18-4.20 (d, 2H, J=5.0), 2.71-2.80 (m, 2H), 1.20-1.22 (m, 3H)

실시예 9: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-t-옥틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.63-7.08 (m, 3H), 6.01 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.18 (s, 2H), 1.43 (m, 6H), 0.91-1.00 (m, 9H); Mass (ESI) m/z 348.6 (M⁺) ; mp 141.7-155.4℃

실시예 11: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-메틸벤질) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.16-7.11 (m, 4H), 6.92-6.89 (m, 3H), 5.99 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 2.26 (s, 3H)

실시예 12: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(2,5-다이메톡시페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 6.69-6.99 (m, 6H), 5.99 (s, 2H), 4.26 (br s, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.62 (s, 3H)

실시예 13: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(2-플루오레닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.94-7.40 (m, 7H), 6.91-6.83 (m, 3H), 6.00 (s, 2H), 4.40 (br s, 2H), 3.93 (s, 2H)

실시예 14: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-플루오로페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.24-7.13 (m, 2H), 6.87-6.75 (m, 5H), 5.96 (s, 2H), 4.27 (s, 2H)

실시예 15: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-메톡시페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.15 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.00 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.84-6.94 (m, 3H), 6.02 (s, 2H), 4.34-4.35 (m, 2H), 3.77 (s, 3H)

실시예 16: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-프로필 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 6.87-6.75 (m, 3H), 5.97 (s, 2H), 4.29 (s, 2H), 3.14-3.25 (m, 2H), 1.40-1.60 (m, 2H), 0.82-0.75 (m, 3H)

실시예 17: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-메틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.62-6.98 (m, 3H), 5.97 (s, 2H), 4.21-4.22 (d, 2H, J=5.4), 2.67 (s, 3H) ; Mass (ESI) m/z 250.6(M⁺) ; mp 143.9-158.1℃

실시예 18: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-알릴 바이구아나이드 염산 염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.69-6.89 (m, 3H), 5.96 (s, 2H), 5.60-5.80 (m, 1H), 5.00-5.20 (m, 2H), 4.30-4.32 (m,2H), 3.79-3.83 (m, 2H); Mass (ESI) m/z 276.8 (M⁺)

실시예 19: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-사이클로펜틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.71-6.98 (m, 3H), 5.97 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 3.81-3.83 (m, 1H), 1.79-1.83 (2H), 1.39-1.59 (m, 6H); mp 182.4-186.9℃

실시예 20: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-사이클로헵틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.71-6.88 (m, 3H), 5.92 (s, 2H), 4.16 (s, 1H), 3.49-3.51 (m, 1H), 1.74-1.82 (m, 2H), 1.25-1.60 (m, 10H) ; mp 156.6-164.7℃

실시예 21: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-사이클로프로판메틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.59-6.73 (m, 3H), 5.81 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 2.77-2.80 (m 2H), 0.76-0.81 (m, 1H), 0.24-0.30 (m, 2H), 0.02-0.03 (m, 2H)

실시예 22: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-이소프로필 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.70-6.82 (m, 3H), 5.88 (s, 2H), 4.21 (s, 2H), 3.60-3.70 (m, 1H), 1.08-1.12 (d, 6H) ; mp 211.2-225.2℃

실시예 23: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-이소부틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.75-6.93 (m, 3H), 5.96 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 2.87-2.91 (m, 2H), 1.70-1.80 (m, 1H), 0.76-0.87 (m, 6H); mp 189.4-195.8℃.

실시예 24: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3,4,5-트리메톡시페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.91-6.99 (m, 3H), 6.56 (s, 2H), 6.09 (s, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.85 (s, 6H), 3.71 (s, 3H).

실시예 25: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-헥실페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.13-7.23 (m, 4H), 6.87-6.98 (m, 3H), 6.00 (m, 2H), 4.36 (s, 2H), 3.22 (s, 2H), 1.55-1.63 (m, 2H), 1.31-1.50 (s, 6H), 0.86-0.93 (m, 3H) ; mp 145.0-158.4℃

실시예 26: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3,5-다이메톡시페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.88-6.98 (m, 3H), 6.31-6.41 (m, 3H), 5.99 (s, 2H), 4.22-4.25 (m, 2H), 3.73 (s, 6H); mp 263.0-266.1℃

실시예 27: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(1-아다만틸) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.69-6.83 (m, 3H), 5.90-5.91 (m, 2H), 4.39-4.45 (d, 1H, J=18.3), 4.01 (s, 1H), 1.87-1.94 (m, 9H), 1.49-1.52 (m, 6H) ; mp 220.3-225.6℃

실시예 28: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(1-아다만틸) 바이구아나이드 염산염 (이성질체)

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.88-7.92 (s, 1H), 6.59-6.71 (m, 3H), 5.84-5.85 (s, 2H), 5.45-5.46 (m, 2H), 4.00 (s, 2H), 1.71-1.92 (m, 9H), 1.47-1.49 (m, 6H)

실시예 29: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(1-아다만틸) 바이구아나이드 염산염 (이성질체)

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.71-6.82 (m, 3H), 5.89-5.90 (m, 2H), 4.01(s, 2H), 1.81-1.94 (m, 9H), 1.50-1.60 (m, 6H)

실시예 30: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-페녹시페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.31-7.33 (m, 3H), 7.03-7.14 (m, 3H), 6.72-6.96 (m, 6H), 5.88 (s, 2H), 4.22 (s, 2H) ; mp 219.2-225.4℃

실시예 31: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(2-메톡시에틸) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 6.68-6.81 (m, 3H), 5.88 (s, 2H), 4.15 (s, 2H), 3.33-3.36 (t, 2H, J=5.4), 3.15-3.22 (m, 2H), 3.08 (s, 3H) ; mp 129.7-133.5℃

실시예 32: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-브로모페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.42-7.46 (m, 2H), 7.07 (d, 2H, J = 8.7Hz ), 6.77-6.88 (m, 3H), 5.89 (s, 2H), 4.24 (s, 2H) ; mp 177.9-181.3℃

실시예 33: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-t-부틸페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.32 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.80-6.90 (m, 3H), 5.97 (m, 2H), 4.26 (s, 2H), 1.23 (s, 9H) ; mp 124.1-126.8℃

실시예 34: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3,5-다이클로로페닐) 바이 구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.14-7.24 (m, 3H), 6.75-6.89 (m, 3H), 5.92 (s, 2H), 4.25 (s, 2H) ; mp 197.6-201.4℃

실시예 35: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-바이페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.56-7.58 (m, 3H), 7.18-7.55 (m, 6H), 6.78-6.87 (m, 3H), 5.90 (s, 2H), 4.26 (s, 2H) ; mp 222.8-230.1℃

실시예 36: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-브로모벤질) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.42-7.45 (d, 2H, J=8.3), 7.14-7.17 (d, 2H, J=8.3), 6.67-6.80 (m, 3H), 5.89 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 4.16 (s, 2H) ; mp 122.6-125.8℃

실시예 37: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-메톡시벤질) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.11-7.14 (m, 2H), 6.69-6.82 (m, 5H), 5.88 (s, 2H), 4.18 (m, 2H), 4.16 (m, 2H), 3.65 (s, 3H) ; mp 111.5-113.5℃

실시예 38: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-사이클로프로필 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.75-6.90 (m, 3H), 5.96 (m, 2H), 4.40-4.47 (m, 2H), 2.45-2.55 (m, 1H), 0.59-0.89 (m, 4H)

실시예 39: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-부틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.73-6.92 (m, 3H), 5.96(s, 2H), 4.38 (s, 2H), 1.37-1.55(m, 2H), 1.11-1.40 (m, 4H), 0.81-0.88 (m, 3H) ; mp 112.9-116.0℃

실시예 40: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-펜틸 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 6.73-6.83 (m, 3H), 5.92 (s, 2H), 4.61-4.72 (m, 1H), 4.16-4.25 (m, 1H), 1.41-1.55 (m, 2H), 1.07-1.24 (m, 6H), 0.78-0.84 (m, 3H)

실시예 41: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3-브로모페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.05-7.24 (m, 4H), 6.76-6.86 (m, 3H), 5.88 (s, 2H), 4.22 (s, 2H)

실시예 42: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3-메틸페닐) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.12-7.18 (m, 1H), 6.73-6.91 (m, 6H), 5.86 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 2.17 (s, 3H); mp 210.4-212.5℃

실시예 43: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(4-플루오로벤질) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 7.10-7.27 (m, 4H), 6.74-6.89 (m, 3H), 6.00 (s, 2H), 4.75-4.78 (m, 2H), 4.29-4.32 (m, 2H)

실시예 44: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(3,4-다이플루오로벤질) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.22-7.33 (m, 2H), 6.99-7.00 (br s, 1H), 6.70-6.88 (m, 3H), 5.90 (s, 2H), 4.27 (s, 2H), 4.20 (s, 2H); mp 143.7-150.3℃

실시예 45: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-페닐 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300MHz, D₂O) δ 7.29-7.31 (m, 2H), 7.07-7.13 (m, 3H), 6.77-6.89 (m, 3H), 5.92 (s, 2H), 4.26 (s, 2H) ; mp 106.4-107.8℃

실시예 46: N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-(2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)에틸) 바이구아나이드 염산염

¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 6.59-6.77 (m, 3H), 5.87 (s, 2H), 4.12 (s, 2H), 3.31-3.39 (m, 10H), 3.12-3.19 (m, 5H)

시험예

상기 실시예에서 얻은 화합물에 대하여 하기 시험예에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 하기 시험은 실시예 1 내지 9, 실시예 10 내지 16, 실시예 17 내지 37 및 실시예 38 내지 46을 그룹으로 하여 4개의 플레이트로 각각 3회 측정하여 평균값을 산출하였고, 각각의 플레이트에 대조군으로서 2mM의 메트포르민을 사용하여 비교하였다. 이 경우, 동일한 농도의 메트포르민으로 시험되었지만, 각각의 플레이트 측정 환경에 따라 시험 결과에 대한 평균값에 다소 차이가 있다.

하기 표 1에 있어서, 콜레스테롤 합성억제 능력, 중성지방산 합성억제 능력 및 포도당 형성억제 능력의 경우 세포독성이 있는 경우 독성에 의해 낮아지는 경우가 있기 때문에 그 수치는 인정되지 않으며, 대조군의 수치가 기준이 되는 수치가 된다. 포도당 섭취 능력의 경우 인슐린과 대조군을 동시에 사용하여 측정하였으며 세포기반 실험을 기준으로 편차를 고려하여 200% 이상일 경우 포도당 섭취 능력이 있는 것으로 판단한다.

시험예 1: 콜레스테롤 합성억제 능력 측정

본 발명의 화합물에 대하여 AMPK(AMP-activated protein kinase)의 중요 기능인 콜레스테롤 합성억제 능력을 측정하기 위하여 간세포 모델인 HepG2 세포(ATCC: American Type Culture Collection)를 이용하여 하기 시험을 실시하였다.

먼저, 간세포모델인 HepG2 세포를 1% 혈청이 들어있는 배지(DMEM(Gibco), FBS(Gibco))에서 24시간 동안 배양한 다음 각 실시예의 화합물을 100㎛ 또는 500㎛ 농도로 24시간 동안 처리한 후 세포를 파쇄용액(0.1M 인산칼륨, pH 7.4, 0.05M NaCl, 5 mM 콜린산(cholic acid), 0.1% 트리톤(Triton) X-100(Sigma))으로 파쇄하였다. 파쇄된 세포에 동일 용량의 반응액(2 U/ml 콜레스테롤 산화제, 2 U/ml 퍼옥 시다제, 0.2 U/ml 콜레스테롤 에스테라제, 형광인자인 300μM Amplex red(Molecular probe))을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 형광 측정기로 560/590 nm (ex/em)파장에서 측정하여 형성된 콜레스테롤의 양을 정량하였다.

수치가 적을수록 콜레스테롤 합성억제 능력이 있음을 의미한다. 대조군의 경우 2 mM 농도에서 각 플레이트에서의 보인 콜레스테롤 합성억제 능력과 비교하여 화합물이 대조군의 수치 이하일 경우 대조군 사용 농도 대비 우수한 것으로 판단한다. 예를 들면 실시예 15의 경우 사용 농도가 100μM에서 대조군보다 낮은 콜레스테롤 합성양을 보여 적어도 20배 이상 효과가 좋은 것으로 판단할 수 있다.

시험예 2: 중성지방산 합성억제 능력 측정

HepG2 세포(ATCC: American Type Culture Collection)를 1% 혈청이 들어있는 배지(DMEM(Gibco), FBS(Gibco))에서 24시간 배양한 다음 각 실시예의 화합물을 100㎛ 또는 500㎛ 농도로 24시간 동안 처리한 후 세포를 파쇄용액(0.1M 인산칼륨, pH7.4, 0.05 M NaCl, 5 mM 콜린산, 0.1% 트리톤 X-100)으로 파쇄하였다. 파쇄된 세포에 동일용량의 반응액(0.76 U/ml 글리세롤 키나제(아산제약), 151333 U/ml 퍼옥시다제(아산제약), 22.2 U/ml 글리세롤 산화제(아산제약), 형광인자인 300μM Amplex red(Molecular Probe)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 형광 측정기로 560/590 nm (ex/em)파장에서 측정하여 형성된 중성지방산의 양을 정량하였다.

수치가 적을수록 중성지방산 합성억제 능력이 있음을 의미한다. 대조군의 경우 2 mM 농도에서 각 플레이트에서의 보인 중성지방산 합성억제 능력과 비교하여 화합물이 대조군의 수치 이하일 경우 대조군 사용 농도 대비 우수한 것으로 판단한다. 예를 들면 실시예 37의 경우 사용 농도가 100μM에서 대조군 보다 낮은 중성지방산 합성양을 보여 적어도 20배 이상 효과가 좋은 것으로 판단할 수 있다.

시험예 3: 포도당 형성억제 능력 측정

HepG2 세포(ATCC: American Type Culture Collection)를 10% 혈청 고혈당 배지에서 배양한 다음, 무혈청 저혈당 배지(DMEM (Gibco), FBS(Gibco))로 옮겨 각 실시예의 화합물을 100㎛ 농도로 24시간 동안 처리한 후, 여기에 0.5 μCi ¹⁴C-락테이트(Amersham Pharmacia)와 10 mM L-락테이트(Sigma)를 처리한 후 4시간 동안 세포를 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 세척된 세포에 0.1N NaOH를 첨가하고 1시간 동안 실온에 두었다. 그 후 1N HCl로 중화시킨 다음 세포 내에서 형성된 포도당의 양을 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)로 측정하였다.

수치가 적을수록 포도당 형성억제 능력이 있음을 의미한다. 대조군의 경우 2 mM 농도에서 각 플레이트에서의 보인 포도당 형성억제 능력과 비교하여 화합물이 대조군의 수치이하일 경우 대조군 사용 농도 대비 우수한 것으로 판단한다. 예를 들면 실시예 9의 경우 사용 농도가 100μM에서 대조군 보다 낮은 콜레스테롤 합성 양을 보여 적어도 20배 이상 효과가 좋은 것으로 판단할 수 있다.

시험예 4: 포도당 섭취 능력 측정

근육세포모델인 C2C12(ATCC: American Type Culture Collection)를 사용하여 우선 6일간 2 % 송아지혈청 함유 배지(DMEM (Gibco), FBS(Gibco))에서 근육세포로 분화를 유도하였다. 근육세포로 분화된 C2C12 세포를 무혈청 저혈당배지(DMEM(Gibco), FBS(Gibco))로 옮기고 각 실시예의 화합물을 100㎛ 농도로 처리한 다음 1μM의 인슐린(Sigma)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 1μCi ³H-데옥시-글루코오스(Amersham Pharmacia)와 10 μM 데옥시-글루코오스(Sigma)를 37℃에서 15분간 처리하였다. 처리 후 배지를 제거하고 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척하였다. 세척된 세포에 0.1N NaOH를 처리하고 1N HCl로 중화하였다. 세포 내로 흡수된 포도당의 양을 액체 섬광 계수기로 측정였다.

수치가 클수록 인슐린 내성을 감소시키는 능력이 강함을 의미한다. 실시예 5의 경우 100μM에서 대조군과 유사한 효과를 보였으므로 농도를 환산하면 대조군 보다 220배 정도 효과가 우수한 것으로 판단된다.

시험예 5: 세포독성 시험

세포 독성을 측정하기 위하여 LDH (Lactate dehydrogenase) 방법을 사용하였다. 즉, 계대 중인 세포들을 실험에 사용하기 위하여 트립신-EDTA 용액을 이용 하여 세포들을 착면으로부터 분리시키고, 플레이트(96 well microplate, Falcon사 제품)에 웰(well)당 세포수가 1×10⁴이 되도록 분주하였다. 분주된 세포들은 CO₂ 인큐베이터내에서 24 시간 배양하여 바닥에 부착시킨 후, 아스피레이터(aspirator)로 배양액을 제거하고, 화합물과 대조약제로 배양액에 희석된 화합물 용액들을 세포가 들어 있는 웰에 각각 100 μL씩 3 배수로 넣어주고, 24 시간 동안 더 배양하였다. 화합물을 용해시키기 위하여 필요에 따라 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하였다. 24시간 처리 후 상층 배지와 LDH (Roche)시약을 혼합하여 반응한 후 반응 흡광도(490 nm)에서 측정하여 세포독성을 측정하였다.

세포독성의 경우 일반적으로 해당 농도에서 30% 이상일 경우 세포독성이 있는 것으로 판단한다. 따라서, 30% 이하의 수치를 나타내는 실시예들은 세포독성이 없어 약물로서 안전하게 사용할 수 있다.

그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 화합물은 모두 세포 독성이 있을 뿐만 아니라, 농도가 100㎛로 적은 농도에서도 농도가 2mM인 메트포르민(대조군)에 비해 콜레스테롤 합성억제 능력, 중성지방산 합성억제 능력, 포도당 형성억제 능력 및 포도당 섭취 능력이 수십배 이상으로 현저히 우수하였다.

Claims

하기 화학식 1의 N1-벤조[1,3]다이옥솔-5-일메틸-N2-치환된 바이구아나이드 유도체 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:

화학식 1

상기 식에서,

R은 C₁-C₈알킬, 알릴, C₁-C₈알콕시알킬, C₃-C₇사이클로알킬, C₃-C₇사이클로알킬C₁-C₃알킬, 임의로 치환된 페닐 또는 페닐C₁-C₃알킬, 임의로 치환된 나프틸 또는 나프틸C₁-C₃알킬, 플루오레닐 또는 아다만틸기이다.
제 1 항에 있어서,

상기 화학식 1에서, R이 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 메톡시메틸, 메톡시에틸, 메톡시에톡시에톡시에틸, 에톡시메틸, 옥틸록시메틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로프로판메틸, 사이클로부탄메틸, 사이클로펜탄메틸, 사이클로헥산메틸, 사이클로프로판에틸, 사이클로부탄에틸, 사이클로펜탄에틸, 사이클로헥산에틸, 사이클로프로판프로필, 사이클로부탄 프로필, 사이클로펜탄프로필, 사이클로헥산프로필, 및 치환되지 않거나 치환기로 치환된 벤질, 페닐, 나프틸, 1-페닐에틸, 2-페닐에틸, 1-페닐프로필, 2-페닐프로필, 3-페닐프로필, 1-나프틸메틸, 2-나프틸메틸, 1-나프틸에틸 및 2-나프틸에틸로 이루어진 군에서 선택되며, 이때 상기 치환기는 1 내지 6개로 각각 동일하거나 상이할 수 있으며, 할로겐원자, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, C₁-C₆알킬기, C₁-C₆할로알킬기, C₁-C₆사이클로알킬기, C₆-C₁₀아릴기, C₆-C₁₀아릴옥시기, C₁-C₆알콕시기, C₁-C₆할로알콕시기, C₃-C₆사이클로알킬옥시기, C₁-C₇알카노일기, 카르복실기, 카르바모일기, 알킬아미노기, C₂-C₇술폰산기, 술폰아미도기 및 C₁-C₆알킬티오기로 이루어진 군에서 선택되는, 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 2 항에 있어서,

R이 에틸, 사이클로헥실, 1-나프틸, tert-부틸, 벤질, 헥실, 에틸페닐, 2-에틸-4-클로로페닐, 옥틸, 3-트리플루오로메틸페닐, 4-메틸벤질, 2,5-다이메톡시페닐, 2-플루오레닐, 4-플루오로페닐, 4-메톡시페닐, 프로필, 메틸, 알릴, 사이클로펜틸, 사이클로헵틸, 사이클로프로판메틸, 이소프로필, 이소부틸, 3,4,5-트리메톡시페닐, 4-헥실페닐, 3,5-다이메톡시페닐, 1-아다만틸, 4-페녹시페닐, 메톡시에틸, 4-브로모페닐, 4-tert-부틸페닐, 3,5-다이클로로페닐, 4-바이페닐, 4-브로모벤질, 4-메톡시벤질, 사이클로프로필, 부틸, 펜틸, 3-브로모페닐, 3-메틸페닐, 4-플루오로벤질, 3,4-다이플루오로벤질, 페닐 또는 메톡시에톡시에톡시에틸인, 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서,

약학적으로 허용 가능한 염이 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산으로 구성된 군으로부터 선택된 산의 염인 것을 특징으로 하는, 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
1) 하기 화학식 2의 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 R-이소티오시아네이트(RNCS)와 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 얻는 단계; 및

2) 하기 화학식 4의 화합물을 산화수은의 존재 하에 구아니딘 용액 중에서 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법:

화학식 1

화학식 2

화학식 4

상기 식에서, R은 제 1 항에서 정의한 바와 같다.
1) 하기 화학식 2의 화합물을 카본다이설파이드와 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 에틸클로로포메이트와 반응시켜 하기 화학식 3의 화합물을 얻는 단계;

2) 하기 화학식 3의 화합물을 염기의 존재 하에 유기용매 중에서 NH₂R과 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 얻는 단계; 및

3) 하기 화학식 4의 화합물을 산화수은의 존재 하에 구아니딘 용액 중에서 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법:

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

상기 식에서, R은 제 1 항에서 정의한 바와 같다.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,

염기가 트리에틸아민, 트리메틸아민 및 다이이소프로필에틸 중에서 선택되고, 유기용매가 다이클로로메탄, 다이클로로에탄 및 다이메틸포름아마이드 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 대사성 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 9 항에 있어서,

대사성 증후군이 인슐린 비의존성 당뇨병, 비만 또는 동맥 경화인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 유전자 P53이 결여된 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

약학적으로 허용 가능한 염이 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산으로 구성된 군으로부터 선택된 산과의 염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.