KR20100038401A - 식료품의 당지수의 시험관내 결정 방법 - Google Patents

식료품의 당지수의 시험관내 결정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 식료품에 대한 당지수 값을 결정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 음식 성분 및 가공 식료품 둘 모두의 당지수를 결정하기 위한 정확하고 저가의 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 특히 식료품의 소화 샘플 중 단백질 함량, 지방 함량, 글루코스의 양, 및 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜의 양의 측정을 포함한다.

Description

식료품의 당지수의 시험관내 결정 방법{IN VITRO METHOD FOR THE DETERMINATION OF GLYCEMIC INDEX OF FOOD PRODUCTS}
<관련 출원>
본원은 2008년 6월 23일에 출원된 미국 특허 출원 제12/144,056호의 계속 출원이고, 2007년 6월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제11/770,361호 (가출원으로 전환 신청됨)를 우선권 주장하며, 상기 출원들은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
<기술분야>
본 발명은 다양한 식료품에 대한 당지수 (GI) 값을 결정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 음식 성분 및 가공 식료품 둘 모두의 당지수를 결정하기 위한 정확하고 저가의 시험관내 방법을 제공한다.
식료품의 당지수에 대한 관심이 최근 수년간 상당히 증가하였다. 당지수는 인간 소화시 제공된 식료품 중 식이 탄수화물에 대한 상대적 당 반응의 지표이며, 이는 탄수화물의 흡수 및 방출 속도를 기준으로 음식을 등급매긴다. 사실상, 당지수는 소위 "좋은 탄수화물" (즉, 상대적으로 낮은 당지수를 갖는 탄수화물) 및 소위 "나쁜 탄수화물" (즉, 상대적으로 높은 당지수를 갖는 탄수화물)을 확인하게 한다. 탄수화물-의식 소비자 및 의료 종사자는 음식 선택을 돕기 위해 당지수 또는 관련 값을 사용할 수 있다.
당지수는 식후 혈당 수준의 변화를 기준으로 0 내지 100의 척도로 탄수화물을 등급매긴다. 높은 GI를 갖는 음식은 신속히 소화되고 흡수되어 이에 의해 혈당 수준의 현저한 변동을 초래하는 것으로 생각된다. 저당지수 값은 몸에 의한 더 느린 소화 및 흡수로 인해 혈당 및 인슐린 수준의 보다 단계적인 상승 및 이에 따라 평탄한 변동을 초래하는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 저당지수 음식은 55 이하의 당지수를 갖는 음식으로, 중당지수 음식은 56 내지 69의 당지수를 갖는 음식으로, 고당지수 음식은 70 이상의 당지수를 갖는 음식으로 정의된다.
고당지수 음식의 소비는 일반적으로 저당지수 음식의 소비보다 혈중 글루코스 수준의 더 높고 보다 신속한 증가를 초래하는 것으로 보인다. 혈중 글루코스의 신속한 증가는 인슐린 분비를 증가시키도록 췌장에 신호를 보낸다. 고당지수 음식의 소비에 의해 유도된 높은 인슐린 수준은 혈중 글루코스 수준의 첨예한 감소 (저혈당증)를 야기할 수 있는 반면, 저당지수 음식의 소비는 일반적으로 혈중 글루코스의 더 낮고 보다 지속적인 증가 및 더 낮은 인슐린 수요를 초래하는 것으로 생각된다. 저당 식이는 당뇨병 (1형 및 2형)이 있는 사람에서 글루코스 및 지질 수준 둘 모두를 개선시키는 것으로 보고되었다. 저당 식이는 또한 식욕을 제어하고 시장기를 지연시키는데 도움이 되기 때문에 체중 조절에 이점이 있는 것으로 보고되었다. 낮은 GI 식이는 또한 인슐린 수준 및 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있다. 하버드 공중보건대학으로부터의 최근 연구에서는, 2형 당뇨병 및 관상동맥질환과 같은 질환의 위험이 전체 식이의 당지수에 의해 강하게 영향을 받는 것으로 보고되었다. 세계보건기구 (WHO) 및 미국의 식량농업기구는 산업화된 국가의 사람들이 관상동맥질환, 당뇨병 및 비만과 같은 가장 흔한 포식병을 예방하기 위해 저당지수 음식을 기초로 한 식이를 섭취할 것을 권고하였다. 그러므로, 소비자가 저당지수 음식의 상대적 양이 고당지수 음식의 대가로 증가되도록 전체 식이를 변형할 것이 종종 권고된다. 당지수 값은 소비자 및 의료 종사자가 음식을 선택하고 특정 질환의 위험을 가능한 감소시키도록 보조하는데 사용될 수 있다.
주어진 식료품의 당지수는 통상적으로 식료품을 섭취한 인간 대상체의 군 (통상적으로 약 6명 이상의 개인)의 혈중 글루코스 수준을 모니터링함으로써 생체내에서 결정하고; 식료품에 대한 혈중 글루코스 반응을, 고정된 시간에 걸친 공지된 당지수의 대조군 물질의 섭취에 의해 자극된 반응과 비교하여, 당지수를 계산한다. 생체내 당지수 결정 방법은 일반적으로 이 분야에서 "절대 표준"으로 고려된다. 현재 인정된 시험 프로토콜에서, 탄수화물 10 내지 50 그램을 함유하는 시험 음식의 측정된 부분을 밤새 금식후 6명 이상의 건강한 사람에게 공급한다. 혈액 샘플 (통상적으로 손가락-단자로부터)을 음식 소비전 (시간 0) 및 음식 소비 직후 2시간 동안 15 내지 30분 간격으로 취하고, 혈중 글루코스 수준에 대해 분석한다. 얻어진 데이터 (전형적으로, 약 7개의 데이터 점)을 사용하여, 시험 음식 소비후 2시간 동안의 혈당 반응 곡선 (즉, 시간에 대해 플로팅된 혈중 글루코스 수준)을 제작한다. 혈당 곡선하면적은 시험 음식의 식사후 혈중 글루코스 수준의 총 상승과 관련된다. 다시 밤새 금식 후, 글루코스 당의 등가-탄수화물 부분 (정의에 의해 100의 당지수를 갖는 기준 음식) 또는 규정된 GI 값을 갖는 흰빵을 소비하는 동일한 개인에서 유사한 시험을 수행하고; 2-시간 혈중 글루코스 반응 곡선을 결정하고, 시험 음식에 대해 수행된 바와 동일한 방식으로 곡선하면적을 측정한다. 시험 음식에 대한 곡선하면적을 기준 음식에 대한 곡선하면적으로 나누고 100을 곱하여 시험 음식의 당지수를 계산한다. 표준 음식의 사용은 대상체의 물리적 및/또는 다른 특징의 차이의 중첩 영향을 감소시킬 뿐만 아니라 시험 샘플의 물리적 형태를 매칭하는데 (즉, 음료 결정을 위한 표준 수성 글루코스 용액 및 고체 음식 결정을 위한 표준 흰빵) 중요하다. 오직 약 7개의 데이터 점 (2 시간 동안)을 사용하여 혈당 곡선을 제작하고, 곡선은 이들 제한된 데이터 점을 통해 평활하게 통과하는 것으로 가정되기 때문에, 글루코스 생성이 취한 실제 데이터 점 사이에서 상당히 증가되거나 감소되는 경우에 오차가 발생할 수 있다.
모든 시험 대상체로부터의 당지수의 평균을 음식의 당지수로서 취한다. 물론, 결정 정확도는 적어도 부분적으로 시험 프로토콜에 대한 시험 대상체의 순응도, 및 개별 대상체의 물리적 및/또는 다른 특징이 시험 및 기준 음식 결정 둘 모두에서 본질적으로 일정한 상태로 유지된다는 가정의 타당성에 의존한다.
이러한 생체내 당지수 결정 방법은 일반적으로 인간 대상체를 필요로 할 뿐만 아니라 고가이고 시험 소모적이기 때문에, 시험관내 시험 프로토콜의 개발에 대한 상당한 관심이 존재해왔다. K.N. 엔글리스트(Englyst) 및 동료에 의한 연구를 기초로 하고 도 1에 예시된 한 시험관내 방법은 글루코스 수준의 결정을 위해 비색 종말점을 사용하여 소화 효소들의 혼합물과의 37℃에서의 시간이 정해진 인큐베이션 도중 시험 음식으로부터 방출된 글루코스를 측정하는 것을 포함한다 (문헌 [Englyst et al., Brit. J. Nutr., 75, 327-337 (1996)]). 이 시험관내 방법은 방출된 글루코스 양을 결정하기 위해 HPLC 종말점을 포함하도록 더 최근에 변형되었다 (문헌 [Englyst et al., Am. J. Clin. Nutr., 69, 448-454 (1999)] (이하 "엔글리스트 방법" 또는 "시험관내 엔글리스트 방법"이라고 함)).
엔글리스트 방법은 공지된 양의 시험 음식 (일반적으로 탄수화물 약 0.5 g을 함유함)을 저미는 (또는 달리 파쇄하거나 부수는) 것을 포함한다. 저민 샘플을 펩신 (5 g/l; 단백질의 가수분해를 수행하기 위함) 및 구아 검 (5 g/l; 분석에 걸쳐 음식 입자를 현탁액으로 유지하는데 도움을 주기 위함)을 함유하는 0.05 M HCl 10 ㎖에서 혼합하면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 이 초기 인큐베이션 후, 0.5 M 아세트산나트륨을 사용하여 샘플을 pH 5.2로 완충한다. 그 후, 효소 혼합물 (특정량의 판크레아틴, 아밀로글루코시다제 및 인버타제를 함유함)을 완충된 샘플에 첨가하고, 샘플을 37℃의 진탕 수조에 위치시킨다 (시간 = 0). 작은 유리 볼은 주요 인큐베이션 도중 샘플의 물리적 구조를 기계적으로 파괴하기 위해 샘플에 포함되고; 첨가된 구아 검은 샘플의 점도를 안정화시킴으로써 샘플을 현탁액으로 유지시키는데 도움을 준다. 주요 인큐베이션으로 정확히 20분에, 샘플의 분취액을 제거하고, 가수분해를 정지시키기 위해 무수 에탄올을 혼합하면서 첨가하고; HPLC를 사용하여 G20 (즉, 20분후 방출된 글루코스; 또한 "신속히 이용가능한 글루코스" 또는 RAG라고도 함)을 결정하기 위해 이 샘플을 사용한다. 샘플의 나머지를 추가 100분 동안 37℃ 조에서 유지시키고, 이 때 샘플의 제2 분취액을 제거하고, 가수분해를 정지시키기 위해 무수 에탄올을 혼합하면서 첨가하고; HPLC를 사용하여 G120 (즉, 120분후 방출된 글루코스)을 결정하기 위해 이 샘플을 사용한다. 그 후, 추가 효소를 첨가한 후 완전한 가수분해를 위해 100℃ 이하의 온도에 노출함으로써, 샘플의 나머지를 도 1에 예시된 바와 같이 처리하고, 그러므로 샘플 중 총 글루코스를 결정한다.
생체내 시험 방법을 사용하여 당지수를 측정한 음식과 비교하여, 엔글리스트 방법을 사용하여 결정된 G20 또는 신속히 이용가능한 글루코스 값은 공지된 음식의 생체내 당지수 값과 상관관계가 있을 수 있다. 이러한 상관계수를 사용하여 시험 음식에 대한 당지수 값을 추정하는데 엔글리스트 방법을 사용할 수 있다.
그러나, 시험관내 엔글리스트 방법은 특히 생체내 당지수 방법의 제안자들로부터 상당한 비판을 받았다. 예를 들어, 문헌 [Garsetti et al., J. Am. Coll. Nutr., 24, 441-447 (2005)]은 엔글리스트 방법을 사용하여 당지수 값 (즉, 신속히 이용가능한 글루코스 값)을 추정한 후, 이를 약 35 내지 60 범위의 당지수를 갖는 식료품 (즉, 쿠키)에 대한 생체내 결정된 값과 비교하였다. 가르세티(Garsetti) 등 (본원에 참고로 도입됨)의 도 2에 나타낸 바와 같이, 생체내 결정된 당지수 값 대 신속히 이용가능한 글루코스 값 (즉, 엔글리스트 방법에 의해 결정됨)의 산점도는 0.25의 R2 값을 갖는 산점도를 산출하였고, 이는 시험관내 방법이 예측 값을 거의 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
문헌 [Brand-Miller et al., Eur. J. Clin. Nutr., 58, 700-701 (2004)]은 엔글리스트 시험관내 시험 방법에 의해 결정된 저당지수 값 (즉, ≤55)을 갖는 것으로 보고된 상업적으로 이용가능한 음식 (1종의 아침식사용 시리얼 및 2종의 스낵바)에 대한 생체내 당지수 값을 결정하였다. 브랜드-밀러(Brand-Miller) 등에 따라, 3종의 식료품은 각각 75 ± 3, 68 ± 5 및 65 ± 5의 평균 생체내 당지수 값 (± sem)을 가지므로, 저당지수 식료품으로서 분류될 수 없었다. 이들 저자들은 "생체내 시험의 고된 노역이 더이상 음식에 대한 GI 값의 측정을 위해 필수적이 아니다"라는 가정이 단순히 옳지 않다는 결론을 내렸고, "음식 표지 목적을 위해 GI 값을 얻기 위한 임의의 시험관내 방법을 사용하는 것에 대해 반대하여 강하게 충고한다." 마지막으로, 저자들은 "음식 제품을 표준화된 생체내 방법을 사용하여 경험된 실험실에서만 GI 시험을 수행할 것을 촉구한다."
식료품의 당지수 값을 결정하기 위한 정확하고 정교하고 재현가능한 시험관내 방법에 대한 필요성이 당분야에 명백히 여전히 존재한다. 또한, 고체 및 액체 식료품을 포함하는 다양한 식료품에 적용될 수 있는 이러한 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 시험관내 시험 방법을 제공한다.
<발명의 요약>
본 발명은 효소에 의한 식료품의 모의 소화를 이용하여 생성된 당/당 알콜, 단백질 및 지방의 수준으로부터 식료품의 당지수를 예측하는, 개선된 시험관내 분석 방법을 제공한다. 현재 당지수 결정 방법은 일반적으로 인간 대상체를 필요로 하고 비용 소모적이고 시간 소모적이다. 본 발명의 방법은 인간 대상체를 사용하는 전통 방법과 비교하여 상당히 감소된 비용으로 1명의 분석가에 의해 1일 내에 최대 약 15개의 음식 샘플의 당지수를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 당지수 값은 인간 대상체를 사용하는 전통 방법을 사용하여 얻은 결과와 매우 높은 상관관계를 나타낸다. 또한, 이러한 본 발명의 방법은 고체 식료품 뿐만 아니라 반고체 식료품 (예를 들어, 요거트 등) 및 액체 식료품 (예를 들어, 음료 등)을 포함하는 다양한 식료품에서 사용될 수 있다.
본 발명은
(1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
(2) 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공하여 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
(3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
(4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
(5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
(6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 공지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
(2) 시험 식료품을 본질적으로 액체 질소 온도에서 분쇄하여 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공함으로써 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
(3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
(4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
(5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
(6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 공지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명의 시험관내 방법은 현재 이용가능한 시험관내 방법과 비교하여 상당히 개선된 정확도 및 정밀도로 고체, 반고체 및 액체 식료품의 당지수 값을 결정하는데 사용될 수 있다. 확실하게, 현재 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 정확도 및 정밀도는 시간 및 비용 둘 모두를 상당히 절약하면서 상업적으로 이용가능한 생체내 방법에 필적한다.
본 발명의 목적을 위해, "본질적으로 균질하고 미분된 상태"는 식품이 부서지기 쉬운 고체가 되도록 충분히 저온에서의 식품의 분쇄와 등가의 분쇄 정도를 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 약 -40℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 -78℃ 미만의 온도, 보다 바람직하게는 대략 액체 질소를 사용하여 수득가능한 온도 (-196℃)가 주변 온도에서 고체 또는 반고체인 대부분의 식품의 분쇄에 충분하다. 주변 온도 고체 물질이 이러한 저온 분쇄 전에 부서지거나 거칠게 분쇄되는 것이 또한 일반적으로 바람직하다. 한 바람직한 실시양태에서, 특히 주변 온도에서 고체 또는 반고체 물질의 경우에, 분쇄는 액체 질소 온도에서 또는 액체 질소 온도에 가까운 온도에서 액체 질소-냉각 분쇄 밀을 사용하여 달성된다. 많은 경우에, 액체 식료품은 본질적으로 균질하고 구성성분이 담체에 가용성이기 때문에 임의의 분쇄를 필요로 하지 않을 것이나; 필요하다면, 이러한 액체 식료품도 또한 더 낮은 온도에서 분쇄될 수 있다. 반고체 물질은 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 이러한 저온 분쇄를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 플레인 요거트는 추가로 분쇄될 필요가 없는 반면, 과일 또는 다른 고체 성분을 포함하는 요거트는 바람직하게는 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 저온에서 분쇄된다. 요구되는 "균질하고 미분된 상태"에 대한 추가 안내는 본 명세서에 포함된 예에서 찾을 수 있다.
바람직하게는, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 등가의 정량 방법을 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 고성능 이온 크로마토그래피 (HPIC)가 효소에 의한 처리 중에 방출된 당의 양을 결정하는데 사용된다. 보다 바람직하게는, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨의 양은 고성능 이온 크로마토그래피 (HPIC)를 사용하여 결정된다.
도 1은 당지수 및 관련 값을 추정하기 위한 시험관내 선행 기술 방법 (즉, 엔글리스트 방법)을 기술하는 흐름도를 제공한다.
도 2는 본 발명의 시험관내 방법을 예시하는 흐름도를 제공한다.
도 3은 실시예 1에 기재된 시험관내 방법에서 얻어진 혼합된 표준 (패널 A) 및 전형적인 비공지된 샘플 (패널 B)의 전형적인 크로마토그램을 제공한다.
도 4A는 실시예 2에서의 데이터를 기준으로 신경망 곡선 적합 절차에 의한 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 시험관내 당지수 값 및 공지의 생체내 당지수 값의 비교를 제공하며; 본 발명의 방법은 R2에 대한 0.97의 값을 산출하였다. 도 4B 및 4C는 실시예 2로부터의 데이터를 사용하여 엔글리스트 방법 (즉, 오직 20분 소화 후 글루코스 방출을 기준으로 함)에서 사용되는 계산 기술을 사용하여 얻은 신속히 이용가능한 글루코스 (RAG, 음식 100 g 당 20분 내에 방출된 글루코스 그램으로서 표현됨) 및 공지의 생체내 당지수 값의 비교를 제공한다. 도 4B는 생체내 GI 대 RAG/(이용가능한 탄수화물 ％)를 플롯팅하고; 도 4C는 생체내 GI 대 RAG를 플롯팅한다. 실시예 2의 데이터 세트에 대해 엔글리스트 계산 기술을 사용하여 도 4B 및 4C에 나타낸 산점도에 대해 각각 0.41 및 0.68의 R2 값을 산출하였다.
도 5A는 실시예 3에서의 데이터를 기준으로 다중 선형 회귀법 곡선 적합 절차에 의한 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 시험관내 당지수 값 및 공지의 생체내 당지수 값의 비교를 제공하며; 본 발명의 방법은 R2에 대한 0.94의 값을 산출하였다. 도 5B 및 5C는 실시예 3으로부터의 데이터를 사용하여 엔글리스트 방법 (즉, 오직 20분 소화 후 글루코스 방출을 기준으로 함)에서 사용되는 계산 기술을 사용하여 얻은 신속히 이용가능한 글루코스 (RAG, 음식 100 g 당 20분 내에 방출된 글루코스 그램으로서 표현됨) 및 공지의 생체내 당지수 값의 비교를 제공한다. 도 5B는 생체내 GI 대 RAG/(이용가능한 탄수화물 ％)를 플롯팅하고; 도 5C는 생체내 GI 대 RAG를 플롯팅한다. 실시예 3의 데이터 세트에 대해 엔글리스트 계산 기술을 사용하여 도 5B 및 5C에 각각 나타낸 산점도에 대해 각각 0.56 및 0.58의 R2 값을 산출하였다.
도 6은 실시예 4에서의 데이터를 기준으로 신경망 곡선 적합 절차에 의한 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 시험관내 당지수 값 및 공지의 생체내 당지수 값의 비교를 제공하며; 본 발명의 방법은 R2에 대한 0.96의 값을 산출하였다.
본 발명은 효소에 의한 식료품의 모의 소화를 이용하여 생성된 당/당 알콜, 단백질 및 지방의 수준으로부터 식료품의 당지수를 예측하는, 개선된 시험관내 분석 방법을 제공한다. 현재 당지수 결정 방법은 일반적으로 인간 대상체를 필요로 하고 비용 소모적이고 시간 소모적이다. 본 발명의 방법은 인간 대상체를 사용하는 전통 방법과 비교하여 상당히 감소된 비용으로 1명의 분석가에 의해 1일 내에 최대 약 15개의 음식 샘플의 당지수를 결정할 수 있다. 또한, 인간 대상체의 스크리닝에 대한 행정상 부담, 충분한 설명에 입각한 동의를 얻는 것 등이 본 발명에서 방지된다. 본 발명의 방법을 사용하여 결정된 당지수 값은 인간 대상체를 사용하는 전통 방법을 사용하여 얻은 결과와 매우 높은 상관관계를 나타낸다. 확실하게, 시험관내 방법은 임상 생체내 방법으로부터의 결과보다 더 정밀한 결과를 산출할 수 있다. 시험관내 방법에서 사용된 보정 샘플의 수가 생체내 방법을 사용하는 단일 결정을 위해 사용된 것보다 더 크기 때문에 (추가 보정 샘플 (즉, 공지된 생체내 GI 값을 갖는 샘플)이 도입되기 때문에 계속 증가할 수 있음), 시험관내 방법을 보정하기 위해 사용된 생체내 데이터 (이로부터 시험관내 GI 결과를 유도함)는 임의의 단일 생체내 시험에서 사용된 것보다 훨씬 더 많은 수의 인간 대상체의 혈중 글루코스 수준 결과를 기초로 한다. 또한, 이러한 본 발명의 방법은 고체 식료품 뿐만 아니라 반고체 식료품 (즉, 요거트 등) 및 액체 식료품 (즉, 음료 등)을 포함하는 다양한 식료품에서 사용될 수 있다.
본 발명은
(1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
(2) 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공하여 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
(3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
(4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
(5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
(6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 공지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명은 또한
(1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
(2) 시험 식료품을 본질적으로 액체 질소 온도에서 분쇄하여 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공함으로써 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
(3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
(4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
(5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
(6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 공지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명의 시험관내 방법은 현재 이용가능한 시험관내 방법과 비교하여 상당히 개선된 정확도 및 정밀도로 고체, 반고체 및 액체 식료품의 당지수 값을 결정하는데 사용될 수 있다. 확실하게, 현재 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 정확도 및 정밀도는 시간 및 비용 둘 모두를 상당히 절약하면서 상업적으로 이용가능한 생체내 방법에 필적하는 것으로 보인다.
본 발명의 목적을 위해, "본질적으로 균질하고 미분된 상태"는 식품이 부서지기 쉬운 고체가 되도록 충분히 저온에서의 식품의 분쇄와 등가의 분쇄 정도를 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로, 약 -40℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 -78℃ 미만의 온도, 보다 바람직하게는 대략 액체 질소를 사용하여 수득가능한 온도 (-196℃)가 주변 온도에서 고체 또는 반고체인 대부분의 식품의 분쇄에 충분하다. 주변 온도 고체 물질이 이러한 저온 분쇄 전에 부서지거나 거칠게 분쇄되는 것이 또한 일반적으로 바람직하다. 한 바람직한 실시양태에서, 특히 주변 온도에서 고체 또는 반고체 물질의 경우에, 분쇄는 액체 질소 온도에서 또는 액체 질소 온도에 가까운 온도에서 액체 질소-냉각 분쇄 밀을 사용하여 달성된다. 많은 경우에, 액체 식료품은 본질적으로 균질하고 구성성분이 담체에 가용성이기 때문에 임의의 분쇄를 필요로 하지 않을 것이나; 필요하다면, 이러한 액체 식료품도 또한 더 낮은 온도에서 분쇄될 수 있다. 반고체 물질은 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 이러한 저온 분쇄를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 플레인 요거트는 추가로 분쇄될 필요가 없는 반면, 과일 또는 다른 고체 성분을 포함하는 요거트는 바람직하게는 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 저온에서 분쇄된다. 요구되는 "균질하고 미분된 상태"에 대한 추가 안내는 본 명세서에 포함된 예에서 찾을 수 있다.
바람직하게는, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 등가의 정량 방법을 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 고성능 이온 크로마토그래피 (HPIC)가 효소에 의한 처리 중에 방출된 당 및/또는 당 알콜의 양을 결정하는데 사용된다. 보다 바람직하게는, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨의 양은 고성능 이온 크로마토그래피 (HPIC)를 사용하여 결정된다. 물론, 특정 음식 샘플의 경우에, 소화 샘플은 1종 이상의 이들 당 또는 당 알콜에 대해 본질적으로 0으로 결정될 수 있다 (즉, 특정 당 또는 당 알콜이 존재하지 않을 수 있음). 상기 경우에, 특정 당 및/또는 당 알콜과 관련된 용어 또는 용어들은 0 (또는 0에 가까움)일 것이고, 상기 당 및/또는 당 알콜에 대한 GI에 대한 기여도는 최소일 것이다.
현재 말티톨은 식료품에서 통상적으로 접하는 수준의 혈당 농도에 대한 인식가능한 효과를 갖는 것으로 과학 문헌에 나타난 유일한 당 알콜인 것으로 보인다. 적절한 컬럼에 의한 HPIC는 많은 추가 당 및 당 알콜 (말티톨만은 아님)을 결정할 수 있기 때문에, 추가 당 및 당 알콜이 필요하다면 분석 및 보정 단계에 포함될 수 있다.
탄수화물의 표준화된 양을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물에 의한 소화 단계에서 사용하여, 소화된 샘플을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 소화 단계에서 사용된 본질적으로 균질하고 미분된 시험 음식 샘플의 양은 이용가능한 탄수화물의 "표준화된 양"을 함유해야 한다. 이러한 이용가능한 탄수화물의 표준화된 양은 당 및 당 알콜의 정확한 결정을 위해 충분한 당 및/또는 당 알콜이 소화 단계에서 얻어지도록 선택되고; 또한 이러한 이용가능한 탄수화물의 표준화된 양은 소화 효소가 유사한 양의 기질에 작용하게 하도록 한다. 실시예 1에 예시된 특정 프로토콜에서, 일반적으로 이용가능한 탄수화물의 표준화된 양이 약 0.2 내지 약 1 g의 범위, 보다 바람직하게는 약 0.5 g이어야 한다는 것이 밝혀졌다. 당 및 당 알콜의 충분히 정확한 결정이 얻어질 수 있다면, 더 많은 양 또는 더 적은 양이 사용될 수 있다. 물론, 표준화된 양이 선택되면, 그 양은 바람직하게는 모든 결정에서 사용된다 (방법의 보정에 사용되는 것 및 뿐만 아니라 보정된 경우 비공지된 샘플을 포함함). 이러한 방법의 목적을 위해, 이용가능한 탄수화물 함량은 총 탄수화물 함량 - 식이 섬유 함량 - 말티톨 이외의 당 알콜의 총 함량으로서 정의된다. 말티톨 이외의 추가 당 알콜이 분석 및 보정에 포함되면, 샘플 중 상기 당 알콜의 함량이 이용가능한 탄수화물로서 포함될 필요가 있을 것이다.
유사하게, 소화 단계를 위한 고정된 기간은 생성된 당 및 당 알콜의 정확한 결정을 위해 충분한 당 및/또는 당 알콜을 제공하도록 선택된다. 실시예 1에 예시된 특정 프로토콜에서, 일반적으로 고정된 기간이 약 15 내지 약 25분의 범위, 보다 바람직하게는 약 20분이어야 한다는 것이 밝혀졌다. 당 및 당 알콜의 정확한 결정을 허용하는 당 및/또는 당 알콜의 충분한 양이 생성된다면, 더 짧은 소화 시간 또는 더 긴 소화 시간이 사용될 수 있다. 물론, 고정된 시간이 선택되면, 상기 값은 모든 결정에서 사용되어야 하며 (방법의 보정에 사용되는 것 및 뿐만 아니라 보정된 경우 비공지된 샘플을 포함함); 다시 말해서, 표준화된 소화 시간이 모든 보정 및 비공지된 샘플 결정 전반에서 사용되어야 한다. 일반적으로, 선택된 고정된 시간의 약 ± 10초 내에, 보다 더 바람직하게는 약 ± 5초 내에 소화 단계를 정지시키는 노력을 해야 한다.
도 2는 본 발명의 한 실시양태를 예시한다. 방법은 주변 온도에서 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는 시험 음식 샘플에 의해 시작된다. 상기 나타낸 바와 같이, 시험 식료품은 "본질적으로 균질하고 미분된 상태"로 제공되어야 한다. 주변 온도에서 대부분의 고체 또는 반고체 음식의 경우에, 이는 식품이 부서지기 쉬운 고체가 되도록 충분히 저온에서의 식품의 분쇄에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 약 -40℃ 미만의 온도, 바람직하게는 약 -78℃ 미만의 온도, 보다 바람직하게는 대략 액체 질소를 사용하여 수득가능한 온도가 주변 온도에서 고체 또는 반고체인 대부분의 식품의 분쇄에 충분하다. 주변 온도 고체 물질이 이러한 저온 분쇄 전에 부서지거나 거칠게 분쇄되는 것이 또한 일반적으로 바람직하다. 그러므로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 시험 음식 샘플을 바람직하게는 거칠게 분쇄하여 샘플을 더 작은 입자로 단순히 부순 후, 미세하게 분쇄하여 본질적으로 균질하고 미분된 샘플을 얻는다. 한 바람직한 실시양태에서, 특히 주변 온도에서 고체 또는 반고체 물질의 경우에, 미세 분쇄는 액체 질소 온도에서 또는 액체 질소 온도에 가까운 온도에서 액체 질소-냉각 분쇄 밀을 사용하여 달성된다. 많은 경우에, 액체 식료품은 본질적으로 균질하고 구성성분이 담체에 가용성이기 때문에 임의의 분쇄를 필요로 하지 않을 것이나; 필요하다면, 이러한 액체 식료품도 또한 더 낮은 온도에서 분쇄될 수 있다. 반고체 물질은 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 이러한 저온 분쇄를 필요로 하거나 필요로 하지 않을 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 플레인 요거트는 추가로 분쇄될 필요가 없는 반면, 과일 또는 다른 고체 성분을 포함하는 요거트는 바람직하게는 본질적으로 균질하고 미분된 상태를 얻기 위해 저온에서 분쇄된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, "본질적으로 균질하고 미분된 상태"의 얻어진 입자 크기 범위를 특정하는 것은 필수적이지 않고 정말로 어려울 것이다. 이러한 방법에 의한 분석에 적합한 대부분의 음식 샘플은 상당한 수분 수준을 함유할 것이다. 그러므로, 액체 질소 온도에서 분쇄하는 경우에도 (고체는 이러한 온도에서 부서지기 쉬운 성질 때문에 더 쉽게 분쇄될 것임), 입자는 물 함량 때문에 주변 온도로 다시 되돌아 올 경우 응집할 수 있다. 이는 저온에서의 분쇄에 의해 수득가능한 균질성 및 미분된 상태이며, 이는 적어도 부분적으로 본 방법의 정확도 및 정밀도를 가능하게 하는 것으로 보인다. 그러므로, 대부분의 경우에, 저온 분쇄의 사용은 균질하고 미분된 혼합물 (특히 고도의 불균질성을 갖는 샘플, 예컨대 초콜릿 칩 쿠키, 트레일 믹스 등)을 생성하는 가장 적절한 수단이다. 그러나, 샘플이 물리적-입체장애 전분 (예컨대, 무손상 또는 부분적 무손상 세포벽에 의해 소화 효소로부터 보호됨)을 함유하는 경우에, 거친 분쇄 또는 파쇄로부터 소화로 직접 진행시키는 것이 더 적절할 수 있으며, 이는 세포 구조의 파괴가 전분이 소화 효소에 너무 접근할 수 있도록 만들어서 잘못되게 높은 GI 수를 초래할 수 있다. 그러므로, 감자칩과 같은 샘플은 바람직하게는 저온에서 분쇄되지 않는다. 감자칩이 저온하에 미세 분말로 분쇄되는 경우에, 얻어진 분석은 약 70 내지 75의 GI 값을 산출한다. 감자칩이 오직 거칠게 분쇄된 경우에 (감자칩은 주변 온도에서 부서지기 쉽기 때문에 수행하기 용이함), 얻어진 분석은 약 55 내지 60의 GI 값을 산출하며, 이는 문헌의 값과 더 일치한다 (문헌 [Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002)]은 평균 값을 54±3으로 보고함). 그러므로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 샘플 제조 기술은 전분 소화의 속도를 늦출 수 있는 본래의 구조의 명백한 파괴 없이 샘플 불균질성의 감소의 균형이다.
샘플이 원하는 균질하고 미분된 상태이면, 이를 소화 프로세스를 모방하기 위해 효소 소화로 처리한다. 바람직하게는 단백질의 가수분해의 시작을 위해 펩신을 첨가한다. 그 후, 효소들의 혼합물을 사용하여, 샘플에 존재하는 탄수화물을 소화하여 당을 생성하고 샘플에 존재할 수 있는 유리 당 및 당 알콜을 가용화한다. 중요하게는, 표준화된 조건은 표준 (둘다 모델 계수를 먼저 결정한 후 전체 방법에 대한 체크로서) 및 비공지된 샘플을 결정하는 경우에 사용된다. 이들 표준화된 조건은 다양할 수 있으나, 일단 선택되면, 방법의 보정 및 그 후 비공지된 샘플의 결정 전반에서 가능한 한 근접하게 유지되어야 한다. 일반적으로, 효소들의 혼합물은 본질적으로 모든 탄수화물을 당으로 전환하고 샘플 중 임의의 유리 당 또는 당 알콜을 가용화하기에 충분한 양으로 판크레아틴, 아밀로글루코시다제 (AMG) 및 인버타제를 함유한다. 효소 혼합물과의 인큐베이션은 일반적으로 37℃에서 20분 동안 수행되고; 한번 더 인큐베이션을 위해 사용되는 정확한 온도 및 시간 (효소가 작용하는 한)은 보정 프로세스 및 비공지된 샘플 결정 전반에서 동일한 인큐베이션 온도 및 소화 시간 (즉, 소화를 위한 고정된 시간)을 사용하는 것보다 덜 중요하다.
인큐베이션이 원하는 시간 (즉, 20분 ± 10초의 표준화된 시간) 동안 수행되면, 효소 반응은 즉시 정지된다. 바람직하게는, 효소 반응을 즉시 정지시키기 위해 에탄올을 첨가한다. 그 후, 존재할 수 있는 임의의 침강물 또는 미립자 물질 및 수집된 샘플을 제거하기 위해 바람직하게는 샘플을 여과한다. 중요하게는, 인큐베이션이 시작되는 시간부터 샘플을 수집하는 시간까지 (즉, 효소 반응이 정지된 후), 전체 또는 완전한 샘플을 유지한다. 즉, 이 시간 동안 샘플을 분리하거나 분할하지 않는다 (효소 반응이 정지된 후 여과 제외). 이 작업 도중 샘플의 물리적 완전성을 유지하는 것은 불균질한 혼합물일 수 있는 것을 샘플링하는 것과 관련된 오차를 방지한다. 그러므로, 예를 들어, 엔글리스트 방법은 20분 소화 후 소화 혼합물로부터 분취액을 취할 때 유의한 샘플링 오차를 도입할 수 있으며, 이는 이때 혼합물은 일반적으로 현탁액 형태이기 때문이다. 본 방법은 이러한 문제점을 방지한다.
소화 혼합물로부터 최종 샘플을 수득하면 (바람직하게는 남아있는 임의의 고체 물질을 제거하기 위한 여과 후), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 등가의 정량 방법을 사용하여 당 및 당 알콜 함량을 측정한다. 바람직하게는, 고성능 이온 크로마토그래피 (HPIC)를 사용하며, 이는 상기 기술이 일반적으로 당, 특히 글루코스 및 갈락토스의 우수한 분리를 제공하고, 동일한 분리에서 당 및 당 알콜 (예를 들어, 말티톨) 둘 모두의 결정을 허용하고, 일반적으로 펄스된 전기화학적 검출의 고도로 선택적인 성질로 인해 덜 간섭하는 경향이 있기 때문이다. 적합한 장비 및 작동 조건은 실시예 1에 예시된다. 한번 더, 당업자가 인식하는 바와 같이, 특정 장비 및 작동 파라미터는 표준화된 조건을 결정하고 그 후 이를 유지하는 것보다 덜 중요하다. 바람직하게는, 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정한다. 보다 더 바람직하게는, 소화 샘플 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨의 양을 결정한다. 상기 주목된 바와 같이, 추가 당 및 당 알콜이 필요하다면 분석 및 보정 단계에 포함될 수 있다.
또한, 시험 음식 샘플에 대한 단백질 및 지방 함량을 결정한다. 이들 파라미터는 표준 및 종래의 분석 기술을 사용하여 결정할 수 있고/거나 시험 음식 샘플의 성분들을 기준으로 계산할 수 있다. 당지수에 대한 예측된 값의 결정은 예를 들어, 다중 선형 회귀법 (MLR), 부분 최소 제곱법 (PLS) 또는 신경망 곡선 적합 절차와 같은 다변량 분석을 사용하여 수행한다. 신경망 곡선 적합 절차가 실시예에서 생성된 데이터에 최량 적합을 제공하는 것으로 보이므로 일반적으로 바람직하다 (도 4A에서 산점도를 참조함). 상기 HPIC 절차를 통해 소화 혼합물을 분석하여, 최종 샘플 소화물 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨 함량에 대한 정량 값을 얻는다. 상기 값을 원래의 샘플의 총 단백질 ％ 및 지방 ％와 함께 바람직하게는 적합한 통계 소프트웨어 프로그램 (예를 들어, JMP 통계 소프트웨어)에 도입하고, 그 후 적절한 예측 또는 상관관계 식 또는 예측 기술을 기준으로 원래의 샘플의 GI 값을 예측한다.
예측 식 또는 예측 기술은 임상 또는 생체내 GI 값이 공지된 보정 세트에 대한 데이터로부터 유도된다. 이는 도 2에 예시되며, 여기서 점선 화살표는 예측 식 또는 예측 기술을 위한 파라미터의 결정을 지시하는데 사용된다. 상기 및 실시예 1에 상세히 기재된 바와 동일한 표준화된 조건 및 절차를 사용하여 데이터를 결정한다. 실시예 1에서 사용된 보정 세트는 임상 GI 값이 공지된 일련의 순수한 표준 및 식료품을 포함한다. 실시예 1에서 사용된 보정 표준은 19 내지 100의 GI 값의 범위에 미치고, 보정에서 다른 음식 샘플과 정확히 동일한 방식으로 처리된다. 모든 보정 샘플 및 표준, 및 이후 모든 비공지된 샘플은 동일한 표준화된 조건 및 절차를 사용하여 분석되어야 한다. 적절한 소프트웨어를 사용하여, 임상 생체내 GI 값 및 예측 변수 간의 상관관계에 대한 최량 적합의 식 또는 다른 관계를 유도하기 위해 보정 샘플 및 표준으로부터의 데이터를 사용한다. 바람직하게는, 다변량 분석 기술 (예를 들어, MLR, PLS 또는 신경망 방법)을 사용한다. 새롭게 이용가능한 보정 샘플 또는 표준으로부터의 추가 생체내 데이터를 필요하다면 모델에 도입하여, 식 또는 예측 기술의 예측 변수를 업데이트하고 개선할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 바람직하게는 보정에서 상기 나열된 모든 당 및 말티톨을 포함한다. 그러나, 접할 가능성이 있는 샘플이 구성성분들 중 몇몇을 포함하지 않는 것으로 공지된 경우에, 이는 보정에서 제외될 수 있다 (예를 들어, 말티톨, 갈락토스). 마찬가지로, 식료품과 관련된 추가 파라미터 또는 측정치 (예를 들어, 유기산 함량, β-글루칸 함량, 등)가 포함될 수 있다. 인버타제는 존재하는 임의의 수크로스를 글루코스 및 프룩토스로 전환할 것으로 예상되기 때문에 소화 샘플 중 수크로스의 양은 전형적으로 본질적으로 0인 것으로 발견된다. 필요하다면, 수크로스의 결정은 내부 체크로서 사용될 수 있다. 그러므로, 방법이 적절하게 수행된 경우에, 수크로스의 수준은 본질적으로 0이어야 하고; 유의한 양의 수크로스가 검출된 경우에, 분석을 의심하고 샘플을 반복해야 한다. 물론, 효과적인 내부 표준으로서 수크로스를 사용하는 이러한 방법은 방법을 위해 선택된 표준화된 조건 및 파라미터가 정말로 소화 샘플 중 수크로스가 본질적으로 함유되지 않는 결과를 가져오는 경우에만 사용되어야 한다. 샘플이 인버타제 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 함유하는 경우에, 남은 수크로스를 정량하는 능력은 시험관내 GI 값의 계산에서 억제 효과를 고려하는 보정 데이터 세트의 개발에서 유용할 수 있다.
<실시예>
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 의도되며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 백분율 및 비율은 중량을 기준으로 한다. 본원에 인용된 모든 공개물은 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1. 본 실시예는 방법의 보정 및 비공지된 샘플의 결정 둘 모두를 위한 본 발명의 시험관내 당지수 결정을 수행하기 위한 상세한 분석 프로토콜을 제공한다. 특정 장비, 시약 및/또는 특정 절차 및 작동 파라미터가 제안되는 모든 경우에 등가의 장비, 시약 및/또는 특정 절차 및 작동 파라미터를 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
장치:
1. 온도-제어된 진탕 수조 (약 175 스트로크/분일 수 있음);
2. 볼텍스 믹서;
3. 분석 균형 (± 0.0001 g 내로 정확함);
4. 부피 플라스크, 클래스 A, 100 ㎖, 1000 ㎖;
5. 피펫, 클래스 A, 1 ㎖, 2 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 10 ㎖;
6. 유리볼, 6 mm (피셔(Fisher) #11-312-D 또는 등가물);
7. 스크류 캡이 있는 유리 샘플 바이알 (40 ㎖) (VWR #66014-389 또는 등가물);
8. 스크류 캡이 있는 플라스틱 원심분리 튜브 (50 ㎖) (VWR #21008-730 또는 등가물);
9. 원심분리;
10. 스펙스 서티프렙(Spex CertiPrep) 6850 동결기 밀 또는 등가물;
11. 1 Qt. 입구가 넓은 메이슨(Mason) 용기;
12. 필터 깔대기;
13. 와트만(Whatman) #4 급속 여과지, 12.5 cm 원, 또는 등가물;
14. 링 스탠드;
15. 애노탑(Anotop) 10 플러스 0.2 ㎛ 10 mm 직경 주사기 필터;
16. 하기 "HPIC 절차" 부분에 나열된 HPIC 장비 및 시약; 및
17. JMP 통계 소프트웨어, 버젼 5.1, SAS 인스티튜트(Institute), 또는 등가물.
시약:
1. 0.5 N 염산 (HCl) (VWR #VW3201-1);
2. 아세트산나트륨 (NaAc) (Acros #42425-5000);
3. 에틸 알콜 USP, 190 프루프(proof) - 95％ (95％ EtOH) (에이아퍼 알콜 & 케미칼 캄파니(Aaper Alcohol & Chemical Co.));
4. 제빵용 효모로부터의 인버타제, 215 U/mg 고체 (시그마(Sigma) #I-9274);
5. 아밀로글루코시다제 (AMG), 300 U/㎖ (노보자임스(Novozymes) #AMG 300 L) (주: 0 내지 25℃에서 저장해야 하고 배송일로부터 3개월 내에 사용해야 함);
6. 돼지 위 점막으로부터의 펩신, 439 U/mg 고체 (시그마 #P-7000);
7. 구아 검 (시그마 #G4129-250G);
8. 돼지 췌장으로부터의 판크레아틴 (시그마 #P-7545);
9. 탈이온수 (H2O); 및
10. 액체 질소; 및
11. 무수 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 갈락토스 및 말티톨의 순수한 표준 (최소 99％ 순도, 시그마 알드리히 캄파니(Sigma Aldrich Company) 또는 등가물; 사용하지 않을 때는 건조기에서 저장해야 함).
용액:
1. 0.05N HCl 용액 (0.5N HCl 100 ㎖를 탈이온수에 의해 1000 ㎖로 희석함);
2. 펩신/구아 검 용액 (0.05 N HCl 중 2195 U/㎖ 펩신 및 0.5％ 구아 검 (W/V)) - 펩신 0.5 g 및 구아 검 0.5 g을 0.05 N HCl 100 ㎖에 용해함;
3. 인버타제 스톡 용액 (H2O 중 510.7 U/㎖) - 인버타제 100 mg을 H2O 42.10 ㎖에 용해함;
4. 0.5 M 아세트산나트륨 용액 (H2O 중 0.5 M NaAc) - 아세트산나트륨 4.10 g을 H2O 100 ㎖에 용해함;
5. 66％ 에틸 알콜 용액 (66％ EtOH) (V/V) - 에틸 알콜 347 ㎖를 탈이온수 153 ㎖과 1 쿼트 메이슨 용기에서 혼합하고 캡핑함; 이는 1개의 샘플에 충분한 용액임; 및
6. 효소 용액 (1개의 샘플에 대한 레시피 - 136 mg/㎖ 판크레아틴, 13.4 U/㎖ AMG 및 25.43 U/㎖ 인버타제):
i. 판크레아틴 1.0 g을 50 ㎖ 원심분리 튜브에 중량측정하여 넣고;
ii. H2O 6.67 ㎖를 첨가하고, 10분 동안 볼텍스 혼합하여 완전히 용해시키고 (여러 샘플에서 사용하기 위한 용액을 제조하는 경우에 교반 막대 또는 유리볼이 필요할 수 있음);
iii. 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고;
iv. 각 시험 샘플에 대해, 상등액 6 ㎖를 다른 50 ㎖ 원심분리 튜브로 이동시키고, AMG 296 ㎕ 및 인버타제 스톡 용액 330 ㎕를 첨가하였다.
고체 샘플을 위한 샘플 제조:
1. 샘플을 워링(Waring) 실험실 미립화기에 넣고, 샘플이 잘 혼합될 때까지 분쇄하였다 (일반적으로 30 내지 60초면 충분함).
2. 그 후, 미립화기로부터의 서브샘플 100 g 당 3 온스를 스펙스 서티프렙 6850 동결기/밀에서 극저온으로 분쇄하였다. 스펙스 서티프렙 6850 동결기/밀은 액체 질소에 의해 냉각된 충격 분쇄기이다. 냉각에 의해 부서지기 쉬운 샘플을 바이알의 말단 플러그에 대한 충격기의 해머링에 의해 분말화하였다. 샘플은 분쇄 바이알 (#6801)의 높이의 약 1/3 내지 약 1/2를 차지해야 하였다.
3. 6850 동결기/밀을 그의 키보드를 사용하여 프로그래밍할 수 있었다. 제어 방식 및 조건: 사이클 1 - 분쇄 시간 1.5분; 속도 (충격 빈도수) 초당 10회의 사이클; 및 예비냉각 시간 4분. (즉, 분쇄 개시전 시간).
4. 분쇄 사이클의 종료시 바이알의 내용물을 적합한 용기로 비우고 캡핑하였다.
소화 절차:
1. 이용가능한 탄수화물 (이용가능한 탄수화물 = 총 탄수화물 - 섬유 - 말티톨 이외의 당 알콜) 0.50 g과 등가의 샘플의 양을 40 ㎖ 유리 스크류 캡 바이알로 중량측정하여 첨가하고, H2O 5 ㎖, 신선하게 제조된 펩신/구아 검 용액 10 ㎖ 및 유리볼 5개를 첨가하였다. 물 0.5 g으로 구성된 샘플 블랭크를 또한 샘플의 각 배치(batch)로 처리하였다.
2. 캡핑된 바이알을 격렬하게 볼텍스 혼합하고, 37℃ 진탕 수조 (175 스트로크/분)에서 수평으로 위치시키고; 펩신에 의한 단백질의 가수분해를 위해 30분 동안 진탕하였다.
3. 0.5 M NaAc (37℃로 평형화됨) 5.0 ㎖를 바이알에 첨가하였다.
4. 혼합한 후, 효소 용액 5 ㎖를 첨가하였다. 반전에 의해 혼합하였다. 상기 소화 혼합물의 pH는 약 5이어야 하였다.
5. 효소 반응을 계속하기 위해 원래의 샘플을 37℃ 진탕 수조에서 수평으로 즉시 위치시켰다. 20분 동안 진탕하였다. 20분 (± 10초) 후 샘플 바이알을 진탕기로부터 제거하였다.
6. 반응을 정지시키기 위해 바이알의 내용물을 66％ EtOH 500 ㎖를 함유하는 메이슨 용기에 즉시 부었다. 메이슨 용기로부터의 EtOH 용액 몇방울로 바이알을 헹구고, 메이슨 용기를 캡핑한 후, 반전에 의해 1회 혼합하였다. 메이슨 용기의 내용물의 일부를 급속 여과지를 통해 40 ㎖ 스크류 캡 바이알로 즉시 여과하고, 캡핑하고, HPIC 분석을 위해 남겨 두었다.
그 후, 소화된 샘플을 하기 상세히 기재된 바와 같이 HPIC에 의해 당 및 당 알콜 함량에 대해 분석하였다:
1. 장비 -
고성능 펌프;
액체 크로마토그래피 모듈;
펄스된 전기화학적 검출기;
희석 탈기 모듈; 및
디오넥스 크로멜레온 크로마토그래피 워크스테이션(Dionex Chromeleon Chromatography Workstation)
으로 구성된 디오넥스(Dionex) 크로마토그래피 시스템.
2. 시약 및 표준
탈이온수, 18 MΩ-cm 저항성;
수산화나트륨 용액, 50％ w/w, 낮은 카르보네이트; 및
갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스 및 말티톨 순수한 표준.
3. 조건:
컬럼: 카보팩(CarboPac)TM PA1 분석 (4 x 250 mm) 및 아미노트랩 가드(AminoTrap guard) (4 x 50 mm) 컬럼;
작동 조건: 압력: 1200 내지 1500 psi; 주입 부피: 10 ㎕; 희석제: 21 mM 수산화나트륨 (각 컬럼에 의한 최선의 분리를 달성하기 위해 조절될 수 있음; 주: 카보팩 PA1은 컬럼 상에 카르보네이트가 축적되는 것을 방지하기 위해 실행 사이에 200 mM NaOH에 의해 세척해야 함); 유속: 1 ㎖/분; 및 검출: 펄스된 전류측정법, 일회용 금 작업 전극 및 표준 탄수화물 세팅.
4. 용액의 제조:
a) 희석제: NaOH 용액 (50％ w/w, 낮은 카르보네이트) 1.6725 g을 탈이온수 (18 MΩ-cm 저항성) 1.0 L에 희석함;
b) 컬럼 세척 용액: 200 mM NaOH: NaOH 용액 (50％ w/w, 낮은 카르보네이트) 16 g을 탈이온수 (18 MΩ-cm 저항성) 1.0 L에 희석함;
5. 표준의 제조:
상기 6개의 표준 (즉, 갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스 및 말티톨 순수한 표준) 약 0.1000 g을 각각 100 ㎖ 부피 플라스크에 정확하게 중량측정하여 첨가하고, 탈이온수 (18 MΩ-cm 저항성)에 의해 1000 ppm 혼합된 표준을 제조하였다. 이 용액을 희석하여 하기 작업 표준을 제조하였다:
a) 1 ㎖를 에틸 알콜 (195 프루프) 66 ㎖를 포함하는 1000 ㎖로 희석하여, 1 ppm 표준을 제조하고;
b) 2 ㎖를 에틸 알콜 (195 프루프) 6.6 ㎖를 포함하는 100 ㎖로 희석하여, 20 ppm 표준을 제조하고;
c) 5 ㎖를 에틸 알콜 (195 프루프) 6.6 ㎖를 포함하는 100 ㎖로 희석하여, 50 ppm 표준을 제조하고;
d) 10 ㎖를 에틸 알콜 (195 프루프) 6.6 ㎖를 포함하는 100 ㎖로 희석하여, 100 ppm 표준을 제조하였다.
6. 샘플 제조 및 주입:
소화 절차로부터의 최종 소화 용액을 탈이온수에 1:10로 희석한 후, 0.2 ㎛ 애노탑10 플러스 주사기 필터를 통해 오토샘플러 바이알로 여과하였다. 그 후, 용액의 샘플 (10 ㎕)을 크로마토그래프에 주입하였다.
7. 크로마토그래피 기울기 조건:
Figure pct00001
8. 전기화학적 검출기 파라미터: Ag/AgCl 기준 전극에 의해 예비로딩된 파형을 사용함:
Figure pct00002
컬럼 저장 용액: 21 mM 수산화나트륨 (NaOH)
9. 당 및 말티톨의 정량 결정:
1, 20, 50 및 100 ppm의 혼합된 표준을 HPIC로 주입하고, 크로마토그래피 시스템을 위한 적절한 소프트웨어를 사용하여 보정 곡선을 작성하였다. 샘플 중 1종 이상의 분석물질의 농도가 가장 높은 표준의 농도를 초과하는 경우에, 보정 곡선은 가장 농축된 샘플에서 발견된 농도보다 더 높은 농도를 갖는 표준을 포함하기 위해 확장시켜야 하였다. 그 후, 샘플 블랭크 또는 시험 샘플을 HPIC에 주입하고, 피크 면적을 사용하여 보정 곡선으로부터 갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스 및 말티톨의 농도를 계산하였다. 상기 단계 6에서 샘플 및 샘플 블랭크의 10배 희석에 대해 설명하기 위해 보정 곡선으로부터의 농도에 10을 곱하고, 최종 소화물 중 각 분석물질의 ％에 대해 보고하였다.
블랭크-수정 샘플 농도 값 (％)을 얻기 위해 각 샘플 중 각 분석물질에 대한 농도 값 (％)에서 샘플 블랭크 중 각 분석물질에 대한 농도 값 (％)을 공제해야 하였다.
혼합된 표준 (패널 A) 및 전형적인 비공지된 또는 시험 샘플 (패널 B)의 실시예 크로마토그램은 도 3에 나타낸다.
계산:
당지수에 대한 예측된 값의 결정은 다중 선형 회귀법 (MLR), 부분 최소 제곱법 (PLS) 또는 신경망 곡선 적합 절차를 통해 달성하였다. 상기 HPIC 절차를 통해 소화 혼합물을 분석하여, 최종 샘플 소화물 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨 함량에 대한 블랭크-수정 정량 값을 얻었다. 원래의 샘플의 총 단백질 ％ 및 지방 ％와 함께 성분 값으로부터 분석 또는 계산에 의해 결정된 상기 값들을 JMP 통계 소프트웨어 스프레드시트에 도입한 후, 사용된 특정 곡선 적합 절차에 적절한 예측 식 또는 예측 기술을 기준으로 원래의 샘플의 GI 값을 예측하였다.
임상 생체내 GI 값이 공지된 보정 세트에 대한 데이터로부터 예측 식, 예측 기술을 유도하였다. 보정 세트는 임상 GI 값이 공지된 일련의 순수한 표준 및 식료품을 포함하였다. 실시예 2에서 방법을 보정하는데 사용된 이들 표준은 19 내지 100의 GI 값의 범위에 미치고, 이를 보정에서 다른 음식 샘플과 완전히 동일한 방식으로 처리하였다. 분석 후, 추가 샘플 및/또는 표준을 재계산된 보정 세트 및 모델 파라미터에 첨가할 수 있고 (상기 샘플 및/또는 표준에 대해 생체내 GI 값이 공지된 경우에); 이러한 첨가는 GI가 결정될 수 있는 음식 샘플의 집단을 보정 세트가 더 광범위하게 대표하게 함으로써 보정을 강화해야 하였다. 그러므로, 새롭게 이용가능한 또는 개선된 생체내 데이터를 포함하기 위해 예측 식 또는 예측 기술을 업데이트할 수 있었다. 상기 기재된 절차를 통해 모든 보정 샘플 및 표준을 미리 분석한 후, MLR, PLS 또는 신경망 방법을 사용하여 임상 GI 값과 예측 변수 간의 관계에 대한 최량 적합인 데이터에 식을 적합하게 하기 위해 JMP 통계 소프트웨어를 사용하였다.
본원에 기재된 방법은 보정에서 모든 당 및 말티톨을 포함하였다. 그러나, 접할 가능성이 있는 샘플이 구성성분들 중 몇몇을 포함하지 않는 것으로 공지된 경우에, 이는 보정에서 제외될 수 있었다 (예를 들어, 말티톨, 갈락토스). 존재하는 임의의 수크로스를 글루코스 및 프룩토스로 전환하는 인버타제의 작용으로 인해 소화된 샘플 중 수크로스의 양은 전형적으로 본질적으로 0인 것으로 발견되었다. 그러나, 샘플이 인버타제 활성 억제제를 함유하는 경우에, 수크로스 수준을 포함하는 능력은 시험관내 GI 값의 계산에서 억제 효과를 고려하는 보정 식의 개발에서 유용할 수 있다. 말티톨은 식료품에서 통상적으로 접하는 수준의 혈당 농도에 대한 인식가능한 효과를 갖는 것으로 과학 문헌에 나타난 유일한 당 알콜이다. 적절한 컬럼에 의한 HPIC는 많은 추가 당 및 당 알콜 (말티톨만은 아님)을 결정할 수 있기 때문에, 추가 당 및 당 알콜을 필요하다면 분석 및 보정 단계에 포함시킬 수 있었다.
샘플 중 단백질 ％, 샘플 중 지방 ％, 및 소화물 중 글루코스 ％, 소화물 중 프룩토스 ％, 소화물 중 락토스 ％, 소화물 중 수크로스 ％, 소화물 중 갈락토스 ％ 및 소화물 중 말티톨 ％에 대한 블랭크-수정 농도 값을 적절한 통계 소프트웨어 패키지 (예를 들어, JMP 통계 소프트웨어)에 도입함으로써 비공지된 샘플을 예측하였으며, 그 후 이는 GI 값을 자동적으로 에측하였다.
실시예 2. 생체내 및 시험관내 시험 프로토콜 둘 모두를 사용하여 다수의 상업적으로 이용가능한 식료품 및 다른 음식 샘플을 검사하였다. 이러한 시험에서 경험된 익히 공지되고 높이 평가되는 비공식적 시험 실험실에 의해 수행되는 생체내 시험을 사용하여 대부분 (총 34개 중 25개)의 생체내 당지수 값을 결정하고; 이러한 생체내 당지수 값의 나머지는 과학 문헌에서 취하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 본 발명의 시험관내 방법을 사용하여 이들 동일한 샘플을 또한 검사하였다. 그 후, JMP 통계 소프트웨어에서 이용가능한 MLR, PLS 및 신경망 방법을 사용하여 본원에 기재된 시험관내 당지수 시험에 대한 모델 파라미터를 계산하기 위해 이들 데이터를 사용하였다.
본원을 출원한 후, 펩신/구아 검 용액을 제조하는데 사용된 HCl 용액이 원하는 0.05 N이 아닌 0.5 N인 것으로 발견되었다. 효소 소화 용액을 제조하기 위해 펩신/구아 검 용액을 사용하였기 때문에, 효소 소화 도중 pH는 원하는 약 5가 아닌 약 1.1이었다. 이러한 더 낮은 pH 값은 효소 소화 반응에 최적이 아니었다. 그러므로, pH가 너무 낮아서, 샘플 중 지방 및 단백질 수준에 비해 상이한 수준의 다양한 당이 방출되었다. 그러나, 모든 샘플을 동일한 방식으로 (즉, 소화 도중 동일한 pH에서) 처리하였기 때문에, 예측된 당지수 값의 상대치는 유효하게 유지되었다. 물론, 이 데이터 세트로부터 유도된 모델 파라미터 및/또는 계수는 오직 효소 소화 도중 더 낮은 pH를 또한 새로운 비공지된 샘플에서 사용한 경우에 사용하기에 적합하였다. 하기 실시예 3 및 4는 적절한 HCl 용액을 사용하여 수행하였으므로; 효소 소화 반응은 더 최적의 pH 조건 하에 수행하였다.
MLR 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00003
그러므로, MLR 방법을 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 63.080214 - 0.974313단백질(％) - 0.67442지방(％) + 367.97478글루코스(％) - 452.5341프룩토스(％) - 191.8138락토스(％) - 437.3615갈락토스(％) - 298.0102말티톨(％).
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00004
변산 분석:
Figure pct00005
5개의 잠재 변수에 의해 PLS 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00006
그러므로, PLS 방법을 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 62.745005 - 0.986004단백질(％) - 0.670993지방(％) + 369.91833글루코스(％) - 446.4468프룩토스(％) - 195.07락토스(％) - 425.7489갈락토스(％) - 291.9779말티톨(％).
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00007
신경망 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터 가중치를 얻었다:
신경망 표 I:
Figure pct00008
신경망 방법은 단순한 예측 식을 제공하지 않는다. 오히려, 상기 방법은 적합한 소프트웨어 프로그램 (이 경우에 JMP 통계 소프트웨어)을 사용하여 예측된 결과를 얻기 위해 사용될 수 있는 네트워크 위상학 및 일련의 파라미터 가중치를 제공한다. 이러한 방법을 사용하여 얻은 적합도를 도 5A에서 그래프로 예시하였다. 이 모델에 대한 관련 파라미터는 아래와 같았다:
Figure pct00009
결과:
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
그 후, 각 데이터 적합 방법을 사용하여 시험관내 당지수 값을 계산하기 위해 얻어진 모델 파라미터를 사용하였다. 상관관계 파라미터를 계산하기 위해 하기 상업적으로 이용가능한 제품으로부터의 결과를 사용하였다. 각 데이터 적합 방법을 사용하여 결정된 얻어진 시험관내 당지수 값을 생체내 당지수 값과 비교하였다:
Figure pct00013
Figure pct00014
* 생체내 값은 달리 나타내지 않는 한 비공식적 시험 실험실을 사용하여 실험적으로 결정하였다.
** "당지수 및 당부하 값의 국제 표" (문헌 [Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002)])로부터 취한 생체내 값.
† 문헌 [Livesy, Nutr. Res. Rev., 16(2), 163-91 (2003)]으로부터 취한 생체내 값.
†† 문헌 [Jentjens et al., Eur. J. App.l Physiol. 88, 459-465 (2003)]으로부터 취한 생체내 값.
곡선 적합 절차로서 신경망 방법을 사용하여 얻은 이 데이터의 산점도는 도 4A에 나타낸다. 이러한 방법을 사용하여 0.97의 R2 값을 얻었다. 시험관내 방법에 대한 표준 편차 (총 34개의 샘플의 이중 결정을 기준으로 함)는 ± 1.08 GI 단위 또는 ± 2.33 상대％였다. 그러므로, 이러한 방법은 매우 높은 정밀도 및 높은 예측 값을 갖는 것으로 보인다.
실시예 3. 원래의 출원을 출원한 후, 작업을 계속하여 추가 데이터 점을 첨가하고, 훨씬 더 정확하고 정밀한 시험관내 방법을 제공하기 위해 방법에 특정 변형을 가하였다. 상기 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 효소 소화 단계 도중 pH는 너무 낮았다. 효소 소화 단계를 위한 적절한 pH 값은 약 5이어야 하고; 상기 변형 이외에 실시예 2와 동일한 방식으로 샘플을 처리하였다. 그러므로, 실시예 2에서 사용된 샘플 중 31개를 재실행하여 더 최적의 효소 소화 pH에서 데이터를 얻었다. 또한, 34개의 새로운 샘플을 실시예 2로부터의 재실행 샘플에 첨가하여, 샘플의 총수를 65로 하였다. 이 시험관내 방법 (이 일부계속출원일인 현재)은 더 최적의 pH 값에서 효소 소화된 샘플을 기준으로 하고, 본원에 제공된다. 물론, 당업자가 인식하는 바와 같이, 이 방법의 정확도 및 정밀도는 또한 보정 샘플 및/또는 표준에 대한 추가 생체내 데이터가 이용가능하게 되고 보정 절차 도중 시험관내 모델에 도입되기 때문에 훨씬 더 증가할 가능성이 있다.
MLR 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00015
그러므로, MLR 방법 및 확장된 데이터 세트를 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 26.779686 - 0.967251 단백질(％) - 0.385715지방(％) + 611.60013글루코스(％) + 301.95014락토스(％) + 169.03383말티톨(％) - 18.16062[글루코스 (％)-0.05718]*[단백질 (％)-8.24967].
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00016
변산 분석:
Figure pct00017
5개의 잠재 변수에 의해 PLS 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00018
그러므로, PLS 방법을 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 26.264529 - 1.048186단백질(％) - 0.248138지방(％) + 621.7824글루코스(％) - 52.7993프룩토스(％) + 233.67679락토스(％) - 61.21071갈락토스(％) + 84.689245말티톨(％).
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00019
신경망 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터 가중치를 얻었다:
신경망 표 I:
Figure pct00020
실시예 2에 나타낸 바와 같이, 신경망 방법은 단순한 예측 식을 제공하지 않는다. 오히려, 상기 방법은 적합한 소프트웨어 프로그램 (이 경우에 JMP 통계 소프트웨어)을 사용하여 예측된 결과를 얻기 위해 사용될 수 있는 네트워크 위상학 및 일련의 파라미터 가중치를 제공한다. 이러한 방법을 사용하여 얻은 적합도를 도 4A에서 그래프로 예시하였다. 이 모델에 대한 관련 파라미터는 아래와 같았다:
Figure pct00021
결과:
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
그 후, 실시예 2에서와 같이 각 데이터 적합 방법을 사용하여 시험관내 당지수 값을 계산하기 위해 얻어진 모델 파라미터를 사용하였다. 각 모델에 대한 상관관계 파라미터를 계산하기 위해 하기 제품 (실시예 2보다 약 33종 더 많음)으로부터의 결과를 사용하였다. 확장된 데이터 세트에 의해 각 데이터 적합 모델 또는 방법을 사용하여 결정된 시험관내 당지수 값의 결과를 생체내 당지수 값과 비교하였다:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
* 생체내 값은 달리 나타내지 않는 한 비공식적 시험 실험실을 사용하여 실험적으로 결정하였다.
** "당지수 및 당부하 값의 국제 표" (문헌 [Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002)])로부터 취한 생체내 값.
*** 소금뿌린 크래커에 대한 이 생체내 값은 실시예 2에서 사용된 것과 상이하였다. 이 현재 값이 더 정확한 것으로 보였다.
**** 코카-콜라에 대한 이 생체내 값 (2개의 결정에 대한 평균을 기준으로 함)은 1개의 결정만을 기준으로 한 실시예 2에서 사용된 것과 상이하였다. 이 현재 값이 더 정확한 것으로 보였다.
‡ "당지수 및 당부하 값의 국제 표" (문헌 [Am. J. Clin. Nutr., 76, 5-56 (2002)])로부터 취한 생체내 값 (특이점 제외). 그러므로, 이 값은 실시예 2에서 사용된 것과 약간 상이하였다.
‡‡ 제조자의 데이터로부터 취한 생체내 값.
‡‡‡ 포테이토 플레이크에 대한 이 생체내 값은 실시예 2에서 포테이토 플레이크 1 및 포테이토 플레이크 2의 평균이었다. 실시예 2에서 2종의 포테이토 플레이크 샘플은 사실상 매우 유사한 것으로 결정되었다.
† 문헌 [Livesy, Nutr. Res. Rev., 16(2), 163-91 (2003)]으로부터 취한 생체내 값.
†† 문헌 [Jentjens et al., Eur. J. App. Physiol. 88, 459-465 (2003)]으로부터 취한 생체내 값.
MLR 곡선 적합 절차를 사용하여 얻은 이 데이터의 산점도는 도 5A에 나타낸다. 이러한 방법을 사용하여 0.94의 R2 값을 얻었다. 시험관내 방법에 대한 표준 편차 (총 65개의 샘플의 이중 결정을 기준으로 함)는 ± 4 GI 단위 또는 ± 6 상대％였다. 그러므로, 이러한 방법은 매우 높은 정밀도 및 높은 예측 값을 갖는 것으로 보인다.
그 후, 본원에 기재된 샘플 제조 및 분석을 위한 방법을 간단히 수행하고, 보정 데이터로부터 결정된 원하는 예측 식 및 데이터를 사용함으로써 비공지된 식료품 또는 음식 성분에 대한 시험관내 GI 값을 계산하기 위해 시험관내 방법을 사용할 수 있었다. 물론, 실시예 2 및 3의 비교에 의해 나타낸 바와 같이, 보정 결과 및 예측 식 데이터는 보정 데이터 세트 및 비공지된 샘플이 분석되는 실제 조건에 의존할 것이다 (특히 효소 소화 단계에 관하여). 그러나, 모든 샘플에 대해 동일한 절차를 사용하는 한, 분석 절차에서 변동은 예측 식이 광범위하게 상이한 경우에도 본 방법의 예측 능력에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 것으로 보이지 않았다. 이는 상기 시험관내 방법의 견고성을 나타내는 것으로 믿어진다. 보정 데이터 세트의 크기가 사용된 생체내 GI 값의 정확도 및/또는 샘플의 수에서 증가하기 때문에, 방법의 정확도 및 정밀도가 증가할 것으로 예상되었다.
상기 나타낸 바와 같이, 가르세티 등은 시험관내 엔글리스트 방법에 대해 0.25의 R2 값을 갖는 산점도를 제공하였으며, 이는 그러므로 이러한 방법이 예측 값을 거의 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 추가 비교 목적을 위해, 실시예 2 및 3으로부터의 데이터에 대해 엔글리스트 방법 (즉, 오직 20분 소화 후 글루코스 방출을 기준으로 함)에서 사용된 계산 기술을 사용하여 얻은 바와 같은 신속히 이용가능한 글루코스 (RAG, 음식 100 g 당 20분 내에 방출된 글루코스 그램으로서 표현됨)은, 문헌 [Englyst et al., Brit. J. Nutr., 75, 327-337 (1996)] (도 4B) 및 문헌 [Englyst et al., Am. J. Clin. Nutr., 69, 448-454 (1999)] (도 4C)에 상세히 기재된 바와 같이 시험관내 엔글리스트 방법 (즉, 오직 20분 후 방출된 글루코스를 사용함)에 기재된 파라미터 및 계산을 사용하여 생체내 GI 값과 개별적으로 상관관계가 있었다. 이러한 산점도는 실시예 2 데이터를 사용하여 도 4B 및 4C에 나타내고, 실시예 4 데이터를 사용하여 도 5B 및 5C에 나타내었다. 도 4B 및 5B에서, 생체내 GI를 실시예 2 및 실시예 3 데이터에 대한 RAG/(이용가능한 탄수화물 ％)에 대해 각각 플롯팅하고; 도 4C 및 5C에서, 생체내 GI를 실시예 2 및 실시예 3 데이터에 대한 RAG에 대해 각각 플롯팅하였다. 실시예 2 데이터를 사용하여 이러한 계산을 수행한 경우에, 엔글리스트 등의 방법의 R2 값은 도 4B 및 4C에서 각각 약 0.41 및 약 0.68로 증가하였고; 실시예 3 데이터를 사용한 경우에, 엔글리스트 등의 방법의 R2 값은 도 5B 및 5C에서 각각 약 0.56 및 약 0.58로 증가하였다. 이들은 가르세티 등의 산점도와 비교하여 개선을 제공하였으나, 방법의 예측 값은 여전히 불량하였다.
본 발명의 방법에서 약 0.94 내지 약 0.97의 R2 값에 의해 나타낸 바와 같이 (사용된 특정 곡선 적합 방법 및 데이터가 생성되는 조건에 의존함), 다양한 식료품 및/또는 음식 성분에 대한 당지수 값을 정확하고 정밀하게 결정하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 방법을 처음으로 제공한 것으로 믿어진다. 현재 추천되는 훨씬 더 시간 소모적이고 고가의 인간 대상체 생체내 시험과 정확도 측면에서 유리하게 비교되는 이러한 방법은 정확한 당지수 값을 용이하고 빠르고 저가로 얻는데 사용할 수 있다. 또한, 이러한 방법의 정확도 및 정밀도는 보정 샘플 및/또는 표준에 대한 추가 생체내 데이터가 이용가능하게 되고 보정 절차 도중 시험관내 모델에 도입되기 때문에 훨씬 더 증가할 가능성이 있다. 당분야에서 이러한 개선은 인간 영양에서 당지수 및 관련 값 (예를 들어, 당지수에 음식에 의해 제공된 탄수화물의 양 (그램)을 곱하고, 그 값을 100으로 나눔으로써 결정된 당부하 값)의 유용성을 확실하게 증가시킨다.
실시예 4. 그러므로, 실시예 2에서 사용된 샘플 (효소 반응 단계에서 최적의 pH 값 미만의 pH 값을 사용함)을 더 최적의 pH 값을 사용하여 실시예 3에서 재실행하였다. 오직 재실행 실시예 2 데이터 세트 (즉, 실시예 3에서 첨가된 추가 샘플을 제외함)에 대한 실시예 3으로부터의 데이터를 사용하여, 다양한 곡선 적합 파라미터의 새로운 세트를 생성하였다. 본 실시예 (실시예 2의 34개의 샘플 중 31개를 기준으로 함)는 더 최적의 pH 값에서의 샘플 실행에 의한 실시예 2의 시험관내 분석을 효과적으로 예시한다. 이는 각 데이터 세트의 샘플수만이 다양한 실시예 2 및 실시예 3으로부터의 상관계수 또는 파라미터를 더 직접적으로 비교하게 하였다.
MLR 방법을 사용하여 이 변형된 데이터에 대한 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00029
그러므로, MLR 방법을 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 30.502796 - 0.787639단백질(％) - 0.515649지방(％) + 573.03525글루코스(％) + 275.61246락토스(％) + 147.62386말티톨(％) - 20.39966[글루코스 (％)-0.05091]*[단백질 (％)-10.0429].
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00030
변산 분석:
Figure pct00031
5개의 잠재 변수에 의해 PLS 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터를 얻었다:
Figure pct00032
그러므로, PLS 방법을 사용하여 시험관내 당지수를 추정하기 위해 사용된 식은 아래와 같았다:
GI = 48.443999 - 1.003763단백질(％) - 0.492915지방(％) + 443.60721글루코스(％) - 265.4383프룩토스(％) - 33.78516락토스(％) - 277.1671갈락토스(％) - 142.2773말티톨(％).
이 모델에 대한 관련 통계 파라미터는 아래와 같았다:
적합도 요약:
Figure pct00033
신경망 방법을 사용하여 하기 모델 파라미터 가중치를 얻었다:
신경망 표 I:
Figure pct00034
실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 신경망 방법은 단순한 예측 식을 제공하지 않는다. 오히려, 상기 방법은 적합한 소프트웨어 프로그램 (이 경우에 JMP 통계 소프트웨어)을 사용하여 예측된 결과를 얻기 위해 사용될 수 있는 네트워크 위상학 및 일련의 파라미터 가중치를 제공한다. 이 모델에 대한 관련 파라미터는 아래와 같았다:
Figure pct00035
결과:
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
그 후, 각 데이터 적합 방법을 사용하여 시험관내 당지수 값을 계산하기 위해 얻어진 모델 파라미터를 사용하였다. 상관관계 파라미터를 계산하기 위해 하기 상업적으로 이용가능한 제품으로부터의 결과를 사용하였다. 각 데이터 적합 방법을 사용하여 결정된 얻어진 시험관내 당지수 값을 생체내 당지수 값과 비교하였다:
Figure pct00039
Figure pct00040
* 실시예 2 및 3에서 사용된 시리얼이 상이하기 때문에, 이 데이터 세트로부터 이를 생략하였다.
** 생체내 값은 본원에서 설명된 바와 같이 유도된 실시예 3으로부터 취하였다.
신경망 곡선 적합 절차를 사용하여 얻은 이 데이터의 산점도는 도 6에 나타낸다. 이러한 방법을 사용하여 0.96의 R2 값을 얻었다. 그러므로, 이러한 방법은 다시 매우 높은 정밀도 및 높은 예측 값을 갖는 것으로 보인다. 실시예 3 및 4 (상이한 수의 샘플을 기준으로 하나 모든 실행은 유사한 조건하에 수행함)의 결과는 일반적으로 일치하였다.
이들 실시예 (특히 실시예 3 및 4)에서 입증된 바와 같이, 샘플수가 증가하기 때문에, 다양한 곡선 적합 절차에서 사용된 다양한 계수 및 다른 파라미터의 값은 데이터 세트에 대한 최량 적합을 달성하도록 정립될 것으로 예상된다. 데이터 세트에 첨가된 추가 샘플은 식료품의 다양성을 증가시키고 더 큰 집단의 식료품을 더 잘 나타낼 것으로 예상된다.

Claims (20)

  1. (1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
    (2) 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공하여 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
    (3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
    (4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
    (5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
    (6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 기지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
    를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (4)에서 모든 나열된 당 및 당 알콜의 양을 결정하여, 단계 (6)에서 당지수를 계산하는데 사용하는 것인 시험관내 방법.
  3. 제1항에 있어서, 시험 식료품을 약 -40℃ 미만의 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻는 것인 시험관내 방법.
  4. 제2항에 있어서, 시험 식료품을 약 -78℃ 이하의 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻는 것인 시험관내 방법.
  5. 제1항에 있어서, 시험 식료품을 액체 질소 온도에서 또는 거의 액체 질소 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻는 것인 시험관내 방법.
  6. 제2항에 있어서, 시험 식료품을 액체 질소 온도에서 또는 거의 액체 질소 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻는 것인 시험관내 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 고성능 이온 크로마토그래피를 사용하여 결정하는 것인 시험관내 방법.
  8. 제2항에 있어서, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 글루코스 및 당 또는 당 알콜의 양을 고성능 이온 크로마토그래피를 사용하여 결정하는 것인 시험관내 방법.
  9. 제1항에 있어서, 시험 식료품을 약 -40℃ 미만의 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻고, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 고성능 이온 크로마토그래피를 사용하여 결정하는 것인 시험관내 방법.
  10. 제2항에 있어서, 시험 식료품을 약 -40℃ 미만의 온도에서 분쇄하여 시험 식료품을 본질적으로 균질하고 미분된 상태로 얻고, 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨의 양을 고성능 이온 크로마토그래피를 사용하여 결정하는 것인 시험관내 방법.
  11. (1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
    (2) 시험 식료품을 액체 질소 온도에서 또는 거의 액체 질소 온도에서 분쇄하여 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공함으로써 시험 음식 샘플을 제공하는 단계;
    (3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
    (4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
    (5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당 또는 당 알콜 및 글루코스의 양을 결정하는 단계; 및
    (6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 기지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
    를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법.
  12. 제11항에 있어서, 다변량 분석이 다중 선형 회귀법, 부분 최소 제곱법 및 신경망 방법으로 이루어진 군에서 선택된 곡선 적합 절차를 사용하는 것인 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 곡선 적합 절차가 다중 선형 회귀법인 시험관내 방법.
  14. 제12항에 있어서, 곡선 적합 절차가 부분 최소 제곱법인 시험관내 방법.
  15. 제12항에 있어서, 곡선 적합 절차가 신경망 방법인 시험관내 방법.
  16. (1) 시험 식료품의 단백질 함량 및 지방 함량을 결정하는 단계;
    (2) 시험 식료품을 액체 질소 온도에서 또는 거의 액체 질소 온도에서 분쇄하여 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 식료품을 제공하는 단계;
    (3) 표준화된 양의 이용가능한 탄수화물을 제공하기에 충분한 양의 본질적으로 균질하고 미분된 상태의 시험 음식 샘플을 고정된 시간 동안 소화 효소들의 혼합물로 소화시켜 소화된 샘플을 제공하는 단계;
    (4) 고정된 시간 직후 소화된 샘플 전체를 처리하여 효소 반응을 정지시키는 단계;
    (5) 단계 (4)로부터의 소화 샘플 중 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 락토스, 수크로스 및 말티톨의 양을 고성능 이온 크로마토그래피를 사용하여 결정하는 단계; 및
    (6) 보정 샘플에 대한 보정 데이터의 다변량 분석으로부터 유도된 예측 식 또는 예측 기술을 사용하여, 시험 식료품에 대해 단계 (1) 및 (5)에서 얻은 데이터로부터 시험 식료품의 당지수를 계산하고, 이 때 보정 데이터는 단계 (1) 및 (5)에서 결정된 시험 식료품에 대한 데이터와 동일한 유형이며 그와 동일한 방식으로 얻은 것이고, 보정 샘플은 기지의 생체내 당지수 값을 갖는 것인 단계
    를 포함하는, 시험 식료품에 대한 당지수를 결정하기 위한 시험관내 방법.
  17. 제16항에 있어서, 다변량 분석이 다중 선형 회귀법, 부분 최소 제곱법 및 신경망 방법으로 이루어진 군에서 선택된 곡선 적합 절차를 사용하는 것인 시험관내 방법.
  18. 제16항에 있어서, 곡선 적합 절차가 다중 선형 회귀법인 시험관내 방법.
  19. 제16항에 있어서, 곡선 적합 절차가 부분 최소 제곱법인 시험관내 방법.
  20. 제16항에 있어서, 곡선 적합 절차가 신경망 방법인 시험관내 방법.
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