CN101784898B

CN101784898B - 测定食品血糖生成指数的体外方法

Info

Publication number: CN101784898B
Application number: CN200880105327.8A
Authority: CN
Inventors: R·L·马加勒塔; S·N·迪卡塔尔多
Original assignee: Kraft Foods Global Brands LLC
Current assignee: Intercontinental Great Brands LLC
Priority date: 2007-06-28
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2028-06-25
Also published as: MX2009014177A; WO2009006155A1; KR20100038401A; CA2691062C; DK2171472T3; EP2171472B1; BRPI0813241A2; CA2691062A1; EP2171472A1; ZA200909056B; RU2010102733A; KR101138598B1; AU2008270671B2; ATE537452T1; JP5272003B2; IL202786A0; CN101784898A; RU2451938C2; JP2010532001A; IL202786A

Abstract

本发明提供用于测定各种食品血糖生成指数值的体外方法。本发明提供精确且廉价的体外方法，用于测定各种食物成分和制成食品的血糖生成指数。其中该方法涉及食品的消化样品中蛋白质含量、脂肪含量、葡萄糖的量和至少两种糖或糖醇的量的测量，所述糖或糖醇选自果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。

Description

测定食品血糖生成指数的体外方法

相关申请

本申请为2008年6月23日提交的美国专利申请第12/144,056号的继续申请，并要求2007年6月28日提交的已被要求转换成临时申请的美国专利申请序号11/770,361的权益，上述申请通过引用而整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及测定各种食品血糖生成指数(glycemicindex)(GI)值的体外方法。本发明提供精确且廉价的体外方法，该方法用于测定各种食物成分和制成食品的血糖生成指数。

发明背景

近年来，已显著提高对食品血糖生成指数的关注。血糖生成指数为在经人消化，并基于碳水化合物的释放和吸收速度将食品分级后，对给定食品中饮食碳水化合物响应的相对血糖指标。实际上，血糖生成指数对所谓“有益的碳水化合物”(即相对低血糖生成指数的碳水化合物)和所谓“有害的碳水化合物”(即相对高血糖生成指数的碳水化合物)给予鉴定。具有碳水化合物意识的消费者和健康护理人员能够使用血糖生成指数或相关值在食物选择方面进行帮助。

基于饮食后血糖水平的变化，血糖生成指数将碳水化合物分成0-100级。认为具有高GI的食物被快速消化和吸收，从而导致血糖水平显著波动。认为由于低血糖生成指数值的食物被身体较慢消化和吸收，导致血糖和胰岛素水平更平缓地上升，因而波动平坦。通常，低血糖生成指数食物定义为具有55或更小的血糖生成指数，中等血糖生成指数食物定义为具有56-69的血糖生成指数，高血糖生成指数食物定义为具有70或更高的血糖生成指数。

消耗高血糖生成指数食物通常看起来会导致在血糖水平方面比消耗低血糖生成指数食物更高、更快速的增长。血糖迅速增长表明胰腺增加胰岛素的分泌。消耗高血糖生成指数食物诱导的高胰岛素水平可导致血糖水平锐减(血糖过少)，反之，通常认为消耗低血糖生成指数食物导致血糖水平更低和更平缓的增加以及更低的胰岛素需求。已报告低升糖饮食改善糖尿病(1型和2型)人的葡萄糖和脂质水平。也已报告由于低升糖饮食帮助控制食欲和延迟饥饿，导致有益于体重的控制。低GI饮食也可以降低胰岛素水平和胰岛素抵抗。哈佛大学公共卫生学院最近的研究报告：整体饮食的血糖生成指数强烈影响疾病如2型糖尿病和冠心病的风险。世界卫生组织(WHO)与联合国粮食及农业组织已建议工业化国家的人们以低血糖生成指数食物为基础饮食，以预防最常见的富贵病，如冠心病、糖尿病和肥胖。因此，常常建议消费者调整他们的整体饮食，以便在减少高血糖生成指数食物的情况下增加低血糖生成指数食物的相对量。血糖生成指数值可用于帮助消费者和健康护理人员选择食物，并可能降低某些疾病的风险。

给定食品的血糖生成指数常常在体内通过监控已摄取食品的受试人群(通常约6名或更多个体)的血糖水平而测得；比较一段固定时间段内食品的血糖响应与通过摄取已知血糖生成指数的对照物而激发的血糖响应，计算出血糖生成指数。通常认为血糖生成指数体内测定方法为该领域的“黄金标准”。在当前公认的测试方案中，含10-50克碳水化合物的受试食物的已测定部分喂给6名或更多过夜禁食后的健康人。于食物消耗前(0时)和食物消耗后的立即两小时内每隔15-30分钟采集血样，通常经扎手指取血，分析血糖水平。用所得数据(一般约7个数据点)制得消耗受试食物后两小时内的血糖响应曲线(即血糖水平对时间作图)。血糖曲线下面积与进食受试食物后血糖水平中的总升高相关。再次过夜禁食后，用相同个体消耗等量碳水化合物部分的葡萄糖(定义为具有100血糖生成指数的参比食物)或具有规定GI值的白面包进行相似测试；测定两小时的血糖响应曲线，用与测试受试食物同样的方法测定曲线下面积。通过受试食物的曲线下面积除以参比食物的曲线下面积并乘以100，计算受试食物的血糖生成指数。为了降低受试者在身体差异和/或其它特征差异的合并影响以及匹配受试样品的物理形式(即标准葡萄糖水溶液用于饮料测定，标准白面包用于固体食物测定)，标准食物的使用是重要的。由于仅有约7个数据点(两小时内)用于生成血糖曲线，且假定该曲线平滑穿过这些有限的数据点，如果葡萄糖生成在所取实际数据点之间显著增加或减少，误差会增大。

取所有受试者的血糖生成指数的平均值作为食物的血糖生成指数。当然，测定的准确度至少部分取决于受试者对测试方案的顺从性以及假定的有效性，假定为个体受试者的身体和/或其它特征对受试食物和参比食物的测定会基本上保持恒定。

由于该血糖生成指数的体内测定方法通常需要人受试者以及费用昂贵且耗时，因此已经相当关注体外测试方案的开发。一种体外方法是基于K.N.Englyst和其同事的研究，以图1进行说明，该方法包括于37℃下与消化酶混合物定时温育期间，从受试食物释放的葡萄糖的测定，使用比色法终点测定葡萄糖水平。Englyst等，Brit.J.Nutr.，75，327-337(1996)。最近该体外方法已被修改成包括HPLC终点，来测定所释放葡萄糖的量。Englyst等，Am.J.Clin.Nutr.，69，448-454(1999)(以下称为“Englyst方法”或“体外Englyst方法”)。

Englyst方法包括切碎(或者别的方式压碎或粉碎)已知量的受试食物(通常含约0.5g碳水化合物)。切碎的样品在10ml含胃蛋白酶(5g/l，影响蛋白质的水解)和瓜尔胶(5g/l，在整个分析过程中帮助维持食物粒子悬浮)的0.05M HCl中混合，于37℃下温育30分钟。该初次温育后，用0.5M醋酸钠缓冲样品至pH 5.2。随后，向已缓冲样品中加入酶混合物(包含特定量的胰酶、淀粉葡萄糖苷酶和转化酶)，并将该样品置于37℃振荡水浴中(时间＝0)。小玻璃球包含于样品中，以便在主要温育期间机械性破坏样品的物理结构；加入的瓜尔胶通过稳定样品的粘度帮助保持样品处于悬浮状态。在主要温育中精确20分钟后，取出等分试样，并在搅拌下加至无水乙醇中，以停止水解；使用该样品用HPLC测定G₂₀(即20分钟后释放的葡萄糖；也称为“可迅速利用的葡萄糖”或RAG)。在37℃水浴中保持样品剩余物另外100分钟，此时取出第二等分样品，并在搅拌下加至无水乙醇中，以停止水解；使用该样品用HPLC测定G₁₂₀(即120分钟后释放的葡萄糖)。如图1所示，然后通过加入另外的酶处理样品剩余物，随后暴露于最高达100℃的温度下以促进完成水解，如此测定样品中的总葡萄糖。

与已使用体内测试方法测定血糖生成指数的食物相比，使用Englyst方法测定的G₂₀或可迅速利用的葡萄糖值可与已知食物的体内血糖生成指数值相关。使用该相关系数，Englyst方法可用于估算受试食物的血糖生成指数值。

然而，体外Englyst方法已经遇到相当多的批评，尤其是来自体内血糖生成指数方法的支持者的批评。例如，Garsetti等，J.Am.Coll.Nutr.，24，441-447(2005)，使用Englyst方法评估血糖生成指数值(即可迅速利用的葡萄糖值)，随后与具有约35-60范围的血糖生成指数的食品(即饼干)的体内测定值作了比较。如Garsetti等(通过引用结合到本文中)的图2所示，体内测定的血糖生成指数值对可迅速利用的葡萄糖值(即通过Englyst方法测定)的散点图产生了R²值为0.25的散点图，提示该体外方法几乎没有预测价值。

Brand-Miller等，Eur.J.Clin.Nutr.，58，700-701(2004)，测定了市售食物(一份谷物早餐和两份快餐)的体内血糖生成指数值，由Englyst体外测试方法测定这些食物时报告具有低血糖生成指数值(即≤55)。根据Brand-Miller等，该三份食品具有中等体内血糖生成指数值(±标准误差)，分别为75±3、68±5和65±5，因而不能归类为低血糖生成指数食品。这些作者推断，假定“体内测试的艰苦任务对于测定食物的GI值不再是必要的”简直是不正确的并且“强烈建议反对使用任何体外方法产生供食品标签用的GI值”。最终，作者“竭力主张食品制造商承诺仅在经验丰富的实验室使用标准化的体内方法进行GI测试。”

显然，本领域仍然需要准确、精密且可重现的体外方法，该方法用于测定食品的血糖生成指数值。此外，仍然需要这样的方法，该方法可应用于各种食品，包括固体和液体食品。本发明提供这样的体外测试方法。

发明概述

本发明提供体外分析方法，该方法根据采用食品与酶的模拟消化产生的蛋白质、脂肪和糖/糖醇的水平，使食品血糖生成指数的预测提高。目前的血糖生成指数测定方法通常需要人受试者以及费用昂贵且耗时。本发明方法能够在一天内，由一名分析人员测定最高达约15个食物样品的血糖生成指数，相对于使用人受试者的传统方法，显著地降低了成本。使用本发明方法测定的血糖生成指数值显示与使用人受试者的传统测试获得的结果有非常高的相关性。而且，本发明方法可用于宽范围的食品，包括固体食品及半固体食品(如酸乳等)和液体食品(如饮料等)。

本发明提供用于测定试验食品血糖生成指数的体外方法，所述方法包括：(1)测定试验食品的蛋白质含量和脂肪含量；(2)以基本上均匀且细碎的状态提供试验食品，来提供试验食物样品；(3)用消化酶混合物，将足以提供标准化量的可利用碳水化合物的量的基本上均匀且细碎状态的试验食物样品消化，保持一段固定时间，以提供消化的样品；(4)经过所述固定时间后，立即将消化的样品按其整体处理，以停止酶反应；(5)测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇；和(6)使用预测方程或预测技术，从步骤(1)和(5)中得到的试验食品的数据，计算该试验食品的血糖生成指数，所述预测方程或预测技术源自校准样品的校准数据多元分析，其中所述校准数据为相同类型，且以与步骤(1)和(5)中测定的试验食品的数据相同的方式获得，且其中所述校准样品具有已知的体内血糖生成指数值。

本发明也提供用于测定试验食品血糖生成指数的体外方法，所述方法包括：(1)测定试验食品的蛋白质含量和脂肪含量；(2)以基本上均匀且细碎的状态提供试验食品，来提供试验食物样品，其中试验食品基本上于液氮温度下研磨；(3)用消化酶混合物，将足以提供标准化量的可利用碳水化合物的量的基本上均匀且细碎状态的试验食物样品消化，保持一段固定时间，以提供消化的样品；(4)经过所述固定时间后，立即将消化的样品按其整体处理，以停止酶反应；(5)测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇；和(6)使用预测方程或预测技术，从步骤(1)和(5)中得到的试验食品的数据，计算该试验食品的血糖生成指数，所述预测方程或预测技术源自校准样品的校准数据多元分析，其中所述校准数据为相同类型，且以与步骤(1)和(5)中测定的试验食品的数据相同的方式获得，且其中所述校准样品具有已知的体内血糖生成指数值。

本发明体外方法可用于测定固体、半固体和液体食品的血糖生成指数值，与目前可得到的体外方法相比，具有显著提高的准确度和精密度。的确，由本发明方法获得的准确度和精密度与商业上可得到的体内方法相当，却显著节约时间和成本。

为了本发明的目的，“基本上均匀且细碎的状态”将表示相当于在足够低的温度下研磨食物从而使食物为脆性固体的研磨程度。通常，温度在约-40℃以下，温度优选低于约-78℃，温度更优选在使用液氮(-196℃)可获得的大约温度，对于研磨在环境温度下为固体或半固体的大多数食物，这类温度是足够的。也通常优选在这类低温研磨前，将环境温度的固体材料破碎或粗研磨。在一个优选的实施方案中，尤其对于环境温度下为固体或半固体的材料，在液氮温度或接近液氮温度下，使用液氮冷却研磨机完成研磨。在许多情况下，液体食品不需要任何研磨，因为它们基本上均匀且组分可溶解于载体中；然而，如果需要，这类液体食品也可于低温下研磨。半固体材料可能需要或可能不需要该低温研磨，以获得基本上均匀且细碎的状态。因此，例如，原味酸乳不需要进一步研磨，而其中有水果或其它固体成分的酸乳优选于低温下研磨，以获得基本上均匀且细碎的状态。关于需要“均匀且细碎的状态”的进一步指导可在本说明书包含的实施例中找到。

优选使用高效液相色谱法(HPLC)或等同定量方法测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。优选使用高效离子色谱法(HPIC)测定用酶处理期间释放的糖的量。更优选使用高效离子色谱法(HPIC)测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇的量。

附图简述

图1提供描述用于评估血糖生成指数及相关值的体外先有技术方法(即Englyst方法)的流程图。

图2提供举例说明本发明体外方法的流程图。

图3提供按照实施例1中所述体外方法得到的混合标准品(图A)和典型未知样品(图B)的典型色谱图。

图4A提供已知的体内血糖生成指数值与体外血糖生成指数值的比较，该体外血糖生成指数值基于实施例2中数据，使用带神经网络曲线拟合程序的本发明方法测得；本发明方法得到的R²值为0.97。图4B和4C提供已知的体内血糖生成指数值与可迅速利用的葡萄糖(RAG，其以每100g食物于20分钟内释放的葡萄糖克数表示)的比较，该可迅速利用的葡萄糖使用Englyst方法中用到的计算技术(即仅基于消化20分钟后释放的葡萄糖)，利用实施例2的数据获得。图4B为体内GI对RAG/(％可利用的碳水化合物)的图；图4C为体内GI对RAG的图。基于实施例2的数据集，使用Englyst计算技术，在图4B和4C中所示散点图中分别得到0.41和0.68的R²值。

图5A提供已知的体内血糖生成指数值和体外血糖生成指数值的比较，该体外血糖生成指数值基于实施例3中数据，使用带多重线性回归曲线拟合程序的本发明方法测得；本发明方法得到的R²值为0.94。图5B和5C提供已知的体内血糖生成指数值与可迅速利用的葡萄糖(RAG，其以每100g食物于20分钟内释放的葡萄糖克数表示)的比较，该可迅速利用的葡萄糖使用Englyst方法中用到的计算技术(即仅基于消化20分钟后释放的葡萄糖)，采用实施例3的数据获得。图5B为体内GI对RAG/(％可利用的碳水化合物)的图；图5C为体内GI对RAG的图。基于实施例3的数据集，使用Englyst计算技术，在图5B和5C中所示散点图中分别得到0.56和0.58的R²值。

图6提供已知的体内血糖生成指数值和体外血糖生成指数值的比较，该体外血糖生成指数值基于实施例4中数据，使用带神经网络曲线拟合程序的本发明方法测得；本发明方法得到的R²值为0.96。

发明详述

本发明提供体外分析方法，该方法根据采用食品与酶的模拟消化释放的蛋白质、脂肪和糖/糖醇的水平，使食品血糖生成指数的预测提高。目前的血糖生成指数测定方法通常需要人受试者以及费用昂贵且耗时。本发明方法能够在一天内，由一名分析人员测定最高达约15个食物样品的血糖生成指数，相对于使用人受试者的传统方法，显著地降低了成本。而且，本发明中避免了筛选人受试者、获得知情同意等方面的管理责任。使用本发明方法测定的血糖生成指数值显示与使用人受试者的传统测试获得的结果具有非常高的相关性。的确，该体外方法可获得比临床体内方法的结果更精确的结果。由于用于体外方法的校准样品数量大于(当另外的校准样品(即具有已知体内GI值的样品)掺入其中时可以继续增加)使用体内方法单次测定所用的数量，用于校准体外方法的体内数据(体外GI结果源自该数据)基于人受试者数目远远大于任何单次体内测试中所用到的血糖水平结果。而且，本发明方法可用于各种食品，包括固体食品及半固体食品(即酸乳等)和液体食品(即饮料等)。

本发明体外方法可用于测定固体、半固体和液体食品的血糖生成指数值，与目前可得到的体外方法相比，具有显著提高的准确度和精密度。的确，可由本发明方法获得的准确度和精密度似乎可与商业上可得到的体内方法相当，却可显著节约时间和成本。

为了本发明的目的，“基本上均匀且细碎的状态”将表示相当于在足够低的温度下研磨食物从而使食物为脆性固体的研磨程度。通常，温度在约-40℃以下，温度优选低于约-78℃，更优选温度在使用液氮(-196℃)可获得的大约温度，对于研磨在环境温度下为固体或半固体的大多数食物，这类温度是足够的。也通常优选在这类低温研磨前，于环境温度将固体材料破碎或粗研磨。在一个优选的实施方案中，尤其对于环境温度下为固体或半固体的材料，在液氮温度或接近液氮温度下，使用液氮冷却研磨机完成研磨。在许多情况下，液体食品不需要任何研磨，因为它们基本上均匀且组分可溶解于载体中；然而，如果需要，这类液体食品也可于低温下研磨。半固体材料可能需要或可能不需要该低温研磨，以获得基本上均匀且细碎的状态。因此，例如，原味酸乳不需要进一步的研磨，然而其中有水果或其它固体成分的酸乳优选于低温下研磨，以获得基本上均匀且细碎的状态。关于需要“均匀且细碎的状态”的进一步指导可在本说明书包含的实施例中找到。

优选使用高效液相色谱法(HPLC)或等同定量方法，测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。优选使用高效离子色谱法(HPIC)测定用酶处理期间释放的糖和/或糖醇的量。甚至更优选使用高效离子色谱法(HPIC)，测定来自步骤(4)的消化样品中的葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇的量。当然，对于特定的食物样品，可测得消化样品中这些糖或糖醇的一种或多种基本上为零(即特定的糖或糖醇可能不存在)。在这种情况下，与特定糖和/或糖醇相关的一个或多个术语将为零(或接近于零)，且那些糖和/或糖醇对GI的贡献将极微。

目前，麦芽糖醇似乎是唯一糖醇，其在科学文献中显示在食品中正常遇到的水平下对血糖浓度具有可检测的影响。由于带合适柱子的HPIC能够测定更多的糖和糖醇(不仅仅为麦芽糖醇)，如果如此需要，更多的糖和糖醇可包括在分析和校准步骤中。

在具有消化酶混合物的消化步骤中，使用足以提供标准化量的碳水化合物的量的基本上均匀且细碎状态的试验食物样品，保持一段固定的时间，以提供消化的样品。为了本发明的目的，在消化步骤中使用的基本上均匀且细碎的试验食物样品的量应包含“标准化量”的可利用碳水化合物。在消化步骤中，考虑到糖和糖醇的精确测定，选择可利用碳水化合物的该标准化量，以获得足够的糖和/或糖醇；此外，可利用碳水化合物的该标准化量使得消化酶作用于相似量的底物上。在实施例1中举例说明的具体方案中，通常发现可利用碳水化合物的标准化量应为约0.2至约1g，更优选约0.5g。如果能获得糖和糖醇的足够准确测定，可以使用更高或更低的量。当然，一旦选择标准化量，优选该量用于所有的测定(包括用于校准方法的那些以及一旦校准后的未知样品)。为了该方法的目的，规定可利用碳水化合物含量为总碳水化合物含量减去膳食纤维含量减去除麦芽糖醇外糖醇的总含量。如果除麦芽糖醇外的另外糖醇包括在分析和校准中，那么样品中那些糖醇的含量将需要作为可利用碳水化合物也包括于其中。

类似地，选择消化步骤的固定时间以提供足够的糖和/或糖醇，以允许准确测定其中生成的糖和糖醇。在实施例1中举例说明的具体方案中，通常发现固定时间应为约15至约25分钟，更优选约20分钟。如果产生足够量的糖和/或糖醇，允许糖和糖醇的准确测定，则可以使用更短或更长的消化时间。当然，一旦选择固定时间，该时间值应该用于所有的测定(包括用于校准方法的那些以及一旦校准后的未知样品)；换句话说，标准化的消化时间应该用于所有校准和未知样品的整个测定过程。通常，应当尽量在所选固定时间的约±10秒内停止消化步骤，甚至更优选于约±5秒内停止消化步骤。

图2举例说明本发明的一个实施方案。该方法用在环境温度下可能为固体、半固体或液体的试验食物样品开始。如上所述，试验食品应认为是“基本上均匀且细碎的状态”。对于在环境温度下为固体或半固体的大多数食物，这可通过在足够低的温度下研磨食物从而使食物为脆性固体来完成。通常，温度在约-40℃以下，温度优选低于约-78℃，更优选温度在使用液氮可获得的大约温度，对于研磨在环境温度下为固体或半固体的大多数食物，这类温度是足够的。也通常优选在这类低温研磨前，于环境温度将固体材料破碎或粗研磨。因此，如图2显示，优选粗研磨试验食物样品以简单地破碎样品成更小的粒子，然后细研磨以获得基本上均匀且细碎的样品。在一个优选的实施方案中，尤其对于在环境温度下为固体或半固体的材料，于液氮温度或接近液氮温度下使用液氮冷却研磨机完成细研磨。在许多情况中，液体食品不需要任何研磨，因为它们基本上均匀且组分可溶解于载体中；然而，如果需要，这类液体食品也可于低温下研磨。半固体材料可能需要或可能不需要该低温研磨以获得基本上均匀且细碎的状态。因此，例如，原味酸乳不需要进一步的研磨，然而其中有水果或其它固体成分的酸乳优选于低温下研磨，以获得基本上均匀且细碎的状态。

本领域技术人员会理解，对于指定“基本上均匀且细碎的状态”的所得粒度范围是不必要的，且的确是困难的。适合由该方法分析的大多数食物样品将包含显著的水分水平。因此，即使在液氮温度下(因为在该温度下它们的易碎性质，因此固体会更容易研磨)研磨，当让其回到环境温度时，因为它们的水分含量，粒子可能结块。于低温下研磨可获得均匀且细碎的状态(至少部分)，这显然使得本发明方法准确和精密。因此，在大多数情况下，低温研磨的使用为制备均匀、细碎混合物(尤其是具有高度不均匀性的样品如巧克力薄饼、什锦干果(trail mixes)等)的最合适方式。然而，如果样品含有物理受阻(physically-hindered)淀粉(例如通过完整或部分完整的细胞壁保护使其免受消化酶影响的淀粉)，直接从粗研磨或压碎到消化的加工可能更为合适，因为破裂壁结构可能导致淀粉变得太容易接近消化酶而导致错误的高GI数值。因此，像马铃薯片类的样品优选不于低温下研磨。当马铃薯片于低温下研磨成细粉时，得到的分析结果GI值为约70-75。如果马铃薯片仅进行粗研磨(由于在环境温度下马铃薯片是易碎的，因而该操作容易实现)，得到的分析结果GI值为约55-60，这个值与文献中值更加一致(Am.J.Clin.Nutr.，76，5-56(2002)报告平均值为54±3)。因此，本领域技术人员会认识到，样品制备技术为减少样品不均匀性而不过分破坏可能减慢淀粉消化的天然结构的平衡。

一旦样品处于所需均匀且细碎的状态，即可经酶消化以模拟消化过程。优选加入胃蛋白酶以开始蛋白质的水解。然后，使用酶的混合物以消化样品中存在的碳水化合物，从而生成糖并且溶解样品中可能存在的游离糖和糖醇。重要的是，当测定标准品(在首次测定模型系数时以及随后检查整个方法时)和未知物时，使用标准化条件。尽管这些标准化条件可能变化，一旦它们被选择，在整个方法校准和随后未知样品的测定过程中，它们就应该尽可能地保持接近。通常，酶的混合物含有足够量的胰酶、淀粉葡萄糖苷酶(AMG)和转化酶，以基本上转化样品中的所有碳水化合物成糖，并溶解样品中的任何游离糖或糖醇。通常于37℃用酶混合物温育20分钟；再一次，用于温育(只要它们使得酶工作)的准确温度和时间不如在整个校准过程和未知样品测定过程中使用的相同温育温度和消化时间(即消化的固定时间)重要。

一旦温育已进行所需的时间(即标准化时间20分钟±10秒)，立即停止酶反应。优选，加入乙醇以便立即停止酶反应。然后，优选将样品过滤以除去可能存在的任何沉淀或微粒物质，收集样品。重要的是，从温育开始的时间直到收集样品(即在酶反应已经停止之后)，保持完整或全部样品。即，这段时间期间不进行样品分离或分开(不同之处在于在酶反应停止之后过滤)。该操作期间保持样品的物理完整性，避免与可能为非均匀混合物的样品有关的误差。因此，例如，当20分钟消化之后从消化混合物取出等分试样时，Englyst方法可能引入显著性取样误差，因为那段时间混合物通常为悬浮形式。本发明方法避免了这些问题。

一旦从消化混合物获得最终样品(优选在过滤后除去任何固体材料残留物)，使用高效液相色谱法(HPLC)或等同定量方法测定糖和糖醇的含量。优选使用高效离子色谱法(HPIC)，因为该技术通常给予糖更好的分离，尤其是葡萄糖和半乳糖，使得在同一分离中测定糖和糖醇(如麦芽糖醇)，由于脉冲电化学检测的高选择性通常不易受干扰。合适的设备和操作条件在实施例1中举例说明。本领域技术人员会再一次意识到具体设备和操作参数不如测定标准化条件和随后使它们自始至终的保持重要。优选测定消化样品中的葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。甚至更优选测定消化样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇的量。如上所述，如果需要，另外的糖和糖醇可包括在分析和校准步骤中。

另外，测定试验食物样品的蛋白质和脂肪含量。使用标准和常规分析技术可测定这些参数，并且/或者基于试验食物样品的成分可计算这些参数。使用多元分析对血糖生成指数进行预测值的测定，例如多重线性回归(MLR)、偏最小二乘法(PLS)或神经网络曲线拟合程序。神经网络曲线拟合程序似乎最适合实施例中产生的数据，因而通常是优选的(见图4A中的散点图)。通过上面的HPIC方法分析消化混合物，以得到最终样品消化物中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇含量的定量值。那些值与原始样品总％蛋白质和％脂肪一起优选输入合适的统计软件程序(如JMP统计软件)，然后基于适当预测或相关方程或预测技术预测原始样品的GI值。

预测方程或预测技术源自临床或体内GI值已知的校准集的数据。这在图2中举例说明，其中使用断箭头指示用于预测方程或预测技术的参数测定。使用如上详述和实施例1中的相同标准化条件和方法测得数据。实施例1中使用的校准集包括食品和临床GI值已知的一系列纯标准品。实施例1中使用的校准标准品跨越GI值19-100的范围，且用与校准中其他食物样品完全相同的方式处理。所有校准样品和标准品以及后来的所有未知样品都应使用相同的标准化条件和方法分析。使用适当的软件，利用来自校准样品和标准品的数据得到方程或最符合临床体内GI值与预测变量之间相关性的其他关系。优选，使用多元分析技术(如MLR、PLS或神经网络)。如果需要，来自最近可得到的校准样品或标准品的其他体内数据可结合至模型中，以更新并改善方程或预测技术的预测变量。

文中描述的方法优选包括上面列出的所有糖加校准中的麦芽糖醇。然而，如果已知可能遇到的样品不含某些组分，可省去它们的校准(如麦芽糖醇、半乳糖)。同样，与食品有关的其他参数或测量(如有机酸含量、β-葡聚糖含量等)可包括在内。发现消化样品中的蔗糖量一般基本为零，因为预计转化酶可使存在的任何蔗糖转化成葡萄糖和果糖。如果需要，蔗糖可作为内部检验测定。因而，如果该方法适当进行，蔗糖的水平应基本上为零；如果检测到大量蔗糖，应怀疑分析结果且应重复样品。当然，如果为该方法选择的标准化条件和参数的确导致消化样品中基本上没有蔗糖，则应利用仅使用蔗糖作为有效内标的该方法。如果样品包含可抑制转化酶活性的任何物质，在形成校准数据集中定量蔗糖剩余物的能力可能是有用的，在计算体外GI值中校准数据集考虑抑制作用。

以下实施例将举例说明本发明，但并不限制本发明。除非另外指出，所有的百分比和比例基于重量计。本文中引用的所有出版物通过引用结合到本文中。

实施例1.为了进行本发明体外血糖生成指数的测定，为了对方法的校准和未知样品的测定，该实施例提供详细的分析方案。在建议了具体设备、试剂和/或具体方法和操作参数的所有情况下，将会理解可使用等同的设备、试剂和/或具体方法和操作参数。

仪器：1.温控的振荡水浴(能够达约175冲程/min)；2.旋涡混合器；3.分析天平(精密至±0.0001g)；4.量瓶，A类，100ml、1000ml；5.移液管，A类，1ml、2ml、5ml、6ml、10ml；6.玻璃球，6mm(Fisher#11-312-D或等同物)；7.带螺旋盖的玻璃样品瓶(40ml)(VWR#66014-389或等同物)；8.带螺旋盖的塑料离心管(50ml)(VWR#21008-730或等同物)；9.离心机；10.Spex CertiPrep 6850冷冻研磨机或等同物；11.1夸脱的Mason广口瓶；12.过滤漏斗；13.Whatman#4快速滤纸，12.5cm圆周，或等同物；14.环形支架；15.Anotop 10加0.2微米10mm直径的注射器过滤器；16.在下面题为“HPIC方法”部分中列出的HPIC设备和试剂；以及17.JMP统计软件，5.1版本，SAS协会，或等同物。

试剂：1.0.5N盐酸(HCl)(VWR#VW3201-1)；2.醋酸钠(NaAc)(Acros#42425-5000)；3.乙醇USP，190酒精纯度(proof)-95％(95％EtOH)(AaperAlcohol&Chemical公司)；4.来自面包酵母的转化酶，215U/mg固体(Sigma#1-9274)；5.淀粉葡萄糖苷酶(AMG)，300U/ml(Novozymes#AMG300L)(注意：应于0-25℃下贮藏并于运输当日起3个月内使用)；6.来自猪胃粘膜的胃蛋白酶，439U/mg固体(Sigma#P-7000)7.瓜尔胶(Sigma#G4129-250G)；8.来自猪胰腺的胰酶(Sigma#P-7545)；9.去离子水(H₂O)；和10.液氮；以及11.无水葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖醇的纯标准品(最小99％纯度，Sigma Aldrich公司或等同物；不使用时应在干燥器中贮藏)。

溶液：1.0.05N HCl溶液(用去离子水稀释100ml 0.5N HCl至1000ml)；2.胃蛋白酶/瓜尔胶溶液(2195U/ml胃蛋白酶和0.5％瓜尔胶(W/V)的0.05N HCl溶液)—0.5g胃蛋白酶和0.5g瓜尔胶溶解在100ml 0.05NHCl中；3.转化酶储备溶液(510.7U/ml的H₂O溶液)—100mg转化酶溶解在42.10ml H₂O中；4.0.5M醋酸钠溶液(0.5M NaAc的H₂O溶液)—4.10g醋酸钠溶解在100ml H₂O中；5.66％乙醇溶液(66％EtOH)(V/V)—347ml乙醇与153ml去离子水混合在1夸脱带盖的广口瓶中；该溶液足够一个样品用；以及6.酶溶液(一个样品用的配比—136mg/ml胰酶、13.4U/ml AMG和25.43U/ml转化酶)：I.称取1.0g胰酶至50ml离心管中；ii.加入6.67ml H₂O并将混合物涡旋10min至完全溶解(如果制备供多个样品使用的溶液，可能需要搅拌棒或玻璃球)；iii.于2000rpm下离心10min；和iv.至于各供试样品，转移6ml上清液至另一个50ml离心管，加入296μl AMG和330μl转化酶储备溶液。

固体样品的样品制备：

1.样品放置在Waring实验室用极细研磨机中并研磨直至样品完全混合(通常30-60秒足够)。

2.然后将来自极细研磨机的3盎司/100g子样品在SpexCertiPrep 6850冷冻机/研磨机中低温研磨。Spex CertiPrep 6850冷冻机/研磨机为由液氮冷却的冲击式研磨机。冷脆的样品通过冲击器捶打小瓶的端塞而粉碎。样品应占研磨瓶(#6801)高度的约1/3至约1/2。

3.6850冷冻机/研磨机可使用其键盘编程。控制模型和条件：循环1-研磨时间1.5min；速度(冲击频率)10周/秒；以及预冷却时间4min.(即研磨开始之前的时间)。

4.在研磨循环结束时，倒空小瓶至合适的容器中并盖上盖子。

消化方法：

1.称取相当于0.50g可利用碳水化合物的样品量(可利用碳水化合物＝总碳水化合物-纤维-除麦芽糖醇之外的糖醇)至40ml玻璃带螺旋盖小瓶中，加入5ml H₂O、10ml新鲜制备的胃蛋白酶/瓜尔胶溶液和5粒玻璃球。由0.5g水组成的样品空白也与每一批样品一起运行。

2.剧烈将封盖小瓶涡旋混合，水平置放在37℃振荡水浴中(175冲程/min)；振摇30min使得蛋白质由胃蛋白酶水解。

3.向小瓶中加入5.0ml 0.5M NaAc(平衡至37℃)。

4.混合，然后加入5ml酶溶液。反转混合。该消化混合物的pH应为约5。

5.原始样品立即水平放置在37℃振荡水浴中以继续酶反应。振摇20分钟。20分钟(±10秒)之后从摇床中取出样品小瓶。

6.立即倾出小瓶的内容物至含500ml 66％ EtOH的广口瓶(mason jar)中以停止反应。用来自广口瓶的几滴EtOH溶液冲洗小瓶，盖上广口瓶，然后再次反转混合。通过快速滤纸立即过滤一部分广口瓶内容物至40ml螺旋盖小瓶中，盖上盖子，保存用于HPIC分析。

然后按如下所述由HPIC分析消化的样品的糖和糖醇含量：

1.设备—Dionex色谱系统，由如下组件组成：高效泵；液相色谱模块；脉冲电化学检测器；洗脱液脱气模块；和Dionex Chromeleon色谱工作站。

2.试剂和标准品去离子水，18MΩ-cm电阻；氢氧化钠溶液50％w/w，低碳酸盐；和半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖醇纯标准品。

3.条件：柱：CarboPacTM PA1分析柱(4×250mm)和AminoTrap保护柱(4×50mm)；操作条件：压力：1200-1500psi；注射容量：10μl；洗脱液：21mM氢氧化钠(可调节以便各柱达到最佳分离；注意：在运行之间应该用200mM NaOH冲洗CarboPac PA1以防止碳酸盐在柱上累积)；流速：1mL/min；以及检测器：脉冲电流，可任意处理的金工作电极和标准碳水化合物设置。

4.溶液的制备：a)洗脱液：用1.0L去离子水(18MΩ-cm电阻)稀释1.6725g NaOH溶液(50％w/w，低碳酸盐)；b)柱洗涤溶液：200mM NaOH：用1.0L去离子水(18MΩ-cm电阻)稀释16g NaOH溶液(50％w/w，低碳酸盐)；

5.标准溶液的制备：精确称取上述6种标准品(即半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖醇纯标准品)每种约0.1000gm至100ml量瓶中，以制得1000ppm混合标准品的去离子水溶液(18MΩ-cm电阻)。稀释该溶液以制得如下工作标准溶液：a)1ml稀释至包含66ml乙醇(195酒精纯度)的1000ml以制得1ppm标准溶液；b)2ml稀释至包含6.6ml乙醇(195酒精纯度)的100ml以制得20ppm标准溶液；c)5ml稀释至包含6.6ml乙醇(195酒精纯度)的100ml以制得50ppm标准溶液；和d)10ml稀释至包含6.6ml乙醇(195酒精纯度)的100ml以制得100ppm标准溶液。

6.样品的制备和注入：来自消化方法的最终消化溶液按1∶10用去离子水稀释，然后经0.2微米Anotop 10Plus注射滤器过滤至自动进样瓶中。然后样品溶液(10μl)注入至色谱仪中。

7.色谱梯度条件：

8.电化学检测器参数：使用带Ag/AgCl参比电极的预加载波形：

时间	电位	积分
			0.0	+0.10
0.20	+0.10	开始
			0.40	+0.10	结束
0.41	-2.00
			0.42	-2.00
0.43	-0.60
			0.44	-0.10
0.55	-0.10

柱贮藏溶液：21mM氢氧化钠(NaOH)

9.糖和麦芽糖醇的定量测定：

1、20、50和100ppm的混合标准品注入至HPIC中，使用色谱系统用的合适软件作校准曲线。如果样品中一种或多种分析物的浓度超过最高标准品的浓度，则应扩展校准曲线以包括浓度高于在最浓样品中发现的那些的标准品。然后样品空白或供试样品注入至HPIC中，使用峰面积从校准曲线计算半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖醇的浓度。来自校准曲线的浓度乘以10是上面步骤6中样品和样品空白的10倍稀释度，并以最终消化物中各分析物的％报道。

样品空白中各分析物的浓度值(％)应从各样品中各分析物的那些中减去，以达到空白修正的样品浓度值(％)。

混合标准品(图A)和一般未知样品或供试样品(图B)的实例色谱图显示在图3中。

计算：

通过多重线性回归(MLR)、偏最小二乘法(PLS)或神经网络曲线拟合程序完成对血糖生成指数预测值的测定。通过上面的HPIC方法分析消化混合物以产生对最终样品消化物中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇含量的空白修正定量值。那些值与从成分值分析或计算测得的原始样品的总％蛋白质和％脂肪一起输入JMP统计软件空白表格程序，然后基于适合所用特定曲线拟合程序的预测方程或预测技术，预测原始样品的GI值。

预测方程预测技术源自于临床体内GI值已知的校准集数据。校准集包括临床GI值已知的食品和一系列纯标准品。用于实施例2中校准方法的这些标准品跨越GI值19-100的范围，用与校准中其他食物样品完全相同的方式处理。它们被分析之后，另外的样品和/或标准品可加入至校准集，如果那些样品和/或标准品的体内GI值已知，则重新计算模型参数；这些增加的样品应该通过制定更宽广、有代表性、GI可测定的食物样品群体的校准集而加强校准。因此，预测方程或预测技术可更新以包括最近可得到或改善的体内数据。所有校准样品和标准品通过上述方法预先分析，然后使用JMP统计软件以拟合方程至最符合临床GI值与预测变量之间关系的数据，也可使用MLR、PLS或神经网络方法。

文中描述的方法包括校准中的所有糖加麦芽糖醇。然而，如果已知可能遇到的样品不含某些组分，则可省去它们的校准(如麦芽糖醇、半乳糖)。由于转化酶的作用，使存在的任何蔗糖转化成葡萄糖和果糖，发现消化的样品中的蔗糖量一般基本上为零。然而，如果样品含有转化酶活性抑制剂，在形成校准方程中包括蔗糖水平的能力可能是有用的，在体外GI值的计算中校准方程考虑抑制作用。麦芽糖醇是在科学文献中显示在食品中正常遇到的水平下对血糖浓度具有可检测影响的唯一糖醇。由于带合适柱子的HPIC能够测定更多糖和糖醇(不仅仅是麦芽糖醇)，如果如此需要，更多糖和糖醇可包括在分析和校准步骤中。

输入样品中％蛋白质、样品中％脂肪和消化物中％葡萄糖的空白修正浓度值、消化物中％果糖、消化物中％乳糖、消化物中％蔗糖、消化物中％半乳糖和消化物中％麦芽糖醇至适当的统计软件包(如JMP统计软件)，然后自动预测GI值，从而预测未知样品。

实施例2.使用体内和体外实验方案检查大量商业上可得到的食品和其他食物样品。使用体内试验测定大多数(25/34)的体内血糖生成指数值，在这个试验中由有名的、很受人尊重的、有经验的私人实验室进行；剩余的这些体内血糖生成指数值取自科学文献。也使用实施例1中描述的本发明体外方法检查这些相同样品。然后使用JMP统计软件中可利用的MLR、PLS和神经网络方法，用这些数据计算文中描述的体外血糖生成指数试验用的模型参数。

在母案申请提交之后，发现用于制备胃蛋白酶/瓜尔胶溶液的HCl溶液为0.5N，而不是所需的0.05N。因为胃蛋白酶/瓜尔胶溶液用于制备酶消化溶液，酶消化期间的pH为约1.1而不是所需的约5。该低pH值不是酶消化反应的最佳值。因此，由于pH太低，因此释放出相对于样品中脂肪和蛋白质水平不同水平的各种糖。然而，由于所有样品用相同方式处理(即消化期间相同的pH下)，因此预测的血糖生成指数值的相对值保持有效。当然，如果酶消化期间较低的pH也用于新的未知样品，则源自这个数据集的模型参数和/或系数将仅适合使用。以下实施例3和4使用适当的HCl溶液进行；因此于更佳的pH条件下进行酶消化反应。

使用MLR方法获得以下模型参数：

项目	值	标准误差	t比	概率＞\|t\|
					截距	63.080214	6.498483	9.71	＜0.0001
蛋白质(％)	-0.974313	0.141985	-6.86	＜0.0001
					脂肪(％)	-0.67442	0.087795	-7.68	＜0.0001
葡萄糖(％)	364.97478	75.57708	4.83	＜0.0001
					果糖(％)	-452.5341	75.17166	-6.02	＜0.0001
乳糖(％)	-191.8138	84.17182	-2.28	0.0311
					半乳糖(％)	-437.3615	90.44204	-4.84	＜0.0001
麦芽糖醇(％)	-298.0102	92.58933	-3.22	0.0034

因此，利用MLR方法用以评估体外血糖生成指数的方程为：GI＝63.080214-0.974313蛋白质(％)-0.67442脂肪(％)+367.97478葡萄糖(％)-452.5341果糖(％)-191.8138乳糖(％)-437.3615半乳糖(％)-298.0102麦芽糖醇(％)。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结

R²	0.948355
		R²Adj	0.934451
均方根误差	6.094049
		响应平均值	46.52941
观测值(或总权重)	34

方差分析：

来源	DF	平方和	均方	F比
					模型	7	17730.897	2532.99	68.2057
误差	26	965.573	37.14	概率＞F

C.总共

33

18696.471

＜.0001

使用PLS方法，采用五个潜在变量，获得以下模型参数：

项目	值
		截距	62.745005
蛋白质(％)	-0.986004
		脂肪(％)	-0.670993
葡萄糖(％)	369.91833
		果糖(％)	-446.4468
乳糖(％)	-195.07
		半乳糖(％)	-425.7489
麦芽糖醇(％)	-291.97779

因此，利用PLS方法用以评估体外血糖生成指数的方程将为：GI＝62.745005-0.986004蛋白质(％)-0.670993脂肪(％)+369.91833葡萄糖(％)-446.4468果糖(％)-195.07乳糖(％)-425.7489半乳糖(％)-291.9779麦芽糖醇(％)。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结：

R²	0.939819
		R²Adj	0.937938
均方根误差	5.929726
		响应平均值	46.52941
观测值(或总权重)	34

使用神经网络方法获得以下模型参数权重：神经网络表I：

参数权重	值
		H1：截距	0.6715187765
H1：蛋白质(％)	0.3364859726
		H1：脂肪(％)	0.2031260198
H1：葡萄糖(％)	-0.697405591
		H1：果糖(％)	0.0085016679
H1：乳糖(％)	-0.162454793
		H1：半乳糖(％)	0.0632785954
H1：麦芽糖醇(％)	-0.053195992
		GI：截距	3.994861093
GI：H1	-6.220038739

神经网络方法不会提供简单的预测方程。相反，该方法提供一系列参数权重和网络布局，然后这些可用于使用合适的软件程序(在该情况下为JMP统计软件)获得预测结果。使用该方法获得的拟合见图5A中图示。用于该模型的相关参数如下：

	具体数值
		隐节点数	1
过拟合罚数(Overfit Penalty)	0.01
		Tour数目	200
最大迭代次数	50
		收敛性	0.00001

结果：

SSE	4.1349837524
		罚数	0.3981397476
总计	4.5331235
		N	65

200	收敛最好
		0	比最好的差的收敛
0	粘合在平台上
		0	未能改善
0	达到最大迭代

Y	SSE	SSE Scaled	RMSE	RMSEScaled	R²
						GI	1540.3848224	4.1349837524	4.94475002	0.25619263	0.9354

然后使用所得模型参数，利用各数据拟合方法计算体外血糖生成指数值。使用从以下商业上可得到的产品的结果计算相关参数。使用各数据拟合方法测定所得的体外血糖生成指数值与体内血糖生成指数值比较：

^*使用私人测试实验室实验测定体内值，除非另外注明。^**体内值取自：“血糖生成指数的国际表和血糖负荷值，”Am.J.Clin.Nutr.，76，5-56(2002)。体内值取自：Livesy，Nutr.Res.Rev.，16(2)，163-91(2003)。

体内值取自：Jentjens等，Eur.J.App.l Physiol.88，459-465(2003)。作为曲线拟合程序使用神经网络获得的该数据散点图显示在图4A中。使用该方法获得0.97的R²值。体外方法(基于34个总样品的一式两份测定)的标准偏差为±1.08GI单位或±2.33相对百分比。因此，该方法明显具有非常高的精密度和高的预测价值。

实施例3.在提交原始申请之后，继续工作，加入另外的数据点，对该方法进行某些修改以提供甚至更正确和精确的体外方法。如上面实施例2中所述，实施例2中酶消化步骤期间的pH太低。用于酶消化步骤的适当pH值应为约5；除那个修改之外，按与实施例2中相同的方式处理样品。因此，再运行实施例2中使用的31个样品以获得于更佳的酶消化pH下的数据。此外，34个新样品加入至实施例2再运行的样品中，得到样品总数为65。该体外方法(当前为该部分继续申请的日期)基于在更佳pH值下酶消化的样品，并在本文中提供。当然，本领域技术人员可认识到，该方法的准确度和精确度甚至也可能进一步增加，因为用于校准样品和/或标准品的另外体内数据可得到，且在校准过程期间结合至体外模型中。

利用MLR方法获得以下模型参数：

项目	值	标准误差	t比	概率＞\|t\|
					截距	26.779686	2.179648	12.29	＜0.0001
蛋白质(％)	-0.967251	44.81633	-8.92	＜0.0001
					脂肪(％)	-0.385715	0.073903	-5.22	＜0.0001
葡萄糖(％)	611.60013	30.00233	20.39	＜0.0001
					乳糖(％)	301.95014	44.81633	6.74	＜0.0001
麦芽糖醇(％)	169.03383	54.85795	3.08	0032
					(葡萄糖(％)-0.05718)^＊(蛋白质(％)-8.24967)	-18.16062	5.456618	-3.33	0.0015

因此，利用MLR方法和扩充的数据集用以评估体外血糖生成指数的方程将是：GI＝26.779686-0.967251蛋白质(％)-0.385715脂肪(％)+611.60013葡萄糖(％)+301.95014乳糖(％)+169.03383麦芽糖醇(％)-18.16062[葡萄糖(％)-0.05718]^*[蛋白质(％)-8.24967]。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结：

R²	0.940178
		R²Adj	0.93399
均方根误差	4.958869
		响应平均值	50.4
观测值(或总权重)	65

方差分析：

来源	DF	平方和	均方	F比
					模型	6	22415.358	2532.99	151.9250
误差	58	1426.242	24.59	Prob＞F
					C.总共	64	23841.6000		＜.0001

使用PLS方法，采用五个潜在变量获得以下模型参数：

项目	值
		截距	26.264529
蛋白质(％)	-1.048186
		脂肪(％)	-0.248138
葡萄糖(％)	621.7824
		果糖(％)	-52.7993
乳糖(％)	233.67679
		半乳糖(％)	-61.21071
麦芽糖醇(％)	84.689245

因此，利用PLS方法用以评估体外血糖生成指数的方程将为：GI＝26.264529-1.048186蛋白质(％)-0.248138脂肪(％)+621.7824葡萄糖(％)-52.7993果糖(％)+233.67679乳糖(％)-61.21071半乳糖(％)+84.689245麦芽糖醇(％)。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结：

R²	0.930041
		R²Adj	0.9289831
均方根误差	5.145383
		响应平均值	50.4
观测值(或总权重)	65

利用神经网络方法获得以下模型参数权重：神经网络表I：

如实施例2中所示，神经网络方法不会提供简单的预测方程。相反，该方法提供一系列参数权重和网络布局，然后这些可用于使用合适的软件程序(在该情况下为JMP统计软件)获得预测结果。使用该方法获得的拟合见图4A中图示。用于该模型的相关参数如下：

	具体数值
		隐节点数	1
过拟合罚数	0.01
		Tour数目	200
最大迭代次数	50

收敛性

0.00001

结果：

SSE	4.1349837524
		罚数	0.3981397476
总计	4.5331235
		N	65

Y	SSE	SSE Scaled	RMSE	R²
					GI	1540.3848224	4.1349837524	4.94475002	0.9354

然后使用所得模型参数，利用如实施例2中的各数据拟合方法计算体外血糖生成指数值。使用以下产品的结果(实施例2中大约超过33个)，计算各模型的相关参数。使用各数据拟合模型或有扩充数据集的方法测定所得的体外血糖生成指数值与体内血糖生成指数值比较：

^*使用私人测试实验室实验测定体内值，除非另外注明。^**体内值取自：“血糖生成指数的国际表和血糖负荷值，”Am.J.Clin.Nutr.，76，5-56(2002)。^***苏打饼干的该体内值不同于实施例2中使用的。这使数值显得更准确。^****基于两次测定的平均值的可口可乐体内值不同于基于仅一次测定的实施例2中使用的值。这使数值显得更准确。

体内值取自：“血糖生成指数的国际表和血糖负荷值，”Am.J.Clin.Nutr.，76，5-56(2002)(异常值排除)。因此，该值稍微不同于实施例2中使用的值。

体内值取自生产商数据。

马铃薯片的该体内值为实施例2中马铃薯片1和马铃薯片2的平均值。实施例2中测定的两种马铃薯片样品在性质上非常相似。

体内值取自：Livesy，Nutr.Res.Rev.，16(2)，163-91(2003)。

体内值取自：Jentjens等，Eur.J.App.l Physiol.88，459-465(2003)。

利用MLR曲线拟合程序获得的该数据散点图显示在图5A中。使用该方法获得0.94的R²值。体外方法(基于65个总样品的一式两份测定)的标准偏差为±4 GI单位或±6相对百分比。因此，该方法明显具有非常高的精密度和高的预测价值。

通过简单进行文中描述用于样品制备和分析的方法，并使用从校准数据测得的数据和所需预测方程，随后可使用该体外方法计算未知食品或食物成分的体外GI值。当然，通过比较实施例2和3证明，校准结果和预测方程数据将取决于分析校准数据集和未知样品(尤其是关于酶消化步骤)的实际条件。然而，只要使用相同方法用于所有样品，分析过程中不会出现显著影响本发明方法预测能力的差异，即使当预测方程广泛不同时。我们相信，这证明该体外方法的稳定性。当校准数据集的大小在样品数量和/或所用体内GI值的准确度方面增加时，预计该方法的准确度和精密度会增加。

如上所述，Garsetti等提供用于体外Englyst方法、R²值为0.25的散点图，因此表明该方法具有很小的预测价值。为了进一步比较的目的，使用Englyst方法(即仅基于20分钟消化之后释放的葡萄糖)中所用计算技术，基于实施例2和3的数据获得可迅速利用的葡萄糖(RAG，其表示为每100g食物于20分钟内释放的葡萄糖克数)，使用如Englyst等，Brit.J.Nutr.，75，327-337(1996)(图4B)和Englyst等，Am.J.Clin.Nutr.，69，448-454(1999)(图4C)中详述的体外Englyst方法(即仅使用20分钟之后释放的葡萄糖)中描述的计算和参数获得体内GI值，所述RAG分别与该体内GI值相关。这些散点图显示在使用实施例2数据的图4B和4C中，显示在使用实施例4数据的图5B和5C中。在图4B和5B中，体内GI分别对实施例2和实施例3数据的RAG/(％可利用碳水化合物)作图；在图4C和5C中，体内GI分别对实施例2和实施例3数据的RAG作图。当使用实施例2数据进行这种计算时，Englyst等方法的R²值在图4B和4C中分别增大至约0.41和约0.68；当使用实施例3的数据时，Englyst等方法的R²值在图5B和5C中分别增大至约0.56和约0.58。与Garsetti等的散点图相比，尽管这些表示有改善，但该方法的预测价值仍然匮乏。

我们相信，如本发明方法约0.94至约0.97的R²值(取决于所用的具体曲线拟合方法和数据产生的条件)所证明的，第一次提供了一种体外方法，该体外方法可用于准确并精密测定各种食品和/或食物成分的血糖生成指数值。可使用该方法容易、快速且便宜地获得准确的血糖生成指数值，与目前推荐的更耗时且更昂贵的人受试者体内试验相比，在准确度方面有利。此外，该方法的准确度和精确度甚至可能进一步增加，因为用于校准样品和/或标准品的其他体内数据可得到，且在校准过程期间结合至体外模型。本领域的该进展在人营养中应增加血糖生成指数和有关值(如由血糖生成指数乘以食物提供的碳水化合物的量(克)并将总数除以100测得的血糖负荷值)的有效性。

实施例4.实施例2中使用的样品(在酶反应步骤中使用小于较佳的pH值)在实施例3中使用更佳的pH值再运行。使用仅再运行的实施例2数据集(即不包括在实施例3中添加的其他样品)的实施例3的数据以产生各种曲线拟合参数的新数据集。该实施例-基于实施例2的34个样品中的31个-有效的举例说明实施例2的体外分析，并且样品于更佳的pH值下运行。这允许实施例2和实施例3的相关系数或参数更直接地比较，其中各数据集中仅样品数目改变。

利用MLR方法获得该修正数据集的以下模型参数：

项目	值	标准误差	t比	概率＞\|t\|
					截距	30.502796	3.388751	9.00	＜0.0001
蛋白质(％)	-0.787639	0.137003	-5.75	＜0.0001
					脂肪(％)	-0.515649	0.088565	-5.82	＜0.0001
葡萄糖(％)	573.03525	51.23366	11.18	＜0.0001
					乳糖(％)	275.61246	45.69519	6.03	＜0.0001
麦芽糖醇(％)	147.62386	51.90435	2.84	0.0090
					(葡萄糖(％)-0.05091)^＊(％蛋白质-10.0429)	-20.39966	6.583621	-3.10	0.0049

因此，利用MLR方法用以评估体外血糖生成指数的方程为：GI＝30.502796-0.787639蛋白质(％)-0.515649脂肪(％)+573.03525葡萄糖(％)+275.61246乳糖(％)+147.62386麦芽糖醇(％)-20.39966[葡萄糖(％)-0.05091]^*[蛋白质(％)-10.0429]。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结：

R²	0.968035
		R²Adj	0.960043
均方根误差	4.393218
		响应平均值	45.03226
观测值(或总权重)	31

方差分析：

来源	DF	平方和	均方	F比
					模型	6	14027.759	2337.96	121.1355
误差	24	463.209	19.31	Prob＞F
					C.总共	30	14490.968		＜.0001

利用PLS方法，采用五个潜在变量获得以下模型参数：

项目	值
		截距	48.443999
蛋白质(％)	-1.003763
		脂肪(％)	-0.492915
葡萄糖(％)	443.60721
		果糖(％)	-265.4383
乳糖(％)	-33.78516
		半乳糖(％)	-277.1671
麦芽糖醇(％)	-142.2773

因此，利用PLS方法用以评估体外血糖生成指数的方程将为：GI＝48.443999-1.003763蛋白质(％)-0.492915脂肪(％)+443.60721葡萄糖(％)-265.4383果糖(％)-33.78516乳糖(％)-277.1671半乳糖(％)-142.2773麦芽糖醇(％)。用于该模型的相关统计参数如下：拟合总结：

R²	0.964188
		R²Adj	0.962953
均方根误差	4.230216
		响应平均值	45.03226
观测值(或总权重)	31

使用神经网络方法获得以下模型参数权重：神经网络表I：

如实施例2和3中所述，神经网络方法不会提供简单的预测方程。相反，该方法提供一系列参数权重和网络布局，然后这些可用于使用合适的软件程序(在该情况下为JMP统计软件)获得预测结果。用于该模型的相关参数如下：

	具体数值
		隐节点数	1
过拟合罚数	0.01
		Tour数目	200
最大迭代次数	50
		收敛性	0.00001

结果：

SSE	1.027472638
		罚数	0.2469635769
总计	1.2744362149
		N	31

Y	SSE	SSE Scaled	RMSE	R²
					GI	496.30242843	1.027472638	4.13689217	0.9658

^*由于实施例2和3中使用的谷类不同，所以它们从该数据集中省略。^**体内值取自实施例3，它们的来源如其中解释。

使用神经网络曲线拟合程序获得的该数据散点图显示在图6中。使用该方法获得0.96的R²值。因此，该方法再一次表明具有非常高的精密度和高的预测价值。基于不同数目的样品但都在相似条件下运行的实施例3和4的结果通常一致。

如这些实施例(尤其是实施例3和4)中所证明的，当样品数目增加时，预期在各种曲线拟合程序中使用的各种系数和其他参数值得到提纯，以实现数据集的最佳拟合。预计向数据集添加其他样品会增加食品的多样性，且更好地代表更大的食品群体。

Claims

1.一种测定试验食品血糖生成指数的体外方法，所述方法包括

(1)测定试验食品的蛋白质含量和脂肪含量；

(2)以基本上均匀且细碎的状态提供试验食品，来提供试验食物样品；

(3)用消化酶混合物，将足以提供标准化量的可利用碳水化合物的量的基本上均匀且细碎的状态的试验食物样品消化一段固定时间，以提供消化的样品；

(4)经过所述固定时间后，立即将消化的样品按其整体处理，以停止酶反应；

(5)测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇；和

(6)使用预测方程或预测方法，从步骤(1)和(5)中得到的试验食品的数据，计算该试验食品的血糖生成指数，所述预测方程或预测方法源自校准样品的校准数据多元分析，其中所述校准数据为相同类型，且以与步骤(1)和(5)中测定的试验食品的数据相同的方式获得，且其中所述校准样品具有已知的体内血糖生成指数值。

2.权利要求1的体外方法，其中将步骤(5)中所有列举的糖和糖醇的量测定，并用于在步骤(6)中计算血糖生成指数。

3.权利要求1的体外方法，其中所述试验食品通过于低于-40℃的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得。

4.权利要求2的体外方法，其中通过于-78℃或更低的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得所述试验食品。

5.权利要求1的体外方法，其中通过于液氮温度或接近液氮温度的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得试验食品。

6.权利要求2的体外方法，其中通过于液氮温度或接近液氮温度的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得试验食品。

7.权利要求1的体外方法，其中使用高效离子色谱法测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。

8.权利要求2的体外方法，其中使用高效离子色谱法测定步骤(5)中所有列举的糖和糖醇的量。

9.权利要求1的体外方法，其中通过于低于-40℃的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得所述试验食品，且其中使用高效离子色谱法测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖和至少两种选自以下的糖或糖醇的量：果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇。

10.权利要求2的体外方法，其中通过于低于-40℃的温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态获得所述试验食品，且其中使用高效离子色谱法测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇的量。

11.一种测定试验食品血糖生成指数的体外方法，所述方法包括

(1)测定试验食品的蛋白质含量和脂肪含量；

(2)通过于液氮温度或接近液氮温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态提供试验食品，来提供试验食物样品；

(6)使用预测方程或预测技术，从步骤(1)和(5)中得到的试验食品的数据，计算该试验食品的血糖生成指数，所述预测方程或预测技术源自校准样品的校准数据多元分析，其中所述校准数据为相同类型，且以与步骤(1)和(5)中测定的试验食品的数据相同的方式获得，且其中所述校准样品具有已知的体内血糖生成指数值。

12.权利要求11的体外方法，其中所述多元分析使用选自多重线性回归、偏最小二乘法和神经网络的曲线拟合程序。

13.权利要求12的体外方法，其中所述曲线拟合程序为多重线性回归。

14.权利要求12的体外方法，其中所述曲线拟合程序为偏最小二乘法。

15.权利要求12的体外方法，其中所述曲线拟合程序为神经网络。

16.一种测定试验食品血糖生成指数的体外方法，所述方法包括

(1)测定试验食品的蛋白质含量和脂肪含量；

(2)于液氮温度或接近液氮温度下研磨试验食品，以基本上均匀且细碎的状态提供试验食物样品；

(5)使用高效离子色谱法测定来自步骤(4)的消化样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖醇的量；和

17.权利要求16的体外方法，其中所述多元分析使用选自多重线性回归、偏最小二乘法和神经网络的曲线拟合程序。

18.权利要求16的体外方法，其中所述曲线拟合程序为多重线性回归。

19.权利要求16的体外方法，其中所述曲线拟合程序为偏最小二乘法。

20.权利要求16的体外方法，其中所述曲线拟合程序为神经网络。