KR20100029207A - 혈액 혈소판을 사용한 마이크로입자 및 나노입자의 전달 - Google Patents

혈액 혈소판을 사용한 마이크로입자 및 나노입자의 전달 Download PDF

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KR20100029207A
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토마스 에이치. 피셔
주니어 이. 스탄 에스크리지
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엔테그리온, 인코포레이티드
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Abstract

의학적 상태의 치료시 사용될, 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는 혈소판이 기술되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 입자-로딩된 혈소판을 포함하는 약제학적 조성물, 및 활성제를 함유하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 환자의 목적 부위에 전달하는 방법이 또한 기술되어 있다.
입자-로딩된 혈소판, 마이크론 또는 나노미터 크기 입자, 나노 입자의 영상화

Description

혈액 혈소판을 사용한 마이크로입자 및 나노입자의 전달{Delivery of micro- and nanoparticles with blood platelets}
본 발명은 활성 약제를 전달하고, 나노입자의 영상이 요구되는 대상체에 대해 나노입자를 영상화하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
혈관 조직에 대한 손상 및 감염의 치료 및 진단은 종종 문제를 야기하며 그 결과 이러한 손상 또는 감염 부위에 적절한 치료제를 투여하는데 있어서 어려움을 초래한다. 이러한 어려움은 다음에 나열하는 이들 특수 질병 및 상태의 효과적인 치료의 개발을 저해하여 왔다. 예를 들면, 출혈열 바이러스에 의한 감염은 다른 것들 중에서도 심각하고 흔히 치명적인 접촉 결과로 인하여 의학 분야에서 중요한 도전이 되고 있다[참조: Borio et. al., JAMA 287, 1-51 (2002)]. 출혈열은 고도의 변화된 병리학적 효과를 발휘하는 다양한 바이러스 그룹에 의해 유발된다. 그러나, 이들 바이러스의 발병기전 메카니즘에 있어서는 2개의 일반적인 단계[하나의 얼리(early), 하나의 레이트(late)]가 존재한다. 첫째로, 선천적인 면역 시스템의 성분으로서, 대식세포(단핵세포)의 감염이 출혈열 바이러스의 증식에 있어 중요한 초기 역활을 수행한다는 우세한 근거가 제안되고 있다. 둘째로, 출혈열 바이러스에 의한 감염은 출혈을 야기하며, 많은 예에서 상처난 부위는 혈관 세포에 대한 바이러스 손상의 결과이다.
출혈열 바이러스는 필로비리다에(Filoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae) 및 플라비비리다에(Flaviviridae) 과의 구성원이며 일본쇄 RNA로 이루어진 게놈을 갖는다. 일반적으로, 바이러스는 다음 메카니즘을 통해 작업한다: (1) 저혈소판증 - 혈소판 수준에 있어서의 감소는 출혈열 바이러스 감염의 거의-공통적인 결과이다; (2) 혈소판기능저하증 - 출혈열에서 혈소판감소 상태는 혈소판 기능장애에 의해 악화될 수 있다; (3) 감소된 체액성 응고 인자 농도 - 체액성 응고 인자의 순환하는 수준에 있어서의 감소는 소모(상처 부위에서 혈소판 또는 DIC와 함께) 및/또는 감소된 인자 합성을 위한 간 조직의 손상; 및 (4) 혈관 통합성의 상실 - 혈장 누출 및 모세혈관 상처 부위의 형성을 초래하는, 내피 통합성에 있어서의 상실은 출혈열병에 있어서 일반적인 특징이다. 그 결과, 이들 바이러스를 치료하기 위한 약제학적 선택은 제한된다.
리바비린은 광범위한-스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖는 것으로 1972년에 최초로 보고된 뉴클레오사이드 유사체이다. 리바비린(모노포스페이트)가 세포 GTP에 있어서의 감소를 위해 이노신 모노포스페이트 데하이드로게나제를 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 보다 최근의 연구는, 이러한 뉴클레오사이드 유사체가 "치명적인 돌연변이유발"을 위한 바이러스의 고유의 돌연변이율을 증가시킴으로써 작용함을 나타낸다. 조직 배양에서, 리바비린은 플라비바이러스(flaviviruses), 아레나바이 러스(Arenaviruses) 및 분야바이러스(Bunyaviruses)를 포함하는, 광범위한 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는다. 보다 상세하게는, 리바비린은 FDA에 의해 플라비비리다에 과 구성원 C형 간염 바이러스의 치료용으로 승인되었고, 아레나바이러스 감염된 제한된 수의 환자를 치료하는데 있어서 효능을 나타낸다.
한편, 항바이러스제로서 리바비린에 대한 맹신은 3개의 관측에 의해 감소되고 있다. 첫째로, 리바비린의 생체내 수행을 기초로 한 전망은 임상적으로 완전하게 실현되지 않았다. 예를 들어, 리바비린은 다수의 필로비리다에 및 플라비비리다에(Flaviviridae) 과의 구성원으로부터의 감염의 치료시 효과적이지 않은 것으로 보고되었다[참조: Borio et al., JAMA 287, 1-51 (2002)]. 둘째로, 당해 뉴클레오사이드 유사체는 C형 간염 바이러스로 감염된 환자에서 간 조직 손상을 제한하지만 바이러스 청소를 위해 인터페론을 사용하는 이중 치료요법을 필요로 하는 것으로 밝혀졌다. 최종적으로, 리바비린 화학치료요법의 부작용은 적혈구 세포 침투 및 분해의 결과로서 빈혈을 유발시키는 것이다. 따라서, 리바비린과 다른 이러한 활성제를 투여하는 신규 방법이 요구되고 있다.
다른 예는 외상 손상의 진단이다. 조직 손상의 정확한 추정은 외상 손상의 조절에 있어 가장 중요하다. 특히 불안정하거나 최소한으로 안정한 혈류역학을 갖는 환자에서, 이러한 추정에 있어 주요 요소는 내부 출혈 부위의 위치의 측정이다. 물리적 실험, 조영제의 전통적인 X-선 혈관조영술 및 혈관외 조영제의 CT 국재화를 사용하여 활성적인 출혈 부위를 국재화할 수 있다. 표지된 적혈구 세포를 기초로 한 방사선 방법이 유용하지만 흔히 출혈 부위를 검출하지 못한다. 이들 기술은, 특히 함께 사용하는 경우 효과적일 수 있다. 그러나, 혈관경련수축 및 혈관 폐색(occulsion), 및 심각한 출혈 부위의 공-국재화(co-localization)는 출혈 부위를 확인하는데 있어서 실패를 초래할 수 있다. 또한, 조영제의 밀도는 보다 작은 출혈 부위를 폐색시킬 수 있다. 당해 폐색 문제는 부분적으로 저 x-선 밀도 CO2 조영제를 사용함에 의해 개선되었다. 출혈성 전환(hemorrhagic transformation)에 있어서 혈관 결함을 검출하기 위해 개발된 MRI 방법의 적용은 뇌 외상 및 척수 손상을 포함하는 일부 유형의 손상에 있어 상처 부위를 국재화하는 도구로서 촉망된다. 그러나, 상기 방법을 사용한 근본적인 문제는, 영상이 순환계 외의 혈관 성분의 이동을 기초로 하며 혈관 파괴의 실제적인 혈관병증(angiopathic) 부위를 직접적으로 영상화하지 않는다는 것이다.
다른 예는 전립샘 암과 같은 암의 치료이다. 전립샘 암은 중년 및 노년 미국 남성에 있어서 이환율 및 사망율의 주요 원인으로 남아있다. 비록 전립샘 암의 몇몇 조직학적 유형은 다음의 생검에서 발견될 수 있지만, 전립샘 암의 대부분은 샘 기원의 선암종(adenocarcinomas)이다. 진단에 있어서의 진전으로 모든 전립샘 암의 대략 90%가 전립샘 내부 또는 근처에서 발견됨이 밝혀졌다. 비교적 초기에 검출된 경우의 90%에서, 5년 생존율은 100%이 이른다. 대조적으로, 파종 질병을 나타내는 10%는 5년 생존율이 단지 34%이다. 단지 피부암 및 4개의 일반적인 조직학적 유형의 폐암의 결합된 사망율은 당해 집단에서 보다 일반적이다. 2007년도에, 미국 암 협회는 대략 27,050건의 사망의 주요 원인과 함께, 218,890건의 신규 경우의 임상 지표를 예견하고 있다. 놀랍게도 6명의 미국 남성 중 1명은 때때로 전립샘 암으로 진행될 것이고, 34명 중 1명은 악성으로 진행될 것이다.
현재의 표준-의료(standard-of-care) 치료요법과 관련된 매우 심각한 부작용의 요약된 조사는 거의 침해적이지 않고, 보다 주의깊게 표적화되며, 종양-특이적인 진단 및 치료 방법의 욕구를 나타낸다. 건강한 전립샘, 신경 및 다른 전립샘외 조직에 대한 손상을 최소화시키면서 현재의 표준-의료 수술 또는 조사(radiation)와 비교하여 종양 사멸 효능을 유지하거나 향상시키는 것이 요구될 수 있다. 전립샘 암 수술(개방 근치 치골뒤전립샘절제술, 개방 근치 회음전립샘절제술, 복강경 근치 전립샘절제술 또는 전립샘의 경요도절제술)과 관련될 수 있는 심각한 부작용은 무력증(impotency), 실금 및 수술 후 감염을 포함한다. 조사 후 무력증 발생율(impotency rate)은 10명의 남성 중 7명 이상에서 외부 빔 조사 치료요법을 받은 후 5년내에 무력증이 되는 수술의 경우와 동일하다. 비록 실금은 수술 후 거의 일반적이지 않지만, 실금의 위험도는 조사 후 치료한지 6년이 될 때까지 매년 증가하며, 이러한 비율은 대부분 수술과 관련된 것만큼 높다. 안드로겐 절제는 진전된 전립샘 암에 대한 표준 치료요법으로 남아있으며 대부분의 남성에게 있어서 질병을 완화시킨다. 그러나, 궁극적으로는 암이 재발하면 이후 환자의 평균 생존기간은 1년 미만이다. 지시된 에너지 전달을 위한 나노입자-로딩된 혈소판의 개발을 위한 제안된 프로그램의 결과는 많은 이러한 어려움을 완화시킬 것으로 전망된다. 전립샘 암에서 현재의 표준 의료를 개선시키는 것이 크게 요구되고 있으며, 본 발명은 이러한 요구에 대한 답이 될 수 있다.
다른 예는 심혈관 질환 및 이의 관련 혈관 병리학의 치료이다. 심혈관 질환에 대한 치료제에 대한 요구의 충족되지 않은 특성은 진단된 심혈관 시스템의 장애를 가진 미국 내 6천만 환자에 대해 매년 3천억 달러를 초과하는 경비에 의해 입증된다. 대부분의 심혈관 질환은 혈관 손상 부위에서 혈전, 염증 및 증식 과정의 통합적인 기능장애에 의해 유발된다. 예를 들어, 급성 심근경색증은, 염증 및 증식 과정이 죽상경화판 파열을 초래하는 경우 발생하는 관상 순환의 혈전 폐색의 결과이다. 유사하게, 혈관형성술 및 심장 바이패스 후 재협착은 초기에 혈전성에 이어, 수술중 원래의 혈관 손상 부위에서 염증 및 증식 과정의 결과이다. 심혈관 질환에서 혈전형성, 염증 및 죽종형성 과정을 겪는 분자 메카니즘의 증가된 이해는 세포내 시그날링 및 세포 주기 조절을 방해하고, 항혈전성 세포내 시그날링을 증폭시키고, 전-죽종형성 지질 대사를 억제함을 포함하는, 유전자 치료요법 시술을 위한 다수의 방법을 가져왔다. 몇가지 방법이 현재 카테터-매개된 유전자 전달 및 외막내로 직접적인 바늘 주사를 사용한 물리적 표적화를 포함하는, 심혈관 유전자 치료요법을 위한 부위-특이적인 유전자 전달을 수득하기 위해 사용된다. 추가의 특이성 수준은 조직-특이적인 프로모터(예를 들면, 평활근 세포 전달을 위한 SM22)를 사용함에 의해 수득된다. 그러나, 혈관 손상을 포함하는 손상 부위에 치료학적 화합물의 특이적인 전달을 위한 추가의 기구가 요구될 수 있다.
혈액 혈소판은 체내에서 순환 및 혈액 시스템의 성분이며 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 미국 특허출원 공개공보 제2005/0025748호 및 제2005/0272161호는 목적 부위에 활성제를 전달하는데 유용하고 활성제를 운반하는 고정-건조된 혈액 세포 및 고정-건조된 혈액 혈소판을 기술하고 있다. 이들 출원에서 혈액 세포 및 혈액 혈소판은 세포의 저장 기간 동안 구조적으로 안정화시키고/시키거나 연장시키기 위해 세포의 적어도 일부 내로 혼입된 적어도 하나의 화학적 화합물을 사용한 화학적 치료로 "고정"된다. 기술된 고정제는 포름알데하이드, 파라포름알데하이드 및 글루타르알데하이드, 및 과망간산염 용액을 포함한다. 그러나, 목적한 제제를 운반하는 혈액 혈소판을 보다 신속하고 청결하게 프로세싱하기 위해 고정 단계를 제거하는 것이 요구될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 나노입자로 로딩된 혈소판 및 나노입자를 사용하여 혈소판을 로딩하기 위한 방법에 관한 것이다. 수득되는 나노입자 로딩된 혈소판은 사람 및 수의학에서 혈관 손상 부위 및 대식 세포로 치료제 및 영상 기법(imaging modality)을 전달하는데 사용된다. 나노입자-로딩된 혈소판은 전신계 순환내로 주입될 수 있거나 손상 표면으로 국소 적용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는 혈소판에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 마이크론 또는 나노미터 크기 입자, 활성제를 함유하는 마이크론 또는 나노미터 크기의 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미 터 크기 입자를 함유하는 혈소판을 제공하는 단계, 및 당해 혈소판을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는 혈소판을 환자의 목적 부위로 전달하는 방법에 관한 것이다.
이들 및 기타 측면은 본 발명의 다음 도면 및 상세한 기술로부터 보다 완전히 이해될 것이다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 다음의 상세한 기술로부터 보다 완전히 이해될 것이다:
도 1은 나노입자에 대한 플라스미드 DNA와 PEI의 응집을 묘사한 투과 전자현미경 사진이다.
도 2는 혈소판에서 PEI-계 나노입자를 묘사한 투과 전자 현미경사진이다.
도 3은 혈소판에서 초-상자성 산화철 나노입자를 묘사한 투과 전자 현미경사진이다.
도 4는 혈소판에서 SPIO 나노입자의 자가 조직화(self organization)를 묘사하는 투과 전자 현미경사진이다.
도 5는 자기 영역에 의한 조절 후 SPIO 로딩된 입자를 묘사하는 투과 전자 현미경사진이다.
도 6은 제정맥 내 SPIO 로딩된 입자의 B-모드 영상을 묘사하는 투과 전자 현미경사진이다.
도 7은 SPIO 로딩된 입자의 자기 공명 및 에코발생 반응을 도시한다.
도 8은 안드로겐 제거 후 전립샘 종양에 국재화된 입자를 묘사하는 투과 전자 현미경사진을 도시한다.
도 9는 전립샘 제노그라프(xenograph) 조직내 입자를 묘사하는 투과 전자 현미경사진이다.
도 10은 폴리에틸렌 이민/다가음이온-계 나노입자의 제조를 도시한다.
도 11은 표지된 나노입자와 혈소판의 연합을 도시하는 투과 전자 현미경사진을 도시한다.
도 12는 생체공학에 의해 제조된 혈소판의 형광 현미경 영상 및 유세포분석 프로파일을 도시한다.
도 13은 몇가지 혈소판의 현미경 형광성을 도시한다.
도 14는 리바비린으로 로딩된 혈소판을 도시한다.
도 15는 표지된 혈소판을 포식하는 단핵세포의 결과를 도시한다.
도 16은 소 단층 소포계 나노입자의 해부학을 도시한다.
도 17은 혈소판에 부착된 SUV 나노입자를 도시한다.
본 발명은 각종의 치료제 또는 영상화제를 운반하기 위한 비히클로서의 혈소판의 용도에 관한 것이다. 혈소판은 적절한 비히클이며 몇가지 이유로 2개 유형의 혈관 부위로의 치료제를 전달하기에 유리하다.
첫째로, 혈소판이 혈관 파괴 부위에 결합하여 지혈하는 것이 광범위하게 인식되고 있으므로, 혈관 손상 부위에 치료제가 로딩된 혈소판을 집중시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 항암제는, 혈관계가 절충된(compromised) 종양으로 전달되는 경우 유리할 수 있다. 항바이러스제를 출혈열에서 혈관 파괴의 부위에 전달하는 경우 유리할 수 있다. 또한, 출혈 부위를 영상화하기 위한 요구는 외상 손상에 있어서 진단 및 외과적 안내 둘다의 목적으로 중요하다.
둘째로, 혈관 손상 부위에 결합하는 혈소판의 최종적인 운명은 상처 치유 과정동안 대식세포에 의해 포식되어야 하는 것이다. 또는, 주입된 세포는 세망내계(RES)의 대식세포에 의한 자유 순환으로부터 제거된다. 대식세포는 출혈열 바이러스를 포함하는 많은 유형의 바이러스에 의한 중요한 감염 부위이며, 병리학적 염증 반응의 생성과 밀접하게 관여된다. 따라서, 대식세포가 영상 및 소염 치료제 전달을 위해 표적화되어야 하는 많은 의학적 상황이 존재한다. 대식세포-기원한 염증은 흔히 예를 들면, 출혈열, 염증성 대장 질환 및 뇌졸중에서 출혈성 전환에 있어서 혈관 파괴의 근본 원인이다. 이의 반대도 또한 성립하는데, 혈관 파괴는 대식세포-기원한 염증 상태의 근본 원인일 수 있다. 예를 들어, 외상에서 과도한 혈액 손실과 관련된 심각한 출혈성 쇼크에서, 염증 매개인자의 대량의 전신 방출은 지혈 시스템을 불활성화시킬 수 있으므로, 혈액 손실을 악화시킬 수 있다. 유사하게, 대식세포 활성화는 과도한 혈액 손실을 수반하는 다수 기관 기능상실의 중요한 구동인자이다. 따라서, 염증 및 혈액학적 과정은 상승 원인 및 효과 방식에서 밀접하게 관련되어 있다. 즉, 치료제 및 영상화 나노입자로 로딩된 혈소판에 대한 많은 강력한 의학적 적용이 존재한다.
본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 대상체는 사람 대상체 및 수의학적 목적 및 약물 개발 목적을 위한 동물 대상체 둘다를 포함한다. 동물 대상체는 일반적으로, 돼지, 양, 소, 말, 염소, 고양이, 개, 마우스 및 랫트 대상체를 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물 대상체이다.
본원에 사용된 용어 "혈전형성 표면"은 상처난 조직, 죽상경화판과 같은 혈관 플라크, 국소 또는 전신 염증으로 인한 활성화된 내피, 항암제, 항신생물제 또는 항증식제의 투여로 인한 독성 부작용으로서 대상체에게 혈전형성이 이루어진 혈관, 표면 또는 조직, 스텐트, 카테터, 페이스마커(pacemaker) 및 리드(lead)와 같은 생의학 삽입물, 인공 관절 등과 같은 정형외과 삽입물에서 발견되는 바와 같은 금속, 중합체 등을 포함하는, 대상체에서 외부 또는 삽입된 항목의 표면을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 천연 또는 인공 혈전형성 표면을 말한다. 화합물은 치료 목적 또는 진단 목적(예를 들면, 방사선영상화, 조직 생검, 삽입물 제거 및 전달된 화합물이 삽입물 표면에서 발견되는지의 측정 등과 같은 임의의 적합한 수단에 의한 혈전형성 표면의 영상화 또는 검출)과 같은 임의의 목적을 위해 혈전형성 표면에 투여될 수 있다.
본원에 정의된 용어 "혈소판"은 일반적으로 동물, 및 바람직하게는 포유동물 기원(예를 들면, 돼지, 양, 소, 말, 염소, 고양이, 개, 마우스, 랫트, 사람 등)이다. 혈소판은, 혈소판이 도입되는 동일한 종으로부터, 또는 혈소판이 도입되는 상이한 종으로부터 유도될 수 있다. 하나의 양태에서, 혈소판은 본원에 기술된 활성제를 제조하기 위해 사용된 대상체로부터 수거되고 이렇게 제조된 후 혈소판이 수거된 동일한 대상체에 다시 후일에 투여된다. 혈소판은 신선하고, 자가(autologous), 동종(allogenic)이거나 재수화되고-동결건조("RL")될 수 있다.
본원의 "고정된"은 세포의 반감기를 구조적으로 안정화시키고/시키거나 연장시키기 위해 세포의 적어도 일부 내로 혼입된 적어도 하나의 화학적 화합물로 화학적으로 처리된 혈소판을 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 혈소판은 고정되어 있지 않다.
본원의 "고정되고-건조된"은 이의 반감기를 추가로 구조적으로 안정화시키고/시키거나 연장시키기 위해 건조, 탈수, 동결건조 또는 냉동-건조와 같은 임의의 적합한 기술에 의해 이로부터 제거된 물을 추가로 가지며, 고정되어 있는 혈소판을 말한다.
"재수화된"은 수용액에 접촉하거나 수용액과 합해져서 물이 세포내 영역 내에 흡수된 고정되고-건조된 혈소판을 말한다.
본원에 사용된 "혈액 응고 단백질"은 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 및 인자 VII 또는 FVIIa, 예를 들면, 인자 XII 또는 인자 XIIa, 또는 인자 X 또는 인자 Xa, 단백질 C, 단백질 S 및 프로트롬빈을 생성하는 응고 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 혈액 응고 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 천연 또는 합성일 수 있고 천연적으로 발생하는 단백질(예를 들면, 유사체)의 약간의 변형을 함유하는 단백질을 포함한다. 천연적으로 발생하는 경우, 단백질은 기원, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 포유동물 또는 사람의 임의의 종일 수 있고, 하나의 양태에서 투여되는 대상체와 동일한 기원의 종이다.
본원에 사용된 "혈액 항-응고 단백질"은 활성화된 단백질 C, 단백질 S, 헤파린 및 헤파리노이드 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 적합한 혈액 항-응고 단백질도 포함한다. 이러한 단백질은 천연 또는 합성일 수 있고 천연적으로 발생하는 단백질(예를 들면, 유사체)의 약간의 변형을 함유하는 단백질을 포함한다. 천연적으로 발생하는 경우, 단백질은 기원, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 포유동물 또는 사람의 임의의 종일 수 있으며, 하나의 양태에서 투여되는 대상체와 동일한 기원의 종이다.
본원에 사용된 "AAV"는 "아데노-관련 바이러스"를 말한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 환자의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)에서의 개선을 포함하는, 질환이 있는 환자에 대해 이점을 부여하고, 질환 등의 진행을 지연시키는 임의의 유형의 치료를 말한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 화합물 또는 조성물이 질환의 중증도 및 치료의 필요성의 측면에서 과도하게 유해한 부작용 없이, 본원에 기술된 치료를 달성하기 위해 대상체에 투여하기에 적합함을 의미한다. 본원에 사용된 "담체"는 약제학적 조성물을 제조하기 위해 활성 성분과 함께 사용된 약제학적 분야에 공지된 담체를 의미한다. 약제학적 담체의 예는 고체, 액체 또는 수성 담체, 예를 들면, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들면, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화된 야채 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨(염수), 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지, 및 이의 배합물을 포함한다.
입자와 관련하여 사용된 경우, 용어 "마이크로" 및 "나노"는 입자 직경의 크기를 말한다. 접두어 "마이크로"는 300 나노미터보다 큰 직경을 갖는 입자를 말한다. 접두어 "나노"는, 직경이 300nm 이하인 입자를 말한다.
본 발명의 마이크로입자 및/또는 나노입자는 천연 및 합성 중합체, 가지돌기 네트워크, 소 분자의 응집물, 센자성 물질, 인지질 소포, 미셀(micelle), 리포좀 및 이의 배합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 물질로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 마이크로입자 및/또는 나노입자는 양이온성 나노입자의 경우에서와 같이 응집[참조: Lu W, Wan J, She Z, Jiang X. J Control Release. (2007) 118:38-53; Feng M, Lee D, Li P. Int. J. Pharm. (2006) 311:209-214; Gupta K, Ganguli M, Pasha S, Maiti S. Biophys. Chem. (2006) 119:303-306; Dawson M, Krauland E, Wirtz D, Hanes J. Biotechnol. Prog. (2004) 20:851-857; Sennerfors T, Solberg D, Tiberg F. J. Colloid Interface Sci. (2002) 254:222-226], 및 산화철 초 상자성 나노입자의 경우에서와 같은 포화점 침전[참조: Corot C, Robert P, Idee JM, Port M. Adv. Drug Deliv. Rev. (2006) 58:1471-1504; Ma HL, Qi XR, Maitani Y, Nagai T. Int. J. Pharm. (2007) 333:177-186; Thorek D L, Chen AK, Czupryna J, Tsourkas A. Ann. Biomed. Eng. (2006) 34:23-38; Babes L, Denizot B, Tanguy G, Le Jeune JJ, Jallet P. J. Colloid Interface Sci. (1999) 212:474-482]을 포함하는, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 마이크로입자 및/또는 나노입자는 몇가지 형태를 취할 수 있다. 하나의 양태에서, 입자는 활성제로부터 제조된 고체 균질 입자이다. 다른 양태에서, 이들 고체 입자는 폴리에틸렌이미드(PEI) 또는 덱스트란과 같은 불활성 물질로 피복된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용된 활성제는 단백질, RNA, DNA, 킬레이트화 작용, 방사성 화합물, 센자성 화합물, 초-상자성 복합체, 소 분자 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치료제 및 영상화제를 포함한다. 활성제의 추가의 예는 조사시 유리 라디칼이 되는 산소-충전된 분자를 포함한다. 악성 종양은 흔히 이들의 정상 조직 대응물보다 낮은 산소 수준을 가지며, 조사에 의한 종양 세포 사멸의 주요 메카니즘은 세포독성 유리 라디칼, 즉, 고 반응성 유리 전자를 함유하는 화학 종의 형성이다.
활성제의 추가의 예는 RNA, DNA, 단백질 또는 펩타이드(효소, 항체 등)와 같은 핵산, 바이러스, 세균, 소 기관 화합물(예를 들면, 단량체), 합성 및 반합성 중합체, 나노입자, 킬레이트화된 금속 및 이온 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물은 항미생물, 항세균 또는 항바이러스 활성; 혈액 응고 또는 항-응고 활성; 리포터 또는 검출가능한 활성 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치료 또는 방법의 특정 목적에 따라 임의의 적합한 기능 또는 활성을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 활성제를 제조하기 위해 혈소판에 커플링될 수 있는 화합물의 추가의 예는 혈관활성, 항산화성, 항혈전성, 항발암성, 항죽종형성, 항유사분열, 항혈관형성 및 항증식성 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 양태에서, 활성제는 항바이러스 화합물이다. 시알산 유사체, 아만타딘, 리만타딘, 지도부딘, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 포스카르네트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 항바이러스 화합물이 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 항바이러스 화합물은 퓨린 뉴클레오사이드 유사체이며, 이의 예는 아사이클로비르, 디다노신, 리바비린, 간시클로비르 및 비다라빈 및 안티센스 뉴클레오사이드, RNA 및 DNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항바이러스 화합물이 로딩된 입자를 운반하는 혈소판은 바이러스 감염을 치료하기에 충분한 양으로 바이러스 감염된 환자에게 투여된다. 하나의 양태에서, 환자는 필로비리다에, 아레나비리다에, 분야비리다에 또는 플라비비리다에 과의 바이러스와 같은 출혈열 바이러스로 감염된다.
입자의 활성제는 또한 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 단백질 C, 단백질 S, 프로트롬빈, 활성화된 단백질 C, 단백질 S, 헤파린 및 헤파리노이드와 같은 항응고 단백질 및 파충류 또는 곤충 기원의 프로- 또는 항-응고 단백질 등일 수 있다. 이러한 화합물은 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있는 인자 VII 또는 인자 VIIa(당해 용어는 인자 VII의 혈액 응고 활성을 보유하는 변형된 인자 VII 또는 인자 VIIa 또는 인자 VII 유사체를 포함한다)는 다른 것들 중에서도, 미국 특허 제6,461,610호; 제6,132,730호; 제6,329,176호; 제6,183,743호; 제6,186,789호; 제5,997,864호; 제5,861,374호; 제5,824,639호; 제5,817,788호; 제5,788,965호; 제5,700,914호; 제5,344,918호; 및 제5,190,919호에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, 재조합체 사람 인자 VIIa가 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, 혈액 응고 단백질이 로딩된 입자를 운반하는 혈소판은 상처에서 혈액 응고를 촉진하고/하거나 상체를 치유하는데 효과적인 양으로 상처를 입은 대상체에게 투여된다.
본 발명의 입자 내에 운반될 핵산은 Lac-Z, 베타-글루쿠로니다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 형광성 단백질, 예를 들면, 녹색 형광성 단백질 등과 같은 검출가능한 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 검출가능한 단백질을 암호화하는 핵산을 운반하는 입자는 혈관 내에 죽상경화 조직 또는 플라크 내에서 검출가능한 단백질을 발현함으로써 죽상경화증의 개선된 동물 모델을 제조하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 이러한 동물(이는 바람직하게는 식이 및/또는 사육에 의해 죽상경화증에 걸리기 쉬운 동물이다)에게는 추정되는 항죽종형성 화합물 및/또는 항죽종형성 식이가 투여된 후 추정되는 항-죽종형성 화합물 및/또는 항-죽종형성 식이가 투여되지 않는 대조군 동물과 비교되며, 실험 동물 대 대조군 동물에서 죽종형성 플라크 형성의 정도는 검출가능한 단백질의 발현을 통해 플라크를 가시화함으로써 비교된다. 본 발명의 다른 양태에서, 핵산은 치료학적 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다. 예에는 ras 효과 단백질 RGL2(예를 들면, 증식을 억제)의 ras 결합 도메인(RBD)을 암호화하는 DNA, 내피 산화질소 합성효소 변이체(예를 들면, 혈소판 작용 억제)를 암호화하는 DNA, NF-KB 초억제자(예를 들면, 염증 과정을 억제)를 암호화하는 DNA와 같은 항-죽종형성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 마이크로입자 및 나노입자는 에코발생 검출과 같은 각종 용도를 위해 금속성일 수 있다. 또는, 마이크로입자 또는 나노입자는 센자성, 상자성 또는 초-상자성, 예를 들면, 초-상자성 산화철 나노입자일 수 있다. 초-상자성 산화철 나노입자의 하나의 예는 바이엘(Bayer)로부터 시판되는 FERIDEX(페룸옥사이드 주사가능한 용액)이다. 이러한 센자성 입자는 열의 생성(미온 치료요법) 또는 청각 시그날의 생성을 위해 외부 적용된 전자기장으로[로렌츠력(Lorenz force), 자기변형, 센자성 공명, 및 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 메카니즘을 통해] 조작될 수 있다. 산화철 입자, 가돌리늄 입자, 마그네타이트 입자, 또는 기타 공지된 자기 물질과 같은 센자성 입자는 또한 외부 적용된 전자기장 또는 자기 공명을 사용하여 청각 시그날 또는 열을 생성하도록 조작할 수 있다. 이러한 유도된 물리력은, 이들이 혈소판-입자 시스템의 파열(rupturing)의 세포 교란 및 기계적 운동, 및 국재화된 조직 받침(bed)에서 응고의 유도를 허용하는데 있어 유용하다. 예를 들면, SPIO(초상자성 산화철) 나노입자는 청각 및/또는 열 반응을 생성하기 위해 센자성 공명 진동에서 진폭-조절된 마이크로파 영역에 적용될 수 있다. 본 발명의 당해 측면은 특히 FDA 승인된 자기 공명 영상화제와 함께 사용되는 경우 사람 및 동물에서 의학 진단 목적을 위해 생체내 영상화하는데 특히 유용하다. 미국 특허 제5,262,176호에 기술된 것과 같은 다당류 도포된 초상자성 산화물 콜로이드를 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.
활성제는 화학적 화합물로 활성제의 입자를 피복하는 것과 같은, 당해 분야에 공지된 통상의 기술을 사용하여 마이크로입자 또는 나노입자 내로 혼입할 수 있다. 또는, 입자 자체는 활성제의 고체 구일 수 있다. 혈소판은 바람직하게는 신선하며, 개체와 같은 임의의 공급원, 또는 저장된 스톡으로부터 얻을 수 있다. 혈소판의 하나의 유용한 유형은 동결건조된 혈소판, 또는 재탈수되고 동결건조(RL)된 혈소판이다. 이들 혈소판은 포름알데하이드 또는 파라포름아데하이드와 같은 고정제로 고정시킬 수 있다. 재탈수되고 동결건조되고 고정된 혈소판의 공급원의 하나의 예는 STASIX[엔테그리온 인코포레이티드(Entegrion, Inc.), 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 소재]이다. 혈소판은 혈소판과 입자를 합하고, 혈장 또는 선택된 배지 속에서 한정된 기간 동안 이들 둘다를 항온처리하여 혈소판이 혈소판의 고유의 면역 기능과 관련된 포식작용 및/또는 폐색의 천연 메카니즘을 통해 마이크로입자 및/또는 나노입자를 흡수하여 본 발명의 마이크로입자 또는 나노입자로 로딩된다. 다른 양태에서, 마이크로입자 및/또는 나노입자는, 나노입자가 존재하는 않는 경우, 고유의 흡수시 링커를 통해 표면 막에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다. 이후, 혈소판은 편차 원심분리(differential centrifugation), 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation), 크기 배재 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 용출법(elutriation), 전기영동 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법으로 세포외 (비혼입된) 마이크로입자 및/또는 나노입자로부터 분리된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 혈소판을 대상체로부터 분리하여, 마이크로입자 및/또는 나노입자를 로딩한 후, 대상체 내로 치료 및/또는 영상 적용을 위해 다시 주입한다. 다른 양태에서, 로딩된 혈소판은 대상체로부터 분리하여, 마이크로입자 및/또는 나노입자로 로딩한 후, 다른 대상체에 치료 및/또는 영상 적용을 위해 다시 주입할 수 있다. 다른 양태에서, 혈소판은 일반적으로 단일 공여자 또는 공여자 풀로부터 액체의 저장된 혈소판이며, 마이크로입자 및/또는 나노입자로 로딩된 후, 하나 이상의 대상체(들)에게 치료 및/또는 영상 적용을 위해 다시 주입된다. 다른 양태에서, 혈소판은 단일 공여자로부터 또는 단일 공여자 또는 공여자 풀로부터의 일반적으로 액체 저장된 혈소판으로부터 수거되고, 마이크로입자 및/또는 나노입자로 로딩된 후, 하나 이상의 대상체(들) 내에 치료 및/또는 영상 적용을 위해 다시 주입시키기 위해 냉동보존된다. 또 다른 양태에서, 혈소판은 단일 공여자 또는 단일 공여자 또는 공여자 풀로부터의 일반적으로 액체 저장된 혈소판으로부터 수거되고, 마이크로입자 및/또는 나노입자로 로딩된 후, 로딩된 혈소판은 미국 특허 제4,287,087호; 제5,651,966호; 제5,902,608호; 제5,891,393호; 및 제5,993,084호에 기술된 바와 같은 공지된 기술에 따라 고정되고, 동결 및 동결건조된다. 일반적으로, 이러한 방법은 상기 사람 혈소판을 고정제(예를 들면, 알데하이드)에 상기 혈소판을 고정시키기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계; 상기 고정제를 혈소판으로부터 제거하는 단계; 이후, 혈소판을 건조시켜 마이크로입자 및/또는 나노입자가 로딩된 고정되고-건조된 혈액 혈소판을 제조하는 단계를 포함한다. 수득되는 동결-건조된 치료제는 재수화시킨 후 하나 이상의 대상체(들) 내로 치료 및/또는 영상 적용을 위해 다시 주입될 수 있다. 혈소판은 바람직하게는 목적한 바람직한 부위, 예를 들면, 혈전형성 표면(예를 들면, 상처난 조직, 혈관 플라크, 염증 부위 등)으로 이동한다. 바람직하게는, 각각의 혈소판은 약 1 내지 약 10,000개의 입자, 및 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 1,000개의 입자를 함유한다.
최근 연구는, 혈소판이 마이크론 및 나노미터 크기 입자의 상이한 유형을 용이하게 내재화함을 입증한다. 이러한 흡수 현상은 전신계 순환으로부터 소 미립자를 청소하는데 있어 혈소판의 역활과 관련될 수 있다. 혈소판과 모델 바이러스의 항온처리는 혈액 세포 내로 나노미터-크기의 병원체로의 내재화를 초래한다. 유사하게, 혈소판이 풍부한 혈장으로의 세균의 첨가는 세균의 명백한 내재화를 초래한다1 ,2. 혈소판이 마이크론 및 나노미터 크기 입자를 내재화하는 메카니즘은 정의되어 있지 않으며, 입자가 이전되는 혈소판 내 궁극적인 부위는 잘 이해되어 있지 않다. 세균과의 상호작용 후 혈소판의 투과 전자 현미경(TEM) 분석은, 병원체가 개방 세관 시스템과 연결된 표면내에 폐색되어 있음을 나타낸다. 이들은 혈소판 '커버사이트(covercyte)"로 명칭된다1 ,2. 환경에 따라, 나노입자가 라이소솜, 알파 과립 또는 치밀과립(dense granule)과 같은 내부 혈소판 기관 내로 수송될 수 있는 가능성이 존재한다. 이들 결과는, 혈소판이 혈액으로부터 병원체를 청소하는데 있어 선천적인 면역 역활을 담당하며, 이들 작용을 이용하여 당해 혈액 세포 내로 나노입자를 유도하기에 유용할 수 있음을 제안한다.
나노입자의 혈소판 흡수에 수반된 메카니즘에 대한 실마리는 이들 세포가 외부 표면과 상호작용하는 방법의 지식으로부터 수집될 수 있다. 외부 표면에 대한 혈소판의 반응은 3개 단계로 발생된다고 추측된다: 혈장 단백질의 초기 신속한 흡수, 흡수된 혈장 단백질의 입체형태 왜곡, 및 이후 흡수된 단백질의 입체형태 변형의 결과인 혈소판 표면 수용체에 의한 작용적 반응(참조: Fischer et al for a review3). 이러한 현상은 아마도 혈소판에 대해 "바이오센서"와 같이 작동하는 피브리노겐에 대해 가장 잘 이해되어 있다. 유리4 및 탄화수소 중합체-계 물질5 -7을 사용한 실험은, 피브리노겐이 왜곡된 입체형태로 결합한 후, 혈소판 인테그린과 상호작용함을 보여준다. 시그날링 과정 안팍(outside-in signaling process)에서 인테그린에 대한 현재의 이해는, 인테그린이 피브린과 유사한 흡수된 피브리노겐 분자상의 도메인(들)에 결합한 후 혈소판 막 상에서 클러스터(cluster)되어 시그날링 안팍의 활성화를 위한 세포골격-관련 시그날링 장치를 구성함을 제안한다8. IgG, 피브리노겐 및 이들 단백질로 표지된 작은 금 나노입자가 알파 과립으로 수송된다는 관측을 기초로 하여9, IgG 및/또는 피브리노겐과 결합하는 일부 유형의 나노입자가 알파 과립으로 이전될 수 있다고 추측할 수 있다. 명백하게 일부 병원체를 사용한 경우에서와 같이1 ,2, 내재화 없이 표면 연결된 개방 세관 시스템으로 나노입자의 방향을 유발하는 인자는 이해되어 있지 않다. 그러나, Fc- 및 보체 수용체 시스템이, 나노입자가 최적화되는 경우 수반될 수 있다는 것을 추측하는 것은 적절하다. 이들 메카니즘의 보다 상세한 이해는 내재화된 영상화 및 치료 나노입자를 지닌 혈소판을 설계하기 위한 본 발명자들의 능력을 향상시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 나노입자-로딩된 혈소판은 중요한 의학적 용도를 가질 수 있다. 전신계 주입시 혈소판은, 이들이 지혈하는 상처 부위에 국재화하여 궁극적으로 상처 치유과정 동안 대식세포에 의해 포식된다. 또는, 주입된 세포는 세망내피계(RES)의 대식세포에 의한 자유 순환으로부터 제거된다. 따라서, 본 발명의 혈소판은 혈관 손상 부위 및 대식세포 내에서 치료제 및 영상제를 농축시킬 수 있는 담체[트로이 호오스(Trojan horse)]로서 작용할 수 있다. 본 발명의 다른 용도 및 적용은 의학적 또는 수의학적 진단, 초음파, 핵 또는 적외선 영상화, 상처 또는 종양 국재화, 방사선 종양학, 및 치료학적 용도, 예를 들면, 전립샘 및 유방에서 종양 절제, 및 응고 치료요법을 포함한다.
본 발명은 당해 분야의 일부 실질적 문제를 극복한다. 비록 혈소판이 전립샘 종양에서 탈안정화된 혈관계로 유도된 에너지 변환 제제를 제공하기 위한 적절한 비히클이라고 해도, 혈소판을 수거하고 저장하는 기호논리학적(logistical) 문제는 혈소판의 이러한 적용을 어렵게 한다. 유효성 및 무익(sterility)의 문제 외에, 혈액 은행 시스템에 의해 제공된 현재의 혈소판 제품은 저장 손실로 인하여 작용적으로 신뢰되지 않는다. 환자 자체의 혈소판은 자가 "암 백 투 암(arm back to arm)"의 치료요법에 유용할 수 있으나, 환자의 아집단에서 저혈소판증 및 혈소판기능저하증과 관련된 2차 건강 문제는 이러한 시도를 제한하는 것으로 예측된다. 혈소판-계 동결-건조된 제품으로서 본 발명의 개발은 이러한 한계를 제거한다.
본 발명을 또한 하기 실시예의 수단으로 상세히 기술한다. 모든 부 및 퍼센트는 중량 기준이며, 모든 온도는 달리 표현하여 나타내지 않는 한 섭씨이다.
실시예 1: 입자의 흡수
천연 메카니즘을 통해 서브-마이크론 크기 입자를 흡수하기 위한 혈소판의 능력은 본 실시예에서 폴리에틸렌이미드(PEI) 나노입자 및 덱스트란-피복된 초상자성 산화철(SPIO) 나노입자를 사용한 실험으로 입증된다. PEI-계 나노입자는 PEI를 녹색-형광성 단백질(GFP) 플라스미드 DNA와 함께 항온처리하여 약 200 내지 400nm 나노입자의 집단을 수득함으로써 제조된다(도 1).
수득되는 나노입자는 새로이 제조된 사람 혈소판이 풍부한 혈장에 문헌에 기술된 바와 같은10 , 11 시트레이트 항응고제와 함께 가하고 실온에서 흔들면서(rocking) 2시간 동안 항온처리한다. 이후, 혈소판을 과량의 나노입자로부터 세포를 2000xg에서 10분 동안 원심분리하여 제거한 후 혈소판을 시트레이트화 염수(3.75mM 시트레이트, 146mM NaCl, pH=7.4)에서 추가로 원심분리 세척시킨다. 이후, 혈소판을 표준 방법10 ,11을 사용하여 투과 전자 형미경에 적용시킨다. 당해 분석(도 2)은, 대부분의 혈소판(패널 A 참조)이 하나 이상의 PEI/DNA 나노입자를 함유하며, 나노입자가 봉입된 이중층 막을 갖는 내부 구조 내에 함유되었음(패널 B 및 C 참조)을 나타내었다.
실시예 2: SPIO 나노입자의 내재화
SPIO 나노입자를 내재화하는 혈소판의 능력을 또한 시험하였다. 혈소판을 PEI 나노입자를 사용한 연구를 위해 기술한 바와 같이 분리한 후, 미국 식품 의약국에 의해 자기 공명 영상 조영제로 승인된 주입-등급 제품인, 덱스트란으로 피복된 약 10nm의 센자성 산화철 코어[FERIDEX, 바이엘 헬쓰케어(Bayer Healthcare)로부터 시판]으로 이루어진 SPIO-나노입자와 함께 항온처리하였다. SPIO 제품을 혈소판이 풍부한 혈장내로 1/10으로 희석시키고 흔들면서 12시간 동안 항온처리하였다. 이후, 혼합물을 밀도 구배 상에서 층화시키고 2,000xg에서 실온으로 10분 동안 원심분리하였다. SPIO 나노입자 로딩된 혈소판을 계면으로부터 수집하고, 시트레이트화 염수로 희석시키고 2,000xg에서 실온으로 10분 동안 원심분리하였다. 최종 SPIO 혈소판을 투과 전자 현미경을 사용하여 PEI에 대해 기술된 바와 같이 시험하였다. PEI의 경우에서와 같이, SPIO 나노입자를 표면 연결된 개방 세관 시스템과 유사하게, 이중층 막이 있는 내부 공간 내에서 농축시켰다(도 3). 나노입자를 자기 인력을 통해 응집체로 자가-조직화시켰다. 당해 실험은, 사람 및 동물에서 의학적 진단 목적을 위한 생체내 영상화에 있어서 본 발명의 유용성을 설명한다.
실시예 3: 상처 부위 영상화를 위한 초-상자성 혈소판 입자
당해 실험의 목적은 유도된 에너지 흡착을 위해 초상자성 산화철(SPIO) 나노 입자를 운반하는 혈소판-계 입자를 사용하여 내부 출혈 부위에서 영상화하는 능력을 전달하고 지혈을 제공하는 것이다. 두 가지 접근이 본 발명을 기초로 제공된다. 첫째로, 혈소판이 자기 SPIO 나노입자를 (위에서 나타낸 바와 같이) 용이하게 내재화하는 것으로 밝혀졌다. 둘째로, 지혈용 주입제로서 혈소판을 처리하기 위해 사용되는 동일한 동결-건조 방법의 사용하여, SPIO 표지된 혈소판이 동결-건조되어 SPIO가 로딩된 입자가 수득될 수 있다. 당해 결과는 원칙적으로 내부 상처 부위에서 외부 자기 영역으로 조작하여 음향 및 열 에너지를 생성할 수 있는 혈소판-계 제품이다. 외부 자기 영역의 적용으로, SPIO 로딩된 입자는 광범위하게 이용가능한 초음파 및 열 영상화 방법으로 내부 출혈 부위에서 영상화될 수 있고, 지혈하기 위해 조작될 수 있는 것으로 발명자들은 생각한다.
본 발명자는, 혈소판이 활발한(robust) 방식으로 초-상자성 산화철 나노입자의 특정 유형을 내재화함을 발견하였다. 덱스트란 피복된 약 10nm 초-상자성 산화철 코어로 이루어진 FERIDEX[바이엘 헬쓰케어 파마슈티칼스(Bayer Healthcare Pharmaceuticals)로부터 시판]를 새로이 분리한 사람 혈소판이 풍부한 혈장과 함께 12시간 동안 항온처리하였다. 혈소판을 과량의 조영제로부터 혼합물을 밀도 구배상에서 적층화하고, 원심분리하며, 매질-혈장 계면으로부터 혈소판을 제거함으로서 분리하였다. 이후, 페리덱스-로딩된 혈소판을 알데하이드 안정화 및 동결건조에 적용시켜 SPIO-STASIX 입자로서 본원에서 언급된 동결-건조된 제품을 수득하였다. 도 4는 투과 전자 현미경을 사용하여, FERIDEX 나노입자(화살표 참조)가 내재화되어 표면 연결된 개방 세관 시스템 내에서 클러스터를 형성하였음을 나타낸다. STASIX 입자내 SPIO 나노입자는 자가-조직화하여 직사각형 교차-단면을 갖는 구조를 형성하였다. 아마도 가장 근접한 이웃 자기 쌍극자 상호작용(nearest neighbor magnetic dipole interaction)에 의해 안정화되는 이러한 유형의 구조들은 FERIDEX의 유리 현탁액 또는 혈소판 간의 공간 내에서는 관측되지 않는다.
자기 영역에 노출시 SPIO-STASIX 입자는 응집의 형성을 위한 강력한 활성화 반응을 겪는 것으로 밝혀졌다. 당해 결과는 도 5에 나타낸 투과 전자 현미경사진에서 입증되며, 여기서, 혈장내 산화철 로딩된 입자는 30초 동안 0.6 테스틀라 영역(Testla field)에 적용되었다. 수득되는 SPIO-STASIX 입자는 고도로 응집되며 활성화된 형태를 나타내었다. 60Hz 진동하는 자기 영역에서 또한 발생하는 이러한 유형의 관측(데이타는 나타내지 않음)은, SPIO-STASIX 입자가 상처 부위에서 조절되어 지혈을 제공할 수 있다는 증거를 제공한다.
임의의 특수 이론에 결부되는 것을 원치 않지만, 혈소판이 산화철 나노입자를 흡수할 수 있다는 관측은 새로운 것이 아니다. 혈소판은 탄소, 라텍스 및 양이온성 페리틴, 피브리노겐 및 IgG로 유도체화된 콜로이드성 금, 모델 바이러스 및 세균을 포함하는 미립자 물질의 몇가지 유형을 취하는 것이 주목되어 왔으며, 또한 잘 입증되어 있다. 세균은 표면 연결된 개방 세관 시스템 내에서 폐색된다. 이러한 관측은, 혈소판이 광범위하게 인지된 보다 중요한 고유의 면역(숙주 방어) 역활을 하며, SPIO 나노입자가 이러한 면역 메카니즘 세트를 통해 축적됨을 제안한다.
산화철 나노입자는 동물 및 사람에게 사용시 주입 치료제로서 안정한 것으로 입증되었다. 독성 성분의 존재로 인하여 잠정적으로 안정하지 않은 많은 유형의 나노입자와는 대조적으로, 철-계 나노입자는 다량의 철을 저장하고 수송하는 신체의 능력으로 인하여 우호적인 안전한 프로파일을 갖는다. FeridexTM은 미국 식품 의약국에 의해 세망-내피 시스템과 관련된 간 병변의 영상화를 위한 T2 향상용 MRI 조영제로서 승인되어 있다. 사람 내로 주입되는 경우, FeridexTM 나노입자는 혈액으로부터 세망-내피 시스템에 의해 측정가능하게 청소된 후, 2일째부터 출발하여 혈청 철로 점진적으로 전환되었다. 투여 후 7일째까지 혈청 철 수준은 정상으로 돌아온다. 이러한 결과는 통상의 철 물질대사 주기의 턴오버와 일치한다.
SPIO의 물리적 특성은 적용된 전자기장을 사용하여 고유의 음향, 열 및 지혈 반응을 유발하는 가능성을 가져온다. 산화철 코어내 소리의 속도에 있어서의 차이로 인하여, SPIO 나노입자는 에코발생인 것으로 밝혀졌으므로 초음파로 검출가능하다. 유사하게, 각각의 초-상자성 코어와 관련된 자기 쌍극자로 인하여, SPIO 입자는 전자기장으로 조작시킬 수 있다. 이러한 특성은 MR 영상화를 위한 완화 조영제로서 SPIO 입자의 유용성의 광범위한 사용의 기초가 된다. SPIO 나노입자는 또한 라디오 주파수 전자기장(전파 또는 마이크로파의 형태)으로 조작하여 생체 내 미온 치료요법을 위한 음향 소리 또는 열을 생성할 수 있다. 산화철은, 쌍을 이루지 않은 Fe 전자의 스핀이 정렬하는 경향으로 인하여 센자성 물질이다. 나노미터의 10배 이상 큰 산화철 입자에서 스핀이 마이크로도메인[바이스 도메인(Weiss domaim)]내에서 정렬되며; 인접한 마이크로도메인은 안티평행 정렬을 갖을 수 있으며 도메인의 계면[블로치 월(Bloch wall)]은 열역학적 관점에서 비싸다. FeridexTM 코어와 같은 보다 작은 산화철 나노입자는, 정렬된 쌍을 이루지 않은 Fe 전자의 단일 도메인이, 소 입자 내에서 블로치 월 계면을 형성하는 높은 열역학적 비용으로 인해 보다 작은 산화철 나노입자에서 호의적이므로 "초-상자성"이다. 이러한 이들의 독특한 특성의 결과는, 원칙적으로, SPIO 나노입자가 유도되어 음향 시그날의 생성을 위한 적용된 전자기장을 사용하여 진동하는 기계적 운동을 겪을 수 있다는 것이다. 본 발명은 STASIX 입자내 SPIO의 음향 및 전자기장 조절사이에 상호작용을 사용하여 보다 민감한 영상 기법을 개발한다.
SPIO 나노입자는 열(인접-영역 RF 또는 마이크로파로 유도), 초음파(고유의 또는 유도된 공명) 또는 MRI 영상 기법으로 전립샘 악성에서 영상화될 수 있다. 하나의 양태에서, 전파 또는 마이크로파와 같은 전자기장을 사용하여 SIPO 입자를 조절함으로써 음향 시그날 또는 열을 생성할 수 있다. SPIO 나노입자가 전자기장으로 조절되어 음향 시그날을 생성할 수 있는 3개의 잠재적인 메카니즘이 존재한다. 첫번째 메카니즘은 로렌츠력(Lorentz force)이다. 여기서, 적용된 전자기장의 자기 성분은 나노입자를 정렬하고 부착시킬 힘(로렌츠력)을 위한 SPIO 나노입자의 자기 쌍극자 운동에 직접 커플링할 수 있다. 적용된 전자기장이 전자기 조사인 경우, SPIO 입자는 조사 빈도에서 진동할 것이고, 나노입자는 스피커가 작동하는 방법과 일부 유사한 메카니즘을 통해 조사의 빈도에서 음향 시그날을 생성할 것이다. 두번째 방법은 자기변형이다. 여기서, 전자기 조사 영역은 진동 방식으로 산화철 나노입자의 물질 구조를 왜곡(자기변형)하여 음향 시그날을 생성한다. 초음파의 생성을 위한 장치에서 육안으로 보이는 규모로 사용된, 자기변형 효과는 SPIO 나노입자를 사용한 현미경 규모에서도 효력이 있다. 3번째 메카니즘은 센자성 공명이다. 여기서, 마이크로파(GHz) 전자기 조사는 센자성 공명을 위한 쌍을 이루지 않은 Fe 전자 스핀-스핀 상태 이동을 구동시킬 수 있다. 전통적인 물질 기계적 용어에서 기술될 수 있는, 나노입자에서 로렌츠력 및 자기변형 효과와는 대조적으로, 센자성 공명은 필수적으로 양자(quantum) 과정이다. 자기 나노입자의 센자성 공명은, 조사가 MASOR에 의해 생성된 바와 같이 간섭되는 경우 초음파 및 열의 생성을 위한 기계적 운동에 전자기 조사 영역을 강력하게 커플링시키는 메카니즘을 나타낸다. 또한, 센자성 공명 빈도에서 마이크로파 영역은 진폭 조절되며, SPIO 나노입자는 조절 빈도에서 소리를 생성할 것이다. 로렌츠력, 자기변형 및 센자성 공명이 SPIO 나노입자로부터 열 및 소리 생성을 초래할 수 있는 방법의 이론적 측면은 잘 확립되어 있다.
시험을 SPIO-STASIX 입자를 사용하여 "전 기관" 제대 모델에서 수행함으로써 생체내 조건하에서 혈소판-관련 SPIO 나노입자의 에코발생 특성을 잘 이해하였다. 요약하면, 선택적 제왕절개한 건강한 공여자로부터 수득한 제정맥을 순환 서킷 내로 결합시킨다. 포장된 적혈구 세포 및 동결된 혈장으로부터 수집한 샴(sham) 혈액을 서킷을 통해 순환시키면서 B-모드 초음파로 영상화하였다. 540,000 SPIO STASIX/㎕의 1.0ml 덩어리를 영상화 동안 탯줄의 상부로 직접 주입하였다. 도 6은 손상되지 않은 정맥을 통한 SPIO-표지된 세포의 자유 운동을 나타낸다. 패널 A, B 및 C는 각각 염수 단독, 염수 + 공기 버블, 및 염수 + SPIO-STASIX 입자의 덩어리 주입(붉은색 화살표)을 사용한 제정맥을 나타낸다. 패널 C의 녹색 화살은 공기 버 블이다.
추가의 시험을 수행하여 SPIO-STASIX 입자가 피브린 응괴의 성분으로서 초음파로 검출될 수 있는지를 측정하였다. SPIO-STASIX를 혈장과 상이한 희석으로 혼합한 후 1.0단위/ml의 트롬빈을 가하여 응괴를 형성시켰다. 이후, 예비형성된 응괴를 아가로즈 플레이트상에 두고 자기 공명 및 B-모드 초음파로 영상화하였다. 도 7은, 산화철 로딩된 입자가 생리학적으로 관련된 농도 범위에 걸쳐서 MR 및 B-모드 초음파로 검출될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 초-상자성 산화철-로딩된 입자를 사용한 항암 치료요법
당해 시험의 목표는 전립샘 종양의 치료를 위한 영상화, 조직 절제 및 치료학적 방출용의 개선되고 유도된 에너지 전달 방법을 개발하는 것이다.
사람 전립샘 종양 절제 조직을 안드로겐의 초생리학적 농도가 공급된 면역 상충된 마우스의 측복부에 이식하였다. 당해 조건하에, 제노그라피 조직이 증식하며 수득되는 종양은 90% 초과의 원인 내피와 함께 혈관계를 발달시킨다. 또한, 사람 전립샘 조직에서 관측된 내피 세포의 교란된 별 구조도 보존된다. 사람 안드로겐 절제 치료요법을 사용한 경우에서와 같이, 호르몬의 제거는 종양 혈관계의 전체 탈안정화를 위한 내피의 대량의 세포자멸사를 초래한다. 고정되고 건조된 혈소판을 신선한 사람 혈소판으로부터 파라포름알데하이드 안정화로 제조하고[참조: Read, M.S. et al. Preservation of hemostatic and structural properties of rehydrated lyophilized platelets: potential for long-term storage of dried platelets for transfusion. Proc Natl Acad Sci USA 92, 397-401 (1995)], 녹색 형광성 CMFDA 염료로 표지한다. 이러한 고정-건조시킨 혈소판은 또한 엔테그리온 인코포레이티드(Entegrion, Inc.)(미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 소재)로부터 Stasix의 상표명하에 시판된다. 마우스를 사람 전립샘 조직을 사용하여 제조한 후 안드로겐을 제거하였다. 2.0 x 109 의 녹색 형광성 StasixTM 입자/마우스의 덩어리 용량을 안드로겐 제거 전 또는 제거 후 2일째에 주입하였다. 동물을 참수시킨 후 전립샘 종양 및 기타 조직을 제거하고 조직학적 분석을 위해 준비하였다.
도 8은 탈안정화 후 종양 혈관계 내 녹색-형광성 혈소판 치료요법을 나타낸다(참조: 좌측 패널 내 화살표). StasixTM 입자는 안드로겐 제거 전 종양 조직(우측 패널), 또는 폐, 간 또는 심장 조직내(데이타는 나타내지 않음)에서 주목되지 않았다. 도 9는 안드로겐 제거 및 녹색-형광성 STASIX 주입 후 전립샘 종양으로부터의 공초점 영상의 3D 재구성을 도시한다. STASIX 입자는 사람 내피 세포, 필수적으로 종양 혈관계를 공-추적(co-tracing)하기 위한 오렌지색-형광성 마커에 매우 근접하여 관측되었다.
실시예 5: 내재화된 나노입자를 갖는 혈소판의 제조
다가양이온으로서 폴리에틸렌 이민(PEI)을 대규모로 이용하여 세포 배양물 및 생체내에서 유전자 형질감염 목적을 위해 cDNA를 접합시킨다. 발명자들은 리바 비린 트리포스페이트와 같은 소 분자로부터 cDNA와 같은 거대 분자에 이르는 크기 범위의 다양한 다가음이온을 지닌 고도로 응축된 나노미립자 구조를 형성하는 PEI의 능력의 장점을 취한다. PEI와 리바비린 리보-올리고뉴클레오타이드 및 DNA 플라스미드의 응집에 이어 조직 배양물내 대식세포로의 전달을 수반하는 당해 방법의 2개의 예를 다음 단락에서 나타낸다.
(A) PEI-리바비린 리보-올리고뉴클레오타이드 나노입자 내재화
PEI를 도 10에 나타낸 바와 같이 8개 잔기 리바비린 리보-올리고뉴클레오타이와 축합시켰다. PEI의 주요 아민을 온화한 조건하에 영상화 잔기(예: 형광단 또는 MRI제) 및/또는 부착용 작용기(예: 바이오틴, his6)으로 표지할 수 있다. 도 10은, PEI가 2개의 리바비린 잔기와 3'-말단 FITC 형광단을 함유하는 팔량체(eight-mer) 리보-올리고뉴클레오타이드와 응집되는 경우 형성된 100nm 내지 300nm의 구형 입자의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸다.
혈소판은 PEI-계 나노입자를 용이하게 내재화하는 것으로 밝혀졌다. 도 11에 나타낸 투과 전자 현미경은, 표면 연결된 개방 세관 시스템에서 PEI/리바비린 리보올리고머 나노입자를 도시한다. 낮은 파워에서 다수의 혈소판의 시험(데이타는 나타내지 않음)에서 실질적으로 모든 혈소판이 하나 이상의 PEI 나노입자를 함유함을 입증하였다. 표면 연결된 개방 세관 시스템내 PEI/음이온 나노입자의 국재화는 SPIO 나노입자로 관측된 것과 유사하며, 이는, 혈소판의 고유의 면역 작용이 나노입자 폐색 현상에서 관여되어 있음을 나타낸다.
(B) 대식세포로의 유전자 전달
다음 연구는, cDNA-나노입자 생체공학에 의해 제조된 혈소판이 조직 배양물내 대식세포로 유전자를 이전시킬 수 있음을 입증한다. 시험의 유전자 전달 부분을 위한 제조에서, 녹색 형광성 단백질 cDNA를 Cy3로 전사에 영향을 미치지 않는 연결을 통해 표지하였다. 이후, 적색 형광성 cDNA를 PEI와 위에서 기술한 방법을 통해 농축시켜 PEI/cDNA 나노입자를 수득하였다. 도 12는, 세포가 나노입자로 내재화한 후 생체공학에 의해 제조된 혈소판의 형광 현미경 영상 및 유세포분석 프로파일을 나타낸다.
유전자 발현 시험은 밀도 구배 방법을 사용하여 말초 사람 혈액으로부터 분리한 단핵 세포를 이용하였다. 단핵 세포를 공여자-특이적인 배지를 사용하여 대식세포로 분화시킨 후, 고유의 면역 세포를 12시간 동안 GFP-나노입자 혈소판과 함께 항온처리하였다. 추가로 24시간 후, 배양물을 현미경 형광성에 대해 시험하여 Cy3-표지된 cDNA가 대식 세포(적색 형광성)내에 존재하는지 및 GFP가 발현되는지(녹색 형광성)를 측정하였다. 적절한 음성 대조군을 수행하여 대식세포 및/또는 혈소판 고유의 형광성이 시험 분석을 방해하지 않는 것을 입증하였다. 결과는 도 13에 나타낸다. 당해 분석의 주요 결과는, 대부분의 모든 대식세포가 혈소판을 내재화하였으며 GFP 유전자를 1/2 이상 발현하였다는 것이다.
실시예 6: 표면-부착된 리바비린을 갖는 혈소판의 제조
리바비린 생체공학에 의해 제조된 StasixTM 입자를 다른 문헌에 요약된 StasixTM 입자에 대한 정상의 제조 방법과 유사한 방식으로 제조하였다. 이 세포를 과량의 혈장 단백질로부터 분리한 후 알데하이드 안정화에 적용시켰다. 이후, 표면 막을 막 불투과성 NHS 바이오틴 유사체로 바이오티닐화하였다. 바이오티닐화된 혈소판을 과량의 아비딘([아비딘]>>[바이오틴])과 항온처리하고 동결건조시켰다. SDS-PAG 전기영동(아비딘 표준물과 함께, 데이타는 나타내지 않음)은, 각각의 혈소판이 670만 아비딘 분자와 결합하였음을 입증하였다. 아비딘화된 StasixTM 입자를 재수화시키고 2개의 리바비린 염기를 함유하는 리바비린 리보올리고뉴클레오타이드(5'-바이오틴'UUU-리바비린-리바비린-UUU-FITC-3'), 추적용의 녹색 형광단 및 커플링용 바이오틴과 함께 항온처리하였다. 리보올리고뉴클레오타이드는 수 초 내에 반응하여 아비딘화된 혈소판과 견고한 복합체를 형성하였다. 형광 현미경(도 14 참조)은, 리바비린 프로브가 혈소판에 부착하였음을 입증하였다. 당해 도의 우측 패널에 나타낸 유세포분석 적정은, 표면-결합된 아비딘이 혈소판당 1,350만 리바비린 잔기에 대해 대략 단일체의 분자비에서 리보올리고뉴클레오타이드와 결합하였음을 나타내었다.
리바비린-접합된 StasixTM 입자를 내재화하는 단핵세포의 능력을 위에서 기술한 cDNA 나노입자 대식세포 포식작용 시험과 유사한 방식으로 시험하였다. 단핵세포를 리바비린-접합된 StasixTM 입자와 함께 12시간 동안 항온처리한 후, 공초점 현미경으로 시험하였다. 당해 분석(도 15 참조)는, 단핵세포가 혈소판을 내재화함 을 나타낸다. 당해 도에서, 화살표는 내재화되지 않는 몇몇 혈소판을 가리킨다. 선택된 세포의 3차원 공초점 재구성(데이타는 나타내지 않음)은, 대부분의 단핵 세포가 5 내지 20개 로딩된 STASIX 입자 사이에서 내재화되었음을 나타내었다. 각각의 단핵 세포의 내부 용적 및 각각의 혈소판 상의 리보올리고뉴클레오타이드의 수를 기초로 하여, 단일 단핵세포에 의한 하나의 혈소판의 내재화는 21μM의 국소 세포내 리바비린 농도를 생성한다. 따라서, 몇가지 혈소판이 포식되는 경우에도, 조직 배양 시스템 내 리바비린으로 측정한 IC-50을 충분히 능가하는 내부 리바비린 농도가 수득된다.
실시예 7: 혈소판에 대한 소 단층 소포의 표면 결합
치료학적 나노입자 함량이 알데하이드 고정에 민감할 경우, 표면 막 부착 방법의 다음 유형을 사용하여 알데하이드 고정 및 동결-건조 후 혈소판에 나노입자를 연합시킬 수 있다. 이러한 시도의 실용성은 소 단층 소포(SUV) 나노입자를 사용한 다음 시험에 의해 입증된다. 인지질 SUV는 인지질 및 계면활성제 옥틸글루코사이드(도 16)의 혼합된 미셀을 문헌에 상세히 기술된 바와 같은 임계 미셀 농도(옥틸글루코사이드의 경우 25mM) 이하의 최종 계면활성제 수준으로 신속히 희석시켜 형성시켰다[참조: Fischer, T. Molecular Crystal Liquid Crystal 102, 141-145 (1984)]. 당해 시험을 위해, 이중층은 추적용의 적색 형광성 PKH 염료를 함유하였으며 포스파티딜에탄올아민의 주요 아민은 바이오틴과 공유결합에 의해 변형되었다.
STASIX 입자는 표준 제조 과정으로 제조하였는데, 하나의 예외로, 알데하이드 고정 단계 후, 표면 막의 외부 측면을 NHS-바이오틴 유사체로 공유결합에 의해 변형시켰다. 이후, 바이오티닐화된 STASIX 입자를 몰 과량의 아비딘과 반응시켜 아비딘화된 막을 수득하였다. 입자를 SDS-PAG 전기영동 및 농도계측 스캐닝(공지된 양의 아비딘을 갖는 레인과 함께)에 적용시켜 혈소판당 아비딘의 수를 계산하였으며; 각각의 동결-건조된 세포는 약 7백만의 아비딘을 함유하였다. 바이오티닐화된 SUV를 후속적으로 아비딘화된 StasixTM 입자와 혼합시켜 소포를 표면 막에 부착시켰다. 도 17은 표면 막과의 적색 형광성 SUV 연합을 도시한다. 투과 전자 현미경은, 내부 표면막 상의 SUV(화살표로 나타냄)를 나타낸다. TEM 단면의 두께 및 세포의 원반 형태가 제공되면서, 당해 시험에서 각각의 StasixTM 입자는 30 내지 60개 SUV와 연합하였다. 당해 시험은, 나노입자가 바이오틴-아비딘 브릿지 방법을 사용하여 생체공학에 의해 제조된 혈소판의 표면에 용이하게 커플링할 수 있음을 입증한다.
실시예 8: 죽상경화성 플라크로 치료제의 전달
본 발명은 혈관 손상 부위에 치료학적 유전자를 전달하는데 사용할 수 있다. 이 능력은 도 18에 나타낸다. 당해 연구에서는, 3개월 동안 고 콜레스테롤 식이를 공급하여 죽상경화판 형성을 유도시킨 고콜레스테롤혈증 돼지를 사용한다. 대퇴 동맥의 1cm 분절을 결찰한 후 Lac Z 유전자를 갖는 AAV 작제물(construct)을 염수 속에 주입한다. 1시간 후, AAV 매질을 제거하고 동맥을 순환을 위해 재개방하였다. 1개월 후 혈관을 분리하고 Lac Z 유전자 생성물 활성에 대해 조직학적으로 분석하였다. AAV 형질도입 생성물을 죽상경화판 속에서 선택적으로 발현시켰다.
실시예 9: 유도된 에너지 전달을 사용한 전립샘 종양 영상화 및 지혈
(A) 사람 전립샘 조직의 주요 이종이식편(xenograft)의 제조
외과적으로 절제한 전립샘 조직의 신선한 조각의 주요 이종이식편의 확립은 통상의 프로토콜이다. 요약하면, 8주된 면역절충된 마우스(SCID 또는 Nu/Nu)를 거세하고 사람 조직을 이식하기 3 내지 7일 전에 지속 방출 테스토스테론 펠렛으로 이식하였다. 근치적 전립샘 절제술(전립샘 암) 또는 방광전립선 적출술(양성 전립샘)으로부터의 신선한 사람 조직을 조직학적으로 확인하고 수술 동안 기관으로 혈액 공급의 차단 2시간 내에 수여한다. 전립샘 조직을 즉시 빙냉 기관 보존액(예: ViaSpanTM) 속에 두고 제조된 면역절충된 숙주에 이식시키기 위해 수송하였다. 조직의 8개의 개개 조각을 각각의 마우스(각각의 측복부 상에 4개)에 피하 이식시키고 동물을 이종이식을 위해 4주 동안 확립시킨다. 조직학적으로, 모든 새로이 이식된 이종이식편의 약 80%가 성공적으로 확립되고, 이종이식편의 주변에 마우스 숙주의 혈관계를 지닌 이종이식편의 사람 혈관 네트워크의 연결술로 표지하였다. 이식 후 초기 14일 동안에 이종이식편 내 사람 혈관계의 미세혈관 밀도는 예비이식 조직과 비교하여 > 5배 증가한다. 4주 후 어느 시점에서, 마우스 숙주를 거세(테 스토스테론 펠렛 제거)하여, 거세 2일 후 최대치인 사람 내피 세포 내 세포자멸사의 파장을 선택적으로 유도시키고, 거세 5 내지 7일 후까지 기본 수준으로 되돌린다. 거세로 인한, 이식에 대한 전립샘 이종이식편의 혈관형성 반응 및 사람 혈관계의 혈관 퇴화는 분석된 모든 표본에서 일치하게 발생하며 환자 특이적인 반응이 아님이 입증되었다. 특이적으로 손상된 내피 층에 대한 입자의 결합을 0일째(입자 국재화 없음) 및 2일째(최대 입자 국재화)에 존재하는 안정한 혈관계 사이에서 비교한다.
(B) 국재화의 직접적인 영상화
마우스 숙주에 저 수준, 중간 수준 및 고 수준의 SPIO-STASIX 입자를 주입하고 B-모드 초음파 및 MRI로 모니터링한다. 동물을 다음과 같이 그룹화할 것이다:
3,000 SPIO-STASIX/□1 혈액 용적 0일째 3마리 마우스 및 2일째 6마리 마우스
10,000 SPIO-STASIX/□1 혈액 용적 0일째 3마리 마우스 및 2일째 6마리 마우스
30,000 SPIO-STASIX/□1 혈액 용적 0일째 3마리 마우스 및 2일째 6마리 마우스
각각의 처리 그룹에 대해 3마리 마우스를 각각의 농도의 SPIO-STASIX 입자와 함께 거세 전 0일 째에 주입하고 6마리 마우스에 각각의 농도의 SPIO-STASIX 입자를 거세-2일 후 주입한다. 동물들은 입자를 주입받을 것이고, 혈소판은 45분 동안 순환하도록 하며, 동물을 영상화한다. 영상화 후, 동물을 안락사시키고, 이종이식 편를 수거하여 조직학적 분석 및 이종이식편/습윤 중량 조직내 철의 양의 정량화를 위해 제조한다.
동물을 B-모드의 초음파 및 청 방사력 충격(acoustic radiation force impulse, ARFI) 펄스 시퀀스(sequence)로 모니터링한다. 이후, 마우스를 등록된 해부학적 기준 및 철 나노입자의 존재에 대한 향상된 감도 둘다를 제공하도록 설계된 2개의 등록된 영상 시퀀스를 사용하여 MR 영상화에 적용시킨다. 3D 확산 가중 투사 암호화된 영상이 512x512x64의 비등방성 영상 배열로 수득될 것이다. 영역 불균등성(T2* 민감성)을 국재화하기 위해 개선된 감도를 제공하도록 설계된 동일한 시퀀스의 변이를 사용하여 나노입자를 검출할 수 있다. 생체내 연구의 결론에서, 이종이식편의 MR 조직학을 수행하여 종양 기하학의 정도의 보다 완벽한 정량화 및 나노입자의 국재화에 대한 보다 높은 공간 해상력 3D 영상을 제공할 수 있다. 관류 고정된 표본(반응계 내에서 고정됨)에서의 작업을 9.4T에서 앞서 기술되고 당해 분야에 공지된 것으로서 위에서 기술된 3D 암호화 방법을 사용하여 수행할 수 있다. MR 조직학 후 숙주 동물을 참수시키고; 이종이식편를 수거하고, 고정하며, 봉매하고 단면화하며; 형광성 및 투과 전자 현미경 시험을 수행하였다.
(C) 유도된 에너지 전달
동물을 적외선 카메라와 전자기 근접 영역 공급원 사이에 동물 피부와 직접 접촉된 초음파 변환기를 사용하여 위치시킨다. SPIO-STASIX 입자 주입 전, 및 45분 후, 고주파를 로렌츠력-중개된 메카니즘(Lorentz force-mediated mechanism)을 통해 열 및/또는 음향 반응의 생성을 위해 적용시킨다. 당해 시험을 또한 센자성 공명의 유도를 위한 초음파 영역의 적용으로 수행할 수 있다. 동물을 유도된 열 및 음향 시그날에 대해 모니터링한다. 6마리 동물의 그룹을 다음과 같이, 저, 중간 및 고 SPIO-STASIX 입자 농도에서 평가한다.
고유 RF 인접영역(nearfield) 마이크로파
열 ~ 3마리 마우스 3마리 마우스
초음파 3마리 마우스 3마리 마우스 3마리 마우스
MRI 3마리 마우스 ~ ~
음향 및 열 시그날을 모니터링한 후, 동물을 참수시키고 마지막 단락에서 상세히 설명한 바와 같이 조직학적 평가에 적용시켜 SPIO-STASIX 입자 분포 및 국재화를 입증한다.
참조
Figure 112009077909308-PCT00001

Claims (34)

  1. 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는, 혈소판.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈소판이 포유동물 혈액 혈소판을 포함하는, 혈소판.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혈소판이 사람 혈액 혈소판을 포함하는, 혈소판.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이크론 또는 나노미터 크기 입자가 천연 및 합성 중합체, 가지돌기 네트워크, 소 분자의 응집물, 센자성 물질, 인지질 소포, 미셀(micelle) 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로부터 제조된, 혈소판.
  5. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 단백질, RNA, DNA, 킬레이트제, 방사성 화합물, 센자성 화합물, 초-상자성 복합체, 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제인, 혈소판.
  6. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 항바이러스제를 포함하는, 혈소판.
  7. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 응고 단백질을 포함하는, 혈소판.
  8. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 항-응고 단백질을 포함하는, 혈소판.
  9. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 핵산을 포함하는, 혈소판.
  10. 제1항에 있어서, 상기 활성제가 초-상자성 산화철 나노입자인, 혈소판.
  11. 활성제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는 혈소판 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 혈소판이 포유동물 혈액 혈소판을 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 혈소판이 사람 혈액 혈소판을 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 마이크론 또는 나노미터 크기 입자가 천연 및 합성 중합체, 가지돌기 네트워크, 소 분자의 응집물, 센자성 물질, 인지질 소포, 미셀 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로 제조된, 약제학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 단백질, RNA, DNA, 킬레이트제, 방사성 화합물, 센자성 화합물, 초-상자성 복합체 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제인, 약제학적 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 항바이러스제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 응고 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 항-응고 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 핵산을 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제11항에 있어서, 상기 활성제가 초-상자성 산화철 나노입자인, 약제학적 조성물.
  21. 제11항에 있어서, 상기 담체가 멸균 담체인, 약제학적 조성물.
  22. 제11항에 있어서, 상기 담체가 고체 담체인, 약제학적 조성물.
  23. 제11항에 있어서, 상기 담체가 액체 담체인, 약제학적 조성물.
  24. 제11항에 있어서, 상기 담체가 수성 담체인, 약제학적 조성물.
  25. 제1항에 따른 혈소판을 제공하는 단계; 및
    상기 혈소판을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 활성제를 포함하는 마이크론 또는 나노미터 크기 입자를 함유하는 혈소판을 환자의 목적 부위에 전달하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 혈소판이 포유동물 혈액 혈소판을 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 혈소판이 사람 혈액 혈소판을 포함하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 마이크론 또는 나노미터 크기 입자가 천연 및 합성 중합체, 가지돌기 네트워크, 소 분자의 응집물, 센자성 물질, 인지질 소포, 미셀 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로부터 제조되는, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 단백질, RNA, DNA, 킬레이트제, 방사성 화합물, 센자성 화합물, 초-상자성 복합체 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제인, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 항바이러스제를 포함하는, 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 응고 단백질을 포함하는, 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 혈액 항-응고 단백질을 포함하는, 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 핵산을 포함하는, 방법.
  34. 제25항에 있어서, 상기 활성제가 초-상자성 산화철 나노입자인, 방법.
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