KR20100017747A - 피부 궤양의 치료 방법 - Google Patents

피부 궤양의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Lp-PLA2 단백질의 활성 또는 발현의 억제제를 포함하는 제약 조성물을 피부 궤양에 걸리거나 피부 궤양이 발생할 위험이 있는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 피부 궤양의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
피부 궤양, Lp-PLA2 단백질, 활성, 발현 억제제, 제약 조성물, 치료, 예방

Description

피부 궤양의 치료 방법{METHODS OF TREATMENT OF SKIN ULCERS}
본 발명의 실시태양은 일반적으로 Lp-PLA2 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제하는 물질을 사용하는 피부 궤양의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 관한 것이다.
지단백질-관련 포스포리파제 A2 (Lp-PLA2) (이전에, 혈소판 활성화 인자 아세틸 히드롤라제 (PAF 아세틸 히드롤라제)로도 당업계에 알려져 있음)는 지단백질 지질 또는 인지질의 가수분해에 관여하는 포스포리파제 A2 효소의 거대부류의 구성원이다. 이는 림프구, 단핵구, 대식세포, T 림프구 및 비만세포를 비롯한, 손상에 대한 전신 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 몇몇 세포에서 분비된다.
LDL의 그의 산화된 형태로의 전환 동안, Lp-PLA2는 산화에 의해 변형된 포스파티딜콜린의 sn-2 에스테르를 가수분해하는 것을 담당하여 리소-포스파티딜콜린 및 산화에 의해 변형된 지방산을 제공한다. Lp-PLA2는 산화된 LDL과 연결된 말단절단된 (truncated) 인지질의 sn2 위치를 가수분해한다. 그 결과, 2가지 염증 세포 귀소 (homing) 매개체 (비-에스테르화 지방산 (NEFA) 및 LYSO PC)가 생성된다. NEFA 및 LYSO PC는 둘 모두 순환하는 단핵구에 대한 화학주성물질이고, 대식세포의 활성화에서 일정 역할을 하고, 산화 스트레스를 증가시키고, T 림프구의 기능적 및 즉각적 반응에 영향을 미친다. Lp-PLA2는 인간 및 돼지에서 지단백질 B를 통해 LDL 분자에 결합하고, 일단 동맥벽 내에서 산화된 LDL은 Lp-PLA2에 의한 가수분해에 대해 감수성이다.
Lp-PLA2 작용의 이들 두 생성물은 모두 순환하는 단핵구에 대한 강력한 화학주성물질이다. 따라서, 상기 효소는 동맥 내에 콜레스테롤 에스테르가 채워진 세포의 축적을 초래하여, 초기 단계의 죽상동맥경화증과 연관된 특징적인 '지방띠 (fatty streak)'를 유발하는 것으로 생각되고, Lp-PLA2 효소의 억제는 (리소포스파티딜콜린의 형성 억제에 의해) 상기 지방띠의 증강을 방지하는데 있어서 유용하고, 죽상동맥경화증의 치료에 유용할 수 있다.
또한, Lp-PLA2는 LDL 산화에서 직접적인 역할을 하는 것으로 제안되었다. 이것은 전체 산화 과정에 기여하고 향상시키는 Lp-PLA2 작용의 다가불포화 지방산-유래 지질 퍼옥사이드 생성물로 인한 것이다. 상기 생각대로, Lp-PLA2는 LDL 산화를 억제한다. 따라서, Lp-PLA2 억제제는 죽상동맥경화증 및 당뇨병과 같은 병태에 추가로, 효소 활성 및/또는 활성화된 염증 반응과 관련한 지질 과산화를 수반하는 임의의 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 심근경색 및 재관류 손상과 같은 다른 병태에서 일반적인 용도를 가질 수 있다.
피부는 인체의 가장 큰 장기이다. 이는 신체를 덮어 외부 표면으로 적용되고, 모든 장기 중에서 가장 큰 표면적을 갖는 것으로 보인다. 또한, 이는 임의의 단일 내부 장기보다 더 무거우므로 체중에 적용되고, 체중의 약 15％를 차지한다. 평균적인 성인의 경우, 피부는 표면적이 1.5-2.0 제곱미터이고, 그 대부분은 2-3 mm 두께이다. 평균 제곱인치의 피부는 650개의 땀샘, 20개의 혈관, 60,000개의 멜라닌세포, 및 수천 개를 초과하는 신경 종말을 갖는다.
장기로서, 피부는 아래에 놓인 근육 및 장기를 보호하는 다층 상피 조직, 표피, 진피, 및 피하조직으로 이루어진 외피계이다. 주위환경과의 계면으로서, 피부는 감염에 대한 방수 및 장벽층을 제공함으로써 병원체에 대한 보호에 있어서 가장 중요한 역할을 한다. 그의 다른 주요 기능은 절연 및 온도 조절, 감각 및 비타민 D 및 B 합성이다. 요소의 미량 분비 및 산소와 의약의 흡수가 또한 피부를 통해 달성된다. 따라서, 피부는 신체의 가장 중요한 부분 중 하나로서 여겨진다.
찰과상 또는 창상에서와 같이 피부의 완전성이 손상되면 다층 상피층의 단절이 존재하고, 따라서, 피부의 보호 기능이 국소적으로 손실된다. 인체는 상피 단절을 막는 것을 주목적으로 하는 국소화된 상처 치유 반응을 일으키고, 병원체의 침입을 방지한다. 상처 치유 반응은 상처로 혈류를 증가시키고, 임의의 병원체와 세포 파편을 제거하기 위해 수많은 면역 세포 (포식성 대식세포) 및 염증 반응을 동원하고, 상처 부위로 섬유모세포를 동원하고, 세포외 매트릭스를 분비하는 것을 포함하고, 진피층과 표피층을 재생함으로써 상처를 봉합한다.
때때로, 상기 상처 치유 반응은 각종 의학적 상태 및/또는 반복하는 외상 및 그의 조합으로 인해 손상되거나 저해되어, 상처는 피부에 개방성 미란 (open sore) 또는 궤양으로 남게 된다. 상기 개방성 미란은 주변 영역 내의 병원체에 의해 감염되기 쉽다. 피부 궤양은 감염 및 비정상의 염증으로 인해 넓어질 수 있다. 고름 (죽은 면역 세포, 피부 세포, 및 감염 물질)이 피부 궤양의 공강 내에 축적되어 고름집 (abscess)을 형성한다. 대부분의 신체 내의 고름집은 거의 스스로 치유되지 않아서, 고름집이 처음 의심될 때 신속한 의학적 조치가 지시된다.
피부는 우리의 주위환경 내의 임의의 병원체에 대한 1차 방어선이므로, 만성 궤양이 있다는 것은 즉각적이고 공격적인 치료를 요하는 매우 심각하고 위험한 의학적 상황을 나타내고, 시기적절한 방식으로 문제를 처리하지 못하면 괴저, 절단술로 인한 부속기관의 상실, 패혈증, 및 심지어 사망과 같은 비참한 결과에 이를 수 있다.
만성 피부 상처는 당뇨병, 순환 문제, 암, 면역계 질환, 신경학적 질환에 걸리거나 움직임이 제한 (limited mobility)되어, 휠체어를 타야하거나 누워서 생활해야 하는 (bedridden) 사람들에 있어서 아주 흔한 문제이다. 움직임 제한은 손상 또는 질병으로 인한 마비, 또는 뇌성마비 및 척추갈림증과 같은 출생 결함으로 인한 것일 수 있다. 만성 피부 궤양은 낙마 사고로 마비된 유명한 배우인 크리스토퍼 리브 (Christopher Reeve)의 주요 사망 요인이다. 피부 궤양의 유병률은 전신마비 환자에서 60％ 및 대퇴골 골절을 입기 쉬운 고령의 환자에서 66％ 정도로 높을 수 있다 ("The Agency for Health Care Policy and Research" Clinical Practice Guideline Number 3, AHCPR Pub. No. 92-0047 참조). 그들의 생애 중에 적어도 1회로 매우 감염되기 쉬운 당뇨 환자에 있어서, 15％가 피부 궤양을 발병할 것이다. 실제로, 매년 시행되는 당뇨 절단술의 85％에는 궤양이 앞서 일어난다 [Glover J. L., et. al., 1997, Adv. Wound Care 10:33-38].
미국에서만 5-7백만 명의 사람들이 만성 피부 궤양으로 시달리고 있는 것으로 추정된다 (Petrie N, et. al, 2003, Surgical Clinics of North America 83(3): 194-9). 미국에서는 매년 상처 진단과 수술 절차, 약제, 상처 봉합 장치 및 병원 및 담당의사 비용을 포함한 만성 상처의 총 직접 비용이 $2백억에 달하는 것으로 추정된다 ([Frykberg R, et. al., 2000, J Foot Ankle Surg 39(5 Suppl):1-60]; [Harding K, et. al., 2002, BMJ 324(7330):160-3]). 작업 시간 손실 및 삶의 질 저하와 같은 만성 상처의 간접 비용은 상기 추정치에 포함되지 않고, 양을 정하기 어렵지만, 상당한 것으로 생각될 수 있다.
현재, 만성 상처 관리는 약물 치료, 예를 들어 항균 및 항진균 약물, 혈전용해제 또는 혈괴-제거제, 예를 들어 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 압박 붕대의 사용, 생물공학적으로 처리된 (bioengineered) 피부 대체물 (Cultivated Epidermal Allografts), 전기 자극, 최신 약물 전달 시스템, 예를 들어 이온도입법 (iontophoresis)-기반 경피 전달 시스템, 조직을 수복하는 물질, 예를 들어 혈소판 유래 및 자가 성장 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (G-M CSF) 및 메소글리칸의 국소화된 전달, 음압 상처 치료 및 초음파를 포함한다. 그러나, 감염의 공격적인 관리 및 혈액 순환 개선과 함께 만성 피부 궤양을 치료하고 그의 치유를 촉진하기 위한 다분야 통합 방안에도 불구하고, 만성 피부 궤양은 계속하여 주요 임 상 문제가 되고 있다. 대부분의 시간에, 의사들은 상처가 이들 고가의 최신 절차의 실시를 필요로 할 수 있음을 초기에 결정할 방법이 없었다. 따라서, 만성 피부 궤양을 발병할 고위험 집단에 있는 사람들에서 피부 궤양의 치료 및 예방에서 새로운 진보가 여전히 필요하다. 또한, 위험이 있는 사람들 사이에서 피부 궤양의 재발 에피소드의 예방에 있어서도 새로운 진보가 절실하게 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 그를 필요로 하는 대상체에게 Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 궤양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양은 대상체가 피부 궤양을 앓고 있거나 피부 궤양이 발생할 위험이 있는지 결정하고, Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 피부 궤양을 앓고 있거나 피부 궤양이 발생할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 궤양을 치료 및/또는 예방하는 방법이다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 피부 궤양은 욕창성 궤양, 열탕 궤양, 동상 궤양, 혈관 궤양, 대사성 궤양, 신경병증성 궤양, 결합 조직 질병에 동반하는 궤양, 의원성 (iatrogenic) 궤양, 인위성 궤양, 외상성 궤양, 종양성 궤양, 면역학적 질병 및 질환과 자가면역 질병에 동반하는 궤양, 혈액학적 질병과 연관된 궤양, 백혈구 질환과 연관된 궤양, 이상 단백혈성 궤양, 병원체 감염으로 인한 궤 양, 기생충 감염으로 인한 궤양, 및 미지의 병인의 질병 및 질환에 동반하는 궤양으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
피부 궤양을 발병할 위험 인자는 피부 궤양을 일으키는 경향이 있는 질병 또는 질환 또는 외상과 연관된 피부 궤양의 과거 에피소드가 있음; 고령; 누워서 생활해야 함; 휠체어를 타야함; 영양실조; 신체 활동의 결핍; 과도한 알콜 사용; 요실금; 대변 실금; 취약 피부; 감소된 정신 능력; 흡연; 당뇨병으로 진단되거나 당뇨병에 걸림; 고혈압; 고수준의 호모시스테인; 과체중임; 정맥류성 정맥의 가족력; 혈관염에 걸림; 혈액 응고 질환으로 진단됨; 장시간 서있어야 하는 직업; 겸상적혈구성 빈혈에 걸림; 브로마이드-함유 약물 치료 경험; 히드록시우레아-기반 화학요법 경험; 신부전증; 나병; 화상 환자임; 및 동상을 포함한다.
한 실시태양에서, 대상체는 적어도 하나의 위험 인자가 있다. 다른 실시태양에서, 대상체는 적어도 2개의 위험 인자가 있다.
한 실시태양에서, Lp-PLA2의 단백질 활성을 억제하는 물질은 소분자, 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 앱타머 (aptamer) 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 단백질 활성을 억제하는 물질은 소분자, 예를 들어 비제한적으로 Lp-PLA2 단백질의 소분자의 가역적 또는 비가역적 억제제이다. 몇몇 실시태양에서, 그러한 소분자는 피리미디온계 화합물이다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 소분자 억제제는 예를 들어 1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트 리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 (SB480848으로도 알려짐) 또는 그의 염이지만 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 소분자 억제제는 예를 들어 N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 또는 그의 염이지만 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 소분자 억제제는 예를 들어 N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드; 또는 그의 염이지만 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 소분자 억제제는 예를 들어 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]-아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 또는 그의 염이지만 이로 제한되지 않는다.
다른 형태의 억제제는 RNAi 물질, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA 또는 리보자임 또는 그의 변이체인 핵산 물질을 포함한다.
한 실시태양에서, Lp-PLA2의 단백질 활성을 억제하는 물질은 추가의 치료제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 이들 추가의 치료제는 항미생물 요법제, 항기생충 요법제, 항비만 요법제, 당뇨병 요법제, 심혈관 질병 요법제, 신부전증 요법제, 혈관염 요법제, 정맥 부전증 요법제, 동맥 부전증 요법제, 암 요법제, 면역 억제 요법제, 면역결핍증 요법제, 스테로이드 요법제, 화상 요법제, 및 정신요법제로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
또다른 실시태양에서, Lp-PLA2의 단백질 활성을 억제하는 물질은 추가의 치료제 및 표준 상처 치유 관리와 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
다른 실시태양에서, Lp-PLA2의 단백질 활성을 억제하는 물질은 생물공학적으로 처리된 피부 대체물과 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
도 1. Lp-PLA2 억제제 SB480848로 처리한 당뇨/고콜레스테롤혈증 (DM/HC) 돼지에서 및 Lp-PLA2 억제제로 처리하지 않은 DM/HC 돼지에서 고름집 (궤양 내의 고름 축적) 발달 및 궤양 치료의 스케쥴 (일). 비-처리 대조군에 21마리의 DM/HC 돼지, 및 SB480848 처리군에 22마리의 DM/HC 돼지가 존재하였다. 돼지 #948 및 #963은 Lp-PLA2 억제제로 처리하였다. 이들 돼지는 억제제 처리 시작 전에 고름집을 발병하였다. 고름집은 처리되고, 1-2주의 평균 시간 내에 치유되었다. 1일 단일 용량의 SB480848 억제제 처리 개시 후에 추가의 고름집은 발달하지 않았다. 돼지 #975, #1024, #949, #947, #1007, 및 #15는 Lp-PLA2 억제제 SB480848로 처리하지 않았다. 이들 돼지는 모두 고름집을 발병하였고, 여기서 2마리의 돼지가 재발 고름집을 발병하였고, 1마리의 돼지는 2개월을 초과하여 지속하는 만성 궤양형성이 있었다.
본 발명의 실시태양은 DM/HC 돼지가 Lp-PLA2 효소를 억제하는 물질로 처리될 때 임의의 피부 궤양을 발병하지 못하였다는 발견에 기초한 것이다. DM/HC 돼지 모델은 표현형에서 고위험 인간 당뇨 환자와 많은 유사성을 나타낸다. 핵심 유사성 중 하나는 피부 고름집 (인간 당뇨병 감염에서 가장 흔하게 단리된 미생물인 포도상구균 (Staphylococcus)에 의해 유발되는 감염된 피부 궤양)을 발병하는 경향이다. 인간 당뇨 환자는 신경병증, 말초 혈관 병리, 및 제어되지 않은 혈당 상승과 종종 연관된 불량한 치유와 같은 합병증의 결과로서 족부 궤양 발병 경향이 크다. 돼지를 Lp-PLA2 효소 억제제 SB480848로 6개월에 걸쳐 처리할 때, 돼지는 임의의 피부 고름집을 발병하지 않았다. 또한, 처리의 초기에 활성 피부 고름집을 가진 돼지는 일단 초기 고름집이 치유된 후 피부 고름집이 없는 상태로 유지되고, 돼지는 피부 고름집의 재발 에피소드를 발병하지 않은 것으로 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양은 Lp-PLA2 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제함으로써 그를 필요로 하는 대상체에서 피부 궤양의 치료이다. 본 발명의 다른 실시태양은 Lp-PLA2 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제하는 것을 포함하는, 이전에 피부 궤양을 앓은 대상체에서 피부 궤양의 예방을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 Lp-PLA2 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제함으로써, 피부 궤양을 발병할 위험이 있는 대상체에서 피부 궤양의 예방을 포함한다.
<정의>
본원에서 달리 규정하지 않으면, 본원과 관련하여 사용되는 학술 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않으면, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "피부 궤양"은 피부 상의 개방성 미란을 나타내고, 여기서 표피가 부재한다. 아래에 놓인 진피 또는 피하조직이 노출되고 보일 수 있다. 주변의 피부는 붉어지고 염증을 일으킬 수 있다. 임의의 종류의 염증성 과정의 주요 증상 및 증후는 발적, 열, 종창 (swelling), 통증 및 기능의 상실이다. 그러한 개방성 미란은 세균, 진균 및 바이러스와 같은 병원체에 의해 감염되기 쉽다. 최근의 사례에서, 미란은 삼출액-고름일 수 있다. 고름 (죽은 면역 세포, 피부 세포, 세포액 및 감염 물질)이 피부 궤양의 공강 내에 축적하여 고름집을 형성한다.
용어 "질병" 또는 "질환"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 앓고있는 사람이나 이 사람과 접촉하는 사람에게 기능의 수행을 저지하거나 방해하고/하거나 불쾌함, 기능이상, 고통과 같은 증상 또는 심지어 사망을 일으키는 신체 및 일부 장기의 상태의 임의의 변경을 나타낸다. 질병 또는 질환은 또한 부조 (distemper), 괴로움, 경증, 만성병, 질환, 앓음, 병, 호소, 가벼운 병 또는 가식에 관련될 수 있다.
용어 "물질 (agent)"는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않거나 투여되는 수준으로 존재하지 않는 임의의 엔티티 (entity)를 나타낸다. 물질은 화학물질; 소분자; 핵산 서열; 핵산 유사체; 단백질; 펩티드; 앱타머; 항체; 또는 그의 단편을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 핵산 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 단일 또는 이중가닥일 수 있고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들어 펩티드-핵산 (PNA), 의사-상보성 (pseudo-complementary) PNA (pc-PNA), 잠금 (locked) 핵산 (LNA) 등을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 그러한 핵산 서열은 예를 들어 전사 리프레서 (repressor)로서 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제성 핵산 서열, 예를 들어 비제한적으로 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 단백질 및/또는 펩티드 또는 그의 단편은 관심 있는 임의의 단백질, 예를 들어, 비제한적으로 돌연변이된 단백질; 치료 활성의 단백질 및 말단절단된 단백질일 수 있고, 여기서 단백질은 세포 내에서 정상적으로 부재하거나 보다 낮은 수준으로 발현된다. 단백질은 또한 돌연변이된 단백질, 유전공학적으로 처리된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 (chimeric) 단백질, 항체, 미니항체, 미니바디 (minibody), 트리아바디 (triabody), 인간화 (humanized) 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 그의 단편을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 별법으로, 물질은 세포 내로 핵산 서열의 도입 및 세포 내에서 Lp-PLA2의 핵산 및/또는 단백질 억제제의 생산을 일으키는 그의 전사의 결과로서 세포 내에서 존재하는 것일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 물질은 비제한적으로 합성 및 자연 발생하는 비-단백질성 엔티티를 포함한, 임의의 화학물질, 엔티티 또는 모이어티 (moiety)이다. 특정 실시태양에서, 물질은 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로시클릴 모이어티, 예를 들어 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 포함한다. 물질은 목적하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 알려질 수 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "억제하는"은 pL-PLA2의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 상동체의 발현 또는 활성에 관련될 때 반드시 발현 및/또는 활성의 완전한 억제를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성은 목적하는 효과를 나타내기 위해 충분한 정도로 및/또는 충분한 시간 동안 억제된다. 특히, Lp-PLA2의 억제는 Lp-PLA2 억제에 대한 분석을 이용하여, 예를 들어 비제한적으로 본원에 개시된 Lp-PLA2 단백질에 대한 생물검정을 이용하여 결정할 수 있다. Lp-PLA2를 억제하는 물질은 Lp-PLA2 단백질 및/또는 Lp-PLA2 기능을 적어도 10％ 억제하는 물질이다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 억제제는 Lp-PLA2 단백질 또는 Lp-PLA2의 발현을 적어도 10％ 억제하는 물질이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "Lp-PLA2"는 본원에 개시된 방법에 의해 억제시킬 단백질 표적을 나타낸다. Lp-PLA2는 Lp-PLA2 및 지단백질 관련 포스포리파제 A2 (이전에 당업계에서 혈소판 활성화 인자 아세틸 히드롤라제 (PAF 아세틸 히드롤라제)로도 공지됨)와 상호교환가능하게 사용된다. 인간 Lp-PLA2는 기탁 번호 U20157 (서열 1) 또는 Ref Seq ID: NM_005084 (서열 2)에 상응하는 핵산에 의해 코딩되고, 인간 Lp-PLA2는 기탁 번호 NP_005075 (서열 3)에 상응하는 단백질 서열에 상응하고, 이는 그 전부가 본원에 구체적으로 참고로 포함된 미국 특허 5,981,252에 개시되어 있다.
본원에서 사용될 때, RNAi 분자, 예를 들어 siRNA 또는 miRNA의 활성에 관련하여 "유전자 사일런싱" 또는 "사일런싱된 유전자"는 miRNA 또는 RNA 간섭 분자의 부재 하에 세포 내에서 발견되는 mRNA 수준의 적어도 약 5％, 약 10％, 약 20％, 약 30％, 약 40％, 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％, 약 99％, 약 100％로 표적 유전자에 대한 세포 내의 mRNA 수준의 감소를 나타낸다. 한 바람직한 실시태양에서, mRNA 수준은 적어도 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％, 약 99％, 약 100％ 감소한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "RNAi"는 임의의 종류의 간섭 RNA, 예를 들어 비제한적으로 siRNAi, shRNAi, 내인성 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA를 나타낸다. 예를 들어, 이는 RNA의 하류 처리 메카니즘에 무관하게 이전에 siRNA로서 확인된 서열을 포함한다 (즉, siRNA는 mRNA의 절단을 일으키는 생체내 처리의 특수한 방법을 갖는 것으로 생각되지만, 그러한 서열은 본원에 기재된 좌우 (flanking) 서열의 문맥에서 벡터 내로 포함될 수 있다).
본원에서 사용될 때, "siRNA"는 이중가닥 RNA를 형성하는 핵산을 나타내고, 여기서 이중가닥 RNA는 siRNA가 표적 유전자, 예를 들어 Lp-PLA2와 동일한 세포 내에 존재하거나 발현될 때 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 능력을 갖는다. 이중가닥 RNA siRNA는 상보성 가닥에 의해 형성될 수 있다. 한 실시태양에서, siRNA는 이중가닥 siRNA를 형성할 수 있는 핵산을 나타낸다. siRNA의 서열은 전장 표적 유전자, 또는 그의 하위서열에 상응할 수 있다. 일반적으로, siRNA는 적어도 약 15-50개 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중가닥 siRNA의 각각의 상보성 서열은 약 15-50개 뉴클레오티드 길이이고, 이중가닥 siRNA는 약 15-50개 염기쌍 길이, 바람직하게는 약 19-30개 염기 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20-25개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다).
본원에서 사용될 때, "shRNA" 또는 "작은 헤어핀 (hairpin) RNA" (스템 루프 (stem loop)로도 칭함)는 siRNA의 한 종류이다. 한 실시태양에서, 이들 shRNA는 짧은 (예를 들어 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드) 안티센스 가닥에 이어, 약 5 내지 약 9개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥으로 이루어진다. 별법으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조에 앞설 수 있고, 안티센스 가닥이 뒤에 올 수 있다.
용어 "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되어 내인성 RNA이고, 그 중 일부는 전사후 수준에서 단백질-코딩 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 내인성 마이크로RNA는 mRNA의 생산적 활용을 조정할 수 있는 게놈 내에 자연적으로 존재하는 작은 RNA이다. 용어 인공 마이크로RNA는 mRNA의 생산적 이용을 조정할 수 있는, 내인성 마이크로RNA 이외의 임의의 종류의 RNA 서열을 포함한다. 마이크로RNA 서열은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Lim, et al., Genes & Development, 17, p. 991-1008 (2003)], [Lim et al Science 299, 1540 (2003)], [Lee and Ambros Science, 294, 862 (2001)], [Lau et al., Science 294, 858-861 (2001)], [Lagos-Quintana et al, Current Biology, 12, 735-739 (2002)], [Lagos Quintana et al, Science 294, 853-857 (2001)] 및 [Lagos-Quintana et al, RNA, 9, 175-179 (2003)]에 기재되어 있다. 다수의 마이크로RNA가 또한 전구체 분자 내로 포함될 수 있다. 또한, miRNA-유사 스템-루프가 miRNA 및/또는 RNAi 경로를 통해 내인성 유전자의 발현을 조정하기 위한 목적으로 인공 miRNA 및 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 전달하기 위해 비히클로서 세포 내에서 발현될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "이중가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 2개의 가닥으로 이루어진 RNA 분자를 나타낸다. 이중가닥 분자는 자체에 둘로 접혀 2-가닥 구조를 형성하는 단일 RNA 분자로 이루어진 것을 포함한다. 예를 들어, 프리 (pre)-miRNA로 불리는, 그로부터 단일가닥 miRNA가 유래하는 스템 루프 구조의 전구 분자 (Bartel et al. 2004. Cell 116:281-297)는 dsRNA 분자를 포함한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본 발명에 따른 제약 조성물을 사용하는 치료 (예방 치료 포함)가 제공되는 동물, 예를 들어 인간을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 나타낸다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예를 들어 마우스 또는 래트), 기니 피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비-포유동물, 예를 들어 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 한 실시태양에서, 대상체는 인간이다. 다른 실시태양에서, 대상체는 질병 모델로서 실험 동물 또는 동물 대체물이다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 구역 및/또는 비-번역 서열 (예를 들어, 인트론, 5'- 및 3'-비번역 서열 및 조절 서열)을 포함하는 게놈 유전자일 수 있다. 유전자의 코딩 구역은 아미노산 서열 또는 기능적 RNA, 예를 들어 tRNA, rRNA, 촉매 활성의 RNA, siRNA, miRNA 및 안티센스 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 유전자는 또한 임의로 그에 연결된 5'- 또는 3'-비번역 서열을 포함하는 코딩 구역 (예를 들어 엑손 및 miRNA)에 상응하는 mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 유전자는 또한 모든 또는 일부의 코딩 구역 및/또는 그에 연결된 5'- 또는 3'-비번역 서열을 포함하는, 시험관 내에서 생산된 증폭된 핵산 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 당업자가 이해할 바와 같이, 단일 가닥의 서술은 또한 상보성 가닥의 서열을 규정한다. 따라서, 핵산은 또한 서술된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 또한 당업자가 이해할 바와 같이, 핵산의 많은 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 그의 상보체를 포함한다. 또한 당업자가 이해할 바와 같이, 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA (게놈 및 cDNA 모두), RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합물, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함한 염기의 조합물을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 얻을 수 있다.
핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 적어도 하나의 상이한 연결기, 예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결기 및 펩티드 핵산 백본 (backbone) 및 연결기를 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있다. 다른 유사체 핵산은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,235,033과 5,034,506에 기재된 것을 포함하는, 양성 백본; 비-이온성 백본, 및 비-리보스 백본을 갖는 것을 포함한다. 하나 이상의 비-자연 발생의 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 핵산이 또한 핵산의 하나의 정의에 포함된다. 변형된 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 핵산 분자의 5'-말단부 및/또는 3'-말단부에 위치할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 대표적인 예는 당- 또는 백본-변형된 리보뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 핵염기-변형된 리보뉴클레오티드, 즉, 자연 발생하는 핵염기 대신에 비-자연 발생하는 핵염기를 함유하는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 5-위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8-위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화된 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 또한 적합함을 알아야 한다. 2' OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로부터 선택되는 기로 교체될 수 있고, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다. 리보스-포스페이트 백본의 변형은 다양한 이유로, 예를 들어, 바이오칩 상의 프로브로서 또는 생리학적 환경 내에서 그러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. 자연 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있고; 별법으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 자연 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 나타낸다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 세균 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가복제성 염색체 외부 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합된 벡터일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "치료하는"은 피부 궤양과 연관된 병태 질병 또는 질환의 적어도 하나의 유해 효과 또는 증상을 감소시키거나 완화하는 것을 포함한다.
Lp-PLA2 억제제를 사용하는 치료 시에 병변 또는 궤양 중증도의 임상적으로 용인되는 척도에서 분류의 적어도 하나의 단계 또는 수준의 개선이 달성되면, 치료는 일반적으로 "효과적인" 것으로 여겨진다. 별법으로 또는 추가로, 치료 이후 적어도 25％의 피부 병변의 크기 (면적 및/또는 깊이)의 감소가 "효과적인" 치료로 여겨진다.
예방의 효능은 Lp-PLA2 억제제를 사용한 치료의 개시 이후 피부 병변을 발병할 위험이 있는 대상체의 피부를 평가함으로써 모니터링한다. 위험이 있는 개체에서 피부 병변의 부재는 "효과적인" 예방의 신호로 여겨진다. 유사하게, 개체가 피부 병변의 병력이 있는 경우에, 새로운 병변의 부재, 또는 심지어 임의의 새로운 병변의 빈도 또는 중증도에서, 예를 들어 50％ 이상의 감소가 본원에 기재된 방법에 의한 피부 궤양의 "효과적인" 예방의 표시이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "유효량"은 상기 용어가 본원에서 정의된 바와 같이 "효과적인" 치료를 제공하기 위한 제약 조성물의 치료제의 양을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 유효량은 또한 질병의 증상의 발병을 방지하거나 지연시키거나, 질병의 증상의 진행을 변경시키거나 (예를 들어 비제한적으로 질병의 증상의 진행을 느리게 하거나), 질병의 증상을 역전시키기 위해 충분한 양을 포함할 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "투여하는", 및 "도입하는"은 상호교환가능하게 사용되고, 목적하는 부위에서 물질의 적어도 부분적인 국재화를 일으키는 방법 또는 경로에 의해 대상체 내로 본원에 개시된 Lp-PLA2를 억제하는 물질의 배치를 나타낸다. 본 발명의 화합물은 대상체에서 효과적인 치료를 일으키는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
용어 "벡터"는 "플라스미드"와 상호교환가능하게 사용되어, 그가 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 그가 작동가능하게 연결되어 있는 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 그들의 벡터 형태에서는 염색체에 결합되지 않는 원형 이중가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"의 형태로 존재한다. 다른 발현 벡터, 예를 들어, 비제한적으로 플라스미드, 에피좀, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터가 본 발명의 상이한 실시태양에서 사용될 수 있고, 그러한 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합되거나 특정 세포 내에서 자발적으로 복제할 수 있다. 동등한 기능을 하는 당업자에게 공지된 다른 형태의 발현 벡터가 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터는 DNA를 코딩하는 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다.
부정관사 ("a" 및 "an")는 부정관사의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 문법적 목적어를 나타내도록 본원에서 사용된다. 예로서, "(an) 효소"는 하나의 효소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "의원성"은 의사의 활동, 방식, 또는 요법에 의해 환자에서 유도된 것, 예를 들어, 특정 질병 또는 질환에 대한 약물 요법에 의해 유도된 것을 의미한다.
Lp - PLA 2 : 일반적인 정보
Lp-PLA2는 또한 별칭으로서 Lp-PLA2, LDL-PLA2, 지단백질 관련 포스포리파제 A2, PLA2G7, 포스포리파제 A2 (그룹 VII), 또는 혈소판 활성화 인자 아세틸 히드롤라제 (PAF 아세틸 히드롤라제 또는 PAFAH)로 당업계에서 언급된다. 인간 Lp-PLA2는 GenBank 기탁 번호 U20157 (서열 1) 또는 Ref Seq ID: NM_005084 (서열 2)에 상응하는 핵산에 의해 코딩되고, 인간 Lp-PLA2는 GenBank 기탁 번호 NP_005075 (서열 3)에 상응하는 단백질 서열에 상응하고, 이는 그 전부가 본원에 구체적으로 참고로 포함된 미국 특허 5,981,252에 개시되어 있다.
포스포리파제 A2 효소 지단백질 관련 포스포리파제 A2 (Lp-PLA2), 서열, 그의 단리 및 정제, 효소를 코딩하는 단리된 핵산, 및 효소를 코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 숙주 세포는 그 전부가 본원에 구체적으로 참고로 포함된 WO 95/00649 (스미쓰클라인 비참 피엘씨 (SmithKline Beecham plc))에 개시되어 있다. 동일한 그룹으로부터의 후속 공개 문헌에는 상기 효소가 추가로 설명되어 있고 (Tew D et al, Arterioscler Thromb Vas Biol 1996:16; 591-9), 여기서 LDL PLA2로 언급되어 있고, 보다 최근의 특허 출원 (WO 95/09921 (아이코스 코퍼레이션 (Icos Corporation))과 국내 단계의 관련 공개 문헌 (Tjoelker et al, vol 374, 6 April 1995, 549)에는 Lp-PLA2와 본질적으로 동일한 서열을 갖는 효소 PAF-AH가 설명되어 있다.
Lp-PLA2는 저밀도 지단백질 (LDL)의 그의 산화된 형태로의 전환 동안 포스파티딜콜린의 리소포스파티딜콜린으로의 전환을 담당하는 것으로 나타났다. 이 효소는 산화된 포스파티딜콜린의 sn-2 에스테르를 가수분해하여 리소포스파티딜콜린 및 산화에 의해 변형된 지방산을 제공하는 것으로 알려져 있다. Lp-PLA2 작용의 두 생성물은 특히 단핵구 화학주성 및 내피 기능이상의 유도를 포함하는 것으로 생각되는 몇몇 전-죽종형성 활성을 갖는 리소포스파티딜콜린과 생물학적으로 활성이고, 이들 둘 모두는 동맥벽 내에서 단핵구-유래 대식세포 축적을 용이하게 한다.
Lp - PLA 2 를 억제하는 물질
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 Lp-PLA2의 억제에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 억제는 Lp-PLA2를 코딩하는 핵산 전사체의 억제, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA)의 억제이다. 별도의 실시태양에서, Lp-PLA2의 억제는 Lp-PLA2의 유전자 생성물, 예를 들어 Lp-PLA2의 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 그의 이소형의 발현의 억제 및/또는 활성의 억제이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "유전자 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 또는 유전자에 의해 코딩되거나 RNA로부터 번역된 폴리펩티드를 나타낸다.
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 억제는 물질에 의한다. 임의의 물질, 예를 들어 비제한적으로 핵산, 핵산 유사체, 펩티드, 파지, 파지미드, 폴리펩티드, 펩티드유사체 (peptidomimetic), 리보솜, 앱타머, 항체, 작거나 큰 유기 또는 무기 분자, 또는 그의 임의의 조합물을 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 유용한 물질은 Lp-PLA 발현의 억제제, 예를 들어 Lp-PLA를 코딩하는 mRNA의 억제제로서 기능하는 물질을 포함한다.
본원에 개시된 방법에서 유용한 물질은 또한 유전자 발현을 억제할 (즉, 유전자의 발현을 억압하고/하거나 억누를) 수 있다. 그러한 물질은 당업계에서 "유전자 사일렌서 (silencer)"로서 언급되고, 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 그 예로는 핵산 서열, RNA, DNA 또는 핵산 유사체를 포함하지만 이로 제한되지 않고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 핵산 유사체, 예를 들어 비제한적으로 펩티드 핵산 (PNA), 의사-상보성 PNA (pc-PNA), 잠금 핵산 (LNA) 및 그의 유도체 등을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 핵산 물질은 또한 예를 들어, 전사 리프레서로서 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제성 핵산 서열, 예를 들어 비제한적으로 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, Lp-PLA2 발현의 억제제 및/또는 Lp-PLA2 단백질 기능의 억제제로서 방법에서 유용한 물질은 임의의 종류의 엔티티, 예를 들어 비제한적으로 화학물질, 핵산 서열, 핵산 유사체, 단백질, 펩티드 또는 그의 단편일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 물질은 비제한적으로 합성 및 자연 발생의 비-단백질성 엔티티를 포함하는 임의의 화학물질, 엔티티 또는 모이어티이다. 특정 실시태양에서, 물질은 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 화학적 모이어티는 본원에 개시된 피리미디온계 화합물이다.
별도의 실시태양에서, 본원에 개시된 방법에서 유용한 물질은 Lp-PLA2의 유전자 발현 또는 Lp-PLA2 단백질의 기능을 억제하는 단백질 및/또는 펩티드 또는 그의 단편이다. 그러한 물질은 예를 들어, 단백질 변이체, 돌연변이된 단백질, 치료 활성의 단백질, 말단절단된 단백질 및 단백질 단편을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 단백질 물질은 또한 돌연변이된 단백질, 유전공학적으로 처리된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 미니바디, 미니항체, 트리아바디, 인간화 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 그의 단편을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다.
별법으로, Lp-PLA2의 억제제로서 본원에 개시된 방법에서 유용한 물질은 비제한적으로 합성 및 자연 발생의 비-단백질성 엔티티를 포함하는 화학물질, 소분자, 큰 분자 또는 엔티티 또는 모이어티일 수 있다. 특정 실시태양에서, 물질은 본원에 개시된 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다.
소분자
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 소분자이다. Lp-PLA2의 비가역적 또는 가역적 억제제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
Lp-PLA2의 비가역적 억제제는 그 전부가 본원에 참고로 구체적으로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 96/13484, WO96/19451, WO97/02242, WO97/217675, WO97/217676, WO97/41098 및 WO97/41099 (스미쓰클라인 비참 피엘씨)에 개시되어 있고, 특히 효소 Lp-PLA2의 억제제인 각종 시리즈의 4 티오닐/술피닐/술포닐 아제티디논 화합물을 개시한다. 이들은 비가역적인 아실화 억제제이다 (Tew et al, Biochemistry, 37, 10087, 1998).
인간에서 효과적인 Lp-PLA2 억제제는 당업자에게 일반적으로 알려져 있고, 예를 들어 전-임상 및 II상 임상 시험을 포함한 임상 평가를 받고 있는 것을 포함한다. 많은 출원이 스미쓰클라인 비참 및 그의 승계회사인 글락소스미쓰클라인 (GlaxoSmithKline)에 의해 출원되고 공개되었다. 동일회사에 양도된 관련 출원 공개의 목록은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO01/60805, WO02/30904, WO03/016287, WO00/66567, WO03/042218, WO03/042206, WO03/042179, WO03/041712, WO03/086400, WO03/087088, WO02/30911, WO99/24420, WO00/66566, WO00/68208, WO00/10980 및 WO2005/021002이다. 추가로, 그 전부가 본원에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 가출원 60/829,328 및 60/829,327 (둘 모두 2006년 10월 13일에 출원됨)을 참조한다.
본원에 개시된 방법에서 유용한 다른 Lp-PLA2 억제제는 특허 출원 공개, 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO2006063791-A1, WO2006063811-A1, WO2006063812-A1, WO2006063813-A1 (모두 바이엘 헬쓰케어 (Bayer Healthcare)의 명칭으로); 및 US2006106017-A1 (한국생명공학연구원 (Korea Res. Inst. Bioscience & Biotechnology)에 양도됨)에 기재되어 있다. Lp-PLA2 억제제는 또한 공지의 물질, 예를 들어 비제한적으로 니아신 (www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568 참조) 및 페노피브레이트 (www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756&taxid=19 참조)와 함께 스타틴의 사용을 포함한다.
상기 문단에 제시된 모든 출원은 본원에 참고로 포함된다. 이들 문헌 내에 개시된 임의의 또는 모든 화합물은 피부 궤양의 예방 또는 치료를 위해 유용한 것으로 생각된다. 본원에 기재되고 실시예에 예시된 당뇨성 피부 궤양의 돼지 모델은 개시된 화합물 또는 Lp-PLA2의 다른 억제제, 예를 들어 항체, 소분자 또는 RNAi 중 어떤 것이 본원에서 청구된 바와 같이 피부 궤양의 치료 또는 예방에 효과적인지 결정하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 그 전부가 본원에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 6,649,619와 7,153,861 (및 국제 특허 출원 공개 WO 01/60805) 및 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 7,169,924 (및 국제 특허 출원 공개 WO 02/30911)에 개시되어 있는 Lp-PLA2 억제제가 본원에 개시된 피부 궤양의 예방 또는 치료를 위한 방법에 유용하다. 몇몇 실시태양에서, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 2005/0033052A1, 및 국제 특허 출원 공개 WO 02/30904, WO 03/042218, WO 03/042206, WO 03/042179, WO 03/041712, WO 03/086400 및 WO 03/87088에 개시되어 있는 Lp-PLA2 억제제는 가역적 Lp-PLA2 억제제이다.
화학식 I
국제 특허 출원 공개 WO 01/60805, 및 이를 기초로 한, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,649,619와 7,153,861 (그 전체 개시내용이 본원 내에 제시된 것처럼 본원에 포함됨)에 개시되어 있는 일군의 가역적 Lp-PLA2 억제제를 사용할 수 있다. 관심 있는 화합물의 보다 좁은 군은, WO 01/60805에 기재되어 있고 미국 특허 6,649,619 및 7,153,861에서 특허청구된 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
Figure 112009076184414-PCT00001
여기서,
Ra 및 Rb는 이들이 부착된 피리미딘 고리 탄소 원자와 함께 융합된 5원 카르보시클릭 고리를 형성하고;
R2는 1 내지 3개의 불소 원자에 의해 치환된 페닐이고;
R3은 NR8R9에 의해 치환된 메틸 또는 C(1-3)알킬이거나; 또는
R3은 Het C(0-2)알킬이고, 여기서 Het는 N을 갖는 5 내지 7원 헤테로시클릴 고리이고, N은 비치환되거나 또는 C(1-6)알킬로 치환되고;
R4 및 R5는 함께 4-(4-트리플루오로메틸페닐)페닐 모이어티를 형성하고;
동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소 및 C(1-6)알킬로 이루어지는 군 중에서 선택되고;
X는 S이다.
모두 화학식 I의 화합물의 범위 내에 포함되고 상기 출원 및 특허에 개시되되어 있는 다음 화합물 또는 상기 화합물의 제약상 허용되는 염이 보다 더 중요하다:
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 (본원에서 설명되는 돼지 연구에 사용됨);
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(2,3-디플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노-카르보닐메틸)-2-(3,4-디플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노- 카르보닐메틸)-2-(2,3,4-트리플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노-카 르보닐메틸)-2-(2-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-메틸-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐메틸)-2-(4- 플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-(1-피페리디노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노-카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(1-에틸피페리딘-4-일)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노-카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-에틸아미노-2-메틸프로필)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
N-(2-tert-부틸아미노에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노-카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(1-메틸피페리딘-4-일)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온;
1-(N-(2-(에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온.
상기 화합물의 제조 방법은 문헌에 개시되어 있다.
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온의 제조를 위한 두 번째 방법은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 03/016287 (미국 특허 출원 공개 20050014793A1)에서 볼 수 있다.
화학식 II
본 발명의 방법의 실시에 유용할 수 있는 화합물의 추가의 군은 WO 02/30911; 상기 국제 특허 출원 공개에 대응하는 미국 특허 7,169,924에 개시되어 있다. 두 출원은 모두 그 전부가 본원에 포함된다. 본원에서 화학식 II로 제시된 일반식은 다음과 같다:
Figure 112009076184414-PCT00002
상기 식에서,
R1은 C(1-6)알킬, C(1-6)알콕시, C(1-6)알킬티오, 히드록시, 할로겐, CN, 및 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체로 임의로 치환된 아릴기이고;
R2는 할로겐, C(1-3)알킬, C(1-3)알콕시, 히드록시C(1-3)알킬, C(1-3)알킬티오, C(1-3)알킬술피닐, 아미노C(1-3)알킬, 모노- 또는 디-C(1-3)알킬아미노C(1-3) 알킬, C(1-3)알킬카르보닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알콕시C(1-3)알킬카르보닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알킬술포닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알킬카르복시, C(1-3)알킬카르복시C(1-3)알킬이고,
R3은 수소, 할로겐, C(1-3)알킬 또는 히드록시C(1-3)알킬이거나; 또는
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리미돈 고리 탄소 원자와 함께 융합된 5원 또는 6원 카르보시클릭 고리를 형성하거나; 또는
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리미돈 고리 탄소 원자와 함께 할로겐, C(1-4)알킬, 시아노, C(1-6)알콕시, C(1-6)알킬티오 또는 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 융합된 벤조 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R4는 수소, 또는 히드록시, 할로겐, OR7, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10, NR9R10, NR7COR8, 모노- 또는 디 (히드록시C(1-6)알킬)아미노 및 N 히드록시C(1-6)알킬-N C(1-6)알킬아미노로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 치환되거나 비치환될 수 있는 C(1-6)알킬이거나; 또는
R4는 Het-C(0-4)알킬이고, 여기서 Het는 N 및 임의로 O 또는 S를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로시클릴 고리이고, N은 히드록시, 할로겐, OR7, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10 또는 NR9R10으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 임의 로 치환된 COR7, COOR7, CONR9R10, 또는 C(1-6)알킬에 의해 임의로 치환될 수 있고, R4는 예를 들어 피페리딘-4-일, 피롤리딘-3-일이고;
R5는 C(1-6)알킬, C(1-6)알콕시, C(1-6)알킬티오, 아릴C(1-6)알콕시, 히드록시, 할로겐, CN, COR7, 카르복시, COOR7, NR7COR8, CONR9R10, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬 및 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알콕시로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
R6은 C(1-18)알킬, C(1-18)알콕시, C(1-6)알킬티오, C(1-6)알킬술포닐, 아릴C(1-6)알콕시, 히드록시, 할로겐, CN, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10, NR7COR8, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬 및 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알콕시, 또는 C(5-10)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
R7은 수소 또는 C(1-12)알킬, 예를 들어 C(1-4)알킬 (예를 들어 메틸 또는 에틸)이고;
R8은 수소, OC(1-6)알킬 또는 C(1-12)알킬, 예를 들어 C(1-4)알킬 (예를 들어 메틸 또는 에틸)이고;
동일하거나 상이할 수 있는 R9 및 R10은 각각 수소, 또는 C(1-12)알킬로부터 선택되거나 또는 R9 및 R10은 이들이 부착되는 질소와 함께, 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고 히드록시, 옥소, C(1-4)알킬, C(1-4)알킬카르복시, 아릴, 예를 들어 페닐, 또는 아르알킬, 예를 들어 벤질, 예를 들어 모르폴린 또는 피페라진으로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환체에 의해 임의로 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하고;
X는 메틸 및 에틸로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 임의로 치환된 C(2-4)알킬렌, 또는 CH=CH이다.
화학식 II의 화합물의 모든 염도 본 발명의 치료 방법에 사용될 수 있다.
화학식 I에 대해 WO02/30911에서 언급된 바와 같이 R1이 할로, C1-C6 알킬, 트리플루오로메틸 또는 C1-C6 알콕시로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 페닐기인 화학식 II의 화합물이 특히 중요하다. 보다 구체적으로, 페닐은 1, 2, 3 또는 4개의 할로겐 치환체, 특히, 1 내지 3개의 플루오로기, 가장 특히, 2,3-디플루오로, 2,4-디플루오로 또는 4-플루오로에 의해 비치환되거나 치환된다.
화학식 II의 추가의 실시태양에서, Y는 -CH2CH2-이다.
또한, R2가 수소이거나, 또는 할로, C1-C6 알킬, 모노 내지 퍼플루오로-C1-C4 알킬, 모노 내지 퍼플루오로 C1-C46 알콕시, 또는 C1-C6 알콕시; 특히 모노 내 지 퍼플루오로-C1-C4 알킬, 모노 내지 퍼플루오로-C1-C4 알콕시, 또는 C1-C6 알콕시인 화학식 II의 화합물이 관심의 대상이다. R2가 수소 이외의 다른 기이고, (R2)n에서 n이 1, 2, 또는 3이고, 치환 패턴이 메타 및/또는 파라, 특히 파라인, 즉 4-위치 치환체인 화학식 II의 화합물이 특히 중요하다. 또한, R2가 4-트리플루오로메틸 또는 4-트리플루오로메톡시인 화합물을 참고한다.
R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 n-부틸이다. R3 및 R4가 동일하고, 메틸, 또는 에틸; 특히 메틸인 화학식 II의 화합물이 본원에서 특히 중요하다.
R5는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C(1-6) 알킬이다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, t-부틸, n-펜틸 또는 n-헥실이 특히 중요하다.
화학식 II의 화합물 내에, 기의 정의가 아래와 같은 화합물의 추가의 하위 군이 존재함이 이해될 것이다:
R1은 2,3-디플루오로에 의해 치환된 페닐이고;
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리미딘 고리 탄소 원자와 함께 융합된 5원 시클로펜테닐 고리를 형성하고;
R4는 2-(디에틸아미노)에틸이고;
R5는 페닐이고;
R6은 4-위치에서 트리플루오로메틸에 의해 치환된 페닐, 또는 5-위치에서 트리플루오로메틸에 의해 치환된 티엔-2-일이고;
X는 (CH2)2이다.
본원에서 관심 있는 특정 화학식 II의 화합물은 다음과 같다:
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-에틸아미노-2-메틸-프로필)-2-(2-(2-(2,3-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-t-부틸아미노에틸)-2-(2-(2-(2,3-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸-피페리딘-4-일)-2-(2-(2-(2,3-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(3-클로로-4-플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
(+/-)-N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2페닐-프로필)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(2,4-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(2,5-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐 -4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(3,4-디플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(2-플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(3-플루오로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(3-클로로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-클로로페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-메틸페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-에틸)-4-옥소- 4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-메톡시페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-(2-(2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
또는 임의의 바이타르트레이트 염의 유리 염기, 또는 다른 제약상 허용되는 염.
또한, WO 02/30904에 개시되어 있는 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 관심의 대상이다.
Figure 112009076184414-PCT00003
상기 식에서,
R1은 C(1-6)알킬, C(1-6)알콕시, C(1-6)알킬티오, 히드록시, 할로겐, CN, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알콕시아릴, 및 아릴 C(1-4)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴기이고;
R2는 할로겐, C(1-3)알킬, C(1-3)알콕시, 히드록시C(1-3)알킬, C(1-3)알킬티오, C(1-3)알킬술피닐, 아미노C(1-3)알킬, 모노- 또는 디-C(1-3)알킬아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알킬카르보닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알콕시C(1-3)알킬카르보닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알킬술포닐아미노C(1-3)알킬, C(1-3)알킬카르복시, C(1-3)알킬카르복시C(1-3)알킬이고,
R3은 수소, 할로겐, C(1-3)알킬 또는 히드록시C(1-3)알킬이거나; 또는
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리돈 고리 탄소 원자와 함께 융합된 5원 또는 6원 카르보시클릭 고리를 형성하거나; 또는
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리돈 고리 탄소 원자와 함께 할로겐, C(1-4)알킬, 시아노, C(1-3)알콕시C(1-3)알킬, C(1-4)알콕시 또는 C(1-4)알킬티오, 또는 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 융합된 벤조 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R4는 수소, 또는 히드록시, 할로겐, OR7, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10, NR9R10, NR7COR8, 모노- 또는 디 (히드록시C(l 6)알킬)아미노 및 N 히드록시C(1-6)알킬-N C(1-6)알킬아미노로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 비치환되거 나 치환된 C(1-6)알킬이거나; 또는
R4는 Het-C(0-4)알킬이고, 여기서 Het는 N 및 임의로 O 또는 S를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로시클릴 고리이고, N은 히드록시, 할로겐, OR7, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10 또는 NR9R10으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 임의로 치환된 COR7, COOR7, CONR9R10, 또는 C(1-6)알킬에 의해 치환될 수 있고, R4는 예를 들어 피페리딘-4-일, 피롤리딘-3-일이고;
R5는 C(1-6)알킬, C(1-6)알콕시, C(1-6)알킬티오, 아릴C(1-6)알콕시, 히드록시, 할로겐, CN, COR7, 카르복시, COOR7, NR7COR8, CONR9R10, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬 및 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알콕시로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
R6은 C(1-18)알킬, C(1-18)알콕시, C(1-6)알킬티오, C(1-6)알킬술포닐, 아릴C(1-6)알콕시, 히드록시, 할로겐, CN, COR7, 카르복시, COOR7, CONR9R10, NR7COR8, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬 및 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알콕시, 또는 C(5-10)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 추가로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 고 리이고;
R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 C(1-12)알킬, 예를 들어 C(1-4)알킬 (예를 들어 메틸 또는 에틸)이고;
동일하거나 상이할 수 있는 R9 및 R10은 각각 수소, 또는 C(1-12)알킬로부터 선택되거나 또는 R9 및 R10은 이들이 부착되는 질소와 함께, 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고 히드록시, 옥소, C(1-4)알킬, C(1-4)알킬카르복시, 아릴, 예를 들어 페닐, 또는 아르알킬, 예를 들어 벤질, 예를 들어 모르폴린 또는 피페라진으로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환체에 의해 임의로 치환된 5 내지 7원 고리를 형성하고;
X는 C(2-4)알킬렌 (메틸 및 에틸로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 임의로 치환됨), CH=CH, (CH2)nS 또는 (CH2)nO (여기서, n은 1, 2 또는 3임)이다.
R2 및 R3이 이들이 부착되는 피리돈 고리 탄소 원자와 함께 할로겐, C(1-4)알킬, 시아노, C(1-4)알콕시 또는 C(1-4)알킬티오, 또는 모노 내지 퍼플루오로-C(1-4)알킬로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 융합된 벤조 또는 헤테로아릴 고리를 형성하는 화학식 III의 화합물이 특히 중요하다. 바람직하게는, R1은 할로겐, C(1-6)알킬, 트리플루오로메틸, C(1-6)알콕시, 바람직하게는, 1 내지 3개의 플루오로, 보다 바람직하게 는, 2,3-디플루오로에 의해 임의로 치환된 페닐이다. R4의 대표적인 예는 1-위치에서 메틸, 이소프로필, 1-(2-메톡시에틸), 1-(2-히드록시에틸), t-부톡시카르보닐 또는 에톡시카르보닐메틸에 의해 치환된 피페리딘-4-일; 2-위치에서 아미노에틸에 의해 치환된 에틸; 1-에틸피페리디닐메틸; 피페리딘-4-일; 3-디에틸아미노프로필; 4-피롤리딘-1-일부틸 및 1-에틸피롤리딘-3-일을 포함한다. 바람직하게는, R4는 1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일, 1-메틸피페리딘-4-일 또는 1-에틸피롤리딘-3-일이다. R5의 대표적인 예는 페닐 및 피리딜을 포함한다. 바람직하게는, R5는 페닐이다. R6의 대표적인 예는 바람직하게는 4-위치에서 할로겐 또는 트리플루오로메틸에 의해 임의로 치환된 페닐, 및 헥실을 포함한다. 바람직하게는, R6은 4-위치에서 트리플루오로메틸에 의해 치환된 페닐이다. R6의 추가의 대표적인 예는 하나 이상의 C(1-3)알킬에 의해 치환된 페닐을 포함한다. 바람직하게는, R6은 4-위치에서 에틸에 의해 치환된 페닐이다. 바람직하게는, R5 및 R6은, 먼 페닐 고리가 바람직하게는 4-위치에서 할로겐 또는 트리플루오로메틸에 의해 임의로 치환될 수 있는 4-(페닐)페닐 또는 2-(페닐)피리디닐 치환체를 형성한다. 바람직하게는, X는 C(2-4)알킬렌, 보다 바람직하게는 C(2-3)알킬렌, 가장 바람직하게는 (CH2)2, 또는 CH2S이다.
화학식 III을 포함하는 화합물의 군 내에, 기의 정의가 아래와 같은 화합물의 추가의 하위 군이 존재함이 이해될 것이다:
R1은 2,3-디플루오로에 의해 치환된 페닐이고;
R2 및 R3은 이들이 부착되는 피리돈 고리 탄소 원자와 함께 융합된 벤조 또는 피리도 고리를 형성하고;
R4는 1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일이고;
R5 및 R6은, 먼 페닐 고리가 바람직하게는 4-위치에서 트리플루오로메틸에 의해 치환된 4-(페닐)페닐 치환체를 함께 형성하고;
X는 CH2S 또는 (CH2)2이다.
하기 화학식 III의 화합물이 관심의 대상이다:
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-에틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-7H-티아졸로[4,5-b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
(±)-N-(1-에틸피롤리딘-3-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타 르트레이트;
(±)-N-(1-에틸피롤리딘-3-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 디히드로클로라이드;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 모노 파라톨루엔술포네이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 모노히드로클로라이드;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4- 옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 디히드로클로라이드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(4-플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(4-플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(4-플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(3,4-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2-플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(3-클로로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일)]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일)]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-피롤리딘-1-일에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-피페리딘-1-일에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-7-플루오로-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-5-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-7H-티에노[3,2-b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-5,6-디메틸-4-옥소-4H-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-5-에틸-4-옥소-4H-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-티에노[3,4-b]피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이 트;
N-(2-피롤리딘-1-일에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[6-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-4-옥소-4H-피라졸로[3,4-b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일메틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(3-디에틸아미노프로필)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(4-피롤리딘-1-일부틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(3-디에틸아미노프로필)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴 놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(4-피롤리딘-1-일부틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[5-(2,3-디플루오로벤질티오)-7-옥소-7H-티에노-[3,2-b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-7H-티아졸로[4,5-b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-에틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-에틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-이소프로필바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-이소프로필바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나 프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에톡시카르보닐메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(3',4'-디메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(t-부톡시카르보닐)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(3',4'-디플루오로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[6-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-티에노-[2,3b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3,4-트리플루오로페닐에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[6-(2,3-디플루오로벤질티오)-2-메틸-4-옥소-2,4-디히드로피라졸로[3,4b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[6-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-에틸-4-옥소-2,4-디히드로피라졸로[3,4b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[6-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-이소프로필-4-옥소-2,4-디히드로피라졸로[3,4b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-에틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-7H-티아졸로[4,5-b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일-메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-7H-티아졸로[4,5-b]-피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-7-옥소-2,7-디히드로피라졸로[4,3b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[5-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-1-메틸-7-옥소-1,7-디히드로피라졸로[4,3b]피리딘-4-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-7-메틸-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-7-메틸-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-7-메틸-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-7-메틸-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아 세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-7-메틸-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-테트라메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린- 1-일]-N-(4'- 클로로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-클로로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-클로로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-클로로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-이소프로필피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-클로로바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[6-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-메틸-4-옥소-4H-피라졸로-[3,4-b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(1-(t-부톡시카르보닐)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(1-에틸피페리딘-4-일)-2-[6-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-2-(2-메톡시에틸)-4-옥소-4H-피라졸로[3,4-b]피리딘-7-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[4-옥소-2-(2-(2,3,4-트리플루오로페닐)에틸)-4H- 퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,4-디플루오로-페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일-메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(3-플루오로-페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-5,6-트리메틸렌-피리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트;
N-(피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-[1,8]나프티리딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 트리플루오로 아세테이트;
N-(2-에틸아미노에틸)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(2-에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드;
N-(1-(2-히드록시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로-메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드 바이타르트레이트; 또는 그의 유리 염기, 또는 다른 제약상 허용되는 염.
화학식 IV
또한, 하기 화학식 IV의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염도 관심의 대상이다.
Figure 112009076184414-PCT00004
여기서,
R1은 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 알킬티오, 아릴 C1-C6 알콕시, 히드 록시, 할로, CN, COR6, COOR6, NR6COR7, CONR8R9, SO2NR8R9, NR6SO2R7, NR8R9, 할로 C1-C4 알킬, 및 할로 C1-C4 알콕시로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 비치환되거나 치환된 아릴기이고;
W는 CH이고 X는 N이거나, 또는 W는 N이고 X는 CH이거나, W와 X 둘 모두가 CH이거나, 또는 W와 X는 N이고;
Y는 C2-C4알킬이고,
R2는 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 알킬티오, 아릴 C1-C6 알콕시, 히드록시, 할로, CN, COR6, 카르복시, COOR6, NR6COR7, CONR8R9, SO2NR8R9, NR6SO2R7, NR8R9, 모노 내지 퍼플루오로-C1-C6 알킬 또는 모노 내지 퍼플루오로-C1-C6 알콕시이고;
n은 0-5이고;
R3은 C1-C4 알킬이고;
R4는 C1-C4 알킬이고;
R5는 수소, C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 할로 C1-C4 알킬, C3-C8 시클로알킬, C3-C8 시클로알킬, C3-C8 시클로알킬 C1-C4 알킬, C5-C8시클로알케닐, C5-C8 시클로알케닐 C1-C4 알킬, 3-8원 헤테로시클로알킬, 3-8원 헤테로시클로알킬 C1-C4 알킬, C6-C14 아릴, C6-C14 아릴 C1-C10 알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 C1-C10 알킬이고; 여기서 각각의 기는 C1-C6 알콕시, C1-C6 알킬티오, 아릴 C1-C6 알콕시, 히드록시, 할로, CN, NR8R9, 또는 할로 C1-C4 알콕시의 동일한 및/또는 상이한 기에 의해 1회 이상 임의로 치환되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소 또는 C1-C10 알킬이고;
R8 및 R9는 동일하거나 상이하고, 수소 또는 C1-C10 알킬이거나 또는 R9 및 R10은 이들이 부착되는 질소와 함께 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고 히드록시, 옥소, C1-C4 알킬, C1-C4 알킬카르복시, 아릴, 및 아릴 C1-C4 알킬로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1 또는 2개의 치환체에 의해 임의로 치환된 5 내지 7원 고리를 형성한다.
임의의 규정된 치환체 및/또는 그의 제시된 라디칼을 화학식 IV의 범위로부터 배제하지는 않지만, 다음 R 기 및 관련 라디칼이 특히 중요하다:
R1에서, 이는 할로, C1-C6 알킬, 트리플루오로메틸 또는 C1-C6 알콕시로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 치환체에 의해 임의로 치환된 페닐기일 수 있다. 보다 구체적으로, 페닐은 1, 2, 3 또는 4개의 할로겐 치환체, 특히, 1 내지 3개의 플루오로기, 가장 특히, 2,3-디플루오로, 2,4-디플루오로 또는 4-플루오로에 의해 비치환되거나 또는 치환된다.
화학식 I의 추가의 실시태양에서 Y는 -CH2CH2-이다.
본 발명은 또한 R2가 수소이거나, 또는 할로, C1-C6 알킬, 모노 내지 퍼플루오로-C1-C4 알킬, 모노 내지 퍼플루오로 C1-C46 알콕시, 또는 C1-C6 알콕시; 특히 모노 내지 퍼플루오로-C1-C4 알킬, 모노 내지 퍼플루오로-C1-C4 알콕시, 또는 C1-C6 알콕시인 화학식 I의 화합물을 제공한다. R2가 수소 이외의 다른 기이고, (R2)n에서 n이 1, 2, 또는 3이고, 치환 패턴이 메타 및/또는 파라, 특히 파라인, 즉 4-위치 치환체인 화합물이 특히 중요하다. 예시적인 화합물은 R2가 4-트리플루오로메틸 또는 4-트리플루오로메톡시인 화합물을 포함한다.
R3 및 R4는 동일하거나 상이하고, 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 n-부틸이다. R3 및 R4가 동일하고, 메틸, 또는 에틸; 특히 메틸인 화학식 I의 화합물이 특히 중요하다.
R5는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C(1-6) 알킬일 수 있다. 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, t-부틸, n-펜틸 또는 n-헥실이 특히 중요하다.
본원에서 상기 설명한 임의의 화합물은 결정 또는 비결정 형태로 제조될 수 있고, 결정일 경우, 예를 들어 수화물로서 용매화될 수 있다. 본 발명은 그의 범위 내에 화학양론적 (stoichiometric) 용매화물 (예를 들어 수화물)을 포함한다.
본원에 기재된 특정 화합물은 하나 이상의 키랄 (chiral) 원자를 함유할 수 있거나, 또는 2개의 에난티오머로서 존재할 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 유 용한 화합물은 에난티오머의 혼합물 및 정제된 에난티오머 또는 에난티오머 농축 혼합물을 포함한다. 또한, 화학식 I - IV로 표시되는 화합물의 개별적인 이성질체, 및 그의 완전히 또는 부분적으로 평형화된 임의의 혼합물이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 본 발명은 특허 청구된 화합물의 개별적인 이성질체를, 하나 이상의 키랄 중심이 역전된 그의 이성질체와의 혼합물로서 포함한다. 또한, 특허 청구되는 화합물의 임의의 호변체 및 호변체의 혼합물이 화합식 I - IV의 화합물의 범위 내에 포함됨이 이해된다. 상이한 이성질체 형태는 종래의 방법에 의해 다른 이성질체 형태로부터 분리 또는 분할될 수 있거나, 또는 임의의 제시된 이성질체는 종래의 합성 방법에 의해 또는 입체특이적 또는 비대칭적인 합성에 의해 얻을 수 있다.
화학식 I, II , III 및 IV 의 화합물의 합성
화학식 I, II 및 III의 화합물의 제조 방법은 특허 문헌에 공개되어 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물의 제조 방법은 WO 01/60805 및 WO03/016287에서 볼 수 있다. 화학식 II의 화합물의 제조 방법은 WO 02/30911에 제시되어 있다. 화학식 III의 화합물의 제조 방법은 WO 02/30904에서 볼 수 있다. 본원은 본원에 참고로 포함된 미국 가출원 60/829,328 및 60/829,327로부터 모방한 방법인, 화학식 IV의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
합성의 몇몇 예를 아래에 제시한다. 본원의 실시예에서 몇몇의 화합물의 일반적인 군을 구별하기 위해서, 화학식 I에 관련된 물질은 "합성 방법 (I)-I의 예"로, 화학식 II에 관련된 물질은 "합성 방법 (II)-1의 예"로, 화학식 III에 관련된 물질은 "합성 방법 (III)-1의 예"로, 화학식 IV에 관련된 물질은 "합성 방법 (IV)-1의 예"로 표시될 것이다.
화학식 I의 합성
화학식 I의 화합물은 WO 01/60805에 개시되어 있는 반응식 I에 의해 제조할 수 있다.
<반응식 I>
Figure 112009076184414-PCT00005
여기서,
L3은 C(1-6)알킬기, 예를 들어 메틸이고;
R15는 C(1-6)알킬기, 예를 들어 에틸 또는 t-부틸이고,
L1, L2, Ra, Rb, Rc, R2, R3, R4, R5, n, X, Y 및 Z는 WO 01/60805에서 규정된 바와 같다.
관심 있는 화학식 I의 화합물의 제조를 위한 예시적인 반응은 다음과 같다:
합성 방법 (I)-1(a)의 예
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐-메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온
Figure 112009076184414-PCT00006
WO 01/60805의 중간체 B69 (87.1 g, 0.26 mol.)를 디클로로메탄 (2.9 리터)에 현탁시켰다. 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (35.2 g, 0.26 mol.) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (99.7 g, 0.52 mol.)를 첨가하고, 현탁액을 45분 동안 교반하여 완전한 용액을 얻었다. WO 01/60805의 중간체 A30 (91.2 g, 0.26 mol.)을 디클로로메탄 (100 ml) 중의 용액으로서 5분에 걸쳐 첨가하고, 용액을 4시간 동안 교반하였다. 포화 염화암모늄 용액:물 혼합물 (1:1, 1리터)을 첨가하고, 용액을 10분 동안 교반하였다. 유기상을 포화 암모늄 클로라이드:물 혼합물 (1:1, 1리터)로 분리 및 추출하였고, 추출물의 pH는 6이었다. 유기상을 아세트산 (10 ml)을 함유하는 물 (1리터)로 분리 및 추출하였고, 추출물의 pH는 5이었다. 디클로로메탄층을 포화 탄산나트륨 용액:물:포화 염수 혼합물 (1:3:0.2, 1리터)로, 이어서 포화 염수:물 혼합물 (1:1, 1리터) 분리 및 추출하 였다 (pH 10.5). 갈색 용액을 탈색 목탄 (35 g)의 존재 하에 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 제거하여 암갈색 발포체를 얻었다. 발포체를 이소-프로필 아세테이트 (100 ml)에 용해시키고, 용매를 진공 제거하였다. 암갈색의 점착성 잔사를 끓고 있는 이소-프로필 아세테이트 (500 ml)에 용해시키고, 실온으로 냉각시킨 후, 씨딩하고 밤새 교반하였다. 생산된 담황색 고체를 여과하고, 이소-프로필 아세테이트 (100 ml)로 세척하였다. 고체를 소결기에서 1시간 동안 흡인 여과한 후, 이소-프로필 아세테이트 (400 ml)로부터 재결정화시켰다. 밤새 교반한 후, 형성된 고체를 여과하고, 이소-프로필 아세테이트 (80 ml)로 세척하고, 진공 건조시켜 표제 화합물 (110 g, 63.5％)을 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 약 1.9:1 회전이성질체 혼합물) δ0.99 (6H, t), 2.10 (2H, m), 2.50 (4H, q), 2.58/2.62 (2H, 2 x t), 2.70/2.82 (2H, 2 x t), 2.86 (2H, t), 3.28/3.58 (2H, 2 x t), 4.45/4.52 (2H, 2 x s), 4.68/4.70 (2H, 2 x s), 4.93 (2H, s), 6.95 (2H, m), 7.31 (2H, d), 7.31/7.37 (2H, 2 x m), 7.48/7.52 (2H, d), 7.65 (2H, m), 7.72 (2H, m); MS (APCI)(M+H)+ 667; mp 125℃ (DSC - 비대칭 흡열에 의함).
합성 방법 (I)-1(b)의 예
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐-메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 바이타르트레이트
WO 01/60805의 실시예 1의 방법에 의해 WO 01/60805의 중간체 A30 및 B69로 부터 제조하였다. 1H-NMR (d6-DMSO, 약 1:1 회전이성질체 혼합물) 0.92/0.99 (6H,2x t), 1.99 (2H,m), 2.54 (6H,m), 2.68/2.74 (4H,m), 3.36 (2H,m), 4.21 (2H,s), 4.37/4.44 (2H,2x s), 4.63/4.74 (2H,2x s), 4.89/5.13 (2H,2x s), 7.08/7.14 (2H,2x m), 7.36-7.50 (4H, m), 7.64/7.70 (2H,2x d), 7.83 (4H,m); MS (APCI+) 실측치 (M+1) = 667; C36H38F4N4O2S는 666을 필요로 한다.
합성 방법 (I)-1(c)의 예
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐-메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 히드로클로라이드
예 (I)-1(a)로부터의 유리 염기 (3.00 g, 0.0045 mol)를 교반하면서 이소프로판올 (30 ml) 중에 현탁시키고, 45℃로 가온하여 투명한 용액을 얻었다. 이어서, 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 진한 염산 (0.40 ml, 0.045 mol)을 첨가하였다. 이어서, 생성되는 슬러리를 주위 온도에서 35분 동안 교반한 후, 35분 동안 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 슬러리를 여과하고, 이소프로판올 (10 ml), 이어서 헵탄 (30 ml)으로 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (3.00 g, 95％)로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3) δ1.38 (6H, t), 2.08 (2H, m), 2.82 (2H, t), 2.99 (2H, t), 3.19 (4H, m), 3.35 (2H, m), 3.97 (2H, s), 4.42 (2H, s), 4.81 (2H, s), 4.99 (2H, s), 6.87 (2H, t), 7.26 (2H, t), 7.33 (2H, d), 7.41 (2H, d), 7.53 (2H, d), 7.71 (2H, d), 11.91 (1H, s).
화학식 II 의 합성
화학식 II의 화합물의 제조 방법 및 상기 화합물의 중간체 및 최종 생성물의 예에 대한 설명은 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 02/30911에서 볼 수 있다. 본 발명에 유용한 화합물의 제조를 위한 최종 단계의 방법은 예 (II)-1이다.
합성 방법 ( II )-1의 예
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)아세트아미드 바이타르트레이트
Figure 112009076184414-PCT00007
디클로로메탄 (10 ml) 중의 N,N-디에틸-N'-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)-에탄-1,2-디아민 (WO 02/30911의 Int D4) (0.50 g, 1.44 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 (0.56 g, 1.45 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (0.12 g) 및 2-(2-[2-(2,3-디플루오로페닐)-에틸]-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일)-아세트산 (WO 02/30911의 Int C1) (0.48 g, 1.44 mmol)의 용액을 주위 온도에서 밤새 교반한 후, 디클로로메탄 (30 ml)으로 희석하고, 수성 중탄산나트륨으로 증발시켰다. 잔사를 크로마토그래피 (10 g 실리 카 카트리지, 에틸 아세테이트-아세톤)로 정제하여 표제 화합물을 황색 발포체 (유리 염기) (0.50 g, 52％)로 수득하였다. 1H-NMR (DMSO, 회전이성질체 혼합물) δ0.83-0.89 (6H, m), 1.98 (2H, m), 2.40 (4H, m), 2.45-2.82 (10H, m), 3.02 (2H, m), 4.64/4.75 (2H,2x s), 4.96/5.19 (2H,2x s), 7.11-7.40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4H, m); MS (APCI+) 실측치 (M+1) = 667; C37H39F5N4O2는 666을 필요로 한다.
d-타르타르산 (0.09 g, 0.60 mmol)을 교반하면서 메탄올 (10 ml) 중의 유리 염기 (0.40 g, 0.60 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성되는 용액을 증발시켜 염 (0.49 g)을 수득하였다. 1H-NMR (DMSO, 회전이성질체 혼합물) δ0.85-0.97 (6H, m), 1.91-2.00 (2H, m), 2.40-2.49 (4H, m), 2.54-2.82 (10H, m), 3.02-3.46 (2H, m), 4.20 (2H, s), 4.64/4.75 (2H, 2x s), 4.97/5.18 (2H, 2x s), 7.11-7.40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4H, m); MS (APCI+) 실측치 (M+1) = 667; C37H39F5N4O2는 666을 필요로 한다.
상기 과정, 또는 별법으로 WO 02/30911에 기재된 다른 과정 후에, 화학식 II의 구조를 갖는 다른 화합물을 제조할 수 있다.
화학식 III 의 합성
화학식 III의 화합물의 전체적인 합성은 WO02/30904에 제시된 하기 반응식 III에 예시된다:
<반응식 III>
Figure 112009076184414-PCT00008
상기 반응식을 참고로 하면, 에스테르 (IV)는 대체로 염기, 예를 들어 THF 중의 BuLi 또는 N-메틸 피롤리디논 (NMP) 중의 수소화나트륨의 존재 하에 R11이 본원에서 규정된 바와 같은 화합물 (VI), 예를 들어 t-부틸 브로모아세테이트 또는 에틸 브로모아세테이트를 사용한 화합물 (V)의 N-1 알킬화에 의해 제조된다 (단계 c).
X가 CH2S일 때, 핵심 중간체 (IV)는 화합물 (XX)을 트리메틸술폭소늄 요오다이드를 저온에서 수소화나트륨으로 처리하여 생성된 디메틸옥소술포늄 메틸리드와 반응시켜 황 일리드 (XXII)를 생성시킴으로써 합성될 수 있다 (단계 q). 화합물 (XXII)를 디이소프로필아민의 존재 하에 이황화탄소로, 이어서 R1CH2-L4 (여기서, L4는 이탈기임)로 후속 처리하여 중간체 (IV)를 수득한다 (단계 r).
별법으로, X가 CH2S일 때, R1X 치환체가 피리딘 (VIII) 또는 피리딘 N-옥사이드 (XIV) 상의 이탈기 L2 (예를 들어 Cl)의 치환 (단계 e)에 의해 도입되어 2-치환된 피리딘 (VII) 및 (XV)를 생성시킬 수 있다. 화합물 (VII) 또는 (XV)의 4-피리돈 (V)으로의 변형은 4-산소의 탈보호 (예를 들어 R12가 알릴일 때 수성 에탄올 중의 (Ph3P)3RhCl을 사용하여) (단계 d), 이어서 화합물 (XVI)에 대해 아세트산 중의 Pd/C의 존재 하에 수소를 사용한 N-옥사이드 치환체의 제거 (단계 k)에 의해 수행된다. 피리딘 (VIII) 또는 피리딘 N-옥사이드 (XIV)는 하기 단계 (i), (h), (g), (f), 및 (j)에 의해 제조될 수 있다:
(j) 화합물 (VIII)를 디클로로메탄 중 m-클로로퍼벤조산으로 처리;
(f) 화합물 (IX)의 R12OH (X) (여기서, R12는 알릴임), 및 DMF 중 수소화나트륨으로 처리;
(g) 화합물 (XI)의 인 옥시클로라이드로 처리;
(h) 가열하면서 화합물 (XII)의 수성 HCl로 처리;
(i) 화합물 (XIII)의 알콜 (여기서, R13은 C(1-6)알킬이고, 일반적으로 R13 = Et) 중 디-저급 알킬 말로네이트 및 나트륨 알콕사이드로 처리;
R1-CH2SH (XIX)는 일반적으로 대응하는 알킬 브로마이드 R1-CH2Br로부터 형성된 티오아세테이트로부터 제조된다.
별법으로, X가 CH2S이고, R2 및 R3이 이들이 부착되는 피리돈 고리 탄소 원자와 함께 융합된 벤조 고리를 형성할 때, 중간체 (IV)는 공지의 출발 물질로부터 하기 단계 (s), (c) 및 (v)에 의해 합성될 수 있다:
(s) 멜드럼 (Meldrum) 산 (XXIII)을 저온의 수소화나트륨으로 처리, 이어서 페닐이소티오시아네이트와 반응시키고, R1CH2-L4로 처리;
(c) 상기 논의된 바와 같음;
(v) 화합물 (XXV)를 트리플루오로아세트산으로 처리.
X가 알킬렌일 때, 단계 (m) 및 (h) (중간체 (XVII), (XVIII)) 또는 단계 (n) 및 (p) (중간체 (XIX), (XX), (XXI))를 사용하는 것이 바람직하다:
(h) 예를 들어 화합물 (XVII) R14=Cl을 수성 HCl 및 디옥산으로 처리하거나, 또는 예를 들어 단계 (d)의 조건을 사용하여 R14 = OR12를 탈보호시킴으로서 4-치환된 피리딘의 4-피리돈으로 변형.
(m) THF 중 R1-Y-CH2-L4 (XVI) (여기서, L4는 이탈기임) 및 강염기, 예를 들어 BuLi로 2-메틸피리딘 (XVIII)을 처리하여, 예를 들어 X = YCH2CH2인 2-알킬 피리딘의 사슬을 연장.
다른 경로에서, 3-에스테르기는 디페닐 에테르 (R15 = tBu) 중에서 가열함으로써 중간체 (XIX) (R15 = C(1-6)알킬)로부터 제거된다 (단계 n); 중간체 (XIX)는 DMF 중의 염기, 예를 들어 NaH 또는 디클로로메탄 중의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운덱-7-엔을 사용한 처리에 의해 2,6-디옥소-1,3-옥사진 (XX) 및 에스테르 (XXI)로부터 형성된다.
공지의 출발 물질로부터 화합물 (XX)의 합성은 단계 (w) 및 (c) 또는 단계 (y) 및 (c)를 통해 달성될 수 있다:
(w) 화합물 (XXVII)를 THF 중 아지도트리메틸실란으로 처리;
(y) 화합물 (XXVI)를 포스겐으로 처리;
(c) 상기 설명한 바와 같음.
화학식 III의 화합물의 제조 방법에 대한 추가의 상세한 설명 및 해설에 대해서는 본원에 참고로 포함된 WO02/30904를 참고한다.
합성 방법 ( III )-1의 예
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)아세트아미드
Figure 112009076184414-PCT00009
유리 염기는 용매로서 디클로로메탄 대신에 DMF를 사용하는 것을 제외하고는 WO02/30904의 실시예 1의 방법에 의해 Int. E1 및 Int. A42로부터 제조하였다. 1.97 g의 상기 물질을 n-부틸 아세테이트 (10 ml)로부터 결정화시켜 표제 화합물 (1.35 g)을 수득하였다. 1H-NMR (CD3OD) δ1.7-2.05 (4H, m), 2.05-2.3 (2H, 2xt), 2.5-2.65 (2H, m), 2.95-3.1 (2H, m), 3.3 (3H, s), 3.45-3.55 (2H, m), 3.9-4.05 + 4.4-4.5 (1H, 2xm), 4.37 + 4.48 (2H, 2xs), 4.71 + 4.87 (2H, 2xbr s), 5.31 + 5.68 (2H, 2xs), 6.44 + 6.52 (1H, 2xs), 6.95-7.3 (3H, m), 7.35-7.85 (11H, m), 8.2-8.35 (1H, m); MS (APCI+) 실측치 (M+1) = 736; C40H38F5N3O3S는 735를 필요로 한다.
화학식 IV 의 합성
하기 흐름도는 본 발명의 화합물의 제조 방법을 보여준다.
Figure 112009076184414-PCT00010
또한, 상기 흐름도에 제시된 몇몇 중간체의 제조에 유용할 수 있는 화학물질에 대해서는 PCT 출원 공개 WO 03/016287을 참조하다. 상기 화학물질은 상기 제조에 유용한 정도로, 마치 본원에 전부가 제시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 또한, PCT 출원 공개 WO01/60805, WO02/30911, WO02/30904, WO03/042218, WO03/042206, WO03/041712, WO03/086400 및 WO03/87088, 및 상기 언급한 동시 계류중인 미국 특허 가출원 60/829,328 및 60/829,327 (둘 모두 2006년 10월 13일에 출원됨)에 제시된 합성을 참조한다. 상기 경로에 제시된 것과는 다른 중간체, 시약, 용매, 시간, 온도 등을 사용하여 화학식 IV의 화합물을 제조하고자 할 경우에는, 상기 PCT 출원 공개 및 동시 계류중인 US 출원에서 유용한 정보를 얻을 수 있다. 이들 출원에 제시된 화학물질은 해당 화합물의 제조에 관련되는 정도로 본원에 참 고로 포함된다.
중간체 ( IV )-A1 {[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아민
Figure 112009076184414-PCT00011
상기 화합물의 제조는 WO 02/30911에 중간체 D7로서 설명되었다.
중간체 ( IV )-A2 ({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아민 히드로클로라이드
Figure 112009076184414-PCT00012
에탄올 (2000 ml) 및 진한 염산 (100 ml) 중의 4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐카르보니트릴 (WO 02/30911의 중간체 D6인 4'-트리플루오로메틸 유사체에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 {4-[(트리플루오로메틸)옥시]페닐}보론산으로부터 제조됨) (66.6 g)의 용액을 환원이 완료될 때까지 25 psi에서 펄먼 (Pearlman) 촉매 (10 g)로 수소화시켰다. 촉매를 셀라이트를 통한 여과에 의해 제거한 후, 용매를 진공 제거하여 요구되는 생성물을 수득하였다.
LCMS Rt = 2.212분; m/z [M+H]+ = 251.0
화학식 IV 의 제조를 위한 중간체
중간체 ( IV )-A3
메틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00013
메틸 2-브로모-2-메틸프로파노에이트 (80.87 ml, 5 당량), 4-피페리돈 히드로클로라이드 일수화물 (19.6 g, 1 당량), 아세토니트릴 (200 ml) 및 탄산칼륨 (69.1 g, 4 당량)의 혼합물을 기계적으로 교반하면서 17.5h 동안 질소 하에 환류로 가열한 후, 빙조에서 냉각시키고, 디에틸 에테르 (100 ml)를 첨가하였다. 셀라이트를 통한 여과, 플래시 크로마토그래피 (실리카, 헥산 중의 10-50％ 에틸 아세테이트) 및 생성물 분획의 증발을 통해 요구되는 생성물을 황색 오일 (14.28 g)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ1.41 (6H,s), 2.47 (4H,m), 2.88 (4H,m), 3.73 (3H,s).
중간체 ( IV )-A4
에틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00014
에틸 2-브로모-2-메틸프로파노에이트 (48.3 ml, 5 당량), 4-피페리돈 히드로클로라이드 일수화물 (100 g, 1 당량), 아세토니트릴 (1216 ml) 및 탄산칼륨 (353 g, 4 당량)의 혼합물을 기계적으로 교반하면서 2Oh 동안 질소 하에 환류로 가열한 후, 빙조에서 냉각시키고, 디에틸 에테르 (약 1400 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 진공 증발시킨 후, 과량의 브로모에스테르를 증류하였다 (50℃ 증류기 헤드 온도/10 Torr). 생성물 분획의 플래시 크로마토그래피 (실리카, 헥산 중의 5-30％ 에틸 아세테이트) 및 증발을 통해 조질 생성물을 황색 오일로서 수득하였다. 일부의 잔류 브로모에스테르 오염물질을 제거하기 위해서, 생 성물을 에틸 아세테이트와 2M 수성 염산 사이에 분배하였다. 유기층을 버리고, 수성층을 탄산나트륨으로 염기성화시키고, 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물의 건조 및 증발을 통해 요구되는 생성물을 황색 오일 (54.7 g)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ1.27 (3H,t), 1.40 (6H,s), 2.47 (4H,m), 2.90 (4H,m), 4.20 (2H,q).
중간체 ( IV )-A5
1,1-디메틸에틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00015
1,1-디메틸에틸 2-브로모-2-메틸프로파노에이트 (8.0 g, 1.1 당량), 4-피페리돈 히드로클로라이드 (5.0 g, 1 당량), 아세톤 (50 ml) 및 탄산칼륨 (13.0 g, 3 당량)의 혼합물을 교반하면서 24h 동안 환류로 가열한 후, 여과하고, 여액을 증발시켰다. 조질 잔사를 정제하지 않은 채로 다음 단계에 사용하였다.
ES+MS m/z [M+H-tBu]+=186.1
중간체 ( IV )-B1
메틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00016
메틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트 (Int. A3) (14.28 g, 1 당량), {[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아민 (Int. A1) (19.6 g, 0.85 당량), DCE (300 ml), 아세트산 (3.8 ml, 0.90 당량) 및 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (20.7 g, 1.25 당량)의 혼합물을 17.5h 동안 질소 하에 실온에서 교반하였다. 수성 탄산나트륨 (2M 용액, 과량)을 첨가하고, 4h 동안 교반한 후, 혼합물을 디에틸 에테르 및 THF의 혼합물로 추출하였다. 유기 추출물을 물 및 염수의 역류로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, DCM 중의 2.5％ 메탄올로 세정한 실리카겔의 패드를 통해 여과하였다. 진공 증발시킨 후, 조질 생성물을 에테르/헥산으로부터 결정화시키고, 마지막으로 빙조 온도에서 건조시킨 후 백색 고체 (20.9 g)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.070분; m/z [M+H]+ = 435.2
1H NMR (d6-DMSO) δ1.15-1.32 (8H, m), 1.75-1.87(2H,m), 1.97-2.12 (2H,m), 2.27-2.40 (1H, m), 2.77-2.90 (2H,m), 3.60 (3H,s), 3.76 (2H,s), 7.46 (2H, d, J=8.03Hz), 7.67 (2H, d, J=8.28Hz), 7.80 (2H, d, J=8.53Hz), 7.88 (2H, d, 8.03Hz)
중간체 ( IV )-B2
에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00017
에틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트 (Int. A4) (25.6 g, 1.2 당량), {[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아민 (Int. A1) (31.1 g, 1.0 당량), DCE (400 ml) 및 아세트산 (6.3 ml, 1.1 당량)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하였다. 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (33.5 g, 1.5 당량)를 첨가하고, 19시간 동안 계속 교반하였다. 수성 탄산나트륨 (2M 용액, 과량)을 첨가하고, 1.5h 동안 교반한 후, 혼합물을 디에틸 에테르 및 THF의 혼합물로 추출하였다. 유기 추출물은 물 및 염수의 역류로 세척하고, 실리카겔의 패드를 통해 여과하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 진공 증발시켰다. 요구되는 생성물을 백색 고체 (44.2 g)로서 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않은 상태로 사용하였다.
LCMS Rt = 2.194분; m/z [M+H]+ = 449.3
1H NMR (d6-DMSO) δ1.06-1.32 (11H,m), 1.74-1.89 (2H,m), 1.99-2.14 (2H, m), 2.25-2.39 (1H, m), 2.69-2.89 (2H, m), 3.75 (2H, s), 4.01-4.12 (2H, m), 7.45 (2H, d, J=7.55 Hz), 7.67 (2H, d, J=7.81 Hz), 7.79 (2H, d, J=8.06 Hz), 7.88 (2H, d, J=8.06Hz)
중간체 ( IV )-B3
에틸 2-메틸-2-{4-[({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00018
에틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트 (Int. A4) (1.09 g, 1.2 당량), ({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아민 히드로클로라이드 (Int. A2) (1.28 g, 1.0 당량), DCE (21 ml) 및 아세트산 (0.27 ml, 1.1 당량)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 교반하였다. 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (1.42 g, 1.5 당량)를 첨가하고, 3시간 동안 계속 교반하였다. 수성 탄산나트륨 (2M 용액, 과량)을 첨가하고, 45min 동안 교반한 후, 혼합물을 디에틸 에테르/THF 및 물의 혼합물로 분배하였다. 유기 추출물은 물 및 염수의 역류로 세척하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 진공 증발시켰다. 요구되는 생성물을 담황색 고체 (2.14 g)로서 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않은 상태로 사용하였다.
LCMS Rt = 2.244분; m/z [M+H]+ = 465.3
중간체 ( IV )-B4
1,1-디메틸에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸} 아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00019
1,1-디메틸 에틸 2-메틸-2-(4-옥소-1-피페리디닐)프로파노에이트 (Int. A6) (370 mg, 1.2 당량), {[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아민 (Int. A1) (397 mg, 1 당량), 나트륨 트리아세톡시보로히드라이드 (400 mg, 1.5 당량), DCM (10 ml) 및 아세트산 (0.076 ml, 1 당량)의 혼합물을 합하고, 아민 출발 물질이 사라진 것을 LCMS로 확인할 때까지 실온에서 교반하였다 (약 18시간). 수성 탄산나트륨을 첨가한 후, DCM으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축하여 고체 (420 mg)를 수득하고, 이를 추가로 정제하지 않은 상태로 사용하였다.
LCMS Rt = 2.24분; m/z [M+H]+ = 477.3
중간체 ( IV )- C1
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산
Figure 112009076184414-PCT00020
상기 화합물의 제조는 중간체 C43으로서 WO 02/30911에 기재되어 있다.
중간체 ( IV )- C2
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세트산
Figure 112009076184414-PCT00021
상기 화합물의 제조는 중간체 E21로서 WO 02/30904에 기재되어 있다.
중간체 ( IV )- C3
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산
Figure 112009076184414-PCT00022
상기 화합물의 제조는 중간체 C45로서 WO 02/30911에 기재되어 있다.
중간체 ( IV )- C4
에틸 [2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1 (4H)-일]아세테이트
Figure 112009076184414-PCT00023
에틸 (2,4-디옥소-3,4-디히드로피리도[2,3-d]피리미딘-1(2H)-일)아세테이트 (WO02/30911, 중간체 B52) (40.8 g, 1.2 당량) 및 3-(2,4-디플루오로페닐)프로판이미다미드 (WO 02/30911의 중간체 A1 내지 A3인 2,3-디플루오로 이성질체에 대해 설명된 바와 유사한 방법으로 제조됨) (30.0 g, 1 당량)의 혼합물을 150℃ 오일조에서 25 min 동안 융합시킨 후, 수조에서 신속하게 실온으로 냉각시켰다. 크로마토그래피 (실리카, 조질 생성물을 DCM에 로딩하고 헥산 중의 50-100％ 에틸 아세테이트로 용출함)에 의해 요구되는 생성물 (43.56 g)을 수득하였다.
LCMS Rt = 2.521분; m/z [M+H]+ = 374.1
1H NMR (CDCl3) δ 1.31 (3H, t), 3.13 (2H, m), 3.26 (2H, m), 4.28 (2H, q), 5.27 (2H, s), 6.82 (2H, m), 7.34 (1H, m), 7.50 (1H, m), 8.65 (1H, m), 8.74 (1H, m).
중간체 ( IV )- C5
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산
Figure 112009076184414-PCT00024
상기 화합물의 제조는 중간체 C35로서 WO 02/30911에 기재되어 있다.
중간체 ( IV )- C6
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산
Figure 112009076184414-PCT00025
에틸 [2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세테이트 (Int. C1) (32.76 g, 1 당량)를 에탄올 (350 ml) 및 물 (70 ml)에 용해시키고, 얼음으로 냉각시킨 후, 수성 수산화리튬 (2M 용액, 43.42 ml, 0.99 당량)을 첨가하였다. 실온에서 2h 동안 계속 교반하였다. 용액을 진공 농축하고, 잔사를 물 (700 ml) 및 포화 수성 중탄산나트륨 (50 ml) 중에 재용해시킨 후, 에틸 아세테이트 (200 ml)로 세척하였다. 수성층을 2M 염산으로 pH 2로 산성화시키고, 침전물을 여과하고, 빙수 (50 ml)로 세척한 후, 진공 건조시켜 (50℃, 16h) 요구되는 생성물 (23.2 g)을 수득하였다.
1H NMR (d6-DMSO) δ 2.4-2.6 (4H, m), 5.24 (2H, s), 7.04 (1H, m), 7.22 (1H, m), 7.48 (1H, m), 7.60 (1H, m), 8.47 (1H, m), 8.84 (1H, m).
( IV )-1의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00026
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C1) (100 mg, 1 당량), 메틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B1) (130 mg, 1.03 당량), DIPEA (0.1 ml, 3.6 당량), 아세토니트릴 (2 ml) 및 HATU (130 mg, 1.4 당량)의 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반한 후, 증발시키고, 아세토니트릴에 재용해시켰다. 역상 HPLC에 의한 정제 (예비 방법 A)를 통해 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (128 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.686분; m/z [M+H]+ = 761.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.33 (3H, s), 1.36 (3H, s), 1.83-2.02 (4H, m), 2.36-2.48 (2H, m), 2.87-2.91 (1H, m), 3.06-3.09 (2H, m), 3.16-3.20 (2H, m), 3.26-3.29 (1H, m), 3.71-3.73 (3H, m), 4.02/4.51 (1H, 2x br m), 4.74 (1H, s), 4.92 (1H, s), 5.12 (1H, s), 5.56 (1H, s), 7.00-7.19 (3H, m), 7.32-7.37 (1H, m), 7.48-7.62 (5H, m), 7.72-7.81 (5H, m), 8.22-8.28 (1H, m).
L-타르타르산 (1.675 g, 1.0 당량)을 한번에 첨가하여 유리 염기를 바이타르트레이트 염으로 전환시키고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 회백색 분말로 진공 농축하고, 이를 실온에서 진공 오븐으로 건조하였다.
합성 방법 ( IV )-2의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00027
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. C2) (100 mg, 1 당량), 카르보닐디이미다졸 (50 mg, 1.05 당량) 및 디메틸아세트아미드 (4 ml)의 혼합물을 60℃에서 30 min 동안 교반한 후, 메틸 2-메틸-2- [4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B1) (132 mg, 1.05 당량)을 첨가하고, 온도를 2h 동안 80℃로 올렸다. 추가 분획의 카르보닐디이미다졸 (0.5 당량)을 첨가하고, 80℃에서 15h 동안 계속 교반하였다. 냉각시킨 후, 조질 혼합물을 역상 HPLC (예비 방법 A)에 적용하여 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (99 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.845분; m/z [M+H]+ = 761.3
1H NMR (CDC13) δ 1.28 (3H, s), 1.31 (3H, s), 1.73-2.05 (4H, m), 2.25 (1H, t), 2.39-2.46 (1H, m), 2.96-2.99 (1H, m), 3.00-3.12 (4H, m), 3.19 (1H, s), 3.68-3.73 (3H, m), 4.11/4.41 (1H, 2x br m), 4.73 (1H, s), 4.97 (1H, s), 5.51 (1H, s), 6.29-6.34 (1H, m), 7.06-7.20 (2H, m), 7.35-7.41 (1H, m), 7.48-7.58 (2H, m), 7.68-7.84 (6H, m), 8.60-8.68 (1H, m), 8.87-8.91 (1H, m).
이를 합성 방법 (I)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-3의 예
에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00028
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C1) (115 mg, 1 당량), 에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B2) (150 mg, 1 당량), HATU (151 mg, 1.2 당량), DMF (2.7 ml) 및 DIPEA (0.17 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 5h 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트/메탄올과 수성 중탄산나트륨 사이에 분배한 후, 유기층을 염수로 세척하고 건조시켰다. 플래시 크로마토그래피 (실리카, DCM 중의 3-4％ 메탄올)를 통해 에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (190 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.55분; m/z [M+H]+ = 775.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.18-1.40 (9H, m), 1.61-2.09 (4H, m), 2.22-2.45 (2H, m), 2.75-2.85 (1H, m), 2.90-3.34 (5H, m), 3.71/4.66 (1H, 2x m), 4.12-4.26 (2H, m), 4.70-4.85 (3H, m), 5.08 (1H, s), 6.80-6.88 (1H,m), 6.95-7.13 (3H, m), 7.27-7.33 (1H, m), 7.34-7.52 (3H,m), 7.56-7.62 (1H, m), 7.63-7.77 (4H, m), 8.29-8.44 (2H, m).
이를 합성 방법 (I)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-4의 예
에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00029
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C1) (124 mg, 1.2 당량), 에틸 2-메틸-2-{4-[({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}프로파노에이트 (Int. B3) (139 mg, 1 당량), DMF (1.2 ml) 및 DIPEA (0.16 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 30 min 동안 진탕한 후, HATU (176 mg, 1.5 당량)을 첨가하고, 4h 동안 계속 진탕하였다. 역상 HPLC (예비 방법 B)를 통해 에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (174 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.77분; m/z [M+H]+ = 791.3
1H NMR (CDCl3) 특징적인 피크: δ 1.21-1.42 (9H, m), 1.58-2.08 (4H, m), 2.20-2.48 (2H, m), 2.71-5.1 (13H, br m), 6.79-6.87 (1H, d), 6.92-7.11 (3H, m), 7.30-7.46 (5H, m), 7.48-7.63 (5H, m), 8.26-8.40 (1H, m)
이를 합성 방법 (I)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-5의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00030
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C3) (100 mg, 1 당량), 메틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B1) (130 mg, 1.03 당량), DIPEA (0.1 ml, 2 당량), 아세토니트릴 (2 ml) 및 HATU (130 mg, 1.4 당량)의 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반한 후, 증발시키고, 아세토니트릴에 재용해시켰다. 역상 HPLC (예비 방법 B)에 의한 정제를 통해 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메 틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (126 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.698분; m/z [M+H]+ = 761.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.30 (3H, s), 1.34 (3H, s), 1.81-2.03 (4H, m), 2.29-2.35 (1H, m), 2.39-2.45 (1H, m), 2.82-2.87 (1H, m), 3.00-3.14 (4H, m), 3.19-3.24 (1H, m), 3.70-3.73 (3H, m), 4.00/4.51 (1H, 2x br m), 4.74 (1H, s), 4.91 (1H, s), 5.10 (1H, s), 5.54 (1H, s), 6.77-6.84 (1H, m), 6.87-6.98 (1H, m), 7.28-7.43 (2H, m), 7.48-7.61 (5H, m), 7.73-7.81 (5H, m), 8.23-8.29 (1H, m).
이를 합성 방법 (I)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-6의 예
에틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00031
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C3) (120 mg, 1 당량), 에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B2) (204 mg, 1.3 당량), DMF (1.4 ml) 및 DIPEA (0.183 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 진탕한 후, HATU (206 mg, 1.5 당량)을 격렬하게 진탕하면서 첨가하고, 1.5h 동안 계속 진탕하였다. 추가 분획의 중간체 D5 (12 mg, 0.1 당량)를 첨가한 후, 2일 동안 계속 진탕하였다. 역상 HPLC (예비 방법 B)를 통해 에틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (173 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.751분; m/z [M+H]+ = 775.3
1H NMR (CDCl3) δ (회전이성질체의 혼합물) 특징적인 피크: 1.22-1.47 (9H, m), 1.63-2.10 (4H, m), 2.16-5.11 (15H, br m), 6.75-6.88 (2H, m), 7.14-7.80 (12H, m), 8.26-8.40 (1H, m).
이를 합성 방법 (I)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-7의 예
에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00032
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세트산 (Int. C3) (114 mg, 1.1 당량), 에틸 2-메틸-2-{4-[({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}프로파노에이트 (Int. B3) (139 mg, 1 당량), DMF (1.2 ml) 및 DIPEA (0.16 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 진탕한 후, HATU (176 mg, 1.5 당량)를 격렬하게 진탕하면서 첨가하고, 30 min 동안 계속 진탕하였다. 추가 분획의 중간체 D5 (21 mg, 0.2 당량)를 첨가하고, 1h 후에 추가의 HATU (23 mg, 0.2 당량)를 첨가한 후, 18h 동안 계속 진탕하였다. 역상 HPLC (예비 방법 B)에 의해 에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (149 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.793분; m/z [M+H]+ = 791.3
1H NMR (CDCl3) 특징적인 피크: δ 1.20-1.45 (9H, m), 1.58-2.12 (4H, m), 2.14-2.48 (2H, m), 2.620-5.11 (11H, m), 6.59-6.72 (1H, m), 6.73-6.90 (2H, m), 7.16-7.64 (11H, m), 8.25-8.40 (1H, m).
이를 합성 방법 (II)의 예에서 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-8의 예
2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸 프로판산 트리플루오로아세테이트
Figure 112009076184414-PCT00033
1,1-디메틸에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸} 아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B4) (1 당량), [2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. C2) (1.2 당량), DIPEA (3 당량) 및 DMF (1.O ml)의 혼합물을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. HATU (1.5 당량)를 한번에 첨가하고, 추가로 5 min 동안 교반하였다. 조질 반응 혼합물을 농축하고, 실리카의 플러그 (plug)를 통해 여과하고, 아세톤으로 용출하고, 증발시켜 조질 1,1-디메틸에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1,8-나프티리딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸} 아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸 프로파노에이트를 수득하였다.
프로파노에이트를 단리하지 않은 채로 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물에 용해시키고, RT에서 4h 동안 교반하였다. 증발 및 예비 HPLC (방법 A)에 의해 표제 화합물을 수득하였다.
다른 염은 종래의 수단에 의해 제조할 수 있다. 또한, 유리 염기도 종래의 수단에 의해 제조할 수 있다.
합성 방법 ( IV )-9의 예
2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸} {[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로판산 트리플루오로아세테이트
Figure 112009076184414-PCT00034
1,1-디메틸에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸} 아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B4) (1 당량), [2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐] 아세트산 (Int. C1) (1.2 당량), DIPEA (3 당량) 및 DMF (1.0 ml)의 혼합물을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. HATU (1.5 당량)를 한번에 첨가하고, 추가로 5 min 동안 교반하였다. 조질 반응 혼합물을 농축하고, 실리카의 플러그로 여과하고, 아세톤으로 용출시키고, 증발시켜 조질 1,1-디메틸에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 수득하였다.
프로파노에이트를 단리하지 않은 채로 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물에 용해시키고, RT에서 4h 동안 교반하였다. 증발 및 예비 HPLC (방법 A)를 통해 표제 화합물을 수득하였다.
합성 방법 ( IV )-10의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]-아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리 디닐]-2-메틸프로파노에이트
Figure 112009076184414-PCT00035
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (20.7 g, 1.3 당량), 메틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B1) (20.0 g, 1.3 당량), DIPEA (24.0 ml, 3 당량) 및 DMF (184 ml)의 혼합물을 기계적으로 교반한 후, HATU (27.1 g, 1.5 당량)를 한번에 첨가하고, 2h 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르/THF (1:1)와 탄산나트륨 (1M, 과량) 사이에 분배하였다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발시켰다. 크로마토그래피를 3개의 실리카 컬럼에 대해 순차적으로 실시하였다 (제1 컬럼: 3:1 EtOAc/헥산; 제2 컬럼: DCM 중의 2％ MeOH; 제3 컬럼: 100％ EtOAc에 대해 1:1 EtOAc/헥산). 생성물 분획을 증발시켜 요구되는 생성물을 무정형 분홍색 고체 (27.5 g)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.702분; m/z [M+H]+ = 762.3
결정화: 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (8.0 g) 및 에탄올 (200 ml)의 혼합물을 완전히 용해될 때까지 가온하였다. 용액을 실온에서 자석을 사용하여 24h 동안 교반한 후, 여과하고, 7.5 g의 고체를 수거하였다. 진공을 약 630 Torr에서 24h 동안 유지하기 위해서 상기 용매화 결정을 질소를 배출시키면서 60℃ 진공 오븐 내에 두어 비용매화 결정의 표제 화합물 (7.15 g)을 수득하였다 (m.p. 150℃).
1H NMR (CD3OD) δ 1.25 (3H, s), 1.30 (3H, s), 1.63-1.99 (4H, m), 2.16-2.28 (1H, m), 2.3-2.43 (1H, m), 2.89-2.98 (1H, m), 2.98-3.08 (2H, m), 3.16-3.30 (3H, m), 3.66-3.69 (3H, m), 4.02/4.38 (1H, 2x br m), 4.69 (1H, s), 4.87 (1H, s), 5.4/5.73 (2H, 2x s), 6.99-7.19 (3H, m), 7.29-7.35 (1H, m), 7.50-7.61 (3H, m), 7.64-7.82 (5H, m), 8.48-8.57 (1H, m), 8.80-8.89 (1H, m); 하기 도 1 참조.
합성 방법 ( IV )-11의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00036
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디 닐]-2-메틸프로파노에이트 (8.5 g, 1 당량)을 메탄올 (100 ml)에 현탁시키고, 고체가 용해될 때까지 50℃로 가온하였다. L-타르타르산 (1.675 g, 1.0 당량)을 한번에 첨가하고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 회백색 분말로 진공 농축하고, 실온에서 진공 오븐에서 건조시켰다.
LCMS Rt = 2.697분; m/z [M+H]+ = 762.3
1H NMR (d6-DMSO) δ 1.17 (3H, s), 1.23 (3H, s), 1.47-1.91 (4H, m), 1.98-2.41 (1H, m), 2.16-2.33 (1H, m), 2.80-3.26 (6H, m), 3.50-3.67 (3H, m), 3.95/4.17 (1H, 2x br m), 4.61 (1H, s), 4.85 (1H, s), 5.39/5.69 (2H, 2x s), 7.08-7.39 (4H, m), 7.53-7.70 (3H, m), 7.72-7.97 (5H, m), 8.42-8.54 (1H, m), 8.85-8.95 (1H, m)
합성 방법 ( IV )-12의 예
에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00037
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (116 mg, 1 당량), 에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)- 4-바이페닐릴]-메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B2) (150 mg, 1 당량), HATU (151 mg, 1.2 당량), DMF (2.72 ml) 및 DIPEA (0.17 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 3.25h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트/메탄올과 수성 중탄산나트륨 사이에 분배하고, 유기층을 염수로 세척하고, 건조시킨 후, 활성탄 (250 mg)으로 처리하였다. 플래시 크로마토그래피 (실리카, DCM 중의 3-4％ 메탄올)를 통해 에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (178 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.58분; m/z [M+H]+ = 776.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.20-1.40 (9H, m), 1.56-2.02 (4H, m), 2.19-2.44 (2H, m), 2.88-3.20, (4H, m), 3.22-3.40 (2H, m), 3.81/4.58 (1H, 2x m), 4.11-4.27 (2H, m), 4.69/4.84 (2H, 2x s), 5.17/5.49 (2H, 2x s), 6.95-7.14 (3H, m), 7.25-7.31 (1H, m), 7.38-7.54 (3H, m), 7.54-7.61 (1H, m), 7.62-7.79 (4H, m), 8.57-8.75 (2H, m)
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-13의 예
에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘 -1(4H)-일]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00038
[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (114 mg, 1.1 당량), 에틸 2-메틸-2-{4-[({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}프로파노에이트 (Int. B4) (139 mg, 1 당량), DMF (1.2 ml) 및 DIPEA (0.16 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 30 min 동안 진탕한 후, HATU (176 mg, 1.5 당량)를 첨가하고, 3h 동안 계속 진탕하였다. 역상 HPLC (예비 방법 B)를 통해 에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소-1(4H)-퀴나졸리닐]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (166 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.87분; m/z [M+H]+ = 792.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.18-1.42 (9H, m), 1.54-2.04 (4H, m), 2.12-2.46 (2H, m), 2.86-3.21 (4H, m), 3.21-3.41 (2H, m), 3.79/4.57 (1H, 2x m), 4.10-4.27 (2H, m), 4.68 (1H, s), 4.82 (1H, s), 5.17 (1H, s), 5.47 (1H, s), 6.94-7.16 (3H, m), 7.20-7.36 (3H, m), 7.37-7.48 (3H, m), 7.48-7.61 (3H, m), 8.56-8.76 (2H, m).
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-14의 예
1-메틸에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00039
1-메틸에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B3) (420 mg, 1 당량), [2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (300 mg, 1 당량), HATU (396 mg, 1.2 당량), DIPEA (0.22 ml, 1.5 당량) 및 DMF (3.0 ml)의 혼합물을 실온에서 30 min 동안 교반하였다. 조질 반응 혼합물을 직접 역상 HPLC (예비 방법 A)에 적용하여 1-메틸에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (171 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.837분; m/z [M+H]+ = 790.3
1H NMR (CD3OD) δ 1.16-1.37 (12H, m), 1.62-2.01 (4H, m), 2.27-2.55 (2H, m), 2.95-3.12 (3H, m), 3.12-3.29 (3H, m), 4.06/4.40 (1H, 2x br m), 4.71 (1H, s), 4.89 (1H, s), 4.92-5.07 (1H, m), 5.43/5.76 (2H, 2x s), 7.00-7.21 (3H, m), 7.29-7.38 (1H, m), 7.49-7.65 (3H, m), 7.65-7.87 (5H, m), 8.48-8.58 (1H, m), 8.81-8.90 (1H, m).
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-15의 예
1-메틸에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00040
1-메틸에틸 2-메틸-2-{4-[({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)-아미노]-1-피페리디닐}프로파노에이트 (Int. B5) (80 mg, 1 당량), [2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (67 mg, 1 당량), HATU (400 mg, 5 당량), DIPEA (0.22 ml, 1.5 당량) 및 DMF (2.0 ml)의 혼합물을 실온에서 30 min 동안 교반하였다. 조질 반응 혼합물을 직접 역상 HPLC (예비 방법 A)에 적용하여 1-메틸에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 (25 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.952분; m/z [M+H]+ = 806.4
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.09-1.25 (12H, m), 1.47-1.91 (4H, m), 2.05-2.20 (1H, m), 2.21-2.38 (1H, m), 2.87-3.07 (3H, m), 3.08-3.22 (3H, m), 3.95/4.17 (1H, 2x br m), 4.59 (1H, s), 4.75-4.97 (2H, m), 5.38/5.68 (2H, 2x s), 7.90-7.21 (1H, m), 7.21-7.36 (3H, m), 7.42-7.55 (3H, m), 7.55-7.64 (2H, m), 7.66-7.77 (2H, m), 7.77-7.85 (1H, m), 8.43-8.52 (1H, m), 8.86-8.95 (1H, m)
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-16의 예
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00041
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,4-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D2) (100 mg, 1 당량), 메틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}-아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B1) (130 mg, 1.03 당량), DIPEA (0.16 ml, 3 당량), 아세토니트릴 (2 ml) 및 HATU (130 mg, 1.2 당량)의 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반한 후, 증발시키고, 아세토니트릴에 재용해시켰다. 역상 HPLC (예비 방법 B)에 의한 정제를 통해 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 (145 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.716분; m/z [M+H]+ = 762.3
1H NMR (CDCl3) δ 1.27 (3H, s), 1.33 (3H, s), 1.69-1.98 (4H, m), 2.22-2.29 (1H, m), 2.36-2.43 (1H, m), 2.96-3.08 (3H, m), 3.13-3.24 (3H, m), 3.69-3.72 (3H, m), 4.04/4.41 (1H, 2x br m), 4.72 (1H, s), 4.91 (1H, s), 5.41/5.73 (2H, 2x s), 6.84-6.97 (2H, m), 7.34-7.44 (2H, m), 7.54-7.63 (3H, m), 7.69-7.83 (5H, m), 8.55-8.60 (1H, m), 8.86-8.91 (1H, m).
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르 트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-17의 예
에틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00042
[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,4-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D2) (120 mg, 1 당량), 에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]-메틸}아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B2) (198 mg, 1.3 당량), DMF (1.4 ml) 및 DIPEA (0.178 ml, 3 당량)의 혼합물을 실온에서 1.5h 동안 진탕한 후, HATU (200 mg, 1.5 당량)를 격렬하게 진탕하면서 첨가하고, 1.5h 동안 계속 진탕하였다. 추가 분획의 중간체 D2 (12 mg, 0.1 당량)를 첨가한 후, 2일 동안 계속 진탕하였다. 역상 HPLC (예비 방법 B)를 통해 에틸 2-[4-({[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 백색 고체 (170 mg)로서 수득하였다.
LCMS Rt = 2.827분; m/z [M+H]+ = 776.3
1H NMR (CDCl3) 특징적인 피크: δ 1.14-1.43 (9H, m), 1.57-2.05 (4H, m), 2.10-2.46 (2H, m), 2.84-3.11 (3H, m), 3.12-3.34 (3H, m), 3.65/3.85 (1H, m), 4.06-4.27 (2H, m), 4.65/4.85 (2H, s), 5.15/5.45 (2H, s), 6.62-6.89 (2H, m), 7.18-7.34 (1H, m), 7.37-7.82 (9H, m), 8.59-8.77 (2H, m).
이를 합성 방법 (II)의 예에 대해 설명한 바와 유사한 방법에 의해 바이타르트레이트 염으로 전환시켰다.
합성 방법 ( IV )-18의 예
에틸 2-{4-[{[2-[2-(2,4-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}({4'-[(트리플루오로메틸)옥시]-4-바이페닐릴}메틸)아미노]-1-피페리디닐}-2-메틸프로파노에이트 2,3-디히드록시부탄디오에이트 (염)
Figure 112009076184414-PCT00043
1,1-디메틸에틸 2-메틸-2-[4-({[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸} 아미노)-1-피페리디닐]프로파노에이트 (Int. B7) (150 mg, 1 당량), [2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세트산 (Int. D1) (130 mg, 1.2 당량), DIPEA (0.164 ml, 3 당량) 및 DMF (1.O ml)의 혼합물을 실온에서 5 min 동안 교반하였다. HATU (180 mg, 1.5 당량)를 한번에 첨가하고, 추가로 5 min 동안 교반하였다. 조질 반응 혼합물을 농축하고, 실리카의 플러그를 통 해 여과하고, 아세톤으로 용출시킨 후 증발시켜 조질 1,1-디메틸에틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.823분; m/z [M+H]+ = 804.4
상기 중간체를 단리하지 않은 채로 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물에 용해시키고, RT에서 4h 동안 교반하였다. 증발 및 예비 HPLC (방법 A)를 통해 요구되는 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로판산 트리플루오로아세테이트 (70 mg)를 수득하였다.
LCMS Rt = 2.554분; m/z [M+H]+ = 748.2
1H NMR (d6-DMSO) d 1.44 (3H, s), 1.51 (3H, s), 1.70-2.30 (4H, m), 2.41-2.56 (2H, m), 2.94-3.54 (6H, m), 4.44-4.95 (3H, m), 5.42/5.76 (2H, 2x br s), 7.07-7.38 (4H, m), 7.54-7.75 (3H, m), 7.76-7.99 (5H, m), 8.42-8.54 (1H, m), 8.85-8.98 (1H, m).
다른 염은 종래의 수단에 의해 제조할 수 있다. 또한, 유리 염기도 종래의 수단에 의해 제조할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 Lp-PLA2의 억제제로서 유 용한 화합물은 다음과 같다:
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 ("SB480848" 또는 피리미디논계 화합물 및 Lp-PLA2의 가역적 억제제이고 본원의 실시예에 사용되는 USAN 명칭 "다라플라딥"으로도 불림),
N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)아세트아미드;
N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)아세트아미드; 및
메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]-아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트.
1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 (AKA SB480848, 본원의 실시예에서 사용됨); N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)아세트아미드; N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이 페닐-4-일메틸)아세트아미드; 및 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트의 제약상 허용되는 염이 또한 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 Lp-PLA2의 억제제로서 유용하다.
Lp - PLA 2 의 핵산 억제제
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 핵산이다. Lp-PLA2의 핵산 억제제는 예를 들어 RNA 간섭-유발 분자, 예를 들어 siRNA, dsRNA, stRNA, shRNA 및 그의 변형된 버전 (이로 제한되지 않음)이고, 이로 제한되지 않으며, 상기 RNA 간섭 분자는 Lp-PLA2의 유전자 발현을 사일런싱시킨다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 핵산 억제제는 안티-센스 올리고핵산, 또는 핵산 유사체, 예를 들어 DNA, RNA, 펩티드-핵산 (PNA), 의사-상보성 PNA (pc-PNA), 또는 잠금 핵산 (LNA) 등 (이로 제한되지 않음)이다. 별도의 실시태양에서, 핵산은 DNA 또는 RNA, 및 핵산 유사체, 예를 들어 PNA, pcPNA 및 LNA이다. 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 관심 있는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, PNA 등을 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 핵산 서열은 예를 들어 전사 리프레서로서 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제성 핵산 서열, 예를 들어 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등 (이로 제한되지 않음)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 진핵 세포에서 내인성으로 발견되는 RNA의 형태인 단일가닥 RNA (ssRNA)는 RNAi 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 세포 ssRNA 분자는 메신저 (messenger) RNA (및 전구체 프리-메신저 RNA), 작은 핵 RNA, 작은 핵소체 (nucleolar) RNA, 전달 RNA 및 리보솜 RNA를 포함한다. 이중가닥 RNA (dsRNA)는, 30 bp 초과의 dsRNA는 인터페론 반응을 활성화시키지만, 더 짧은 dsRNA는 다이서 (Dicer) 효소의 하류에 위치하는 세포의 내인성 RNA 간섭 기구 내로 공급되도록 하는 크기-의존 면역 반응을 유발한다.
Lp-PLA2는 Lp-PLA2 폴리펩티드의 발현 억제 또는 당업자에게 일반적으로 공지된 "유전자 사일런싱" 방법에 의해 감소될 수 있다.
RNA 간섭 (RNAi)은 선택된 표적 폴리펩티드의 발현을 억제하기 위한 강력한 방안을 제공한다. RNAi는 선택적인 분해를 위해 표적 폴리펩티드를 코딩하는 메신저 RNA를 표적화하는 작은 간섭 RNA (siRNA) 이중체를 이용한다. 유전자 발현의 siRNA-의존성 전사후 사일런싱은 siRNA에 의해 안내된 부위에서 표적 메신저 RNA 분자의 절단을 수반한다.
RNA 간섭 (RNAi)은 진화상 보존된 과정이고, 이에 의한 표적 유전자에 동일하거나 고도로 유사한 서열의 RNA의 발현 또는 도입은 표적화된 유전자로부터 전사된 메신저 RNA (mRNA)의 서열 특이적 분해 또는 특이적 전사후 유전자 사일런싱 (PTGS)을 야기하여 ([Coburn, G. 및 Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225] 참조), 표적 유전자의 발현을 억제한다. 한 실시태양에서, RNA는 이 중가닥 RNA (dsRNA)이다. 이 과정은 식물, 무척추동물, 및 포유동물 세포에서 설명된 바 있다. 자연에서, RNAi는 긴 dsRNA의 siRNA로 불리는 이중가닥 단편으로의 가공 (processive) 절단을 촉진하는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 개시된다. siRNA는 표적 mRNA를 인식하고 절단시키는 단백질 복합체 ("RNA 유도된 사일런싱 복합체", 또는 "RISC"로 불림) 내로 통합된다. RNAi는 또한 표적 유전자의 발현을 억제하거나 사일런싱시키기 위해 핵산 분자, 예를 들어, 합성 siRNA 또는 RNA 간섭 물질을 도입함으로써 개시될 수도 있다. 본원에서 사용될 때, "표적 유전자 발현의 억제"는 RNA 간섭이 유도되지 않은 상황에 비해 표적 유전자 또는 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 단백질 활성 또는 수준의 임의의 감소를 포함한다. 감소는 RNA 간섭 물질에 의해 표적화되지 않은 표적 유전자의 발현 또는 상기 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 수준에 비해 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상의 감소일 수 있다.
본원에서 "작은 간섭 RNA"로도 불리는 "짧은 간섭 RNA" (siRNA)는 예를 들어 RNAi에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하는 물질로서 규정된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 시험관 내 전사에 의해 생산될 수 있거나, 또는 숙주 세포 내에서 생산될 수 있다. 한 실시태양에서, siRNA는 길이가 약 15 내지 약 40개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15 내지 약 28개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 19, 20, 21, 22, 또는 23개 뉴클레오티드인 이중가닥 RNA (dsRNA) 분자이고, 각각의 가닥 상에 길이가 약 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드인 3' 및/또는 5' 오버행 (overhang)을 함유할 수 있다. 오버행의 길이는 2개의 가닥 사이에 독립적이다. 즉, 하나의 가닥 상의 오버행의 길이는 제2 가닥 상의 오버행의 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는, siRNA는 표적 메신저 RNA (mRNA)의 분해 또는 특이적 전사후 유전자 사일런싱 (PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진할 수 있다.
siRNA는 또한 작은 헤어핀 (스템 루프로도 칭함) RNA (shRNA)를 포함한다. 한 실시태양에서, 이들 shRNA는 짧은 (예를 들어, 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드) 안티센스 가닥, 이어서 약 5 내지 약 9개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 루프, 및 유사한 센스 가닥으로 이루어진다. 별법으로, 센스 가닥은 뉴클레오티드 루프 구조 앞에 존재할 수 있고, 안티센스 가닥이 뒤에 올 수 있다. 이들 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스에 포함되고, 예를 들어 pol III U6 프로모터, 또는 다른 프로모터로부터 발현될 수 있다 (예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Stewart, et al. (2003) RNA Apr; 9(4):493-501] 참조).
RNA 간섭 물질의 표적 유전자 또는 서열은 세포 유전자 또는 게놈 서열, 예를 들어 Lp-PLA2 서열일 수 있다. siRNA는 표적 유전자 또는 게놈 서열, 또는 그의 단편에 실질적으로 상동성일 수 있다. 상기 맥락에서 사용될 때, 용어 "상동성"은 표적의 RNA 간섭을 실행하기 위해 표적 mRNA, 또는 그의 단편에 대해 실질적으로 동일한, 충분히 상보성이거나 유사한 것으로서 규정된다. 천연 RNA 분자 이외에, 표적 서열의 발현의 억제 또는 간섭에 적합한 RNA는 RNA 유도체 및 유사체를 포함 한다. 바람직하게는, siRNA는 그의 표적과 동일하다.
siRNA는 바람직하게는 하나의 서열만을 표적으로 한다. 각각의 RNA 간섭 물질, 예를 들어 siRNA는 예를 들어 발현 프로파일링 (profiling)에 의해 잠재적인 부정확한 (off-target) 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Jackson et al, Nature Biotechnology 6:635-637, 2003]에 기재되어 있다. 발현 프로파일링 이외에, 부정확한 효과를 가질 수 있는 잠재적인 서열을 확인하기 위해서 서열 데이타베이스 내의 유사한 서열에 대해 잠재적인 표적 서열을 스크리닝할 수도 있다. 예를 들어, 잭슨 (Jackson)의 상기 문헌에 따르면, 서열의 15개, 또는 아마도 11개의 적은 연속 뉴클레오티드도 비-표적화된 전사체의 직접 사일런싱을 위해 충분하다. 따라서, 임의의 공지의 서열 비교 방법, 예를 들어 BLAST에 의한 서열 동일성 분석을 사용하여 잠재적인 부정확한 사일런싱을 방지하기 위해 제시된 siRNA를 초기에 스크리닝할 수 있다.
siRNA 분자는 단지 RNA를 함유하는 분자로 제한될 필요가 없고, 예를 들어 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 더 포함하고, 또한 리보스 당 분자가 다른 당 분자 또는 유사한 기능을 수행하는 분자를 치환한 분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오티드 잔기 사이의 비-천연 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결을 사용할 수 있다. 예를 들어, RNA에서 발견되는 자연 발생하는 D-리보뉴클레오시드 대신에 D-아라비노푸라노실 구조를 함유하는 siRNA가 본 발명에 따라 RNAi 분자에 사용될 수 있다 (미국 특허 5,177,196). 다른 예는 뉴클레오시드의 당과 헤테로시클릭 염기 사이에 o-연결을 함유하는 RNA 분자를 포함하고, 이것은 뉴클레아제 내성 및 2'-O-메틸 리보스, 아라비노스, 특히 D-아라비노스를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 유사한 올리고뉴클레오티드 분자에 대한 긴밀한 상보성 가닥 결합을 부여한다 (미국 특허 5,177,196).
RNA 가닥은 리포터기의 반응성 관능기, 예를 들어 형광단으로 유도체화될 수 있다. 특히 유용한 유도체는 RNA 가닥의 말단(들), 일반적으로 센스 가닥의 3' 말단에서 변형된다. 예를 들어, 3' 말단의 2'-히드록실은 다양한 기로 쉽게 선택적으로 유도체화될 수 있다.
다른 유용한 RNA 유도체는 변형된 탄수화물 모이어티, 예를 들어 2'0-알킬화된 잔기 또는 2'-O-메틸 리보실 유도체 및 2'-O-플루오로 리보실 유도체를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. RNA 염기도 변형될 수 있다. 표적 서열의 발현을 억제하거나 간섭하기 위해 유용한 임의의 변형된 염기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 할로겐화 염기, 예를 들어 5-브로모우라실 및 5-요오도우라실이 포함될 수 있다. 염기는 또한 알킬화될 수 있고, 예를 들어, 7-메틸구아노신이 구아노신 잔기 대신에 도입될 수 있다. 성공적인 억제를 유도하는 비-천연 염기도 포함될 수 있다.
가장 바람직한 siRNA 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘 또는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 및 포스포디에스테르 또는 상이한 수의 포스포로티오에이트 연결을 함유하는 RNA 이중체를 포함한다. 그러한 변형은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003]에 기재되어 있다. siRNA 분자에 대한 대부분의 유용한 변형은 안티센스 올리고뉴클레오티드 기술에 대해 확립된 화학을 사용하여 도입될 수 있다. 바람직하게는, 변형은 최소 의 2'-O-메틸 변형을 수반하고, 바람직하게는 상기 변형은 제외된다. 또한, 변형은 바람직하게는 siRNA의 유리 5'-히드록실기의 변형을 제외한다.
각종 "테일 (tail)"이 그의 3'- 또는 5'-말단부에 또는 둘 모두에 공유 부착된 siRNA 및 miRNA 분자도 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 따라 전달되는 siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, RNA 분자의 3' 또는 5' 말단부에 부착된 삽입기 (intercalating group), 각종 리포터기 및 친지질성기는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 따라 유용하다. 본 발명에 따라 유용한 변형된 RNA 분자의 제조에 적용가능한 3'-콜레스테롤 또는 3'-아크리딘 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성에 대한 설명은 예를 들어 문헌 [Gamper, H. B., Reed, M. W., Cox, T., Virosco, J. S., Adams, A. D., Gall, A., Scholler, J. K., and Meyer, R. B. (1993) Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3'-Modified Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 21 145-150]; 및 [Reed, M. W., Adams, A. D., Nelson, J. S., and Meyer, R. B., Jr. (1991) Acridine and Cholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3'-Modified Oligonucleotides. Bioconjugate Chem. 2 217-225 (1993)]에서 볼 수 있다.
Lp-PLA2 발현을 표적화하기에 유용한 다른 siRNA는 쉽게 설계되고 시험될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 유용한 siRNA는 Lp-PLA2의 유전자에 상동성인 약 15 내지 약 40개 또는 약 15 내지 약 28개 뉴클레오티드 길이의 siRNA 분자를 포함한다. 바람직하게는, Lp-PLA2 표적화 siRNA 분자의 길이는 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게는, Lp-PLA2 표적화 siRNA 분자의 길이는 약 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드이다. 또한, Lp-PLA2 표적화 siRNA 분자는 3' 히드록실기를 포함할 수 있다. Lp-PLA2 표적화 siRNA 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고; 상기 분자는 블런트 말단 (blunt ended)일 수 있거나 또는 오버행 말단 (예를 들어, 5', 3')을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, RNA 분자는 이중가닥이고, 블런트 말단이거나 또는 오버행 말단을 포함한다.
한 실시태양에서, Lp-PLA2 표적화 RNA 분자의 적어도 하나의 가닥은 길이가 약 0 내지 약 6개 뉴클레오티드 (예를 들어, 피리미딘 뉴클레오티드, 퓨린 뉴클레오티드)인 3' 오버행을 갖는다. 다른 실시태양에서, 3' 오버행의 길이는 약 1 내지 약 5개 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3개 뉴클레오티드, 약 2 내지 약 4개 뉴클레오티드이다. 한 실시태양에서, Lp-PLA2 표적화 RNA 분자는 이중가닥이고, 여기서 하나의 가닥은 3' 오버행을 갖고, 다른 가닥은 블런트 말단이거나 오버행을 가질 수 있다. Lp-PLA2 표적화 RNA 분자가 이중가닥이고 두 가닥이 모두 오버행을 포함하는 실시태양에서, 오버행의 길이는 각각의 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 RNA는 페어링되고 RNA의 두 3' 말단부 상에 약 1 내지 약 3개, 특히 약 2개의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는 약 19, 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시태양에서, 3' 오버행은 분해에 대해 안 정화될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함함으로써 안정화된다. 별법으로, 피리미딘 뉴클레오티드의 변형된 유사체에 의한 치환, 예를 들어 우리딘 2 뉴클레오티드 3' 오버행의 2'-데옥시티미딘에 의한 치환은 허용되고, RNAi의 효능에 영향을 주지 않는다. 2' 히드록실이 존재하지 않으면, 조직 배양 배지 내에서 오버행의 뉴클레아제 저항성을 유의하게 향상시킬 수 있다.
Lp-PLA2 mRNA는 siRNA를 이용하여 성공적으로 표적화되고, 상기 siRNA 또는 이들의 제조를 위한 벡터는 예를 들어 인비트로겐 (Invitrogen)으로부터 상업적으로 이용가능하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 Lp-PLA2 siRNA를 사용한 Lp-PLA2 단백질의 발현 및/또는 녹 다운 (knock down)의 평가는 시판되는 키트, 예를 들어 다이아덱서스 (diaDexus)의 PLAC 분석 (이로 제한되지 않음)을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 서열은 표적 mRNA의 공지의 서열을 기초로 하여 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 불확실함을 방지하기 위해, 인간 Lp-PLA2 cDNA의 서열은 예를 들어 GenBank 기탁 번호 U20157 (서열 1) 또는 NM_005084 (서열 2)에서 제시된다. U20157의 서열은 다음과 같다 (서열 1):
Figure 112009076184414-PCT00044
Figure 112009076184414-PCT00045
siRNA 서열은 siRNA의 안티센스 (가이드 (guide)) 가닥의 RISC 내로의 흡수를 최대화하고, 이에 의해 분해를 위한 인간 Lp-PLA2 mRNA를 표적화하는 RISC의 능 력을 최대화하기 위해 선택된다. 이것은 안티센스 가닥의 5'-말단에 최저 자유 결합 에너지를 갖는 서열에 대한 스캐닝에 의해 달성될 수 있다. 보다 낮은 자유 에너지는 siRNA 이중체의 안티센스 가닥의 5'-말단부의 풀림 (unwinding)을 향상시키고, 이에 의해 안티센스 가닥이 RISC에 의해 흡수되고 인간 Lp-PLA2 mRNA의 서열-특이적 절단의 유도를 보장한다.
바람직한 실시태양에서, siRNA 또는 변형된 siRNA는 제약상 허용되는 담체 내에서 전달된다. 추가의 담체 물질, 예를 들어 리포좀이 제약상 허용되는 담체에 첨가될 수 있다.
다른 실시태양에서, siRNA는 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 코딩하는 벡터를 제약상 허용되는 담체 내에서 개체의 장기 내의 세포에 전달함으로써 전달된다. shRNA는 전사된 후에 세포에 의해, 예를 들어 Lp-PLA2를 표적화할 수 있는 siRNA로 전환된다. 한 실시태양에서, 벡터는 조절가능한 벡터, 예를 들어 테트라사이클린 유도가능 벡터일 수 있다.
한 실시태양에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 RNA 간섭 물질은 벡터를 사용하지 않으면서, 정맥내 주사, 예를 들어, 유체역학 (hydrodynamic) 주사 후에 생체 내에서 세포에 의해 능동적으로 흡수되고, 이것은 본 발명의 방법에서 사용되는 RNA 간섭 물질, 예를 들어 siRNA의 효율적인 생체 내 전달을 보여준다.
본 발명의 방법에 사용되는 RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA의 전달을 위한 다른 전략, 예를 들어 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡 터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터도 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188]에 기재된 상기 벡터를 사용할 수 있다. 다른 전달 방법은 RNA 간섭 물질을 기본 펩티드, 예를 들어 TAT 펩티드의 단편에 컨쥬게이팅 또는 혼합하거나, 양이온 지질과 혼합하거나 또는 입자로 제제화함으로써 기본 펩티드를 사용하여 본 발명의 RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA를 전달하는 것을 포함한다.
언급된 바와 같이, dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA는 유도가능 벡터, 예를 들어 테트라사이클린 유도가능 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, pTet-On 벡터 (비디 바이오사이언시스 클론테크 (BD Biosciences Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 이용하여 문헌 [Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106]에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 외래 서열의 삽입을 위해 및 진핵 세포 내로의 도입을 위해 변경된 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 벡터는 효능제 또는 길항제 핵산 분자의 DNA 서열의 RNA로의 전사를 지시할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 바이러스 발현 벡터는 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스계 벡터 또는 상기 임의의 벡터의 하이브리드 바이러스를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 에피좀 벡터이다. 적합한 에피좀 벡터는 길항제 핵산 분자를 대상체 내에 고 카피수의 염색체외 DNA로 유지함으로써 염색체 통합의 잠재적인 효과를 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 개시된 방법에 유용한 RNA 간섭 분자 및 핵산 억제제는 임의의 공지의 기술, 예를 들어 직접적인 화학적 합성을 사용하여, 재조합 다이서 단백질 또는 초파리 (Drosophila) 배아 용해물에 대한 노출에 의한 보다 긴 이중가닥 RNA의 처리를 통해, S2 세포로부터 유도된 시험관 내 시스템을 통해, 파지 RNA 중합효소, RNA-의존성 RNA 중합효소, 및 DNA 기반 벡터를 사용하여 생산될 수 있다. 세포 용해물 또는 시험관 내 처리의 사용은 용해물로부터 짧은, 예를 들어 약 21-23개 뉴클레오티드의 siRNA의 후속 단리 등을 추가로 수반할 수 있다. 화학적 합성은 대체로 2개의 단일가닥 RNA-올리고머를 제조한 후, 2개의 단일가닥 올리고머를 이중가닥 RNA로 어닐링 (annealing)함으로써 진행한다. 다른 예는 siRNA의 화학적 및 효소적 합성을 교시하는 WO 99/32619 및 WO 01/68836에 개시된 방법을 포함한다. 또한, 많은 상업적 서비스가 특이적 siRNA를 설계하고 제조하기 위해 이용가능하다 (예를 들어, 퀴아겐 인크. (QIAGEN Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아) 및 암비온 인크. (AMBION Inc., 미국 텍사스주 오스틴) 참조).
몇몇 실시태양에서, 물질은 Lp-PLA2의 발현 및/또는 Lp-PLA2 단백질의 활성을 억제하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 RNAi 물질이다. 이러한 실시태양에서, 세포가 Lp-PLA2의 천연 억제제 물질, 예를 들어 Lp-PLA2의 단백질 또는 miRNA 억제제를 높은 수준으로 발현하도록, 예를 들어 자연 발생하는 프로모터를 전체적으로 또는 부분적으로 이종 프로모터의 전체 또는 일부로 치환함으로써 상기 물질의 발현을 증가시키기 위해 세포를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 상동성 재조합에 의 해). 이종 프로모터는 상기 물질을 코딩하는 요구되는 핵산에 작동가능하게 연결되는 방식으로 삽입된다. 예를 들어, PCT 출원 공개 WO 94/12650 (Transkaryotic Therapies, Inc.), PCT 출원 공개 WO 92/20808 (Cell Genesys, Inc.), 및 PCT 출원 공개 WO 91/09955 (Applied Research Systems)를 참조한다. 또한, 세포는 유도가능 조절 요소의 조절 하에 상기 물질을 포함하는 내인성 유전자를 발현하도록 공학적으로 처리될 수 있고, 이 경우에 내인성 유전자의 조절 서열은 상동성 재조합에 의해 대체될 수 있다. 유전자 활성화 기술은 미국 특허 5,272,071 (Chappel); 미국 특허 5,578,461 (Sherwin et al.); PCT/US92/09627 (W093/09222; Selden et al.); 및 PCT/US90/06436 (WO91/06667; Skoultchi et al.)에 기재되어 있다. 물질은 형질전환된 숙주 세포를 miRNA 발현에 적합한 조건 하에 배양함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성되는 발현 물질은 공지의 정제 공정, 예를 들어 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 상기 배양액으로부터 (즉, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터) 정제될 수 있다. Lp-PLA2의 펩티드 또는 핵산 물질 억제제의 정제는 또한 단백질에 결합하는 물질을 함유하는 친화도 컬럼; 콘카나발린 A-아가로스, 헤파린-토이오펄 (heparin-toyopearl)™ 또는 시바크롬 (Cibacrom) 블루 3GA 세파로스와 같은 친화도 수지에 대한 하나 이상의 컬럼 단계; 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피; 면역친화도 크로마토그래피, 또는 상보성 cDNA 친화도 크로마토그래피를 수반하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, Lp-PLA2의 핵산 억제제는 합성에 의해, 예를 들어 당업자에게 공지된 임의의 합성 방법에 의해 핵산을 화학적으로 합성함으로써 얻을 수 있다. Lp-PLA2의 합성된 핵산 억제제는 이어서 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 핵산의 화학적 합성 방법은 포스포트리에스테르, 포스페이트 또는 포스포르아미다이트 화학 및 고상 기술을 사용하거나, 또는 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한 시험관 내에서의 화학적 합성을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (미국 특허 5,705,629 (Bhongle) 참조).
몇몇 환경에서, 예를 들어 뉴클레아제 안정성의 증가가 요구되는 경우에, 핵산 유사체 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 핵산이 바람직할 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 핵산도 당업계에 잘 공지되어 있는 시약 및 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포네이트 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 메톡시에틸 포스포르아미데이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 디이소프로필실릴, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 디메틸렌-술파이드 (-CH2-S-CH2), 디메틸렌-술폭시드 (-CH2-SO-CH2), 디메틸렌-술폰 (-CH2-SO2-CH2), 2'-O-알킬, 및 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 핵산의 합성 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다 ([Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584]; [Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335] 및 상기 문헌에서 인용된 문헌 참조). 미국 특허 5,614,617 및 5,223,618 (Cook, et al.), 5,714,606 (Acevedo, et al.), 5,378,825 (Cook, et al.), 5,672,697 및 5,466,786 (Buhr, et al.), 5,777,092 (Cook, et al.), 5,602,240 (De Mesmacker, et al.), 5,610,289 (Cook, et al.) 및 5,858,988 (Wang)에는 뉴클레아제 안정성 및 세포 흡수의 향상을 위한 핵산 유사체가 기재되어 있다.
shRNA 분자를 포함하여 합성 siRNA 분자는 당업자에게 공지된 많은 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 적절하게 보호된 리보뉴클레오시드 포스포르아미다이트 및 종래의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다 (예를 들어, [Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498]; [Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15: 188-200]; [Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565]; [Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017]; 및 [Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197] 참조). 별법으로, 프롤리고 (Proligo, 독일 함부르크), 다르마콘 리써치 (Dharmacon Research, 미국 콜로라도주 라파예트), 피어스 케미칼 (Pierce Chemical, 퍼비오 사이언스 (Perbio Science)의 자회사, 미국 일리노이주 록포드), 글렌 리써치 (Glen Research, 미국 버지니아주 스털링), 켐진스 (ChemGenes, 미국 매사추세츠주 애쉬랜드), 및 크루아켐 (Cruachem, 영국 글래스고우)을 포함하고, 이로 제한되지 않는 상업적 RNA 합성 회사의 제품이 이용가능하다. 따라서, siRNA 분자는 합성이 그다지 어렵지 않고, RNAi에 적합한 품질로 쉽게 제공된다. 또한, dsRNA는 플라스미드 벡터, 레트로바 이러스 및 렌티바이러스에 의해 코딩되는 스템 루프 구조로서 발현될 수 있다 ([Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958]; [McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850]; [Paul, C.P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508]; [Miyagishi, M. et al (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500]; [Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520]; [Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243]; [Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505]; [Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052]; [Zeng, Y., et al. (2002) Mol Cell 9: 1327-1333]; [Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406]; [Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501]). 상기 벡터는 일반적으로 dsRNA의 상류에 polIII 프로모터를 갖고, 센스 및 안티센스 RNA 가닥을 별개로 및/또는 헤어핀 구조로서 발현할 수 있다. 세포 내에서, 다이서는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 효과적인 siRNA로 처리한다.
본 발명의 siRNA 분자의 표적 구역은 출발 코돈 하류의 약 25 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 50 내지 75개의 뉴클레오티드, 또는 약 75 내지 100개의 뉴클레오티드에서 시작하는 제시된 표적 유전자 서열, 예를 들어, Lp-PLA2 코딩 서열로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 5' 또는 3' UTR 및 출발 코돈 근처의 구역을 함유할 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자를 설계하는 하나의 방법은 23개 뉴클레오티드의 서열 모티프 AA(N19)TT (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)의 확인, 및 적어도 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 또는 75％의 G/C 함량을 갖는 히트 (hit)의 선택을 수반한다. 서열의 "TT" 부분은 선택 사항이다. 별법으로, 상기 서열이 발견되지 않을 경우, 검색은 모티프 NA(N21) (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)를 사용하여 확장될 수 있다. 상기 상황에서, 센스 siRNA의 3' 말단부는 센스 및 안티센스 3' 오버행의 서열 조성에 관하여 대칭적 이중체의 생성을 허용하기 위해 TT로 전환될 수 있다. 이어서, 안티센스 siRNA 분자는 23개 뉴클레오티드의 서열 모티프의 뉴클레오티드 위치 1 내지 21에 대한 보체로서 합성될 수 있다. 작은 간섭 리보뉴클레오단백질 입자 (siRNP)가 대략 동일한 비의 센스 및 안티센스 표적 RNA-절단 siRNP로 형성되는 것을 보장하기 위해 대칭적 3' TT 오버행의 사용이 유리할 수 있다 ([Elbashir et al. (2001) 상기 문헌] 및 [Elbashir et al. 2001 상기 문헌]). 또한, NCBI, BLAST, Derwent 및 GenSeq를 포함하고 이로 제한되지 않는 서열 데이타베이스의 분석 및 상업적으로 이용가능한 올리고합성 소프트웨어, 예를 들어 Oligoengine®를 사용하여, 하나의 유전자만이 표적화되는 것을 보장하도록 EST 라이브러리에 대해 siRNA 서열을 선택할 수 있다.
RNA 간섭 물질의 전달: RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA, 또는 RNA 간섭 물질을 함유하는 벡터를 표적 세포 (예를 들어, 중추 및 말초 신경계 내의 세포에 대해 뇌의 세포 또는 다른 요구되는 표적 세포)로 전달하는 방법은 예를 들어, (i) RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA를 함유하는 조성물의 주사, 또는 (ii) 세포, 예를 들어 뇌의 세포를 RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA를 포함하는 조성물과 직접 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, RNA 간섭 물질은 Lp-PLA2를 발현하는 림프구가 만들어지는 골수를 표적으로 할 수 있다. 다른 실시태양에서, RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA는 예를 들어, 유체역학 주사 또는 카테터 삽입 (catheterization)을 통해 임의의 혈관, 예를 들어 정맥, 동맥, 세정맥 또는 세동맥 내로 직접 주사될 수 있다. 또다른 실시태양에서, RNA 간섭 물질은 피부 궤양의 부위에 주사되거나 직접 국소 적용될 수 있다.
투여는 단일 주사 또는 2회 이상의 주사에 의할 수 있다. RNA 간섭 물질은 제약상 허용되는 담체 내에서 전달된다. 하나 이상의 RNA 간섭 물질이 동시에 사용될 수 있다. RNA 간섭 물질, 예를 들어, Lp-PLA2 mRNA를 표적으로 하는 siRNA는 단독으로, 또는 다른 RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA, 예를 들어 다른 세포성 유전자를 표적으로 하는 siRNA와 조합되어 전달될 수 있다. Lp-PLA2 siRNA는 또한 신경변성 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 다른 약제와 조합되어 투여될 수 있다.
한 실시태양에서, 특이적 세포가 RNA 간섭으로 표적화되어, RNA 간섭의 비-특이적 표적화에 의해 야기되는 RNA 간섭의 잠재적인 부작용을 제한한다. 방법에서는 예를 들어, 세포 표적화 모이어티, 및 RNA 간섭물질을 세포 내로 효과적으로 전달하기 위해 사용되는 RNA 간섭물질 결합 모이어티를 포함하는 복합체 또는 융합 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체-프로타민 융합 단백질은 siRNA와 혼합될 때 siRNA에 결합하고, siRNA를 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포 내로 선택적으로 전달하여, 항원을 발현하는 세포에서만 유전자 발현을 사일런싱시킨다. siRNA 또는 RNA 간섭-유발 분자 결합 모이어티는 단백질 또는 핵산 결합 도메인, 또는 단백질의 단편이고, 결합 모이어티는 표적화 모이어티의 일부에 융합된다. 표적화 모이어티의 위치는 구성체의 카르복실-말단 또는 아미노-말단 단부 내에 또는 융합 단백질의 중간에 놓일 수 있다.
바이러스-매개 전달 메카니즘이 또한 문헌 [Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1006]에 설명된 바와 같이 시험관 내에서 및 생체 내에서 siRNA를 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. shRNA의 플라스미드- 또는 바이러스-매개 전달 메카니즘이 또한 문헌 ([Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406] 및 [Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501])에 설명된 바와 같이 시험관 내에서 및 생체 내에서 shRNA를 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다.
RNA 간섭 물질, 예를 들어, siRNA는 또한 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액계 또는 림프계, 및 뇌척수액을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 RNA 간섭 물질의 용량은 특정 표적 유전자의 RNA 간섭, 예를 들어, 번역후 유전자 사일런싱 (PTGS)을 수행하여, 표적 유전자 발현의 억제 또는 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 수준의 억제를 일으키기 위해 필요한 양일 것이다.
또한, RNAi 분자가 그들의 표적 서열에 완전히 일치해야하는 것은 아님이 알려져 있다. 그러나, 바람직하게는, siRNA의 안티센스 (가이드) 가닥의 5' 및 중간 부분은 표적 핵산 서열에 완전히 상보성이다.
따라서, 본 발명에서 Lp-PLA2의 핵산 억제제로서 기능하는 RNAi 분자는 예를 들어, 비변형 및 변형 이중가닥 (ds) RNA 분자, 예를 들어 짧은-일시적 RNA (stRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 이중가닥 RNA (dsRNA) (예를 들어 [Baulcombe, Science 297:2002-2003, 2002] 참조)이다. dsRNA 분자, 예를 들어 siRNA는 또한 3' 오버행, 바람직하게는 3'UU 또는 3'TT 오버행을 함유할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 siRNA 분자는 약 30-40개 초과의 염기, 약 40-50개 염기, 약 50개 이상의 염기의 ssRNA를 포함하는 RNA 분자를 포함하지 않는다. 한 실시태양에서, 본 발명의 siRNA 분자는 그의 길이의 약 25％ 초과, 약 50％ 초과, 약 60％ 초과, 약 70％ 초과, 약 80％ 초과, 약 90％ 초과에 대해 이중가닥이다. 몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2의 핵산 억제제는 Lp-PLA2 mRNA에 결합하여 그의 발현을 억제하는 임의의 물질이고, 여기서 Lp-PLA2 mRNA의 발현 또는 서열 1 또는 2에 의해 코딩되는 핵산의 전사가 억제된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 RNA 전사체를 절단하여 야생형 단백질의 생산을 방지할 수 있는 촉매 활성의 핵산 구성체, 예를 들어 리보자임이다. 리보자임은 리보자임 촉매 부위에 측면이 접하는 표적에 상보성인 서열의 2개의 구역에 의해 특정 서열에 표적화되어 이 서열과 어닐링된다. 결합 후에, 리보자임은 표적을 부위 특이적 방식으로 절단한다. 본원에 기재된 유전 자 생성물의 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는, 예를 들어 Lp-PLA2 또는 그의 상동체 또는 변이체의 절단을 위한 리보자임의 설계 및 시험은 당업자에게 잘 공지된 기술에 의해 달성할 수 있다 (예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Lleber and Strauss, (1995) Mol Cell Biol 15:540. 551]).
Lp - PLA 2 의 단백질 및 펩티드 억제제
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 Lp-PLA2의 단백질 및/또는 펩티드 억제제 또는 억제제의 단편, 예를 들어, 비제한적으로 돌연변이된 단백질; 치료 단백질 및 재조합 단백질이다. 단백질 및 펩티드 억제제는 또한 예를 들어 돌연변이된 단백질, 유전자 변형된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 인간화 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 그의 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 Lp-PLA2의 우성 음성 변이체, 예를 들어 Lp-PLA2의 비-기능적 변이체이다.
항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 유용한 유전자 및/또는 유전자 생성물의 억제제는 예를 들어 항체, 예를 들어 모노클로날, 키메라, 인간화, 및 재조합 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 중화 항체가 Lp-PLA2 효소의 억제제로서 사용될 수 있다. 항체는 항원으로 면역화시킴으로써 토끼 또는 마우스와 같은 동물에서 쉽게 생성된다. 면역화시킨 마우스가 하이브리도마의 제조를 위한 B 세포원을 제공하기 위해 특히 유용하고, 상기 하이브리도마는 다시 배양되어 다량의 모노클로날 항체를 생산한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자 생성물에 대한 억제제는 항체 분자 또는 항체 분자의 에피토프-결합 모이어티 등일 수 있다. 항체는 광범위한 표적 항원 및 합텐에 대해 높은 결합 친화력 및 독특한 특이성을 제공한다. 본 발명의 실시에서 유용한 모노클로날 항체는 전체 항체 및 그의 단편을 포함하고, 종래의 기술, 예를 들어 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성에 따라 생성된다.
유용한 모노클로날 항체 및 단편은 임의의 종 (인간 포함)으로부터 유래될 수 있거나, 하나 초과의 종으로부터의 서열을 포함한 키메라 단백질로서 형성될 수 있다. 인간 모노클로날 항체 또는 "인간화" 쥐 항체가 또한 본 발명에 따라 사용된다. 예를 들어, 쥐 모노클로날 항체는 쥐 Fv 구역 (즉, 항원 결합 부위를 함유하는) 또는 그의 상보성 결정 구역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 불변 도메인 구역 및 Fc 구역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 유전적으로 재조합함으로써 "인간화"될 수 있다. 인간화 표적화 모이어티는 숙주 수여체에서 항체 또는 폴리펩티드의 면역반응성을 감소시켜, 유럽 특허 출원 0,411,893 A2에 개시된 것과 유사한 방식으로 반감기의 증가 및 이상 면역 반응의 가능성 감소를 허용하는 것으로 인정된다. 쥐 모노클로날 항체는 바람직하게는 인간화 형태로 사용되어야 한다. 항원 결합 활성은 항체의 가변 부분 (Fv)의 경쇄 및 중쇄 상에 (각각 3개) 위치하 는 6개의 상보성 결정 구역 (CDR)의 아미노산의 서열 및 입체형태에 의해 결정된다. 짧은 펩티드 스페이서 서열을 통해 연결된 경쇄의 가변 구역 (VL) 및 중쇄의 가변 구역 (VH)으로 이루어지는 25-kDa 단일쇄 Fv (scFv) 분자는 지금까지 개발된 가장 작은 항체 단편이다. scFv에 대한 유전자를 함유하는 섬유상 파지의 표면 상에 scFv 분자를 디스플레이하기 위해 기술이 개발되었다. 넓은 범위의 항원-특이성을 갖는 scFv 분자는 scFv-파지 라이브러리의 단일의 큰 풀 (pool) 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 고친화도 모노클로날 항체 및 그의 키메라 유도체의 몇몇 예는 유럽 특허 출원 EP 186,833; PCT 특허 출원 공개 WO 92/16553; 및 미국 특허 6,090,923에 기재되어 있다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개 이상의 세그먼트 또는 부분을 특징으로 하는 면역글로빈 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 구역은 비-인간 포유동물 항체, 예를 들어 쥐 모노클로날 항체로부터 유래되고, 면역글로빈 불변 구역은 인간 면역글로빈 분자로부터 유래된다. 바람직하게는, 두 구역 및 조합물은 일상적으로 결정될 때 낮은 면역원성을 갖는다.
scFv 분자의 한계 중 하나는 표적 항원과의 일가 상호작용이다. 표적 항원에 대한 scFv의 결합을 개선하는 가장 쉬운 방법 중 하나는 다량체의 생성을 통해 그의 기능적 친화도를 증가시키는 것이다. 디아바디 (diabody), 트리아바디 및 테트라바디를 형성하는 동일한 scFv 분자의 회합은 많은 동일한 Fv 모듈을 포함할 수 있다. 따라서, 이들 시약은 다가이지만, 단일특이적이다. 각각 상이한 모 Ig로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2개의 상이한 scFv 분자의 회합은 완전 기 능적 이중특이적 디아바디를 형성할 것이다. 이중특이적 scFv의 독특한 용도는 2개의 (인접한) 표면 에피토프를 통해 동일한 표적 분자 상의 2개의 부위에 동시에 결합하는 것이다. 이들 시약은 단일 scFv 또는 Fab 단편에 비해 유의한 친화력 잇점을 얻는다. 예를 들어, 미니항체 (miniantibody), 이량체성 미니항체, 미니바디, (scFv)2, 디아바디 및 트리아바디를 포함한 많은 다가 scFv-기반 구조가 공학처리되었다. 이들 분자는 광범위한 결합가 (2 내지 4개의 결합 부위), 크기 (50 내지 120 kDa), 유연성 및 제조 용이성을 갖는다. 단일쇄 Fv 항체 단편 (scFv)은 VH 및 VL 도메인이 적어도 12개 잔기의 폴리펩티드 링커 (linker)로 연결될 때 현저하게 단량체성이다. 모든 조건 하에 12 및 25개 아미노산 길이의 링커를 갖는 단량체 scFv는 열역학적으로 안정하다. 비공유 디아바디 및 트리아바디 분자는 공학처리하기 쉽고, 단일 scFv 분자의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결하는 펩티드 링커를 짧게 함으로써 생산된다. scFv 이량체는 높은 정도의 유연성을 부여하는 양친화성 나선에 의해 연결되고, 미니항체 구조는 이중 나선을 통해 연결된 2개의 미니항체 (4개의 scFv 분자)를 함유하는 이량체성 이중특이적 (DiBi) 미니항체를 생성하도록 변형될 수 있다. 유전자-융합된 또는 디술파이드 결합된 scFv 이량체는 중간 정도의 유연성을 제공하고, C-말단 Gly4Cys 서열을 첨가하는 직접적 클로닝 기술에 의해 생성된다. scFv-CH3 미니바디는 직접 (LD 미니바디) 또는 매우 유연한 힌지 구역을 통해 (Flex 미니바디) IgG CH3 도메인에 연결된 2개의 scFv 분자로 이루어진다. 약 80 kDa의 분자량을 가지므로, 이들 2가 구성체는 항원에 유의하게 결합할 수 있다. Flex 미니바디는 마우스에서 인상적인 종양 국재화를 보인다. 이중- 및 삼중-특이적 다량체는 상이한 scFv 분자의 회합에 의해 형성될 수 있다. 기능적 친화도의 증가는 Fab 또는 단일쇄 Fv 항체 단편 (scFv)이 이량체, 삼량체 또는 더 큰 응집체로 복합될 때 달성될 수 있다. 일가 scFv 및 Fab 단편에 비해 다가 scFv의 가장 중요한 잇점은 표적 항원에 대한 기능적 결합 친화도 (친화력)의 획득이다. 높은 친화력은 scFv 다량체가 별개의 표적 항원에 동시에 결합할 수 있는 것을 요구한다. scFv 단량체에 비해 scFv 디아바디에 대한 기능적 친화도의 획득은 유의하고, 주로 감소된 오프율 (off-rate)에서 보이고, 이는 2개 이상의 표적 항원에 대한 다중 결합 및 하나의 Fv가 해리될 때 재결합으로부터 야기된다. 그러한 scFv 분자가 다량체로 회합할 때, 이들은 단일 표적 항원에 대한 높은 친화력 또는 상이한 표적 항원들에 대해 다중 특이성을 갖도록 설계될 수 있다. 항원에 대한 다중 결합은 Fv 모듈 내의 정확한 정렬 및 배향에 의존적이다. 다가 scFvs 표적에서 완전 친화력을 위해, 항원 결합 부위는 동일한 방향을 향해야 한다. 다중 결합이 입체적으로 가능하지 않으면, 기능적 친화도에서 겉보기 획득은 증가된 재결합의 효과로 인한 것 같고, 이는 확산율 및 항원 농도에 의존한다. 그들의 특성을 개선시키는 모이어티와 컨쥬게이팅된 항체가 또한 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 그들의 생체내 반감기를 증가시키는 PEG와의 항체 컨쥬게이트가 본 발명에서 사용될 수 있다. 면역 라이브러리는 나이브 (naive) 또는 면역화시킨 동물 또는 환자의 B 림프구로부터의 가변 항체 단편을 코딩하는 유전자를 PCR 증폭시킴으로써 제조된다. 면역글로불린 유전자에 대해 또는 면역글로불린 유전자 부류에 대해 특 이적인 올리고뉴클레오티드의 조합이 사용된다. 면역글로불린 생식계열 (germ line) 유전자가 반합성 항체 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 가변 단편의 상보성-결정 구역은 축퇴 (degenerate) 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭된다. 이들 단일-포트 (single-pot) 라이브러리는 대단히 많은 항원에 대한 항체 단편이 하나의 단일 라이브러리로부터 단리될 수 있다는 잇점이 있다. 파지-디스플레이 기술이 항체 단편의 친화도를 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 새로운 라이브러리는 이미 존재하는 항체 단편으로부터 랜덤, 코돈-기반 또는 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 개별 도메인의 사슬을 나이브 레퍼토리로부터의 단편 사슬로 셔플링(shuffling)함으로써, 또는 세균 돌연변이유발 (mutator) 균주를 사용함으로써 제조된다.
별법으로, SCID-hu 마우스, 예를 들어 겐팜 (Genpharm)에서 개발된 모델이 항체 또는 그의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 다가 상호작용의 효과를 이용함으로써 생성된 새로운 종류의 고친화력 결합 분자 (펩타바디 (peptabody)로 칭함)가 고려된다. 짧은 펩티드 리간드는 반고형 힌지 구역을 통해 연골 올리고머성 매트릭스 단백질의 꼬인 코일 (coiled-coil) 조립 도메인과 융합되어, 5량체성 다가 결합 분자를 생성시킨다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 리간드 및/또는 키메라 억제제는 예를 들어, 항-리간드 항체 (Ab) 및 특이적 표적에 대하여 지정된 Ab의 화학적 연결에 의해 생산된 이중특이적 항체를 사용함으로써 조직- 또는 종양-특이적 표적을 표적으로 할 수 있다. 화학적 컨쥬게이트의 한계를 피하기 위해, 세포 표면 분자에서 리간드 및/또는 키메라 억제제에 대해 작용하는 재조합 이중특이적 단일쇄 Ab의 생산을 위해 항체의 분자 컨쥬게이트가 사용될 수 있다. 별법으로, 표적화 모이어티들에 부착된 2 이상의 활성 물질 및 또는 억제제가 투여될 수 있고, 여기서 각각의 컨쥬게이트는 표적화 모이어티, 예를 들어 상이한 항체를 포함한다. 각각의 항체는 상이한 표적 부위 에피토프 (동일한 또는 상이한 표적 부위 항원과 회합된)와 반응성이다. 물질이 부착된 상이한 항체들은 목적하는 표적 부위에서 상가적으로 축적된다. 리간드 또는 억제제를 표적 부위에 전달하기 위해 항체-기반 또는 비-항체-기반 표적화 모이어티가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조절되지 않은 또는 질병 연관 항원에 대한 천연 결합제가 상기 목적을 위해 사용된다.
Lp - PLA 2 억제제를 확인하기 위한 생물검정:
Lp-PLA2 단백질의 억제에 대한 스크린
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 피부 궤양의 치료를 위한 Lp-PLA2의 억제제의 사용에 관한 것이다. 필요한 경우에, Lp-PLA2 단백질을 억제하는 물질은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,981,252에 기재된 바와 같이 생물검정을 이용하여 평가된다. 그러한 한 분석은 재조합 Lp-PLA2 단백질에 대한 물질의 효과를 시험하는 것이다. 하나의 분석에서, 예를 들어, 재조합 Lp-PLA2는 아연 킬레이팅 컬럼, 블루 세파로스 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 컬럼을 이용하여 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 균질도로 정제된다. 정제 및 한외여 과 후에, 효소를 6 mg/ml로 4℃에서 저장할 수 있다. 분석 버퍼는 Tris-HCl (50 mM), NaCl (150 mM) 및 1 mM CHAPS (pH 7.4)를 실온에서 포함한다. 활성은 384 웰 미세적정판을 갖는 형광측정 기판 판독기를 이용하여 기질로서 N-((6-(2,4-디니트로페닐)아미노)헥사노일)-2-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노일)-1-헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염 (PED6, 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) 카탈로그 참조 D-23739)의 가수분해 시에 535 nm에서 방출의 증가에 의해 측정한다. 반응은 총 부피 10 마이크로리터의 억제제에 효소 (중량 기준으로 약 400 pM 최종) 및 기질 (5 μM 최종)의 첨가에 의해 개시시킨다.
Figure 112009076184414-PCT00046
(PED6)
본원, 예를 들어 합성의 예의 문단에 개시된 화합물을 시험하였고, IC50 값이 0.1 내지 10 nM임이 밝혀졌다.
피부 궤양
피부 궤양은 피부의 개방성 미란이다. 피부 궤양은 다양한 사건, 예를 들어 외상, 열기 또는 냉기에의 노출 (화상 및 동상), 혈액 순환의 문제, 피부마찰, 또는 부식성 물질에 대한 노출로부터의 자극에 의해 유발될 수 있다. 압력 궤양 (욕 창성 궤양 또는 욕창으로도 알려짐)은 지속적인 압력 때문에 혈액 공급이 감소된 신체의 일정 영역에서 발병하는 피부 궤양이고; 누워서 지내거나 의자에 의지해야 하는 사람들, 또는 딱딱한 보조기 (brace) 또는 석고붕대를 착용해야 하는 사람들에서 일어날 수 있다. 피부 궤양은 감염될 수 있어서, 심각한 건강 결과를 야기한다. 피부 궤양을 일으킬 수 있는 다른 건강 상태는 구강 궤양 (구내염), 만성 정맥 부전증, 당뇨병, 감염, 및 말초 혈관 질병을 포함한다. 피부 궤양은 일반적으로 염증, 감염, 및/또는 치유를 저해하는 의학적 상태에 의해 유지되고, 종종 염증이 생긴 조직의 탈락 (sloughing-off)을 동반한다.
많은 원인에도 불구하고, 피부 궤양은 다음 특징으로 표시된다: (1) 피부 영역의 완전성의 손실, (2) 세균, 진균 또는 바이러스에 의한 부위의 2차 감염, (3) 환자의 전신 약화, 및 (4) 치유 지연. 궤양의 중증도 및 깊이를 전달하기 위해 분류 시스템이 사용된다. 양호 또는 악화로 변화를 전달하는 것이 쉽다.
머크 매뉴얼 (Merck Manual) 분류 1-6기는 다음과 같다:
1기: 피부가 붉다. 아래에 놓인 조직은 연하다. 발적은 소한 압력에서 사라진다.
2기: 영역 둘레에서 피부의 발적, 종창 및 굳어짐이 존재한다. 때때로 물집이 형성된다. 때때로 표면 피부가 손실된다.
3기: 피부는 괴사성으로 된다. 피부 바로 밑의 지방이 노출될 수 있다. 피부는 그 전체 층을 통해 손실될 수 있다.
4기: 지방이 보다 많이 손실되고, 바로 밑의 근육까지 피부가 보다 많이 괴 사된다.
5기: 지방의 손실 및 아래의 근육의 괴사가 계속된다.
6기: 뼈의 자극, 골수염 (뼈의 감염)으로 진행하는 뼈 피질의 침식과 함께 뼈 파괴가 시작한다. 관절의 패혈증, 병리적 골절 또는 전신 신체 감염, 패혈증이 존재할 수 있다.
다른 피부 궤양 분류는 압력 궤양의 중증도를 등급 결정하기 위한 National Pressure Ulcer Advisory Panel (NPUAP)에서 개발된 치유를 위한 압력 궤양 스케일 (PUSH Tool)이다. 이는 시간 경과에 따라 압력 궤양 상태의 변화를 모니터링하기 위해 빠르고 신뢰가능한 툴 (tool)로서 사용된다. 사용하기 위해, 첫 번째 단계는 압력 궤양을 관찰하고 측정하는 것이다. 이어서, 궤양을 (1) 표면적, (2) 삼출물 - 삼출하는 고름, 및 (3) 상처 조직의 종류에 관하여 분류한다. 분류된 궤양의 중증도에는 스코어 (score)를 매긴다. 예를 들어, 카테고리 3 상처 조직의 종류에서: 스코어 4 - 괴사 조직 (괴사 딱지): 상처 층 또는 궤양 가장자리에 단단히 부착되고, 주변의 피부보다 더 단단하거나 더 연할 수 있는 흑색, 갈색 또는 황갈색 조직; 스코어 3 - 딱지 (slough): 선 또는 두꺼운 덩어리로 궤양 층에 부착하거나 점액성인 황색 또는 백색 조직; 스코어 2 - 육아 (granulation) 조직: 반짝이고 습한 과립형 외관의 분홍색 또는 붉은 소고기색 조직; 스코어 1 - 상피 조직: 표면 궤양에 대하여, 가장자리로부터 또는 궤양 표면 상에 섬 형태로 성장하는 새로운 분홍색 또는 반짝이는 조직 (피부); 및 스코어 0 - 밀폐된/표면 재생된: 상처는 상피 (새로운 피부)로 완전히 덮인다. 이어서, 각각의 이들 궤양 특징에 대한 하위- 스코어를 기록한다. 마지막으로, 하위-스코어를 더하여 전체 스코어를 얻는다. 전체 스코어가 작을수록, 궤양이 더 양호하다. 시간 경과에 따라 측정된 전체 스코어의 비교는 압력 궤양 치유에서 개선 또는 악화의 표시를 제공한다. 따라서, 보다 작은 전체 스코어를 향한 점진적인 경향은 궤양이 치유되고 있다는 우수한 표시이다. PUSH 툴 버전 3.0은 www.npuap.org/push3-0.htm에서 얻을 수 있다.
압력 궤양의 NPUAP 기 결정은 다음과 같다:
1기 - 압력을 가하면 희게 되지 않는 무손상 피부의 홍반이 존재한다. 이는 피부 궤양형성의 예고 병변일 수 있다.
2기 - 표피, 진피 또는 둘 모두를 포함한 부분적 피부 손실이 존재한다. 궤양은 표면적이고, 찰과상, 물집, 또는 중심부가 얕은 상처로서 존재한다.
3기 - 이는 전체 두께 피부 손실이다. 이는 아래에 놓인 근막까지 뻗을 수 있지만 그를 관통하지 않는 피하 조직에 대한 손상 또는 괴사를 포함할 수 있다. 궤양은 인접한 무손상 조직을 침식하거나 침식하지 않으면서 깊은 크레이터 (crater)로서 존재한다.
4기 - 근육, 뼈 또는 지지 구조에 대한 광범한 파괴, 조직 괴사 또는 손상이 있는 전체 두께 피부 손실이 존재한다. 힘줄 및 관절이 또한 노출되거나 관련될 수 있다. 이 기에 침식하고/하거나 궤양과 연합된 누도 (sinus tract)가 존재할 수 있다.
제3의 궤양 분류는 당뇨성 족부 궤양형성의 중증도를 등급 결정하기 위한 와그너 (Wagner) 분류이다.
등급 0 - 이전의 치유된 궤양 흉터, 때때로 전-궤양성 병변으로 불리는 압력의 영역, 또는 보호되지 않은 지점에 압력을 가하는 뼈 변형의 존재가 있는 피부.
등급 1-A - 상처는 특성상 표면적이고, 부분 또는 전체-두께 피부 관련을 갖지만 힘줄, 관절낭 또는 뼈를 포함하지 않는다.
등급 1-B - 위에서와 같이 상처는 특성상 표면적이고, 부분 또는 전체 두께 피부 관련을 갖지만 힘줄, 관절낭 또는 뼈를 포함하지 않지만; 상처는 감염된다. 상기 상처의 정의는 아래에 놓인 구조의 관련이 없는 표면적인 감염을 의미한다. 상처가 상당한 화농 또는 파동 (fluctuance)의 증후를 보이면, 보다 높은 등급 분류의 감염을 드러내기 위한 추가의 진찰이 적절하다.
등급 1-C - 위와 같지만 혈관이 손상된다.
등급 1-D - 위와 같지만 허혈 (ischemia)이 있다. 허혈은 일종의 혈관 손상이기 때문에, 이들 2개의 등급 사이의 구분은 종종 어렵다.
등급 2-A - 힘줄 또는 인대를 드러내지만 뼈를 드러내지 않는 피하 조직을 통한 관통.
등급 2-B - 힘줄 또는 인대 및 심지어 관절낭을 포함하지만 뼈를 포함하지 않는 심부 조직을 통한 관통.
등급 2-C - 상기 2B와 같지만 허혈을 포함한다.
등급 2-D - 상기 2C와 같지만 감염을 포함한다.
등급 3-A - 뼈에 들어가지만 국소 감염 또는 전신 감염의 징후를 보이지 않는 상처.
등급 3-B - 뼈에 들어가고 감염된 상처.
등급 3-C - 뼈에 들어가고 감염되고 허혈성인 상처.
등급 3-D - 활성 감염, 허혈 조직 및 노출된 뼈를 특징으로 하는 뼈에 들어간 상처.
등급 4 - 앞발의 괴저
등급 5 - 전체 발의 괴저
당뇨성 궤양의 텍사스 대학 (The University of Texas) 분류를 아래에 제시한다.
0 I II III
A 때때로 전-궤양성 병변으로 불리는 압력의 영역 힘줄, 관절낭 또는 뼈를 포함하지 않는 표면적인 궤양 힘줄, 관절낭을 포함하지만 뼈를 포함하지 않는 심부 궤양 뼈 및 관절을 포함하는 심부 궤양
B 감염 감염 감염 감염
C 허혈 허혈 허혈 허혈
D 감염 + 허혈 감염 + 허혈 감염 + 허혈 감염 + 허혈
피부 궤양의 원인
피부 궤양은 많은 질병, 질환 및 외상으로부터 직접 또는 간접적으로 야기될 수 있고, 종종 질병, 질환 및 외상의 조합으로부터 발생할 수 있다. 피부 궤양의 원인은 혈관성 (정맥성, 동맥성, 림프성, 혈관염), 신경병증성 (예를 들어, 당뇨병, 척추갈림증, 나병), 대사성 (예를 들어, 당뇨병, 통풍), 결합 조직 질병 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 피부경화증, 전신 홍반 루푸스), 혈액학적 질병 (적혈구 질환 (예를 들어, 겸상적혈구 질병); 백혈구 질환 (예를 들어, 백혈병); 혈소판 질환 (예를 들어, 혈소판증가증), 면역학적 (예를 들어, 자가면역 질병 및 다른 염증 성 질환: 류마티스성 관절염, 피부경화증, 전신 홍반 루푸스; 이상 면역 반응: 괴저성 농피증), 이상 단백질혈증 (예를 들어, 한랭글로불린혈증, 아밀로이드증), 면역결핍 (예를 들어, HIV, 면역억제 요법), 종양성 (예를 들어, 기저세포 암종, 편평세포 암종, 전이성 질병), 감염 (세균, 진균, 바이러스), 기생충 감염 (피부 리슈만편모충증 (leishmaniasis)), 지방층염 (예를 들어, 유지방성 생괴사 - 반짝이는 위축성 병변이 다리에 발생하는 때로 당뇨병과 연관되는 병태), 외상성 (예를 들어, 압력 궤양, 방사선 손상), 의원성 (예를 들어, 약물/약물 치료), 인위성 (예를 들어, 자해, "인공 피부염" 및 정신병), 및 미지의 병인의 질병 및 질환 (예를 들어, 사코이드증 - 비건락성 (noncaseating) 상피모양 세포 결절의 모든 침범된 조직에 존재한다는 특징을 갖는, 거의 임의의 장기 또는 조직을 포함하는 만성, 진행성, 전신성 육아종성 세망증)일 수 있다 (Grey, J. E., et. al., 2006, BMJ 332: 285-288).
정맥성 궤양은 혈관 폐색성 또는 정맥성 질병에 의해 야기되고, 혈액이 다리 정맥에 고이도록 하는 다리를 통한 불충분한 혈류로부터 생성된다. 이어서, 압력이 정맥 및 모세혈관 내에서 증가한다. 증가된 압력은 유체를 혈관으로부터 주변 조직으로 누출시키고, 종창이 발생한다. 궁극적으로, 종창은 모세혈관으로부터 조직으로 산소 및 영양분의 이동을 저해한다. 조직이 산소 및 영양분이 결핍되기 때문에 및 누출된 유체가 그에 압력을 가하기 때문에 손상된다. 그 결과, 정맥성 궤양이 형성될 수 있다. 정맥성 궤양은 주로 다리 내의 정맥이 손상된 후 하지에서 발달한다. 이들 궤양은 피부 내로 깊이 관통할 수 있다.
혈액이 다리 정맥 내에 고이도록 하는 임의의 질환은 정맥성 궤양을 일으킬 수 있다. 정맥류성 정맥 또는 혈괴에 의해 차단된 정맥 (심정맥 혈전증)이 손상될 수 있어서, 혈액이 고이도록 한다. 다리 정맥에 대한 그러한 손상은 만성 정맥 부전증으로 불린다. 그 예는 울혈성 심부전증, 비만, 신부전증, 항인지질-항체 증후군, 청피반양 (livedoid) 혈관병증, 정맥내 저류, 소-혈관 폐색 동맥성 질병, 타입 I 한랭글로불린혈증 또는 왈덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 및 클리펠-트레나우내이-웨버 (Klippel-Trenaunay-Weber) 증후군을 포함하지만 이로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
정맥성 궤양은 고령자들에서 비교적 흔하다. 정맥성 궤양은 쉽게 감염된다. 때때로, 정맥성 궤양이 장기간 지속하면, 가장자리에서 피부암이 발생한다. 정맥성 궤양에 감수성인 영역은 발 및 다리이고, 아래에 놓인 혈관 기능부족에 의해 야기된다. 반복된 외상 때문에 피부는 파괴되거나 치유되지 못한다. 손발톱의 균등한 압력이 조갑하 궤양형성을 유발할 수 있다. 이들은 손상으로부터 치유 가능성이 매우 낮은 당뇨 환자에게서 가장 빈번하게 일어난다.
혈관염 (복수의: 혈관병증)은 백혈구 이동 및 결과의 손상으로 인한 혈관 벽의 염증을 특징으로 하는 질병의 군이다. 인체의 가장 큰 혈관 (대동맥)으로부터 피부 내의 가장 작은 혈관 (모세혈관)까지 모든 크기의 혈관이 침범받을 수 있다. 침범된 혈관의 크기는 혈관염의 특정한 종류에 따라 변한다. 손상된 혈관은 허혈 조직에 이어 조직 괴사를 일으킨다.
피부 궤양을 생성시킬 수 있는 혈관병증의 예는 베게너 (Wegener) 육아종증, 결절성 다발동맥염, 한랭글로불린혈성 (혼합형) 혈관염, 다카야수 (Takayasu) 동맥염, 및 백혈구파괴 혈관염을 포함한다.
만성 비치유 피부 궤양이 많은 암에서 관찰되었다: 기저세포 암종 - 다리 궤양 ([Phillips TJ, et. al. 1991, J Am Acad Dermatol. Jul;25(1 Pt 1):47-9]; [Conde-Taboada A, et. al. 2006 J Eur Acad Dermatol Venereol. Mar;20(3):359]), 림프종 - 혈관중심성 T-세포 림프종, 역형성 대세포 T-세포 림프종, 및 수포성 균상식육종, 피부 백혈병, 및 랑게르한스 (Langerhan's) - 세포 조직구증.
각종 병원체에 의한 피부 감염이 또한 피부 궤양을 일으킬 수 있다. 그 예는 심재성 진균 감염: 스포로트리쿰증 (Sporotrichosis), 아스페르길루스증 (Aspergillosis), 크립토콕쿠스증 (Cryptococcosis), 접합균증 (Zygomycosis), 페니실리움 마르네페이 (Penicillium marneffei) 감염; 제2형 단순 포진 바이러스, 피부 결핵, 및 피부 아메바증 (amebiasis cutis)을 포함한다.
피부 리슈만편모충증은 물린 부위에 기생충인 피부 리슈만편모충 (Leishmania tropica) 또는 큰 리슈만편모충 (Leishmania major)을 옮기는 모래파리에 물림으로써 야기되는 피부 궤양이다. 피부 리슈만편모충은 주로 지역에서 발견되고, 큰 리슈만편모충은 건조한 사막 지역에서 발견된다.
당뇨병은 고혈당증 (고혈당)을 특징으로 하는 대사성 질환이다. 당뇨병은 많은 합병증을 유발할 수 있고, 이 중에서 신경 손상 (신경병증) (여러 종류의), 미세혈관 손상, 및 불량한 치유는 종종 다리 및 발에서 피부 궤양을 발생시킨다. 발바닥이 당뇨병에서 특히 피부 궤양의 경향이 있다.
혈액 글루코스 수준의 만성적인 상승은 혈관 손상을 유발한다. 당뇨병에서, 그로 인해 발생하는 문제는 "미세혈관 질병" (작은 혈관에 대한 손상으로 인한) 및 "거대혈관 질병" (동맥에 대한 손상으로 인한)으로 분류된다.
대체로 '장갑 및 양말 (glove and stocking)' 착용 부위에서의 당뇨성 신경병증인 비정상적이고 저하된 감각은 발에서 시작하지만, 잠재적으로 다른 신경, 추후에 종종 손가락 및 손에서 발생한다. 손상된 혈관과 함께 발생하면, 이것은 당뇨성 발을 유발할 수 있다.
종종 신경병증 및 동맥 질병의 조합에 의한 당뇨성 발은 피부 궤양 및 감염 및, 심각한 환자에서 괴사 및 괴저를 유발할 수 있다. 이것은 선진국에서 대체로 성인의 발가락 및/또는 발의 절단의 가장 흔한 원인이다.
특히 발에 생긴 상처의 불량한 치유는 절단을 필요로 할 수 있는 괴저를 유발할 수 있고, 이는 선진국 성인의 비-외상성 절단의 주원인이다. 적절한 당뇨병 치료, 및 혈압 조절 및 생활방식 인자 (예를 들어)에 대한 주의 환기는 대부분의 상기 언급된 합병증의 위험 프로필을 개선시킬 수 있다 (Nathan DM, et. al. N Engl J Med 2005; 353:2643-53. PMID 16371630).
자기원인성 (self-caused) 피부 궤양은 정신병, 예를 들어 우울증, 문하우젠 (Munchausen) 증후군, 및 인공 (인위성) 질환의 발생시에 발생할 수 있다. 인공 질환이 있는 사람들은 인공 피부염을 경험하고, 이에 의해 사람들은 임의의 방법에 의해 그 자신의 피부를 손상시킨다. 이들은 손톱 또는 칼 또는 다른 예리한 도구로 피부를 긁거나, 담배, 성냥불 또는 촛불과 같은 불로 피부를 태우거나, 부식성 화학물질, 예를 들어 표백제로 피부를 태움으로써 그들의 피부를 손상시킬 수 있다. 이들은 자신이 스스로 손상을 유발하고 있음을 인지하거나 인지하지 않을 수 있지만, 일반적으로 고의로 손상을 초래하였음을 부인한다.
또한, 피부 궤양형성은 특정 약물 (의원성 궤양)과 연관될 수 있고, 예를 들어 히드록시우레아-유발 궤양형성 (히드록시우레아는 항대사물질로 불리는 화학요법 약물의 일반적인 군에 속함), 브롬발진 (bromoderma) (항경련 약물 치료에서 브로마이드에 대한 과민증에 의한 여드름 모양 또는 육아종 발진) 및 약물-유발 루푸스가 있다. 만성 골수성 백혈병 및 혈액 질환, 예를 들어 겸상적혈구성 빈혈)의 치료에 사용된다.
몇몇 염증성 질환, 예를 들어 피부 크론 (Crohn) 병, 궤양성 유지방성 생괴사, 괴저성 농피증, 전신 홍반 루푸스, 및 수포성 경피증 (Bullous morphea)이 피부 궤양과 관련된다.
또한, 피부 궤양형성은 외부 조직 손상 (외상), 예를 들어 접촉성 외음염 (외음염은 여성 외부 생식기 (외음부)의 염증이다), 2차 감염을 일으키는 주사-약물 남용, 록소셀레즈 거미 물림증 (loxoscelism) (갈색 은둔자 거미 (brown recluse spider)의 교상), 괴저성 농피증에서 종종 관찰되는 이상 초과민 (피부 외상 후 염증 반응의 유도), 및 압력 궤양 (모든 외상 관련 피부 궤양형성 중에서 가장 의학적으로 유의함)과 연관될 수 있다. 고열 (화상) 및 극심한 냉기 노출 (동상)도 피부 궤양형성을 야기할 수 있다.
압력 궤양 (욕창 또는 욕창성 궤양으로도 알려짐)은 체중을 옮기지 않으면서 너무 오랫동안 한 자세로 있을 때 파괴되는 피부의 영역이다. 이는 휠체어를 사용하거나 누워서 생활해야 하는 경우에 심지어 짧은 기간 동안에라도, 예를 들어 수술 또는 손상 후에 종종 일어난다. 피부에 대한 지속적인 압력은 그 영역으로 혈액 공급을 감소시키고, 침대와 같은 저항 표면의 마찰은 혈류를 감소시키면서 영역을 자극하고, 침범된 조직이 죽는다.
압력 궤양은 붉어진 피부로서 시작하지만, 점진적으로 악화하여 물집, 이어서 개방성 미란, 마지막으로 크레이터를 형성한다. 압력 궤양의 가장 일반적인 위치는 팔꿈치, 뒤꿈치, 엉덩이, 발목, 어깨, 등 및 뒤통수처럼 근육 및 지방이 덜 분포되어 있는 뼈의 돌출부위 위이다.
움직일 수 없는 환자는 동일한 엎드린 자세로 장시간 누워있을 때 압력 미란이 형성되기 쉽다. 피부 궤양이 발생할 위험이 있는 그러한 환자의 예는 당뇨, 양쪽 하반신 마비, 전신마비, 고령, 움직임 및/또는 협응 (coordination) 장애가 있는 개체, 예를 들어 신경학적 결함, 예를 들어 뇌성마비 및 척추갈림증이 있는 대상체, 신경근육 질병, 예를 들어 근위축성 측색 경화증 (ALS) 및 다발 경화증 (MS)이 있는 대상체, 자가면역 질병, 예를 들어 피부경화증이 있는 대상체, 및 화상 환자를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
피부 궤양을 포함한 질병 및 질환의 치료
혈관염의 현재의 치료는 스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론, 코르티손 및 시클로포스파미드)를 사용하여 염증을 표적으로 한다. 면역억제제, 예를 들어 시클로포스파미드 및 아자티오프린이 또한 투여될 수 있다. 염증성 질병의 치 료에서 면역억제제가 또한 사용된다.
펜톡시필린은 정맥성 피부 궤양에 대한 표준 약물 치료제이다. 압박 스타킹을 사용한 표준 치료와 조합으로, 경구 펜톡시필린은 정맥성 피부 궤양 치유를 개선하기 위해 사용된다. 펜톡시필린 혈액의 점성 또는 "점착성"을 감소시켜, 혈액 순환을 개선시킨다. 펜톡시필린은 또한 신체에서 염증을 감소시키고, 이는 또한 궤양 치유를 도울 수 있다.
1형 당뇨병의 치료에서는 인슐린을 사용하고, 2형 당뇨병에서는 경구 항당뇨 약물 또는 경구 혈당강하제를 사용한다. 약물은 일반적으로 혈액 내의 글루코스 수준을 저하시킴으로써 작용한다.
술포닐우레아는 최초로 널리 사용된 경구 혈당강하 약물 치료제였다. 이들은 인슐린 분비촉진제이고, 췌장 베타 세포의 KATP 채널에 직접 작용하여 인슐린 방출을 촉발한다. 분비촉진제는 다른 물질을 분비시키는 물질이다. 술포닐우레아는 인슐린의 내인성 방출을 자극함으로써 작용하므로 II형 당뇨병에서만 유용하다. 술포닐우레아의 예는 톨부타미드 (오리나제 (Orinase)); 아세토헥사미드 (다이멜러 (Dymelor)); 톨라자미드 (톨리나제 (Tolinase)); 클로르프로파미드 (다이아비네스 (Diabinese)); 글리피지드 (글루코트롤 (Glucotrol)); 글리부라이드 (다이아베타 (Diabeta), 마이크로나제 (Micronase), 글리나제 (Glynase)); 글리메피리드 (아마릴 (Amaryl)); 글리클라지드 (디아미크롱 (Diamicron))을 포함하고 이로 제한되지 않는다
아밀린 유사체, 예를 들어 프람린티드 (Pramlintide); 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP-4) 억제제 (빌다글립틴, 시타글립틴); 인크레틴 (Incretin) 모방 GLP 유사체, 예를 들어 엑센딘 (Exendin)-4; 알파 글루코시다제 억제제 - 미글리톨 (글라이셋 (Glyset)) 및 아카르보스 (프레코스 (Precose)/글루코바이 (Glucobay)); 비구아니드 - 메트포르민 (글루코파지 (Glucophage)); 메글리티니드 - 레파글리니드 (프란딘 (Prandin)) 및 나테글리니드 (스타릭스 (Starlix)); PPARα/γ 리간드 (무라글리타자르, 테사글리타자르 및 티아졸리딘디온 - 로지글리타존 (아반디아 (Avandia)), 피오글리타존 (액토스 (Actos)) 및 트로글리타존 (레줄린 (Rezulin)); SGLT (나트륨-의존 글루코스 수송체 1) 억제제; 및 FBPase (프룩토스 1,6-비스포스파타제) 억제제 ([Lebovitz HE. Therapy for Diabetes Mellitus and Related Disorders. 4th edition. Alexandria: American Diabetes Association, 2004] 참조).
기저세포 암종에 대한 요법은 광역학 요법을 포함한다 (종양은 크림 (예를 들어 Metvix) 또는 로션 형태의 광감작 화학물질을 사용하고, 수시간 후에 광에 노출시켜 치료된다). 국소 이미퀴모드 (imiquimod) 크림, 냉동요법 (동결), 및 방사선요법 (X-선 치료)을 이용하여 85％까지의 표면 기저세포 암종이 뛰어난 미용 결과를 가지면서 치유된다.
피부 리슈만편모충증에 대한 표준 치료는 5가 안티몬이다. 다른 약물 치료는 암포테리신 B (펑기존 (Fungizone)) (5가 안티몬 실패에 대한 예비제), 펜타미딘 이세티오네이트 (Pentam 300), 및 국소 파로모마이신을 포함한다.
압력 궤양의 치유 및 치료는 문헌 ([Brillhart B. Rehabil Nurs. 2005; 30(3): 85-91]; [de Laat EH, et. al. J Clin Nurs. 2005; 14(4): 464-472]; 및 [Cole L and Nesbitt C. Ostomy Wound Manage. 2004; 50(11): 32-40])에서 찾을 수 있다.
본 발명의 한 실시태양은 항미생물 요법, 항기생충 요법, 항비만 요법, 당뇨병 요법, 심혈관 질병 요법, 신부전증 요법, 혈관염 요법, 정맥 부전증 요법, 동맥 부전증 요법, 암 요법, 면역억제 요법, 면역결핍증 요법, 스테로이드 요법 및 정신요법과 조합하여 Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 사람들에서 피부 궤양의 치료 및/또는 예방을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 것을 포함하는, 누워서 생활해야 하거나 휠체어를 타야하는 사람들에서 압력 궤양의 치료 및/또는 예방을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 것을 포함하는, 화상 또는 동상을 입은 사람들에서 피부 궤양치료 및/또는 예방을 포함한다.
피부 궤양의 치료
피부 궤양 관리는 약물 치료, 예를 들어 항균, 항진균, 항기생충 및 항바이러스 약물, 혈전용해제 또는 혈괴-제거제, 예를 들어 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 압박 붕대의 사용, 생물공학적으로 처리된 피부 대체물 (예를 들어, 배양된 표피 동종이식편-Apligraf), 전기 자극, 최신 약물 전달 시스템, 예를 들어 이온도 입법-기반 경피 전달 시스템, 조직 수복을 촉진하는 물질, 예를 들어 혈소판 유래 및 자가 성장 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (G-M CSF) 및 메소글리칸의 국소화된 전달, 음압 상처 치료, 및 초음파를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시태양은 항-병원체 약물 치료, 혈전용해제, 압박 붕대의 사용, 생물공학적으로 처리된 피부 대체물, 전기 자극, 최신 약물 전달 시스템, 조직 수복 촉진 요법의 국소화된 전달, 음압 상처 치료, 및 초음파를 포함하지만 이로 제한되지 않는 상처 관리와 조합으로 Lp-PLA2의 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 것을 포함하는, 피부 궤양이 있는 대상체에서 피부 궤양의 치료이다.
피부 궤양을 발병하는 위험 인자
본 발명의 한 실시태양은 피부 궤양을 발병할 위험이 있는 사람들에서 피부 궤양을 예방하는 것이다. 피부 궤양을 발병할 위험이 있는 사람에 관한 판단에는 피부 궤양형성에 기여할 수 있는 위험 인자를 확인하는 것이 필요하다.
피부 궤양은 매우 많은 질병, 질환 및 외상과 그의 조합에 의해 유발될 수 있으므로, 피부 궤양을 발병할 위험을 증가시키는 많은 인자가 존재한다. 이들 인자는 상기 개시한 질병 또는 질환 또는 외상과 연관된 피부 궤양의 과거 에피소드가 있음, 고령, 보조 없이 신체의 특정 부분을 움직이지 못함, 예를 들어 척추 또는 뇌 손상 후에 누워서 생활해야 하거나 휠체어를 타야하거나, 또는 신경근육 질병 (다발 경화증과 같이)이 있거나, 영양실조 (특히 불충분한 단백질), 신체 활동의 결핍, 과도한 알콜 사용, 신체의 영역이 상기 개시한 바와 같이 적절한 혈류를 받지 못하도록 하는 만성 병태, 예를 들어 당뇨병에 걸리거나; 요실금 또는 대변 실금 (장기간 동안 피부에 가까운 습기는 피부 파괴를 일으킬 수 있는 피부 자극을 야기할 수 있다), 취약 피부, 알츠하이머 (Alzheimer)병과 같은 병태로부터 정신 장애 (환자는 압력 궤양을 적절하게 예방 또는 치료할 수 없다), 흡연, 당뇨병으로 진단됨, 고혈압 및/또는 높은 수준의 호모시스테인, 과체중 (이상적인 체중보다 30％를 초과함), 정맥류성 정맥의 가족력, 특히 내부 대퇴에서 위로 향하는 복재 (saphenous) 정맥에서 역혈류가 또한 존재하는 경우, 혈액이 너무 많이 엉기는 경향이 있는 과응고 상태 또는 혈전기호증과 같은 혈액 응고 질환으로 진단됨, 장시간 서있어야 하는 직업이 있음, 겸상적혈구성 빈혈에 걸림, 항경련 요법을 위해 브롬화칼륨과 같은 브로마이드-함유 약물 치료를 받고 있음, 및 신부전증을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
압력 궤양의 예측 및 예방에 대한 완전한 지침은 문헌 [Clinical Practice Guideline Number 3, 1992, AHCPR Pub. No. 92-0047 by the Agency for Health Care Policy and Research (AHCPR)]에서 찾을 수 있다.
하나의 위험 인자를 갖는 것은 대상체가 피부 궤양을 발병하여 Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 물질로 치료받을 것임을 의미하지는 않지만, 위험 인자들의 조합을 갖는 것은 대상체가 대상체의 생애 동안 궁극적으로 적어도 하나의 피부 궤양을 발병할 기회를 확실히 증가시킬 것이다. 2 이상 또는 3 이상의 위험 인자들의 조합을 갖는 대상체는 담당의가 본원에 개시된 방법에 의한 치료 및/또는 예방을 위한 후보로서 간주해야 한다. 예를 들어, 고령이고, 당뇨가 있고, 정신 능력이 감소된 대상체, 또는 비만이고 움직일 수 없는 대상체는 본원에 개시된 치료를 위한 각각의 후보이다.
그러나, 그 자체로 개별적인 위험 인자를 갖는 대상체에서 피부 궤양이 아마도 발생할 것이라는 매우 우수한 표시자인 일부 위험 인자가 존재한다. 이들은 "고위험" 인자로 간주된다. 이들은 당뇨병, 혈관염, 나병, 누워서 생활해야 하거나 휠체어를 타야하는 것, 화상 또는 동상, 히드록시우레아-기반 화학요법을 받는 것, 및 질병/질환-관련 피부 궤양의 과거 병력을 포함한다. 단연 가장 유의한 위험 인자는 피부의 한 부분 상에 지속적인 압력이 존재하는 당뇨병, 혈관염 (자가면역 질병), 죽상동맥경화증, 누워서 생활해야 하는 것 및 휠체어를 타야하는 것이다. 이들 인자가 있는 대상체는 담당의가 본원에 개시된 본 발명의 방법에 의한 치료 및/또는 예방을 위한 후보로서 간주해야 한다.
조성물의 제제화
본원에 개시된 화합물, 예를 들어, Lp-PLA2를 억제하는 물질은 의약으로서 사용되거나 본원에 개시된 하나 이상의 효용을 갖는 제약 조성물을 제제화하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 배양액 내의 세포에 시험관 내로, 인체 내의 세포에 생체 내로, 또는 동일한 개체 또는 다른 개체의 신체로 나중에 되돌아갈 수 있는 개체 외부의 세포에 생체 외로 투여될 수 있다. 그러한 세포는 분해되거나 고형 조직으로서 제공될 수 있다.
본원에 개시된 화합물, 예를 들어 Lp-PLA2를 억제하는 물질은 의약 또는 다른 제약 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 조성물을 개체에게 전달하기 위해 유용한 성분을 더 포함하는 제약상 허용되는 담체 및 조성물을 더 포함하는 Lp-PLA2를 억제하는 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 담체 및 다른 성분을 본원에 개시된 물질에 첨가하는 것은 당업계의 기술 수준 내에 있다.
제약 조성물은 혈액-뇌 장벽을 통과하기 위해 또는 내피와 직접 접촉하도록 채택된 제형으로서 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 전신 전달을 위해 채택된 제형으로서 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 특수한 장기, 예를 들어 비제한적으로 간, 비장, 골수, 및 피부로의 전달을 위해 채택된 제형으로서 투여될 수 있다.
별법으로, 제약 조성물은 세포 외에서 세포의 배양 배지에 첨가될 수 있다. 활성 화합물에 추가로, 그러한 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 투여를 촉진하고/하거나 흡수를 증진시키는 것으로 공지된 다른 성분을 함유할 수 있다 (예를 들어, 염수, 디메틸 술폭시드, 지질, 중합체, 친화도-기반 세포 특이적-표적화 시스템). 지속적인 국소 방출을 위해 조성물은 겔, 스폰지, 또는 다른 투과성 매트릭스 (예를 들어, 펠렛 또는 디스크 (disk)로서 형성된) 내에 포함되고 내피에 근접하게 놓일 수 있다. 조성물은 단일 용량으로 또는 상이한 시간에 투여되는 다수 용량으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 임의의 공지의 경로로 투여될 수 있다. 예로서, 조성물은 점 막, 폐, 국소, 또는 다른 국소화 또는 전신 경로 (예를 들어, 장내 및 비경구)로 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 구문 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 대체로 주사에 의해 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 뇌실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척추내, 뇌척수내, 및 흉골간 주사, 주입 및 비제한적으로 다른 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본원에서 사용될 때, 구문 "전신 투여", "전신 투여되는", "말초 투여" 및 "말초로 투여되는"은 동물의 시스템 내로 들어가 대사 및 다른 유사한 과정을 거치게 되는 본원에 개시된 물질의 투여, 예를 들어, 피하 투여를 의미한다.
구문 "제약상 허용되는"은 본원에서 분별있는 의학적 판단 내에서, 이익/위험비에 잘 맞는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 위해 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 나타내도록 사용된다.
본원에서 사용될 때, 구문 "제약상 허용되는 담체"는 대상 물질을 하나의 장기 또는 신체의 일부로부터 다른 장기 또는 신체의 일부로 옮기거나 전송하는데 관여되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 적합성인 의미에서 "허용되어야" 하고, 예를 들어 담체는 치료에 대한 물질의 효과를 감소시키지 않는다. 즉, 담체는 제약상 불활성이다.
투여의 양 및 시기, 제형 및 투여 경로에 대한 적합한 선택은 피부 병변 또 는 그의 위험이 있는 대상체에서 유리한 반응을 달성하고 (즉, 효능), 그에 대한 과도한 독성 또는 다른 해를 피하는 (즉, 안전성) 목표를 갖고 이루어질 수 있다. 따라서, "효과적인"은 목적하는 효과를 달성하기 위한 조건들의 일상적인 조작을 포함하는 선택을 나타낸다.
짧은 시간에 걸쳐 1일 1회로 개체에게 투여되는 제형의 볼러스 (bolus)가 편리한 투여 스케쥴이다. 별법으로, 유효 1일 용량은 투여의 목적으로 다수 용량으로, 예를 들어, 1일 2 내지 12회 용량으로 나누어질 수 있다. 또한, 제약 조성물 내의 활성 성분의 투여 수준은 대상체에서 화합물 또는 그의 유도체의 일시적인 또는 지속적인 농도를 달성하고 목적하는 치료 반응 또는 보호를 유도하기 위해 상이할 수 있다. 그러나, 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 용량을 시작하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키는 것도 당업계의 기술에 포함된다.
Lp-PLA2를 억제하는 물질의 용량은 당업자에게 공지된 인자, 예를 들어 화합물의 생활성 및 생체이용률 (예를 들어, 체내 반감기, 안정성 및 대사); 화합물의 화학적 특성 (예를 들어, 분자량, 소수도 및 용해도); 투여 경로 및 스케쥴 등에 따라 결정된다. 임의의 특정 개체에 대해 결정되는 특정한 용량 수준은 연령, 성별, 건강, 의료력, 체중, 하나 이상의 다른 약물과의 조합 및 질병의 중증도를 포함한 다양한 인자에 따라 결정될 수 있음도 이해될 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 Lp-PLA2를 억제하는 물질은 다른 물질, 예를 들어 피부 궤양의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제 또는 피부 궤양과 연관된 질병 및 질환의 치료에 사용되는 치료제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 물질은 펜톡시필린 (정맥성 피부 궤양) 및 술포닐우레아 (당뇨병)를 포함한다.
따라서, Lp-PLA2를 억제하는 하나 이상의 물질과 하나 이상의 다른 의학적 절차의 조합 치료를 실시할 수 있다.
또한, 치료는 Lp-PLA2 발현 또는 활성을 억제하기 위한 다수의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다른 물질은 니아신 (www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568 참조) 및 페노피브레이트 (www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756&taxid=19 참조)와 함께 스타틴의 사용을 포함한다.
대상체에게 투여되는 양은 바람직하게는 그의 투여로 인한 잇점보다 큰 독성 효과를 유발하지 않는 양이다. 추가의 목적은 승인된 치유 표준에 비해 개체에서 수의 감소, 중증도의 감소, 및/또는 질병의 증상으로 인한 고통의 경감이다.
현재 규정에 따른 화합물의 제조는 우수 실험실 운영 기준 (GLP) 및 우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준 (GMP)을 위해 정부 기관 (예를 들어, 미국 FDA)에 의해 규제될 것이다. 이것은 정확하고 완전한 기록 유지 및 QA/QC의 모니터링을 필요로 한다. 또한, 고지에 의한 동의서 (informed consent)를 접수하고, 제품의 안전성, 생활성, 적절한 용량, 및 효능이 기별로 연구되고, 결과가 통계적으로 유의하고, 윤리적 기준이 준수됨을 확실하게 하기 위해 기관 및 연구 패널에 의한 환자 프로토콜의 감독이 계획된다. 동물 모델 사용, 및 독성 화학물질의 사용 프로토콜, 및 규정 준수에 대한 유사한 감독도 필요하다.
Lp-PLA2 발현 및/또는 활성의 억제를 목표로 하는 결과를 분석하기 위한 용량, 제제화, 투여 부피, 투여 계획, 및 방법도 변할 수 있다. 따라서, 최소 및 최대 유효 용량은 투여 방법에 따라 상이하다. 피부 병변의 증상 또는 중증도는 특이적 용량 범위 내에서 억제할 수 있지만, 상기 용량은 해당 용량의 투여 대상체, 투여 경로, Lp-PLA2를 억제하는 물질이 다른 동시 자극 분자와 함께 투여되는지의 여부, 및 Lp-PLA2 억제제의 특이적 투여 계획에 따라 상이하다. 예를 들어, 일반적으로, 국소 또는 비내 투여는 경구, 장내, 직장, 또는 질내 투여보다 더 적은 용량을 필요로 한다.
본 발명에서 사용하기 위한 경구 또는 장내 제제를 위해, 정제는 당업계에 잘 공지된 고체 담체를 사용하는 종래의 절차에 따라 제제화될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 경구 제제를 위해 사용되는 캡슐은 임의의 제약상 허용되는 물질, 예를 들어 젤라틴 또는 셀룰로스 유도체로부터 제조될 수 있다. 또한, 경구 투여되는 투여 형태를 위한 지효성 경구 전달 시스템 및/또는 장용 코팅 (enteric coating), 예를 들어 미국 특허 4,704,295 ("Enteric Film-Coating Compositions", 1987년 11월 3일 등록); 미국 특허 4,556,552 ("Enteric Film-Coating Compositions", 1985년 12월 3일 등록); 미국 특허 4,309,404 ("Sustained Release Pharmaceutical Compositions", 1982년 1월 5일 등록; 및 미국 특허 4,309,406 ("Sustained Release Pharmaceutical Compositions", 1982년 1월 5일 등록)에 기재된 것도 고려된다.
고체 담체의 예는 전분, 당, 벤토나이트, 실리카, 및 통상 사용되는 다른 담체를 포함한다. 본 발명의 제제에 사용될 수 있는 담체 및 희석제의 추가의 비제한적인 예는 염수, 시럽, 덱스트로스, 및 물을 포함한다.
장용 코팅 제제
본원에 개시된 화학식 I - IV의 Lp-PLA2의 억제제의 작은 화학적 엔티티를 투여하기 위한 제제에 대해, 특히 유용한 한 실시태양은 장용 중합체 외피 (enteric polymer casing)와 함께 Lp-PLA 억제제를 포함하는 정제 제제이다. 상기 제제의 예는 WO2005/021002에서 볼 수 있다. 코어 내의 활성 물질은 미립화 또는 가용화 형태로 존재할 수 있다. 활성 물질 이외에, 코어는 압축 정제 기술에 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제 내의 적절한 첨가제는 희석제, 예를 들어 무수 락토스, 락토스 일수화물, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 제2 인산칼슘 또는 이들의 혼합물; 바인더, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 예비-젤라틴화 전분 또는 검 아카시아 또는 이들의 혼합물; 붕해제, 예를 들어 미정질 셀룰로스 (바인더와 붕해제 기능을 모두 수행) 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 나트륨 또는 그의 혼합물; 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 활택제 또는 유동 조제, 예를 들어 콜로이드성 실리카, 탈크 또는 전 분, 및 안정화제, 예를 들어 건조 무정형 실리카, 착색제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 정제는 락토스를 희석제로서 포함한다. 바인더가 존재할 경우, 이는 바람직하게는 히드록시프로필메틸 셀룰로스이다. 바람직하게는, 정제는 스테아르산마그네슘을 윤활제로서 포함한다. 바람직하게는, 정제는 크로스카르멜로스 나트륨을 붕해제로서 포함한다. 바람직하게는, 정제는 미정질 셀룰로스를 포함한다.
희석제는 코어의 10-80 중량％의 범위로 존재할 수 있다. 윤활제는 코어의 0.25-2 중량％의 범위로 존재할 수 있다. 붕해제는 코어의 1-10 중량％의 범위로 존재할 수 있다. 미정질 셀룰로스는 존재하는 경우에 코어의 10-80 중량％의 범위로 존재할 수 있다.
활성 성분은 바람직하게는 코어의 10 내지 50 중량％, 보다 바람직하게는 15 내지 35 중량％를 구성한다 (유리 염기 균등물로서 계산됨). 코어는 임의의 치료상 적합한 투여 수준의 활성 성분을 함유할 수 있고, 바람직하게는 활성 성분의 유리 염기로서 150 mg 이하를 함유한다. 특히 바람직하게는, 코어는 활성 성분의 유리 염기로서 20, 30, 40, 50, 60, 80 또는 100 mg을 함유한다. 활성 성분은 유리 염기로서 또는 임의의 제약상 허용되는 염으로서 제공될 수 있다. 활성 성분이 염으로서 제공되면, 중량은 정제가 염의 유리 염기로서 계산된, 요구되는 양의 활성 성분을 함유하도록 조정된다. 바람직하게는, 활성 성분은 히드로클로라이드 염으로서 제공된다.
코어는 그의 성분의 압축된 혼합물로 제조될 수 있다. 성분은 직접 압축되 거나, 또는 압축 전에 과립화될 수 있다. 상기 과립은 당업계에 공지된 종래의 과립화 방법에 의해 형성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 과립은 장용 외피로 개별적으로 코팅된 후, 표준 캡슐 외피 내에 봉입될 수 있다.
코어는 장용 중합체를 포함하는 외피에 의해 둘러싸인다. 장용 중합체의 예는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 메틸셀룰로스 프탈레이트, 에틸히드록시셀룰로스 프탈레이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐부티레이트 아세테이트, 비닐 아세테이트-말레산 무수물 공중합체, 스티렌-말레산 모노-에스테르 공중합체, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체 또는 메타크릴레이트-메타크릴산-옥틸 아크릴레이트 공중합체이다. 이들은 단독으로 또는 조합되어, 또는 상기 언급된 것 이외의 다른 중합체와 함께 사용될 수 있다. 또한, 외피는 생체 내에서 분해되거나 가용화되지 않는 불용성 물질, 예를 들어 알킬 셀룰로스 유도체, 예를 들어 에틸 셀룰로스, 가교결합된 중합체, 예를 들어 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, 히드록실기를 갖는 다당류, 예를 들어 덱스트란, 2관능성 가교결합제, 예를 들어 에피클로로히드린, 디클로로히드린 또는 1,2-, 3,4-디에폭시부탄으로 처리된 셀룰로스 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 외피는 전분 및/또는 덱스트린을 포함할 수 있다.
바람직한 장용 코팅 물질은 단독으로 또는 가소제와 함께 사용되는 시판 유드라기트 (Eudragit)® 장용 중합체, 예를 들어 유드라기트® L, 유드라기트® S 및 유드라기트® NE이다. 상기 코팅은 정상적으로 액체 매질을 사용하여 적용되고, 가소제의 특성은 매질이 수성인지 비-수성인지에 따라 결정된다. 수성 매질과 사용하기 위한 가소제는 프로필렌 글리콜, 트리에틸 시트레이트, 아세틸 트리에틸 시트레이트 또는 시트로플렉스 (Citroflex)® 또는 시트로플렉스® A2를 포함한다. 비-수성 가소제는 상기 가소제, 및 디에틸 및 디부틸 프탈레이트 및 디부틸 세바케이트를 포함한다. 바람직한 가소제는 트리에틸 시트레이트이다. 포함되는 가소제의 양은 당업자에게 자명할 것이다.
또한, 외피는 방착제 (anti-tack agent), 예를 들어 탈크, 실리카 또는 글리세릴 모노스테아레이트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 방착제는 글리세릴 모노스테아레이트이다. 일반적으로, 외피는 약 5-25 wt％의 가소제 및 약 50 wt％ 이하의 방착제, 바람직하게는 1-10 wt％의 방착제를 포함할 수 있다.
요구될 경우, 계면활성제가 중합체의 수성 현탁액의 형성을 돕기 위해 포함될 수 있다. 가능한 계면활성제의 많은 예가 당업자에게 공지되어 있다. 계면활성제의 바람직한 예는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 또는 나트륨 라우릴 술페이트이다. 존재할 경우, 계면활성제는 외피의 0.1-10％, 바람직하게는 0.2-5％, 특히 바람직하게는 0.5-2％를 형성할 수 있다.
한 실시태양에서, 코어와 장용 코팅 사이에 포함되는 밀봉 코트가 존재한다. 밀봉 코트는 코어 내의 임의의 알칼리성 성분에 의한 가능한 화학적 공격으로부터 장용 외피를 보호하기 위해 사용될 수 있는 코팅 물질이다. 또한, 밀봉 코트는 보다 평탄한 표면을 제공하여, 장용 외피의 보다 용이한 부착을 가능하게 할 수 있다. 당업자는 적합한 코팅을 잘 알 것이다. 바람직하게는, 밀봉 코트는 Opadry 코팅으로 제조되고, 특히 바람직하게는 밀봉 코트는 Opadry White OY-S-28876이다.
한 실시태양에서, 제약 활성 성분은 1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온, 또는 그의 염이다.
WO2005/021002에 기재되어 있는 상기 장용 코팅 제제의 일례는 상이한 양의 1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 (이 예에서 "활성"으로 언급됨)을 히드로클로라이드 염으로서 포함한다.
상기 예에서, 락토스 일수화물, 미정질 셀룰로스, 활성 성분, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 1/2의 크로스카르멜로스 나트륨을 10 리터 Fielder 고전단 블렌더 (임의의 적합한 고전단 블렌더를 사용할 수 있음) 내로 체질하고, 쵸퍼 (chopper)를 정지시킨 상태에서 5분 동안 300 rpm에서 블렌딩하였다. 이어서, 계속 블렌딩하면서 약 750 ml의 물을 첨가하여 혼합물을 과립화하였다. 과립을 Glatt 3/5 유동층 건조기에서 건조시키고, Comil에 의해 Pharmatec 5 리터 빈 (bin) 블렌더 내로 체질한 후, 제제 내에 제공된 임의의 락토스 무수물 및 나머지의 크로스카르멜로스 나트륨과 5분에 걸쳐서 20 rpm에서 블렌딩하였다. 스테아르산마그네슘을 블렌더 내로 체질하고, 혼합 과정을 추가로 1분 동안 10 rpm에서 계속하였다. 매끄러운 혼합물을 9.5 mm의 일반적인 둥근 볼록 펀치가 구비된 Riva Piccolla 회전 정제 프레스를 사용하여 압축하였다 (임의의 적합한 정제 프레스를 사용할 수 있다). 밀봉코트, 이어서 장용 코트를, 코팅 중합체의 제조자에 의해 권장되는 코팅 방법을 위한 파라미터를 사용하여 Manesty 10 코팅기로 코트 성분의 수성 현탁액을 분무하여 적용한다 (역시, 임의의 적합한 코팅기를 사용할 수 있음).
상기 종류의 다른 장용 코팅 제제는 상기 물질 또는 그의 균등물을 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다.
국소 적용
본 발명은 피부 궤양에 대한 국소 적용을 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 로션, 겔, 크림, 연고, 에멀젼, 피부 패치 등을 포함한다. 상기 모든 투여 형태는 그의 제조 방법과 함께 제약 및 화장업계에 잘 공지되어 있다 ([HARRY'S COMSETICOLOGY (Chemical Publishing, 7th ed. 1982)]; [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., 18th ed. 1990)]). 일반적으로, 상기 국소 제제는 0.001 내지 10 mg/ml 농도의 활성 성분을 적합한 비히클과 혼합하여 함유한다. 다른 바람직한 성분은 보존제, 공용매, 점성 형성제 (building agent), 담체 등을 포함한다. 담체 자체 또는 담체 내에 용해된 성분은 그 자체의 억제 또는 치료 특성, 예를 들어 습윤화, 세정, 상처 치유 촉진, 또는 소염 특성을 보유할 수 있다. 본 발명의 방법의 Lp-PLA2 억제제는 치료 유효량의 소염제, 예를 들어 코르티코스테로이드, 살진균제, 항생제, 습윤제 또는 상처 치유 촉진 화합물, 예를 들어 혈소판 유래 및 자가 성장 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (G-M CSF), 및 메소글리칸과 조합될 수 있다.
투과 향상제는 예를 들어 표면 활성제; 특정 유기 용매, 예를 들어 디-메틸 술폭시드 및 다른 술폭시드, 디메틸-아세트아미드 및 피롤리돈; 헤테로시클릭 아민, 글리콜 (예를 들어 프로필렌 글리콜)의 특정 아미드; 프로필렌 카르보네이트; 올레산; 알킬 아민 및 유도체; 각종 양이온성, 음이온성, 비이온성, 및 양쪽성 표면 활성제 등일 수 있다.
적합한 연고 베이스는 예를 들어 바셀린, 파라핀, 폴리에틸렌, 천연 수소화 또는 합성 트리글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 마크로골, 카르보 왁스, 셀룰로스 및 그의 유도체, 고분산 산화규소, 벤토나이트, 전분, 아밀로펙틴 및 그의 유도체, 알기네이트, 트라가칸트, 폴리아크릴산, 폴리비닐 알콜 및/또는 폴리아릴비닐피롤리돈을 함유한다. 적합한 유화제는 예를 들어 세틸스테아릴알콜, 세틸에스테르알콜, 나트륨 라우릴술페이트, 나트륨 세틸술페이트, 나트륨 스테아릴술페이트, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 및 폴리옥시에틸렌글리세리드 알콜 에테르이다. 적합한 안정화제의 예는 에탄올, 이소프로판올, 소르브산, 파라벤 (4-히드록시벤조산), 파라벤에스테르 (4-히드록시벤조산 에스테르), 메틸파라벤, 프로필파라벤, 헥사클로로펜, 벤즈알코늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 및 아스코르브산이다. 적합한 촉진제 (투과 향상제, 흡수 촉진제 등도 포함)는 예를 들어 이소프로필미리스테이트, 디메틸술폭시드, 2-피롤리돈, 1-도데실아자시크로헵탄-2-온, 1,2-프로필렌글리콜, 올레산, 나트륨 라우릴술페이트, 우레아, 살리실산, 히알루로니다제, 올레일 알콜, 및 에틸렌글리콜이다.
본 발명에서 이용되는 활성 성분에 대한 투여 요법은 치료되는 질병 또는 병태에 따라 상이하고, 환자의 체중 및 연령, 및 환자의 개별적인 상태, 및 적용가능 한 기술 및 최신 시설에 의해 결정된다.
약리학상 유효량의 국소 투여는 당업계에 잘 공지된 경피 전달 시스템을 이용할 수 있다. 경피 전달 시스템의 제조는 미국 특허 4,626,539, 4,405,616, 4,416,886, 4,655,766, 및 문헌 [Stanley Scheindlin, Molecular Interventions 4:308-312, (2004)]에 기재되어 있다.
또한, 이온도입 전달 시스템은 당업자에 의해 경피 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 이러한 적용의 예는 문헌 [Kazuhiro A, et. al., "Iontophoresis of insulin using a device with microneedles". Int J Pharm Fed World Cong. 2002:62:27]에서 볼 수 있다.
치료 효능:
피부 궤양의 치료에 관하여, 용어 "치료"는 개방성 미란이 깨끗해지도록 (고름의 부재) 개방성 미란 내의 감염을 억제 및 근절하는 것을 의미한다. 또한, 이 용어는 개방성 미란 크기의 축소 및 개방부의 실질적으로 완전한 폐쇄에 의해 평가되는 개방성 미란의 점진적인 치유를 나타낸다. 또한, 치료는 국소화된 염증, 쓰림, 접촉시 통증 및 궤양의 주변 영역 내의 발적의 감소를 포함한다. 치료는 또한 궤양이 시간이 경과하여도 더 커지지 않음을 의미한다.
또한, 예방 방법 (예를 들어, 재발률의 억제 또는 감소)도 치료로 간주된다.
치료의 효능은 본원에 기재된 임의의 하나의 표준 척도, 또는 피부 궤양 중증도의 측정을 위한 다른 임상적으로 용인되는 표준을 사용하여 모니터링될 수 있다. 따라서, 머크 매뉴얼 분류 (1-6기), PUSH Tool 및 NPUAP 등급 결정, 및/또는 와그너 분류 척도가 각각 사용될 수 있다. Lp-PLA2 억제제를 사용하는 치료 시에 분류의 적어도 하나의 단계 또는 수준의 개선이 달성되면, 치료는 일반적으로 "효과적인" 것으로 여겨진다. 별법으로 또는 추가로, 치료 이후 적어도 25％의 피부 병변의 크기 (면적 및/또는 깊이)의 감소가 "효과적인" 치료로 여겨진다.
예방 효능은 Lp-PLA2 억제제를 사용한 치료의 개시 이후 피부 병변이 발생할 위험이 있는 대상체의 피부를 평가함으로써 모니터링한다. 위험이 있는 개체에서 피부 병변의 부재는 "효과적인" 예방의 신호로 여겨진다. 유사하게, 개체가 피부 병변의 병력이 있는 경우에, 새로운 병변의 부재, 또는 심지어 치료 전의 빈도 또는 중증도에 비해 임의의 새로운 병변의 빈도 또는 중증도에서, 예를 들어 50％ 이상의 감소가 본원에 기재된 방법에 의한 피부 궤양의 "효과적인" 예방의 표시이다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 따라서 변할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이고, 청구의 범위에 의해서만 규정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 이외의 다른 설명 부분에서, 또는 달리 나타낸 경우를 제외하고는, 본원에서 사용되는 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해하여야 한다. 용어 "약"은 백분율과 함께 사용될 때 ±1％를 의미할 수 있다.
본원에서 제시되는 실시예는 Lp-PLA2의 억제에 의한, 피부 궤양, 예를 들어 당뇨 피부 궤양 (이로 제한되지 않음)의 예방 및/또는 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본원 전체에 걸쳐, 각종 간행물이 인용된다. 모든 간행물 및 이들이 인용하는 참고문헌의 개시 내용은 본 발명이 관련되는 기술의 상태를 보다 상세하게 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 의도하지 않으며, 단지 특정 실시태양을 예시하고자 제시되는 것이다. 당업자에 의한 예시적인 방법의 임의의 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
동물 모델: 인간-유사 당뇨병 및 인간-유사 죽상동맥경화증을 모방하는 당뇨/당뇨성 고콜레스테롤혈증 돼지 모델 (DM/HC)을 개발하였다. 125 mg/kg의 스트렙토조토신 (시코르 파마슈티칼스 (Sicor Pharmaceuticals), 미국 캘리포니아주 어빈)의 단일 정맥내 주사에 의해 25-30 kg의 4개월 이하의 사육 돼지를 당뇨 상태로 만들었다. 1-2주 동안 안정화시킨 후, 혈장 글루코스 수준이 상승한 동물 (>150 mg/dl)에게, 약 250-800 mg/dl의 콜레스테롤 수준을 달성하기 위해 표 1에 제시된 죽종형성 (high-fat) 식이 (diet) (애니멀 스페셜티즈 (Animal Specialties), 미국 펜실베니아주 퀘이커타운)를 공급하였다. 콜레스테롤 수준의 유지는 표 2에 제시된 방법에 의해 결정하였다.
Figure 112009076184414-PCT00047
0.5％ 콜레스테롤 식이를 위해, 성분은 0.5％ 콜레스테롤 및 20％ 라드를 제외하고는 유사하다. 동물은 3-5세의 거세된 수컷 요크셔 (Yorkshire) 돼지로서, 아쳐 팜스 (Archer Farms, 미국 메릴랜드주 달링톤)로부터 얻었다. 상기 사료는 애니멀 스페셜티즈 앤드 프로비젼스, 엘엘시에 의해 제조되었다.
1-2일에, 동물에게 정상적인 사료를 공급한 후, 3-14일에는 동물에게 0.5％ 콜레스테롤, 2％ 라드의 식이를 공급하고, 14일에 콜레스테롤 수준을 측정하고, 콜레스테롤이 300 mg/dl 미만이면 2％ 콜레스테롤, 10％ 라드로 증가시키도록 식이를 조정하였다. DM/HC의 유도 후에, 콜레스테롤 수준이 300 내지 800 mg/dl로 안정할 때까지 콜레스테롤을 측정하고, 콜레스테롤 안정화 후에, 콜레스테롤을 매달 측정하였다. 초기 안정화기 후에 콜레스테롤 수준이 불안정하면, 동물의 식이를 초기의 2주 측정 스케쥴로 다시 전환하였다. 총 콜레스테롤, LDL, HDL, VLDL 및 트리글리세리드의 수준을 포함하여 콜레스테롤 수준을 매달 측정하였다. 안정한 콜레스테롤 수준을 위한 동물 식이의 조정은 표 2에 제시된 개요에 따라 결정하였다.
Figure 112009076184414-PCT00048
Figure 112009076184414-PCT00049
250-800 mg/dl에서 콜레스테롤을 1개월 안정화시킨 후에, 동물을 2개의 실험군, 즉 DM/HC (고혈당증 및 고콜레스테롤혈증) 비처리군 및 처리군 (1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온)으로도 불리는 SB-480848의 10 mg/kg/일)으로 무작위로 분류하였다. 이어서, 약물이 대조군 동물에서 발견되지 않도록 하기 위해 동물을 2개의 별개의 방에 넣었다. 즉, 대조군 동물을 하나의 방에 넣고, 처리 동물을 다른 방에 넣었다. 동물을 특히 다리 및 발의 피부 고름집에 대해 1일 2회 육안으로 조사하고, 1회 육안 검사를 실시하고 8-10 시간 후에 2회 육안 검사를 실시하였다. 고름집으로 간주되기 위해서, 최소 고름집 크기는 주변 영역의 발적과 함께 1 mm이었다. 고름집이 검출되면, 치료를 실시하였다. 치료는 고름집의 크기 및 깊이를 평가하고, 죽은 조직 및 세포의 고름집의 고름을 짜내고 소독하고, 베타딘으로 세척하고, 건조시키고, 멸균 드레싱으로 감고, 항생제를 경구 투여하는 것을 포함한다. 치료는 개방성 미란 내의 감염이 제거되고 (고름의 부재) 개방성 미란이 크기 축소에 의해 치유되고 개방부가 완전히 닫힐 때까지 매일 시행하였다. 감염원 병원체를 결정하기 위해서 고름집을 배양하였다. 동물은 6개월 동안 계속 연구에서 포함되었고, 6개월 경과시에 희생시켜 조직을 즉시 수거하였다. 동물 프로토콜은 펜실베니아 대학 동물 실험 윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of University of Pennsylvania)에 의해 승인되었다.
2개의 당뇨/고콜레스테롤혈증 군을 평가하였다: 1. DM/HC 군 및 2. Lp-PLA2 억제제를 투여한 DM/HC 동물. 실험은 대조군 (DM/HC 군 - 21마리의 돼지) 및 실험군 (Lp-PLA2 억제제를 투여한 DM/HC 동물 - 22마리의 돼지)을 포함하였다. 추가로, 혈액 콜레스테롤 수준은 실험 동물에서 보다 우수한 시험 모델을 제공하는 것으로 결정된 300 내지 800 mg/dl로 유지하였다. 혈액 콜레스테롤 수준은 표 4에 제시된 바와 같이 2개월마다 모든 동물에서 모니터링하였고, 표 2에 제시된 바와 같이 사료의 지방 함량을 조정하였다. 콜레스테롤 및 라드 비율은 각각 0.5-2％ 및 10-25％이었고, 모든 동물에게 상기 범위 내의 콜레스테롤 및 라드 농도를 함유하는 사료를 공급하였다. 6개월의 실험 기간에 걸쳐 DM/HC 동물에서 확인되고 처리된 다리 고름집의 스케쥴을 도 1에 도시한다. 다리 고름집 발생을 표 4에 요약한다.
통계학적 유효성을 위한 최소 요건을 증명하기 위해 선택된 동물 수는 실험당 2개의 동물군이었다: 1. 대조군 (n=21); 당뇨 및 고지혈증; 2. 실험군 (n=22): 표 3에 제시된 바와 같이 10 mg/kg Lp-PLA2 억제제를 투여한 당뇨, 고지혈증.
사육 돼지인 요크셔 수퇘지 (중량 25-35 kg)를 지역 농장으로부터 구입하고, 수의사의 관찰 하에 실내 돈사에 두었다. 이들 돼지를 연구 개시 3-5일 전에 거세하였다. 30분 동안 스트렙토조신 (125 mg/kg)의 1회 용량을 IV 주입하여 시험 돼지를 당뇨로 만들었다. 동물이 당뇨 상태로 되지 않으면, 제2 용량 (50 mg/kg)을 투여하였다. 초기 저혈당증의 개시 가능성을 방지하기 위해서, 20 g의 글루코스 분말을 처음 2일 동안 사료에 첨가하였다. 혈당측정기를 사용하여 처음 14일 동안에는 사료 공급 전에 매일, 이후에는 1주 1회로 혈액 글루코스를 측정하였다.
식분 (coprophagia)에 의한 동물간 약물 전달을 방지하기 위해서 시험 동물을 별개로 수용하였다. 모든 동물에게 물을 자유롭게 섭취하도록 하면서 죽종형성 식이를 1일 2회 공급하였다. 맞춤 식이는 0.5 및 2％ 콜레스테롤 및 10 및 25％ 라드를 함유하였고, 그 성분은 표 1에 제시되었다.
Figure 112009076184414-PCT00050
Figure 112009076184414-PCT00051
1일 투여는 29일에 개시하였고, 이때 각각의 시험 동물에게 10 mg/kg SB-480848의 1일 용량을 투여하였다 (개 사료에 볼러스 등가물로서 제공함).
고름집 배양은 포도상구균이 감염을 유발하는 우세한 병원체임을 보여주었다. 또한, 상기 병원체는 인간 당뇨 감염에서 단리되는 가장 흔한 세균이다.
DM/HC 돼지 모델은 피부 고름집 발생, 형성, 치료, 및 예방에 대한 Lp-PLA2 억제제의 효과를 연구하기 위한 이상적인 모델이었다. 그 이유는 이들 돼지가 표현형에서 당뇨성 족부 궤양 또는 고름집 발생 경향과 같은 고위험 인간 당뇨 환자와 많은 유사성을 공유하기 때문이다.
Lp-PLA2 억제제로 처리된 22마리의 DM/HC 돼지 중에서, 단지 2마리의 돼지, 즉 돼지 #948 및 #963만이 그의 발에 가시적인 고름집을 보유하였다. 각각의 돼지에는 하나의 고름집이 존재하였다. 이들 돼지에서 Lp-PLA2 억제제 처리 개시 전에 고름집이 발생하였다 (도 1). 고름집을 처리하였고, 고름집은 평균 1-2주 내에 치유되었다. 1일 단일 용량의 억제제 처리의 개시 후에 추가의 고름집이 발생하지 않았다. Lp-PLA2 억제제로 처리된 나머지 20마리의 돼지의 경우, 6개월의 처리 기간에 걸쳐서 어떠한 고름집도 발생하지 않았다.
Lp-PLA2 억제제로 처리되지 않은 21마리의 DM/HC 돼지 (대조군) 중에서, 6마리의 돼지, 즉 돼지 #975, #1024, #949, #947, #1007, 및 #15에서 고름집이 발생하였다. 이들 돼지 모두에서 고름집이 발생하였고, 2마리의 돼지에서는 고름집이 재발하였고 (새 고름집이 이전의 고름집 치유 후에 발생함), 1마리의 돼지에서는 2개월 초과의 기간 동안 지속되는 만성 궤양이 형성되었다 (공격적인 상처 치유에도 불구하고 고름집 치유에 실패함).
이론에 구속되는 것을 바라지 않지만, Lp-PLA2 효소의 억제는 전신 염증을 감소시킴으로써 피부 감염 위험을 감소시킨다.
총괄적으로, 데이타는 Lp-PLA2 효소의 억제가 고름집 형성 예방, 재발하는 고름집 형성 억제, 및 당뇨 환자에서 만성 고름집 발생의 억제에 효과적일 수 있음을 나타낸다.
또한, 연구 기간 동안 Lp-PLA2 억제제를 투여한 동물은 외부 자극에 보다 반응성이고, 우리 내에서 활동 증가를 보이고, 대조군 동물에 비해 먹이 공급 및 관리에 보다 기민하게 반응하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 유사한 혈당 및 콜레스테롤 수준에도 불구하고, Lp-PLA2 억제제로 처리된 동물은 각각 26.9 kg 및 30.3 kg 중량의 기준선으로부터 대조군 동물에 비해 중량의 증가를 보였다 (대조군 동물의 50.9 kg에 대해 62.5 kg). Lp-PLA2 억제제를 투여한 동물의 중량은 보다 병약한 동물 (즉, 대조군 동물)이 먹이를 먹지 않는다는 점에서 동물의 전체적인 행복 수준을 직접적으로 반영한다. Lp-PLA2의 억제에 의한 염증 억제는 전신 염증 환경에서 보다 큰 행복 수준 및 건강을 유도하는 것으로 관찰되었다.
본원 명세서 전반에 걸쳐서 인용된 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.

Claims (15)

  1. 대상체가 피부 궤양을 앓고 있거나 피부 궤양이 발생할 위험이 있는지 결정하고, Lp-PLA2 단백질의 활성 및/또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 피부 궤양을 앓고 있거나 피부 궤양이 발생할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 피부 궤양을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 위험 인자가 피부 궤양의 과거 에피소드를 갖는 것, 당뇨병에 걸린 것, 누워서 생활해야 하거나 휠체어를 타야 하는 것 및 혈관염을 앓고 있는 것으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 물질이 소분자, 핵산, 단백질, 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 핵산이 RNAi 물질인 방법.
  7. 제6항에 있어서, RNAi 물질이 siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA 또는 리보자임 또는 그의 변이체인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 소분자가 1-(N-(2-(디에틸아미노)에틸)-N-(4-(4-트리플루오로메틸페닐)벤질)-아미노카르보닐메틸)-2-(4-플루오로벤질)티오-5,6-트리메틸렌피리미딘-4-온 또는 SB480848 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 소분자가 N-(2-디에틸아미노에틸)-2-[2-(2-(2,3-디플루오로페닐)에틸)-4-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-시클로펜타피리미딘-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸-바이페닐-4-일메틸)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 소분자가 N-(1-(2-메톡시에틸)피페리딘-4-일)-2-[2-(2,3-디플루오로벤질티오)-4-옥소-4H-퀴놀린-1-일]-N-(4'-트리플루오로메틸바이페닐-4-일메틸)-아세트아미드; 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 소분자가 메틸 2-[4-({[2-[2-(2,3-디플루오로페닐)에틸]-4-옥소피리도[2,3-d]피리미딘-1(4H)-일]아세틸}{[4'-(트리플루오로메틸)-4-바이페닐릴]메틸}아미노)-1-피페리디닐]-2-메틸프로파노에이트 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항미생물 요법제, 항기생충 요법제, 항비만 요법제, 당뇨병 요법제, 심혈관 질병 요법제, 신부전증 요법제, 혈관염 요법제, 정맥 부전증 요법제, 동맥 부전증 요법제, 암 요법제, 면역억제 요법제, 면역결핍증 요법제, 스테로이드 요법제 및 화상 요법제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 대상체에게 표준 상처 치유 관리를 적용하는 것을 더 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 대상체에게 생물공학적으로 처리된 피부 대체물을 적용하는 것을 더 포함하는 방법.
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