KR20100016355A

KR20100016355A - Ｔｅｍ８ 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR20100016355A
Application number: KR1020097023352A
Authority: KR
Inventors: 타쿠야 츠노다; 류지 오사와
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2008-04-10
Publication date: 2010-02-12
Also published as: AU2008238739A1; JP5320544B2; EP2508601A2; RU2498993C2; BRPI0811021A2; CN102786582A; TW200906850A; RU2009141595A; US20120093843A1; JP2010523471A; HK1175197A1; CN101711280B; EP2508601B1; CN101711280A; TWI434853B; CA2683454A1; IL201386A0; US8367799B2; EP2155872A4; CN102786582B

Abstract

본 발명에 있어서, 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 또는 68의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는, 세포독성 T 림프구(CTL) 유도성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 그것의 CTL 유도성을 유지하고 있는 한, 1개, 2개, 또는 복수의 아미노산 치환 또는 추가를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 펩티드 중 어느 것을 포함하는, 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 종양 재발 방지를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 백신을 포함한다.

Description

ＴＥＭ８ 펩티드 및 이를 포함하는 백신{TEM8 peptides and vaccines comprising the same}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2007년 4월 11일에 출원된 미국 가출원 제 60/911,194호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 전체적으로 본 문서에 참조문헌으로 삽입된다.

발명의 분야

본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 암 백신 및, 종양의 치료 및 예방을 위한 약물로 매우 효과적인 TEM8 펩티드에 관한 것이다.

CD8 양성 세포독성 T 림프구(CD8 positive cytotoxic T lymphocytes,CTLs)가 주조직적합성복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I 분자에 존재하는 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인지한 후, 종양세포를 사멸시키는 것으로 입증되고 있 다. TAA의 첫번째 예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 면역학적 접근을 통해 발견되었으며(Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9), 상기 TAA 중 일부는 현재 면역치료의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.

강력하고 특이적인 항종양 면역반응을 유도하는 새로운 TAA를 동정함으로써, 다양한 종류의 암에서 펩티드 백신 전략의 임상적인 응용의 무궁한 발전이 보장된다(Harris CC, J Natl Cancer Inst 1999 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al, Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al, Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; Van der Burg SH et al, J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al, Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al, Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al, Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양관련 항원 유래 펩티드를 이용한 몇몇의 임상 실험이 보고되고 있다. 불행하게도, 지금까지 암 백신 임상 실험에서는 낮은 객관적 반응률만을 관찰할 수 있었다(Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep,10(9):909-15).

이러한 유효성의 상대적인 결여에 있어서 하나의 가능성 있는 원인은, 고형종양으로 빈발하고 몇몇 T 세포 매개 항-종양 반응을 현저하게 손상시키는, 종양 세포상의 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) 클래스 I 분자의 발현 손실 또는 억제일 수 있다(Cormier JN et al., Int J Cancer 1998 Feb 9, 75(4):517-24; Hicklin DJ et al., Mol Med Today 1999 Apr, 5(4):178-86; Paschen A et al., Int J Cancer 2003 Mar 1, 103(6):759-67). 비록 강력한 세포독성 T 림프구(CTL)가 종양관련 항원을 표적으로 하는 암 백신에 의해 유도되더라도, 표적세포가 충분한 양의 HLA 클래스 I 분자들을 발현하지 않을 경우에는 상기 CTL은 표적세포를 인식할 수 없게 된다.

종양 혈관신생은 종양의 진행에 결정적으로 관여한다. HLA 클래스 I 분자가 내피세포에서 억제되지 않기 위해서, 혈관내피증식인자수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 1 및 2를 표적으로 하는, 내피세포에 근거하는 접근에 따라 종양 혈관신생에 대하여 효과적인 백신이 개발될 수 있다는 것이 이미 증명되었다(Wada S et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11):4939-46; Ishizaki H et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19):5841-9). 또한, 이들의 치료 표적은 종양 비의존적이기 때문에, 종양 미소환경에 있어서의 혈관내피세포의 고갈은 다양한 악성 종양에 대하여 유효한 가능성이 있다. 또한, 종양내피세포는 혈액 순환 중의 림프구가 용이하게 접근하여, CTL은 다른 어느 조직에도 침투하지 않고 내피세포에 직접 손상을 줄 수 있다. 또한, 종양혈관계 내의 소수의 내피세포의 용해마저도 혈관의 완전성의 파괴를 초래하고, 이렇게 하여 복수의 종양세포의 억제를 초래할 수 있다(Folkman J, Nat Med 1995 Jan, 1(1):27-31). 따라서, 종양내피세포는 암 면역치료를 위한 효과적인 표적이 된다. 종양의 혈관신생을 특 이적이고 효율적인 CTL 반응으로 억제하기 위하여, 혈관신생에 관련된 분자 중에서 적절한 표적이 선택될 필요가 있다.

TEM8을 포함하는 종양내피마커(tumor endothelial marker, TEM)는, 정상조직과 비교하여 종양관련 내피에서 특이적으로 상승하는 것으로 나타났다(St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482):1197-202). TEM8 전사체는 폐 및 뇌의 종양 및 간 전이암에서 발현된다. TEM8을 표적으로 하는 치료는 광범위한 종양의 종류에 적용가능하다. 예를 들면, WO 2005/048943은 종양관련 항원을 암호화하는 백신과 함께 TEM8의 세포외 도메인을 암호화하는 벡터를 포함하는 백신의 사용을 제안하고 있다. 그러나 이 문헌은 TEM8 발현 벡터의 도입이 종양관련 내피에 대하여 CTL의 유도를 야기한다는 어떠한 증거도 제공하고 있지 않고, 또한 TEM8 단백질내의 에피토프(epitope)의 위치에 관한 어떠한 정보도 제공하고 있지 않는다.

발명의 개요

종양 미소환경을 표적으로 하는 암 치료, 특히 종양의 혈관신생을 표적으로 하는 암 치료의 임상효과를 개선하는 것이 중요하다. 본 발명은 항-종양 면역치료의 표적으로서 종양의 혈관에 초점을 맞춘다. 특히, 본 발명은 종양내피마커8(tumor endothelial marker 8, TEM8)이 광범위한 종류의 종양의 혈관에서 발현되는 것으로 여겨지므로, TEM8{GenBank Accession No. NM_032208(서열번호 : 75)}의 유전자에 의해 암호화되는 TEM8{(GenBank Accession No. NP_115584(서열번호 : 76)}을 표적으로 한다. 본 발명은 대응하는 분자에 특이적 CTL을 유도하는 에피토프 펩티드를 포함하는 TEM8 유전자 산물을 제공한다. 건강한 공여자에게서 받은 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 TEM8 유래의 후보 펩티드에 결합하는 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201을 이용하여 자극하였다. 또한, 본 발명은 각각의 후보 펩티드로 자극되는 HLA-A24 또는 HLA-A02 양성 표적세포를 특이적으로 인식하는 구축된 CTL, 및 종양의 혈관에서 발현되는 TEM8에 대하여 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A02에 제한적인 에피토프 펩티드를 제공한다. 이러한 결과는 TEM8은 강력한 면역원성이고, 그 에피토프는 종양 면역치료를 위한 효과적인 표적임을 나타내고 있다.

따라서, 본 발명은 세포독성 T 세포의 유도성을 가진 분리된 노나(nona)펩티드 또는 데카(deca)펩티드를 제공하고, 상기 노나펩티드 또는 데카펩티드는 서열번호 : 76의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도성을 가지는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 변경된 펩티드가 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한, 1개, 2개 또는 복수의 아미노산이 치환 또는 추가된 펩티드를 포함한다.

개체에 투여하였을 경우, 본 발명의 펩티드는 항원을 발현하는 세포의 표면에 제시되고, 그 후 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 제시하는 항원제시세포 및 항원제시세포를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 TEM8 폴리펩티드(polypeptide) 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 TEM8 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 및 항원제시세포의 투여에 의해 항-종양면역반응이 유도된다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 그것의 활성성분으로 상기 엑소솜 및 항원제시세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 백신으로서 사용된다.

또한, 본 발명은 TEM8 폴리펩티드, TEM8 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, TEM8 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 항원제시세포, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암(종양)을 치료 및/또는 예방(즉, 방지) 방법, 및/또는 수술 후 암의 재발을 방지하는 방법, 및 CTL을 유도하는 방법, 종양관련 내피에 대한 면역반응 및 항-종양면역을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 TEM8 폴리펩티드를 표적으로 하는 CTL은 종양관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TEM8 폴리펩티드를 표적으로 하는 CTL을 제공한다. 본 발명의 CTL은 암에 대한 백신으로서도 사용된다.

상기 발명의 개요 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적인 실시태양이며, 본 발명의 내용 또는 본 발명의 다른 대체적인 실시태양은 이에 한정하지 않는다고 이해되어야 한다.

I. 정의

본 발명에서 사용되는 용어 "a", "an", 및 "the"는 따로 명시되지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기, 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 대응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기에 적용된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 모방체(mimetic) 및 아미노산 유사체(analog)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), γ-카복시글루탐산(γ-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. "아미노산 유사체"라는 용어는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌 설폭사이드(methionine sulfoxide, 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. "아미노산 모방체"라는 용어는 서로 다른 구조가 있으나, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 상징 또는 1문자 상징에 의해 불린다.

본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 아미노산과 마찬가지로, 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 불린다.

그밖에 규정되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미가 있다.

Ⅱ. 펩티드

TEM8 유래 펩티드가 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여, TEM8{GenBank Accession No. NP_115584(서열번호 : 76)}유래 펩티드가 보통 HLA 대립유전자에 보여지는 HLA-A24 또는 HLA-A02에 의해 제한되는 항원 에피토프인 것인가 아닌가를 확인하기 위하여 TEM8 유래 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994). HLA-A24 및 HLA-A02에 결합하는 TEM8 유래 펩티드 후보를 HLA-A24 및 HLA-A02에 대한 그들의 결합 친화성 정보를 이용하여 동정하였다. 이러한 펩티드를 보유한 수지상세포(dendritic cell, DC)에 의해 T 세포를 생체 외에서 자극한 후, 하기 펩티드를 이용해서 CTL을 성공적으로 구축하였다.

TEM8-A24-9-39 (서열번호 : 3),

TEM8-A24-9-277 (서열번호 : 4),

TEM8-A24-10-277 (서열번호 : 9),

TEM8-A02-9-337 (서열번호 : 23),

TEM8-A02-9-338 (서열번호 : 25),

TEM8-A02-9-278 (서열번호 : 30),

TEM8-A02-10-338 (서열번호 : 60),

TEM8-A02-10-265 (서열번호 : 63) 및

TEM8-A02-10-333 (서열번호 : 68).

이러한 구축된 CTL은 펩티드가 각각의 펩티드로 자극한 표적세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 TEM8이 CTL에 의해 인식되는 항원이고, 하기의 펩티드는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 의해 제한되는 TEM8의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.

TEM8-A24-9-39 (서열번호 : 3),

TEM8-A24-9-277 (서열번호 : 4),

TEM8-A24-10-277 (서열번호 : 9),

TEM8-A02-9-337 (서열번호 : 23),

TEM8-A02-9-338 (서열번호 : 25),

TEM8-A02-9-278 (서열번호 : 30),

TEM8-A02-10-338 (서열번호 : 60),

TEM8-A02-10-265 (서열번호 : 63) 및

TEM8-A02-10-333 (서열번호 : 68).

TEM8 유전자는 대부분의 암 환자에게서 과잉 발현되므로, 이것은 임상 효과를 높이는 면역치료의 효과적인 표적이 된다. 따라서, 본 발명은 CTL에 인식되는 TEM8 유래 에피토프의 노나펩티드(9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드) 및 데카펩티드(10개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드)를 제공한다. 본 발명에 있어서, 노나펩티드 또는 데카펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 : 76으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포독성 T 림프구 유도성을 가진 분리된 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드는 서열번호 : 76의 아미노산 서열로부터 선택되는 9개 또는 10개의 연속한 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 구체적으로, 일부 실시태양에 있어서, 본 발명은 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 제공한다.

일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1,152(1):163-75에 기재되어 있는 것과 같이, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성을 산출할 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75; 및 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6):1872-81에 기재되어 있는 것에 따라, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185:181-190; Protein Science, 2000, 9:1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 공지된 프로그램에 의해 HLA 항원에 결합하는 것으로 확인된 TEM8의 펩티드를 포함한다.

또한, 본 발명의 이러한 펩티드는 상기 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한, 부가적 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. CTL 유도성을 가진 이러한 펩티드는 예를 들면, 약 40 아미노산 미만, 흔히 약 20 아미노산 미만, 보통 약 15 아미노산미만이다. 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 인접하는 아미노산 서열은 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 이에 한정되지 않고 동시에 임의의 종류의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 펩티드이며, 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드도 제공한다.

일반적으로, 어떠한 단백질 중의 1개 또는 그 이상의 아미노산의 변형이 상기 단백질의 기능에 영향을 미치지 않거나, 또는 어떠한 경우에는 원래 단백질의 원하는 기능을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 1개, 2개 또는 복수의 아미노산 잔기를 치환 또는 추가함으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물 활성을 유지한다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에 있어서, CTL 유도성을 가지는 본 발명의 펩티드는 1개, 2개 또는 복수의 아미노산이 추가 및/또는 치환된, 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 또는 68의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산으로 구성될 수 있다.

당업자는 1개의 아미노산 또는 낮은 비율의 아미노산이 변경되는 아미노산 서열에 대한 개별적 추가 또는 치환이 원래의 아미노산 측쇄의 특성을 보존한다는 것을 인지하게 될 것이다. 따라서 이것은 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"이라고 부르고, 단백질의 변화는 비슷한 기능이 있는 단백질이 된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄가 있다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W)이다. 또한, 다음의 8개 군은 서로 보존적으로 치환되는 아미노산을 각각 포함한다:

(1) 알라닌(A), 글리신(G);

(2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E);

(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

(4) 아르기닌(R), 리신(K);

(5) 이소 류신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

(6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

(7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

(8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(Creighton, Proteins 1984 참조)

이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고, 펩티드가 CTL 유도성을 가지는 한, 비보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한 상기 변형된 펩티드는 TEM8 다형성 변종, 종간 상동체(homologue) 및 TEM8의 대립 유전자의 CTL 유도 가능한 펩티드를 제외하지 않는다.

필요한 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여 소수의(예를 들면, 1개, 2개 또는 복수) 또는 낮은 비율의 아미노산을 변형(추가 또는 치환)할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "복수"는 5개 또는 그 이하, 예를 들면 3개 또는 그 이하를 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 20% 또는 그 이하, 예를 들면, 15% 또는 그 이하, 예를 들면 10% 또는 1 ∼ 5%일 수 있다.

본 발명의 펩티드, TEM8-A24-9-39(서열번호 : 3), TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25), TEM8-A02-9-278(서열번호 : 30), TEM8-A02-10-338(서열번호 : 60), TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63) 및 TEM8-A02-10-333(서열번호 : 68)의 상동성 분석에서 이들이 다른 어떤 공지의 인간 유전자 산물에서 유래하는 펩티드와 유의적인 상동성을 가지고 있지 않다는 것으로 나타났다. 이것은 면역치료에 사용하면 불명확한 또는 불필요한 면역반응의 가능성을 낮춘다. 따라서, 이러한 관점에서도, 이들의 펩티드는 종양관련 내피 상의 TEM8에 대한 종양환자의 면역을 유발하기 위해 사용된다.

면역치료에 사용했을 경우, 본 발명의 펩티드는 HLA 항원과의 복합체로서 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시된다. 따라서, 그것들의 CTL 유도성과 더불어, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드를 선택할 수 있다. 또한, 더욱 높은 결합 친화성을 얻기 위해서 아미노산 잔기의 치환, 추가 등에 의해 펩티드를 변형할 수 있다. 자연적으로 드러난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합으로 드러난 펩티드 서열의 규칙성은 이미 공지되었으므로(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307), 이와 같은 규칙성에 근거한 변형을 본 발명의 면역원성 펩티드에 대해 실시할 수 있다. 예를 들면, 높은 HLA-A24 결합 친화성을 나타내는 펩티드는 N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소 류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 펩티드도 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환, 및/또는 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소 류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 서열번호 : 3, 4 또는 9의 아미노산 서열을 가진 펩티드는 본 발명에 포함된다.

한편, N-말단으로부터 2번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환되고, C-말단의 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환되는 펩티드는 높은 HLA-02 결합 친화성을 가지는 펩티드로서 사용할 수 있다. 따라서, N-말단으로부터 2번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환, 및/또는 C-말단이 발린 혹은 루신으로 치환되는 서열번호 : 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 아미노산 서열 중 어느 것을 가지는 펩티드는 본 발명에 포함된다. 치환은 말단의 아미노산에서뿐만 아니라 펩티드의 잠재적인 TCR 인식 부위에서도 실시할 수 있다. 몇 개의 연구에서, 예를 들면 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377)또는 gp100_(209-217), 펩티드 중의 아미노산 치환이 원래의 것과 동일하거나 더욱 뛰어난 것일 수 있음을 증명하고 있다(Zaremba et al., Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997; T. K. Hoffmann et al., J Immunol. (2002) Feb 1, 168(3):1338-47; S. O. Dionne et al., Cancer Immunol immunother. (2003) 52:199-206 및 S. O. Dionne et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

또한, 본 발명의 펩티드의 N 및/또는 C-말단에 1개 내지 2개의 아미노산을 추가할 수도 있다. 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지며, CTL 유도성을 유지하고 있는 이러한 변형된 펩티드 또한 본 발명에 포함된다.

그러나, 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 자가면역장애 또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서, 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 실시할 수 있다. 목표 펩티드와 1개 또는 2개의 아미노산 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 드러날 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 수송 능력을 증강시키기 위해, 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.

상기와 같이, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "CTL 유도성"은 항원제시세포 상에 제시될 경우에 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하는 능력, 및 CTL에 의한 표적세포의 용해 촉진, 및 CTL의 IFN-γ 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 항원제시세포{예를 들면, B림프구, 마크로파지(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell, DC)}, 또는 더욱 구체적으로는 인간 말초혈액단핵백혈구 유래의 DC를 유도하고, 펩티드를 사용하여 자극한 후, CD8 양성세포와 혼합한 후, 표적세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-γ를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T (H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 표적세포를 ⁵¹Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적세포로부터 방출된 방사능으로부터 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 다른 방법으로, 고정화된 펩티드를 가진 항원제시세포(APC)의 존재하에 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-γ를 측정하고, 항-IFN-γ 단일클론항체를 사용한 배지에서 저해 영역을 가시화함으로써, 세포독성 활성을 확인할 수 있다.

상기와 같이, 펩티드의 CTL 유도성을 검사한 결과, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드가 반드시 높은 유도성을 가지는 것은 아니었다. 또한, 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68에 의해 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 노나펩티드 또는 데카펩티드는, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보였다. 따라서, 이들의 펩티드는 본 발명의 예시적인 실시태양이다.

상기와 같이, 펩티드의 변형과 함께, 본 발명의 펩티드는 그들이 CTL 유도성을 유지하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합될 수 있다. 예시적인 물질에는 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등이 포함된다. 상기 펩티드는 본 발명에서 설명하는 펩티드의 생물 활성이 손실되지 않는 한, 당화(glycosylation), 측쇄 산화 또는 인산화 등의 변형을 포함한다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능 및 전달 기능)을 제공하거나 폴리펩티드를 안정시키기 위해 실시할 수 있다.

예를 들면, 폴리펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체, 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 이 개념은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 펩티다아제, 및 인간 혈장 및 혈청 등의 다양한 생물학적 배지를 사용하여 안정성을 시험할 수 있다(예를 들면, Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302을 참조).

본 발명에 있어서, 본 발명의 펩티드는 "TEM8 펩티드" 또는 "TEM8 폴리펩티드"라고 기재할 수도 있다.

Ⅲ. TEM8 펩티드의 제조

본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합형 DNA 기술 또는 화학 합성에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 2개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 상기 펩티드는 분리될 수 있는데, 즉, 자연에 존재하는 다른 숙주세포 단백질 및 이의 단편, 또는 다른 어떠한 화학물질을 실질적으로 포함하지 않도록 정제 또는 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기초로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 합성에 사용할 수 있는 일반적인 펩티드 합성 방법은 하기의 것을 포함한다:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co, 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；

(vi) WO99/67288; 및

(vii) Barany G. 및 Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis,"Academic Press, New York, 1980, 100-118.

또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 공학 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 형태(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 그 다음에, 상기 숙주세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 사용하여 시험관 내에서 제작될 수도 있다.

Ⅳ. 폴리뉴클레오티드

본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연에 존재하는 TEM8 유전자{GenBank Accession No. NM_032208(서열번호 : 75)}에서 유래한 폴리뉴클레오티드 및 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열로부터 유래한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴로 인하여, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모든 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU은 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변종을 "침묵 변종(silent variations)"이라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩티드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업자는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변종은 공개된 각 서열에서 비명시적으로 기재되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 이들의 유도체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C 및 G 등의 염기로 적절하게 구성되고, T는 RNA에서는 U로 대체된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 개재 아미노산 서열의 유무를 불문하고 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자 등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 이용한 전통적인 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.

재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 또는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 또는, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

Ⅴ. 엑소솜 ( Exosome )

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포내 소낭을 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 항원제시세포를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 마찬가지로 백신으로써 접종할 수 있다.

복합체에 포함된 HLA 항원의 형태는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 형태와 일치해야한다. 예를 들면, 일본인에 대하여, HLA-A24, 특히 HLA-A2402가 대개 적합하다. HLA 항원에 대해 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 A-24 또는 A-02 형태의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 도움이 되고, A-2402 및 A-0201을 포함하는 아형이 사용된다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 형태는 미리 검사되고 있어, 이 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시세포에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 나타내는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 TEM8 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 1개, 2개 또는 복수의 아미노산의 치환 또는 추가를 실시할 수 있다.

본 발명의 엑소솜에 대하여 A-24 형태의 HLA 항원을 사용할 경우, 서열번호 : 3, 4 또는 9의 서열을 포함하는 펩티드가 사용되고, 한편 A-02 형태의 HLA 항원을 사용할 경우, 서열번호 : 23, 25, 30, 60, 63 또는 68의 서열을 포함하는 펩티드가 사용된다.

Ⅵ. 항원제시세포( antigen - presenting cells , APCs )

또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 항원제시세포(APC)를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 접촉시키는 것에 의해, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현가능한 형태로 도입함으로써 얻을 수 있는 APC는 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 유래할 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과 조합하여 면역 주사로 투여할 수 있다. 또는, 본 발명은 HLA 항원과 함께 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC도 제공하고, 상기 APC는;

(a) 본 발명의 펩티드를 APC와 접촉, 또는

(b) 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC내에 도입하고, APC를 제작함으로써 유도된다.

상기 APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 림프구에 의해 인식되는 것과 같이, 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있는 수지상세포(DC), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화T세포를 포함한다. DC는 강력한 CTL 유도성을 가지는 APC 중의 하나이며, DC는 본 발명의 APC로서 사용된다.

예를 들면, 말초혈액단핵세포로부터 DC를 유도하고, 그런 다음 그것들을 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 APC를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하면, 본 발명의 펩티드가 제시된 APC가 개체의 체내로 유도된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "APC 유도"는 세포를 본 발명의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드와 접촉(자극)시켜 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하는 뉴클레오티드를 포함한다. 또는, APC가 본 발명의 펩티드를 제시할 수 있게 APC에 상기 펩티드를 도입한 후, 개체에 상기 APC를 백신으로서 투여할 수 있다. 예를 들면, 생체 외 투여는 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a : 제 1의 개체에서 APC를 분리하는 단계;

b : 단계 a의 APC를 펩티드와 접촉시키는 단계 및

c : 상기 펩티드를 보유한 APC를 제 2의 개체에 투여하는 단계.

상기 제 1의 개체와 제 2의 개체는 동일한 개체이며, 또는 다른 개체일 수 있다. 또는, 본 발명에 따라, 항원제시세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 항원제시세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드도 제공한다. 단계 b에 의해 얻을 수 있는 APC를 백신으로서 상기 개체에 투여할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양에 있어서, APC는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. "높은 수준의 CTL 유도성"이라는 용어에 있어서, 높은 수준은 펩티드와 접촉시키지 않는 APC 또는 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉시킨 APC의 CTL유도성 수준과 비교한 CTL 유도성 수준이다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APC는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자를 시험관 내에서 APC에 도입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 도입 유전자는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 도입 방법으로는, 특별한 제한 없이, 본 기술분야에서 관례적으로 실시되는 다양한 방법, 예를 들면, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산칼슘법 등을 사용할 수 있다. 더 구체적으로는, Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 특허공보 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자를 APC로 도입함으로써, 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 겪고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 부분적인 펩티드가 제시된다.

Ⅶ. 세포독성 T 세포

본 발명의 펩티드의 어느 것인가에 대해 유도된 세포독성 T 세포는 생체 내에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강하고 그로 인하여 상기 펩티드와 같이 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은;

(a) CD⁸ ⁺ T 세포를, HLA 항원과 본 발명의 펩티드를 함께 제시하는 APC와 접촉시키는 단계에 의해 유도된, 또는

(b) HLA-A24 또는 HLA-A2의 상황에서 본 발명의 펩티드와 결합하는 TCR 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 형질도입된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.

이러한 세포독성 T 세포는 (1) 개체에 투여하거나 (2) 개체에서 유래한 APC, 및 CD8 양성 세포, 또는 말초혈액단핵백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드와의 접촉(자극)을 통해 얻을 수 있다.

본 발명의 펩티드를 제시하는 APC의 자극에 의해 유도되는 세포독성 T 세포는 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체, 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 얻어진 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드, 또는 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 TEM8을 내생적으로 발현하는 세포, 또는 TEM8 유전자가 형질전환된 세포일 수 있고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.

Ⅷ. T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 아단위(subunit)를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 상기 TCR 아단위(subunit)는 TEM8을 제시하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 1개 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 아단위로서의 α 측쇄 및 β 측쇄의 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, 2003). TCR 유도체는 TEM8 펩티드를 제시하는 표적 세포와 높은 결합력으로 결합할 수 있고, TEM8 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효과적인 살상을 생체 내 및 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.

TCR 아단위를 암호화하는 핵산은 적절한 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 핵산 또는 이를 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, 환자 유래의 T 세포 내에 효율적으로 도입할 수 있다. 유용하게는, 본 발명은 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유 동물의 T 세포)의 빠른 변경에 의해, 뛰어난 암 세포 살상 특성을 갖는 변경된 T 세포를 빠르고 쉽게 제작하는 것을 가능하게 하는 즉시 사용가능한(off-the-shelf) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HLA-A24 또는 HLA-A2의 상황에서, 예를 들면, 서열번호 : 3, 4, 9, 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 TEM8 펩티드에 결합하는 TCR 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입함으로써 제작된 CTL을 제공한다. 상기 도입된 CTL은 생체 내에서 암 세포로의 추적이 가능하여, 잘 알려진 배양 방법에 따라 시험관 내에서 증가시킬 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol. , 142, 3452-3461, 1989). 본 발명의 T 세포는 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자의 암의 치료 또는 예방에 유용한 면역원성 조성물 형성에 사용될 수 있다 (WO2006/031221).

방지 및 예방은 질환에 의한 사망 또는 감염의 부담을 줄이는 임의의 행위를 포함한다. 방지 및 예방은 "제 1, 제 2 및 제 3의 예방 수준"으로 행하여 질 수 있다. 제 1의 방지 및 예방은 질환의 발생을 막는 것, 제 2 및 제 3의 수준의 방지 및 예방은 기능을 회복시고 질환 관련된 합병증을 감소시키는 것에 의해 기존의 질환의 악영향을 저하시키는 것에 더하여, 질환의 진행 및 증상의 출현을 방지 및 예방하는 것을 목적으로 한 행위를 포함한다. 또는, 방지 및 예방은 특정한 질환의 중증도를 경감하는, 예를 들면, 종양의 증식 및 전이를 감소, 혈관신생을 감소시키는 것을 목적으로 하는 광범위한 예방적 치료를 포함한다.

암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 암의 재발 방지는, 이하의 예를 들면, 암 세포의 외과적 제거, 암성 세포의 성장의 억제, 종양의 퇴축 또는 퇴화, 완화 유도 및 암의 발생의 억제, 종양의 퇴화, 및 전이의 저하 또는 억제와 같은 임의의 단계를 포함한다. 암이 효과적인 치료 및/또는 예방은 사망율을 감소시키고 암을 가진 개체의 예후를 개선하고, 혈중의 종양 마커 수준을 저하시키며, 이기는 암에 따른 인지 가능한 증상을 경감한다. 예를 들면, 증상의 경감 또는 개선은 효과적인 치료의 구성 요소이며, 및/또는 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 경감, 또는 안정된 질환을 포함한다.

IX . 약학적 조성물

TEM8의 발현은 정상 조직에 비해 종양관련 내피에 있어서 특히 상승하기 때문에(St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482):1197-202), 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 암의 재발 방지에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩티드의 1개 또는 그 이상, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한, 및/또는 수술 후 암의 재발 방지를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 또는, 약학적 조성물로서의 사용을 위하여, 본 발명의 펩티드를 APC와 같은, 상기의 엑소솜 또는 세포의 표면에 발현되게 할 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 상기의 세포독성 T 세포도 본 발명의 약학적 조성물의 활성성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 백신으로서 사용된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "백신"(면역원성 조성물이라고도 함)은 동물에 주사하면 항-종양 면역을 유도하는 기능을 가진 물질을 의미한다.

본 발명의 약학적 물질은 인간, 및 생쥐, 쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비 및 침팬지, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축을 포함하나 이에 한정되지 않고, 모든 포유 동물을 포함하는 개체 또는 환자에 있어서의 암의 치료 및/또는 방지, 및/또는 수술 후 암의 재발 방지에 이용할 수 있다. 　

본 발명에 있어서, 서열번호 : 3, 4 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 종양관련 내피에 대하여 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 제한적인 에피토프 펩티드임을 알게 되었다. 따라서, 서열번호 : 3, 4 및 9의 아미노산 서열을 가지는 임의의 이러한 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A24인 개체에의 투여에 특히 적합한다. 반면에, 서열번호 : 23, 25, 30, 60, 63 또는 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 종양관련 내피에 대하여 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A02 제한적인 에피토프 펩티드임을 알게 되었다. 따라서, 서열번호 : 23, 25, 30, 60, 63 및 68의 아미노산 서열을 가지는 임의의 이러한 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A02인 개체에의 투여에 특히 적합하다. 임의의 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물도 적합하다.

본 발명의 약학적 조성물에 의해 치료할 수 있는 암은 한정되지 않고 예를 들면, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 담관세포암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간장암, 폐암, 신경아세포종, 골육종, 난소암, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 신장암, 정소종양 또는 직장암을 포함하는, TEM8이 관여하는 모든 종류의 암을 포함한다(도 5 참조).

본 발명의 약학적 조성물은 상기의 활성성분에 더하여, 암성 세포에 대한 CTL 유도성을 가지는 기타의 펩티드, 상기 기타의 펩티드를 암호화하는 기타의 폴리뉴클레오티드, 상기 기타의 펩티드를 제시하는 기타의 세포, 또는 그것과 같은 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 암성 세포에 대한 CTL 유도성을 가지는 기타의 펩티드는 암 특이적 항원(예를 들면, 동정된 TAA)에 의해 예시되지만, 이에 한정되지 않는다.

필요한 경우에는, 본 발명의 약학적 조성물은 다른 치료적 물질이 예를 들면, 본 발명의 임의의 펩티드와 같은 활성성분의 종양관련 내피에 대한 항종양 효과를 저해하지 않는 한, 상기 치료적 물질을 활성성분으로서 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제는 항염증 물질, 진통제, 화학요법 방지제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체에 다른 치료적 물질을 포함시키는 것에 더하여, 본 발명의 약물은 1개 또는 그 이상의 다른 약학적 물질과 순차적 또는 동시적으로 투여할 수 있다. 의약 및 약학적 물질의 양은 예를 들어, 사용된 약학적 물질의 종류, 치료되는 질병, 및 투여 계획 및 경로에 따라 결정된다.

본 명세서에서 특별히 언급한 성분에 더하여, 본 발명의 약학적 조성물은 당해의 제제의 형태를 고려하여, 당업계에서 관례적인 다른 약제를 포함할 수 있는 것이 이해되어야한다

본 발명의 일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 약학적인 조성물은 암과 같은 치료하고자하는 질환의 병리학적 상황을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 상기 제품은 라벨을 가지는, 본 발명의 임의의 약학적 조성물의 용기를 포함할 수 있다. 적절한 용기는 병, 유리병 및 시험관을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱 등과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기 상의 라벨에는 해당 내용물이 1개 또는 그 이상의 질병 상태를 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다는 것을 나타내야한다. 상기 라벨은 투여 등에 관한 지시도 나타낼 수 있다.

상기의 용기에 더하여, 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용되는 희석액을 수용하는 제 2의 용기를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 사용을 위한 설명서와 함께, 다른 완충액, 희석액, 여과기, 바늘, 시린지(syringe), 및 첨부문서를 포함하여, 상업적이고 사용자의 입장에서 바람직한 다른 재료도 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 필요한 경우, 활성성분을 포함하는 1개 또는 그 이상의 제형 단위를 포함할 수 있는 팩 또는 분배기 장치로 제공할 수 있다. 상기 팩에는, 예를 들면, 블리스터 팩 등의 금속 또는 플라스틱 포일이 포함될 수 있다. 상기 팩 또는 분배기 장치에는 투여에 관한 설명서가 첨부될 수 있다.

(1) 펩티드를 활성성분으로 포함하는 약학적 조성물

본 발명의 펩티드는 약학적 조성물로 직접 투여할 수 있고, 또는 필요한 경우에는, 종래의 제제 방법에 의해 제제화된다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 더하여, 약물에 주로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특별한 제한 없이 적절하게 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예로는 살균수, 생리식염수, 인산완충액 및 배양액 등이 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 필요에 따라 완충액, 현탁액, 저장액, 계면 활성제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 항암 목적으로 이용할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 생체 내에서 CTL을 유도하기 위하여, 2종 이상의 본 발명의 펩티드를 포함하는 조합으로 제조할 수 있다. 상기 펩티드는 칵테일 상태로 존재하거나 표준 기술을 사용하여 서로 결합되게 할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결시키거나, 1개의 융합 폴리펩티드 서열에서 발현되게 할 수 있다. 조합하는 펩티드는 서로 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 APC 상의 HLA 항원에 의해 고밀도로 제시되고, 제시된 펩티드와 상기 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 또는, 본 발명의 임의의 펩티드가 그것의 세포 표면에 제시된 APC는 개체로부터 APC(예를 들면, DC)를 제거함으로써 얻고, 이러한 APC(예를 들어, DC)를 상기 개체에 다시 투여함으로써 상기 개체에서 CTL을 유도하여, 결과적으로 종양관련 내피에 대한 공격성을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 펩티드를 활성성분으로 포함하는 암의 치료 및/또는 예방용 약학적 조성물은, 세포성 면역이 효과적으로 확립되게 하거나 다른 활성성분과 함께 투여될 수 있으며, 과립제로 제제화하여 투여될 수 있게 하기 위하여 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여할 경우에 상기 단백질에 대한 면역반응을 증강시키는 화합물을 의미한다. 사용 가능한 보조제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7:277-89)에 기재된 것을 포함한다. 보조제의 예로는, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 명반, 콜레라독소 및 살모넬라독소 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

또한, 리포솜 제제, 펩티드가 작은 마이크로미터 직경의 비즈에 결합하고 있는 과립 제제, 및 지방질이 펩티드에 결합하고 있는 제제를 적절하게 사용할 수 있다.

일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 CTL을 자극하는 구성성분을 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 자극할 수 있는 작용물질로서 동정되었다. 예를 들면, 팔미트산 잔기는 리신 잔기의 ε-아미노기 및 α-아미노기에 결합시키고 이어서 본 발명의 펩티드에 연결시킬 수 있다. 그런 다음 지질화된 펩티드는 미셀 또는 입자에 넣어 직접 투여하거나 리포솜에 통합하여 투여하거나, 보조제에 유화시켜 투여할 수 있다. CTL 반응의 지질에 의한 자극의 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 대장균(E. coli) 지질단백질은 적절한 펩티드에 공유결합되면 CTL을 자극할 수 있다(예를 들면, Deres et al., Nature 1999, 342:561).

투여 방법은 경구, 피 내, 피하 또는 정맥내 주사 등이 있고, 및 전신 투여 또는 표적부위의 근방에 국소 투여가 사용될 수 있다. 투여는 단일 투여에 의해 실시하거나, 여러 번 투여에 의해 추가 면역할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 투여량은 치료하는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법에 따라 적절하게 조절할 수 있고, 보통 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎, 예를 들면, 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ ~ 10 ㎎이고 수일부터 몇 개월에 한 번 투여할 수 있다. 당업자는 적절한 투여량을 적절하게 선택할 수 있다.

(2) 활성성분으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산을 발현가능한 형태로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 "발현가능한 형태로"라고 하는 용어는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 도입되었을 경우에, 항종양면역을 유도하는 폴리펩티드가 생체 내에서 발현되는 것을 의미한다. 예시적인 실시태양에 있어서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 표적세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되도록 필요한 것을 갖출 수 있다(상동 재조합 카세트 벡터의 설명에 관해서 예를 들면, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51:503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990, 247:1465-8; 미국 특허 제 5,580,859호; 제 5,589,466호; 제 5,804,566호; 제 5,739,118호; 제 5,736,524호; 제 5,679,647호; 및 WO98/04720. DNA에 근거한 전달 기술의 예로는 "naked DNA", 촉진된{부피비캐인(bupivicaine), 중합체, 펩티드가 매개된}전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자가 매개된("유전자 총") 또는 압력이 매개된 전달이 포함된다(예를 들면, 미국 특허 제 5,922,687호).

본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 발현시킬 수도 있다. 발현 벡터의 예로는 백시니아(vaccinia) 또는 플로우폭스(flowpox) 같은 약화된 바이러스 숙주가 포함된다. 이 접근은 예를 들면, 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 벡터로 백시니아(vaccinia) 바이러스를 사용하는 것과 관련된다. 숙주에 도입하면, 재조합 백시니아 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하고, 그것에 의해 면역반응을 유발한다. 면역화 프로토콜로 유용한 백시니아 벡터 및 이의 방법은 미국 특허 제 4,722,848호에 기재되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351:456-60에 기재되어 있다. 치료적인 투여 또는 면역화를 위해 유용한 다양한 종류의 벡터에는 예를 들면, 아데노 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라균 벡터 및 무독성 탄저병 독소 벡터 등이 있다. Shata et al., Mol Med Today 2000, 6:66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68:793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14:571-85를 참조한다.

환자에게 폴리뉴클레오티드의 전달은 환자가 폴리뉴클레오티드를 가지는 벡터에 직접 노출되는 직접적인 것, 또는 세포가 먼저 시험관 내 관심 대상의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 후 환자에게 이식되는 간접적인 것일 수 있다. 이러한 두가지 접근은 각각 생체 내 유전자 치료 및 생체 외 유전자 치료로 잘 알려져 있다.

유전자 치료 방법의 일반적인 개설에 관해서는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33:573-96; Mulligan, Science 1993, 260:926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62:191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5):155-215를 참조한다. 본 발명에서도 이용할 수 있는 재조합 DNA 기술의 당업계에서 일반적으로 잘 알려진 방법은, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993판; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990판에 기재되어 있다.

투여 방법은 경구, 피 내, 피하 또는 정맥내 주사 등이 있고, 전신 투여 또는 표적부위의 근방에 국소 투여가 사용될 수 있다. 투여는 단일 투여에 의해 실시하거나 여러 번 투여에 의해 추가 면역할 수 있다. 적절한 담체 중의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 형질전환한 세포의 투여량은 치료하는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법에 따라 적절하게 조절할 수 있고 보통 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎, 예를 들면, 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ ~ 10 ㎎이고 수일마다 한번에서 몇 개월마다 한번 투여할 수 있다. 당업자는 적절한 투여량을 적절하게 선택할 수 있다.

X. 펩티드, 엑소솜 , APC 및 CTL 을 사용하는 방법

APC 및 CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 엑소솜 및 APC도 사용할 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APC는 다른 임의의 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한, 상기 화합물로 조합시켜서 사용할 수 있다. 따라서, 상기 본 발명의 임의의 약학적 조성물은 CTL을 유도하기 위하여 사용할 수 있고, 또한, 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것도 하기 기재된 바와 같이 APC를 유도하기 위하여 사용할 수 있다.

(1) 항원제시세포(APC) 유도 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 APC를 유도하는 방법을 제공한다. APC의 유도는 상기 "VI. 항원제시세포" 항목에 기재된 것과 같이 실시할 수 있다. 또한, 본 발명은 높은 수준의 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하는 방법을 제공하고, 상기 유도는 상기 "VI. 항원제시세포" 항목에 언급되어 있다. 바람직하게는, 본 발명은 높은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 펩티드를 APC와 접촉시키거나 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC내에 도입하고, HLA 항원과 함께 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC를 제작하는 단계를 포함한다.

(2) CTL 유도 방법

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 방법은 CD⁸ ⁺T 세포를 하기와 접촉시키는 단계를 포함한다;

(a) HLA 항원과 함께 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC; 또는

(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 항원제시세포에 도입함으로써 유도된 APC.

본 발명의 펩티드를 개체에 투여했을 경우, 상기 개체의 체내에서 CTL이 유도되어, 종양관련 내피를 표적으로 하는 면역반응의 강도가 증강된다. 또는, 개체 유래의 APC, 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액단핵백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜, CTL을 유도한 후, 활성화된 CTL 세포주를 상기 개체에 되돌려주는 생체 내 치료 방법을 위하여 상기 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a : 개체로부터 APC를 분리하는 단계;

b : 단계 a의 APC를 펩티드와 접촉하는 단계;

c : 단계 b의 APC를 CD⁸ ⁺T 세포와 혼합한 후, CTL을 유도하기 위해 동시 배양하는 단계; 및

d : 단계 c의 동시 배양한 것에서 CD⁸ ⁺ T 세포를 분리하는 단계.

또는, 본 발명에 따라, CTL을 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 CTL을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다

단계 d를 통하여 얻은 세포독성 활성을 가진 CD⁸ ⁺T 세포는 백신 접종으로서 개체에 투여될 수 있다. 상기 단계 c에서 CD⁸ ⁺T 세포와 혼합되는 APC는 상기 "Ⅵ. 항원제시세포" 항목에 자세히 설명한 것과 같이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APC로 도입하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, T 세포에 제시되는 펩티드를 효과적으로 제시하는 모든 APC 또는 엑소솜이 본 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에 기재되어 있는 것과 비슷하거나 또는 동일한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본 발명에서 언급하는 모든 출판물, 특허출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 통합된다. 분쟁이 발생할 경우, 정의를 포함하는 본 명세서를 따른다. 또한, 상기 재료, 방법, 및 실시예는 예시에 지나지 않고, 한정되는 것을 의도하는 것이 아니다.

하기의 실시예는 본 발명을 설명하고, 당업자가 같은 것을 제작 및 사용하는 것을 지원하기 위하여 제공된다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 형태로도 한정되지 않는다.

[도 1] 도 1은 TEM8에서 유래한 펩티드로 유도된 CTL에 대한 IFN-γ ELISPOT 분석의 결과를 나타낸 그림이다. TEM8-A24-9-39(서열번호 : 3)로 자극한 5번 및 6번 웰의 CTL(a), TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)로 자극한 6번 웰의 CTL(b), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9)로 자극한 3번 웰의 CTL(c), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23)로 자극한 3번 웰의 CTL(d), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25)로 자극한 6번 웰의 CTL(e), TEM8-A02-9-278(서열번호 : 30)로 자극한 3번 웰의 CTL(f), TEM8-A02-10-338(서열번호 : 60)로 자극한 2번 웰의 CTL(g), TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63)로 자극한 5번 웰의 CTL(h), 및 TEM8-A02-10-333(서열번호 : 68)으로 자극한 4번 웰의 CTL(i)은, 각각 대조군과 비교하여 강력한 IFN-γ 생산을 보였다. 반면에, 음성 데이타(CTL 유도 안함)의 전형적인 예로서, 펩티드 자극한 표적세포에 대하여 TEM8-A02-9-207(서열번호 : 46)로 자극한 CTL에서의 특이적 IFN-γ의 생산은 나타 나지 않았다(j). 예측한 펩티드의 대부분이 CTL 유도를 나타내지 않았고, 따라서 본 발명에서는 양성 데이타(CTL 유도)에 초점을 맞추었다. 이 그림의 웰 위에 있는 사각형은 대응하는 웰의 세포가 증식해서 CTL 세포주를 구축한 것을 나타낸다. 그림에서 "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타낸다.

[도 2] 도 2는 TEM8-A24-9-39(서열번호 : 3)(a), TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)(b), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9)(c), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23)(d), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25)(e), TEM8-A02-9-278(서열번호 : 30)(f), TEM8-A02-10-338(서열번호 : 60)(g), TEM8-A02-10-265(서열번호:63)(h), 및 TEM8-A02-10-333(서열번호 : 68)(i)으로 자극한 CTL 세포주의 구축에 대해 IFN-γ ELISA 분석 결과를 나타낸 꺽은선 그래프이다. 각각의 펩티드의 자극에 의해 구축된 CTL 세포주는 대조군과 비교하여 강력한 IFN-γ 생산을 나타내는 것이 증명되었다. 반면에, 음성 데이타(CTL 유도 안함)의 전형적인 예로서, 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 TEM8-A02-9-207(서열번호 : 46)로 구축한 CTL 세포주에서의 특이적 IFN-γ의 생산은 나타나지 않았다(j). 그림에서 "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타낸다.

[도 3] 도 3은 TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)(a), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9)(b), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23)(c), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25)(d), 및 TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63)(e)로 자극한 CTL클론(clone)의 구축을 나타낸 꺽은선 그래프이다. 각각의 펩티드의 자극에 의해 구축된 CTL클론(clone)은 대응하는 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 강력한 IFN-γ의 생산을 나타냈다. 한편, 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산은 나타나지 않았다. 그림에서 "+"는 적절한 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타낸다.

[도 4] 도 4는 TEM8 및 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201을 내생적으로 발현하는 표적세포에 대한 특이적 CTL 활성을 나타낸 꺽은선 그래프이다. 전장의 TEM8 유전자 또는 TEM8 유래의 적절하지 않은 펩티드를 이용한 자극에 대응하는 HLA 유전자를 형질전화한 COS7세포를 대조군으로서 제작하였다. (a)TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)로 구축한 CTL클론(clone)은 TEM8 및 HLA-A24 모두를 형질전환한 COS7세포에 대해 높은 특이적 CTL 활성을 나타냈다(검은 마름모꼴 표시). 한편, HLA-A*2402(흰 삼각형 표시) 또는 TEM8(흰 원형)의 어느 것인가를 발현하는 표적세포에 대한 유의적인 특이적 CTL 활성은 확인되지 않았다. (b)TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63)로 구축한 CTL클론(clone)은 TEM8 및 HLA-A02 모두를 형질전환한 COS7세포에 대해 높은 특이적 CTL 활성을 나타냈다(검은 마름모꼴 표시). 한편, HLA-A*0201(흰 삼각형 표시) 또는 TEM8(흰 원형)의 어느 것인가를 발현하는 표적세포에 대한 유의적인 특이적 CTL 활성은 확인되지 않았다.

[도 5] 도 5는 TEM8-A24-9-277 펩티드를 이용한 백신 접종의 생체 내 면역원 성 및 항종양 효과를 나타낸 그래프이다. (a) "재료 및 방법"에 기재한 프로토콜에 따라 TEM8 에피토프 펩티드의 생체 내 면역원성을 조사하였다. 불완전 프레운드 보강제(Freund adjuvant, IFA)가 결합된 TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)(M1∼M5) 또는 IFA만(N1 및 N2)을 BALB/c 마우스에 주사하였다. 그림에서 "+"는 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타내고(검은 막대선), "-"는 어떠한 펩티드로도 자극하지 않은 표적세포에 대한 IFN-γ의 생산을 나타낸다(흰 막대선). 백신 접종한 마우스 유래의 비장림프구는 어떠한 펩티드도 자극하지 않은 표적세포에 대해 IFN-γ를 생산하지 않았고, TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)로 자극한 RLmale1세포에 대해서는 IFN-γ를 생산하였다. SFC(spot forming cell)는 스팟을 형성하는 세포를 나타냈다. (b) TEM8 에피토프 펩티드를 이용한 백신 접종으로 의한 항종양 효과를 예방적 설정(preventive setting)으로서 시험하였다. TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4)과 결합된 IFA(검은 삼각형 표시) 또는 펩티드와 결합하지 않은 IFA(흰 마름모꼴 표시)를 7일 전 및 0일째에 BALB/c 마우스에 주사하였다. 0일째에 5×10⁴개의 CT26 마우스 직장암 세포주를, 백신 접종한 마우스에 피하 주사하였다. 종양 사이즈를 5마리 마우스의 평균으로 나타냈다. 에피토프 펩티드의 백신 접종에 의한 종양증식 억제의 유의적인 차이가 관찰되었다(*;P<0.05).

재료 및 방법

세포주

HLA-A24 양성 인간 B-림프구를 엡스타인바 바이러스(Epstein-bar virus)로 형질전환함으로써 24 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주(A24LCL)를 구축하였다. 인간 B-림프아구양 세포주 T2(HLA-A2), COS7 및 마우스 결장직장 암 세포주인 CT26을, ATCC에서 구입하였다. 마우스 림프종 세포주인, RLmale1은, 토호쿠대학(東北大學) 부속 의료용 세포자원 센터에서 구입하였다.

TEM8 유래 펩티드의 후보 선택

HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 분자에 결합하는 TEM8 유래의 9개 및 10개 아미노산 펩티드를 Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1):163-75) 및 Kuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6):1872-81)에 의해 알고리즘이 기재되어 있는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind)를 사용하여 예측하였다. 이러한 펩티드는 표준적인 고체 상 합성법에 따라 Sigma(삿포로, 일본)에서 합성하였고, 역상고속액체크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동일성은 각각 분석용 HPLC 및 질량분석을 통하여 측정하였다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO) 20 ㎎/㎖에 용해하고, -80℃에서 저장하였다.

시험관 내에서의 CTL 유도

단핵세포 유래 수지상세포(dendritic cell, DC)를 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC)로 사용하여 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대한 CTL 반응을 유도하였다. 참고 문헌(Horiguchi S. et al. Cancer Res. 59:2950-6)에 기재된 바와 같이, DC를 시험관 내에서 제작하였다. 특히, Ficoll-Plaque(Pharmacia) 용액을 사용하여 정상적인 지원자(HLA-A*2402 및/또는 HLA-A*0201 양성)에서 분리한 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 단핵세포 비율을 높이기 위하여 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 붙여서 분리하였다. 단핵세포가 많은 개체군을 1000 U/㎖의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 및 1000 U/㎖ 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)(R&D System)가 존재하고 2%의 열에 의해 비활성화된 자가혈청(autologous, AS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 7일 후, 사이토카인으로 유도한 DC에, AIM-V 배지에서 20 ℃에서 4시간 동안, 3 ㎍/㎖의 β2-마이크로글로불린 존재하에서 20 ㎍/㎖의 각각의 합성 펩티드를 적용하였다. 제작한 세포는 그 세포표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 클래스 II 등의 DC 관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(결과는 나타내지 않음). 그런 다음, 펩티드 자극한 DC를 마이토마이신 C(mitomycin C, MMC)에서 불활성화(30 ㎍/㎖로 30분간)하여, CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)를 사용하여 양성 선택으로 얻은 자가 CD8+ T 세포와 1:20의 비율로 혼합하였다. 이들 배양물을 48-웰 플레이트(Corning)에 배양하여; 각 웰은 0.5 ㎖의 AIM-V/2% AS 배지에 1.5×10⁴개의 DC, 3×10⁵개의 펩티드 자극한 CD8+ T 세포, 및 10 ng/㎖의 IL-7(R&D System)을 포함하였다. 배양 3일 후, 상기 배양액에 최종 농도를 20 IU/㎖가 되도록 하여 IL-2(CHIRON)를 첨가하였다. 7일 및 14일 째에, 펩티드로 자극한 자가 DC로 T 세포를 더 자극하였다. 상기와 같은 방법으로 상기 DC를 매회 제조하였다. 21일째에 3차 펩티드 자극 후, 펩티드를 자극한 A24LCL 세포에 대하여 CTL 활성을 측정하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).

CTL 증식 과정

Riddell 등에 의해 보고된 방법과 같은 방법을 사용하여 CTL을 배양하여 증식시켰다(Walter et al., N Engl J Med 1995, 333(16):1038-44; Riddell et al, Nat Med 1996 Feb, 2(2):216-23). 총 5×10⁴개의 CTL을 40 ng/㎖의 항 CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, MMC에 의해 불활성화된 2종류의 인간 B 림프아구양(lymphoblastoid) 세포주와 함께, 25 ㎖의 AIM-V/5% AS 배지에 현탁하였다. 배양 시작한 뒤 1일 후, 120 IU/㎖의 IL-2를 상기 배양물에 첨가하였다. 5, 8 및 11일째에 30 IU/㎖의 IL-2를 함유하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지를 상기 배양물에 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1):94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8):1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May ,97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).

CTL 클론( clone )의 구축

96 웰 둥근 바닥 마이크로 타이터 플레이트(Nalge Nunc International)에 1 웰당 0.3, 1 및 3 CTL이 되도록 희석하였다. 1 웰당 5% AS를 함유하는 총 150 ㎕의 AIM-V 배지에서 1 웰당 1×10⁴세포의 2종류의 인간 B 림프아구양세포주, 30 ng/㎖의 항 CD3 항체, 및 125 U/㎖의 IL-2와 함께 CTL을 배양하였다. 10일 후, IL-2의 최종농도가 125 U/㎖이 되도록 상기 배지에 1 웰당 50 ㎕의 IL-2를 첨가하였다. 14일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기와 같은 방법을 이용하여 CTL 복제(clone)를 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506).

특이적인 CTL 활성

특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론-감마(interferon-γ, IFN-γ) 효소결합 이뮤노스팟(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 분석 및 IFN-γ 효소결합면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 실시하였다. 구체적으로, 펩티드 자극한 A24LCL(1×10⁴개/웰)을 자극세포로서 제조하였다. 48 웰에 배양한 세포 또는 한계 희석 후의 CTL 클론(clone)을 반응 세포(responder cell)로서 사용하였다. IFN-γ ELISPOT 분석 및 IFN-γ ELISA 분석을 제작자의 과정에 따라서 수행하였다.

BALB/c 마우스의 에피토프 펩티드의 면역원성

펩티드 특이적인 CTL을 제조하기 위하여, 마우스 1 마리당 50 ㎕의 HLA-A24 제한적인 펩티드 및 50 ㎕의 IFA를 함유하는 100 ㎕ 백신 혼합물을 사용하여 면역화를 실시하였다. 백신은 0일에 최초 면역화를 위해 마우스 오른쪽 복부에 피하 주사하고, 7일째에 2번째로 왼쪽 복부에 피하 주사하였다. 14일째, 백신 접종한 마우스에서 유래한 지라세포(splenocyte)를 반응 세포로서 사용하였고, 펩티드를 자극하거나 자극하지 않은 RLmale1 세포를 IFN-γ ELISPOT 분석용 자극 세포로서 사용하였다.

생체 내에서 항종양 효과

IFA가 결합된 펩티드를 사용하여 7일전 및 0일째에 백신 접종을 하였다. 0일째에 CT26 세포(마우스 1마리당 5 × 10⁴세포)를 BALB/c 마우스의 오른쪽 복부에 피하 주사하였다. 2개의 수직 직경(㎜²)의 결과로서 종양 증식을 측정하였다.

결과

HLA -A24에 결합하는 TEM8 유래 펩티드의 예측

표 1은 HLA-A*2402 및 HLA-A*0201에 결합하는 TEM8 펩티드를 결합 친화성이 높은 순서대로 나타낸다. 잠재적 HLA-A24 결합성을 가지는 총 21개의 펩티드를 선택하였고, 에피토프 펩티드를 결정하기 위해 시험하여(표 1a), 잠재적인 HLA-A2결합성을 가지는 총 53개의 펩티드를 같은 방법으로 선택하였고, 에피토프 펩티드를 결정하기 위해 시험하였다(표1b 및 표1c). 예측한 펩티드의 대부분이 CTL 유도를 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에서는 CTL 유도를 나타낸 펩티드에 초점을 맞 췄다.

HLA-A24에 결합하는 TEM8 유래 펩티드(9-머(mer) 및 10-머(mer) 펩티드)

시작위치	아미노산 서열	결합 점수	양성 공여자 수	양성 웰 수	양성 CTL 세포주	서열번호
446	WYSPIKGKL	369.6	0/1	0/6	-	1
175	VYCVGVKDF	100	0/1	0/6	-	2
39	CYGGFDLYF	100	1/1			3
277	TYLLCPAPI	75	1/1			4
138	GYRTASVII	50	0/1	0/6	-	5
330	LFLLLALAL	36	-	-	-	6
84	VFSTRGTTL	20	0/1	0/6	-	7
140	RTASVIIAL	11.2	0/1	0/6	-	8
277	TYLLCPAPIL	300	1/1			9
424	EYEFPEPRNL	300	0/1	0/6	-	10
39	CYGGFDLYFI	50	0/1	0/6	-	11
382	YYGGRGVGGI	50	0/1	0/6	-	12
330	LFLLLALALL	30	-	-	-	13
12	GFQWLSLATL	30	0/1	0/6	-	14
64	YFVEQLAHKF	23.76	0/1	0/6	-	15
258	SFKINDSVTL	20	0/1	0/6	-	16
7	RALGIGFQWL	17.28	0/1	0/6	-	17
494	KYPLNNAYHT	15	0/1	0/6	-	18
445	KWYSPIKGKL	12.32	0/1	0/6	-	19
488	KNNQPAKYPL	12	0/1	0/6	-	20
250	RNVDRVLCSF	10.08	0/1	1/6	0/1	21

HLA-A02에 결합하는 TEM8 유래의 9-머(mer) 펩티드

시작위치	아미노산 서열	결합 점수	양성 공여자 수	양성 웰 수	양성 CTL 세포주	서열번호
266	TLNEKPFSV	1653.947	0/1	0/8	-	22
337	ALLWWFWPL	1126.333	1/1			23
331	FLLLALALL	836.253	-	-	-	24
338	LLWWFWPLC	452.836	1/1			25
298	SMNDGLSFI	390.792	0/1	0/8	-	26
8	ALGIGFQWL	223.237	0/1	0/8	-	27
13	FQWLSLATL	190.197	0/1	0/8	-	28
326	ALLILFLLL	150.178	-	-	-	29
278	YLLCPAPIL	149.071	1/1			30
47	FILDKSGSV	86.756	0/1	0/8	-	31
327	LLILFLLLA	73.815	-	-	-	32
94	KLTEDREQI	73.358	0/1	0/8	-	33
329	ILFLLLALA	71.872	-	-	-	34
79	RMSFIVFST	71.796	0/1	0/8	-	35
302	GLSFISSSV	69.552	0/1	0/8	-	36
119	YMHEGFERA	63.000	0/1	0/8	-	37
369	GLPKKKWPT	55.890	0/1	0/8	-	38
453	KLDALWVLL	50.843	0/1	0/8	-	39
112	VLPGGDTYM	46.451	0/1	1/8	0/1	40
328	LILFLLLAL	42.494	-	-	-	41
15	WLSLATLVL	40.289	0/1	1/8	0/1	42
324	AIALLILFL	37.157	-	-	-	43
322	ILAIALLIL	34.246	-	-	-	44
325	IALLILFLL	24.896	-	-	-	45
207	ALQGIIHSI	23.995	0/1	1/8	0/1	46
190	RIADSKDHV	19.213	0/1	0/8	-	47
223	ILAAEPSTI	17.736	0/1	0/8	-	48
104	QGLEELQKV	15.841	0/1	0/8	-	49
170	DLGAIVYCV	11.998	0/1	1/8	0/1	50

HLA-A02에 결합하는 TEM8 유래의 10-머(mer) 펩티드

시작위치	아미노산 서열	결합 점수	양성 공여자 수	양성 웰 수	양성 CTL 세포주	서열번호
459	VLLRkGYDRV	321.549	0/1	0/8	-	51
13	FQWLsLATLV	269.238	0/1	0/8	-	52
326	ALLIIFLLLA	160.655	-	-	-	53
329	ILFLILALAL	134.369	-	-	-	54
337	ALLWwFWPLC	118.745	-	-	-	55
369	GLPKkKWPTV	118.238	0/1	0/8	-	56
15	WLSLaTLVLI	110.379	0/1	0/8	-	57
47	FILDkSGSVL	84.039	0/1	0/8	-	58
327	LLILfLLLAL	83.527	-	-	-	59
338	LLWWfWPLCC	70.098	1/1			60
230	TICAgESFQV	55.468	0/1	0/8	-	61
324	AIALlILFLL	39.184	-	-	-	62
265	VTLNeKPFSV	35.242	1/1			63
111	KVLPgGDTYM	30.962	0/1	0/8	-	64
336	LALLwWFWPL	26.594	-	-	-	64
103	RQGLeELQKV	16.219	0/1	0/8	-	66
409	KLEKaKNARV	15.580	0/1	0/8	-	67
333	LLALaLLWWF	12.019	1/1			68
83	IVFStRGTTL	11.757	0/1	0/8	-	69
7	RALGiGFQWL	11.472	0/1	0/8	-	70
17	SLATlVLICA	11.426	-	-	-	71
305	FISSsVIITT	10.841	-	-	-	72
294	ALQVsMNDGL	10.468	0/1	0/8	-	73
321	SILAiALLIL	10.249	-	-	-	74

시작 부위는 TEM8의 N-말단으로부터의 아미노산의 번호를 나타낸다.

결합 점수는 "BIMAS"로부터 유래한다.

HLA -A*2402 또는 HLA -A*0201로 제한되는 TEM8 유래의 예측된 펩티드를 사용한 CTL 의 유도 및 TEM8 유래 펩티드로 자극한 CTL 세포주의 구축

TEM8 유래 펩티드에 대한 CTL을 "재료 및 방법"에 기재한 프로토콜을 따라 제작하였다. IFN-γ ELISPOT 분석을 통해 펩티드 특이적인 CTL 활성을 측정하였다(도1a ~ i). 이에 의해 TEM8-A24-9-39(서열번호 : 3), TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25), TEM8-A02-9-278(서열번호 : 30), TEM8-A02-10-338(서열번호 : 60), TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63) 및 TEM8-A02-10-333(서열번호 : 68)은 대조군 웰과 비교하여 강력한 IFN-γ 생산을 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 서열번호 : 3으로 자극한 5번, 서열번호 : 4로 자극한 6번, 서열번호 : 9로 자극한 3번, 서열번호 : 23으로 자극한 3번, 서열번호 : 25로 자극한 6번, 서열번호 : 30으로 자극한 3번, 서열번호 : 60으로 자극한 2, 서열번호 : 63으로 자극한 5번 및 서열번호 : 68로 자극한 4번의 양성 웰의 세포를 증폭하여, CTL 세포주를 구축하였다. 그것들의 CTL 세포주의 CTL 활성을 IFN-γ ELISA 분석을 통해 측정하였다(도2a ∼ i). 이에 의해 모든 CTL 세포주는 펩티드로 자극하지 않은 표적세포와 비교하여 대응하는 펩티드로 자극한 표적세포에 대하여 강력한 IFN-γ 생산을 나타내는 것으로 나타났다. 반면에, 표 1에 나타낸 것 이외의 펩티드는 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201과의 결합성을 가질 가능성이 있지만, 그들을 이용한 자극에 의해 구축된 CTL 세포주는 없었다. 예를 들면, TEM8-A02-9-207(서열번호 : 46)로 자극한 CTL 반응의 전형적인 음성 데이타를 도1j 및 도2j에 나타냈다. 결과적으로, TEM8 유래의 9개의 펩티드가 강력한 CTL 세포주를 유도할 수 있는 펩티드로서 스크리닝 된 것을 나타냈다.

TEM8 특이적 펩티드에 대한 CTL 클론( clone )의 구축

또한, "재료 및 방법"의 항목에 기재되어 있는 한계희석에 의해 각 CTL 세포주로부터 CTL 클론(clone)을 구축하였고, 펩티드로 자극한 표적세포에 대한 CTL 클론(clone)으로부터의 IFN-γ 생산을 IFN-γ ELISA 분석을 통해 측정하였다. 도 3에서 서열번호 : 4, 서열번호 : 9, 서열번호 : 23, 서열번호 : 25 및 서열번호 : 63으로 자극한 CTL 클론(clone)으로부터의 강력한 IFN-γ 생산이 측정되었다.

TEM8 및 HLA -A*2402 또는 HLA -A*0201을 내생적으로 발현하는 표적세포에 대한 특이적인 CTL 활성

상기 펩티드에 대한 상기의 구축된 CTL 세포주 또는 클론(clone)에 대하여 TEM8 및 HLA-A*2402 분자를 내생적으로 발현하는 표적세포를 인식하는 그들의 능력을 시험하였다. TEM8 유전자의 전장 및 HLA-A*2402 분자의 유전자 모두를 형질전환 COS7세포에 대한 특이적인 CTL 활성(TEM8 및 HLA-A*2402 유전자를 내생적으로 발현하는 표적세포에 대한 특이적 모델)을 대응하는 펩티드에 의해 제작한 CTL 세포주 또는 클론(clone)을 작동자 세포(effector cell)로서 이용하여 실시하였다. TEM8 유전자의 전장 또는 HLA-A*2402 중 어느 것을 형질전환한 COS7세포를 대조군으로서 제조하였다. 도 4a에서 TEM8 및 HLA-A*24를 모두 형질전환한 COS7세포에 대한 CTL은 강력한 CTL 활성을 보였다. 반면에, 대조군에 대한 현저한 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 또한, HLA-A2 제한적인 펩티드에 대해 구축된 CTL 세포주 또는 클론(clone)에 대하여 TEM8 및 HLA-A*0201분자를 내생적으로 발현하는 표적세포를 인식하는 그들의 능력을 시험하였다. TEM8 유전자의 전장 및 HLA-A*0201 분자의 유전자를 모두 형질전환한 COS7세포에 대한 특이적인 CTL 활성을 시험하였다. 대응하는 HLA-A2 제한적인 펩티드에 의해 유도된 CTL 세포주 및 클론(clone)을 작동자 세포(effector cell)로서 이용하였다. TEM8 유전자의 전장 또는 HLA-A*0201 유전자 중 어느 것을 형질전환한 COS7세포를 대조군으로서 이용하였다. 도 4b에서 서열번호 : 63으로 자극한 CTL은 TEM8 및 HLA-A2를 모두 형질전환한 COS7세포에 대한 강력한 CTL 활성을 나타냈다. 반면에, 상기 대조군에 대한 현저한 특이적 CTL 활성은 나타나지 않았다. 따라서, 이러한 결과에서 서열번호 : 4 및 서열번호 : 63은 HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 분자를 가진 표적세포에 자연적으로 발현되고 상기 CTL에 의해 인지된다는 것이 명확하게 입증되었다. 또한, 그것으로 TEM8 유래의 그들의 2개 펩티드가 CTL을 유도할 수 있는 에피토프 펩티드인 것을 알 수 있었고, 그것이 TEM8 발현 세포를 가진 환자에 대하여 항암 백신을 적용하는데도 도움이 될 수 있을 것이다.

BALB /c 마우스에서 에피토프 펩티드의 면역원성

TEM8 에피토프 펩티드의 면역원성을 평가하기 위하여 BALB/c 마우스에 대하여 서열번호 : 4의 면역화를 실시하였다. IFA 결합 펩티드의 2번째 주사 후 펩티드 특이적인 CTL 활성을 IFN-γ ELISPOT 분석을 통하여 측정하였다. 백신 접종한 마우스로부터 회수한 비장세포를 반응세포로서 사용하였을 경우, 강력한 IFN-γ 생산이 특이적으로 검출되었고, 도 5에서 서열번호 : 4에 특이적인 IFN-γ 생산은 5 마리중 4 마리의 마우스(M1, M3, M4 및 M5)에서 검출되었지만, 대조군 마우스(N1 및 N2)에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 서열번호 : 4가 펩티드를 자극한 표적세포에 대한 특이적 CTL을 생체 내에서 유도한다는 것을 나타냈다.

TEM8 에피토프 펩티드 백신 접종의 항종양 효과

펩티드를 사용하여 항종양 효과를 조사하기 위하여, CT26 종양 세포주를 사용하여 생체 내 항종양 모델을 검사하였다. 7일 전 및 0일째에 서열번호 : 4의 투여를 실시하였고, 0일째에 BALB/c 마우스에 CT26 직장암 세포를 피하 주사하였다. 서열번호 : 4를 백신 접종한 마우스에서는 대조군 마우스와 비교하여 종양 증식이 현저히 억제되었다(도 5b). 서열번호 : 4를 사용하여 백신 접종을 받은 마우스에서의 종양 증식 억제는 통계적으로 유의적인 차이가 나타났다(P<0.05).

항원 펩티드의 상동성 ( homology ) 분석

하기의 펩티드:

TEM8-A24-9-39(서열번호 :3),

TEM8-A24-9-277(서열번호 :4),

TEM8-A24-10-277(서열번호 :9),

TEM8-A02-9-337(서열번호 :23),

TEM8-A02-9-338(서열번호 :25),

TEM8-A02-9-278(서열번호 :30),

TEM8-A02-10-338(서열번호 :60),

TEM8-A02-10-265(서열번호 :63) 및

TEM8-A02-10-333(서열번호 :68)으로 자극한 CTL은 각각, 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 나타내는 것이 입증되었다.

이 결과는 상기 펩티드의 서열이 인간 면역계를 감작하는 것이 알려져 있는 다른 분자에서 유래하는 펩티드와 상동적이라고 하는 사실에 기인할 가능성이 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 이들의 펩티드 서열에 대해 높은 상동성을 가진 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast. cgi) 검색을 이용하여 상동성(homology) 분석을 실시하였다. 상동성(homology) 분석의 결과에서 TEM8-A24-9-39(서열번호 : 3), TEM8-A24-9-277(서열번호 : 4), TEM8-A24-10-277(서열번호 : 9), TEM8-A02-9-337(서열번호 : 23), TEM8-A02-9-338(서열번호 : 25), TEM8-A02-9-278(서열번호 : 30), TEM8-A02-10-338(서열번호 : 60), TEM8-A02-10-265(서열번호 : 63) 및 TEM8-A02-10-333(서열번호 : 68)의 서열은 각각 고유한 것이며 따라서, 본 발명자들의 지식으로는 어떠한 관련되지 않은 분자에 대응하여 의도하지 않은 면역반응을 발생시킬 가능성이 거의 없는 것을 알 수 있다.

결론적으로, TEM8 유래의 신규한 HLA-A*2402 또는 A*0201 에피토프 펩티드를 동정하였다. 또한, TEM8의 에피토프 펩티드는 암 면역치료에 적용할 수 있음을 입증하였다.

본 발명은 혈관신생에 관련된 광범위한 질환에서 형성되는 내피세포를 표적으로 하는 CTL을 유도하고, 백신으로서 매우 유효한 신규 펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 이들의 임의의 펩티드를 활성성분으로 포함하는, 종양 등의 혈관신생에 관련된 질환의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 면역을 유도하는데 필요한 펩티드의 크기는 대단히 작다(예를 들면, 9 ∼ 10 아미노산 잔기). 따라서, 본 발명은 상기 펩티드의 합성 및 정제를 지극히 간단히 실행할 수 있다는 점에서 특히 유리하다.

본 발명에서 인용한 모든 출판물, 특허, 및 특허출원은 전체적으로 본 문서에 참조문헌으로 삽입된다.

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synthesized peptide sequence <400> 61 Thr Ile Cys Ala Gly Glu Ser Phe Gln Val 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 62 Ala Ile Ala Leu Leu Ile Leu Phe Leu Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 63 Val Thr Leu Asn Glu Lys Pro Phe Ser Val 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 64 Lys Val Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 65 Leu Ala Leu Leu Trp Trp Phe Trp Pro Leu 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 66 Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 67 Lys Leu Glu Lys Ala Lys Asn Ala Arg Val 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 68 Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Trp Trp Phe 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 69 Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 70 Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 71 Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 72 Phe Ile Ser Ser Ser Val Ile Ile Thr Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 73 Ala Leu Gln Val Ser Met Asn Asp Gly Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 74 Ser Ile Leu Ala Ile Ala Leu Leu Ile Leu 1 5 10 <210> 75 <211> 5540 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (144)..(1835) <400> 75 aattgcttcc ggggagttgc gagggagcga gggggaataa aggacccgcg aggaagggcc 60 cgcggatggc gcgtccctga gggtcgtggc gagttcgcgg agcgtgggaa ggagcggacc 120 ctgctctccc cgggctgcgg gcc atg gcc acg gcg gag cgg aga gcc 167 Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala 1 5 ctc ggc atc ggc ttc cag tgg ctc tct ttg gcc act ctg gtg ctc atc 215 Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile 10 15 20 tgc gcc ggg caa ggg gga cgc agg gag gat ggg ggt cca gcc tgc tac 263 Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr 25 30 35 40 ggc gga ttt gac ctg tac ttc att ttg gac aaa tca gga agt gtg ctg 311 Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu 45 50 55 cac cac tgg aat gaa atc tat tac ttt gtg gaa cag ttg gct cac aaa 359 His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys 60 65 70 ttc atc agc cca cag ttg aga atg tcc ttt att gtt ttc tcc acc cga 407 Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg 75 80 85 gga aca acc tta atg aaa ctg aca gaa gac aga gaa caa atc cgt caa 455 Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln 90 95 100 ggc cta gaa gaa ctc cag aaa gtt ctg cca gga gga gac act tac atg 503 Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met 105 110 115 120 cat gaa gga ttt gaa agg gcc agt gag cag att tat tat gaa aac aga 551 His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg 125 130 135 caa ggg tac agg aca gcc agc gtc atc att gct ttg act gat gga gaa 599 Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu 140 145 150 ctc cat gaa gat ctc ttt ttc tat tca gag agg gag gct aat agg tct 647 Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser 155 160 165 cga gat ctt ggt gca att gtt tac tgt gtt ggt gtg aaa gat ttc aat 695 Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn 170 175 180 gag aca cag ctg gcc cgg att gcg gac agt aag gat cat gtg ttt ccc 743 Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro 185 190 195 200 gtg aat gac ggc ttt cag gct ctg caa ggc atc atc cac tca att ttg 791 Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu 205 210 215 aag aag tcc tgc atc gaa att cta gca gct gaa cca tcc acc ata tgt 839 Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Glu Pro Ser Thr Ile Cys 220 225 230 gca gga gag tca ttt caa gtt gtc gtg aga gga aac ggc ttc cga cat 887 Ala Gly Glu Ser Phe Gln Val Val Val Arg Gly Asn Gly Phe Arg His 235 240 245 gcc cgc aac gtg gac agg gtc ctc tgc agc ttc aag atc aat gac tcg 935 Ala Arg Asn Val Asp Arg Val Leu Cys Ser Phe Lys Ile Asn Asp Ser 250 255 260 gtc aca ctc aat gag aag ccc ttt tct gtg gaa gat act tat tta ctg 983 Val Thr Leu Asn Glu Lys Pro Phe Ser Val Glu Asp Thr Tyr Leu Leu 265 270 275 280 tgt cca gcg cct atc tta aaa gaa gtt ggc atg aaa gct gca ctc cag 1031 Cys Pro Ala Pro Ile Leu Lys Glu Val Gly Met Lys Ala Ala Leu Gln 285 290 295 gtc agc atg aac gat ggc ctc tct ttt atc tcc agt tct gtc atc atc 1079 Val Ser Met Asn Asp Gly Leu Ser Phe Ile Ser Ser Ser Val Ile Ile 300 305 310 acc acc aca cac tgt tct gac ggt tcc atc ctg gcc atc gcc ctg ctg 1127 Thr Thr Thr His Cys Ser Asp Gly Ser Ile Leu Ala Ile Ala Leu Leu 315 320 325 atc ctg ttc ctg ctc cta gcc ctg gct ctc ctc tgg tgg ttc tgg ccc 1175 Ile Leu Phe Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Trp Trp Phe Trp Pro 330 335 340 ctc tgc tgc act gtg att atc aag gag gtc cct cca ccc cct gcc gag 1223 Leu Cys Cys Thr Val Ile Ile Lys Glu Val Pro Pro Pro Pro Ala Glu 345 350 355 360 gag agt gag gaa gaa gat gat gat ggt ctg cct aag aaa aag tgg cca 1271 Glu Ser Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gly Leu Pro Lys Lys Lys Trp Pro 365 370 375 acg gta gac gcc tct tat tat ggt ggg aga ggc gtt gga ggc att aaa 1319 Thr Val Asp Ala Ser Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Val Gly Gly Ile Lys 380 385 390 aga atg gag gtt cgt tgg gga gaa aag ggc tcc aca gaa gaa ggt gct 1367 Arg Met Glu Val Arg Trp Gly Glu Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Ala 395 400 405 aag ttg gaa aag gca aag aat gca aga gtc aag atg ccg gag cag gaa 1415 Lys Leu Glu Lys Ala Lys Asn Ala Arg Val Lys Met Pro Glu Gln Glu 410 415 420 tat gaa ttc cct gag ccg cga aat ctc aac aac aat atg cgt cgg cct 1463 Tyr Glu Phe Pro Glu Pro Arg Asn Leu Asn Asn Asn Met Arg Arg Pro 425 430 435 440 tct tcc ccc cgg aag tgg tac tct cca atc aag gga aaa ctc gat gcc 1511 Ser Ser Pro Arg Lys Trp Tyr Ser Pro Ile Lys Gly Lys Leu Asp Ala 445 450 455 ttg tgg gtc cta ctg agg aaa gga tat gat cgt gtg tct gtg atg cgt 1559 Leu Trp Val Leu Leu Arg Lys Gly Tyr Asp Arg Val Ser Val Met Arg 460 465 470 cca cag cca gga gac acg ggg cgc tgc atc aac ttc acc agg gtc aag 1607 Pro Gln Pro Gly Asp Thr Gly Arg Cys Ile Asn Phe Thr Arg Val Lys 475 480 485 aac aac cag cca gcc aag tac cca ctc aac aac gcc tac cac acc tcc 1655 Asn Asn Gln Pro Ala Lys Tyr Pro Leu Asn Asn Ala Tyr His Thr Ser 490 495 500 tcg ccg cct cct gcc ccc atc tac act ccc cca cct cct gcg ccc cac 1703 Ser Pro Pro Pro Ala Pro Ile Tyr Thr Pro Pro Pro Pro Ala Pro His 505 510 515 520 tgc cct ccc ccg ccc ccc agc gcc cct acc cct ccc atc ccg tcc cca 1751 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ala Pro Thr Pro Pro Ile Pro Ser Pro 525 530 535 cct tcc acc ctt ccc cct cct ccc cag gct cca cct ccc aac agg gca 1799 Pro Ser Thr Leu Pro Pro Pro Pro Gln Ala Pro Pro Pro Asn Arg Ala 540 545 550 cct cct ccc tcc cgc cct cct cca agg cct tct gtc tagag cccaaagttc 1850 Pro Pro Pro Ser Arg Pro Pro Pro Arg Pro Ser Val 555 560 ctgctctggg ctctctcaga aacttcagga gatgttagaa caagtctttc cagttagaga 1910 agaggagtgg tgataaagcc cactgacctt cacacattct aaaaattggt tggcaatgcc 1970 agtataccaa caatcatgat cagctgaaag aaacagatat tttaaattgc cagaaaacaa 2030 atgatgaggc aactacagtc agatttatag ccagccatct atcacctcta gaaggttcca 2090 gagacagtga aactgcaaga tgctctcaac aggattatgt ctcatggaga ccagtaagaa 2150 aatcatttat ctgaaggtga aatgcagagt tggataagaa atacattgct gggtttctaa 2210 aatgctgcct tcctgcctct actccacctc catccctgga ctttggaccc ttggcctagg 2270 agcctaagga ccttcacccc tgtgcaccac ccaagaaaga ggaaaacttt gcctacaact 2330 ttggaaatgc tggggtccct ggtgtggtaa gaaactcaac atcagacggg tatgcagaag 2390 gatgttcttc tgggatttgc aggtacataa aaaatgtatg gcatcttttc cttgcaaatt 2450 cttccagttt ccaagtgaga aggggagcag gtgtttactg atggaaaagg tatgttgcta 2510 tgttgatgtg taagtgaaat cagttgtgtg caatagacag gggcgtattc atgggagcat 2570 cagccagttt ctaaaaccca caggccatca gcagctagag gtggctggct ttggccagac 2630 atggacccta aatcaacaga caatggcatt gtcgaagagc aacctgttaa tgaatcatgt 2690 taaaaatcaa ggtttggctt cagtttaaat cacttgaggt atgaagttta tcctgttttc 2750 cagagataaa cataagttga tcttcccaaa ataccatcat taggacctat cacacaatat 2810 cactagtttt ttttgtttgt ttgttttttg ttttttttct tggtaaagcc atgcaccaca 2870 gacttctggg cagagctgag agacaatggt cctgacataa taaggatctt tgattaaccc 2930 ccataaggca tgtgtgtgta tacaaatata cttctctttg gcttttcgac atagaacctc 2990 agctgttaac caaggggaaa tacatcagat ctgcaacaca gaaatgctct gcctgaaatt 3050 tccaccatgc ctaggactca ccccatttat ccaggtcttt ctggatctgt ttaatcaata 3110 agccctataa tcacttgcta aacactgggc ttcatcaccc agggataaaa acagagatca 3170 ttgtcttgga cctcctgcat cagcctattc aaaattatct ctctctctag ctttccacaa 3230 atcctaaaat tcctgtccca agccacccaa attctcagat cttttctgga acaaggcaga 3290 atataaaata aatatacatt tagtggcttg ggctatggtc tccaaagatc cttcaaaaat 3350 acatcaagcc agcttcattc actcacttta cttagaacag agatataagg gcctgggatg 3410 catttatttt atcaatacca atttttgtgg ccatggcaga cattgctaat caatcacagc 3470 actatttcct attaagccca ctgatttctt cacaatcctt ctcaaattac aattccaaag 3530 agccgccact caacagtcag atgaacccaa cagtcagatg agagaaatga accctacttg 3590 ctatctctat cttagaaagc aaaaacaaac aggagtttcc agggagaatg ggaaagccag 3650 ggggcataaa aggtacagtc aggggaaaat agatctaggc agagtgcctt agtcagggac 3710 cacgggcgct gaatctgcag tgccaacacc aaactgacac atctccaggt gtacctccaa 3770 ccctagcctt ctcccacagc tgcctacaac agagtctccc agccttctca gagagctaaa 3830 accagaaatt tccagactca tgaaagcaac cccccagcct ctccccaacc ctgccgcatt 3890 gtctaatttt tagaacacta ggcttcttct ttcatgtagt tcctcataag caggggccag 3950 aatatctcag ccacctgcag tgacattgct ggacccctga aaaccattcc ataggagaat 4010 gggttcccca ggctcacagt gtagagacat tgagcccatc acaactgttt tgactgctgg 4070 cagtctaaaa cagtccaccc accccatggc actgccgcgt gattcccgcg gccattcaga 4130 agttcaagcc gagatgctga cgttgctgag caacgagatg gtgagcatca gtgcaaatgc 4190 accattcagc acatcagtca tatgcccagt gcagttacaa gatgttgttt cggcaaagca 4250 ttttgatgga atagggaact gcaaatgtat gatgattttg aaaaggctca gcaggatttg 4310 ttcttaaacc gactcagtgt gtcatccccg gttatttaga attacagtta agaaggagaa 4370 acttctataa gactgtatga acaaggtgat atcttcatag tgggctatta caggcaggaa 4430 aatgttttaa ctggtttaca aaatccatca atacttgtgt cattccctgt aaaaggcagg 4490 agacatgtga ttatgatcag gaaactgcac aaaattattg ttttcagccc ccgtgttatt 4550 gtccttttga actgtttttt ttttattaaa gccaaatttg tgttgtatat attcgtattc 4610 catgtgttag atggaagcat ttcctatcca gtgtgaataa aaagaacagt tgtagtaaat 4670 tattataaag ccgatgatat ttcatggcag gttattctac caagctgtgc ttgttggttt 4730 ttcccatgac tgtattgctt ttataaatgt acaaatagtt actgaaatga cgagaccctt 4790 gtttgcacag cattaataag aaccttgata agaaccatat tctgttgaca gccagctcac 4850 agtttcttgc ctgaagcttg gtgcaccctc cagtgagaca caagatctct cttttaccaa 4910 agttgagaac agagctggtg gattaattaa tagtcttcga tatctggcca tgggtaacct 4970 cattgtaact atcatcagaa tgggcagaga tgatcttgaa gtgtcacata cactaaagtc 5030 caaacactat gtcagatggg ggtaaaatcc attaaagaac aggaaaaaat aattataaga 5090 tgataagcaa atgtttcagc ccaatgtcaa cccagttaaa aaaaaaatta atgctgtgta 5150 aaatggttga attagtttgc aaactatata aagacatatg cagtaaaaag tctgttaatg 5210 cacatcctgt gggaatggag tgttctaacc aattgccttt tcttgttatc tgagctctcc 5270 tatattatca tactcagata accaaattaa aagaattaga atatgatttt taatacactt 5330 aacattaaac tcttctaact ttcttctttc tgtgataatt cagaagatag ttatggatct 5390 tcaatgcctc tgagtcattg ttataaaaaa tcagttatca ctataccatg ctataggaga 5450 ctgggcaaaa cctgtacaat gacaaccctg gaagttgctt tttttaaaaa aataataaat 5510 ttcttaaatc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5540 <210> 76 <211> 564 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg 20 25 30 Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile 35 40 45 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr 50 55 60 Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met 65 70 75 80 Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr 85 90 95 Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser 115 120 125 Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val 130 135 140 Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr 145 150 155 160 Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr 165 170 175 Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala 180 185 190 Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu 195 200 205 Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Ala Glu Pro Ser Thr Ile Cys Ala Gly Glu Ser Phe Gln Val Val 225 230 235 240 Val Arg Gly Asn Gly Phe Arg His Ala Arg Asn Val Asp Arg Val Leu 245 250 255 Cys Ser Phe Lys Ile Asn Asp Ser Val Thr Leu Asn Glu Lys Pro Phe 260 265 270 Ser Val Glu Asp Thr Tyr Leu Leu Cys Pro Ala Pro Ile Leu Lys Glu 275 280 285 Val Gly Met Lys Ala Ala Leu Gln Val Ser Met Asn Asp Gly Leu Ser 290 295 300 Phe Ile Ser Ser Ser Val Ile Ile Thr Thr Thr His Cys Ser Asp Gly 305 310 315 320 Ser Ile Leu Ala Ile Ala Leu Leu Ile Leu Phe Leu Leu Leu Ala Leu 325 330 335 Ala Leu Leu Trp Trp Phe Trp Pro Leu Cys Cys Thr Val Ile Ile Lys 340 345 350 Glu Val Pro Pro Pro Pro Ala Glu Glu Ser Glu Glu Glu Asp Asp Asp 355 360 365 Gly Leu Pro Lys Lys Lys Trp Pro Thr Val Asp Ala Ser Tyr Tyr Gly 370 375 380 Gly Arg Gly Val Gly Gly Ile Lys Arg Met Glu Val Arg Trp Gly Glu 385 390 395 400 Lys Gly Ser Thr Glu Glu Gly Ala Lys Leu Glu Lys Ala Lys Asn Ala 405 410 415 Arg Val Lys Met Pro Glu Gln Glu Tyr Glu Phe Pro Glu Pro Arg Asn 420 425 430 Leu Asn Asn Asn Met Arg Arg Pro Ser Ser Pro Arg Lys Trp Tyr Ser 435 440 445 Pro Ile Lys Gly Lys Leu Asp Ala Leu Trp Val Leu Leu Arg Lys Gly 450 455 460 Tyr Asp Arg Val Ser Val Met Arg Pro Gln Pro Gly Asp Thr Gly Arg 465 470 475 480 Cys Ile Asn Phe Thr Arg Val Lys Asn Asn Gln Pro Ala Lys Tyr Pro 485 490 495 Leu Asn Asn Ala Tyr His Thr Ser Ser Pro Pro Pro Ala Pro Ile Tyr 500 505 510 Thr Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Cys Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ala 515 520 525 Pro Thr Pro Pro Ile Pro Ser Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Pro Pro 530 535 540 Gln Ala Pro Pro Pro Asn Arg Ala Pro Pro Pro Ser Arg Pro Pro Pro 545 550 555 560 Arg Pro Ser Val

Claims

서열번호 76으로 기재되는 서열 내에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 분리된 노나(nona)펩티드 또는 데카(deca)펩티드.
서열번호 3, 4 및 9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 노나펩티드 또는 데카펩티드.
하기의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 유도성을 가지는 펩티드:

(a) 서열번호 3, 4 또는 9; 및

(b) 서열번호 : 3, 4 또는 9에서 1개, 2개 또는 복수의 아미노산이 치환 또는 추가.
제 3항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 치환을 가지는 펩티드:

(a) N-말단에서 2번째의 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌(Methionin) 및 트립토판; 및

(b) C-말단의 아미노산이 페닐알라닌, 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판 및 메티오닌(Methionin).
서열번호 23, 25, 30, 60, 63 및 68로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 노나펩티드 또는 데카펩티드.
하기의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도성을 가지는 펩티드:

(a) 서열번호 23, 25, 30, 60, 63 또는 68; 및

(b) 서열번호 23, 25, 30, 60, 63 또는 68에서 1개, 2개 또는 복수의 아미노산이 치환 또는 추가.
제 6항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 1개의 치환을 가지는 펩티드:

(a) N-말단에서 2번째의 아미노산이 루신(leucine) 또는 메티오 닌(Methionin); 및

(b) C-말단의 아미노산이 발린 또는 루신(leucine).
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항의 1개 또는 그 이상의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는. 종양 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 종양 재발 방지를 위한 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A02인 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 9항에 있어서, 약학적 조성물은 암 치료를 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 약학적 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드, 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜(exosome).
제 12항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
제 12항에 있어서, HLA항원이 HLA-A2402인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
제 12항에 있어서, HLA항원이 HLA-A02인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
제 12항에 있어서, HLA항원이 HLA-A0201인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 사용에 의한 높은 CTL 유도성을 가지는 항원제시세포를 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 사용에 의한 CTL을 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 항원제시세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 사용에 의한 높은 CTL 유도성을 가지는 항원제시세포를 유도하는 방법.
제 1항 내지 제 7항의 펩티드 중 어느 것을 표적으로 하는 분리된 세포독성 T 세포.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드의 사용에 의해 유도된, 또는 HLA-A24 또는 HLA-A2의 상황에서, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드와 결합하는 TCR 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질도입된, 분리된 세포독성 T 세포.
HLA 항원 및 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 항원제시세포.
(a) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 사용; 또는

(b) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사용에 있어서, 항원제시세포가 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 항원제시세포에 도입함으로써 항원제시세포가 유도되는 것에 의해 유도된 항원제시세포.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 펩티드, 면역학적으로 활성화 이의 단편, 또는 상기 펩티드 또는 상기 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양관련 내피에 대한 면역반응을 유도하는 방법.