KR20140057325A - Ｍｐｈｏｓｐｈ１ 펩티드 및 이를 포함한 백신 - Google Patents

Ｍｐｈｏｓｐｈ１ 펩티드 및 이를 포함한 백신 Download PDF

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    • G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation

Abstract

본 명세서에서 상세하게 설명한 바와 같이, MPHOSPH1 유래의 분리된 에피토프 펩티드는 HLA 항원과 결합하여 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)를 유도하고, 이에 따라 암 면역치료의 범주, 보다 구체적으로 암 백신에서 사용되기에 적합하다. 본 발명의 펩티드는 상기-언급한 MPHOSPH1 유래의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 형태 모두를 포함하며, 원래 서열의 CTL 유도능을 유지하는 한 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 이들의 변형된 것을 제공한다. 추가로, 상기 언급한 펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 언급한 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 약학적 제제 또는 조성물이 제공된다. 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 직장암, 위암, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 림프종, 골육종, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하는 암 및 종양의 치료 및 예방 중 하나 또는 모두에서 구체적으로 유용하다.

Description

ＭＰＨＯＳＰＨ１ 펩티드 및 이를 포함한 백신{MPHOSPH1 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME}
본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 백신으로서 효과적인 신규한 펩티드 뿐만 아니라 종양의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다를 위한 약물에 관한 것이다.
우선권
본 출원은 2011년 8월 12일에 출원된 미국 가출원 제 61/822,991 호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
세포독성 T 림파구(Cytotoxic T lymphocytes, CTLs)는 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 종류 I 분자 상에서 주요하게 발견된 종양관련 항원(tumor-associated antigens, TAAs)에서 유래한 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인식하여, 이어서 종양 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 TAA가 면역학적 접근을 통해 발견되었다(NPL 1, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 상기 TAA 중 일부는 현재 면역치료법의 표적으로서 임상 개발 과정에 있다.
유망한 TAA는 암 세포의 증식 및 생존에 필수적이다. 면역치료를 위한 표적으로서 이러한 TAA의 이용은 치료상으로 유도된 면역 선별(immune selection)의 결과로서, TAA의 결실, 돌연변이, 또는 하향-조절(down-regulation)에 기인한 암 세포의 면역 회피(immune escape)의 잘-묘사된 위험을 최소화할 수 있다. 따라서, 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있는 새로운 TAA의 동정(identification)은, 그 이상의 발전 및 이후 다양한 종류의 암에 대한 펩티드 백신 전략의 임상 적용을 보장한다(NPL 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 지금까지, 상기 종양관련 항원 유래 펩티드를 이용한 여러 임상 시도가 보고되었다. 불행히도, 현재 다수의 암 백신 시도는 낮은 목표 회답률(response rate)만을 보였다(NPL 11, Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). 따라서, 면역요법의 표적으로 신규 TAA가 당업계에서 필요로 남아있다.
MPHOSPH1(M기 인단백질 1(M-phase phosphoprotein 1); 유전자은행 등록번호(GenBank Accession No.) NM_016195 및 NP_057279, 서열번호(서열번호): 125 및 126)은, G2/M 전이에 있어서 특이적으로 인산화된 단백질 중 하나로서 동정되어, 양성-말단 방향의(plus-end-directed) 키네신(kinesin) 관련 단백질로서 특징화되었다(NPL 14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.). 더욱 구체적으로, MPHOSPH1은 세포질 분열(cytokinesis )에서 중요한 역할을 담당하여, 헤라 세포(HeLa cells) 내에서 후기(anaphase )부터 말기(telophase) 동안에 방추체(spindle)의 중간구역(midzone)에 축적되는 양성-말단 방향의 분자 모터(molecular motor) 로서 보고된 바 있다(NPL 14, Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; NPL 15, Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8). 23,040 개의 유전자를 포함하는 게놈-와이드 cDNA 마이크로어레이(genome-wide cDNA microarray)를 사용하는 유전자 발현 프로파일 분석의 과정에서, MPHOSPH1은 유방암에 있어서 상향 조절되는 신규한 분자로서 동정되었다(NPL 16, Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1;67(7):3276-85.; PTL 1, WO2006/085684). 또한, 노던블럿 분석을 통해서, MPHOSPH1 유전자 산물의 발현은 정소(testis)에 한정되며 정상의 주요 기관에서는 발견되지 않는 것으로 확인되었다.
세포 살해성 T 림프구(CTL) 유도능(inducibility)을 가지는 MPHOSPH1 유래의 몇 가지 펩티드 단편은 이전에 동정되었다(PTL 2, WO2008/047473). 이러한 펩티드 단편은 동족(cognate) 펩티드 단편에 자극된 세포에 대하여 CTL을 유도하는 능력을 확인하였다. 그러나, 이전에 연구는 펩티드 절편이 MPHOSPH1 유전자 및 HLA-A2 항원을 발현하는 종양 세포를 표적으로 하는 CTL을 유도하는 능력을 가지는가에 대하여 확인하는 것에는 실패하였다.
WO2006/085684 WO2008/047473
Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52. Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8 Kanehira M et al., Cancer Res. 2007 Apr 1; 67(7):3276-85.
본 발명은, 최소 부분으로, 면역치료법의 적합한 표적으로서 역할을 할 수 있는 신규한 펩티드의 발견을 기반으로 한다. TAA는 일반적으로 면역계에 대해 “자기(self)”로 인지되어 종종 내재 면역성을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 발견은 매우 중요하다. 앞서 언급했듯이, MPHOSPH1(예를 들어, 유전자 은행 등록번호 NM_016195(서열 번호: 125)의 유전자에 의해 암호화된 서열번호: 126)은 암에서 상향조절 되는 것으로 동정되었으며, 이러한 암의 예시는 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma) 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 암/종양 면역 치료의 후보 표적으로써 MPHOSPH1을, 더욱 구체적으로 적합한 면역치료의 표적으로써 제공될 수 있는 신규한 MPHOSPH1 에피토프(epitope) 펩티드에 초점을 맞춘다.
그 목적에 달하기 위하여, 본 발명은 MPHOSPH1 유래의 펩티드 중에서 MPHOSPH1에 특이적인 CTL을 유도하는 능력을 가지는 특이적 에피토프 펩티드의, 적어도 일부분에 대해, 향하여 있다. 하기에 더욱 자세히 기술된 것과 같이, 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 MPHOSPH1으로부터 유래되어 HLA-A*0201에 결합하는 후보 펩티드를 사용하여 자극되었다. 그 후 각 후보 펩티드에 부가(pulsed)하여 HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포독성을 갖는 CTL 세포주가 확립되었다. 상기 결과는 이러한 펩티드가 MPHOSPH1를 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A2에 제한된(restricted) 에피토프 펩티드임을 증명한다. 상기 결과는 또한 MPHOSPH1은 강한 면역원성(immunogenic)이고, 그것의 에피토프는 암/종양 면역치료법에 효과적인 표적임을 증명한다.
따라서, 본 발명의 목적은 HLA 항원에 결합하고, CTL을 유도하는 분리되 펩티드를 제공하는 것이며, 상기 펩티드는 MPHOSPH1(서열번호: 126)의 면역적으로 활성의 단편을 포함한다. 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 밖(ex vivo)에서 CTLs를 유도하는 데 사용될 수 있거나, 암에 대한 생체 내(in vivo) 면역반응을 유도하기 위한 물질을 직접적으로 투여할 수 있으며, 그 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 펩티드는 일반적으로 길이가 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10 개 아미노산 미만이다. 본 발명의 바람직한 펩티드는 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이다. 더욱 바람직한 펩티드는 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산을 가지며, 이들 펩티드는 HLA-A2 항원에 결합하여 CTL을 유도하는 것으로 보고되었기 때문이다.
따라서, 몇 가지 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10 개의 아미노산 길이 미만의 펩티드이다. 전형적인 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 노나펩티드 또는 데카펩티드이다. 추가로, 본 명세서에서 밝힌 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 120의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다.
시험관 내, 생체 밖 또는 생체 내에서 항원표시세포(antigen presenting cells, APCs)와 접촉하였을 때, 본 발명의 펩티드는 APC 상의 HLA-A2 항원과 결합하여, HLA-A2 항원과 복합체로서 APC 위에 나타난다. 대체적으로, 본 발명의 펩티드는 APC에 의해 흡수되어, APC 내에서 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 절편에 가공되고(processed), HLA-A2 항원과의 복합체로서 APC 상에 나타날 수 있다. 결과적으로, 상기 펩티드에 특이적인 CTL이 유도되며, 상기 CTL은 본 발명의 요소(element)로서 여겨진다.
본 발명은 또한 변형된 펩티드가 원래 변형되지 않은 펩티드와 동질의 CTL 유도능(inducibility)을 유지하는 한, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택되는 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환(substituted), 결실(deleted), 삽입(inserted) 및/또는 추가(added)되는 아미노산 서열을 가지는 변형된 펩티드를 고려한다. 이러한 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 CTL 유도능을 가지며 하기 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 길이 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10 미만의 아미노산의 분리된 펩티드를 제공한다:
(i) 서열번호: 5, 14, 및 64로 이루어지 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 다수의 아미노산이 치환된 아미노산 서열
(ii) 상기 아미노산 서열은 하기의 특징의 하나 또는 둘 다를 가지는, (i)의 아미노산 서열
(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산은 발린(valine) 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 발명은 또한 CTL 유도능을 가지며 하기의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 길이 15, 14, 13, 12, 또한 11 미만의 아미노산에서 분리된 펩티드를 제공한다:
(i’) 한 개, 두 개 또는 다수의 아미노산은 서열번호: 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 치환된 아미노산 서열, 및
(ii’) 상기 아미노산 서열은 하기 특징 중 하나 또는 둘 다를 가지는, (i’)의 아미노산 서열:
(a) 상기 서열번호의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 및
(b) 상기 서열번호의 C-말단 아미노산은 발린(valine) 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 펩티드는 APC 상에 HLA-A2 항원과 결합하여, HLA-A2 항원과의 복합체로서 APC 상에 나타날 수 있다. 대체적으로, 상기 펩티드는 이들 펩티드가 APC와 접촉할 때, APC에 의해 흡수되어, APC 내에서 (i), (ii), (i`), 및 (ii`)으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단편에서 가공되고, HLA-A2 항원과의 복합체로서 APC 상에 나타날 수 있다. 결과적으로, 이러한 펩티드에 특이적인 CTL이 유도되어 상기 CTL은 본 발명의 요소로서 여겨진다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 펩티드 중 어떠한 것을 암호하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도능을 가지는 APC를 유도 또는 준비하는데 사용될 수 있다. 상기 기재된 본 발명의 펩티드와 유사하게, 상기 APC는 암에 대하여 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있다.
개체 내 투여될 때, 본 발명의 펩티드는 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위하여 APCs의 표면에 제시된다. 그러므로, 본 발명의 하나의 목적은 CTL을 유도하기 위하여 본 발명에서 제공된 어떤 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(composition) 및 제제(agent)를 제공하는 것이다. 어떤 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는, 조성물 또는 제제는 암의 치료 및/또는 예방 또는 수술 후 암의 재발, 상기 암은 AML, CML, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, 식도암, 위암, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암, SCLC, NSCLC, 연부 조직 종양 및 고환 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료 및 암의 예방(prophylaxis) 중 하나 또는 둘 다를 위하여 약학적 제제 또는 조성물을 제공하는 것이며, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 제제화한다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 대신 또는 추가하여, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 펩티드의 어느 것을 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 활성성분으로써 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, APCs를 본 발명의 펩티드와 접촉시키거나 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드를 APCs 내로 도입함으로써, HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하고 있는 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 APCs는 그들의 표면에 표적 제시하는 세포를 특이적으로 인식하는 CTLs을 유도하는 능력을 가지고 있어 암 면역치료에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하는 방법 뿐만 아니라 상기 방법으로 수득된 APC를 포함한다. 추가로, 본 발명은 APC의 유도에서 사용하기 위한 제제 또는 조성물을 제공하며, 상기 제제 또는 조성물은 본 발명의 어느 하나의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 CTL을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 이들의 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 APC 또는 엑소솜과 함께 CD8-양성 세포를 공배양하는(co-culturing) 단계 또는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit) 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 중 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계이며, 상기 TCR은 본 발명의 펩티드 및 세포 표면에 제시된 HLA 항원의 복합체와 결합할 수 있다. 상기 방법으로 수득된 CTL은 암의 치료 및 암의 예방 중 어느 하나 또는 둘 다에 사용될 수 있다. 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
그러나 본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 APCs를 제공하는 것이다. 본 발명은 더욱이 본 발명의 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL을 제공한다. 상기 APCs 및 CTL은 암 면역치료로의 관련에서 이용된다.
그러나 본 발명의 또 다른 목적은 암에 대한 면역 반응을 그것을 필요로 하는 개체에서 유도하는 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC 및 상기 펩티드를 자시의 표면에 제시하는 세포를 인식하는 CTL 중에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 제제 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 적용가능성은 암과 같이, MPHOSPH1의 과발현과 관련 있거나 이로부터 발생하는 수많은 질병 중 어느 것으로 확대할 수 있고, 암의 예로는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 다음을 제공한다:
[1] 하기 (a) 또는 (b)에 따른 분리된 펩티드:
(a) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드.
(b) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 1, 2 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 결실, 도입 및/또는 첨가된 펩티드로서, 상기 펩티드는 세포독성 T 림파구(Cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 유도능을 가지는 펩티드.
[2] 상기 펩티드는 하기 특징을 하나 또는 둘 다를 가지는 펩티드인, [1]의 분리된 펩티드:
(a) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택됨; 및
(b) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택됨.
[3] 상기 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인, [1] 또는 [2]의 분리된 펩티드,
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화(encoding)하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide),
[5] [1] 내지 [3] 중 어느 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 [4]의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CTL 유도용 조성물,
[6] [1] 내지 [3] 중 어느 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 [4]의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CTL 유도능을 가지는 APC 유도용 조성물,
[7] 하기의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물:
(a) [1] 내지 [3] 중 어느 하나 또는 그 이상의 펩티드;
(b) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면(surface)에 제시하는 하나 또는 그 이상의 APCs 또는 엑소솜(exosomes); 및
(d) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인지하는 하나 또는 그 이상의 CTL.
[8] 암의 치료 및 재발 중 어느 하나 또는 둘 다에 사용하기 위해, 또는 개체 내에 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 [7]의 약학적 조성물.
[9] 상기 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위하여 제형화된, [7] 또는 [8]의 약학적 조성물,
[10] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법이고, CTL 유도성을 가지는 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법:
(a) 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 APC에 접촉시키는 단계, 및
(b) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계,
[11] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법인, CTL을 유도하는 방법:
(a) HLA 항원 및 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APCs와 CD8-양성 T 세포를 공-배양(co-culture)하는 단계;
(b) HLA 항원 및 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜(exosome)과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계; 및
(c) TCR은 세표 표면에 표시되는 HLA 항원 및 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있고, 상기 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 아단위(subunit) 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포 내로 도입하는 단계,
[12] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC,
[13] [10]의 방법에 의해 유도되는, [12]의 APC,
[14] HLA 항원 및 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인식하는 분리된 CTL,
[15] 상기 CTL은 [11]에 의해 유도되는 [14]의 CTL.
[16] 대상에 약학적으로 유효한 양의:
(a) [1] 내지 [3] 중 어느 하나 또는 그 이상의 펩티드;
(b) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜; 또는
(d) [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인식하는 하나 또는 그 이상의 CTL를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법인, 개체에서 감의 치료 또는 예방 중 어느 하나 또는 둘 다의 방법,
[17] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법인, 이들을 필요로 하는 개체에 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법,
[18] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드에 대한 항체 또는 이들의 면역학적인 활성 단편,
[19] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터,
[20] [19]의 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 숙주세포(host cell),
[21] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 펩티드, [4]의 폴리뉴클레오티드 또는 [18]의 항체를 포함하는 진단 키트(diagnostic kit).
본 발명의 목적 및 특징은 하기 상세한 설명을 동봉된 도면 및 실시예와 연계하여 읽을 때 더욱 완전하게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상기 요약 및 하기의 상세한 설명 둘 다는 본보기가 되는 실시예이고, 및 본 발명이나 또는 본 발명의 다른 대안적 실시예를 제한하지 않는다고 이해될 것이다. 특히, 본 발명은 여기에서 많은 구체적인 실시예에 관하여 설명되지만, 그 설명은 본 발명의 예시일뿐 및 본 발명의 제한으로 구성되지 않는다고 평가될 것이다. 본 발명의 정신(spirit) 및 범위(scope)에서 벗어나지 않는 한, 첨부된 청구항에 의해 기술된 것과 같이, 다양한 변형 및 적용이 당업자에게 일어날 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 다른 목적, 특징, 유용성(benefit) 및 이점(advantages)는 상기 요약 및 하기에 기술된 특정 실시예로부터 명백해질 것이고, 및 당업자에게도 용이하게 명백할 것이다. 상기 목적, 특징, 유용성 및 이점은 동봉된 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터 가능한 모든 타당한 추론과 함께, 단독으로, 또는 여기에서 통합된 참조문헌의 고려와 함께 상기로부터 명백할 것이다.
본 발명의 다양한 측면 및 적용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 자세한 설명 및 이의 하기 바람직한 실시예을 고려하여 당업자에게 명백하게 될 것이다.
[도 1] 도 1은 MPHOSPH1 유래 펩티드로 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타낸, 일련의 사진, (a) 내지 (j)로 구성되어 있다. MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5)(a)로 자극된 웰 번호 #7, MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14)(b)로 자극된 웰 번호 #5, MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64)(c)로 자극된 웰 번호 #5, MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73)(d)로 자극된 웰 번호 #2, MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77)(e)로 자극된 웰 번호 #1, MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79)(f)로 자극된 웰 번호 #1, MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97)(g)로 자극된 웰 번호 #4, MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103)(h)로 자극된 웰 번호 #45 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)(i)로 자극된 웰 번호 #8 내의 CTL은 각각 대조군과 비교하여 강력한 IFN-감마 생산물을 제시하였다. 이 도의 웰에 있는 사각형은 해당 웰의 세포가 CTL 세포주를 수립하기 위해 확장되었음을 나타낸다. 대조적으로, 네거티브 데이터의 일반적인 경우와 같이, MPHOSPH1-A02-9-575(서열번호: 1)(j)로 자극된 CTL로부터의 특이적인 IFN-감마 생산은 제시되지 않았다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 나타내고, 및 “-”는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다.
[도 2a 내지 f] 도 2a 내지 f는 MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5)(a), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14)(b), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64)(c), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73)(d), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77)(e), 및 MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79)(f)로 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 나타내는, IFN-감마 ELISA 분석 결과를 나타낸, 일련의 선그래프 (a) 내지 (f)로 구성되어 있다. CTL 주가 생산하는 IFN-감마의 양은 IFN-감마 효소-결합 면역흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)로 측정되었다. 결과는 각 펩티드에 의한 자극으로 수립된 CTL 세포주는 대조군과 비교하였을 때 IFN-감마 생산의 강력하게 나타내는 것을 확인하였다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 나타내고, 및 “-”는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다. R/S 비는 응답 세포(responder cells)(CTL 세포주) 및 자극 세포(stimulator cell)의 수의 비를 나타낸다.
[도 2g 내지 i] 도 2g 내지 i는 MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97)(g), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103)(h) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)(i)로 자극된 CTL 세포주의 IFN-감마 생산을 나타내는, IFN-감마 ELISA 분석 결과를 나타낸, 일련의 선그래프 (g) 내지 (i)로 구성되어 있다. CTL 주가 생산하는 IFN-감마의 양은 IFN-감마 효소-결합 면역흡착 검사(ELISA)로 측정되었다. 결과는 각 펩티드에 의한 자극으로 수립된 CTL 세포주는 대조군과 비교하였을 때 IFN-감마 생산의 강력하게 나타내는 것을 확인하였다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 나타내고, 및 “-”는 어떤 펩티드로도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산물을 나타낸다. R/S 비는 응답 세포(CTL 세포주) 및 자극 세포의 수의 비를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 MPHOSPH1-A02-9-850(서열 번호: 5)(a), MPHOSPH1-A02-9-846(서열 번호: 64)(b), MPHOSPH1-A02-10-460(서열 번호: 73) (c), MPHOSPH1-A02-10-770(서열 번호: 77) (d) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열 번호: 120) (e)로 자극된 CTL 세포주로부터 제한 희석(limiting dilution)하여 수립된 CTL 클론의 IFN-감마 생산을 나타내는, (a) 내지 (e), 일련의 선그래프로 구성된다. 상기 결과는 각 펩타이드로 자극되어 수립된 CTL 클론들이 대조군과 비교하여 강한 IFN-감마 생산을 제시함을 나타낸다. 도면에서, “+”는 적절한 펩티드로 부가된 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 나타내고, 및 “-”는 어떤 펩티드도 부가되지 않은 표적 세포에 대한 IFN-감마 생산을 나타낸다. R/S 비는, 응답세포(CTL 클론) 및 자극 세포의 수의 비율을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 종양세포주에 대하여 특이적 CTL 활성을 나타내는 일련의 선 그래프이다. MPHOSPH1 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 J82 세포, MPHOSPH1을 발현하나 HLA-A*0201를 발현하지 않는 HT1376 세포 및 HLA-A*0201를 발현하나 MPHOSPH1를 발현하지 않는 T2 세포는 자극 세포로서 사용되었다. MPHOSPH1-A02-10-282(서열 번호: 120)으로 수립된 CTL 클론은 J82 세포에 대하여 특이적인 CTL 활성을 나타었다. 반면, 유의적이지 않은 특이적 CTL 활성은 HT1376 및 T2 세포에 대하여 검출되었다. R/S 비는 응답 세포(CTL 클론) 및 자극 세포의 수의 비를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 종양세포주에 대하여 CTL의 세포 살해 활성을 나타내는 일련의 선 그래프이다. MPHOSPH1 및 HLA-A*0201을 모두 발현하는 UMUC-3 세포, MPHOSPH1을 발현하나 HLA-A*0201를 발현하지 않는 MKN45 세포 및 HLA-A*0201를 발현하나 MPHOSPH1를 발현하지 않는 T2 세포는 표적 세포로서 사용되었다. MPHOSPH1-A02-10-282(서열 번호: 120)로 수립된 CTL 클론은 UMUC-3 세포에 대하여 강력한 세포 살해 활성을 나타내었다. 반면, 유의적이지 않은 특이적 CTL 활성은 MKN45 및 T2 세포에 대하여 검출되었다. E/T 비는 효과 세포(CTL 클론) 및 표적 세포의 수의 비를 나타낸다
[도 6] 도 6는 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201를 발현하는 표적 세포에 대하여 CTL의 세포 살해 활성을 나타내는 선 그래프이다. HLA-A*0201 또는 전장의 MPHOSPH1 유전자로 형질감염(transfected)한 COS7 세포가 대조군으로 준비되었다. MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 수립된 CTL 세포주는 MPHOSPH1 및 HLA-A*0206 둘 다로 형질감염한 COS7 세포(검은 마름모꼴)에 대하여 특이적인 CTL 활성을 나타냈다. 반편, 유의적이지 않은 특이적 CTL 활성은 HLA-A*0201(삼각형) 또는 MPHOSPH1(원) 중 어느 하나를 발현하는 표적세포에 대하여 검출되었다.
비록 여기에서 기술한 것과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실시예의 검사 또는 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 재료는 여기에서 기술된다. 하지만, 본 발명의 재료 및 방법을 기술하기 전에, 본 발명의 설명은 단지 설명하기 위한 것일 뿐, 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 또한, 여기에서 기술한 특정한 크기, 종류, 면적, 재료, 방법론, 프로토콜(protocol) 등으로 제한되지 않는데, 이것은 그것들이 일반적인 실험 및/또는 최적화에 따라 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 기술에서 사용되는 전문용어(terminology)는 오직 실시예 또는 특정 버전(version)을 기술하려는 목적이 있고, 및 이것은 오직 하기 청구항에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에서 언급된 각각의 출판물, 특허, 또는 특허 출원의 표시는 여기에서 이의 전체가 구체적으로 참조로서 통합된다. 하지만, 본 명세서상의 어떤 것도 공지에 의해 공개된 바 또는 이전 발명과 같이 선행된 권리로서 인정하지 않는다.
따로 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 대립이 있는 경우에는, 용어의 정의를 포함한, 현 상세한 설명이 규제할 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 예시는 묘사하는 것 뿐이며, 한정하는 것을 의미하지 않는다.
I. 정의
여기에서 사용되는 단어 “a”, “an”, 및 “the”는 따로 분명하게 명시되지 않는 한, “적어도 하나”를 의미한다.
물질(예를 들어, 펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 등)과 연관되어 사용되는 용서 “추출(isolated)” 및 “정제(purified)”는 천연 재료에 그 밖에 포함될 수 있는 적어도 하나의 물질의 상당한 제거를 나타낸다. 따라서, 추출 또는 분리된 펩티드는 펩티드가 유래된 세포 또는 조직 재료로부터의 탄수화물, 지질, 또는 다른 오염발생 단백질과 같은 세포 물질이 상당히 제거되거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구물질 또는 다른 화학물질이 상당히 제거된 펩티드를 지칭한다. 용어 “세포 물질의 상당한 제거(substantially free of cellular material)”는 펩티드 준비를 포함하고 여기에서 상기 펩티드는 세포의 세포 구성요소로부터 분리되며 이 세포로부터 추출 또는 재조합하여 생산된다. 따라서, 세포 물질이 상당히 제거된 펩티드는(또한 여기에서 “오염유발 단백질(contaminating protein)”로 지칭되는) 이종 단백질(건조 중량을 기준)의 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%보다 적은 폴리펩티드의 준비를 포함한다. 상기 펩티드가 재조합되어 생산될 때, 이는 또한 바람직하게 배양 배지를 상당히 제거하고, 이는 상기 펩티드 준비 부피의 약 20%, 10%, 또는 5%보다 적게 배양 배지와 펩티드의 준비를 포함한다. 상기 펩티드가 화학적 합성에 의해 생산될 때, 이는 바람직하게 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질을 상당히 제거하고, 이는 상기 펩티드 준비 부피의 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량을 기준)보다 적게 펩티드 합성과 관여된 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질과 함께 펩티드의 준비를 포함한다. 특정한 펩티드 준비는 추출 또는 정제된 펩티드를 함유하는 것은 예를 들어, 단백질 준비 및 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 의 소듐 도데실 황산염(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤 전기영동 또는 상기 젤의 유사물이 제시될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는 추출 또는 정제된다.
용어 “폴리펩티드(polypeptide)”, “펩티드(peptide)” 및 “단백질(protein)”은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 여기에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 변형될 수 있는 잔기(들), 또는 자연적으로 발생한 아미노산 중합체(naturally occurring amino acid polymers)뿐만 아니라, 자연적으로 발생한 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체(들)(artificial chemical mimetic(s))와 같은, 비자연적으로 발생한 잔기(들)(non-naturally occurring residue(s))인 아미노산 중합체에 적용된다.
본 명세서에서 종종 사용되는 용어 “올리고펩티드(oligopeptide)”는 길이가 20개 또는 보다 적은 잔기, 전형적으로 15개 또는 보다 적은 잔기인 본 발명의 펩티드를 나타내기 위해 사용되고, 전형적으로 약 8개 및 약 11개 잔기, 종종 9개 또는 10개 잔기 사이로 구성된다. 후자는 각각, “노나펩티드(nonapeptides)”및 “데카펩티드(decapeptides)”로서 여기에 언급된다.
여기에서 사용되는 용어 “아미노산(amino acid)”은 자연적으로 발생한 아미노산과 비슷하게 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라, 자연적으로 발생 및 합성(synthetic)된 아미노산을 나타낸다. 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산 둘 중 어느 하나일 수 있다. 자연적으로 발생한 아미노산은 세포 안에서 번역(tranlation) 후에 변형된 것뿐 아니라, 유전자코드에 의해 암호화된 것이다(예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate), 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)). 상기 용어 “아미노산 유사체”는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 알파 탄소)를 가지고 있지만 그러나 변형된 하나 또는 그 이상의 R기(들) 또는 변형된 골격(backbone)을 가지는 화합물(예를 들어, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium))을 나타낸다. 상기 구 “아미노산 모방체”는 서로 다른 구조를 갖지만 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 나타낸다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomeclatere Commission)가 권장하는 일반적으로 알려진 3문자 약어(symbol) 또는 1-문자 약어로 여기에서 표기될 수 있다.
용어 “유전자”, “폴리뉴클레오티드” 및 “핵산”은 여기에서 호환적으로 사용되고, 달리 명백하게 나타내지 않는 한 일반적으로 인정되는 한-문자 코드로 나타내어 상기 아미노산과 유사하다.
용어 “제제(agent)” 및 “조성물(composition)”은 구체적 양의 구체적 성분의 조합으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 결과하는 어떠한 생산물뿐 아니라, 구체적 양의 구체적 성분을 포함하는 생산물에 관하여 나타내기 위하여 여기에서 교환적으로 사용된다. 수식어 “약학적”(“약학적 제제” 및 “약학적 조성물“로서)으로 관련되어 사용될 때, 상기 용어는 유효 성분, 및 담체로 구성된 어떤 비유효(inert) 성분(들)을 포함하는 생산물, 뿐만 아니라 어느 둘 또는 그 이상의 성분의 조합, 복합(complexation) 또는 집적(aggregation)으로부터, 또는 상기 성분의 하나 또는 그 이상의 분리로부터, 또는 상기 성분의 하나 또는 그 이상의 상호결합 또는 반응의 다른 종류로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 형성되는 어떤 생산물을 포함하도록 의도한다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 상기 용어 “약학적 제제” 및 “약학적 조성물”은 본 발명의 분자 또는 화합물 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체의 혼합에 의해 만들어진 어떤 산물(product)에 관한 것이다.
여기에서 사용되는, 어구(pharse) "약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용 가능한 담체"는, 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 재료, 조성물, 물질, 또는 수단(vehicle)를 의미하며, 액체 또는 고체 충전제(solid filler), 희석제, 부형제(excipient), 용매, 또는 캡슐화 물질(encapsulating material)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적인 제제 또는 조성물은 특히 백신으로서 사용을 발견한다. 본 발명과의 관련에 있어서, 어구 "백신"("면역원성조성물"로 또한 언급된다)은 동물에 접종되는 때에 항-종양 면역력(immunity)을 유도하는 기능을 가지는 제제 또는 조성물을 나타낸다.
여기에서 용어 “유효 성분(active ingredient)”은 생물학적 또는 생리학적으로 활성이 있는 제제 또는 조성물의 물질에 관한 것이다. 특히, 약학적 제제 또는 조성물의 맥락에서, 상기 용어 “유효 성분”은 목표 약학적 효과를 나타내는 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 암의 치료 또는 예방에서 사용을 위한 약학적 제제 또는 조성물의 경우, 상기 제제 또는 조성물의 유효 성분은 암 세포 및/또는 조직에 직접적으로 또는 간접적으로 최소 하나의 생물학적 또는 생리학적 작용(action)을 유도할 수 있다. 바람직하게, 이러한 작용은 암 세포 성장 감소 또는 저해, 암 세포 및/또는 조직의 손상 또는 살해(killing), 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 유효 성분의 간접적 효과는 암 세포를 인지하거나 살해하는 CTL의 유도이다. 제형화되기 전에, “유효 성분”은 또한 “대량(bulk)”, “약물 물질(drug substance)” 또는 “기술적 제품(technical product)”으로 나타낼 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 용어 “암”은 MPHOSPH1 유전자를 과발현하는 암을 나타내며, 이의 예는 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma) 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다
달리 정의되지 않는 한, 용어 “세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)”, “세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)” 및 “CTL”은 여기에서 호환되어 쓰이며 달리 구체적으로 지정되지 않는 한, 비-자기 세포(non-self cell)( 예를 들어, 종양/암 세포, 바이러스-감염된 세포)를 인식 및 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는, 용어 “HLA-A2”는 예를 들어 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 및 HLA-A*0250을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 예와 같은 아류형(subtype)을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 용어 “키트(kit)”는, 시약(reagent) 및 다른 물질의 혼합에 관하여 사용된다. 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker), 등을 포함할 수 있다고 여기에서 고려된다. “키트” 용어는 시약 및/또는 물질의 특정한 혼합으로 한정됨을 의도하지 않는다.
여기에서 사용되듯이, 개체 또는 환자의 맥락에서, 상기 구 “개체의(또는 환자의) HLA 항원은 HLA-A2이다”는 개체 또는 환자가 MHC(major histocompatibility complex) 종류 I 분자로서 HLA-A2 항원 유전자를 동형 또는 이형으로 소유하고, HLA-A2 항원은 HLA 항원으로서 상기 개체 또는 환자의 세포에서 발현되는 것에 관한 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 “치료(treatment)”라는 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 개체 내에서 암의 크기, 유병(prevalence), 또는 전이력(metastatic potential)의 감소, 암의 진행 지연(retarding progression), 암의 임상 증상의 완화(alleviation), 생존 시간의 연장, 향후 재발의 억제 등과 같은 임상적 이득을 초래한다면 치료는 “효과적(efficacious)”으로 여겨진다. 상기 치료가 예방을 위하여 이용될 때, “효과적”은 그것이 암의 형성을 지연 또는 방지하거나 또는 암의 임상적 증상을 방지 또는 경감시키는 것을 의미한다. 효과성은 특정 종양 종류를 진단 또는 치료하기 위해 어떠한 알려진 방법과 관련하여 결정된다.
본 발명의 방법 및 조성물이 암의 “방지(prevention)” 및 “예방(prophylaxis)”의 맥락에서 유용성을 갖는 범위 내에서, 질병으로부터 치사율(mortality) 또는 사망률(morbidity)의 부담(burden)을 감소시키는 어떤 활성을 나타내기 위하여 상기의 용어들은 여기에서 상호교환된다. 방지 및 예방은 “1차, 2차 및 3차 예방 수준”에서 일어날 수 있다. 1차 예방 및 방지가 질병의 발달을 피하는 반면, 2차 및 3차 수준의 방지 및 예방은 질병 진행 및 증상 발현의 방지 및 예방뿐만 아니라 기능을 개선 또는 질병 관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 수립된 질병의 부정적 영향을 감소시키는 활성을 포함한다. 그 대신에, 방지 및 예방은 특정 장애(disorder)의 심각성을 완화시키는, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 목적으로 예방적 치료법의 넓은 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는, 예를 들면, 암 세포의 성장 억제, 종양의 퇴화(involution) 또는 퇴행(regression), 완화(remission)의 유도, 암 발생의 억제, 종양 퇴행, 전이의 감소 또는 억제, 암 수술후 재발의 억제 및 생존 시간의 연장과 같은 상기 이벤트(event)를 아우르는 의미의 활성을 포함한다. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방은 치사율을 감소시키고 암을 가지는 개개인의 예후(progrosis)를 개선시키며, 혈액에 있는 종양 마커의 수준을 감소시키고, 및 암을 동반하는 탐지가능한 증상을 완화시킨다. 예를 들어, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료하는 것으로 여겨지고 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정 병변(stable disease)을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 “항체(antibody)”는 지정된 단백질 또는 이의 펩티드에 대해 특이적으로 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 이의 단편을 지칭한다. 항체는 인간 항체(human antibodies), 영장류 항체(primatized antibodies), 키메라 항체(chimeric antibodies), 이중특이적 항체(bispecific antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), 다른 단백질 또는 방사선 표지와 결합된 항체, 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 더욱이, 여기에서 항체는 가장 넓은 의미로 사용되고 특히 완전한 단일클론 항체(intact monoclonal antibodies), 다클론 항체(polyclonal abtibodies), 최소한 2개의 완전한 항체로부터 형성된 다중-특이적 항체(multi-specific antibodies)(예를 들어 이중특이적 항체(bispecific antibodies)), 및 항체 단편을 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 포함한다. “항체”는 모든 클래스(예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)를 나타낸다.
II . 펩티드:
하기 상세히 기술된 본 발명의 펩티드는 “MPHOSPH1 펩티드(들)”또는 “MPHOSPH1 폴리펩티드(들)”로서 지칭될 수 있다.
MPHOSPH1로부터 유래된 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 기능 한다는 것을 나타내기 위하여, 흔히 HLA 대립 유전자와 만나는 HLA-A2에 의해 제한되는 항원 에피토프인지 결정하기 위하여 MPHOSPH1(서열 번호: 126)에서 유래된 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). HLA-A2으로의 그들의 결합 친화력(binding affinity)에 기반하여 MPHOSPH1으로부터 유래된 HLA-A2 결합 펩티드 후보가 동정되었다.
또한, 시험관 내(in vitro)에서 상기 펩티드를 추가한(적재한(loaded)) 수지상 세포(dendritic cells; DCs)에 의해 T-세포를 시험관 내에서 자극한 후, CTLs은 하기 펩티드의 각각을 이용하여 DC를 자극함으로써 성공적으로 수립되었다:
MPHOSPH1-A2-9-850(서열번호: 5),
MPHOSPH1-A2-9-129(서열번호: 14),
MPHOSPH1-A2-9-846(서열번호: 64),
MPHOSPH1- A2-10-460(서열번호: 73),
MPHOSPH1-A2-10- 770(서열번호: 77),
MPHOSPH1-A2-10- 407(서열번호: 79),
MPHOSPH1-A2-10- 923(서열번호: 97),
MPHOSPH1- A2-10-1484(서열번호: 103) 및
MPHOSPH1- A2-10-282(서열번호: 120).
상기 수립된 CTL은 각각의 펩티드에 의해 자극받은 표적 세포에 대해 강한 특이적 CTL 활성을 보인다. 이러한 결과는 MPHOSPH1이 CTLs에 의해 인지되는 항원임 및 상기 검사되는 펩티드들은 HLA-A2에 의해 제한되는 MPHOSPH1의 에피토프 펩티드임을 나타내고; 따라서, 상기 펩티드는 CTLs에 의한 세포 독성을 위한 표적 항원으로써 효과적인 수 있다. 추가로, MPHOSPH1-A2-10-282(서열번호: 120)은 MHC 클래서 I 분자로서 MPHOSPH1 및 HLA-A2 항원 모두를 발현하는 암 세포에 대하여 강력한 세포 독성을 가지는 CTLs를 유도한다. 상기 결과는 MPHOSPH1-A2-10-282 펩티드가 생체 내에서 자연적으로 HLA-A2 항원(예를 들어, HLA-A*0201 또는 HLA-A*0206)에 의해 MPHOSPH1를 나타내는 암 세포에 나타나도록 발생하는 것을 나타낸다. 상기 발견에 따르면, 서열 번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120, 또는 이의 유도체, 변이체(mutant), 변종(variant) 또는 변형된 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 MPHOSPH1 및 HLA-A2 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 면역학적인 치료의 범위에서 유용하다. 본 발명의 어떠한 실시예에 있어서, 여기에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드는 암의 면역학적인 치료에서 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암의 예시는, 예를 들면,
방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암 및 연부 조직 종양을 포함한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들이 MPHOSPH1 및 HLA-A2 항원을 발현하기만 하면, 어떤 암에도 적용될 수 있다.
MPHOSPH1 유전자는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양과 같은 암 세포에서 발현되나, 대부분의 정상 조직에서는 발현되지 않기 때문에, 이것은 면역치료에 대한 좋은 표적이다. 따라서, 본 발명은 MPHOSPH1 유래 CTL-인식 에피토프의 노나펩티드(nonapeptides, 9개의 아미노산으로 구성된 펩티드) 및 데카펩티드(decapeptides, 10개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 그 대신에, 본 발명은 HLA 항원에 결합 및 세포독성 T 세포(CTLs)를 유도하는 분리된 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드는 MPHOSPH1(서열번호: 126)의 면역학적 활성 단편으로 구성된다. 보다 구체적으로, 몇몇의 실시예에서, 본 발명은 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중으로부터 선택된 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 120의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.
일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75 및 Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재되어 있는 것과 같이, 예를 들어, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램은 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성(binding affinity)을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약된 Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 및 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796 기재되어 있는 것과 같이, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들어, Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) 및 Protein Science (2000, 9: 1838-1846)에 기재되어 있다. 따라서, 하나를 HLA 항원에 높은 결합 친화도를 가지는 MPHOSPH1 유래 그것들의 단편을 선별하기 위하여 이러한 소프트웨어 프로그램을 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 알려진 프로그램에 의한 HLA 항원과 결합하도록 결정될 수 있는, MPHOSPH1 유래 어떤 단편으로 구성된 펩티드를 포함한다. 더욱이, 상기 펩티드는 MPHOSPH1의 전장(full length) 서열로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드, 특히 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는 상기 펩티드가 이의 CTL 유도성을 유지하는 한, 부가적 아미노산 잔기를 인접(flank)시킬 수 있다. 상기 특정한 부가적인 아미노산 잔기는 원래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한 어떤 유형의 아미노산으로도 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 MPHOSPH1 유래의 아미노산 서열을 포함하는, CTL 유도능을 가지는 펩티드를 포함한다. 특히 MPHOSPH1 유래의 펩티드를 포함한다. 상기 펩티드들은, 예를 들어, 약 40개 아미노산 미만, 보통 약 20개 아미노산 미만, 대개 약 15 개 아미노산 미만이다.
펩티드 중에서 하나, 둘, 다수 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 펩티드의 기능에 영향을 미치지 않고, 또한 어떠한 경우에는 심지어 원래 펩티드의 원하는 기능을 증진시킨다고 일반적으로 알려져 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기가 치환, 도입, 결실, 및/또는 첨가됨으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 보유한다는 것이 알려져왔다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 본 발명의 한 실시예에 있어서, 본 발명의 CTL 유도성을 가진 펩티드는 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 여기에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 첨가, 결실, 도입 및/또는 치환되었다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 원래의 펩티드의 CTL 유도능을 유지하는 변형된 펩티드를 제공하는, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중 으로부터 선택된 아미노산 서열 중에서 치환, 결실, 도입, 및/또는 첨가된 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산(들)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 원래의 펩티드의 CTL 유도능을 유지하는 변형된 펩티드를 제공하는, 서열번호: 120의 아미노산 서열에서 치환, 결실, 도입, 및/또는 첨가된 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산(들)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다.
당업자는 단일 아미노산 또는 전체 아미노산 서열 중 적은 비율의 아미노산을 변화시키는 아미노산 서열에 대한 개개의 변형(즉, 결실, 도입, 첨가 또는 치환)이 원래 아미노산 측쇄(side-chain) 특성의 보존을 결과하는 경향이 있는 것을 인지할 것이다; 이는 따라서 “보존적 치환(conservative substitution)” 또는 “보존적 변형(conservative modification)”으로서 지칭되며, 여기에서 단백질의 변화는 비슷한 기능을 가지는 단백질을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄의 특징의 예는 소수성(hydrophobic) 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성(hydrophillic) 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄이다: 지방족(aliphatic) 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기(hydroxy group)를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자(sulfur atom)를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산(carboxylic acid) 및 아미드(amide)를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기(base)를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족 군(aromatic group)을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 게다가, 하기 8개 군 각각은 서로에게 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(alanine; A), 글리신(glycine; G);
2) 아스파르트산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E);
3) 아스파라긴(asparagine; N), 글루타민(glutamine; Q);
4) 아르기닌(arginine; R), 리신(lysine; K);
5) 이소루신(isoleucine; I), 루신(leucine; L), 메티오닌(methionine; M), 발린(valine; V);
6) 페닐알라닌(phenylalanine; F), 티로신(tyrosine; Y), 트립토판(tryptophan; W);
7) 세린(serine; S), 트레오닌(threonine; T); 및
8) 시스테인(cysteine; C), 메티오닌(methionine; M)(예를 들어, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드인 것으로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고 그 결과적인 변형된 펩티드가 원래의 변형되지 않은 펩티드의 CTL 유도성을 보유하는 한, 비보존적인 변형도 포함할 것이다. 더욱이, 상기 변형된 펩티드는 다형성 변종(polymorphic variants), 종간 상동체(interspecies homologues), 또는 MPHOSPH1 대립 유전자 유래의 CTL 유도 가능한 펩티드를 제외하지 않아야 한다.
아미노산 잔기는 본 발명의 펩티드에 도입, 치환, 결실 및/또는 첨가될 수 있거나, 그 대신에, 아미노산 잔기는 더 높은 결합 친화도를 달성하기 위해 그것으로부터 결실될 수 있다. 필수적인 CTL 유도성을 유지하기 위하여, 오직 소수만이(예를 들어, 1, 2 또는 여러 개) 또는 아미노산의 적은 비율이 바람직하게 변형된다(도입, 결실, 첨가 및/또는 치환). 여기에서, 상기 용어 “여러 개“는 5개 또는 그 이하의 아미노산, 예를 들면 4개 또는 3개 또는 그 이하를 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 예를 들어, 20% 또는 그 이하, 바람직하게는 15% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 10% 또는 그 이하, 더더욱 바람직하게는 1 내지 5%일 수 있다.
암 면역치료법의 범주에서 사용되었을 경우, 본 발명의 펩티드는 HLA 항원과 복합체로서 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시될 수 있다. 따라서, CTL을 유도하는 것 뿐만 아니라, HLA 항원에 대하여 강한 결합 친화력을 나타내는 펩티드를 선책하는 것이 바람직하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 펩티드는 개선된 결합 친화력을 가지는 변형된 펩티드를 수득하기 위해 아미노산 잔기의 치환, 도입, 결실 및/또는 첨가로서 변형될 수 있다. 자연적으로 나타나는 펩티드뿐만 아니라, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 왔기 때문에(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 상기 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드(immunogenic peptides)에 도입될 수 있다.
예를 들어, 높은 HLA-A2 결합 친화도를 소유하는 펩티드는 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌으로 치환되는 경향이 있다. 유사하게, C-말단 아미노산이 발린 또는 루신으로 치환된 펩티드는 또한 호의적으로 사용될 수 있다. 따라서, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택되어진 아미노산 서열을 가지는 펩티드는, 상기 서열번호의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 상기 서열 번호의 아미노산 서열의 C 말단이 발린 또는 류신으로 치환되어진 펩티드로, 본 발명에서 완성되었다. 또다른 실시예에 있어서, 본 발명은 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택되어진 아미노산 서열의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 치환되거나, 및/또는 상기 서열번호의 아미노산 서열의 C 말달이 발린 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 120의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 류신 또는 메치오닌으로 치환되거나, 및/또는 상기 서열번호의 아미노산 서열의 C 말단이 발린 또는 류신으로 치환되어진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 본 발명은 CTL 유도능을 가지는 펩티드로서, 이하의 (1) 내지 (9)로 구성되는 군으로부터 선택되는 일반식(general formula)을 가지는 펩티드를 제공한다:
(1) MPHOSPH1-A2-9-850 (SEQ ID NO: 5)-에 상응하는 F [X1] L T I E N E [X2],
(2) MPHOSPH1-A2-9-129 (SEQ ID NO: 14)-에 상응하는 F [X1] G C I M Q P [X2],
(3) MPHOSPH1-A2-9-846 (SEQ ID NO: 64)-에 상응하는 G [X1] R A F L L T [X2],
(4) MPHOSPH1- A2-10-460 (SEQ ID NO: 73)-에 상응하는 Y [X1] A Y D E T L N [X2],
(5) MPHOSPH1-A2-10- 770 (SEQ ID NO: 77)-에 상응하는 K [X1] I C N E T V E [X2]
(6) MPHOSPH1-A2-10- 407 (SEQ ID NO: 79)-에 상응하는 L [X1] T L G K C I N [X2]
(7) MPHOSPH1-A2-10- 923 (SEQ ID NO: 97)-에 상응하는 K [X1] S N E I E T A [X2]
(8) MPHOSPH1- A2-10-1484 (SEQ ID NO: 103)-에 상응하는 Q [X1] V A A L E I Q [X2], 및
(9) MPHOSPH1- A2-10-282 (SEQ ID NO: 120)-에 상응하는 Y [X1] Y D L F V P V [X2].
일반식 (1)-(9)에서, [X1]은 류신 또는 메티오닌이며, [X2]는 발린 또는 류신이다. 본 발명의 구체적이고 바람직한 실시예에 있어서, 일반식은 서열번호: 120에 대응하는, (9)일 수 있다. 본 발명은 추가로 상기 정의된 일반식 (1)-(9)로서 제시된 분리된 펩티드로서, 이의 N 말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다의 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산이 첨가된 것을 제공한다. 대안적인 실시예에서, 본 발명은 일반식 (1)-(9)로서 제시된 분리된 펩티드로서, 이의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다의 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산이 결실된 것을 제공한다. 본 발명은 또한 일반식 (1)-(9)로서 제시된 분리된 펩티드로서, 상기 서열 중 어느 하나에 있어서 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산이 도입 또는 결실된 펩티드를 제공한다.
치환은 말단 아미노산뿐만 아니라 가능성 있는 펩티드의 T 세포 수용체(TCR) 인지 위치의 부위에 도입될 수 있다. 여러 연구, 예를 들어, CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004) 53, 307-314)는 원래의 것에 비해 동일하거나 더 나은 기능을 가지는 아미노산 치환을 가지는 펩티드를 나타내었다. 본 발명은 또한 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산이 본 발명의 펩티드의 N 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다 도입될 수 있음을 고려한다. CTL 유도성을 함유하는 상기 변형된 펩티드 역시 본 발명에 포함된다.
그러나, 상기 펩티드 서열이 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 부분과 동일할 때, 특이적 물질에 대한 자가면역질환 또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상과 같은 부정적인 부작용이 유발될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 할 수 있는 것이 바람직하다. 자연계에 존재하는 목표 펩티드(objective peptide)와 동일하거나 1 또는 2개의 아미노산 차이를 가지가 있는 펩티드도 심지어 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 분명해질 때, 상기 부작용의 어떠한 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 유도성을 증강시키기 위해 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된, 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 여기에서, 상기 구 “CTL 유도성”은 항원-제시 세포(antigen-presenting cell; APC) 상에 제시될 때 CTL을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 더욱이, “CTL 유도성”은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식을 유도하고, CTL에 의한 표적세포의 용해를 촉진하기 위한, 및 CTL에 의한 IFN-감마(gamma) 생산을 증가하기 위한 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APCs(예를 들어, B-림프구, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell; DC)), 또는 보다 구체적으로 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes)에서 유래된 수지상세포를 유도하고, 및 실험 펩티드로 APC를 자극시킨 후, CTL을 유도하기 위해 CD8 양성 세포와 APC를 혼합하고, 그 후에 CTL에 의해 생산 및 방출되는 표적세포에 대한 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작되어온 형질전환 동물(예를 들어, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 대체적으로, 상기 표적세포를 51Cr 및 이러한 것으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적세포로부터 방출된 방사능으로부터 CTL의 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 그 대신에, 이는 고정화된 펩티드를 수반한 APCs의 존재 하에 CTL에 의해 생산 및 방출된 IFN-감마(gamma)를 측정함으로써, 및 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용한 배지에서 억제 영역을 가시화함으로써 검사될 수 있다.
상기 기술된 펩티드의 CTL 유도성을 시험한 결과, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 제시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드로부터 선택된 노나펩티드(nonapeptides) 및 데카펩티드(decapeptides)는 특히 높은 CTL 유도성 및 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 보이는 것을 발견하였다. 따라서, 이 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 예시된다.
또한, 상동성 분석(homology analyses) 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 공유하지 않음을 보인다. 면역치료법에 사용할 때 알려지지 않았거나 원하지 않는 면역 반응의 가능성은 낮다. 그러므로, 또한 이러한 측면으로부터, 이 펩티드들은 MPHOSPH1에 대한 암 환자의 면역력을 유도하기에 유용하다. 따라서, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 본 발명에 의해 포함된다.
상기에서 논의된 변형에 추가하여, 본 발명의 펩티드는 연결된 펩티드 결과가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 보유하는 한, 다른 펩티드와 연결될 수 있다. 적합한 “다른“ 펩티드의 예는 하기를 포함한다: 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAA로부터 유래된, CTL 유도성 펩티드. 본 발명의 펩티드는 링커를 통해 “다른” 펩티드에 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 상기 펩티드 사이의 링커(linker)는 당업계, 예를 들어, AAY(P.M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000. 165: 7308-7315) 또는 K(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476. K.S. Kawamura et al., J Immunol. 2002. 168: 5709-5715)에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 비-MPHOSPH1(non-MPHOSPH1) 종양-관련 항원 유래의 펩티드는 HLA 종류 I 및/또는 종류 II를 통해서 면역 반응을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 암 세포는 하나 이상의 종양관련 유전자를 발현할 수 있는 것아 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 TAA로부터 유래된 몇몇의 CTL 유도성 펩티드가 분리되었다(예를 들어, WO2008/047473, WO2010/047062, WO2008/102557, WO2009/025116). 따라서, 본 발명의 펩티드와 연결된 “다른” 펩티드의 예는 MPHOSPH1 이외의 TAA 유래의 CTL 유도성 펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, “다른” 펩티드는 MHC 종류 I(MHC class I) 제한된 펩티드인 것뿐만 아니라, MHC 종류 II 제한된 펩티드일 수 있다. 당업자는 통상적인 분자생물학의 절차를 이용하여, 하나 또는 그 이상의 MPHOSPH1 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 비-MPHOSPH1 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 준비할 수 있다.
상기-기술된 연결된 펩티드는 여기에서 “폴리톱(polytopes)“이라고 지칭하며, 즉, 다양한 배열(예를 들어, 연결(concatenated), 겹칩(overlapping))에서 함께 연결될 수 있는 펩티드를 자극시키는 둘 또는 그 이상의 잠재적으로 면역형성 또는 면역 반응의 군이다. 면역 반응을 자극, 증진 및/또는 유발시키는 폴리톱의 효과를 검사하기 위해, 상기 폴리톱(또는 폴리톱을 암호화하는 핵산)은, 예를 들어 동물에, 표준 면역화 절차에 따라 투여될 수 있다.
펩티드는 폴리톱을 형성하기 위해 직접적으로 또는 인근 서열의 사용을 통해 함께 연결될 수 있고, 백신으로서 폴리톱의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849. 1995; Gilbert et al., Nature Biothechnol. 15(12):1280-1284. 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):882-826. 1996; Tarn et al., J Exp Med. 171(1):299-306. 1990 참조). 에피토프의 다양한 수 및 조합을 포함하는 폴리톱은 CTL에 의한 인지 및 면역 반응을 증가시키는 효과(efficacy)를 위해 제조 및 검사될 수 있다.
본 발명의 상기 펩티드는 그들이 CTL 유도성을 보유하고 있는 한, 다른 물질에 더 결합할 수 있다. 상기 “다른” 물질의 실제적인 예는 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등을 포함하나, 이에 한정되지 않난다. 상기 변형이 여기에서 기재된 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 한, 상기 펩티드는 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능, 및 전달 기능)을 제공하거나 또는 상기 폴리펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에 알려져 있으며; 이 개념은 또한 상기 폴리펩티드에 채택될 것이다. 폴리펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들어, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11:291-302 참조). 본 발명의 펩티드가 시스테인 잔기를 포함할 때, 상기 펩티드는 시스테인 잔기의 SH 기 사이에 이황화 결합을 통해 이량체를 형성하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 이량체는 본 발명의 펩티드에 포함된다.
또한, 상기에 기술된 것과 같이, 하나, 둘 또는 여러 개의 아미노산 잔기에 의해 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되어 변형된 펩티드 중에서, 원래의 펩티드와 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 것은 스크리닝 되거나 또는 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 원래의 것에 비교하여 동일하거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드를 스크리닝하거나 또는 선택하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a: 본 발명 펩티드의 최소한 하나의 아미노산 잔기를 변형하는 단계(치환, 결실, 삽입, 또는 첨가),
b: 단계 (a)에서 변형된 펩티드의 활성을 결정하는 단계, 및
c: 원래 펩티드에 비교하여 동일하거나 또는 더 높은 활성을 갖는 펩티드를 선택하는 단계.
여기에서, 상기 활성은 MHC 결합 활성 및 APCs 또는 CTL 유도성을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩티드의 활성은 CTL 유도성이다.
III . MPHOSPH1 펩티드의 제조:
본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로 또는 두 개 또는 그 이상의 펩티드를 포함한 더 긴 폴리펩티드로 합성될 수 있다. 상기 펩티드는 다른 자연적으로 발생한 숙주 세포 단백질 및 이의 단편, 또는 어떤 다른 화학 물질이 거의 없도록 분리, 즉 정제되거나 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화와 같은 변형이, 원래의 펩티드(original peptide)의 생물학적 활성을 저해하지 않는다면, 상기 변형을 포함할 수 있다. 다른 예시적 변형은 예를 들어, 펩티드의 혈청 반감기(serum half life)를 증가시키기 위해, D-아미노산 또는 사용될 수 있는 다른 아미노산 모방체의 통합을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 합성을 위해 채택할 수 있는 보편적인 펩티드 합성 방법은 하기를 포함한다:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals(제 2 판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
(vi) WO99/67288; 및
(vii) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis“, Academic Press, New York, 1980, 100-118.
그 대신에, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 알려진 유전자 조작 방법을 채택하여 획득할 것이다(예를 들어, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들어, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 종류(예를 들어, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하는 적절한 벡터를 제조 및 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 상기 벡터 및 숙주세포는 본 발명에의해 역시 제공된다. 그 다음에 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 또한 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 채택하여 시험관 내에서 제조될 수 있다.
IV. 폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 상기 언급한 펩티드 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 존재하는 MPHOSPH1 유전자(예를 들어, 서열 번호: 125(유전자 등록번호 NM_001031702)로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 구 “보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열“은 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 어떤 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌이 존재하는 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경 없이 기술된 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 것이다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변종의 한 종류로서 나타나는 “침묵 변이(silent variations)”로서 당업계에서 언급된다. 펩티드를 암호화하는 것으로 여기에서 기재된 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업계에서 보편적인 것 중 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인, AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인, TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 따라서, 개시된 펩티드를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 이와 관련된 침묵 변이의 비명시적인 개시를 나타낸다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이들의 유도체로 구성될 것이다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, DNA 분자는 자연적으로 생성되는 염기인 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 구성되고, T는 RNA에서 U로 적절하게 대체된다. 당업계의 숙련자는 비-자연적으로 존재하는 염기 또한, 폴리뉴클레오티드에 포함된다는 것을 인지할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 개입(intervening) 유무를 불문하고 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상기 개입 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들어, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자 및 이와 같은 것을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 중합효소(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있을 것이다.
재조합 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질감염될 때 발현하는 적절한 벡터 내에, 본 발명의 펩티드의 암호화 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 제조될 수 있다. 그 대신에, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 복제를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참고). 그 대신에, Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
V. 엑소솜(Exosomes)
본 발명은 본 발명의 펩티드와 그 표면의 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 제시하고, 엑소솜이라고 말하는, 세포 내 소낭(vehicle)을 더 제공한다. 엑소솜은, 예를 들어, 일본 특허 출원 Kohyo Publications Mos. Hei 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 및 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자에게서 얻어진 APCs를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 유사하게, 백신으로서 접종될 수 있다.
복합체에 함유된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 종류와 반드시 일치해야 한다. 예를 들어, 일본인에 대해서, HLA-A2, 특히 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206은 때때로 적합하다. 일본인과 백인(Caucasian)에서 높게 발현되는 HLA-A2 종류의 사용은 효과적인 결과를 얻기 위해 바람직하고, HLA-A*0201 및 HLA-A*0206과 같은 아류형(subtype)도 이용할 수 있다. 전형적으로, 임상에서, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 종류는 미리 검사되고 있어, 상기 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 또는 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 보이는 펩티드를 얻기 위하여, 1, 2, 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 또는 도입이 자연적으로 발생하는 MPHOSPH1 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 수행될 수 있다.
본 발명의 엑소솜에 대해 HLA-A2 종류 HLA 항원을 사용할 때, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 특정 유용성을 가진다. 몇 가지의 실시예에서, 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A2 항원의 복합체를 그들의 표면 상에 나타내는 엑소솜이다. 상기 복합체에 포함되는 HLA-A2의 전형적인 예는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VI. 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs)
본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드로 형성된 복합체를 이들의 표면에 제시하는 분리된 APCs를 또한 제공한다. 상기 APCs는 치료 및/또는 예방의 대상인 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 CTL을 포함하는 다른 약물과 조합하여 백신으로 투여될 수 있다.
상기 APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 수지상세포(DC), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 마크로파지(macrophage), B 세포, 및 활성화 T 세포를 포함하며, 이들은 림프구에 의해 인식되기 위하여 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있다. 수지상세포는 APCs 중 가장 강력한 CTL 유도 활성을 가지는 대표적인 APCs이기 때문에, 수지상세포는 본 발명의 APCs로서 적합하다.
예를 들어, 말초 혈액 단핵구로부터 DC를 유도 및 그 다음 그것들을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)함으로서 본 발명의 APCs를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여할 때, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs가 개체의 체내에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 APCs는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 APCs를 수집함으로써 획득할 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 상기 APCs를 본 발명의 상기 펩티드를 가진 개체로부터 수득한 APCs와 접촉함으로써 획득할 수 있다.
본 발명의 상기 APCs는, 그들 자신에 의해 개체 내의 암에 대한 면역 반응을 유도할 개체에게, 또는 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약물과의 조합으로 개체로 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체 외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 첫 번째 개체로부터 APCs를 수집하는 단계,
b: 단계 a의 APCs와, 본 발명의 펩티드를 접촉하는 단계, 및
c; 단계 b의 APCs를 두 번째 개체에 투여하는 단계.
첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 단계 b에서 수득된 APCs는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 투여될 수 있고, 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 APC를 유도하는 약학적 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)를 혼합 또는 제형화하는 과정을 포함한다.
본 발명의 측면에 따르면, 본 발명의 APCs는 CTL 유도성을 가지고 있다. APC의 맥락에서, 구 “CTL 유도성을 가지는”은 펩티드와 접촉하지 않은 APC의 것 보다도 더 높은 CTL 유도성을 나타내는 것을 언급한다. 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APCs는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 APCs에 전달 단계뿐 아니라 상기 언급된 방법을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 도입된 유전자는 DNA 또는 RNA 종류일 수 있다. 도입 방법의 예는, 특별한 제한 없이, 예를 들어, 리포펙션(lipofection), 전기천공법(electroporation), 또는 인산칼슘법과 같은, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시될 것이다. 유전자를 APCs로 전달함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서처럼 전사, 번역을 겪고, 그리고나서 얻어진 단백질은 MHC 종류 I 또는 종류 II에 의해 처리되고, 부분적으로 제시된 펩티드를 제시하기 위한 제시 경로를 거쳐 진행된다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 APCs는 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 APC이다. 상기 복합체에 포함된 HLA-A2 항원의 전형적인 예는 HLA-A*0201 및 HLA-A*0206을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VII . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T Lymphocytes ; CTL )
본 발명의 임의의 펩티드에 대해 유도된 CTL은 생체 내에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하고 및 그로 인하여 상기 펩티드와 유사하게 백신으로서 사용될 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 제시된 펩티드 중 어느 것에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 CTL을 제공한다.
이러한 CTL은 (1) 본 발명의 펩티드를 개체에 투여, (2) 개체 유래 APCs 및 CD8 양성 T 세포, 또는 본 발명의 펩티드(들)와 함께 시험관 내에서 말초 혈액 단핵 림프구 접촉(자극), (3) CD8 양성 T 세포 또는 말초 혈액 단핵 림프구와 시험관 내에서 그것들의 표면에 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 복합체를 제시하는 APCs 또는 엑소솜을 접촉, 또는 (4) 각각의 TCR 서브유닛을 암호화흔 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 서브유닛 또는 폴리뉴클레오티드 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의하여 획득될 수 있고, 상기 TCR은 본 발명의 펩티드 및 세포 표면의 HLA-A2 항원의 복합체에 결합할 수 있다. CTL의 준비에서 사용되는 상기 APC 또는 엑소솜은 상기 기재된 방법에 의해 준비될 수 있다. (4)의 방법의 자세한 설명은 아래 “VIII. T 세포 수용체(TCR)” 부분에 기재되었다.
본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있고, 그 자체 또는 조절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 얻어진 CTL은 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암 세포와 같은, MPHOSPH1를 내생적으로 발현하는 세포, 또는 MPHOSPH1 유전자가 형질감염된 세포일 수 있고; 펩티드에 의한 자극때문에 세포 표면에 본 발명의 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적으로 사용할 수 있다.
어떤 실시예에 따르면, 본 발명의 CTL은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지한다. CTL의 맥락에서, 상기 구 “세포를 인지함“은 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 TCR을 통해 세포 표면에 결합함 및 상기 세포에 대한 특이적인 세포독성 활성을 제시함을 나타낸다. 여기에서, “특이적인 세포독성 활성“은 다른 세포가 아닌 HLA-A2 항원 및 상기 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 세포에 대한 세포독성 활성 제시함을 나타낸다. 상기 복합체에서 포함되는 HAL-A2 항원의 전형적인 예는 HLA-A＊0201 및 HAL-A＊0206을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VIII. T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)
본 발명은 또한 TCR 서브유닛 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛의 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이와 동일한 것을 이용한 방법을 또한 제공하며, 상기 TCR은 세포 표면에 HLA-A2 항원 및 본 발명의 펩티드 복합체를 결합할 수 있다. 상기 TCR 서브유닛은 MPHOSPH1를 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포에 특이성을 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR을 구성하는 알파-(alpha-) 및 베타-(beta-) 사슬(chain) 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288, (2003)). 예를 들어, 상기 PCR 방법은 바람직하게 사용될 수 있다. 상기분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 측면(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머(5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3')(서열 번호: 127) 및 TCR 알파 사슬 C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머(5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3')(서열 번호: 128), TCR-베타 사슬 C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머(5'-tcagaaatcctttctcttgac-3')(서열 번호: 129) 또는 3' 측면 프라이머로서 TCR 베타- 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TR 베타-C2 프라이머(5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3')(서열 번호: 130)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 TCR 유도체는 본 발명의 MPHOSPH1 펩티드를 제시하는 표적 세포에 높은 결합력(avidity)으로 결합할 수 있고, 본 발명의 상기 MPHOSPH1 펩티드를 제시하는 표적 세포의 효과적인 사멸을 생체 내 및 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.
TCR 서브유닛 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 핵산 또는 그것을 함유한 벡터는 T 세포(예를 들어, CD8 양성 T 세포), 예를 들어, 환자로부터의 T 세포에 유용하게 전달될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 환자 그들의(또는 다른 포유류의 것) T 세포가 암 세포를 죽일 수 있는 탁월한 특징을 갖는 변형된 T 세포를 빠르고 용이하게 생산하도록 급격한 변화를 허용하는 바로 살 수 있는 조성물(off-the-shelf composition)을 제공한다.
본 발명의 펩티드에 대한 특이적 TCR은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있고, 이것은 상기 TCR이 상기 T 세포 표면에 제시되어 있을 때, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 제시하는 표적세포에 대한 T 세포 특이적 활성을 제공한다. 필요한 활성은 상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 도입함으로서 준비된 CTL은 상기 표적 세포로 특이적으로 인지될 수 있는 어떤 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다. 상기 방법의 바람직한 예는 예를 들어, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드를 이용한 HLA 다합체(multimer) du염색 분석, 및 ELISPOT 분석을 포함한다. ELISPOT의 수행에 의해, 상기 방법에 의해 준비된 CTL은 표적 세포를 인지하고, 및 상기 인지에 의해 생성된 신호가 세포내부로 이동될 수 있음이 확인될 수 있다. 더욱이, 상기 기술된 방법에 의해 준비된 CTL이 표적 세포에 대한 특정 세포독성 활성을 가지는 알려진 방법에 의해 또한 확인될 수 있다. 상기 방법의 예는, 예를 들어, HLA-A2 항원 및 MPHOSPH1 둘 다를 발현시키는 세포를 사용한 Cr 방출(relaese) 검사를 포함한다.
한 관점에서, 본 발명은 TCR 서브유닛 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들를 암호화하는 폴리펩티드들로 형질도입(transduction)함으로서 준비된 CTL을 제공하고, 여기에서 상기 TCR 서브유닛에 의해 형성된 TCR은 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 세포 표면의 HLA-A2 항원의 복합체에 결합할 수 있다.
상기 형질도입된 CTL은 생체 내에서 암 세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 배양 방법으로 시험관 내에서 증식시킬 수 있다(예를 들어, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자에서 암의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다에 유용한 면역학적 조성물을 형성하도록 사용될 수 있다(WO2006/031221).
IX . 약학적 조성물:
MPHOSPH1 발현은 정상 세포와 비교하여 예를 들어 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 예로써 포함하나, 이에 반드시 한정되지 않는 암에서 특이적으로 증가하기 때문에, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방 중 하나 또는 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로서 포함하는 제제 또는 조성물로서, 암의 치료 및 예방 중 하나 또는 둘 다를 위해 제형화된 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다. 또는, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원과의 복합체를 제시하는 상기 엑소솜 또는 APC 중 어느 것을 약학적인 제제 또는 조성물을 위해 유효성분으로서 사용하는 것이 가능하다. 추가로, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 제시하는 세포를 확인할 수 있는 상기 언급한 CTL 또한 본 발명의 약학적인 제제 또는 조성물을 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 하나를 vhg마하는 제제 또는 조성물을 제공한다:
(a) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드;
(b) 여기에서 기술한 상기 펩티드를 발현 가능한 형태로 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 하나 또는 그 이상의 CTL.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 구 “백신”(또한 면역원 조성물(immunogenic composition)로 지칭)은 동물에게 투여되었을 때 항종양 면역을 증진, 향상, 및/또는 유도하는 기능을 가지는 물질을 의미한다. 다시 말하면, 본 발명은 개체 내에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 약학적인 제제 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적인 제제 또는 조성물은 개체에서 암의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 역학적 제제 또는 조성물을 적용할 수 있는 대상의 예는, 인간 뿐 아니라, 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이(baboon) 및 침팬지, 구체적으로 상업적으로 중요한 동물 또는 사용되는 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 몇 가지의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여되기 위해서 제제화될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 이들의 수술 후 재발을 포함하는 암 또는 종양의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다를 위해 제형화된 약학적 제제 또는 조성물의 제조에서, 하기 중 선택되는 유효성분의 사용을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또는, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및 예방 중 어느 하나 또는 둘 다에서의 용도를 위한 유효성분을 또한 제공하고, 상기 유효성분은 하기로부터 선택된다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또는, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양의 치료 및 예방 중 하나 또는 둘 다를 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 유효 성분이 있는 담체를 제형화하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및 예방의 어느 하나 또는 둘 다를 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 또한 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효 성분이 있는, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 유효 성분과 혼합하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 암 또는 종양의 치료 및 예방 중 하나 또는 둘 다를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기로 부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분을 개체에 투여하는 단계를 포함한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 이의 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.
본 발명에 따라, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 에피토프 펩티드로 제한된 HLA-A2로서 알려져 있으며 따라서 개체 내에서 HLA-A2 및 MPHOSPH1을 발현하는 암에 대하여 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 후보자로서 제공된다. 따라서, 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120의 아미노산 서열을 가진 이 펩티드들의 어느 것을 포함하는 본 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여에 특히 적합하다. 이러한 펩티드의 구체적으로 바람직한 예는 HLA-A2 항원 및 MPHOSPH1을 발현하는 암 세포를 표적화하는 CTL을 유도하는 능력을 가지는 것으로 확인된 서열번호: 120의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 서열번호: 120의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 또는 이들의 변형된 형태, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 동일한 것은 이 펩티드들의 어느 것을 암호화하는 폴리펩티드(즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물로 치료되는 암은 제한적이지 않고 MPHOSPH1가 발현된(예를 들어, 과다발현된) 어떤 암을 포함하며, 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하나 이에 한정되지 않는 예를 포함한다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 상기 기재한 유효 성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포, 및 이와 같은 것(the like)을 포함할 수 있다. 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 이러한 “다른“ 펩티드들의 예는 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA들)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 물질 또는 조성물은 본 발명의 펩티드의 유효 성분(즉, 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜, PAC, CTL)의 항종양 효과를 억제하지 않는 한, 다른 치료적 물질을 부가적인 유효 성분으로서 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제형(formulation)은 항염증적 제제, 진통제, 화학요법, 및 그와 같은 것을 포함할 수 있다. 그 약제 안에 다른 치료적 물질 뿐 아니라, 본 발명의 약제는 역시 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 제제 또는 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제 또는 조성물의 양은, 예를 들어, 사용되는 약학적 조성물(들)의 유형, 치료되는 질병, 및 투여의 일정 및 루트(route)에 의존한다.
특히 여기에서 언급한 성분뿐만 아니라, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되고 있는 제형의 종류(예를 들어, 필러(filler), 결합제(binder), 희석제(diluent), 부형제(excipients) 등)에 관하여 당업계에서 일반적인 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 질병의 병리 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 예를 들어, 키트와 같은 제조물(article of manufacture)에 포함될 수 있다. 상기 제조물은 라벨이 있는 상기 약학적 제제 또는 조성물 중 어느 것의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 제제 또는 조성물이 상기 질병의 하나 또는 그 이상의 조건을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되는 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여에 관한 지시 등을 나타낼 수 있다.
상기 기재한 용기에 추가하여, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 또한 포함할 수 있다. 이것은 또한 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은, 바람직하다면, 유효 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 포장될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터 팩과 같은 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 지시에 의해 동반 할 수 있다.
(1) 상기 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물:
본 발명의 펩티드들은 약학적 제제 또는 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제형화될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드뿐만 아니라, 담체, 부형제(excipient), 및 약물에서 평이하게 사용되는 것이 특이적 제한 없이 적절한 것으로 포함될 수 있다. 상기 담체들의 예는 멸균된 물, 생리학적 살린(saline), 인산 버퍼(phosphate buffer), 배양 유액 및 이와 같은 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제(surfactant) 및 이와 같은 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 물질, 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해, 둘 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드의 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드는 혼합제(cocktail)일 수 있거나 또는 표준 기술을 이용하여 서로 다른 것이 접합 될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드들은, 링커(예를 들어, Lysine linker: K. S. Kawamura et al., J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715)로 하나 또는 여러 개의 아미노산(들)을 가질 수 있는 단독 융합 폴리펩티드 서열로서 발현되거나 화학적으로 연결될 수 있다. 상기 조합의 펩티드들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APCs에 HLA 항원에 의해 높은 밀도로 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 또는, APCs(예를 들어, DC)는 개체에서 제거될 수 있으며, 그리고나서 본 발명의 어떤 펩티드를 그것의 표면에 제시하고 있는 APCs를 얻기 위해 본 발명의 펩티드로 자극된다. 이 APCs는 개체에서 CTL을 유도하기 위해 개체에 재투여될 수 있고, 그 결과로, 종양-결합 내피(tumor-associated endothelium)에 대한 공격성(aggressiveness)이 증가될 수 있다.
본 발명의 어느 펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 세포성 면역을 효과적으로 확립한다고 알려진 보강제(adjuvant)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 과립(granule)으로 제형되어 투여될 수 있는 다른 활성 성분과 투여될 수 있다. 보강제는 면역학적 활성을 가진 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 어떠한 화합물, 물질 또는 조성을 나타낸다. 적용될 수 있는 보강제는 문헌(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)에 기술되어 있는 것들을 포함한다. 예시적인 보강제는 알루미늄 포스패이트(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록시드(aluminum hydroxide), 알럼(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin), 불완전 프로인트 보강제(Incomplete Freund's adjuvant, IFA), 완전 프로인트 보강제(Complete Freund's adjuvant, CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, O/W 에멀전(O/W emulsion), 및 이와 같은 것을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 리포좀 제형, 펩티드가 미세한 마이크로미터 지름의 비드(bead)가 결합된 과립 제형, 및 지질(lipid)이 펩티드와 결합되는 제형이 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 또한 투여될 수 있다. 상기 염(salts)의 바람직한 예는 알칼리 금속(alkali metal), 금속을 가진 염(salts with a metal), 유기 염기를 가진 염(salts with an organic base), 아민기를 가진 염(salts with an amine), 유기산(organic acid)(아세트 산(acetic acid), 포름산(formic acid), 프로피온산(propionic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말레익산(maleic acid), 숙신산(succinic acid), 타타르산(tartaric acid), 시트릭산(citric acid), 말릭산(malic acid), 옥살릭산(oxalic acid), 벤조익산(benzoic acid), 메탄설폰산(methanesulfonic acid) 및 등등)을 가진 염 및 무기산(inorganic acid)(염산(hydrochloric acid), 인산(phosphoric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 황산(sulfuric acid) 및 등등)을 가진 염을 포함한다. 여기에서 사용되듯이, “약학적으로 허용가능한 염“은 화합물의 생물학적 효율성 및 특성을 보유하고 무기 또는 유기 산 또는 염기와의 반응에 의하여 획득한 염을 지칭한다.
어떤 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 초회감작(prime)하는 구성요소를 또한 포함한다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 초회감작시킬 수 있는 물질로 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신 잔기의 엡실론(epsilon)- 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며 그 후에 본 발명의 펩티드와 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 그리고나서 마이셀(micelle) 또는 입자(particle) 둘 중 하나 안에 직접적으로 투여되거나, 리포좀(liposome)에 통합되거나, 또는 보강제에 유화시킬 수 있다. CTL 반응을 초회참작시키는 지질의 또 다른 예로서, 적절한 펩티드와 공유적으로 결합될 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐-세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은, 대장균(E. coli) 지질단백질(lipidprotein)이 CTL을 초회참작시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).
적절한 투여 방법의 예는 경구, 피내, 피하, 근육 내, 골 내, 복막, 및 정맥내 주사, 또는 이와 같은 것, 및 전신 투여 또는 표적 장소 부근에 국소 투여(즉, 직접 주입)를 포함하지만, 이에 필수적으로 한정하지 않는다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 따라 적당하게 적용될 수 있고, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들어, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg 내지 10 mg, 및 며칠 내지 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적절하고 최적의 투여량을 쉽게 정한다.
(2) 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물:
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 발현할 수 있는 종류로 여기에서 공개된 펩티드(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 구 “발현할 수 있는 형태”는 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항-종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 분명한 실시예에서, 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비 될 수 있다(예를 들어, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 설명을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조. 또한, 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조). DNA-기반의 전달 기술의 예는 “네이키트 DNA(naked DNA)“, 용이한 전달(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개), 양이온 지질 복합체, 및 입자-매개(“유전자 총“) 또는 압력-매개 전달을 포함한다(예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,687 참조).
본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 세균 벡터에 의해 또한 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은, 약화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터로서 백시니아 바이러스의 사용을 포함한다. 숙주에 도입할 때, 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 면역성 펩티드를 발현하고, 그렇게 함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, U.S. Patent No. 4,722,848에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노 및 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이럴 벡터(retroviral vectors), 살모넬라 타이피 벡터(Salmonella typhi vectors), 독성이 없는 탄저균 독소 벡터(detoxified anthrax toxin vectors), 및 이와 같은 것이 분명할 것이다. 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85을 참조한다.
환자로의 폴리뉴클레오티드 전달은 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 환자가 직접적으로 노출되는 직접적 경우, 또는 세포가 시험관 내에서 상기 관심 있는 폴리뉴클레오티드로 첫 번째 형질 전환되고, 그리고나서 세포가 개체에 이식되는 간접적 경우 중 둘 중 하나가 될 수 있다. 이 두 가지 방법이, 각각, 생체 내 및 생체 외 유전자 치료법으로 알려져 있다.
유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰를 위하여, Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에 적용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel et al. in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger in Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 의해 기재되어 있다.
펩티드의 투여와 같이, 폴리펩티드의 투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥내 주사, 근육내 주사, 골 내, 및/또는 복막 주사, 또는 이와 같은 것을 수행할 수 있고, 전신 투여 또는 표적 장소 부근에 국소 투여를 통해 사용될 수 있다. 상기투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 적절한 담체 또는 세포의 볼리뉴클레오티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 및 이와 같은 것에 따라 적당하게 적용될 수 있고, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들어, 0.01 mg 내지 100 mg, 예를 들어, 0.1 mg 내지 10 mg, 예를 들어, 및 며칠마다 한 번 내지 몇 달마다 한 번 투여될 수 있다. 당업자가 적절하게 알맞은 용량을 선택할 수 있다.
X.펩티드, 엑소솜, APCs 및 CTL을 이용하는 방법
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTL을 제조 또는 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 엑소솜 및 APCs는 CTL을 유도하기 위해 또한 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APCs는 부가적인 화합물이 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이에 추가하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 하기 기재되듯이 APCs를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
(1) 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APCs) 유도 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 CTL 유도성이 있는 APCs를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드를 APCs와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 생체 외에서 본 발명의 펩티드와 APCs를 접촉하는 단계를 포함하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;, 및
b: 본 발명의 펩티드 및 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계.
APCs는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 DCs, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게, DCs는 APCs 사이에서 가장 강한 CTL 유도성을 갖기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드 중 어느 하나는 그 자체로 또는 본 발명의 다른 펩티드의 조합 또는 MPHOSPH1과 다른 TAAs로부터 유래된 CTL 유도성 펩티드와 함께 사용될 수 있다.
반면, 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 생체 내에서(in vivo) 상기 APCs는 펩티드와 접촉되고, 그 결과, CTL 유도성이 있는 APCs는 개체의 몸에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드를 개체의 체내에 CTL 유도능을 가지는 APC를 유도하기 위한 개체에 투여하는 것을 포함한다. 비슷하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현되는 형태로 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드가 발현되고 생체 내에서 APCs와 접촉하여, 결과적으로, 개체의 몸에서 CTL 유도성이 있는 APCs를 유도한다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 개체의 체내에서 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하기 위한 개체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. “발현가능한 형태(expressible form)”는 상기 부분 “IX. 약학적 조성물, (2) 유효성분으로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물”에 기재된다.
그 대신에, 본 발명은 CTL 유도성이 있는 APCs를 유도하기 위해 APCs로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;, 및
b: 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC 내로 도입하는 단계.
단계 b는 상기 “VI. 항원-제시 세포“ 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.
그 대신에, 본 발명은 MPHOSPH1에 대한 CTL 활성을 특이적으로 유도하는 항원-제시 세포(APC)를 제조하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기의 단계의 하나를 포함할 수 있다:
(a) 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입시키는 단계.
그 대신에, 본 발명은 CTL 유도성을 가지는 APC를 도입하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 하기 중으로부터 선택된 단계를 포함한다:
(a) APC를 본 발명의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입시키는 단계.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTL유도성을 가지는 APCs의 유도를 위해 사용되는 APCs는 바람직하게 HLA-A2 항원을 발현하는 APCs일 수 있다. 상기 APCs는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 HLA 항원이 HLA-A2인 개체로부터 획득된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)로부터 준비될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APCs는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원(HLA-A2 항원)의 복합체를 이들의 표면에서 제시하는 APCs일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 유도된 APCs는 개체에서 암에 대한 면영 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 상기 개체는 바람직하게 APCs를 유래한 것과 같은 것이다. 하지만, 상기 개체가 APCs 기증자(donor)와 같은 HLA 종류를 갖는 한 APCs 기증자와 다른 것일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL 유도성을 갖는 APCs를 포함하는 사용을 위한 제제 또는 조성물을 제공하고, 상기 제제 또는 조성물은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 APCs를 도입하기 위해 제형화된 제제 또는 조성물의 제조 동안 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드의 사용에 대해 제공한다.
그 대신에, 본 발명은 더욱이 본 발명의 펩티드 또는 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하는 사용을 위해 펩티드를 암호화하는 폴리펩티드를 제공한다.
(2) CTLs를 유도하는 방법:
본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 본 발명의 엑소솜 또는 APCs를 사용하여 CTLs를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 TCR 서브유닛 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CRL을 도입하기 위한 방법을 제공하며, 상기 TCR이 세포 표면상에 제시된 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원과의 복합체를 인식(결합)할 수 있다. 바람직하게, CTLs을 유도하는 방법은 하기 중에서 선택된 최소 하나의 단계를 포함할 수 있다:
a) CD8 양성 T 세포를 그 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜과 접촉시키는 단계; 및
b) TCR이 세포 표면상에 제시된 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원과의 복합체를 인식(결합)할 수 있는, TCR 서브유닛 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포에 도입하는 단계.
본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs, 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, MPHOSPH1를 발현하는 암 세포를 표적하는 면역 반응이 증진된다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APCs 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
그 대신에, CTL은 그들을 생체 외 또는 시험관 내에서 사용함으로써 또한 유도될 수 있고, CTL 유도 후, 활성화된 CTLs은 개체에 되돌려질 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;
b: 펩티드와, 단계 a의 APCs를 접촉하는 단계; 및
c: CD8 양성 T 세포와 단계 b의 APCs를 공배양(co-culture)하는 단계.
상기 단계 c에서 CD8 양성 T 세포와 공배양된 APCs는 상기 “VI. 항원-제시 세포“ 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APCs에 전달함으로써 또한 준비될 수 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 본 발명의 HLA항원 및 펩티드의 복합체를 그들의 표면에 효과적으로 제시하는 어떠한 APCs든지 포함한다.
상기 언급한 APCs 대신 본 발명의 HLA 항원 및 펩티드의 복합체를 표면에 제시하는 엑소솜을 선택적으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 엑소솜을 공배양하는(co-cultured) 단계를 포함할 수 있다. 상기 엑소솜은 상기 “V. 엑소솜” 부분에 기술된 방법에 의해 준비될 수 있다. CTL의 도입에 유도에 사용된 APC 또는 엑소솜은 본 발명의 펩티드 및 HLA-A2 항원의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜인 것이 바람직하다.
더욱이, TCR 서브유닛 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 서브유닛 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포에 도입하는 것으로서 CRL을 유도할 수 있으며, 상기 TCR은 세포 표면상에 제시된 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원과의 복합체에 결합할 수 있다. 이러한 형질도입은 상기 “VIII. T 세포 수용체(TCR)” 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. CTLs의 유도를 위해 사용되는 CD8 양성 T 세포는 개체로부터 수득한 PBMCs로부터 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 실시예에서, CD8 양성 T 세포의 공여자(donor)는 HLA 항원이 HLA-A2인 개체일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 도입된 CTLs은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인지할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 도입된 CTLs이 개체의 암에 면역 반응을 유도하기 위하여 개체에 투여될 때, 상기 개체는 바람직하게 CD8 양성 T 세포가 유래된 것으로부터 동일한 것이다. 그러나, 상기 개체가 CD8 양성 T 세포 공여자와 같은 HLA 유형을 가지고 있는 한, 개체는 CD8 양성 T 세포 공여자와 다른 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CTLs을 유도하기 위한 약학적 제제 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하고, 상기 방법 또는 과정은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합 또는 제형화하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하는 제제 또는 조성물을 제공하고, 여기에서 제제 또는 조성물은 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들), 또는 하나 또는 그 이상의 APCs 또는 본 발명의 엑소솜으로 구성된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 CTL을 유도하기 위하여 제형화된 제제 또는 조성물의 제조 동안 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APC 또는 엑소솜의 사용을 제공한다.
그 대신에, 본 발명은 CTL을 유도하는 사용을 위해 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 APCs 또는 엑소솜을 더 제공한다.
(3) 면역 반응을 유도하는 방법
또한, 본 발명은 MPHOSPH1와 관련된 질병에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 고려되는 질병은 암, 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제제 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명의 어떤 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APCs를 투여 또한 고려될 수 있다. 상세하게는, “IX. 약학적 조성물”, 특히 백신으로서 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 사용을 기술하는 부분을 참조. 또한, 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 엑소솜 및 APCs는 “V.엑소솜”, “VI. 항원-제시 세포(APCs)”, 및 “X. 펩티드, 엑소솜, APCs 및 CTLs을 사용하는 방법”의 (1) 및 (2) 항목에 상세하게 기술되어 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 개체는 HLA 항원이 HLA-A2인 개체일 수 있다.
본 발명은 면역 반응을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 또한 제공하고, 여기에서 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 담체와 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 첨가 또는 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
그 대신에, 본 발명의 방법은 하기를 함유하는 본 발명의 백신 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현 가능한 형태로 여기에서 공개된 펩티드와 같은 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 본 발명의 펩티드를 표면에 제시하는 APCs 또는 엑소솜; 또는
(d) 본 발명의 CTL.
본 발명의 맥락에서, MPHOSPH1를 과발현하는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 이러한 암의 예는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 유효 성분을 포함하는 백신 또는 약학적 조성물의 투여 이전에, 검사될 세포 또는 조직에서 MPHOSPH1의 발현 수준이 동일한 기관의 정상 세포와 비교하여 향상되는가를 확인하는 것은 바람직하다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 MPHOSPH1를 발현하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
i) 치료될 암을 갖는 개체로부터 수득된 암 세포 또는 조직(들)에서 MPHOSPH1의 발현 수준을 결정하는 단계;
ii) MPHOSPH1의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계; 및
iii) 상기 기술된 단계 (a) 내지 (d) 중으로부터 선택된 최소 하나의 구성요소를 정상 대조군과 비교하여 MPHOSPH1을 과발현하는 암을 갖는 개체에게 투여되는 단계.
그 대신에, 본 발명은 또한 MPHOSPH1를 과발현하는 암을 갖는 개체에 투여에서 사용하기 위해, 상기 기술된 (a) 내지 (d) 중으로부터 선택된 최소 하나의 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물을 제공한다. 환언하면, 본 발명은 본 발명의 MPHOSPH1 폴리펩티드로 치료되는 개체를 확인하는 방법을 더 제공하고, 이러한 방법은 개체-유래 암 세포 또는 조직(들)에서 MPHOSPH1의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교한 수준의 증가는 개체가 본 발명의 MPHOSPH1 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암에 걸렸을 수 있다. 본 발명의 암을 치료하기 위한 개체를 확인하는 방법은 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
MPHOSPH1의 목표 전사 또는 번역 생산물을 포함하는 한 어떤 개체-유래 세포 또는 조직은 MPHOSPH1 발현의 결정을 위해 사용될 수 있다. 적절한 표본의 예는 신체 조직 및 혈액, 가래 및 요(urine)과 같은, 체액을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 바람직하게, 개체-유래 세포 또는 조직 표본은 상피 세포, 보다 바람직하게는 암 상피 세포 또는 암이 될 것으로 의심되는 조직으로부터 유래한 상피 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또한, 필요하다면, 상기 세포는 수득된 신체의 조직 및 체액으로부터 정제되고, 그 후 개체-유래 표본으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 개체는 바람직하게 포유류이다. 실제적 예의 포유류는 인간, 비-인간 영장류(non-human primate), 마우스, 랫, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 개체로부터 수득된 세포 또는 조직에서 MPHOSPH1의 발현 수준이 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여, 전사(핵산) 생산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들어, MPHOSPH1의 mRNA는 혼성화(hybridization) 방법에 의해 탐침(probe)을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, 노던(Northern) 혼성화). 탐지는 칩, 또는 어레이(array) 또는 그 외로 수행될 수 있다. 어레이의 사용은 MPHOSPH1의 발현 수준을 탐지하는데 바람직할 수 있다. 당업자들은 MPHOSPH1의 서열 정보를 이용하여 이러한 탐침을 준비할 수 있다. 예를 들어, MPHOSPH1의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지 될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.
또한, MPHOSPH1(서열번호: 125)의 전사 생산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들어, RT-PCR). 상기 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 제조될 수 있다.
특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한, 적절하게 엄격한 또는 낮게 엄격한 조건 하에서 MPHOSPH1의 mRNA와 혼성화된다. 여기에서 사용되듯이, 상기 구 “엄격한(혼성화) 조건”은 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경 하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하) 표적 서열에 상보적인 상기 탐침의 50%가 표적 서열에 평형상태로 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서, 상기 탐침의 50%는 평형상태로 점유된다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 소듐 이온 미만일 것이며, 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온(또는 다른 염들) 및 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30℃이고(예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은, 불안정화 물질의 첨가로 또한 수득할 수 있다.
본 발명의 탐침 또는 프라이머는 전형적으로 상당히 정제된 올리고뉴클레오티드이다. 상기 올리고 뉴클레오티드는 엄격한 조건에서 최소 약 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 또는 25로 혼성화되는 뉴클레오티드 서열, MPHOSPH1서열을 포함하는 핵산의 연이은(consecutive) 정방향 사슬(sense strand) 뉴클레오티드 서열, 또는 MPHOSPH1서열을 포함하는 핵산의 역방향 사슬(anti-sense strand) 뉴클레오티드 서열의, 또는 상기 서열에서 자연적으로 발생한 돌연변이의 부분을 포함한다. 특히, 예를 들어, 바람직한 실시예에서, 길이로 5 - 50개를 가지는 올리고뉴클레오티드는 탐지를 위해, 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, MPHOSPH1 유전자의 mRNA 또는 cDNA는 특정한 크기, 일반적으로 15 - 30b 길이인 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머로 검출될 수 있다. 그 크기는 최소 10 뉴클레오티드, 최소 12 뉴클레오티드, 최소 15 뉴클레오티드, 최소 20 뉴클레오티드, 최소 25 뉴클레오티드, 최소 30 뉴클레오티드인 범위일 수 있고 탐침 및 프라이머는 크기에 있어서 5 - 10 뉴클레오티드, 10 - 15 뉴클레오티드, 15 - 20 뉴클레오티드, 20 - 25 뉴클레오티드 및 25 - 30 뉴클레오티드인 범위일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머의 길이는 15 - 25개로부터 선택될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 이용한 유전자 검출을 위한 분석 절차, 기계, 또는 시약은 잘 알려져 있다(예를 들어 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 또는 PCR). 상기 분석법에서, 탐침 또는 프라이머는 태그(tag) 또는 링커 서열을 포함할 수 있다. 또한, 탐침 또는 프라이머는 검출가능한 표지 또는 포착되기 위한 친화성 리간드(affinity ligand)로 변형될 수 있다. 그 대신에, 검출 절차에 기초한 혼성화에서, 몇 백(예를 들어, 약 100 - 200)의 염기 내지 몇 킬로(예를 들어, 1000 - 2000)의 염기를 가진 폴리뉴클레오티드도 또한 탐침으로 사용될 수 있다(예를 들어, 노던 블랏 분석 또는 cDNA 마이크로어레이 분석). 그 대신에, 번역 생산물은 본 발명의 진단을 위해 탐지될 수 있다.
예를 들어, MPHOSPH1 단백질(서열 번호: 126) 또는 이의 면역학적 단편의 양은 결정될 수 있다. 번역 생산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 단일클론(monoclonal) 또는 다중클론(polyclonal)일 수 있다. 또한, 단편 또는 변형된 항체가 MPHOSPH1 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은 탐지를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 이의 단편에 대한 상기 항체는 본 발명에 의해 또한 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 이의 등가물을 준비하기 위해 본 발명에 적용될 수 있다.
MPHOSPH1 유전자 발현 수준을 탐지하기 위해 이의 번역 생산물에 기초한 또 다른 방법으로서, 염색의 강도는 MPHOSPH1 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 즉, 상기 측정에서, 강한 염색은 단백질의 증가한 존재/수준과, 동시에, MPHOSPH1 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.
만약 그 수준이, 예를 들어, 표적 유전자의 대조군 수준의 10%, 25%, 또는 50%까지 증가하거나; 또는 1.1 배 이상, 1.5 배 이상, 2.0 배 이상, 5.0 배 이상, 10.0 배 이상, 또는 그 이상으로 증가하면, 암 세포에서 표적 유전자, 예를 들어, MPHOSPH1 유전자의 발현 수준은 증가할 것으로 결정될 수 있다.
질환 상태(들)(암성 또는 비-암성)라고 알려진 개체(들)로부터 이전에 수거 및 저장된 표본(들)을 사용한 암 세포에 비해 동일한 시간에 대조군 수준이 결정될 수 있다. 또한, 치료될 암을 갖는 기관의 비-암성 부위로부터 수득된 정상 세포는 정상 대조군으로서 사용될 수 있다. 그 대신에, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 개체로부터 알려진 표본에서 확인된 MPHOSPH1 유전자의 발현 수준(들)을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 결정될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 생물학적 표본 내의 MPHOSPH1 유전자의 발현 수준은 다수의 대조군 수준과 비교 및 다수의 참조 표본으로부터 결정될 수 있다. 개체 유래 생물학적 표본과 유사한 조직 종류로부터 유래된 참조 표본으로부터 대조군 수준을 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려져 있는 군의 MPHOSPH1 유전자의 발현 수준의 기준 값을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 기준 값은 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 평균 +/- 2 S.D. 또는 평균 +/- 3 S.D.의 범위가 기준 값으로 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 비-암성인 것으로 알려진 생물학적 표본으로부터 결정된 대조군 수준은 “정상 대조군 수준"으로 지칭된다. 표본 발현 수준 및 대조군 발현 사이의 차이는 대조군 핵산, 예를 들어, 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현 수준으로 정규화될 수 있고, 이 발현 수준은 세포의 암성 또는 비-암성 상태에 의존하여 다르게 하지 않는다고 알려져 있다. 예시적인 대조군 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드 3 인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase), 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한편, 만약 대조군 수준이 암성인 생물학적 표본으로부터 결정된다면, 이것은 “암성 대조군 수준”으로 지칭된다.
MPHOSPH1 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가하였을 때, 또는 암 대조군 수준과 유사/동등할 때, 개체는 치료될 암을 갖는 것으로 진단될 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 암을 가지고 있는 것으로 의심되는 개체가 치료될 암을 가지고 있는지에 대한 여부 진단, 및/또는 (ii) 암 치료를 위한 개체를 선택하는 방법을 또한 제공하고, 그 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 세포 또는 조직(들)에서 MPHOSPH1의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) MPHOSPH1의 발현 수준을 정상 대조군 수준과 비교하는 단계;
c) 만약 MPHOSPH1의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가하였다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.
그 대신에, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:
a) 치료될 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 세포 또는 조직(들)에서 MPHOSPH1의 발현 수준을 결정하는 단계;
b) MPHOSPH1의 발현 수준을 암성 대조군 수준과 비교하는 단계;
c) 만약 MPHOSPH1의 발현 수준이 암성 대조군 수준과 비교하여 유사하거나 동등하다면, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서, 개체가 치료될 암을 갖는 것으로 진단되었다면, 암 치료를 위한 개체를 선택하는 단계.
본 발명은 본 발명의 MPHOSPH1 폴리펩티드로 치료될 수 있는 고통을 받거나 받을 것으로 의심거나, 암으로 발전할 가능성이 있는 개체를 진단 또는 결정하기 위한 진단 키트(kit)를 또한 제공하고, 이는 암 면역치료법의 효율성 또는 적용가능성을 평가 및/또는 모니터링하는 용도를 또한 찾을 수 있다. 바람직하게는, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 키트는 바람직하게 개체-유래 세포에서 MPHOSPH1 유전자의 발현을 탐지하기 위한 최소 하나의 시약을 포함할 수 있고, 상기 시약은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
(a) MPHOSPH1 유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 시약;
(b) MPHOSPH1 단백질 또는 이의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 시약; 및
(c) MPHOSPH1 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.
MPHOSPH1의 mRNA의 탐지를 위해 적합한 시약의 예는 MPHOSPH1 mRNA에 특이적으로 결합 또는 이를 확인하는, 예를 들면 MPHOSPH1 mRNA의 부분에 대한 상보적 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은, 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 MPHOSPH1 mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침에 의해 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, MPHOSPH1 mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, MPHOSPH1 mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.
한편, MPHOSPH1 단백질 또는 이의 면역학적 단편의 참지를 위한 적절한 시약의 예는 MPHOSPH1 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있다. 또한 단편 또는 변형된 항체가 MPHOSPH1 단백질 또는 이의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등)은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하기 위해 어떤 방법이든 본 발명에서 적용될 수 있다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 항체 표지 및 그들의 표적에 항체의 결합을 탐지하는 표지 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, MPHOSPH1 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.
키트는 상기 언급한 시약을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 매트릭스 및 MPHOSPH1 유전자에 대한 탐침 또는 MPHOSPH1 펩티드에 대한 항체에 결합하는 고형 매트릭스 및 시약, 세포를 배양하는 배지 및 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 MPHOSPH1 펩티드에 대한 항체를 탐지하기 위한 2차 항체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 암이 없거나 또는 암을 겪고 있는 개체로부터 얻어진 조직 표본은 유용한 대조 시약으로 제공할 수 있다. 본 발명의 키트는 바람직하게 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용설명용 패키지 삽입물(예를 들어, 문서, 테이프, CD-ROM 등)을 포함하는 다른 물질을 더 포함할 수 있다. 적절한 용기는 병, 바이알(vials), 및 테스트 튜브(test tube)를 포함할 수 있다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로 형성될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 시약이 MPHOSPH1 mRNA에 대한 탐침일 때, 상기 시약은 적어도 하나의 탐지 부위를 형성하기 위하여, 다공성 스트립(strip)과 같은, 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지 지역은 각각 핵산(탐침)을 포함하는, 많은 수의 부분을 포함할 수 있다. 시험(test) 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 그 대신에, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로, 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫 번째 탐지 부위의 더 많은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 표본의 첨가에 따라, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 표본 안에 존재하는 MPHOSPH1 mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 설정될 수 있으며 전형적으로 바 또는 도트 스패닝(dot spanning)의 모양 시험 스트립의 너비이다.
본 발명의 키트는 양성 대조군 표본 또는 MPHOSPH1 기준 표본을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 양성 대조군 표본은 MPHOSPH1 양성 표본을 수집하고 그들의 MPHOSPH1 수준을 검사함으로써 준비될 수 있다. 그 대신에, 양성 표본 또는 MPHOSPH1 기준 표본을 형성하기 위해 정제된 MPHOSPH1 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 MPHOSPH1를 발현하지 않는 세포에 첨가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 정제된 MPHOSPH1는 재조합 단백질일 수 있다. 양성 대조군 표본의 MPHOSPH1 수준은, 예를 들어, 판정 컷오프(cut-off) 값 이상이다.
한 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 인지되는 단백질 또는 이의 부분 단백질을 포함하는, 진단용 키트를 더 제공한다.
본 발명의 부분 펩티드(partial peptide)의 예는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 최소 8개, 바람직하게 15개, 및 보다 바람직하게 20개의 연속적인 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은 본 발명의 단백질 또는 펩티드(폴리펩티드)를 사용하는 표본(예를 들어, 혈액, 조직)에서 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩티드를 제조하는 방법은 상기에 기술된 바와 같다.
본 발명의 암을 진단하기 위한 방법은 항-MPHOSPH1 항체의 양 및 상기 기술된 것과 상응하는 대조군 표본에서의 양 사이의 차이를 결정함으로써 수행될 수 있다. 만약 개체의 세포 또는 조직이 유전자의 발현 생산물(MPHOSPH1)에 대한 항체를 포함하고, 항-MPHOSPH1 항체의 양이 정상 대조군에서의 것과 비교하여 판정 컷오프 이상으로 결정되면, 그 개체는 암을 앓고 있는 것으로 추정된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 진단용 키트는 본 발명의 펩티드 및 이에 결합하는 HLA 분자를 포함할 수 있다. 항원성 펩티드 및 HLA 분자를 사용하여 항원 특이적 CTLs을 탐지하는 방법은 이미 확립되었다(예를 들어, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체는 종양 항원 특이적 CTLs을 탐지하기 위한 탐지 방법에 적용될 수 있고, 이에 의해 암의 조기 탐지(earlier detection), 재발 및/또는 전이가 가능하다. 또한, 이것은 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 약학물(pharmaceuticals)과 함께 적용할 수 있는 개체의 선택, 또는 약학물의 치료 효과의 평가에 적용될 수 있다.
특히, 알려진 방법에 따르면(예를 들어, Altman JD et al., Science. 1996. 274(5284): 94-6 참조), 방사선-표지된 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의, 테트라머와 같은, 올리고머 복합체가 준비될 수 있다. 복합체를 사용하여, 예를 들어, 암으로 고통받는 것으로 의심되는 개체 유래 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)에서 항원-펩티드 특이적 CTLs을 정량함으로써 상기 진단이 수행될 수 있다.
본 발명은 여기에서 기술된 펩티드 에피토프를 이용함으로서 개체의 면역 반응을 평가하기 위한 방법 및 진단용 제제를 더 제공한다. 본 발명의 한 실시예에서, 여기에서 기술된 HLA A-24 제한된 펩티드는 개체의 면역 반응을 평가하거나 또는 예측하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 평가되는 면역 반응은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역원(immunogen)을 면역능력이 있는 세포(immunocompetent cell)와 접촉시킴으로써 유도될 수 있다. 어떤 실시예에 있어서, 펩티드 에피토프를 인식하여 결합하는 항원특이적 CTL의 생산을 결과할 수 있는 임의의 물질 또는 조성물을 시약으로서 사용할 수 있다. 펩티드 시약을 면역원으로서 사용될 필요가 없다. 상기 분석을 위해 사용되는 검사 시스템은 테트라머(tetramer), 세포 내 림포카인(lynphokine) 및 인터페론(interferon) 분비 검사법을 위한 염색, 또는 ELISPOT 분석과 같은, 상대적으로 최근의 기술 발달을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 면역 반응을 측정하기 위한 면역기능이 있는 세포는 말초 혈액(peripheral blood), 말초 혈액 단핵구(peripheral blood lymphocyte, PBL), 및 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 선택될 수 있다. 상기 면역기능이 있는 세포를 수집 또는 분리를 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 대체적인 바람직한 실시예에서, 펩티드 시약과 접촉될 면역기능이 있는 세포는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드는 종양 세포 항원 또는 면역원에 대한 노출 이후 항원-특이적 CTLs의 존재를 위해 말초 혈액 단핵구 세포를 평가하기 위한 테트라머 염색 검사법에서 사용될 수 있다. HLA 테트라머 복합체는 말초 혈액 단핵구세포의 표본에서 직접적으로 항원 특이적 CTL을 가시화 하고(예를 들어, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; 및 Altman et al., Science 174: 94-96. 1996 참조) 및 항원-특이적 CTL 집단의 빈도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 사용한 테트라머 시약은 하기에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다.
HLA 분자에 결합하는 펩티드는 상응하는 HLA 중쇄(heavy chain) 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재하에 3분자 복합체를 생산하기 위하여 다시 접힌다(refolded). 상기 복합체에서, 중쇄의 카복실 말단은 이전에 단백질로 조작되었던 부위에서 바이오틴화된다. 그 후, 상기 3분자 복합체 및 스트렙토아비딘(streptoavidin)으로 구성된 테트라머를 형성하기 위하여 스트렙토아비딘은 복합체로 첨가된다. 형광으로 표지된 스트렙토아비딘에 의하여, 상기 테트라머는 항원-특이적 세포를 염색시키기 위해 사용될 수 있다. 그 후 상기 세포는, 예를 들어, 유동 분석(flow cytometry)에 의해서 동정될 수 있다. 상기 분석은 진단 또는 예후의 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 절차에 의해 동정된 세포는 또한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 면역 회상 반응(immune recall response)을 평가하기 위해 본 발명의 펩티드를 포함하는 시약을 또한 제공한다(예를 들어, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 및 Penna et al., J. Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991 참조). 예를 들어, 치료될 암을 앓고 있는 개인으로부터 수득된 환자 PBMC 표본은 특이적 펩티드를 사용하여 항원-특이적 CTLs의 존재를 위해 분석될 수 있다. 단핵 세포를 포함하는 혈액 표본은 PBMC를 배양하고 상기 세포를 본 발명의 펩티드로 자극시킴으로써 검사될 수 있다. 적절한 배양 기간 후, 증식된 세포 집단은, 예를 들어, CTL 활성에 대하여 분석될 수 있다.
상기 펩티드는 백신의 효험(efficacy)를 평가하기 위해 시약으로서 또한 사용될 수 있다. 면역원으로 예방접종된 환자로부터 수득한 PBMCs는, 예를 들어 상기 기재된 방법들 중 어느 하나를 사용하여 분석될 수 있다. 환자는 분석을 위해 선택되었다는 점에서 환자는 HLA 종류가 있고, 대립 유전자-특이적 분자를 인지하는 펩티드 에피토프 시약이 있다. 백신의 면역원성은 PBMC 표본에서 에피토프-특이적 CTLs의 존재에 의해 나타날 수 있다.
본 발명의 펩티드는 당업계에서 잘 알려진 기술을 사용함으로써, 항체를 만드는데 또한 사용될 수 있고(예를 들어, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY ; 및 Antibodies a Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조), 이는 암을 진단, 검출 또는 모니터하기 위한 시약으로의 용도를 찾을 수 있다. 상기 항체는 HLA 분자의 맥락에서, 펩티드를 인지하는 것, 즉, 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 조성물은 많은 첨가적 용도를 갖고, 그 일부는 여기에서 기술된다. 예를 들어, 본 발명은 MPHOSPH1 면역원성 폴리펩티드의 정량에 의해 특징화되는 질환을 진단 또는 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 표본에서 MPHOSPH1 펩티드의 정량, 또는 MPHOSPH1 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현을 결정하는 것과 관련이 있다. 펩티드 또는 펩티드 및 HLA 종류 I 분자의 복합체의 발현은 상기 펩티드 또는 복합체의 결합 파트너로 검사함으로써 결정 또는 탐지될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 펩티드 또는 복합체를 위한 결합 파트너는 펩티드를 인지하고 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 종양 조직검사(biopsy)와 같은, 생물학적 표본에서 MPHOSPH1의 발현은 MPHOSPH1 프라이머를 사용한 표준적인 PCR 증폭 프로토콜에 의하여 또한 검사될 수 있다. 종양 발현의 예는 여기에서 나타나고 나아가 MPHOSPH1 증폭에 대한 예시적인 조건 및 프라이머의 공개는 선행문헌으로서 본 발명에 포함되는 WO2003/27322에서 발견될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단 방법은 생물학적 표본에서 MPHOSPH1 HLA 결합 펩티드의 존재를 탐지하기 위하여 MPHOSPH1 HLA 결합 펩티드를 위한 특이적 제제와 함께 개체로부터 분리된 생물학적 표본를 접촉시키는 것과 관련이 있다. 여기에서 사용되듯이, “접촉"은 물질 및 생물학적 표본에 존재하는 MPHOSPH1 HLA 결합 펩티드 사이에서 특이적 상호결합을 허용하도록, 제제와 충분히 근접한 곳 및, 예를 들어, 농축, 온도, 시간, 이온화 강도의 적절한 조건에 생물학적 표본를 놓아두는 것을 의미한다. 일반적으로, 생물학적 표본에 있는 분자 및 이의 인지체(cognate)(예를 들어, 단백질 및 이의 수용체 인지체, 항체 및 상기 단백질 항원 인지체, 핵산 및 이의 상보적 서열 인지체) 사이의 특이적 상호결합을 촉진하기 위해 제제를 생물학적 표본과 접촉시키는 조건은 당업자에게 자명하다. 분자 및 그것의 인지체 사이의 특이적 상호결합을 촉진시키기 위한 최적의 조건은 본 명세서의 선행기술문헌인 Low et al.에 의해 발행된 U.S. Patent No. 5,108,921에 기술되어 있다.
본 발명의 진단 방법은 생체 내 및 시험관 내 중 어느 하나 또는 그 모두에서 수행될 수 있다. 따라서, 생물학적 표본은 본 발명에서 생체 내 또는 시험관 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 표본은 생체 내에서 조직일 수 있고, MPHOSPH1 면역원성 폴리펩티드에 특이적인 제제는 그 조직에서 상기 분자의 존재를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 그 대신에, 생물학적 표본은 시험관 내에서 수집 또는 분리될 수 있다(예를 들어, 혈액 표본, 종양 조직검사, 조직 추출물). 특별히 바람직한 실시예에서, 생물학적 표본는 세포 포함 표본일 수 있고, 보다 바람직하게 진단 또는 치료되는 개체로부터 수집된 종양 세포를 포함하는 표본일 수 있다.
그 대신에, 상기 진단은 형광-표지된 HLA 다중결합 복합체를 사용한 염색에 의해 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 허용하는 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, Altman. J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman. J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330 ;). 세포 내 림포카인 염색, 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 분비 검사법 또는 ELISPOT 분석이 제공되었다. 다합체 염색, 세포 내 림포카인 염색 및 ELISPOT 검사법 모두는 더욱 보편적인 검사에 비해 최소 10-배 이상이 될 것으로 보인다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186 : 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8 : 413). 펜타머(pentamer)(예를 들어, US 2004-209295A), 덱스트라머(dextramer)(예를 들어, WO 02/072631), 및 스트렙타머(예를 들어, Nature Medicine 6. 631-637 (2002)) 또한 사용될 수 있다.
예를 들어, 어떤 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 MPHOSPH1 펩티드 중 최소 하나가 투여된 개체의 면역학적 반응을 진단 또는 평가하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 면역원에 대해 특이적인 CTL 유도에 적합한 조건 하에서 면역능력이 있는 세포와 면역원을 접촉하는 단계;
(b) 단계(a)에서 유도된 CTL 유도 수준을 탐지 또는 결정하는 단계; 및
(c) CTL 유도 수준이 있는 개체의 면역 반응을 연관시키는(correlating) 단계.
본 발명의 맥락에서, 상기 면역원은 (a) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120의 아미노산 중으로부터 선택된 MPHOSPH1 펩티드 및, (b) 1, 2 또는 그 이상의 아미노산 치환으로 변형된 이러한 아미노산 서열을 가지는 펩티드들의 이러한 아미노산을 가지는 펩티드 중 최소 하나를 포함한다. 그동안, 면역원 특이적 CTL의 유도에 적합한 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 면역능력이 있는 세포는 면역원 특이적 CTL을 유도하기 위해 면역원(들)의 존재 하에 시험관 내에서 배양될 수 있다. 면역원 특이적 CTLs을 유도하기 위해, 어떤 자극 인자(stimulating factors)든지 상기 세포 배양에 첨가될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 CTL 유도를 위한 바람직한 자극 인자이다.
어떤 실시예에서, 펩티드 암 치료로 치료되는 개체의 면역학적 반응을 모니터 또는 평가하는 단계는 치료 전, 동안 및/또는 후에 수행될 수 있다. 일반적으로, 암 치료의 절차 동안, 면역성 펩티드는 반복적으로 치료되는 개체에 투여된다. 예를 들어, 면역성 펩티드는 3 - 10 주 동안 매주 투여될 수 있다. 따라서, 개체의 면역학적 반응은 암 치료 과정 동안 평가 또는 모니터될 수 있다. 그 대신에, 암치료에 대한 면역학적 반응의 평가 또는 모니터링 단계는 치료 과정의 완료일 수 있다.
본 발명에 따라, 대조군과 비교하여 면역원 특이적 CTL의 증가된 유도는 투여된/되었던 면역원(들)에 대한 면역학적으로 반응되어 평가 또는 진단된 개체를 나타낸다. 상기 면역학적 반응을 평가하기 위한 적합한 대조군은, 예를 들어, 면역능력이 있는 세포가 펩티드 없이, 또는 어떤 MPHOSPH1 펩티드(예를 들어, 무작위 아미노산 서열) 외에 아미노산 서열을 가지는 대조군 펩티드(들)와 접촉될 때 CTL 유도 수준을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 개체에 투여된 각 면역원 사이의 면역 반응을 비교함으로써, 상기 개체의 면역학적 반응은 서열 특이적 방법으로 평가된다. 특히, 어떤 유형의 MPHOSPH1 펩티드의 혼합물이 개체에 투여될 때라도, 면역학적 반응은 상기 펩티드에 따라 다를 수 있다. 그러한 경우에, 각 펩티드 사이의 면역 반응의 비교에 의해, 더 높은 반응을 보이는 개체에 대한 펩티드가 동정 될 수 있다.
XI. 항체
본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 추가적으로 제공한다. 바람직한 항체는 특이적으로 본 발명의 펩티드와 결합하고 다른 펩티드에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합). 그 대신에, 항체는 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 그것의 상동체와 결합할 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 또는 예후 검사법뿐만 아니라 이미지화 방법론(imaging methodology)에서 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 MPHOSPH1이 암 환자에서 발현되거나 또는 과발현되는 정도로 다른 암의 치료, 진단 및/또는 예후에서 사용될 수 있다. 또한, 세포 내에서 발현되는 항체(예를 들어, 단일 사슬 항체)는 MPHOSPH1의 발현이 관련된 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 암을 치료하기 위한 용도를 치료적으로 찾을 수 있다.
본 발명은 MPHOSPH1 단백질(서열 번호: 126) 또는 서열 번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120 중에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함하는 그것의 단편의 탐지 및/또는 정량을 위한 다양한 면역학적 검사법을 또한 제공한다. 상기 검사법은 MPHOSPH1 단백질 또는 그것의 단편과 결합하고 인지할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-MPHOSPH1 항체를 적절하게, 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, MPHOSPH1 폴리펩티드와 결합하는 항-MPHOSPH1 항체는 바람직하게 서열 번호 2 내지 33 중에서 선택된 아미노산 서열이 구성하는 폴리펩티드를 인지할 것이나, 다른 것은 배재된다. 항체의 결합 특이성은 억제 검사(inhibition test)의 수단으로서 확인될 수 있다. 즉, 서열 번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120의 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 어떤 단편의 폴리펩티드의 존재 하에서 분석될 항체 및 전장의 MPHOSPH1 폴리펩티드 사이의 결합이 억제될 때, 상기 항체는 그 단편에 특이적으로 결합하는 것을 보여준다. 본 발명의 맥락에서, 상기 면역학적 검사법은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역학적 검사법 종류(format) 내에서 수행되고, 방사선-면역검사법(radio-immunoassay), 면역-크로마토그래프 기술(immuno-chromatograph technique), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), ELIFA(enzyme-linked immunofluorescent assay), 및 이와 같은 것의 다양한 유형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 관련된 면역학적이지만 비항체 검사법은 T 세포 면역원성 검사법(억제성 또는 자극성)뿐만 아니라 MHC 결합 검사법로 또한 구성된다. 또한, MPHOSPH1를 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역학적 이미지 방법은 본 발명에 의해 또한 제공되고, 본 발명의 표지된 항체를 사용한 방사선 동위 원소 이미지 방법(radioscintigraphic imaging method)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 검사법은 MPHOSPH1를 발현하는 암, 예를 들면 방광암, 유방암, 자궁경부암, 간내담도암, CML, 직장암, 위암, NSCLC, 림프종, 골육종, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 연부 조직 종양을 포함하는, 암의 탐지, 모니터, 및 예후로의 용도를 임상적으로 찾을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 단일클론 또는 다중클론 항체와 같은, 어떠한 형체에서도 사용될 수 있고, 본 발명의 펩티드로 면역화된 동물, 예를 들면 토끼에 의해 수득된 항혈청을 포함하고, 모든 종류의 다중클론 및 단일클론 항체, 인간항체, 및 유전적 재조합에 의해 생성된 인간화된 항체를 포함한다.
항체를 얻기 위해 항원으로서 사용된 본 발명의 펩티드는 어떠한 동물의 종류에서도 유래할 수 있으나, 바람직하게는 인간, 마우스(mouse), 또는 랫(rat)과 같은 포유류, 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래할 수 있다. 인간-유래 펩티드는 여기에서 공개된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라, 단백질의 완전체(complete) 및 부분적 펩티드는 면역항원으로서 제공될 수 있다. 적합한 부분 펩티드의 예는 아미노(N)-말단 또는 카복시(C)-말단 단편를 포함한다.
여기에서, 항체는 MPHOSPH1 펩티드의 전장 또는 단편 중 어느 하나에 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 항체는 서열 번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 MPHOSPH1의 단편 펩티드를 인지한다. 올리고펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로서 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명에서, 올리고펩티드(예를 들면, 9 또는 10 머(mer))는 면역원성을 증진시키기 위해 담체와 결합되거나 연결될 수 있다. KLH(Keyhole-limpet hemocyanin)은 담체로서 잘 알려져 있다. KLH와 펩티드를 결합시키는 방법도 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
또는, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자 또는 이들의 단편은 알려진 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 그 후 여기에서 기술되는 것과 같이 숙주 세포에 형질도입시키기 위해 사용된다. 원하는 펩티드 또는 이들의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주 세포의 밖 또는 안으로부터 회복될 수 있고, 그 후에 항원으로서 사용될 수 있다. 또는, 펩티드를 발현하는 전체 세포 또는 그들의 용해물(lysate) 또는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있다.
어느 포유류 동물은 항원으로 면역화될 수 있지만, 세포 융합에 사용된 모 세포(parental cell)와의 양립성(compatibility)은 바람직하게 고려된다. 일반적으로, 설치류(Rodentia), 토끼류(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates) 과(family)의 동물이 사용된다. 설치류 과의 동물은 예를 들어, 마우스, 랫 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼류 과의 동물은 예를 들어, 토끼(rabbit)를 포함한다. 영장류 과의 동물은 예를 들어, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지와 같은 토끼목(Catarrhini(늙은 세계 원숭이, old world monkey))의 원숭이를 포함한다.
항원으로 동물을 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내(intraperitoneal) 주입 또는 피하(subcutaneous) 주입이 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원은 PBS(phosphate buffered saline), 생리적 살린(physiological saline) 등의 적절한 양에서 희석되거나 현탁될 수 있다. 바람직하다면, 상기 항원 현탁은 적절한 양의 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 같은, 표준 보강제와 혼합되고, 유화액으로 만들어지며 그 후 포유류 동물에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 그 후 매 4 내지 21일마다 프로인트 완전 보강제의 적절한 양과 함께 혼합한 항체를 여러 번 투여한다. 적절한 담체(carrier)도 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후, 혈청은 원하는 항체의 양의 증가를 위한 표준 방법에 의해 조사될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 대한 다중 클론 항체는 혈청에서 원하는 항체의 증가를 위해 시험되는 면역화된 포유류의 혈액을 수거함으로써, 및 어떠한 보편적인 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리시킴으로써 준비될 수 있다. 다중클론 항체는 다중클론 항체를 포함하는 혈청을 포함할 뿐만 아니라, 상기 다중클론 항체를 포함한 분획물을 혈청으로부터 분리한다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 오직 본 발명의 펩티드를 인지하는 분획물로부터, 예를 들면 본 발명의 펩티드와 연결된 친화성 컬럼을 사용하여, 그리고 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 사용하여 상기 분획물을 정제하는 것에 의해 준비될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되기 위한 단일클론 항체를 준비하기 위하여, 항원으로 면역화시킨 포유류로부터 면역세포를 수거하고, 그 면역세포에서 상기 기술된 것과 같이 혈청에서 원하는 항체의 증가된 수준을 검사하고, 세포 융합을 한다. 바람직하게, 세포 융합을 위해 사용되는 면역 세포는 비장(spleen)으로부터 수득될 수 있다. 상기 면역세포와 함께 융합되는 다른 바람직한 모 세포는 예를 들어, 포유류의 골수 세포(myeloma cell), 및 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위해 획득한 특성을 갖는 골수 세포를 포함한다.
상기 면역 세포 및 골수 세포는 알려진 방법, 예를 들면 Milstein et al.(Galfre and Milstein, Method Enzymol 73: 3-26(1981))의 방법에 따라 융합될 수 있다.
상기 세포 융합에 의해 수득된 결과인 하이브리도마(hybridoma)는 HAT 배지(히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지)와 같은, 표준 선택 배지에 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 며칠 내지 몇 주 동안 지속되는데, 이는 원하는 하이브리도마를 제외하고 모든 다른 세포(non-fused cell)를 사멸시키기에 허용되는 충분한 시간이다. 그 후, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크린 및 복제(clone)시키기 위해 표준 제한 희석(standard limiting dilution)을 수행될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위해 비인간 동물을 항원으로 면역화시킨 상기 방법 뿐만 아니라, EB 바이러스에 의해 감염된 것과 같은 인간 림프구는 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물을 사용하여 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그 후, 상기 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위해, 면역화된 림프구를, U266과 같은, 무한으로 분열할 수 있는 인간 유래 골수 세포와 융합할 수 있다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. Sho 63-17688).
그 이후 상기 수득한 하이브리도마를 마우스의 복강(abdominal cavity)으로 이식 및 복수를 추출할 수 있다. 상기 수득한 단일클론 항체를, 예를 들어, 암모늄 황산 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 본 발명의 펩티드가 연결된 친화성 컬럼에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드의 작용제 및 길항제에 대한 후보로서 사용될 수도 있다.
또는, 항체를 생산하는, 면역화된 림프구와 같은, 면역 세포는 종양유전자(oncogene)에 의해 무한증식(immortalization)될 수 있고 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그 후 수득된 단일클론 항체는 유전자 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다(예를 들어, MacMillan Publishers LTD의해 영국에서 출간된, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies (1990) 참조). 예를 들어, 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은, 면역 세포로부터 복제될 수 있고, 적절한 벡터로 삽입될 수 있으며, 재조합 항체를 만들기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기술된 재조합 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명 펩티드와 결합하는 한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fc(scFv)일 수 있고, 여기에서 H 및 L 사슬로부터의 Fv 단편은 적절한 링커(linker)에 의해 연결된다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). 보다 구체적으로, 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin)과 같은 효소와 함께 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 또는, 상기 항체 단편을 암호화하는 유전자는 제조될 수 있고, 발현 벡터로 삽입될 수 있으며 적절한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다(예를 들어, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991) 참조).
항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)(PEG)과 같은, 다양한 분자와 연결됨으로써 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 화학적으로 변형된 항체를 변형함으로서 얻을 수 있다. 상기 변형 방법은 당업계에서 보편적이다.
또는, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유래된 가변 부위(variable region) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 부위(constant region) 사이의, 키메라 항체로서, 또는 비인간 항체로부터 유래된 CDR(complementarity determining region), FR(framework region) 및 인간항체로부터 유래된 불변 부위를 포함하는, 인간화된 항체로서 수득될 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)가 수행될 수 있다(예를 들어, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 참조). 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라 항체이고, 여기에서 온전한 인간 가변 도메인보다 상당히 적은 도메인은 비-인간 종으로부터 그에 상응하는 서열에 의해 치환되었다.
전체적으로 인간 프레임워크 및 불변 부위뿐만 아니라 인간 가변 부위로 구성된 인간 항체 또한 사용될 수 있다. 상기 항체는 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 시험관 내(in vitro) 방법은 인간 항체 단편이 제시되는 박테리오파지의 재조합 라이브러리(예를 들어, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))의 사용과 관련이 있다. 유사하게, 형질전환 동물, 예를 들어, 내재성 면역 글로불린 유전자(endogenous immunoglobulin gene)가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스로 인간 항체는 인간 면역글로불린 위치(loci)의 유도를 통해 도입시킴으로써 만들어질 수 있다. 상기 접근은 예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기술되어 있다.
상기와 같이 수득한 항체는 동종성(homogeneity)으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에서 사용되는 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절하게 선택되고 혼합된 컬럼 크로마토그래피의 사용, 예를 들면 친화성 크로마토그래피, 여과, 울트라여과, 염-외(salting-out), 희석(dialysis), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 등점적 전기영동(isoelectric focusing)에 의해 상기 항체는 분리(sepseration) 및 추출(isolation)될 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이에 한정되지 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로서 사용될 수 있다. 사용되는 예시적인 단백질 A 컬럼은, 예를 들어, Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F.(Pharmacia)를 포함한다.
친화성을 제외한, 적합한 크로마토그래피 기술의 예는, 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 겔 여과(gel filtration), 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 그와 같은 것(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))을 포함한다. 크로마토그래피 절차는 HPLC 및 FPLC와 같은, 액체상 크로마토그래피(liquid-phase chromatography)에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 흡수도의 측정, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), EIA(enzyme immunoassay), RIA(radioimmunoassay) 및/또는 면역형광이 본 발명 항체의 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 측정하기 위해 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트에 고정시키고, 본 발명의 펩티드를 플레이트에 첨가하며, 그 후 항체를 생산하는 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체와 같은, 원하는 항체를 포함하는 표본를, 첨가한다. 그 후, 1차 항체를 인지하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은, 효소로 표지된 2차 항체를 적용하고, 상기 플레이트를 배양한다. 그 다음, 세척 후, p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)와 같은, 효소 기질을 플레이트에 첨가시키고, 상기 표본의 항원 결합 활성을 평가하기 위하여 흡수도를 측정한다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은, 펩티드의 단편은 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 항원으로서 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)는 본 발명에 따라 항체의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 펩티드를 포함한다고 가정되는 표본에 노출시킴으로써, 본 발명의 펩티드를 탐지 또는 측정하게 해주고, 상기 항체 및 상기 펩티드에 의해 형성된 면역 복합체를 탐지 또는 측정하게 해준다.
본 발명에 따라 펩티드를 탐지 또는 측정하는 방법은 특이적으로 펩티드를 탐지 또는 측정할 수 있기 때문에, 이 방법은 상기 펩티드를 사용하는 다양한 실험의 용도를 발견할 수 있다.
XII. 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 도입시키는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포에 대해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 담체, 구체적으로 DNA로서, 본 발명의 펩티드를 발현하기 위하거나, 또는 유전자 치료법에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하기 위하여 유용하다.
숙제 세포로서 대장균(E. coli)이 선택되고 벡터가 대장균 내에서(예를 들어, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue) 대량으로 증폭 및 생산될 때, 상기 벡터는 대장균 내에서 증폭되기에 적합한 “ori” 및 형질전환된 대장균을 선별하기에 적합한 유전자 마커(예를 들어, 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 그와 같은 것과 같은 약물에 의해 선별되는 약물-내성 유전자)를 가져야 한다. 예를 들어, M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, 등이 사용될 수 있다. 게다가, pGEM-T, pDIRECT 및 pT7 또한 상기 기술된 벡터뿐만 아니라 cDNA를 서브클로닝 및 추출을 위해 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용될 때, 발현 벡터는 특히 유용하다. 예를 들어, 대장균에서 발현되는 발현 벡터는 대장균 내에서 증폭되기 위하여 상기 특징을 가져야 한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue와 같은, 대장균을 숙주 세포로서 사용할 때, 벡터는 대장균 내에서 원하는 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward et al., Nature 341: 544-6(1989); FASEB J 6: 2422-7(1992)), araB 프로모터(Better et al., Science 240: 1041-3(1988)), T7 프로모터 또는 그와 같은 것을 가져야 한다. 이러한 관점에서, 예를 들어, pGEX-5X-1(Pharmacia), “QIAexpress system"(Qiagen), pEGFP 및 pET(이 경우에, 숙주는 우선적으로 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이다)가 상기 벡터들을 대신하여 사용될 수 있다. 게다가, 상기 벡터는 펩티드 분비를 위한 신호 서열(signal sequence)을 포함할 수 있다. 대장균의 주변 세포질(periplasm)로 분비되도록 펩티드에 지시하는 신호 서열의 예는 pelB 신호 서열(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379(1987))이 있다. 벡터를 표적 숙주 세포로 도입시키기 위한 수단은, 예를 들어, 칼슘 클로라이드(calcium chloride) 방법, 및 전기침공(electroporation) 방법을 포함한다.
대장균에 추가하여, 예를 들어, 포유류로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pcDNA3(Invitrogen) 및 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990)), pEF, pCDM8), 곤충 세포로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, “Bac-to-BAC baculovirus expression system"(GIBCO BRL), pBacPAK8), 식물로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pMH1, pMH2), 동물 바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pZIpneo), 효모로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, “Pichia Expression Kit"(Invitrogen), pNV11, SP-Q01) 및 바실러스 섭틸릭스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 발현 벡터(예를 들어, pPL608, pKTH50)가 본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은, 동물 세포에서 벡터를 발현시키기 위해서, 벡터는 상기 세포 내에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature 277: 108(1979)), MMLV-LTR 프로모터, EF1 알파 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322(1990)), CMV 프로모터 및 그와 같은 것을 운반해야 하고, 바람직하게 형질전환체를 선별하기 위한 유전자 마커(예를 들어, 약물(neomycin, G418)에 의해 선별되는 약물 내성 유전자)를 가져야 한다. 상기 특징을 가진 알려진 벡터의 예는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.
이하, 실시예를 참고하여 본 발명은 보다 상세하게 기재되었다. 그러나, 하기 재료, 방법 및 실시예는 본 발명의 어떠한 실시예의 제조 및 사용에서 당업자의 이해를 위해 설명될 뿐, 본 발명의 실제적인 측면을 위해 만들어진 것 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다. 당업자는 쉽게 이해할 수 있으므로, 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 실험에서 사용될 수 있다.
여기에서 기술된 것과 비슷하거나 동일한 재료 및 방법은 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 재료는 기술된다. 모든 공개 발표(publication), 특허 출원, 특허, 및 여기에서 언급한 다른 참고문헌(references)은 이 전체에서 참조로서 통합된다. 갈등의 경우에, 정의를 포함하는, 본 명세서는 조절될 것이다. 게다가, 재료, 방법, 및 실시예는 오직 예시하기 위한 것이고 제한하는 의도가 아니다.
실시예
재료 및 방법
세포주
HLA-A*0201-양성의 B-림프아형 세포주(lymphoblastoid cell line)인 T2, HLA-A*0206-양성의 B-림프아형 세포주인 HT1376, J82, COS7 및 UM-UC3는 ATCC로부터 구입하였다. MKN-45는 JCRB에서 구입하였다.
MPHOSPH1 유래 펩티드의 후보 선별
HLA-A*0201 분자에 결합하는 MPHOSPH1 HLA-A*0201 분자에 결합하는 MPHOSPH1로부터 유래된 9-머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 “BIMAS” (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al., J Immunol 1994, 152(1): 163-75; Kuzushima et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81)를 이용하여 예측되었다. 이러한 펩티드들은 표준 고체상 합성 방법(standard solid phase synthesis method)에 따라 Biosynthesis(Lewisville, Texas)에 의하여 합성되었고 역상 고속 액체 크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)로 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동정(identity)은 각각, 분석용 HPLC 및 질량분석법(mass spectrometry analysis)에 의하여 결정되었다. 펩티드를 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 20 mg/ml로 용해하고, -80℃에 저장하였다.
시험관 내에서 CTL 유도
단핵구-유래 수지상세포(dendritic cell, DC)는 인간 백혈구 항체(human leukocyte antigen, HLA)에 제시된 펩티드에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)로 사용되었다. DC를 다른 곳(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)에 기술된 것과 같이 시험관 내에서 생산하였다. 특히, 정상 지원자(HLA-A*0201 양성)로부터 피콜-플라크 플러스(Ficoll-Plaque plus; Pharmacia) 용액에 의해 분리된 말초 혈액 단핵구 세포를 단핵구 분획물(fraction)로서 이를 풍부하도록(enrich) 하기 위하여 플라스틱 조직 배양 접시(Becton Dickinson)에 부착하는 것을 이용하여 분리하였다. 단핵구-풍부한 집단을 2% 열-불활성화(heat-inactivated) 자신의 혈청(autologous serum; AS)를 포함한 AIM-V 배지(Invitrogen)에 과립-대식 세포집락-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; R&D System) 1000 U/ml 및 IL(interleukin)-4(R&D System) 1000 U/ml의 존재 하에 배양하였다. 배양 7 일 후, 3 시간 동안 37℃에서 AIM-V 배지에서 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin) 3 μg/ml의 존재 하에서 사이토카인-유도된 DC에 합성된 펩티드 각각의 20 μg/ml를 부과하였다. 생성된 세포는 그들의 세포 표면에 CD80, CD83, CD86 및 HLA 종류 II와 같은, DC-관련 분자를 발현하는 것으로 나타났다(데이터는 기재 안 함). 그 후 상기 펩티드-부과 DC를 X레이-방사선 처리(20 Gy)에 의하여 비활성화하였고 자신의 CD8+ T 세포와 1:20 비율로 혼합하여, CD8 양성 분리 키트(CD8 positive Isolation Kit; Dynal)를 사용한 양성 선택으로 수득하였다. 상기 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에서 수행하였고; 각 웰은 AIM-V/2% AS 배지 0.5 ml에 1.5 × 104 펩티드-부과 DC, 3 × 105 CD8+ T 세포 및 IL-7(R&D system)의 10 ng/ml을 포함하였다. 3 일 후, 상기 배양에 최종 농도가 20 IU/ml이 되도록 IL-2(CHIRON)을 첨가하였다. 7 및 14 일째, 상기 T 세포를 나아가 자신의 펩티트-부과 DC로 자극하였다. 상기 DC를 상기 기술된 동일한 방법으로 매시간 준비하였다. 21 일째 펩티드 자극 3 번째 라운드(round) 이후 CTL은 펩티드-부가된 T2 세포에 대하여 검사하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 증식 과정
Riddell 등에 의해 기술된 것(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)과 유사한 방법을 사용한 배양으로 CTL을 증식시켰다. 40 ng/ml의 항-CD3 단일 클론 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, 미토마이신 C(mitomycin C)에 의해 불활성화된, 두 종류의 인간 B-림프아형 세포주와 함께 총 5 × 104 CTL 25ml의 AIM-V/5% AS 배지에 부유하였다. 배양을 시작한 뒤 1 일 후, IL-2의 120 IU/ml를 상기 배양에 첨가하였다. 5, 8 및 11 일째에 IL-2의 30 IU/ml를 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지와 함께 상기 배양을 공급하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 수립
96 둥근-밑면 마이크로 타이터 플레이트(round-bottomed micro titer plate; Nalge Nunc International)에 0.3, 1, 및 3 CTLs/웰(well)이 되도록 희석하였다. CTL을 1 × 104 세포/웰의 두 종류의 인간 B 림프아형 세포주, 30 ng/ml의 항-CD3 항체, 및 IL-2 125 U/ml와 함께, 5%의 AS를 포함하는 AIM-V 배지의 총 150 μl/웰에서 배양하였다. 10 일 후 IL-2의 최종농도가 125 U/ml이 되도록 상기 배지에 IL-2의 50 μl/웰을 첨가하였다. 14 일째에 CTL 활성을 시험하였고, 상기에 기술된 것과 동일한 방법을 이용하여 CTL 클론을 증식시켰다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
특이적인 CTL 활성
특이적인 CTL 활성을 조사하기 위하여, 인터페론(interferon; IFN)-감마(gamma) ELISPOT(enzyme-linked immunospot) 검사 및 IFN-감마 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 펩티드-부가 T2(1 × 104/웰)을 자극 세포(stimulator cell)로서 제조하였다. 48 웰 플레이트에 배양된 세포인, CTL 세포주 및 CTL 클론은 반응 세포(responder cell)로서 사용되었다. IFN-감마 ELISPOT 검사 및 IFN-감마 ELISA 검사를 제조사 과정에 따라서 수행하였다.
MPHOSPH1 및 HLA -A*0201을 내인적으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 CTL 능력
CTL 클론을 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201을 내인적으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 이들의 능력에 대하여 조사하였다. 수립된 CTL 클론을 표적 세포주(5 X 104/웰)와 함께 2 일 밤 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액의 IFN-감마를 ELISA로 측정하였다. IFN-감마 ELISA는 제조사의 과정 하에서 수행되었다.
세포 독성 활성
CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201를 내인적으로 발현하는 종양 세포를 죽이기 위한 이들의 능력에 대하여 조사하였다. 표적 세포(종양세포주)는 100 micro-Ci의 Na2 51CrO4 (Perkin Elmer)로 CO2 배양기에서 1 시간 동안 표지하였다. 펩티드-진동된 목적 세포는 세포를 20 ㎍/㎖의 펩티드와 함께 16 시간 동안 배양하여 표지 전에 준비되었다. 51Cr 표지된 목적 세포는 세척하여 최종 부피 200 ㎕로 CTL 클론과 함께 96-웰 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하였다. 상기 플레이트는 세포-간 접촉(cell-to-cell contact)을 증가시키기 위해서 원심분리(800 rpm 에서 4 분)하고 CO2 배양기 내에 두었다. 4 시간 동안 배양한 후, 상층액 50 ㎕는 각 웰로부터 수득되었고 방사능(radioactivity) 감마 계수기(gamma counter)(PerkinElmer)와 함께 측정되었다. 특이적인 세포독성의 백분율은 하기 식에 의해서 특이적인 51Cr-방출의 백분율을 계산하여 특정하였다: [(실험 시료 방출의 cpm-자연방출의 cpm)/(최대 방출의 cpm-자연 방출의 cpm)]×100. 자연 방출은 표적 세포 단독으로, 효과 세포(effector cell)의 부재 하에서 배양하여 측정하였다. 최대 방출은 표적을 1 N HCl과 배양하여 수득되었다. 모든 실험은 두 번 반복수행(duplicate)으로 행하였다.
표적 유전자 및 HLA -A0206 중 어느 하나 또는 모두를 강제로 발현하게 하는 세포의 수립
표적 유전자 또는 HLA-A*0206의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭시켰다. 이 PCR-증폭된 생산물을 발현 벡터(expression vector)로 클로닝하였다. 제조사에서 절차에 따라서 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 사용하여, 상기 플라스미드를 표적 유전자 및 HLA-A*0206-눌(null) 세포주, COS7으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 상기 형질감염된 세포를 versene(Invitrogen)을 사용하여 수거하였고 CTL 활성 검사를 위해 자극세포(5 × 104 세포/웰)로서 사용하였다.
MPHOSPH1 및 HLA -A*0206을 내인적으로 발현하는 표적 세포주를 인식하는 CTL 능력
CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0206를 내인적으로 발현하는 표적 세포주를 인식하는 이들의 능력에 대하여 조사되었다. 수립된 CTL 세포주 및 클론은 표적 세포주((5 X 104/웰)과 함께 2 일 밤 동안 배양되었다. 배양 후, 배양액의 IFN-감마를 ELISA로 측정하였다. IFN-감마 ELISA는 제조사의 과정 하에서 수행되었다.
결과 1
암에서 증가된 MPHOSPH1 발현
cDNA-마이크로어레이(microarray)를 이용하여 다양한 암으로부터 획득된 전체 유전자 발현 프로파일(profile) 데이터는 관련된 정상 조직과 비교하였을 때 암조직에서 MPHOSPH1(유전자 등록번호: NM_016195; 서열번호: 125) 발현이 유효하게 증가하였다. MPHOSPH1 발현은 해당 정상 조직과 비교하여 방광암 31 개 중에서 30 개, 유방암 36 개 중에서 8 개, 자궁경부암 18 개 중에서 18 개, 간내담도암 17 개 중에서 5 개, CML 31 개 중에서 25 개, 직장암 11 개 중에서 6 개, 위암 14 개 중에서 6 개, NSCLC 5 개 중에서 5 개, 림프종 7 개 중에서 7 개, 골육종 10 개 중에서 6 개, 전립선암 22 개 중에서 7 개, 신장암 18 개 중에서 10 개 및 연부 조직 종양 21 개 중에서 15 개 유효하게 증가하였다(표 1).
방광암 31 개 중에서 30 개, 유방암 36 개 중에서 8 개, 자궁경부암 18 개 중에서 18 개, 간내담도암 17 개 중에서 5 개, CML 31 개 중에서 25 개, 직장암 11 개 중에서 6 개, 위암 14 개 중에서 6 개, NSCLC 5 개 중에서 5 개, 림프종 7 개 중에서 7 개, 골육종 10 개 중에서 6 개, 전립선암 22 개 중에서 7 개, 신장암 18 개 중에서 10 개 및 연부 조직 종양 21 개 중에서 15 개 유효하게 증가하였다(표 1).
정상조직에 비하여 암 조직에서 관측된 MPHOSPH1 의 상향조절 예의 비율
암 비율
방광암 30/31
유방암 8/36
자궁경부암 18/18
간내담도암 5/17
CML 25/31
직장암 6/11
위암 6/14
NSCLC 5/5
림프종 7/7
골육종 6/10
전립선암 7/22
신장암 18/10
연부조직종양 21/15
MPHOSPH1 유래 HLA -A02에 결합하는 펩티드의 예측
표 2a 및 2b는 MPHOSPH1의 9머 및 10머 펩티드에 결합하는 HLA-A02를 높은 결합 친화도 순으로 나타낸다. 가능성 있는 HLA-A2 결합 능력을 가지는 전체 47개의 펩티드를 선별하였고 상기 에피토프 펩티드(epitope peptides)를 결정하기 위해 조사하였다.
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Figure pct00004
시작위치는 MPHOSPH1의 N-말단에서부터 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.
결합 점수(binding score)는 “BIMAS”로부터 유래한다.
HLA-A*0201로 제한된 MPHOSPH1 유래 예측된 펩티드로 CTL 유도
MPHOSPH1 유래 이러한 펩티드에 대한 CTL은 “재료 및 방법"에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마(gamma) ELISPOT 분석으로 검출하였다(도 1). MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5)로 자극된 웰번호 #7(a), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14)로 자극된 #5(b), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64)로 자극된 #5(c), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73)로 자극된 #2(d), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77)로 자극된 #1(e), MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79)로 자극된 #1(f), MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97)로 자극된 #4(g), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103)로 자극된 #5(h) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 #8(i)은 대조군 웰과 비교하였을 때 강력한 IFN-감마 생산을 나타낸다. 한편, 펩티드가 HLA-A*0201와 결합 가능한 활성을 지님에도 불구하고, 표 2a 및 b에서 제시한 다른 펩티드로 자극하여 어떠한 특이적인 CTL 활성도 검출되지 않았다. 네거티브(negative) 데이터의 일반적인 경우로서, 특정 IFN-감마 생산물은 MPHOSPH1- A02-9-575(서열번호: 1)(j)로 자극된 CTL로부터 관찰되지 않았다. 이와 함께, 상기 결과들은 MPHOSPH1 유래의 선택된 10 개의 펩티드가 강력한 CTL을 유도할 수 있음을 나타낸다.
MPHOSPH1 유래 펩티드에 대한 CTL 세포주 및 클론의 수립
IFN-감마 ELISPOT 분석에서 펩티드 특이적인 CTL 활성을 나타내는 MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5)로 자극된 웰번호 #7(a), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14)로 자극된 #5(b), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64)로 자극된 #5(c), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73)로 자극된 #2(d), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77)로 자극된 #1(e), MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79)로 자극된 #1(f), MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97)로 자극된 #4(g), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103)로 자극된 #5(h) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 #8(i)은, CTL 세포주로 확대 및 수립되었다(도 2). 이러한 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA를 통해 측정되었다. CTL 세포주는 펩티드 부가되지 않은 T2 세포에 비해 해당 펩티드로 부가된 T2 세포에 대하여 강한 IFN-감마 생산을 보였다. 더욱이, 상기 CTL 클론은 “재료 및 방법"에 기재된 CTL 세포주로부터 제한 희석하여 수립하였고, 관련된 펩티드로 부가된 표적세포에 대하여 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산을 IFN-감마 ELISA 분석으로 결정하였다. 강한 IFN-감마 생산은 MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5)(a), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64)(b), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73)(c), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77)(d) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 CTL 클론으로부터 관찰되었다(도 3).
MPHOSPH1 및 HLA -A* 0201를 발현하는 종양세포에 대한 특이적 CTL 활성
수립된 CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201 분자를 발현하는 표적 세포를 인식하는 능력에 대하여 조사되었다. MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 J82 세포에 대하여 강한 CTL 활성을 나타내었다. 한편, MPHOSPH1을 발현하나 HLA-A*0201를 발현하지 않는 HT1376 세포 및 HLA-A*0201를 발현하나 MPHOSPH1를 발현하지 않는 T2 세포에 대하여 유의적인 특이 CTL 활성이 검출되지 않았다(도 4). 따라서, 상기 결과는 MPHOSPH1-A02-10-282 (서열번호: 120) 펩티드가 내인적으로 가공되어 HLA-A*0201 분자와 함께 목표 세포에서 발현되고 CTL을 인지하는 것을 나타낸다.
MPHOSPH1 및 HLA -A* 0201를 발현하는 종양세포에 대한 특이적 세포 독성 활성
수립된 CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201 분자를 발현하는 표적 세포를 인식하는 능력 및 종양 세포를 죽이는 능력에 대하여 조사되었다. MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA-A*0201 모두를 발현하는 UMUC-3 세포에 대하여 강한 세포 독성 활성을 나타내었다. 한편, MPHOSPH1을 발현하나 HLA-A*0201를 발현하지 않는 MKN45 세포 및 HLA-A*0201를 발현하나 MPHOSPH1를 발현하지 않는 T2 세포에 대하여 유의적인 특이 CTL 활성이 검출되지 않았다(도 5). 상기 결과는 MPHOSPH1-A02-10-282 (서열번호: 120) 펩티드가 MPHOSPH1을 발현하는 종양을 가지는 환자에 대하여 암 백신으로 적용될 수 있음을 나타낸다.
MPHOSPH1 및 HLA -A* 0206를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적인 CTL 활성
MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)에 대하여 생산된 수립 CTL 세포주는 MPHOSPH1 및 HLA-A*0206 분자를 발현하는 표적 세포를 인지하는 능력에 대하여 조사되었다. MPHOSPH1 및 HLA-A*0206 유전자 모두의 전장으로 형질감염된 COS7 세포(MPHOSPH1 및 HLA-A*0206 유전자를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적인 모델)는 자극 세포로서 준비되었고, MPHOSPH1 또는 HLA-A*0206 중 어느 하나의 전체 길이로 형질감염된 COS7 세포는 대조군으로서 사용되었다. 도 6에서, MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 CTL 클론은 MPHOSPH1 및 HLA- A*0206 모두를 발현하는 COS7 세포에 대하여 강력한 CTL 활성을 나타내었다. 한편, 대조군에 대하여는 유의적인 특이 CTL 활성이 검출되지 않았다. 따라서, 상기 결과는 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)가 내인적으로 가공되어 HLA-A*0206 분자와 함께 표적 세포에서 발현되고 CTL로서 인지되는 것을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77), MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79), MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)로 자극된 상기 CTL은 유의적 및 특이적 CTL 활성을 보였다. 이 결과는 MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77), MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79), MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)의 서열이 인간 면역 시스템을 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자 유래 펩티드와 상동성이 있다는 사실 때문일 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석을 유의적인 상동성이 있는 서열을 나타내지 않는 BLAST 알고리즘(algorithm)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) 쿼리(queries)를 이용하여 이 펩티드 서열에 대하여 수행하였다. 상동성 분석의 결과는 MPHOSPH1-A02-9-850(서열번호: 5), MPHOSPH1-A02-9-129(서열번호: 14), MPHOSPH1-A02-9-846(서열번호: 64), MPHOSPH1-A02-10-460(서열번호: 73), MPHOSPH1-A02-10-770(서열번호: 77), MPHOSPH1-A02-10-407(서열번호: 79), MPHOSPH1-A02-10-923(서열번호: 97), MPHOSPH1-A02-10-1484(서열번호: 103) 및 MPHOSPH1-A02-10-282(서열번호: 120)의 서열이 유일한 것임을 나타내고 따라서, 우리가 아는 한, 이 분자가 어떤 관련없는 분자에 대하여 의도하지 않은 면역 반응을 야기할 가능성은 거의 없다.
결론적으로, 여기에서 확인된 MPHOSPH1 유래의 HLA-A*0201 에피토프 펩티드는 암 면역치료의 영역에서 이용용도를 찾을 수 있다.
본 발명은 새로운 TAA, 특히 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있고 따라서 다양한 암 영역에 적용가능성을 가지는 MPHOSPH1으로부터 유래한 것을 제공한다. 이러한 TAA는 MPHOSPH1과 관련된 질병에 대한, 예를 들어, 암, 보다 구체적으로, 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 간내담도암(cholangiocellular carcinoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 림프종(lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 전립선암(prostate cancer), 신장암(renal carcinoma) 및 연부 조직 종양(soft tissue tumor)에 대한 펩티드 백신으로 사용할 수 있다.
본 발명이 여기에서 이의 구체적 실시예와 함께 상세히 기술되는 동안, 앞서 언급한 기술이 사실상 예시적 및 설명적이고 본 발명 및 이의 바람직한 실시예를 설명하기 위해 의도된 것이 이해되어야 한다. 통상적인 실험을 통해, 당업자는 본 발명의 뜻과 범위, 첨부된 청구항에 의해 정의된 경계 및 한계 내에서 다양한 변화 및 변형이 그 안에 존재할 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> MPHOSPH1 PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME <130> ONC-A1108P <150> US 61/522,991 <151> 2011-08-12 <160> 131 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 1 Lys Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 2 Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 3 Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln Asp Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 4 Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys Glu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 5 Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 6 Ala Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 7 Lys Leu Gly Ile Lys His Gln Ser Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 8 Thr Leu Gln Lys Phe Gly Asp Phe Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 9 Lys Leu Thr Asp Ala Lys Lys Gln Ile 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 10 Arg Leu Ala Ile Phe Lys Asp Leu Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 11 Gln Leu Thr Glu Lys Asp Ser Asp Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 12 Asn Leu Gln Asp Met Lys His Leu Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 13 Ser Val Trp Val Ser Phe Phe Glu Ile 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 14 Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln Pro Val 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 15 Val Leu Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 16 Thr Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 17 Ala Ile Trp Glu Glu Cys Lys Glu Ile 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 18 Phe Leu Gln His Ser Pro Ser Ile Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 19 Asp Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu Val 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 20 Ser Leu Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 21 Lys Leu Thr Asn Leu Gln Asp Glu Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 22 Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu Asn Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 23 Ile Leu Pro Arg Thr Leu Asn Val Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 24 Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys Arg Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 25 Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 26 Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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derived from MPHOSPH1 <400> 61 Leu Ile Asn Glu Lys Lys Glu Lys Leu 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 62 Met Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 63 Val Leu Glu Ala Lys Leu Glu Glu Val 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 64 Gly Leu Arg Ala Phe Leu Leu Thr Ile 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 65 Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 66 Val Leu Asp Ser Cys Glu Val Ser Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 67 Tyr Val Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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derived from MPHOSPH1 <400> 81 Gln Val Leu Glu Ala Lys Leu Glu Glu Val 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 82 Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr Leu 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 83 Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Thr Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 84 Ala Ile Trp Glu Glu Cys Lys Glu Ile Val 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 85 Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr Leu 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 86 Val Thr Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 87 Lys Thr Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe Ile 1 5 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peptide derived from MPHOSPH1 <400> 94 Lys Gln Ile Val His Phe Gln Gln Glu Leu 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 95 Gln Gln Tyr Glu Arg Ala Cys Lys Asp Leu 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 96 Met Ile Val Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu 1 5 10 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 97 Lys Leu Ser Asn Glu Ile Glu Thr Ala Thr 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 98 Lys Gln Ile Lys Gln Val Gln Lys Glu Val 1 5 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 99 Asn Leu Pro Asn Thr Gln Leu Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a peptide derived from MPHOSPH1 <400> 100 Gln Leu Asp Leu Leu Gly Asn Asp Tyr 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gaaataaatt tcgatggcat taagcttgat 180 ctgtctcatg aattttcctt agttgctcca aatactgagg caaacagttt cgaatctaaa 240 gattatctcc aggtttgtct tcgaataaga ccatttacac agtcagaaaa agaacttgag 300 tctgagggct gtgtgcatat tctggattca cagactgttg tgctgaaaga gcctcaatgc 360 atccttggtc ggttaagtga aaaaagctca gggcagatgg cacagaaatt cagtttttcc 420 aaggtttttg gcccagcaac tacacagaag gaattctttc agggttgcat tatgcaacca 480 gtaaaagacc tcttgaaagg acagagtcgt ctgattttta cttacgggct aaccaattca 540 ggaaaaacat atacatttca agggacagaa gaaaatattg gcattctgcc tcgaactttg 600 aatgtattat ttgatagtct tcaagaaaga ctgtatacaa agatgaacct taaaccacat 660 agatccagag aatacttaag gttatcatca gaacaagaga aagaagaaat tgctagcaaa 720 agtgcattgc ttcggcaaat taaagaggtt actgtgcata atgatagtga tgatactctt 780 tatggaagtt taactaactc tttgaatatc tcagagtttg aagaatccat aaaagattat 840 gaacaagcca acttgaatat ggctaatagt ataaaatttt ctgtgtgggt ttctttcttt 900 gaaatttaca atgaatatat ttatgactta tttgttcctg tatcatctaa attccaaaag 960 agaaagatgc tgcgcctttc ccaagacgta aagggctatt cttttataaa agatctacaa 1020 tggattcaag tatctgattc caaagaagcc tatagacttt taaaactagg aataaagcac 1080 cagagtgttg ccttcacaaa attgaataat gcttccagta gaagtcacag catattcact 1140 gttaaaatat tacagattga agattctgaa atgtctcgtg taattcgagt cagtgaatta 1200 tctttatgtg atcttgctgg ttcagaacga actatgaaga cacagaatga aggtgaaagg 1260 ttaagagaga ctgggaatat caacacttct ttattgactc tgggaaagtg tattaacgtc 1320 ttgaagaata gtgaaaagtc aaagtttcaa cagcatgtgc ctttccggga aagtaaactg 1380 actcactatt ttcaaagttt ttttaatggt aaagggaaaa tttgtatgat tgtcaatatc 1440 agccaatgtt atttagccta tgatgaaaca ctcaatgtat tgaagttctc cgccattgca 1500 caaaaagttt gtgtcccaga cactttaaat tcctctcaag agaaattatt tggacctgtc 1560 aaatcttctc aagatgtatc actagacagt aattcaaaca gtaaaatatt aaatgtaaaa 1620 agagccacca tttcatggga aaatagtcta gaagatttga tggaagacga ggatttggtt 1680 gaggagctag aaaacgctga agaaactcaa aatgtggaaa ctaaacttct tgatgaagat 1740 ctagataaaa cattagagga aaataaggct ttcattagcc acgaggagaa aagaaaactg 1800 ttggacttaa tagaagactt gaaaaaaaaa ctgataaatg aaaaaaagga aaaattaacc 1860 ttggaattta aaattcgaga agaagttaca caggagttta ctcagtattg ggctcaacgg 1920 gaagctgact ttaaggagac tctgcttcaa gaacgagaga tattagaaga aaatgctgaa 1980 cgtcgtttgg ctatcttcaa ggatttggtt ggtaaatgtg acactcgaga agaagcagcg 2040 aaagacattt gtgccacaaa agttgaaact gaagaagcta ctgcttgttt agaactaaag 2100 tttaatcaaa ttaaagctga attagctaaa accaaaggag aattaatcaa aaccaaagaa 2160 gagttaaaaa agagagaaaa tgaatcagat tcattgattc aagagcttga gacatctaat 2220 aagaaaataa ttacacagaa tcaaagaatt aaagaattga taaatataat tgatcaaaaa 2280 gaagatacta tcaacgaatt tcagaaccta aagtctcata tggaaaacac atttaaatgc 2340 aatgacaagg ctgatacatc ttctttaata ataaacaata aattgatttg taatgaaaca 2400 gttgaagtac ctaaggacag caaatctaaa atctgttcag aaagaaaaag agtaaatgaa 2460 aatgaacttc agcaagatga accaccagca aagaaagggt ctatccatgt tagttcagct 2520 atcactgaag accaaaagaa aagtgaagaa gtgcgaccga acattgcaga aattgaagac 2580 atcagagttt tacaagaaaa taatgaagga ctgagagcat ttttactcac tattgagaat 2640 gaacttaaaa atgaaaagga agaaaaagca gaattaaata aacagattgt tcattttcag 2700 caggaacttt ctctttctga aaaaaagaat ttaactttaa gtaaagaggt ccaacaaatt 2760 cagtcaaatt atgatattgc aattgctgaa ttacatgtgc agaaaagtaa aaatcaagaa 2820 caggaggaaa agatcatgaa attgtcaaat gagatagaaa ctgctacaag aagcattaca 2880 aataatgttt cacaaataaa attaatgcac acgaaaatag acgaactacg tactcttgat 2940 tcagtttctc agatttcaaa catagatttg ctcaatctca gggatctgtc aaatggttct 3000 gaggaggata atttgccaaa tacacagtta gaccttttag gtaatgatta tttggtaagt 3060 aagcaagtta aagaatatcg aattcaagaa cccaataggg aaaattcttt ccactctagt 3120 attgaagcta tttgggaaga atgtaaagag attgtgaagg cctcttccaa aaaaagtcat 3180 cagattgagg aactggaaca acaaattgaa aaattgcagg cagaagtaaa aggctataag 3240 gatgaaaaca atagactaaa ggagaaggag cataaaaacc aagatgacct actaaaagaa 3300 aaagaaactc ttatacagca gctgaaagaa gaattgcaag aaaaaaatgt tactcttgat 3360 gttcaaatac agcatgtagt tgaaggaaag agagcgcttt cagaacttac acaaggtgtt 3420 acttgctata aggcaaaaat aaaggaactt gaaacaattt tagagactca gaaagttgaa 3480 tgtagtcatt cagccaagtt agaacaagac attttggaaa aggaatctat catcttaaag 3540 ctagaaagaa atttgaagga atttcaagaa catcttcagg attctgtcaa aaacaccaaa 3600 gatttaaatg taaaggaact caagctgaaa gaagaaatca cacagttaac aaataatttg 3660 caagatatga aacatttact tcaattaaaa gaagaagaag aagaaaccaa caggcaagaa 3720 acagaaaaat tgaaagagga actctctgca agctctgctc gtacccagaa tctgaaagca 3780 gatcttcaga ggaaggaaga agattatgct gacctgaaag agaaactgac tgatgccaaa 3840 aagcagatta agcaagtaca gaaagaggta tctgtaatgc gtgatgagga taaattactg 3900 aggattaaaa ttaatgaact ggagaaaaag aaaaaccagt gttctcagga attagatatg 3960 aaacagcgaa ccattcagca actcaaggag cagttaaata atcagaaagt ggaagaagct 4020 atacaacagt atgagagagc atgcaaagat ctaaatgtta aagagaaaat aattgaagac 4080 atgcgaatga cactagaaga acaggaacaa actcaggtag aacaggatca agtgcttgag 4140 gctaaattag aggaagttga aaggctggcc acagaattgg aaaaatggaa ggaaaaatgc 4200 aatgatttgg aaaccaaaaa caatcaaagg tcaaataaag aacatgagaa caacacagat 4260 gtgcttggaa agctcactaa tcttcaagat gagttacagg agtctgaaca gaaatataat 4320 gctgatagaa agaaatggtt agaagaaaaa atgatgctta tcactcaagc gaaagaagca 4380 gagaatatac gaaataaaga gatgaaaaaa tatgctgagg acagggagcg tttttttaag 4440 caacagaatg aaatggaaat actgacagcc cagctgacag agaaagatag tgaccttcaa 4500 aagtggcgag aagaacgaga tcaactggtt gcagctttag aaatacagct aaaagcactg 4560 atatccagta atgtacagaa agataatgaa attgaacaac taaaaaggat catatcagag 4620 acttctaaaa tagaaacaca aatcatggat atcaagccca aacgtattag ttcagcagat 4680 cctgacaaac ttcaaactga acctctatcg acaagttttg aaatttccag aaataaaata 4740 gaggatggat ctgtagtcct tgactcttgt gaagtgtcaa cagaaaatga tcaaagcact 4800 cgatttccaa aacctgagtt agagattcaa tttacacctt tacagccaaa caaaatggca 4860 gtgaaacacc ctggttgtac cacaccagtg acagttaaga ttcccaaggc tcggaagagg 4920 aagagtaatg aaatggagga ggacttggtg aaatgtgaaa ataagaagaa tgctacaccc 4980 agaactaatt tgaaatttcc tatttcagat gatagaaatt cttctgtcaa aaaggaacaa 5040 aaggttgcca tacgtccatc atctaagaaa acatattctt tacggagtca ggcatccata 5100 attggtgtaa acctggccac taagaaaaaa gaaggaacac tacagaaatt tggagacttc 5160 ttacaacatt ctccctcaat tcttcaatca aaagcaaaga agataattga aacaatgagc 5220 tcttcaaagc tctcaaatgt agaagcaagt aaagaaaatg tgtctcaacc aaaacgagcc 5280 aaacggaaat tatacacaag tgaaatttca tctcctattg atatatcagg ccaagtgatt 5340 ttaatggacc agaaaatgaa ggagagtgat caccagatta tcaaacgacg acttcgaaca 5400 aaaacagcca aataaatcac ttatggaaat gtttaatata aattttatag tcatagtcat 5460 tggaacttgc atcctgtatt gtaaatataa atgtatatat tatgcattaa atcactctgc 5520 atatagattg ctgttttata catagtataa ttttaattca ataaatgagt caaaatttgt 5580 atatttttat aaggcttttt tataatagct tctttcaaac tgtatttccc tattatctca 5640 gacattggat cagtgaagat cctaggaaag aggctgttat tctcatttat tttgctatac 5700 aggatgtaat aggtcaggta tttggtttac ttatatttaa caatgtctta tgaatttttt 5760 ttactttatc tgttatacaa ctgattttac atatctgttt ggattatagc taggatttgg 5820 agaataagtg tgtacagatc acaaaacatg tatatacatt atttagaaaa gatctcaagt 5880 ctttaattag aatgtctcac ttattttgta aacattttgt gggtacatag tacatgtata 5940 tatttacggg gtatgtgaga tgttttgaca caggcatgca atgtgaaata cgtgtatcat 6000 ggagaatgag gtatccatcc cctcaagcat ttttcctttg aattacagat aatccaatta 6060 cattctttag atcatttaaa aatatacaag taagttatta ttgattatag tcactctatt 6120 gtgctatcag atagtagatc attcttttta tcttatttgt ttttgtaccc attaaccatc 6180 cccacctccc cctgcaaccg tcagtaccct taccagccac tggtaaccat tcttctactc 6240 tgtatgccca tgaggtcaat tgattttatt tttagatccc ataaataaat gagaacatgc 6300 agtctttgtc aaaaaaaaa 6319 <210> 126 <211> 1780 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg Pro Ser Tyr Val 1 5 10 15 Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg Pro Ser Glu Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Ile Lys Leu Asp Leu Ser His Glu Phe Ser Leu Val Ala Pro Asn Thr 35 40 45 Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg 50 55 60 Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser Glu Lys Glu Leu Glu Ser Glu Gly Cys 65 70 75 80 Val His Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys 85 90 95 Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys 100 105 110 Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe 115 120 125 Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys Gly Gln 130 135 140 Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys Thr Tyr 145 150 155 160 Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu Asn Ile Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu 165 170 175 Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Asn 180 185 190 Leu Lys Pro His Arg Ser Arg Glu Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Glu Gln 195 200 205 Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys 210 215 220 Glu Val Thr Val His Asn Asp Ser Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Leu 225 230 235 240 Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys Asp Tyr 245 250 255 Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val Trp 260 265 270 Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val 275 280 285 Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys Arg Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln 290 295 300 Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe Ile Lys Asp Leu Gln Trp Ile Gln Val 305 310 315 320 Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Gly Ile Lys His 325 330 335 Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg Ser His 340 345 350 Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile Leu Gln Ile Glu Asp Ser Glu Met Ser 355 360 365 Arg Val Ile Arg Val Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser 370 375 380 Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln Asn Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Thr 385 390 395 400 Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val 405 410 415 Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg 420 425 430 Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly 435 440 445 Lys Ile Cys Met Ile Val Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Ala Tyr Asp 450 455 460 Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys Val Cys 465 470 475 480 Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser Ser Gln Glu Lys Leu Phe Gly Pro Val 485 490 495 Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys Ile 500 505 510 Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr Ile Ser Trp Glu Asn Ser Leu Glu Asp 515 520 525 Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu Val Glu Glu Leu Glu Asn Ala Glu Glu 530 535 540 Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr 545 550 555 560 Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg Lys Leu 565 570 575 Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys 580 585 590 Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe Lys Ile Arg Glu Glu Val Thr Gln Glu 595 600 605 Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg Glu Ala Asp Phe Lys Glu Thr Leu 610 615 620 Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg Leu Ala 625 630 635 640 Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly Lys Cys Asp Thr Arg Glu Glu Ala Ala 645 650 655 Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys Val Glu Thr Glu Glu Ala Thr Ala Cys 660 665 670 Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln Ile Lys Ala Glu Leu Ala Lys Thr Lys 675 680 685 Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys Glu Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asn Glu 690 695 700 Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu Leu Glu Thr Ser Asn Lys Lys Ile Ile 705 710 715 720 Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys Glu Leu Ile Asn Ile Ile Asp Gln Lys 725 730 735 Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys Ser His Met Glu Asn 740 745 750 Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys Ala Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile Asn 755 760 765 Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu Thr Val Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys 770 775 780 Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys Arg Val Asn Glu Asn Glu Leu Gln 785 790 795 800 Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys Lys Gly Ser Ile His Val Ser Ser Ala 805 810 815 Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys Ser Glu Glu Val Arg Pro Asn Ile Ala 820 825 830 Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val Leu Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu Arg 835 840 845 Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu Lys Asn Glu Lys Glu Glu 850 855 860 Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln Ile Val His Phe Gln Gln Glu Leu Ser 865 870 875 880 Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile 885 890 895 Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala Ile Ala Glu Leu His Val Gln Lys Ser 900 905 910 Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu Lys Ile Met Lys Leu Ser Asn Glu Ile 915 920 925 Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile Thr Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys Leu 930 935 940 Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu Arg Thr Leu Asp Ser Val Ser Gln 945 950 955 960 Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ser 965 970 975 Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn Thr Gln Leu Asp Leu Leu Gly Asn Asp 980 985 990 Tyr Leu Val Ser Lys Gln Val Lys Glu Tyr Arg Ile Gln Glu Pro Asn 995 1000 1005 Arg Glu Asn Ser Phe His Ser Ser Ile Glu Ala Ile Trp Glu Glu Cys 1010 1015 1020 Lys Glu Ile Val Lys Ala Ser Ser Lys Lys Ser His Gln Ile Glu Glu 1025 1030 1035 1040 Leu Glu Gln Gln Ile Glu Lys Leu Gln Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys 1045 1050 1055 Asp Glu Asn Asn Arg Leu Lys Glu Lys Glu His Lys Asn Gln Asp Asp 1060 1065 1070 Leu Leu Lys Glu Lys Glu Thr Leu Ile Gln Gln Leu Lys Glu Glu Leu 1075 1080 1085 Gln Glu Lys Asn Val Thr Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val Val Glu 1090 1095 1100 Gly Lys Arg Ala Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys Tyr Lys 1105 1110 1115 1120 Ala Lys Ile Lys Glu Leu Glu Thr Ile Leu Glu Thr Gln Lys Val Glu 1125 1130 1135 Cys Ser His Ser Ala Lys Leu Glu Gln Asp Ile Leu Glu Lys Glu Ser 1140 1145 1150 Ile Ile Leu Lys Leu Glu Arg Asn Leu Lys Glu Phe Gln Glu His Leu 1155 1160 1165 Gln Asp Ser Val Lys Asn Thr Lys Asp Leu Asn Val Lys Glu Leu Lys 1170 1175 1180 Leu Lys Glu Glu Ile Thr Gln Leu Thr Asn Asn Leu Gln Asp Met Lys 1185 1190 1195 1200 His Leu Leu Gln Leu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Thr Asn Arg Gln Glu 1205 1210 1215 Thr Glu Lys Leu Lys Glu Glu Leu Ser Ala Ser Ser Ala Arg Thr Gln 1220 1225 1230 Asn Leu Lys Ala Asp Leu Gln Arg Lys Glu Glu Asp Tyr Ala Asp Leu 1235 1240 1245 Lys Glu Lys Leu Thr Asp Ala Lys Lys Gln Ile Lys Gln Val Gln Lys 1250 1255 1260 Glu Val Ser Val Met Arg Asp Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Lys Ile 1265 1270 1275 1280 Asn Glu Leu Glu Lys Lys Lys Asn Gln Cys Ser Gln Glu Leu Asp Met 1285 1290 1295 Lys Gln Arg Thr Ile Gln Gln Leu Lys Glu Gln Leu Asn Asn Gln Lys 1300 1305 1310 Val Glu Glu Ala Ile Gln Gln Tyr Glu Arg Ala Cys Lys Asp Leu Asn 1315 1320 1325 Val Lys Glu Lys Ile Ile Glu Asp Met Arg Met Thr Leu Glu Glu Gln 1330 1335 1340 Glu Gln Thr Gln Val Glu Gln Asp Gln Val Leu Glu Ala Lys Leu Glu 1345 1350 1355 1360 Glu Val Glu Arg Leu Ala Thr Glu Leu Glu Lys Trp Lys Glu Lys Cys 1365 1370 1375 Asn Asp Leu Glu Thr Lys Asn Asn Gln Arg Ser Asn Lys Glu His Glu 1380 1385 1390 Asn Asn Thr Asp Val Leu Gly Lys Leu Thr Asn Leu Gln Asp Glu Leu 1395 1400 1405 Gln Glu Ser Glu Gln Lys Tyr Asn Ala Asp Arg Lys Lys Trp Leu Glu 1410 1415 1420 Glu Lys Met Met Leu Ile Thr Gln Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Arg 1425 1430 1435 1440 Asn Lys Glu Met Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Arg Glu Arg Phe Phe Lys 1445 1450 1455 Gln Gln Asn Glu Met Glu Ile Leu Thr Ala Gln Leu Thr Glu Lys Asp 1460 1465 1470 Ser Asp Leu Gln Lys Trp Arg Glu Glu Arg Asp Gln Leu Val Ala Ala 1475 1480 1485 Leu Glu Ile Gln Leu Lys Ala Leu Ile Ser Ser Asn Val Gln Lys Asp 1490 1495 1500 Asn Glu Ile Glu Gln Leu Lys Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ser Lys Ile 1505 1510 1515 1520 Glu Thr Gln Ile Met Asp Ile Lys Pro Lys Arg Ile Ser Ser Ala Asp 1525 1530 1535 Pro Asp Lys Leu Gln Thr Glu Pro Leu Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser 1540 1545 1550 Arg Asn Lys Ile Glu Asp Gly Ser Val Val Leu Asp Ser Cys Glu Val 1555 1560 1565 Ser Thr Glu Asn Asp Gln Ser Thr Arg Phe Pro Lys Pro Glu Leu Glu 1570 1575 1580 Ile Gln Phe Thr Pro Leu Gln Pro Asn Lys Met Ala Val Lys His Pro 1585 1590 1595 1600 Gly Cys Thr Thr Pro Val Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg Lys Arg 1605 1610 1615 Lys Ser Asn Glu Met Glu Glu Asp Leu Val Lys Cys Glu Asn Lys Lys 1620 1625 1630 Asn Ala Thr Pro Arg Thr Asn Leu Lys Phe Pro Ile Ser Asp Asp Arg 1635 1640 1645 Asn Ser Ser Val Lys Lys Glu Gln Lys Val Ala Ile Arg Pro Ser Ser 1650 1655 1660 Lys Lys Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Gln Ala Ser Ile Ile Gly Val Asn 1665 1670 1675 1680 Leu Ala Thr Lys Lys Lys Glu Gly Thr Leu Gln Lys Phe Gly Asp Phe 1685 1690 1695 Leu Gln His Ser Pro Ser Ile Leu Gln Ser Lys Ala Lys Lys Ile Ile 1700 1705 1710 Glu Thr Met Ser Ser Ser Lys Leu Ser Asn Val Glu Ala Ser Lys Glu 1715 1720 1725 Asn Val Ser Gln Pro Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Thr Ser Glu 1730 1735 1740 Ile Ser Ser Pro Ile Asp Ile Ser Gly Gln Val Ile Leu Met Asp Gln 1745 1750 1755 1760 Lys Met Lys Glu Ser Asp His Gln Ile Ile Lys Arg Arg Leu Arg Thr 1765 1770 1775 Lys Thr Ala Lys 1780 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer sequence <400> 127 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer sequence <400> 128 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer sequence <400> 129 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer sequence <400> 130 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims (21)

  1. 하기 (a) 또는 (b)에 따른 분리된 펩티드:
    (a) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드.
    (b) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에서 1, 2 또는 여러 개의 아미노산(들)이 치환, 결실, 도입 및/또는 첨가된 펩티드로서, 상기 펩티드는 세포독성 T 림파구(Cytotoxic T lymphocytes, CTLs) 유도능을 가지는 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 특징을 하나 또는 둘 다를 가지는 분리된 펩티드:
    (a) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택됨; 및
    (b) 서열번호: 5, 14, 64, 73, 77, 79, 97, 103 및 120로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택됨.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 펩티드는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 분리된 펩티드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화(encoding)하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide).
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 제 4항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CTL 유도용 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 제 4항의 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CTL 유도능을 가지는 APC 유도용 조성물.
  7. 하기의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물:
    (a) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드;
    (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면(surface)에 제시하는 하나 또는 그 이상의 APCs 또는 엑소솜(exosomes); 및
    (d) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인지하는 하나 또는 그 이상의 CTL.
  8. 제 7항에 있어서, 암의 치료 및 재발 중 어느 하나 또는 둘 다에 사용하기 위해, 또는 개체 내에 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 약학적 조성물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 투여하기 위하여 제형화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법이고, CTL 유도성을 가지는 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법:
    (a) 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 APC에 접촉시키는 단계, 및
    (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC에 도입시키는 단계.
  11. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 방법인, CTL을 유도하는 방법:
    (a) HLA 항원 및 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APCs와 CD8-양성 T 세포를 공-배양(co-culture)하는 단계;
    (b) HLA 항원 및 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜(exosome)과 CD8-양성 T 세포를 공-배양하는 단계; 및
    (c) TCR은 세표 표면에 표시되는 HLA 항원 및 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 펩티드의 복합체와 결합할 수 있고, 상기 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 아단위(subunit) 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 TCR 아단위 각각을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포 내로 도입하는 단계.
  12. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이의 표면에 제시하는 분리된 APC.
  13. 제 12항에 있어서, 제 10항의 방법에 의해 유도되는 APC.
  14. HLA 항원 및 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 이의 표면에 제시하는 세포를 인식하는 분리된 CTL.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 CTL은 제 11항에 의해 유도되는 CTL.
  16. 대상에 약학적으로 유효한 양의:
    (a) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 펩티드;
    (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 하나 또는 그 이상의 APC 또는 엑소솜; 또는
    (d) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그 표면에 제시하는 세포를 인식하는 하나 또는 그 이상의 CTL를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법인, 개체에서 감의 치료 또는 예방 중 어느 하나 또는 둘 다의 방법.
  17. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법인, 이들을 필요로 하는 개체에 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드에 대한 항체 또는 이들의 면역학적인 활성 단편.
  19. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  20. 제 19항의 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 숙주세포(host cell).
  21. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 펩티드, 제 4항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 18항의 항체를 포함하는 진단 키트(diagnostic kit).
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