JP2014510513A - Mphosph1ペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年8月12日に出願された米国仮特許出願第61/522,991号の恩典を主張し、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
(i)SEQ ID NO:5、14および64からなる群より選択されるアミノ酸配列において1個、2個、または数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列、ならびに
(ii)以下の特徴の一方または両方を有する、(i)のアミノ酸配列:
(a)前記SEQ ID NOのN末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される;ならびに
(b)前記SEQ ID NOのC末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
(i')SEQ ID NO:73,77,79,97,103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列において1個、2個、または数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列、ならびに
(ii')以下の特徴の一方または両方を有する、(i')のアミノ酸配列:
(a)前記SEQ ID NOのN末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される;ならびに
(b)前記SEQ ID NOのC末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
本発明はさらに、本発明のペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、CTL誘導能を有するAPCを誘導または調製するために使用することができる。上記の本発明のペプチドと同様に、そのようなAPCは、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与してよい。
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導するための方法であって、本発明のペプチド、そのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなペプチドを提示するエキソソームまたはAPCおよびそのようなペプチドを自身の表面上に提示する細胞を認識するCTLの中より選択される少なくとも1つの成分を含む剤または組成物を投与する段階を含むそのような方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。
[1]以下の(a)または(b)の単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO:5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(b)SEQ ID NO:5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列において1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、かつ、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する、ペプチド、
[2]以下の特徴の一方または両方を有する、[1]に記載の単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される;ならびに
(b)SEQ ID NO5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列のC末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される、
[3]ノナペプチドまたはデカペプチドである、[1]または[2]に記載の単離されたペプチド、
[4][1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、
[5]CTLを誘導するための組成物であって、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の1種もしくは複数種のペプチド、または[4]に記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物、
[6]CTL誘導能を有するAPCを誘導するための組成物であって、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の1種もしくは複数種のペプチド、または[4]に記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物、
[7](a)[1]〜[3]のいずれか1つに記載の1種または複数種のペプチド;
(b)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドをコードする1種または複数種のポリヌクレオチド;
(c)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する1種もしくは複数種のAPCまたはエキソソーム;および
(d)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する1種もしくは複数種のCTL
からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む薬学的組成物、
[8]がんの治療および予防のいずれかもしくは両方において、または対象におけるがんに対する免疫応答の誘導において使用するための、[7]に記載の薬学的組成物、
[9]HLA抗原がHLA−A2である対象への投与のために製剤化される、[7]または[8]に記載の薬学的組成物、
[10]CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法:
(a)APCを[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階、および
(b)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階、
[11]CTLを誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法:
(a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階;
(b)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階;および
(c)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、CD8陽性T細胞に導入する段階であって、該TCRが、細胞表面上に提示された、HLA抗原と[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとの複合体に結合し得る、段階、
[12]HLA抗原と[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたAPC、
[13][10]に記載の方法によって誘導される、[12]に記載のAPC、
[14]HLA抗原と[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する、単離されたCTL、
[15][11]に記載の方法によって誘導される、[14]に記載のCTL、
[16]対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法であって、対象に薬学的有効量の
(a)[1]〜[3]のいずれか1つに記載の1種もしくは複数種のペプチド;
(b)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドをコードする1種もしくは複数種のポリヌクレオチド;
(c)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する1種もしくは複数種のAPCもしくはエキソソーム;または
(d)[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する1種もしくは複数種のCTL
を投与する段階を含む方法、
[17]がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、[1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法、
[18][1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片、
[19][1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、
[20][19]に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞、ならびに
[21][1]〜[3]のいずれか1つに記載のペプチド、[4]に記載のポリヌクレオチドまたは[18]に記載の抗体を含む診断キット。
特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解される。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になる。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになる。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例示するためのものであり、限定することは意図しない。
本明細書で使用する「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも1つ」を意味する。
物質(例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製されたペプチドは、細胞材料、例えば炭水化物、脂質、またはペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの他の汚染タンパク質を実質的に含まないかまたは化学合成される場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ペプチドが、それが単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から分離されている、ペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まないペプチドには、約30%、20%、10%、または5%未満(乾燥重量ベースで)の異種タンパク質(本明細書において「混入タンパク質」とも称する)を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ペプチドを組換え産生する場合、ペプチドは、好ましくは、培養培地も実質的に含まず、培養培地をペプチド調製物の容量の約20%、10%、または5%未満で有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを化学合成によって生成する場合、ペプチドは、好ましくは、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、ペプチドの合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容量の約30%、20%、10%、5%未満(乾燥重量ベース)で有するペプチドの調製物を含む。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動よびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様において、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離または精製される。
本明細書で時として使用する「オリゴペプチド」という用語は、長さが20残基またはそれ未満、典型的には15残基またはそれ未満の本発明のペプチド、および典型的には約8〜約11残基、しばしば約9または10残基から構成される本発明のペプチドを指すのに使用される。後者はそれぞれ、本明細書において「ノナペプチド」および「デカペプチド」と称される。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、特に別段の指定のない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている1文字コードで記載される。
本発明の薬学的な剤または組成物は、特にワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」(「免疫原性組成物」とも称される)という語句は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する剤または組成物を指す。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Tリンパ球」、「細胞傷害性T細胞」および「CTL」という用語は本明細書において互換的に使用され、特に別段の指定のない限り、非自己細胞(例えば、腫瘍/がん細胞、ウイルス感染細胞)を認識し、そのような細胞の死滅を誘導し得るTリンパ球のサブグループを指す。
対象または患者との関連において、本明細書で使用される「対象の(または患者の)HLA抗原はHLA−A2である」という語句は、対象または患者がMHC(主要組織適合複合体)クラスI分子としてのHLA−A2抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、かつHLA−A2抗原が対象または患者の細胞においてHLA抗原として発現されることを指す。
以下に詳述する本発明のペプチドは、「MPHOSPH1ペプチド」または「MPHOSPH1ポリペプチド」と称することができる。
MPHOSPH1由来のペプチドがCTLによって認識される抗原として機能することを実証するために、MPHOSPH1(SEQ ID NO:126)由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるHLAアリルであるHLA−A2によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155:4307-12,1995;Kubo RT et al., J Immunol 152:3913-24, 1994)。
MPHOSPH1由来のHLA−A2結合ペプチドの候補を、HLA−A2に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。
MPHOSPH1−A2−9−850(SEQ ID NO:5)、
MPHOSPH1−A2−9−129(SEQ ID NO:14)、
MPHOSPH1−A2−9−846(SEQ ID NO:64)、
MPHOSPH1−A2−10−460(SEQ ID NO:73)、
MPHOSPH1−A2−10−770(SEQ ID NO:77)、
MPHOSPH1−A2−10−407(SEQ ID NO:79)、
MPHOSPH1−A2−10−923(SEQ ID NO:97)、
MPHOSPH1−A2−10−1484(SEQ ID NO:103)および
MPHOSPH1−A2−10−282(SEQ ID NO:120)。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
このような保存的改変ペプチドも、本発明のペプチドとみなされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元の未改変ペプチドのCTL誘導能を保持する限り、非保存的改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、MPHOSPH1の多型変異体、種間相同体、またはアリル由来のCTL誘導可能なペプチドを排除すべきでない。
(1)MPHOSPH1−A2−9−850(SEQ ID NO:5)に対応
F [X1] L T I E N E [X2]、
(2)MPHOSPH1−A2−9−129(SEQ ID NO:14)に対応
F [X1] G C I M Q P [X2]、
(3)MPHOSPH1−A2−9−846(SEQ ID NO:64)に対応
G [X1] R A F L L T [X2]、
(4)MPHOSPH1− A2−10−460(SEQ ID NO:73)に対応
Y [X1] A Y D E T L N [X2]、
(5)MPHOSPH1−A2−10−770(SEQ ID NO:77)に対応
K [X1] I C N E T V E [X2]
(6)MPHOSPH1−A2−10−407(SEQ ID NO:79)に対応
L [X1] T L G K C I N [X2]
(7)MPHOSPH1−A2−10−923(SEQ ID NO:97)に対応
K [X1] S N E I E T A [X2]
(8)MPHOSPH1−A2−10−1484(SEQ ID NO:103)に対応
Q [X1] V A A L E I Q [X2]、および
(9)MPHOSPH1−A2−10−282(SEQ ID NO:120)に対応
Y [X1] Y D L F V P V [X2]。
本発明はまた、本発明のペプチドのN末端およびC末端のいずれかまたは両方に対する1個、2個、または数個のアミノ酸の付加を企図し、これらを付加することもできる。CTL誘導能を保持するそのような改変ペプチドも、本発明に含まれる。
本発明のペプチドがシステイン残基を含む場合、それらのペプチドはシステイン残基のSH基間のジスルフィド結合を介して二量体を形成する傾向がある。したがって、本発明のペプチドの二量体も、本発明のペプチドに含まれる。
a:本発明のペプチドの少なくとも1個のアミノ酸残基を改変(すなわち、置換、欠失、挿入または付加)する段階、
b:段階(a)において改変されたペプチドの活性を測定する段階、および
c:元のペプチドと比較して同一かまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、活性には、MHC結合活性およびAPCまたはCTL誘導能が含まれ得る。好ましくは、ペプチドの活性はCTL誘導能である。
周知の技法を使用して、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えDNA技術または化学合成によって、本発明のペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966;
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press, New York, 1976;
(iii)「ペプチド合成」(日本語),丸善,1975;
(iv)「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語)丸善,1985;
(v)医薬品の開発(第2版)(日本語),続第14巻(ペプチド合成),広川書店,1991;
(vi)WO99/67288;および
(vii)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol.2,"Solid Phase Peptide Synthesis",Academic Press,New York,1980,100-118.
本発明は、上述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドには、天然MPHOSPH1遺伝子(例えば、GenBankアクセッション番号NM_001031702(SEQ ID NO:125))由来のポリヌクレオチドまたはその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれ得る。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は当技術分野において「サイレント変異」と称され、保存的に改変された変異体の1種を表す。ペプチドをコードする本明細書に記載するあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は容易に認識する。したがって、開示したペプチドをコードする各核酸配列は、それに関連するサイレント変異の非明示的な開示を表す。
本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平11−510507号およびWO99/03499に詳述されている方法を使用することによって調製することができ、治療および/または予防の対象となる患者から得られたAPCを使用して調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
本発明はまた、HLA抗原および本発明のペプチドによって形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたAPCを提供する。APCは、治療および/または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはCTLを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
a:第1の対象からAPCを回収する段階、
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階、および
c:段階bのAPCを第2の対象に投与する段階。
本発明はまた、APCを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明のAPCは、HLA−A2抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCである。そのような複合体中に含まれるHLA−A2抗原の典型例には、HLA−A*0201およびHLA−A*0206が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたCTLは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチドと同様にワクチンとして使用することができる。したがって本発明は、本発明の本ペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたCTLを提供する。
本発明はまた、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを含み、該TCRが、細胞表面上の、HLA−A2抗原と本発明のペプチドとの複合体に結合し得る、組成物、およびそれを使用する方法を提供する。そのようなTCRサブユニットは、MPHOSPH1を発現する腫瘍細胞に対する特異性をT細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を使用することによって、本発明のペプチドで誘導されたCTLのTCRのα鎖およびβ鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを同定することができる(WO2007/032255、およびMorgan et al., J Immunol.171.3288(2003))。例えば、PCR法を好ましく使用することができる。解析のためのPCRプライマーは、例えば、5'側プライマーとしての5'−Rプライマー(5'−gtctaccaggcattcgcttcat−3')(SEQ ID NO:127)、および3'側プライマーとしての、TCRα鎖C領域に特異的な3−TRa−Cプライマー(5'−tcagctggaccacagccgcagcgt−3')(SEQ ID NO:128)、TCRβ鎖C1領域に特異的な3−TRb−C1プライマー(5'−tcagaaatcctttctcttgac−3')(SEQ ID NO:129)、またはTCRβ鎖C2領域に特異的な3−TRβ−C2プライマー(5'−ctagcctctggaatcctttctctt−3')(SEQ ID NO:130)であってよいが、これらに限定されない。TCR誘導体は、本発明のペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、本発明のペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
MPHOSPH1の発現は、正常組織と比較して、その例に膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるが必ずしもこれらに限定されないがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを、がんの治療および予防のいずれかまたは両方に使用することができる。したがって、本発明は、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のために製剤化される薬学的な剤または組成物であって、本発明の1種もしくは複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分として含むそのような剤または組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を提示する前述のエキソソームまたはAPCのいずれかを、薬学的な剤または組成物のための有効成分として使用することができる。さらに、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を提示する細胞を認識し得る前述のCTLを、本発明の薬学的な剤または組成物のための有効成分として使用することもできる。
(a)本発明の1種または複数種のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする1種または複数種のポリヌクレオチド;
(c)本発明の1種または複数種のAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の1種または複数種のCTL。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド;
(c)本発明のAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド;
(c)本発明のAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド;
(c)本発明のAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
当業者は、特に本明細書に言及された成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物がさらに当該製剤化の型を考慮して当技術分野における従来の他の物質(例えば、増量剤、結合剤、希釈剤、添加剤等)を含み得ることを容易に認識する。
必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、本発明の薬学的な剤または組成物を包装することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
本発明のペプチドは、薬学的な剤または組成物として直接投与してよく、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してよい。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常使用される担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、薬学的な物質、剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に使用することができる。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に使用してもよい。
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。具体的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するように備えることができる(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12を参照されたい。例えば、Wolff et al., Science 1990,247:1465-8;米国特許第5,580,859号;第5,589,466号;第5,804,566号;第5,739,118号;第5,736,524号;第5,679,647号;およびWO98/04720)も参照されたい。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が含まれる(例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して、APCおよびCTLを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびAPCを使用して、CTLを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソームおよびAPCは、CTL誘導能を任意の他の化合物が阻害しない限り、この追加の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかを使用してCTLを誘導することができる。それに加えて、該ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを使用して、以下に説明するように、APCを誘導することもできる。
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む。例えば、APCを本発明のペプチドとエクスビボで接触させる段階を含む方法は、以下の段階を含み得る:
a:対象からAPCを回収する段階;および
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階。
a:対象からAPCを回収する段階;および
b:本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
段階bは、「VI.抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
(a)APCを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
あるいは、本発明は、CTL誘導能を有するAPCを誘導するための方法であって、以下の中より選択される段階を含む方法を提供する:
(a)APCを本発明のペプチドと接触させる段階;
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
別の態様において、本発明は、CTL誘導能を有するAPCの誘導に使用される剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の1種または複数種のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
あるいは本発明は、CTL誘導能を有するAPCの誘導に使用される本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリペプチドをさらに提供する。
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソームまたはAPCを使用してCTLを誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを使用してCTLを誘導するための方法であって、該TCRが、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識(と結合)し得る、方法、を提供する。好ましくは、CTLを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも1つの段階を含み得る:
a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および/またはエキソソームと接触させる段階;ならびに
b)TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、CD8陽性T細胞に導入する段階であって、該TCRが、細胞表面上に提示された、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識(と結合)し得る、段階。
a:対象からAPCを回収する段階;
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階、および
c:段階bのAPCをCD8陽性T細胞と共培養する段階。
CTLの誘導に使用されるAPCまたはエキソソームは、好ましくは、本発明のペプチドとHLA−A2抗原との複合体を自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソームであり得る。
別の態様において、本発明は、CTLを誘導するための剤または組成物であって、本発明の1種もしくは複数種のペプチド、1種もしくは複数種のポリヌクレオチド、または1種もしくは複数種のAPCもしくはエキソソームを含む剤または組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、CTLの誘導のために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはAPCもしくはエキソソームの使用を提供する。
あるいは本発明は、CTLの誘導に使用される本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはAPCもしくはエキソソームをさらに提供する。
さらに本発明は、MPHOSPH1に関連する疾患に対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。企図される疾患にはがんが含まれ、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
好ましい形態において、本発明の方法によって治療される対象は、HLA抗原がHLA−A2である対象であり得る。
あるいは、本発明の方法は、以下を含む本発明のワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含み得る:
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸(ポリヌクレオチド);
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCもしくはエキソソーム;または
(d)本発明のCTL。
i)治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞または組織中のMPHOSPH1の発現レベルを決定する段階;
ii)MPHOSPH1の発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記の段階(a)〜(d)の中より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してMPHOSPH1を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。具体的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
具体的には、本発明の方法に使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、MPHOSPH1のmRNAとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択する。Tmとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの50%が標的配列とハイブリダイズする(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは、平衡状態でプローブの50%が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン(または他の塩)約0.01〜1.0Mであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)に関しては少なくとも約30℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化物質、例えばホルムアミドの添加によって達成してよい。
標的遺伝子、例えばMPHOSPH1遺伝子のがん細胞における発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞中のレベル)から例えば10%、25%、もしくは50%増加するか;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで増加する場合に、増加していると判定され得る。
MPHOSPH1遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している/同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のMPHOSPH1の発現レベルを決定する段階;
b)MPHOSPH1の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)MPHOSPH1の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のMPHOSPH1の発現レベルを決定する段階;
b)MPHOSPH1の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)MPHOSPH1の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
(a)MPHOSPH1遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)MPHOSPH1タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬;および
(c)MPHOSPH1タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
(a)免疫原を、該免疫原に対して特異的なCTLの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)で誘導されたCTLの誘導レベルを検出または決定する段階;および
(c)対象の免疫学的応答をCTL誘導レベルと相関させる段階。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合し得る。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、MPHOSPH1ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および/または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体(例えば、一本鎖抗体)は、MPHOSPH1の発現が関与するがんの治療において治療的に使用され得、このがんの例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、腎癌および軟組織腫瘍が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書では、抗体を、MPHOSPH1ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO:5、14、64、73、77、79、97、103および120の中より選択されるアミノ酸配列を有するMPHOSPH1の断片ペプチドを認識する。オリゴペプチドを合成する方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製してもよい。本発明において、免疫原性を増強するために、オリゴペプチド(例えば、9merまたは10mer)を担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)が周知である。KLHとペプチドを結合する方法も、当技術分野において周知である。
公知の方法、例えば、Milstein et al.(Galfre and Milstein, MethodsEnzymol 73:3-46(1981))の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を使用して組換えによって調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTD(1990)によって英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい)。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
本発明のペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするベクターおよび本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中における本発明のポリヌクレオチド担体、特にDNAとして、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子療法用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
細胞株
T2、HLA−A*0201陽性Bリンパ芽球様細胞株、HLA−A*0206陽性Bリンパ芽球様細胞株、HT1376、J82、COS7およびUM−UC3は、ATCCから購入した。MKN−45はJCRBから購入した。
HLA−A*0201分子に結合するMPHOSPH1由来の9merおよび10merペプチドを、結合予測ソフトウェア「BIMAS」(http://www−bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker et al., J Immunol 1994, 152(1):163-75、Kuzushima et al., Blood 2001, 98(6):1872-81)を使用して予測した。これらのペプチドは、Biosynthesis(Lewisville,Texas)によって、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。該ペプチドの純度(>90%)および同一性を、それぞれ分析用HPLCおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに20mg/mlで溶解し、−80℃で保存した。
単球由来の樹状細胞(DC)を抗原提示細胞として使用して、ヒト白血球抗原(HLA)上に提示されたペプチドに対して応答する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導した。他所に記載されているように、DCをインビトロで作製した(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15,63(14):4112-8)。具体的には、Ficoll−Plaque plus(Pharmacia)溶液によって健常なボランティア(HLA−A*0201陽性)から単離した末梢血単核細胞を、プラスチック製の組織培養ディッシュ(Becton Dickinson)へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。2%の加熱非働化した自己血清(AS)を含むAIM−V培地(Invitrogen)中、1000U/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(R&D System)および1000U/mlのインターロイキン(IL)−4(R&D System)の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。7日間の培養後、サイトカインで誘導したDCに、AIM−V培地中で37℃で3時間、3μg/mlのβ2−ミクログロブリンの存在下で20μg/mlの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、DC関連分子、例えばCD80、CD83、CD86およびHLAクラスIIを発現しているようであった(データは示さず)。次いで、ペプチドパルスしたこれらのDCをX線照射(20Gy)によって不活化し、CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)を用いた陽性選択によって得られた自己CD8+T細胞と1:20の比率で混合した。これらの培養物を48ウェルプレート(Corning)中に準備し、各ウェルは、0.5mlのAIM−V/2%AS培地中に、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+T細胞および10ng/mlのIL−7(R&D System)を含んだ。3日後、これらの培養物に、IL−2(CHIRON)を最終濃度20IU/mlまで添加した。7日目および14日目に、ペプチドパルスした自己DCでT細胞をさらに刺激した。DCは上記と同じ方法によって毎回調製した。21日目に、3回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたT2細胞に対してCTLを試験した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8):1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16):1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2):216-23)によって記載されている方法と類似の方法を使用して、CTLを培養下で増殖させた。40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体(Pharmingen)の存在下で、マイトマイシンCによって不活化した2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株とともに、合計5×104個のCTLを25mlのAIM−V/5%AS培地中に懸濁した。培養開始1日後に、120IU/mlのIL−2を該培養物に添加した。5、8、および11日目に、30IU/mlのIL−2を含む新たなAIM−V/5%AS培地を、該培養物に供給した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1):94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8):1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。
96丸底マイクロタイタープレート(Nalge Nunc International)においてCTL0.3個、1個、および3個/ウェルとなるように、希釈を行った。CTLを、1×104個細胞/ウェルの2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL−2とともに、合計150μl/ウェルの5%AS含有AIM−V培地中で培養した。10日後、50μl/ウェルのIL−2を、IL−2の最終濃度が125U/mlに到達するように該培地に添加した。14日目にCTL活性を試験し、上記と同じ方法を使用してCTLクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。
特異的CTL活性を調べるために、インターフェロン(IFN)−γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイおよびIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。ペプチドパルスしたT2(1×104個/ウェル)を刺激細胞として調製した。48ウェルプレート中の培養細胞、CTL株およびCTLクローンを応答細胞として使用した。IFN−γELISPOTアッセイおよびIFN−γELISAアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
CTLクローンを、MPHOSPH1およびHLA−A*0201を内因的に発現する標的細胞を認識するその能力について調べた。樹立したCTLクローンを、標的細胞株(5×104個/ウェル)とともに二晩培養した。インキュベート後、培養培地中のIFN−γをELISAによって測定した。IFN−γELISAは、製造業者の手順のもと行った。
CTLクローンを、MPHOSPH1およびHLA−A*0201を内因的に発現する腫瘍細胞を殺傷するその能力について調べた。標的細胞(腫瘍細胞株)を100μ−CiのNa2 51CrO4(Perkin Elmer)でCO2インキュベーター内で1時間標識した。ペプチドパルスした標的細胞は、細胞を20μg/mlのペプチドとともに標識前に16時間インキュベートすることによって調製した。51Crで標識した標的細胞をリンスし、96ウェル丸底マイクロタイタープレート中で200μlの最終容量でCTLクローンと混合した。プレートを遠心分離(800rpmで4分)して細胞間接触を増加させ、CO2インキュベーター内に配置した。4時間のインキュベート後、50μlの上清を各ウェルから回収し、放射能をガンマカウンター(PerkinElmer)で測定した。特異的細胞傷害性の割合は、以下の式によって特異的51Cr放出の割合を算出することによって決定した:{(試験試料放出のcpm−自然放出のcpm)/(最大放出のcpm−自然放出のcpm)}×100。自然放出は、標的細胞を単独で、エフェクター細胞の非存在下でインキュベートすることによって決定した。最大放出は、標的を1N HClとインキュベートすることによって得た。すべての測定は二重で行った。
標的遺伝子またはHLA−A*0206のオープンリーディングフレームをコードするcDNAをPCRによって増幅した。PCR増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の手順に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用して、標的遺伝子およびHLA−A*0206ヌル細胞株であるCOS7に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、トランスフェクトした細胞をベルセン(Invitrogen)を用いて回収し、CTL活性アッセイのための刺激細胞(5×104個細胞/ウェル)として使用した。
CTLクローンを、MPHOSPH1およびHLA−A*0206を内因的に発現する標的細胞を認識するその能力について調べた。樹立したCTL株およびクローンを、標的細胞株(5×104個/ウェル)とともに二晩培養した。インキュベート後、培養培地中のIFN−γをELISAによって測定した。IFN−γELISAは、製造業者の手順のもと行った。
がんにおけるMPHOSPH1発現の増強
cDNAマイクロアレイを使用して様々ながんから得られた包括的な遺伝子発現プロファイルデータによって、MPHOSPH1(GenBankアクセッション番号NM_016195;SEQ ID No:125)発現が、対応する正常組織と比較してがん組織内で特異的に上昇していることが明らかになった。MPHOSPH1発現は、31例の膀胱癌のうち30例、36例の乳癌のうち8例、18例の子宮頸癌のうち18例、17例の胆管細胞癌のうち5例、31例のCMLのうち25例、11例の結腸直腸癌のうち6例、14例の胃癌のうち6例、5例のNSCLCのうち5例、7例のリンパ腫のうち7例、10例の骨肉腫のうち6例、22例の前立腺癌のうち7例、18例の腎癌のうち10例、および21例の軟組織腫瘍のうち15例において、確かに上昇していた(表1)。
表2aおよび2bは、HLA−A02に結合するMPHOSPH1の9merおよび10merペプチドを、結合親和性の高い順に示す。エピトープペプチドを決定するために、HLA−A02結合能を有する可能性がある合計47種のペプチドを選択して調べた。
MPHOSPH1由来のペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN−γELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を検出した(図1)。MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)で刺激したウェル番号#7(a)、MPHOSPH1−A02−9−129(SEQ ID NO:14)で刺激した#5(b)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)で刺激した#5(c)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)で刺激した#2(d)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)で刺激した#1(e)、MPHOSPH1−A02−10−407(SEQ ID NO:79)で刺激した#1(f)、MPHOSPH1−A02−10−923(SEQ ID NO:97)で刺激した#4(g)、MPHOSPH1−A02−10−1484(SEQ ID NO:103)で刺激した#5(h)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)で刺激した#8(i)が、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を実証した。一方、表2aおよびbに示される他のペプチドは、HLA−A*0201との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激では、特異的なCTL活性は検出されなかった。典型的な陰性データの例として、MPHOSPH1−A02−9−575(SEQ ID NO:1)で刺激したCTL(j)からは特異的IFN−γ産生は観察されなかった。以上を総合すると、これらの結果は、MPHOSPH1由来の10種の選択ペプチドが強力なCTLを誘導し得ることを示唆している。
IFN−γELISPOTアッセイにおいてペプチド特異的なCTL活性を示した、MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)で刺激したウェル番号#7(a)、MPHOSPH1−A02−9−129(SEQ ID NO:14)で刺激した#5(b)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)で刺激した#5(c)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)で刺激した#2(d)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)で刺激した#1(e)、MPHOSPH1−A02−10−407(SEQ ID NO:79)で刺激した#1(f)、MPHOSPH1−A02−10−923(SEQ ID NO:97)で刺激した#4(g)、MPHOSPH1−A02−10−1484(SEQ ID NO:103)で刺激した#5(h)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)で刺激した#8(i)における細胞を増殖させ、CTL株を樹立した(図2)。これらのCTL株のCTL活性をIFN−γELISAによって測定した。CTL株は、ペプチドをパルスしなかったT2細胞と比較して、対応するペプチドをパルスしたT2細胞に対して強力なIFN−γ産生を実証した。さらに、「材料および方法」に記載したとおりに、CTL株から限界希釈によってCTLクローンを樹立し、対応するペプチドをパルスしたT2細胞に対するCTLクローンからのIFN−γ産生をIFN−γELISAによって測定した。MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)(a)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)(b)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)(c)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)(d)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)(e)で刺激したCTLクローンから強力なIFN−γ産生が観察された(図3)。
樹立したCTLクローンを、MPHOSPH1およびHLA−A*0201分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)を用いて刺激したCTLクローンは、MPHOSPH1およびHLA−A*0201の両方を発現するJ82細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、MPHOSPH1を発現するがHLA−A*0201を発現しないHT1376細胞およびHLA−A*0201を発現するがMPHOSPH1を発現しないT2細胞に対して有意な特異的CTL活性は検出されなかった(図4)。したがって、このデータによって、MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)ペプチドが内因的にプロセシングされ、HLA−A*0201分子とともに標的細胞上に発現され、CTLによって認識されることが明確に実証された。
樹立したCTLクローンを、MPHOSPH1およびHLA−A*0201を発現する腫瘍細胞株を認識し、殺傷するその能力について調べた。MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)を用いて刺激したCTLクローンは、MPHOSPH1およびHLA−A*0201の両方を発現するUMUC−3細胞に対して強力な細胞傷害活性を示した。一方、MPHOSPH1を発現するがHLA−A*0201を発現しないMKN45細胞およびHLA−A*0201を発現するがMPHOSPH1を発現しないT2細胞に対して、両方のCTLクローンについて有意な細胞傷害活性は検出されなかった(図5)。これらの結果は、MPHOSPH1由来のMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)ペプチドがMPHOSPH1発現腫瘍を有する患者のためのがんワクチンに適用可能であり得ることを示している。
MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)ペプチドに対して産生された樹立CTL株を、MPHOSPH1およびHLA−A*0206分子を発現する標的細胞を認識する能力について調べた。全長MPHOSPH1およびHLA−A*0206遺伝子の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞(MPHOSPH1およびHLA−A*0206遺伝子を発現する標的細胞についての特異的モデル)を刺激細胞として調製し、全長MPHOSPH1またはHLA−A*0206のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として使用した。図6において、MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)を用いて刺激したCTLクローンは、MPHOSPH1およびHLA−A*0206の両方を発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的CTL活性は検出されなかった。したがって、このデータによって、MPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)ペプチドが内因的にプロセシングされ、HLA−A*0206分子とともに標的細胞上に発現され、CTLによって認識されることが明確に実証された。
MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1−A02−9−129(SEQ ID NO:14)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)、MPHOSPH1−A02−10−407(SEQ ID NO:79)、MPHOSPH1−A02−10−923(SEQ ID NO:97)、MPHOSPH1−A02−10−1484(SEQ ID NO:103)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)を用いて刺激したCTLは、有意かつ特異的なCTL活性を示した。この結果は、MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1−A02−9−129(SEQ ID NO:14)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)、MPHOSPH1−A02−10−407(SEQ ID NO:79)、MPHOSPH1−A02−10−923(SEQ ID NO:97)、MPHOSPH1−A02−10−1484(SEQ ID NO:103)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するために、BLASTアルゴリズム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果は、MPHOSPH1−A02−9−850(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1−A02−9−129(SEQ ID NO:14)、MPHOSPH1−A02−9−846(SEQ ID NO:64)、MPHOSPH1−A02−10−460(SEQ ID NO:73)、MPHOSPH1−A02−10−770(SEQ ID NO:77)、MPHOSPH1−A02−10−407(SEQ ID NO:79)、MPHOSPH1−A02−10−923(SEQ ID NO:97)、MPHOSPH1−A02−10−1484(SEQ ID NO:103)およびMPHOSPH1−A02−10−282(SEQ ID NO:120)の配列が固有のものであること、したがって本発明者らの知る限りでは、この分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
Claims (21)
- 以下の(a)または(b)の単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO:5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド;
(b)SEQ ID NO:5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列において1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されているアミノ酸配列を含むペプチドであって、かつ、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する、ペプチド。 - 以下の特徴の一方または両方を有する、請求項1記載の単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される;ならびに
(b)SEQ ID NO5、14、64、73、77、79、97、103および120からなる群より選択されるアミノ酸配列のC末端アミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。 - ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項1または2記載の単離されたペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- CTLを誘導するための組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド、または請求項4記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- CTL誘導能を有するAPCを誘導するための組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド、または請求項4記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- 以下からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む、薬学的組成物:
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド;
(b)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする1種もしくは複数種のポリヌクレオチド;
(c)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する1種もしくは複数種のAPCまたはエキソソーム;および
(d)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する1種もしくは複数種のCTL。 - がんの治療および予防のいずれかもしくは両方において、または対象におけるがんに対する免疫応答の誘導において使用するための、請求項7記載の薬学的組成物。
- HLA抗原がHLA−A2である対象への投与のために製剤化される、請求項7または8記載の薬学的組成物。
- CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法:
(a)APCを請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階、および
(b)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。 - CTLを誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法:
(a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階;
(b)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階;および
(c)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを、CD8陽性T細胞に導入する段階であって、該TCRが、細胞表面上に提示された、HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体に結合し得る、段階。 - HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する、単離されたAPC。
- 請求項10記載の方法によって誘導される、請求項12記載のAPC。
- HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する、単離されたCTL。
- 請求項11記載の方法によって誘導される、請求項14記載のCTL。
- 対象におけるがんの治療および予防のいずれかまたは両方の方法であって、対象に薬学的有効量の
(a)請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド;
(b)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする1種もしくは複数種のポリヌクレオチド;
(c)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する1種もしくは複数種のAPCまたはエキソソーム;または
(d)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の表面上に提示する細胞を認識する1種もしくは複数種のCTL
を投与する段階を含む方法。 - がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
- 請求項19記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド、請求項4記載のポリヌクレオチドまたは請求項18記載の抗体を含む診断キット。
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