CN101711280A - Tem8肽和包含tem8肽的疫苗 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，包含SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63或68的氨基酸序列的肽被证明具有细胞毒T淋巴细胞(CTL)诱导能力。因此，本发明提供了具有选自下组的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68。该肽可以包含一个、两个或数个氨基酸替换或添加，只要其保持CTL诱导能力即可。而且，本发明提供了用于治疗和/或预防肿瘤和/或防止其手术后复发的药物制剂，该制剂包括这些肽中的任一种。本发明的药物制剂包括疫苗。
Description
对相关申请的对照援引
本专利申请主张2007年4月11日递交的美国临时专利申请No.60/911,194的权益，本申请通过援引并入其全部内容用于所有目的。
发明领域
本发明涉及生物科学领域，更具体地说是癌症治疗领域。特别地，本发明涉及用作癌症疫苗非常有效的TEM8肽和用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术
人们已经证明CD8阳性细胞毒T淋巴细胞(CTL)可识别主要组织相容性复合体(MHC)I类分子上肿瘤相关抗原(TAA)来源的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。自从黑素瘤抗原(MAGE)家族作为第一例TAA被发现以来，人们已经通过免疫学方法发现了许多其它的TAA(Boon T，Int J Cancer 1993 May8，54(2)：177-80；Boon T&van der Bruggen P，J Exp Med 1996Mar 1，183(3)：725-9)，而且当前一些TAA正处于作为免疫治疗靶点的临床开发过程中。
可诱导强烈并且特异的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定，为进一步开发肽疫苗接种策略在各种类型癌症中的临床应用提供了保证(Harris CC，JNatl Cancer Inst 1996，88：1442-5；Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999，59：3134-42；Vissers JLM et al.，Cancer Res 1999，59：5554-9；Van der Burg SH etal.，J Immunol 1996，156：3308-14；Tanaka F et al.，Cancer Res 1997，57：4465-8；Fujie T et al.，Int J Cancer 1999，80：169-72；Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999，81：459-66；Oiso M et al.，Int J Cancer 1999，81：387-94)。迄今为止，已经报道了数种使用这些肿瘤相关抗原衍生肽的临床测定法。不幸的是，目前在这些癌症疫苗试验中仅观察到较低的客观应答率(Belli F et al.，J Clin Oncol2002Oct 15，20(20)：4169-80；Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002Oct，188：33-42；Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep，10(9)：909-15)。
造成这种效力相对较低的一个可能的原因是肿瘤细胞上的人类白细胞抗原(HLA)I类分子的表达缺失或下调。这种缺失或下调在实体肿瘤中经常出现，并且严重阻碍T细胞介导的抗肿瘤应答(Cormier JN et al.，Int J Cancer1998 Feb 9，75(4)：517-24；Hicklin DJ et al.，Mol Med Today 1999Apr，5(4)：178-86；Paschen A et al.，Int J Cancer 2003 Mar 1，103(6)：759-67)。即使靶定肿瘤相关抗原的癌症疫苗诱导出强力的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，当这些CTL不表达足够量的HLA I类分子时，它们也不能识别靶细胞。
肿瘤血管发生是肿瘤进程中涉及的关键因素。已经证明，由于内皮细胞上的I类HLA分子不被下调，根据基于内皮细胞的方法，靶定血管内皮生长因子受体(VEGFR)1和2，可以开发出针对肿瘤血管发生的有效疫苗(Wada S et al.，Cancer Res 2005 Jun 1，65(11)：4939-46；Ishizaki H et al.，ClinCancer Res 2006 Oct 1，12(19)：5841-9)。而且，由于这些治疗靶点是不依赖肿瘤的，所以耗竭肿瘤微环境中的血管内皮细胞对各种恶性疾病可能有效果。进一步，血流中的淋巴细胞容易接触到肿瘤内皮细胞，并且CTL无需渗透任何其他组织类型即能够直接杀伤内皮细胞。此外，甚至肿瘤血管网络内少量内皮细胞的减退也可以导致脉管完整性的破坏，从而导致大量肿瘤细胞被抑制(Folkman J，Nat Med 1995 Jan，1(1)：27-31)。因此，肿瘤内皮细胞是癌症免疫治疗的良好靶点。为了以特异而有效的CTL应答抑制肿瘤血管发生，需要在与血管发生相关的分子中选择合适的靶点。
人们已发现肿瘤内皮标记(TEM)，包括TEM8，在肿瘤相关内皮中相比在正常组织中被特异提高(St Croix B et al.，Science 2000 Aug 18，289(5482)：1197-202)。TEM8转录本在肺和脑肿瘤和肝转移中表达。靶定TEM8的疗法在很多类型的肿瘤类型中可以应用。例如，WO 2005/048943提出了包含编码TEM8胞外域的载体的疫苗和编码肿瘤相关抗原的疫苗的共同使用。然而，该文献没有提供任何证据可以证明TEM8表达载体的引入导致了针对肿瘤相关内皮的CTL的诱导，也没有提供任何有关TEM8蛋白内表位的位置的信息。
发明的公开
发明内容
靶定肿瘤微环境的癌症治疗，特别是那些靶向于肿瘤血管发生的癌症治疗而言，提高临床效力具有重要的意义。本发明聚焦于将肿瘤血管作为抗肿瘤免疫治疗的靶标。特别地，本发明靶定肿瘤内皮标志8(TEM8)(GenBank登录号为NP_115584(SEQ ID NO：76)，由GenBank登录号为NM_032208(SEQ ID NO：75)的基因编码)，因为TEM8被认为在多种肿瘤类型的血管内表达。本发明提供包含表位肽的TEM8基因产物，所述表位肽引发特异针对应答分子的CTL。用来源于TEM8的能结合HLA-A*2402或HLA-A*0201的候选肽刺激获自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。本发明进一步提供了已经建立的CTL，它们特异识别用相应候选肽冲击(pulse)过的HLA-A24或HLA-A02阳性靶细胞；还提供了HLA-A24或HLA-A02限制性表位肽，这些表位肽能够诱发针对在肿瘤血管上表达的TEM8的强力和特异的免疫应答。这些结果证明，TEM8具有强烈的免疫原性，并且其表位是用于肿瘤免疫治疗的有效的靶标。
因此，本发明提供了一种分离的具有细胞毒T细胞诱导能力的九肽或十肽，其中所述九肽或十肽包括选自SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的氨基酸序列。具体地，本发明提供了包含选自SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68的氨基酸序列，并且具有CTL诱导能力的肽。本发明的肽涵盖有一个、两个或多个氨基酸被替换或添加的肽，只要经过修饰的肽依然保持原始的CTL诱导能力即可。
当施加给受试者时，本发明的肽被呈递在抗原呈递细胞的表面上，然后诱导靶向于各个肽的CTL。因此，根据本发明的一个方面，还提供了可呈递任何本发明肽的抗原呈递细胞和外来体，以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。
通过施用本发明的TEM8多肽或编码这些多肽的多核苷酸、以及呈递TEM8多肽的外来体和抗原呈递细胞，可诱发抗肿瘤免疫应答。因此，本发明提供包含所述多肽或编码它们的多核苷酸以及外来体和抗原呈递细胞作为有效成分的药物制剂。本发明的药物制剂可用作疫苗。
而且，本发明提供了用于治疗和/或预防(例如阻止)癌症(肿瘤)，和/或预防其手术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法，用于诱导针对肿瘤相关内皮的免疫应答和抗肿瘤免疫的方法，该方法包括施用TEM8多肽、编码TEM8多肽的多核苷酸、呈递TEM8多肽的外来体或抗原呈递细胞、或本发明的药物制剂的步骤。
此外，靶向本发明TEM多肽的CTL可强化靶定肿瘤相关内皮的免疫应答。因此，本发明提供了靶定本发明TEM多肽的CTL。本发明的CTL还可用作针对癌症的疫苗。
应当理解，前面的发明内容和后面的详细说明都是例示性实施方案，对本发明或者本发明的其他可供选择的实施方案不构成限制。
附图简述
图1的照片显示了对用来源于TEM8的肽诱导的CTL进行的IFN-γELISPOT测定的结果。如下编号的孔中的CTL与对照相比显示出强烈的IFN-γ产生：用TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)刺激的#5和#6(a)，用TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)刺激的#6(b)，用TEM8-A24-10-277(SEQ IDNO：9)刺激的#3(c)，用TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)刺激的#3(d)，用TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)刺激的#6(e)，用TEM8-A02-9-278(SEQID NO：30)刺激的#3(f)，用TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)刺激的#2(g)，用TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)刺激的#5(h)，和用TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)刺激的#4(i)。对比地，作为一个典型的阴性数据(无CTL诱导)的例子，用TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO：46)刺激的CTL针对经过肽冲击的靶细胞没有显示出特异的IFN-γ产生(j)。大多数预测肽没有显示CTL诱导，因此在本发明中集中关注阳性数据(CTL诱导)。图片中孔上的方框表明，来源于相应孔的细胞被扩增建立了CTL系。在附图中，″+″表示针对用合适肽冲击过的靶细胞的IFN-γ产生，而″-″表示针对没有用任何肽冲击的靶细胞的IFN-γ的产生。
图2的折线图显示了在IFN-γELISA测定中用如下肽刺激的CTL系的建立：TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)(a)，TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)(b)，TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)(c)，TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)(d)，TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)(e)，TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)(f)，TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)(g)，TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)(h)和TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)(i)。证明与对照相比，通过用每种肽进行刺激而建立的CTL系均显示了强烈的IFN-γ产生。对比地，作为典型的阴性数据(无CTL诱导)的例子，用TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO：46)建立的CTL针对经肽冲击的靶细胞没有显示特异的IFN-γ产生(j)。在附图中，″+″表示针对用合适的肽冲击过的靶细胞的IFN-γ产生，而″-″表示针对没有用任何肽冲击过的靶细胞的IFN-γ的产生。
图3的折线图显示了用如下肽刺激的CTL克隆的建立：TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)(a)TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)(b)，TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)(c)，TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)(d)和TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)(e)。通过用每种肽刺激建立的CTL克隆针对用相应肽冲击的靶细胞均显示了强烈的的IFN-γ产生。另一方面，针对没有经任何肽冲击的靶细胞则没有显示出IFN-γ产生。在附图中，″+″表示针对用合适的肽冲击过的靶细胞的IFN-γ产生，而″-″表示针对没有用任何肽冲击过的靶细胞的IFN-γ的产生。
图4的折线图显示了针对内源表达TEM8和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶细胞的特异CTL活性。制备用全长TEM8基因转染、或用相应HLA基因转染并用来源于TEM8的非合适肽冲击的COS7细胞作为对照。(a)用TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)建立的CTL克隆针对同时用TEM8和HLA-A24转染的COS7细胞(黑色菱形)显示出高度的特异性CTL活性。另一方面，针对表达HLA-A*2402(空心三角形)或TEM8(空心圆形)的靶细胞，没有检测出显著的特异性CTL活性。(b)用TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)建立的CTL克隆针对同时用TEM8和HLA-A02转染的COS7细胞(黑色菱形)显示出高度的特异性CTL活性。另一方面，针对表达HLA-A*0201(空心三角形)或TEM8(空心圆形)的靶细胞，没有检测出显著的特异性CTL活性。
图5描述了使用TEM8-A24-9-277肽的疫苗接种的体内免疫原性和抗肿瘤效果。(a)根据“材料和方法”中介绍的规程对TEM8表位肽的体内免疫原性进行检验。BALB/c小鼠用不完全弗氏佐剂(IFA)偶联的TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)注射(M1-M5)，或者仅注射IFA(N1和N2)。在附图中，″+″表示针对用肽冲击过的靶细胞(黑柱)的IFN-γ产生，而″-″表示针对没有用任何肽冲击过的靶细胞(白柱)的IFN-γ的产生。来源于经过疫苗接种的小鼠的脾细胞针对用TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)冲击过的RLmale1细胞产生了IFN-γ，而针对未用任何肽冲击过的靶细胞则没有产生IFN-γ。SFC表示斑点形成细胞(spot forming cells)。(b)对作为预防性设定(preventive setting)的TEM8表位肽疫苗接种的抗肿瘤效果进行了检测。在第-7和0天，向BALB/c小鼠注射与TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)偶联(黑色三角形)的IFA或没有与肽偶联(空心菱形)的IFA。在第0天向经免疫的小鼠皮下注射5×104个CT26小鼠结直肠癌细胞系。肿瘤尺寸以5只小鼠的平均值表示。通过表位肽疫苗接种观察到了肿瘤生长抑制的显著性差异(*；P＜0.05)。
发明详细说明
I.定义
本文中使用的词语“一种(个)”和“该”是指“至少一种(个)”，除非特别地另有说明。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中有一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或者非天然存在的残基，例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物；这些术语也适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文使用的术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有类似于天然存在氨基酸的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及翻译后在细胞内被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。语句“氨基酸类似物”是指如下的化合物，其具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(α碳与一个氢原子、一个羧基、一个氨基和一个R基键合)，但具有经过修饰的R基或者经过修饰的骨架(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”是指具有与一般氨基酸不同的结构但相似的功能的化合物。
在本文中，氨基酸可以用其众所周知的三字母符号或者IUPAC-IUB生物化学命名法委员会推荐的单字母符号来指称。
在本文中，除非特别地另有说明，术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且与氨基酸类似，可以用它们公认的单字母编码来指称。
除非另外定义，本文使用的全部技术和科学术语的意思与本发明所属领域的普通技术人员所通常知晓的意思相同。
II.肽
为了证明来源于TEM8的肽可以发挥被细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别的抗原的功能，在本发明中，对来源于TEM8(GenBank登录号NP_115584(SEQ ID NO：76))的肽进行分析，以确定它们是否为被常见的HLA等位基因HLA-A24或HLA-A02限制的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47：93-101，1996；Kondo A et al.，J Immunol 155：4307-12，1995；Kubo RT et al.，JImmunol 152：3913-24，1994)。来源于TEM8的HLA-A24和HLA-A02结合肽候选物，是利用它们对HLA-A24和HLA-A02的结合亲和性的信息来鉴定的。在用载有这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞之后，用如下的每一种肽成功地建立了CTL：
TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)，
TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)，
TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)，
TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)，
TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)，
TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)，
TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)，
TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和
TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)。
这些建立的CTL针对用各自的肽冲击的靶细胞显示出强烈而特异的CTL活性。这些结果证明，TEM8是被CTL识别的抗原，并且如下的肽是被HLA-A24或HLA-A02限制的TEM8的表位肽：
TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)，
TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)，
TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)，
TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)，
TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)，
TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)，
TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)，
TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和
TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)。
由于TEM8基因在大多数癌症患者中过表达，所以它是用于具有更高临床效力的免疫治疗的良好靶标。因此，本发明提供了来自TEM8的CTL识别表位(CTL-recognized epitopes)的九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)。在本发明中，九肽或十肽的氨基酸序列可以从SEQ ID NO：76选择。因此，本发明提供了一种分离的具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含9个或10个连续的氨基酸序列，所述序列选自氨基酸序列SEQ ID NO：76。更具体地，在一些实施方案中，本发明提供了由选自下组的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68。
一般地，目前互联网上可用的软件程序，例如Parker KC.et al，J Immunol.1994Jan 1；152(1)：163-75中介绍的程序，可以用来通过计算机计算各种肽与HLA抗原之间的结合亲和性。与HLA抗原的结合亲和性可以按照例如在下列文献中介绍的方法进行测量：Parker KC.et al，J Immunol.1994Jan1；152(1)：163-75.；和Kuzushima K，et al.((2001)Blood.；98(6)：1872-81。结合亲和性的测定方法在例如Journal of Immunological Methods，1995，185：181-190；Protein Science，2000，9：1838-1846。因此，本发明包括TEM8的肽，所述肽通过此类已知的程序被确定为可以结合HLA抗原。
而且，本发明的这些肽的两侧可以具有额外的氨基酸残基，只要该肽留CTL诱导能力即可。这些具有CTL诱导能力的肽可以例如少于大约40个氨基酸，经常地少于大约20个氨基酸，通常少于大约15个氨基酸。肽两侧的氨基酸序列包括选自下组的氨基酸序列：位于由SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68组成的肽之两侧的氨基酸不受限制，可以由任何类型的氨基酸构成，只要不阻碍肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明还提供了具有CTL诱导能力的肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：3、4、9、23、25、30、60、63和68。
一般地，已知对蛋白质中的一个或多个氨基酸进行修饰不会影响蛋白质的功能，或者在某些情况下，甚至会提高原蛋白质的期望功能。实际上，经过修饰的肽(即，包含通过向原参考序列替换或添加1个、2个或多个氨基酸残基进行修饰而成的氨基酸序列的肽)已知可以保持原来的肽的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1982，79：6409-13)。因此，根据本发明的一个实施方案，本发明具有CTL诱导能力的肽可以由如下所述的氨基酸构成：所述氨基酸包含SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63或68氨基酸序列，其中添加和/或替换了一个、两个或者甚至更多的氨基酸。
本领域的技术人员会认识到，向一个氨基酸序列进行个别的添加或替换从而改变单个氨基酸或一小部分氨基酸，结果会保留原氨基酸侧链的性质；因此这被称作“保守替换”或“保守修饰”，其中某种蛋白质的改变导致产生具有相似功能的蛋白质。可提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域众所周知的。氨基酸侧链性质的实例是疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下的共同功能基团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基的侧链(S、T、Y)；含硫原子的侧链(C、M)；含羧酸和酰胺的侧链(D、N、E、Q)；含碱的侧链(R、K、H)；和含芳香基的侧链(H、F、Y、W)。此外，如下8组中，每组包含的氨基酸彼此构成保守替换：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见例如Creighton，Proteins(1984)).
这些经过保守修饰的肽也被看作是本发明的肽。然而，本发明的肽不仅限于此，可以包括非保守修饰，只要肽保留CTL诱导能力即可。而且，经过修饰的肽不排除能够诱导CTL的肽的多态性变异体、种间同源体和TEM8的等位片段。
为了保持必要的CTL诱导能力，可以修饰(添加或替换)少量(例如1个，2个或数个)或少部分的氨基酸残基。这里，术语“数个”是指5个或者更少的氨基酸，例如3个或者更少的氨基酸。要修饰的氨基酸残基的百分比可以是20％或者更少，例如15％或者更少，例如10％或者更少，例如1-5％。
对本发明肽：TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)、TEM8-A24-9-277(SEQID NO：4)、TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)、TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)、TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)、TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)、TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)、TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)的同源性分析显示，它们与来源于任何其他已知的人基因产物的肽不具有显著的同源性。这降低了在用于免疫治疗时发生未知或不良免疫应答的可能性。因此，同样在此方面中，这些肽可用于在肿瘤患者中引发针对肿瘤相关内皮上的TEM8的免疫。
当用于免疫治疗时，本发明的肽作为与HLA抗原所成的复合体被呈递在细胞或外来体的表面。因此，可以选择除了CTL诱导能力之外，还具有高HLA结合亲和性的肽。而且，可以通过替换、添加氨基酸残基等方式对所述肽进行修饰，以实现更高的结合亲和性。除了天然被展示的肽之外，由于通过与HLA抗原结合而被展示的肽序列的规则性(也就是，一致性)是已知的(J Immunol 1994，152：3913；Immunogenetics 1995，41：178；J Immunol1994，155：4307)，所以可以根据这种规则性对本发明的免疫原性肽进行修饰。例如，显示高HLA-A24结合亲和性的肽自N端起的第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸替换，C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替换的肽也可以优选地加以使用。因此，具有SEQ ID NO：3，4或9的氨基酸序列且其中自N端起的第二个氨基酸被替换为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的肽，和/或具有上述氨基酸序列并且其中C端被替换为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽，都包含在本发明之内。
另一方面，自N端起的第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸、且C端氨基酸被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽，可以用作具有高HLA-02结合亲和性的肽。因此，具有SEQ ID NO：23、25、30、60、63和68中任一氨基酸序列并且其中自N端起的第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸或色氨酸、和/或其中C端被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽，包含在本发明之内。替换不仅可以在末端氨基酸处引入，还可以在肽的潜在TCR识别位置上引入。数项研究已证明，肽内的氨基酸替换可以等同于或者优于原来的肽，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.CancerRes.1997、57、4570-4577、T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.、S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206以及S.O.Dionne et al.Cancer Immunology、Immunotherapy(2004)53、307-314)。
而且，可以在本发明肽的N和/或C端添加1-2个氨基酸。这些具有HLA抗原结合亲和性并保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之中。
然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能会诱发副作用，例如自身免疫紊乱或针对特定物质的过敏症状。因此，可以利用可用的数据库进行同源性检索，以避免遇到肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当同源性检索表明不存在与目标肽仅有1个或2个氨基酸差异的其他肽时，即可对目标肽进行修饰，以增加其与HLA抗原的结合亲和性，和/或增加其CTL诱导能力，而没有发生此类副作用的危险。
尽管上文描述的与HLA抗原具有高结合亲和性的肽被预期是高度有效的，但是还需要对以高结合亲和性的有无作为指标筛选得到的候选肽进行检查，看其是否具有CTL诱导能力。这里，短语“CTL诱导能力”表示所述肽在被呈递到抗原呈递细胞上时诱导CTL的能力。此外，“CTL诱导能力”包括所述肽诱导CTL激活、CTL增殖，促进CTL对靶细胞的裂解，和增加IFN-γ产生的能力。
CTL诱导能力的确认通过诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，或者更具体地说，来源于人外周血单核白细胞的DC，在用肽刺激后，与CD8阳性细胞混合，然后测量针对靶细胞的由CTL产生和释放的IFN-γ。作为反应系统，可以使用已产生的表达人HLA抗原的转基因动物(例如在下列文献中描述的：BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol61(8)：764-79，2000Aug，Related Articles，Books，Linkout Induction of CTLresponse by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response)。例如，可用51Cr等对靶细胞进行放射性标记，细胞毒活性可以由从靶细胞释放的放射性计算出来。或者，可以通过在携带有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下测量由CTL产生和释放的IFN-γ，并使用抗IFN-γ单克隆抗体显现出培养基上的抑制区，来进行检验。
作为如上所述的肽的CTL诱导能力检验的结果，具有对HLA抗原的高结合亲和性的肽不一定具有高的诱导能力。此外，从包含如SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68所示的氨基酸序列的肽中选择的九肽或十肽显示出特别高的CTL诱导能力，并具有高的HLA抗原结合亲和性。因此，这些肽是本发明的示例实施方案。
除了上文讨论的对本发明肽的修饰之外，本发明的肽还可以与其他物质连接，只要它们保留CTL诱导能力即可。可以使用的物质包括：肽、脂、糖和糖链、乙酰基、天然和合成聚合物等。肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化、或磷酸化；只要该修饰不破坏本文所述的肽的生物活性即可。实施这些种类的修饰可以提供额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或者使多肽稳定。‘
例如，为了增加多肽的体内稳定性，本领域已知可引入D氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；本发明的多肽也可以采用这个构思。多肽的稳定性可以用多种方法进行测试。例如，肽酶和各种生物介质，例如人血浆和血清，可以用来检测稳定性(见例如Verhoef et al.，Eur J Drug MetabPharmacokin 1986，11：291-302)。
本文中，本发明的肽也被称作“TEM8肽”或“TEM8多肽”。
III.肽的制备
本发明的肽可以用众所周知的技术加以制备。例如，肽可以通过重组DNA技术或化学合成方法合成地制备。本发明的肽可以单独合成或者被合成为包含两个或多个肽的较长的多肽。肽可以是分离的，即被纯化或分离成基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，或任何其他化学物质。
本发明的肽可以根据所选的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，合成可以采用的传统肽合成方法包括：
(i)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；
(ii)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；
(iii)Peptide Synthesis(日文)，Maruzen Co.，1975；
(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日本)，Maruzen Co.，1985；
(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(日本)，Vol.14(peptide synthesis)，Hirokawa，1991；
(vi)WO99/67288；和
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，″Solid Phase PeptideSynthesis″，Academic Press，New York，1980，100-118。
或者，本发明的肽可以用任何已知的用于产生肽的遗传工程方法获得(例如，Morrison J.(1977)J.Bacteriology 132：349-51；Clark-Curtiss&Curtiss(1983)Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983，101：347-62)。例如，首先，制备携带以可表达形式编码目标肽(例如，处于相应的启动子序列调节序列的下游)的多核苷酸的合适载体，并将其转移到合适的宿主细胞。然后培养宿主细胞，产生目的肽。肽还可以采用体外翻译系统在体外产生。
IV.多核苷酸
本发明提供了多核苷酸，其编码任何一种前述的本发明肽。它们包括来源于天然存在的TEM8基因(GenBank登录号NM 032208(SEQ ID NO：75))的多核苷酸，和具有其经保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在这里，短语“经保守修饰的核苷酸序列”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质都有多种功能相同的核酸来编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个被密码子指定为丙氨酸的位置，密码子可以改变成任何所述的相应密码子，而不会改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰的变异中的一种。本文中每一个编码肽的核酸序列也记载了该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(除AUG和TGG之外，前者一般仅是甲硫氨酸的密码子，而后者一般仅是色氨酸的密码子)均可被修饰，以产生功能上相同的分子。因此，在每个公开的序列中默示地记载了编码肽的核酸的每一种沉默变异。
本发明的多核苷酸可以包括DNA、RNA及其衍生物。DNA由合适的碱基如A、T、C和G构成。在RNA中，T被U替换。
本发明的多核苷酸可以编码多个本发明的肽，在所述多个肽之间有或者没有间插(intervening)的氨基酸序列。例如，间插氨基酸序列可以提供多核苷酸的或被翻译的肽的剪切位点(例如酶识别序列)。而且，除了编码本发明肽的编码序列之外，多核苷酸可以包含任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是重组多核苷酸，其包括肽的表达所需要的调节序列，或者可以是具有标记基因等的表达载体(质粒)。一般地，这些重组多核苷酸可以通过常规的重组技术(使用例如聚合酶和核酸内切酶)对多核苷酸进行操作来制备。
重组和化学合成技术均可用于产生本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入到合适的载体中，后者在被转染到感受态细胞中时可以被表达，来产生多核苷酸。或者，可以利用PCR技术，或者通过在合适的宿主中表达，来扩增多核苷酸(见例如Sambrook et al.，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。或者，多核苷酸可以用固相技术加以合成，例如在下列文献中描述的：Beaucage S.L.&Iyer R.P.，Tetrahedron 1992，48：2223-311；Matthes et al.，EMBO J 1984，3：801-5。
V.外来体(exosomes)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递在本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防针对的患者获得的APC制备。与本发明的肽相似，本发明的外来体可以作为疫苗进行预防接种。
复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型匹配。例如，对于日本人，HLA-A24，特别是HLA-A2402，通常是合适的。使用在日本人和白种人中高表达的A-24或A-02型对获得有效的结果是有利的。通常，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样就能够合适地选择对该抗原具有高水平的结合亲和性的肽，或通过抗原呈递具有细胞毒T细胞(CTL)诱导能力的肽。而且，为了获得显示高的结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在TEM8的部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或多个氨基酸的替换或添加。
在本发明外来体使用A-24型HLA抗原的场合，可以使用包含SEQ IDNO：3、4、或9的序列的肽，而在使用A-02型HLA抗原的场合，可以使用包含SEQ ID NO：23、25、30、60、63或68的序列的肽。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供了APC，它们在表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合体。通过与本发明的肽接触而获得的，或者通过以可表达形式导入编码本发明肽的核苷酸而获得的APC，可以来源于被治疗和/或预防的受试者，并可以自身作为疫苗施用，或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或细胞毒T细胞)组合施用。或者，本发明还提供了一同呈递本发明肽和HLA抗原的APC，其中所述APC是通过如下的方法诱导的：
(a)使本发明的肽与APC接触，或
(b)将编码所述肽的多核苷酸引入到APC中，以产生该APC。
APC不仅限于具体类型的细胞，可以包括DC、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、B细胞、和激活的T细胞，这些细胞已知都可以在其表面上呈递蛋白质抗原，从而被淋巴细胞识别。因为DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，所以DC可以用作本发明的APC。
例如，可以通过从外周血单核细胞诱导出树突细胞，然后使它们与本发明的肽在体外、离体或在体内进行接触(刺激)，来获得APC。当本发明的肽施加给受试者时，呈递本发明肽的APC在受试者体内被诱导。“诱导APC”包括使细胞与本发明的肽或者编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)，从而在细胞表面上呈递在HLA抗原和本发明肽之间形成的复合体。或者，在将本发明肽引入到APC中并容许APC呈递该肽之后，可以将APC作为疫苗施用到受试者体内。例如，离体施用可以包括如下步骤：
a：从第一受试者收集APC；
b：使步骤a中的APC与肽接触，和。
c：将负载了肽的APC施用给第二受试者。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同的个体。或者，根据本发明，提供了使用本发明的肽在制造可诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的用途。而且，本发明还提供了用于诱导抗原呈递细胞的本发明的肽。通过步骤b获得的APC可以作为疫苗施用给受试者。
根据本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于不使APC接触肽或者使APC接触不能诱导CTL的肽而得到的水平而言的。这些具有高水平细胞毒T细胞诱导能力的APC可以通过包括如下步骤的方法制备：在体外将包含编码本发明肽的多核苷酸的基因转移到APC的步骤。所引入的基因可以是DNA或RNA的形式。关于引入方法，没有特殊限制，本领域常用的各种方法，包括脂质体转染(lipofection)、电穿孔和磷酸钙方法，都可使用。更具体地，可以按照下列文献中描述的进行：Cancer Res 1996，56：5672-7；J Immunol1998，161：5607-13；J Exp Med 1996，184：465-72；日本公表专利公报第2000-509281。通过将基因转移到APC内，基因在细胞内经过转录、翻译等，然后所得的蛋白质被MHC I类分子或II类分子加工，并通过呈递途径，呈递部分肽。
VII.细胞毒T细胞
针对本发明任一种肽被诱导的细胞毒T细胞可以在体内强化靶向肿瘤相关内皮的免疫应答，因此可以和这些肽相似地用作疫苗。因此，本发明提供被任何本发明的肽特异性地诱导或激活的分离的细胞毒T细胞。优选地，本发明提供如下所述的分离的细胞毒T细胞：
(a)其通过将CD8+T细胞与呈递有本发明的肽和HLA抗原的APC接触的步骤被诱导，或者
(b)其被编码在HLA-A24或HLA-A2的背景下与本发明的肽结合的TCR亚单位多肽的核酸转化。
这些细胞毒T细胞可以通过(1)向受试者施用本发明的肽，或者(2)使来源于受试者的APC，和CD8阳性细胞，或者外周血单个核白细胞在体外与本发明的肽接触(刺激)来获得。
通过呈递本发明肽的APC的刺激而被诱导的细胞毒T细胞可以来自作为治疗和/或预防对象的受试者，并可以自身或者与其他药物(包括本发明的肽或者用于调节作用的外来体)组合施用。所获得的细胞毒T细胞特异地作用于呈递本发明的肽，或者例如与用于诱导的相同的肽，的靶细胞。靶细胞可以是内源表达TEM8的细胞，或者是被TEM8基因转染的细胞，并且由于受到这些肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可以充当活化CTL攻击的靶标。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供了一种组合物，其包含编码能够形成T细胞受体(TCR)亚基的多肽的核酸，并提供了该组合物的使用方法。所述TCR亚基具有形成可赋予T细胞以针对呈递TEM8的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可以鉴定出作为被一种或多种本发明肽诱导的CTL之TCR亚基的α-和β-链的核酸(WO2007/032255和Morgan et al.，JImmunol，171，3288(2003))。衍生的TCR能够以高亲和性结合展示TEM8肽的靶细胞，并任选地能够在体内和体外介导对呈递TEM8肽的靶细胞进行高效杀伤。
编码TCR亚基的核酸可以掺入到合适的载体内，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领域众所周知的。可以将核酸或包含它们的载体有用地转移到T细胞，例如来自患者的T细胞中。有利的是，本发明提供了容易获得的(off-the-shelf)组合物，其容许快速地修饰患者自身的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)，从而快速而容易地产生具有优异的癌细胞杀伤性质的修饰T细胞。
另外，本发明提供通过用编码在HLA-A24或HLA-A2背景下与TEM8肽(例如SEQ ID NO：3、4、9、23、25、30、60、63和68)结合的TCR亚基多肽的核酸进行转导而制备的CTL。被转导的CTL能够在体内归巢到(homing to)癌细胞，并可以用众所周知的培养方法在体外进行扩增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461(1989))。可以使用本发明的T细胞形成免疫组合物，所述免疫组合物可用于治疗或预防需要治疗或保护的患者的癌症(WO2006/031221)。
防止和预防包括任何可以减轻疾病死亡率或发病率负担的行为。防止和预防可以在“一级、二级和三级预防水平”上发生。一级防止和预防避免疾病的发展，而二级和三级水平的防止和预防包括旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症，来防止和预防疾病的进展和症状的出现，以及降低已有疾病的不利影响的行为。或者，防止和预防包括广泛的旨在缓解特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移，减少血管新生，的预防治疗。
癌症的治疗和/或预防和/或其手术后复发的防止包括下列步骤中的任何一种：例如癌细胞的手术切除、癌细胞生长的抑制、肿瘤的退缩(involution)或退化、缓解的诱导和癌症发生的抑制、肿瘤退化、以及转移的降低或抑制。有效的癌症治疗和/或预防可降低死亡率、改善患癌个体的预后、降低血液中肿瘤标志物的水平，和减轻癌症所伴随的可检测症状。例如，症状的减轻或改善是有效治疗的构成要素，和/或预防导致包括10％、20％、30％或更多的减少，或者病情稳定。
IX.药物制剂
由于TEM8的表达在肿瘤相关内皮中相比于正常组织被特异提高(StCroix B et al.，Science 2000 Aug 18，289(5482)：1197-202)，所以本发明的肽或编码该肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或防止其手术后复发。因此，本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或防止其手术后复发的药物制剂，其包括一种或多种本发明的肽，或者编码这些肽的多核苷酸，作为活性成分。或者，为了用作药物制剂，本发明的肽可以在任何前述外来体或细胞(例如APC)的表面上表达。此外，前述的靶定任何本发明肽的细胞毒T细胞也可用作本发明药物制剂的活性成分。
本发明的药物制剂可用作疫苗。在本发明中，短语“疫苗”(也称作免疫原性组合物)是指如下的物质，其在接种到动物体内时可以发挥诱导抗肿瘤免疫的功能。
本发明的药物制剂可用于治疗和/或预防受试者或患者体内的癌症，和/或防止其手术后复发，所述受试者包括人和任何其他哺乳动物，后者包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或家畜。
根据本发明，已发现包含SEQ ID NO：3、4或9的氨基酸序列的多肽是能够诱导针对肿瘤相关内皮的强烈而特异的免疫应答的HLA-A24限制性表位肽。因此，包含这些含有SEQ ID NO：3、4和9的氨基酸序列中的任何一种的多肽的本药物制剂特别适合于施用给HLA为HLA-A24的受试者。另一方面，包含SEQ ID NO：23、25、30、60、63或68的氨基酸序列的多肽被发现是能够诱导针对肿瘤相关内皮的强烈而特异的免疫应答的HLA-A02限制性表位肽。因此，包含这些含有SEQ ID NO：23，25，30，60，63或68的氨基酸序列中的任何一种的多肽的药物制剂特别适合于施用给HLA为HLA-A02的受试者。这同样可适用于包含编码任意这些多肽的多核苷酸的药物制剂。
用本发明药物制剂治疗的癌症不受限制，包括所有种类的涉及TEM8的癌症，包括例如膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、成神经细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、睾丸肿瘤或结直肠癌(见图5)。
除了前述的活性成分之外，本药物制剂还可以包含其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽，编码这些其它肽的其它多核苷酸，呈递这些其它肽的其它细胞等。在本文中，其它具有诱导针对癌细胞的CTL的能力的肽的实例有癌特异抗原(例如已鉴定的TAA)，但不限于此。
如果需要，本发明的药物制剂可任选地包含其他治疗性物质作为活性成分，只要该物质不抑制活性成分(例如任何本发明的肽)对肿瘤相关内皮的抗肿瘤效果即可。例如，制剂可以包括抗炎剂、止痛剂、化疗剂等。本发明的药物除了本身包含其他的治疗性物质之外，还可以和一种或多种其他的药理学作用剂顺次或同时施用。药物和药理学作用剂的量取决于，例如，所用的药理学作用剂是何种类型、所治疗的疾病、以及给药的日程方案和途径。
应当理解，除了本文中特别提到的成分之外，本发明的药物制剂可以包括与所讨论的制剂类型有关的本领域中常规使用的其他作用剂。
在本发明的一个实施方案中，本药物制剂可以包含在制品和试剂盒中，所述制品和试剂盒含有可用于治疗待治疗的病理状况(例如癌症)的材料。该制品可以包括具有标签的任何本发明药物制剂的容器。合适的容器包括瓶子、小瓶和试管。容器可以用多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器上的标签应当指明该制剂是用于治疗或预防疾病的一种或多种状况。该标签还可以标明用药说明等。
除了上述的容器之外，包含本发明药物制剂的试剂盒可以任选地进一步包含第二容器，其容纳药物可接受的稀释剂。它还可以进一步包括其他从商业和用户角度上看期望的材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。
如果期望的话，药物组合物可以在包装(pack)或分配装置(dispenserdevice)中提供，所述包装或分配装置可以包含一个或多个单位剂量形式的活性成分。该包装可以包括，例如，金属或塑料箔，例如发泡包装。该包装或配药器可以附带有给药说明。
(1)含有肽作为活性成分的药物制剂
本发明的肽可以直接作为药物制剂施用，或者如果需要的话，可以用常规的制剂方法配制。在后一种情况下，除了本发明的肽之外，还可以视情况包含载体、赋形剂和其他通常用于药物的物质，但没有特别的限制。这些载体的实例有无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。而且，药物制剂可以根据需要包含稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。本发明的药物制剂可用于抗癌目的。
本发明的肽可以制备为组合的形式，所述组合包含两种或更多种本发明的肽，用于在体外诱导CTL。多个肽(peptides)可以形成鸡尾酒混合物，或者可以借助标准技术彼此偶联。例如，多个肽(peptides)可以被化学连接起来，或者被表达为单个融合多肽序列。组合中的多个肽可以是相同的也可以是不同的。通过施用本发明的肽，这些肽被HLA抗原以高密度呈递在抗原呈递细胞上，然后诱导出特异性地与被展示肽和HLA抗原所形成的复合体发生反应的CTL。或者，可以通过从用本发明的肽刺激过的受试者体内取出APC(例如DC)而获得在其细胞表面上呈递任何本发明肽的APC，通过向受试者重新施用这些APC(例如DC)在受试者体内诱导CTL，作为其结果，可以增加针对肿瘤相关内皮的攻击性。
包含本发明的肽作为活性成分的用于治疗和/或预防癌症的药物制剂可以任选地包含佐剂，以便有效地建立细胞免疫；或者，它们可以和其他活性成分一起施用，而且它们可以配制成小颗粒来施用。佐剂是指如下的化合物，其在和具有免疫活性的蛋白质一起(或顺次)施用时，可以提高针对该蛋白质的免疫应答。可以使用的佐剂包括在文献中描述的佐剂(ClinMicrobiol Rev 7：277-89，1994)。示例性的佐剂包括磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等，但不仅限于此。
而且，可以方便地使用脂质体制剂、Foxp3肽与数微米直径的球珠结合而成的颗粒制剂、和脂质与肽结合的制剂。
在一些实施方案中，本发明的药物制剂包括可引发(prime)CTL的组分。脂质已被鉴定为是能够在体内针对病毒抗原引发CTL的作用剂。例如，可以将棕榈酸残基连接到赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接到本发明的肽上。随后可以将脂质化的肽直接置于胶囊或颗粒中、或者掺入脂质体中、或者乳化在佐剂中来施用。作为CTL应答的脂质引发的另一个实例，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，在共价连接到合适的肽时，可以用来引发CTL(见例如Deres et al.，Nature1989，342：561-4)。
给药方法可以是口服、皮内、皮下、或静脉内注射等，并可以使用全身给药或者在靶标部位附近局部给药。给药可以是单次给药或者通过多次给药进行增强。本发明肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、给药方法等进行合适的调节，一般为0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg，并可以从每几天给药1次到每几个月给药1次。本领域的技术人员可以恰当地选择合适的剂量。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物制剂
本发明的药物制剂还可以包含处于可表达形式的编码本文公开的肽的核酸。本文中，语句“处于可表达的形式”是指多核苷酸在引入到细胞内时可以在体内表达为可诱导抗肿瘤免疫的多肽。在一个示例性实施方案中，目标多核苷酸的核酸序列包括表达该多核苷酸所必需的调节元件。可以为多核苷酸提供必要的配备，使其可以稳定地插入到靶细胞的基因组内(关于同源重组盒载体的描述见例如Thomas KR&Capecchi MR，Cell 1987，51：503-12)。见例如Wolffet al.，Science 1990，247：1465-8；美国专利5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；和WO 98/04720。基于DNA的递送技术的实例包括“裸DNA”、辅助(bupivicaine、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合体、和颗粒介导(“基因枪”)或压力介导的递送(见例如美国专利No.5,922,687)。
本发明的肽还可以用病毒或细菌载体表达。表达载体的实例包括减毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘。这种方法涉及使用痘苗病毒，例如，作为载体，表达编码该肽的核苷酸序列。一旦被引入到宿主内，重组的痘苗病毒就表达免疫原性肽，借此引发免疫应答。免疫规程中可以使用的痘苗载体和方法在下列文献中有描述，例如美国专利No.4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover et al.，Nature 1991，351：456-60中有描述。显然存在大量其他的可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000，6：66-71；Shedlock et al.J Leukoc Biol 2000，68：793-806；Hipp et al.，In Vivo2000，14：571-85。
多核苷酸可以直接输送到患者体内，其中使患者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者可以间接输送，其中首先在体外用目的多核苷酸对细胞进行转化，然后将细胞移植到患者体内。这两种方法被分别称作体内和离体基因治疗。
关于基因治疗方法的一般综述，见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993，12：488-505；Wu and Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33：573-96；Mulligan，Science 1993，260：926-32；Morgan&Anderson，Ann Rev Biochem 1993，62：191-217；Trends inBiotechnology 1993，11(5)：155-215)。可以使用的在重组DNA技术中普遍知道的方法在下面文献中有描述：Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY，1993；和Krieger，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY，1990。
给药方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等，还可以使用全身给药或对靶标部位附近的局部给药。给药可以通过单次给药来实施，或者通过多次给药进行加强。对于处于合适载体内的多核苷酸或者用编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞内的剂量而言，可以根据待治疗的疾病、患者的年龄、体重、给药方法等加以合适的调节，一般为0.001mg-1000mg，例如0.001mg-1000mg，例如0.1mg-10mg，并可以从每几天给药1次到每几个月给药1次。本领域的技术人员可以恰当地选择合适的剂量。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和编码这些肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以和任何其它化合物组合使用，只要这些化合物不抑制它们的CTL诱导能力即可。因此，任何前述的本发明药物制剂均可用于诱导CTL，除此之外，包含该肽或多核苷酸的那些也可如下文中将解释的那样用于诱导APC。
(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法
本发明提供了使用本发明的肽或编码这些肽的多核苷酸诱导APC的方法。诱导APC可以如上文部分“VI.抗原呈递细胞”中所述那样进行。本发明还提供了用于诱导具有高水平的CTL诱导能力的APC的方法，其诱导在上文“VI.抗原呈递细胞”条目下有讨论。优选地，本发明提供了用于诱导具有高水平的CTL诱导能力的APC的方法，其中该方法包括如下步骤：使本发明的肽与APC接触，或将编码该肽的多核苷酸引入到APC中，以产生呈递本发明肽和HLA抗原的APC。
(2)诱导CTL的方法
而且，本发明还提供了使用本发明的肽、编码这些肽的多核苷酸或呈递这些肽的外来体或APC诱导CTL的方法。在一个优选实施方案中，该方法包括使CD8+T细胞与下列物质接触的步骤：
(a)呈递本发明的肽和HLA抗原的APC，或
(b)通过将包含编码本发明肽的多核苷酸的基因引入到抗原呈递细胞内而诱导的APC。当本发明的肽被施用给受试者时，在受试者体内诱导出CTL，并且靶向肿瘤相关内皮的免疫应答的强度被提高。或者，可以将所述肽和编码所述肽的多核苷酸用于离体治疗方法，其中将受试者来源的APC和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞与本发明的肽在体外进行接触(刺激)，并且在诱导出CTL之后，将激活的CTL细胞返回到受试者体内。例如，该方法可以包括如下步骤：
a：从受试者收集APC，
b：使步骤a的APC与肽接触，
c：将步骤b的APC与CD8+T细胞混合，并共培养以诱导CTL；和
d：从步骤c的共培养物中收集CD8+T细胞。
或者，根据本发明，提供了本发明的肽用于制造可诱导CTL的药物组合物的用途。而且，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。
通过步骤d获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用给受试者。在上面步骤c中与CD8+T细胞混合的APC还可以根据在上文条目“VI.抗原呈递细胞”中详细说明的方法，通过将编码本发明肽的基因转移到APC中来加以制备；但并不仅限于此，任何能够有效地将本发明的肽呈递给T细胞的APC或外来体均可用于本方法。
尽管在实践和测试本发明时可以使用与本文描述的相似或等价的方法和材料，但这里还是描述了合适的方法和材料。本文通过援引方式并入在这里提到的所有出版物、专利公开、专利和其它参考文献的全部内容。在出现矛盾时，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是例证性的，不意图构成限制。
下面的实施例是用于举例说明本发明，和帮助本领域的技术人员制造和使用本发明。这些实施例不意图在任何方面对本发明的范围构成限制。
实施例
材料和方法
细胞系
通过用Epstein-bar病毒转化进入HLA-A24阳性人B淋巴细胞而建立了A24类淋巴母细胞细胞系(A24LCL)。T2(HLA-A2)、人B-类淋巴母细胞、COS7和CT26、小鼠结直肠癌细胞系购自于ATCC。RLmalel、小鼠淋巴瘤细胞系购自于日本东北大学生物医学研究细胞资源中心(Cell ResourceCenter for Biomedical Research，Tohoku University)。
TEM8衍生肽的候选物筛选
使用结合预测软件″BIMAS″(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)预测了TEM8来源的可结合HLA-A*2402和HLA-A*0201分子的9聚体和10聚体肽，其算法由Parker KC et al.(J Immunol 1994，152(1)：163-75)和Kuzushima K et al.(Blood 2001，98(6)：1872-81)所描述。由Sigma(Sapporo，Japan)根据标准固相合成方法合成这些肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)加以纯化。肽的纯度(＞90％)和身份分别用分析HPLC和质谱分析加以确定。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，并保存于-80摄氏度。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞，诱导针对在人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。DC在体外产生，方法如别处所述(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003 Jul 15，63(14)：4112-8)。具体地说，用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液从正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-A*0201阳性)分离外周血单核细胞(PBMC)，通过粘附到塑料组织培养盘(Becton Dickinson)对其进行分离，从而富集其中的单核细胞部分。将富含单核细胞的群体培养在有1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(R&D System)和1000U/ml白介素(IL)-4(R&DSystem)存在并含有2％热失活的自体同源血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中。培养7天后，在3微克/ml β2-微球蛋白的存在下用20微克/ml的每种合成肽将用细胞因子诱导出的DC在37摄氏度的AIM-V培养基中冲击3小时。所产生的细胞似乎在其细胞表面上表达DC相关分子，例如CD80、CD83、CD86和II类HLA分子(数据未显示)。然后用丝裂霉素C(MMC)(30微克/ml，历时30min)使这些经过肽冲击的DC失活，然后以1∶20的比例与自体同源CD8+T细胞混合，这些CD8+T细胞是用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)进行阳性筛选而获得的。在48孔培养板(Corning)中准备好这些培养物，每孔含有1.5×104个经过肽冲击的DC，3×105个CD8+T细胞和10ng/ml的IL-7(R&D System)，处于0.5ml AIM-V/2％AS培养基中。3天后，向这些培养物中补充IL-2(CHIRON)至终浓度为20IU/ml。第7和14天，用经肽冲击的自体同源DC进一步对这些T细胞进行刺激。每一次DC的制备均采用与上述相同的程序。在第21天，经过3轮肽刺激后，针对肽冲击过的A24LCL细胞测试CTL(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5，84(1)：94-9；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr 20，84(8)：1052-7；Uchida Net al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci2006May，97(5)：411-9；Watanabe T et al.，Cancer Sci 2005Aug，96(8)：498-506)。
CTL扩增程序
使用与Riddell等报道的相似的方法(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995Oct 19，333(16)：1038-44；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb，2(2)：216-23)在培养下扩增CTL。在40ng/ml抗-CD3单克隆抗体(Pharmingen)存在下，将总共5×104个CTL与2种用MMC失活的人B-类淋巴母细胞系一起悬浮在25ml AIM-V/5％AS培养基中。开始培养1天之后，向该培养物中添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天，向该培养物中添加含有30IU/mlIL-2的新鲜AIM-V/5％AS培养基(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001Jan 5，84(1)：94-9；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001Apr 20，84(8)：1052-7；Uchida N et al.，C1inCancer Res 2004Dec 15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci 2006May，97(5)：411-9；Watanabe T et al.，Cancer Sci 2005Aug，96(8)：498-506)。
CTL克隆的建立
在96孔圆底微滴定板(Nalge Nunc International)内进行稀释至0.3、1、和3个CTL/孔。在总体积为150微升/孔的含5％AS的AIM-V培养基中，将CTL与1×104细胞/孔的2种人B-类淋巴母细胞系、30ng/ml的抗-CD3抗体、和125U/mlIL-2一起培养。10天后，向培养基添加50微升/孔IL-2，使IL-2的终浓度为125U/ml。在第14天检测CTL活性，使用与上文相同的方法扩增CTL克隆(Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15，10(24)：8577-86；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May，97(5)：411-9；Watanabe T et al.，Cancer Sci 2005 Aug，96(8)：498-506)。
特异性CTL活性
为了检验特异性CTL活性，实施干扰素(IFN)-γ酶联免疫斑点(immunospot)(ELISPOT)测定和IFN-γ酶联免疫吸附测定(ELISA)。具体地，制备经过肽冲击的A24-LCL(1×104/孔)作为刺激细胞(stimulator cell)。使用在48孔板中培养的细胞或经过有限稀释的CTL克隆作为应答细胞。IFN-γELISPOT测定和IFN-γELISA根据制造商的程序实施。
表位肽在BALB/c小鼠体内的免疫原性
为了引发肽特异的CTL，使用100微升疫苗混合物进行免疫，该疫苗混合物含有每只小鼠50微升HLA-A24限制性肽和50微升IFA。在第0天皮下注射疫苗到小鼠的右胁进行第一次免疫，在第7天注射到左胁进行第二次免疫。在第14天，使用来自经接种的小鼠的脾细胞作为应答细胞，使用有或者没有被肽冲击过的RLmale1细胞作为刺激细胞，进行IFN-γELISPOT测定。
体内抗肿瘤效果
在第-7天和0天用IFA偶联的肽进行疫苗接种。在第0天，将CT26细胞(5×104细胞/鼠)皮下注射到BALB/c小鼠的右胁。用两个垂直直径的乘积来衡量肿瘤生长(mm2)。
结果
来源于TEM8的HLA-A24结合肽的预测
表1按照预测高结合亲和性的次序显示了TEM8的HLA-A*2402和HLA-A*0201结合肽。总共选择了21种具有潜在HLA-A24结合活性的肽，并检验确定表位肽(表1a)，并类似地选择了总共53种具有潜在HLA-A2结合能力的肽，并检验确定表位肽(表1b和表1c)。大多数预测肽没有显示CTL诱导。因此，在本发明中，集中关注显示了CTL诱导的肽。
[表1a]来源于TEM8的HLA-A24结合肽(9聚体和10聚体肽)
[表1a]
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 446 | WYSPIKGKL | 369.6 | 0/1 | 1 | ||
| 175 | VYCVGVKDF | 100 | 0/1 | 0/6 | 2 | |
| 39 | CYGGFDLYF | 100 | 1/1 | 3 | ||
| 277 | TYLLCPAPI | 75 | 1/1 | 4 | ||
| 138 | GYRTASVII | 50 | 0/1 | 0/6 | - | 5 |
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 330 | LFLLLALAL | 36 | - | - | - | 6 |
| 84 | VFSTRGTTL | 20 | 0/1 | 0/6 | - | 7 |
| 140 | RTASVILAL | 11.2 | 0/1 | 0/6 | - | 8 |
| 277 | TYLLCPAPIL | 300 | 1/1 | 9 | ||
| 424 | EYEFPEPRNL | 300 | 0/1 | 0/6 | - | 10 |
| 39 | CYGGFDLYFI | 50 | 0/1 | 0/6 | - | 11 |
| 382 | YYGGRGVGGI | 50 | 0/1 | 0/6 | - | 12 |
| 330 | LFLLLALALL | 30 | - | - | - | 13 |
| 12 | GFQWLSLATL | 30 | 0/1 | 0/6 | - | 14 |
| 64 | YFVEQLAHKF | 23.76 | 0/1 | 0/6 | - | 15 |
| 258 | SFKINDSVTL | 20 | 0/1 | 0/6 | - | 16 |
| 7 | RALGIGFQWL | 17.28 | 0/1 | 0/6 | - | 17 |
| 494 | KYPLNNAYHT | 15 | 0/1 | 0/6 | - | 18 |
| 445 | KWYSPIKGKL | 12.32 | 0/1 | 0/6 | - | 19 |
| 488 | KNNQPAKYPL | 12 | 0/1 | 0/6 | - | 20 |
| 250 | RNVDRVLCSF | 10.08 | 0/1 | 1/6 | 0/1 | 21 |
[表1b]来源于TEM8的HLA-A02结合性9聚体肽
[表1b]
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 266 | TLNEKPFSV | 1653.947 | 0/1 | 0/8 | - | 22 |
| 337 | ALLWWFWPL | 1126.333 | 1/1 | - | - | 23 |
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 331 | FLLLALALL | 836.253 | - | - | - | 24 |
| 338 | LLWWFWPLC | 452.836 | 1/1 | - | - | 25 |
| 298 | SMNDGLSFI | 390.792 | 0/1 | 0/8 | - | 26 |
| 8 | ALGIGFQWL | 223.237 | 0/1 | 0/8 | - | 27 |
| 13 | FQWLSLATL | 190.197 | 0/1 | 0/8 | - | 28 |
| 326 | ALLILFLLL | 150.178 | - | - | - | 29 |
| 278 | YLLCPAPIL | 149.071 | 1/1 | - | - | 30 |
| 47 | FILDKSGSV | 86.756 | 0/1 | 0/8 | - | 31 |
| 327 | LLILFLLLA | 73.815 | - | 32 | ||
| 94 | KLTEDREQI | 73.358 | 0/1 | 0/8 | - | 33 |
| 329 | ILFLLLALA | 71.872 | - | - | - | 34 |
| 79 | RMSFIVFST | 71.796 | 0/1 | 0/8 | - | 35 |
| 302 | GLSFISSSV | 69.552 | 0/1 | 0/8 | - | 36 |
| 119 | YMHEGFERA | 63.000 | 0/1 | 0/8 | - | 37 |
| 369 | GLPKKKWPT | 55.890 | 0/1 | 0/8 | - | 38 |
| 453 | KLDALWVLL | 50.843 | 0/1 | 0/8 | - | 39 |
| 112 | VLPGGDTYM | 46.451 | 0/1 | 1/8 | 0/1 | 40 |
| 328 | LILFLLLAL | 42.494 | - | - | - | 41 |
| 15 | WLSLATLVL | 40.289 | 0/1 | 1/8 | 0/1 | 42 |
| 324 | AIALLILFL | 37.157 | - | - | - | 43 |
| 322 | ILAIALLIL | 34.246 | - | - | - | 44 |
| 325 | LALLILFLL | 24.896 | - | - | - | 45 |
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 207 | ALQGIIHSI | 23.995 | 0/1 | 1/8 | 0/1 | 46 |
| 190 | RIADSKDHV | 19.213 | 0/1 | 0/8 | - | 47 |
| 223 | ILAAEPSTI | 17.736 | 0/1 | 0/8 | - | 48 |
| 104 | QGLEELQKV | 15.841 | 0/1 | 0/8 | - | 49 |
| 170 | DLGAIVYCV | 11.998 | 0/1 | 1/8 | 0/1 | 50 |
[表1c]来源于TEM8的HLA-A02结合性10聚体肽
[表1c]
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 459 | VLLRkGYDRV | 321.549 | 0/1 | 0/8 | - | 51 |
| 13 | FQWLsLATLV | 269.238 | 0/1 | 0/8 | - | 52 |
| 326 | ALLIIFLLLA | 160.655 | - | - | - | 53 |
| 329 | ILFLILALAL | 134.369 | - | - | - | 54 |
| 337 | ALLWwFWPLC | 118.745 | - | - | - | 55 |
| 369 | GLPKkKWPTV | 118.238 | 0/1 | 0/8 | - | 56 |
| 15 | WLSLaTLVLI | 110.379 | 0/1 | 0/8 | - | 57 |
| 47 | FILDkSGSVL | 84.039 | 0/1 | 0/8 | - | 58 |
| 327 | LLILfLLLAL | 83.527 | - | - | - | 59 |
| 338 | LLWWfWPLCC | 70.098 | 1/1 | - | - | 60 |
| 230 | TICAgESFQV | 55.468 | 0/1 | 0/8 | - | 61 |
| 324 | ALALlILFLL | 39.184 | - | - | - | 62 |
| 265 | VTLNeKPFSV | 35.242 | 1/1 | - | - | 63 |
| 起始位置 | 氨基酸序列 | 结合得分 | 阳性供体数 | 阳性孔数 | 阳性CTL系 | SEQ IDNO |
| 111 | KVLPgGDTYM | 30.962 | 0/1 | 0/8 | - | 64 |
| 336 | LALLwWFWPL | 26.594 | - | - | - | 65 |
| 103 | RQGLeELQKV | 16.219 | 0/1 | 0/8 | - | 66 |
| 409 | KLEKaKNARV | 15.580 | 0/1 | 0/8 | - | 67 |
| 333 | LLALaLLWWF | 12.019 | 1/1 | - | - | 68 |
| 83 | IVFStRGTTL | 11.757 | 0/1 | 0/8 | - | 69 |
| 7 | RALGiGFQWL | 11.472 | 0/1 | 0/8 | - | 70 |
| 17 | SLATIVLICA | 11.426 | - | - | - | 71 |
| 305 | FISSsVIITT | 10.841 | - | - | - | 72 |
| 294 | ALQVsMNDGL | 10.468 | 0/1 | 0/8 | - | 73 |
| 321 | SILAiALLIL | 10.249 | - | - | - | 74 |
起始位置表示从TEM8N-末端起的氨基酸残基数
结合得分来源于“BIMAS”
使用来源于TEM8的HLA-A*2402或HLA-A*0201限制性预测肽的CTL诱
导和TEM8衍生肽刺激的CTL系的建立
针对TEM8衍生肽的CTL根据“材料和方法”中描述的规程来产生。通过IFN-γELISPOT测定法确定肽特异性的CTL活性(图1a-i)。图中显示，TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)，TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)，TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)，TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)，TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)，TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)，TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)，TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)与对照孔相比显示了强烈的IFN-γ产生。而且，对如下阳性孔中的细胞进行了扩增并建立了CTL系：用SEQ ID NO：3刺激的#5，用SEQ ID NO：4刺激的#6，用SEQ ID NO：9刺激的#3，用SEQID NO：23刺激的#3，用SEQ ID NO：25刺激的#6，用SEQ ID NO：30刺激的#3，用SEQ ID NO：60刺激的#2，用SEQ ID NO：63刺激的#5，和用SEQID NO：68刺激的#4。这些CTL系的CTL活性通过IFN-γELISA测定加以确定(图2a-i)。图中显示，与没有用肽冲击的靶细胞相比，针对用相应肽冲击过的靶细胞全部的CTL系均显示有强烈IFN-γ产生。另一方面，通过用其它表1所示的肽进行刺激未能建立CTL系，尽管这些肽具有潜在的与HLA-A*2402或HLA-A*0201的结合活性。例如，图1j和图2j显示了用TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO：46)刺激的CTL应答的典型阴性数据。结果其表明，9种TEM8来源的肽作为能够诱导强烈CTL系的肽被筛选出来。
针对TEM8特异性肽的CTL克隆的建立
此外，按照“材料和方法”条目下的描述，从每种CTL系通过有限稀释建立了CTL克隆，并通过IFN-γELISA测定法确定了来自CTL克隆的针对肽冲击的靶细胞的IFN-γ产生。从图3中用SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：63刺激的CTL克隆测到了强烈的IFN-γ产生。
针对内源表达TEM8和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶细胞的特异
CTL活性
针对用这些肽产生并建立的CTL系或者克隆，检查其识别内源表达TEM8和HLA-A*2402分子的靶细胞的能力。以使用相应的肽产生的CTL系或克隆作为效应细胞，检验了针对同时用全长TEM8和HLA-A*2402分子基因转染的COS7细胞(其是内源表达TEM8和HLA-A*2402基因的靶细胞的特异性模型)的特异CTL活性。制备用全长TEM8基因或HLA-A*2402转染的COS7细胞作为对照。CTL针对同时用TEM8和HLA-A24转染的COS7细胞显示了强烈的CTL活性，如图4a所示。另一方面，针对对照没有检测到显著的特异性CTL活性。此外，还对用HLA-A2限制性肽产生并建立的CTL系或克隆检查了它们识别内源表达TEM8和HLA-A*0201分子的靶细胞的能力。检验了针对同时用全长TEM8和HLA-A*0201分子基因转染的COS7细胞的特异CTL活性。使用被相应HLA-A2限制性肽诱导的CTL系或克隆作为效应细胞。使用被全长TEM8基因或HLA-A*0201基因转染的COS7细胞作为对照。用SEQ ID NO：63刺激的CTL针对同时用TEM8和HLA-A2转染的COS7细胞显示了强烈的CTL活性，如图4b所示。另一方面，针对对照没有检测到显著的特异性CTL活性。因此，这些数据清晰地表明，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：63在靶细胞上与HLA-A*2402或HLA-A*0201分子一起天然地表达，并且被CTL识别。而且，其表明，这两种来源于TEM8的肽是能够诱导CTL的表位肽，并且可用于向具有TEM8表达细胞的患者应用癌症疫苗。
表位肽在BALB/c小鼠体内的免疫原性
用SEQ ID NO：4免疫BALB/c小鼠，以评估TEM8表位肽的免疫原性。在第二次注射与IFA偶联的所述肽之后，通过IFN-γELISPOT测定来确定肽特异的CTL活性。当使用从被免疫小鼠收集的脾细胞作为应答细胞时，特异地检测到了强烈IFN-γ产生。在图5a中，在5只小鼠中的4只(M1、M3、M4和M5)检测到了特异针对SEQ ID NO：4的IFN-γ产生，但在对照小鼠中则没有检测到(N1和N2)。这些数据表明，SEQ ID NO：4在体内诱导了针对肽冲击靶细胞的特异CTL。
TEM8表位肽疫苗接种的抗肿瘤效果
为了检查使用该肽的抗肿瘤效果，使用CT26肿瘤细胞系检验了体内抗肿瘤模型。在第-7天和0天施用SEQ ID NO：4，并在第0天将CT26结直肠癌细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。与对照小鼠相比，用SEQ ID NO：4疫苗接种的小鼠体内的肿瘤生长明显降低(图5b)。图中显示，关于用SEQ IDNO：4疫苗接种的小鼠体内的肿瘤生长抑制显示了统计学上显著的差异(P＜0.05)。
抗原肽的同源性分析
已经证明，分别用如下肽刺激的CTL显示出显著而特异的CTL活性：
TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)，
TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)，
TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)，
TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)，
TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)，
TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)，
TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)，
TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和
TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)，
该结果可能是由于这些肽的序列与来源于其它已知可以敏化人免疫系统的分子的肽具有同源性而导致的。为了排除这种可能性，以这些肽序列作为查询序列，使用BLAST算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行了同源性分析，结果显示没有具有显著同源性的序列。同源性分析的结果表明，序列TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO：3)、TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO：4)、TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO：9)、TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO：23)、TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO：25)、TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO：30)、TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO：60)、TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO：63)和TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO：68)是独特的，因此，据我们所知，这些分子不大可能会激发意图之外的针对无关分子的免疫应答。
最后，鉴定了来源于TEM8的新型HLA-A*2402或A*0201表位肽。而且，证明了TEM8的表位肽能够用于癌症免疫治疗。
工业应用性
本发明提供了新型肽，它们可诱导靶向于内皮细胞(该细胞在多种血管发生相关疾病中均有形成)的CTL，这些肽可极其有效地用作疫苗。本发明还提供了用于治疗和预防与血管发生有关的疾病(例如肿瘤)的药物，其包括任何这些肽作为活性成分。根据本发明，用于诱发免疫所需的肽的大小非常小(例如9-10个氨基酸残基)。因此，本发明的肽合成和纯化非常容易实施，这是本发明的一个特别有利之处。
本说明书通过援引并入本文引用的全部出版物、专利和专利申请。
Claims (24)
1.一种分离的具有细胞毒T细胞诱导能力的九肽或十肽，其中所述九肽或十肽包含选自SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
2.一种九肽或十肽，包括选自SEQ ID NO：3，4和9的氨基酸序列。
3.一种具有细胞毒T淋巴细胞(CTL)诱导能力的肽，其中该肽包括选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：3、4或9；和
(b)SEQ ID NO：3、4或9，其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。
4.权利要求3的肽，其具有至少一个选自下组的替换：
(a)自N端起的第二个氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和
(b)C端氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
5.一种九肽或十肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23、25、30、60、63和68。
6.一种具有CTL诱导能力的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：23、25、30、60、63或68；和
(b)SEQ ID NO：23、25、30、60、63或68，其中替换或添加了1个、2个或数个氨基酸。
7.权利要求6的肽，其具有至少一个选自下组的替换：
(a)自N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和
(b)C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
8.一种用于治疗和/或预防肿瘤和/或防止其手术后复发的药物制剂，其中该药物制剂包括一种或多种根据权利要求1-7中任一项的肽，或编码该肽的多核苷酸。
9.权利要求8的药物制剂，其意图施用于给HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02的受试者。
10.权利要求9的药物制剂，其意图用于治疗癌症。
11.权利要求10的药物制剂，其是疫苗。
12.一种外来体，所述外来体在其表面上呈递包含权利要求1-7中任一项的肽和HLA抗原的复合体。
13.权利要求12的外来体，其中HLA抗原是HLA-A24。
14.权利要求12的外来体，其中HLA抗原是HLA-A2402。
15.权利要求12的外来体，其中HLA抗原是HLA-A02。
16.权利要求12的外来体，其中HLA抗原是HLA-A0201。
17.一种诱导具有高的CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法，所述方法是通过使用权利要求1-7中任一项的肽或编码该肽的多核苷酸进行的。
18.一种诱导CTL的方法，所述方法是通过使用权利要求1-7中任一项的肽或编码该肽的多核苷酸进行的。
19.一种诱导具有高的CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法，所述方法是通过使用权利要求1-7中任一项的肽或编码该肽的多核苷酸进行的，其中所述方法包括将包含编码权利要求1-7中任一项的肽的多核苷酸的基因导入抗原呈递细胞的步骤。
20.一种分离的细胞毒T细胞，其靶向权利要求1-7的任一种肽。
21.一种分离的细胞毒T细胞，其是使用权利要求1-7中任一项的肽诱导的，或者是被编码在HLA-A24或HLA-A2的背景下与权利要求1-7中任一项的肽结合的TCR亚单位多肽的核酸转导的。
22.一种分离的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞在其表面上呈递由HLA抗原和权利要求1-7中任一项的肽形成的复合体。
23.一种抗原呈递细胞，其是通过如下方式被诱导的：
(a)使用权利要求1-7中任一项的肽或编码该肽的多核苷酸，或
(b)使用权利要求1-7中任一项的肽或编码该肽的多核苷酸，其中所述抗原呈递细胞是通过将包含编码权利要求1-7中任一项的肽的多核苷酸的基因引入到抗原呈递细胞中而被诱导的。
24.一种在受试者体内诱导针对肿瘤相关内皮的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含权利要求1-7的肽、其免疫活性片段、或编码该肽或片段的多核苷酸。
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