KR20100014523A - 인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 프로바이오틱 그램-양성 박테리아 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 프로바이오틱(probiotic) 그램-양성 박테리아가 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한(viable) 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 존재하는, 인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 약제에 관한 것이다.
락토바실러스, 프로바이오틱, 박테리아, 게놈 DNA, 알레르기

Description

인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 프로바이오틱 그램-양성 박테리아{PROBIOTIC GRAM-POSITIVE BACTERIA FOR THE PROPHYLAXIS, SUPPRESSION, OR ELIMINATION OF ALLERGIC REACTIONS IN HUMANS}
본 발명은 인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 약제에 관한 것이다.
식물의 화분(고초열) 또는 다른 구성요소, 고양이 털과 다른 동물 털, 집먼지 진드기 분비물을 포함한 먼지, 곤충 독, 우유나 견과류와 같은 식품, 또는 향수 및 다른 화장품 구성요소와 같은 물질에 대한 알레르기 반응이 잘 알려져 있으며, 점점 많은 사람에게 문제가 커지고 있다.
그 원인은 인체 자체의 면역 시스템이 이러한 물질이 기생충과 같은 실제로 해로운 침입자인 것처럼 상기 물질에 반응하기 때문이다. 또한, 그 반응 정도는 엄청나다.
이러한 자기면역 반응 동안에, 백혈구, 림프구는 중요한 역할을 한다. 림프구의 한 형태는 T 림프구 또는 헬퍼 세포(TH 세포)인데, 이들은 면역 반응을 조절 하기 위하여 다양한 매개체인 사이토카인을 분비한다. 첫째로는, 알레르기 반응을 감소 또는 예방하는 사이토카인이 있고, 둘째로는 비만 세포와 같은 행위자 세포(actor cell)에 대한 조정자로서 자극 효과를 가짐으로써 염증, 즉, 알레르기 반응을 유발하는 다른 사이토카인이 있다. 이러한 효과에 따라, 모든 TH 세포는 2개 군, 즉 TH1 및 TH2 세포로 분류된다. TH1 세포는 γ-인터페론(IFN-γ) 또는 인터루킨-2(IL-2)와 같은 항알레르기 사이토카인을 포함한다. TH2 세포는 인터루킨 IL-3, IL-4, IL-5 및 IL-10과 같이 알레르기 반응을 유발하는 매개자를 포함한다. 인터루킨-4는 비만 세포를 자극하여서 항체 면역글로불린 E형(IgG)을 형성하는데, 이는 알레르기에 매우 다량으로 존재한다.
TH1 세포 및 TH2 세포 수의 비는 침입한 병원체에 대한 신체 면역 반응에 결정적이다. 이는 건강한 사람에서보다 알레르기 반응을 갖는 환자에게서 유의하게 낮다. 신생아 또는 미숙아 역시 매우 낮은 수치를 가져서 엄마의 유기체가 유아 세포를 실수로 공격하지 않는다고 알려져 있다.
그러므로, TH1-TH2 균형은 각 인간의 중요한 특징이고, 또한 점점 잘 널리 알려지고 있다.
지나친 위생 및 전염성 질병 감소의 결과로서 매우 어린 유년시절의 장내 세균총의 변화 및/또는 박테리아 자극의 부족이 상기 균형 수치로부터 벗어나게 하는 소인을 발생시키고, 따라서, 알레르기 과민성을 일으킨다고 일반적으로 생각된다.
따라서, 심지어는 유아에서도 알레르겐(allergen) 침입은 콧물 및 점막 부종, 심지어는 체온 상승과 같은 염증 반응을 야기할 수 있다.
발현 증상을 제거하거나 억제하는 많은 약제가 알려져 있다. 이들은 종종 매우 고가이고 많은 바람직하지 않은 많은 부작용을 유발하며 환자가 지속적으로 섭취해야 하는 단점을 갖는다.
이러한 배경에 대하여, 본 발명의 목적은, 이미 공지되어 있으며 산업적 규모로 생산될 수 있어서 쉽게 구입 및 가공가능하여 저 비용을 발생시키고 건강한 사람에서도 한계 양으로 이미 존재하여서 특정 한도에서는 인간 유기체에 의해 제거가능하고 조정자에 의한 유발 단계를 제외한 증상 단계에서는 알레르기 반응을 공격하지 않는 활성 물질을 밝히는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 프로바이오틱(probiotic) 그램-양성 박테리아가 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한(viable) 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 존재하는 약제를 제안한다.
"프로바이오틱" 특성은 2개의 미생물이 다른 상대방에게 해를 끼치지 않으며 한 상대방의 이익을 위해 공존하는 것으로 [브록하우스(Brockhaus)]에 설명되어 있다. 본 발명의 경우에, 제 2 미생물, 즉 박테리아는 인간 유기체에 대해 사용된다. 박테리아 그 자체는 해롭지 않으므로 생존가능한 채로 있다. 이는 경구 투여시에 가능한한 많은 박테리아가 산, 효소 및 다른 정장제를 갖는 위를 무사히 통과한다는 사실을 포함한다.
"프로바이오틱"이란 용어는 인간에 대한 불리한 효과가 무시할 수 있거나 또는 적어도 매우 적고, 유용하다고 분류되는 효과가 주로 발생함을 또한 의미한다. "프로바이오틱 물질"이란 용어는 충분량으로 섭취될 때 숙주 유기체에 대해 건강-증진 효과를 갖는 미생물 제제를 의미한다. 프로바이오틱 유산균(락토바실러스)이 가장 오랫동안 사용되어 왔다. 프로바이오틱 물질은 특수하게 제조된 식품으로 또는 약제 형태로 투여될 수 있다.
프로바이오틱 물질의 건강-증진 효과는 각 경우에 균주-특이적이다. 근거 중심적 의학에 따르면, 락토오스 분해를 명백히 촉진하고 장의 병원성 미생물을 억제하며 설사를 제한 또는 억제하는 프로바이오틱 박테리아 균주가 알려져 있다.
다른 박테리아 균주는 전염으로부터의 보호를 증가시키고, 콜레스테롤 수치를 낮추며, 결장암 위험도를 감소시킨다.
이러한 효과는 광범위한 적용 이전에 생체외에서 성공적으로 증명되었다. 따라서, 일련의 실험실 실험에 의해 본 발명의 건강-증진 효과를 확인하는 것은 합법이다.
하기에 기재된 실험에 의해, 인간 혈구(PBMC-말초혈액 단핵세포) 분획으로부터 어떠한 사이토카인이 특정 조건하에서 방출되는지가 측정되었다. 첫번째 일련의 실험을 위해서 상기 혈구는 건강한 사람의 혈액으로부터 단리되고, 두번째 일련의 실험을 위해서는 집먼지에 알레르기를 갖는 알레르기 환자의 혈액으로부터 단리되었다. 자극을 위해 황색포도상구균 장관독 A형(SEA) 및 추가적인 일련의 실험에서는 진드기(Dermatophagoide: Dpt)가 추가되었는데, 집먼지 알레르기 환자는 일반적으로 이들에도 알레르기를 갖기 때문이다. 이에 의해, 알레르겐 물질의 침입이 시뮬레이션된다.
γ-인터페론은 TH1 반응에 대한 대용으로 측정되었다. TH2 패턴은 분비된 인터루킨 4 및 5(IL-4 및 IL-5)에 의해 기록되었다. 알레르기 질환이 널리 퍼지는데 관련될 수 있는 인자는 유년기에 장내 세균총의 변화 또는 박테리아 자극의 부족을 포함하는 것으로 생각된다. TH2 사이토카인은 IgE 생성을 증가시키고, 비만 세포를 자극한다. 반면, TH1-사이토카인인 γ-인터페론(IFN-γ)은 IgE 합성을 억제하는데 일조한다. 이러한 방식으로, "TH2에 대한 TH1" 발현의 불균형은 알레르기 질환을 유발하고 유지하는데 일조할 수 있다. 장내의 천연 세균총의 일부를 형성하는 락토바실러스 박테리아는 알레르기 형질발현의 빈도 및 중증도를 감소시키고 TH1/TH2 반응을 조정하는 것으로 생각된다. 작용 메카니즘은 아직 해명되지 않았다.
목표: 본 실험의 목표는 건강한 사람 및 집먼지 진드기 알레르기를 갖는 환자의 TH1 및 TH2 유형 사이토카인의 생성에 대한 프로바이오틱 박테리아의 영향을 결정하고, 황색포도상구균 장관독 A(SEA) 및 세로무늬 먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus: Dpt)에 대한 TH1/TH2 반응에 있어서 박테리아 게놈 DNA 효과의 분자상 근거를 설명하며, 이를 생존 박테리아 효과와 비교하는 것이다. 방법: 건강한 제공자의 PBMC와 비교되는 집먼지 진드기 알레르기를 갖는 환자의 PBMC를 SEA 및 Dpt 알레르겐과 함께 또는 이들없이 24 및 48시간동안 항온처리하였다. 24시간동안 배양 및 항온처리된 물질에 동시에 첨가되는 생존 프로바이오틱 박테리아에 의한 예비 항온처리의 효과 뿐만 아니라, 이들의 게놈 DNA의 영향을 TH1/TH2 사이토카인 생성 측정에 의해 평가하였다.
결과
시험된 생존가능한 그램-양성 프로바이오틱 박테리아 및 이들의 게놈 DNA는 이들이 TH2 사이토카인의 SEA 및 Dpt-자극된 분비를 억제하고(EL4 및 EL5) IFN-γ 자극을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 이러한 효과는 투약량 및 선택된 박테리아 균주 둘다에 좌우된다. 대조군인 그램-음성 대장균(Escherichia coli) TG1에 의해서는 유의한 억제가 유발되지 않았다. 프로바이오틱 박테리아는 특히 SEA 및 Dpt에 의한 재자극 이후에, 알레르기 PBMC로부터 IL-4 사이토카인 생성을 감소시켰고, 건강한 사람에게서는 더 효과적으로 감소시켰다. 반면, 건강한 피험자에 있어서 IL-5 억제는 더욱 명확하게 현저하였다. 박테리아 DNA는 또한 IL-4 및 IL-5의 방출을 다소 낮은 정도로만 억제하였다. EL4의 억제는 건강한 피험자에서보다 알레르기 환자의 PBMC의 경우에 더욱 현저하였는데, 이는 EL5의 경우에서도 마찬가지이었다.
1. 도입부
인간 실험 연구가 유전자 조건이 장관 점막의 면역 반응에 일조하고 장 박테리아가 알레르기 질환의 발병기전에 일조한다는 것을 보여주었으나, 알레르기 질환의 원인에 대한 교지는 불명확하다. 일부 연구는 TH2 사이토카인, 특히 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13이 IgE의 생성을 조절하고 비만 세포를 자극함으로써 발병기전에서 중요한 역할을 함을 시사한다. TH2 림프구에 의한 높은 수준의 IL-4, IL-5, IL-9 또는 IL-13의 생성은 알레르기 반응의 발현 및 진행에서 결정적인 역할을 할 수 있다; 대조적으로, IFN-γ, 일명 TH1 사이토카인은 IgE 합성을 억제하는 능력을 갖는다. 불완전한 IFN-γ 발현은 종종 IgE-매개된 알레르기로 연결된다. TH1/TH2 사이토카인 균형의 조절곤란은 기관지 천식 또는 아토피 피부염과 같은 질병에서 알레르기 염증 과정을 유발하고 유지하는데 큰 원인이 될 수 있다.
특히, 신생아의 TH2 사이토카인의 프로파일, 즉, TH1/TH2 균형을 정상적으로 감소시키는 노화; 현대적인 위생 규제; 식품의 광범위한 무균화 및/또는 인공 분유를 수유함으로써 야기되는 신생아의 장내 세균총의 변화가 TH1/TH2 균형 변화에 주요한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 이 분야에서 얻어진 지식은 많은 새로운 요법에 대한 배경을 만들었다. 하나의 접근법은 프로바이오틱 박테리아가 TH1/TH2 균형을 조정하기 때문에, 단순히 프로바이오틱 박테리아를 사용하여 지나치게 대규모로 형성된 상기 사이토카인을 감소시키거나 또는 충분량으로 형성되지 않은 상기 사이토카인을 재생시키는 것이다.
프로바이오틱 박테리아는 일반적으로 안전하다고 분류되며, 인간 또는 동물에 의해 섭취되었다. 락토바실러스 및 비피도박테리움 박테리아는 인간 위장관에 가장 널리 분포하는 미생물이다. 프로바이오틱 박테리아의 면역-자극 효과, 특히 항알레르기 효과에 관심이 많아지고 있다. 알레르기 질환에서 박테리아의 중요 역할은 프로바이오틱 처리에 의해 장내 세균총을 조정함으로써 상기 불균형을 예방 또는 치료할 가능성을 높이는 것이다. 프로바이오틱 박테리아는 내인성 세균총 또는 면역 시스템의 조정에 의해 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 단지 국소적인 효과와는 대조적으로 점막 면역 시스템을 통해 건강을 증진시키는 박테리아에 대한 "생체면역 물질(immunobiotics)"이라는 새로운 표현을 사용하는 것이 제안되었다. 염증-증진 사이토카인의 분비, 림프구 재생 및 질소 산화물의 형성과 같이 프로바이오틱 물질에 대한 다양한 면역 반응이 보고되었다. 또한, 전체 세포, LGG 또는 LGG의 DNA에 의해 분비되는 일부 가용성 구성성분, 락토바실러스의 펩티도글리칸 또는 지질타이코산과 같은 세포벽 구성성분이 염증 면역 반응 및 생체면역 활성을 유발한다고 나타났다. 장관 투여되는 생존 박테리아 뿐만 아니라 단리된 프로바이오틱 DNA는 피하 주사되는 경우에도 활성임이 증명되었다.
박테리아 DNA의 비변성 CpG 모티프가 마우스의 B-세포에 대해 분열유발성이고, 대식세포 및 수상세포(dendritic cell: DC)에 의해 염증 사이토카인의 생성을 유발하는 것으로 보고되었다. 또한, CpG 올리고디옥시뉴클레오티드(ODN) 및 박테리아 DNA는 마우스의 B-림프구 및 자연 세포독성(killer) 세포에 의해 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 12(IL-12) 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 생성을 유발한다. 또한, CpG DNA는 T-헬퍼 세포 1 및 2에서 영향을 받지 않은 활성화된 T-세포의 분화 및 B-세포의 증식을 유도한다. 특이적 CpG ODN(D-유형)은 원형질 수상세포에 의한 α-인터페론(IFN-α)의 생성 및 NK 세포의 활성화에 특히 효율적인 반면, 다른 ODN(K 유형)은 B 세포의 특히 효과적인 활성화제이다. 톨유사(toll-like) 수용체 9(TLR9)는 CpG DNA에 의한 세포 활성화를 유발하는데 있어서 결정적인 역할을 한다는 것이 최근에 밝혀졌다.
난 알부민에 민감성인 마우스에서 실시된 실험은 위에 유산균을 투여한 후에 특정 IgE 및 TH2 프로파일-의존적 염증 반응이 억제되었음을 보여주었다. 또한, 최근 보고서는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG가 사이토카인의 신호화 작용에 합쳐진 전사인자를 활성화시킴으로써 선천성 면역 반응을 유발할 수 있는 방식과 유사한 방식으로 인간 피험자의 알레르기 질환 증상을 감소시킬 수 있음을 시사하였다. 수유하는 엄마 및 신생아에게 상기 박테리아 균주를 투여하면 아기 아토피 습진의 위험도를 억제할 수 있었다. 생체외 실험은 각종 유산균에 의해 건강한 제공자의 PBMC 또는 단핵구를 자극하면 중요한 프로-TH1 사이토카인으로서 알레르기 질환 발현의 조절에 관련된 IL-12 분비를 유도함을 보여주었다. LAB가 알레르기 질환의 발현 개시를 초래하는 TH2 사이토카인의 생성에 영향을 주는 작용 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 비피도박테리움 및 락토바실러스로부터의 DNA 염색체에 비변성 DNA 서열(CpG 모티프)이 존재하는 점을 고려하여, 본 연구에 서 락토바실러스 및 비피도박테리움 박테리아의 4개 균주 및 이들의 염색체 DNA가 IL-4, IL-5 및 IFN-γ 생성에 대해 갖는 효과를 건강한 피험자 및 알레르기 피험자의 SEA- 및 Dpt-자극된 PBMC에 의하여 연구하기로 결정하였다. 조사된 락토바실러스 및 비피도박테리움 박테리아는 항-TH2 활성 및 프로-TH1 사이토카인, IFN-γ을 나타냈다.
2. 방법 및 물질
2.1 박테리아 배양
본 연구에서 하기 박테리아 균주를 사용하였다: 락토바실러스 람노서스 GG(92164), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)(PA 16/8), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)(MG 20/5), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum)(SP 07/3) 및 LgsB.bB.l(락토바실러스 가세리, 비피도박테리움 비피둠 및 비피도박테리움 롱굼의 혼합물). 37℃에서 16시간동안 0.05% L-시스테인에 의해 보충된 비피도박테리움 및 락토바실러스 균주를 사용하였다(30% 글리세롤에서 -80℃로 혐기 보관된 균주의 0.02% 접종원)(기밀구획실(airlock)을 갖는 혐기 시스템, MACS-VA500 웍스테이션(Workstation) 및 MRS 매질(MRS; 머크(Merck), 독일 다름스타트)중 기밀구획실, 돈 휘틀리 사이언티픽 리미티드 유케이(Don Whitley Scientific Limited UK)). 채취하여서 PBS에서 세척하기 이전에, 새로 준비된 배양물의 연속된 용액을 MRS-한천 배지를 함유한 플레이트에 도말하고, 계수를 위해 배양하였다. 프로바이오틱 박테리아 군의 집락형성단위(CFU ㎖-1) 의 계수는 여러 차례의 10배 용액을 플레이트에 도말하여서 유도하였다. 플레이트를 24 내지 48시간동안 37℃에서 혐기적으로 항온처리하였다. 이어서, 박테리아를 PBS에 의해 3회 세척하고, 1010, 107 및 101 CFU㎖-1의 최종 농도로 조정하였다. 박테리아 현탁액을 30% 글리세롤을 함유한 MRS 용액에서 -80℃로 보관하였다. 모든 박테리아 균주에 대하여, OD600 vs 새로 제조되어 여러 차례 용해된 배양물의 한천 플레이트 계수를 기록하여서 정규 증가 곡선을 작성하였다. 새로 제조된 배양물중 생존가능한 박테리아 계수를 계산하기 위하여 98.5% 보다 큰 모든 수치를 가진 로그 출력정보에 의해 곡선을 정합(fitting)시켰다(데이터는 도시되지 않음). 그램-음성 대장균 TG1(제품번호 BU-00035)는 맥심 바이오텍 잉크.(Maxim Biotech Inc.)에서 구입하고, 37℃에서 18시간동안 LB-배지에서 증식시키고, 상기와 같이 채취하였다.
2.2 박테리아로부터 게놈 DNA 의 추출
프로바이오틱 박테리아의 순수 배양물로부터의 게놈 DNA는 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올(25:24:1)로 추출하여서 정제하였다. 세포를 완전히 파괴하기 위하여, 효소 용해(enzymatic lysis)를 2시간으로부터 7시간으로 연장함으로써 상기 방법을 약간 변형하였다. 이어서, DNA를 침전시키고, 차가운(-20℃) 95% 에탄올로 무균화하고, 2차 증류수(ddH2O)에 용해하였다. 모든 DNA 추출물의 농도 및 순도는 OD260흡수도 또는 OD260 /280 및 OD260 /230의 비를 측정하여서 유도하였다. OD260 /280 비>1.8 및 OD260 /230>2를 갖는 DNA만을 사용하였다. DNA는 트리톤(Triton)X-114D에 의 해 내독소로부터 정제하고, 또한 리물루스(limulus) 변형세포 시험(QCL-1000, 캄브렉스(CAMBREX), 독일)을 이용하여 지질다당체(LPS) 함량에 대해 조사하였다. LPS 함량은 0.01U 내독소 ㎍-1 보다 적었다.
DNA 추출물에서 LPS 또는 다른 박테리아 오염물의 생체활성도를 결정하기 위하여, DNA를 DNase I(시그마(Sigma))에 의해 파괴하였다. 75μ㎖-1 농도를 갖는 파괴된 DNA가 첨가될 때 기저 수준 미만의 PBMC에 의한 사이토카인의 명백한 억제는 없었다(DNA 파괴 처리 전에 측정함).
2.3 PBMC 단리 및 배양
2.3.1 프로바이오틱 박테리아와 함께 PBMC 의 예비 항온처리 및 SEA 및 Dpt 에 의한 추가 자극
연구를 위해 알레르기 환자 8명과 건강한 제공자 8명을 모집하였다. 모든 피험자는 조사에서 인간 피험자의 이용에 대해 키일(Kiel) 대학의 윤리위원회에서 요구하는 바와 같이 본 연구에 등록하기 이전에 구두 및 서면 동의서를 제출하였다. 정맥혈을 제공자로부터 헤파린첨가된 정맥채혈관으로 옮겨서 0.9% NaCl로 1:1 희석하였다. 이어서, 헤파린첨가된 희석 혈액의 새로운 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 밀도 증가(1.077g㎖-1)에 따라 원심분리하여서 단리하였다(림포프레프(Lymphoprep), AXIS-SHIELD PoC AS, 노르웨이 오슬로). 세포를 10% (v/v) 열-활성화된(56℃, 1시간) 소태아 혈청, 젠타마이신(50㎍㎖-1)(시그마), 페니실린 스트렙 토마이신(1%) 및 소듐 피루베이트 용액(0.23mmolℓ-1)(시그마)으로 보충된 RPMI-1640 배양 배지(시그마, 독일 뮌헨)에 유화시켰다(완전 배지로 주문). 모든 구성성분은 LAL에 의해 요구되는 바와 같이 내독소 시험된 것을 구입하였다. 세포를 24웰을 갖는 용기에서 2 x 106 세포㎖-1의 농도로 완전 배지중에서 배양하였다. 동시에, 자극을 위해 생존 프로바이오틱 박테리아 4개 균주 및 그램-음성 박테리아(대장균 TG1)를 배양물에 첨가하였다. 박테리아 계수에 요구되는 바와 같이, 프로바이오틱 및 다른 박테리아는 배양물에 첨가하는 시점에 살아있었다. 배지만으로 배양된 세포가 비-자극된 대조군이었다. 200㎕/웰의 최종 부피를 갖는 배양물로서 IL-4 및 IL-5에 대해 실시된 투약량 의존성 시험은 단핵세포당 0.025, 0.25, 1, 2, 5, 10 및 25 박테리아에 상응하는 2 x 106 단핵세포 및 5 x 104, 5 x 105, 2 x 106, 5 x 106, 2 x 107 및 5 x 107 박테리아/㎖를 갖는 바닥이 평평한 96-웰 미량역가판(눈(Nune), 덴마크 로스킬라이드)에서 준비하였다. 상기 시험은 10:1의 비(PBMC에 대한 박테리아)에 상응하는 2 x 107 CFU 박테리아/㎖에서 최대 억제가 관찰되었음을 나타내었다. 이 농도는 다른 실험에서 사용하였다. PBMC 및 박테리아의 최종 비(PBMC에 대한 박테리아의 비)는 건강한 제공자 및 알레르기 환자에 대하여 10:1이었다. 대조군 처리를 위해, 배양 배지만을 PBMC 용액에 첨가하였다. 이어서, 및 37℃에서 3시간 항온처리한 후에 PBMC를 SEA(2㎍㎖-1) 또는 Dpt(2㎍ 투약량 ㎖-1 에 해당하는 2000SQ-E ㎖-1)에 의해 48시간동안 37℃에서 5% CO2-습윤된 항온처리기에서 추가로 자극하였다. 모든 실험은 2회 반복하여(duplicate) 실시하였다. 48시간동안 항온처리한 후, 배양 배지를 4℃에서 20분동안 1,000xg으로 원심분리하였다. 세포를 함유하지 않은 상청액을 0.2㎛ 세공 크기를 갖는 필터(밀리포어(Millipore), 독일)에 통과시켜서 무균화하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 세포의 생존도는 박테리아와 함께 항온처리하기 전후에 트립판 블루 배제에의해 결정하였다.
2.3.2 SEA , LPS 및 게놈 DNA 에 의한 자극
건강한 제공자 4명의 헤파린첨가된 말초 혈액으로부터 새로운 PBMC를 밀도 증가(1.077g㎖-1)에 따라 원심분리하여 단리하였다(림포프레프, AXIS-SHIELD PoC AS, 노르웨이 오슬로). 세포를 10% (v/v) 열-활성화된(56℃, 1시간) 소태아 혈청, 젠타마이신(50㎍㎖-1)(시그마), 페니실린 스트렙토마이신(1%) 및 소듐 피루베이트 용액(0.23mmolℓ-1)(시그마)으로 보충된 RPMI-1640 배양 배지(시그마, 독일 뮌헨)에 유화시켰다(완전 배지). 모든 구성성분은 내독소 시험된 것을 구입하였다. 200㎕/웰의 최종 부피를 갖는 배양물로서 IL-4 및 IL-5에 대해 실시된 모든 투약량 의존도 시험은 2 x 106 단핵세포 및 ㎖당 5, 10, 25, 50, 75 및 100㎍의 게놈 DNA를 갖는 바닥이 평평한 96-웰 미량역가판(눈, 덴마크 로스킬라이드)에서 준비하였다. 이들은 75㎍ DNA ㎖-1에서 최대 억제가 관찰될 수 있음을 나타내었다. 상기 농도는 다른 실험에서 사용하였다. 세포는 24-웰 플레이트(눈, 덴마크 로스킬라이드)에서 2 x 106 세포㎖-1의 농도로 완전 배지중에서 배양하였다. 동시에, 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA(75㎍㎖-1), 송아지로부터의 게놈 DNA(75㎍㎖-1 시그마, 독일 뮌헨), SEA(2㎍㎖-1) 및 대장균의 LPS(20㎍㎖-1, 시그마, 독일 뮌헨)를 배양물에 첨가하고, 24시간동안 37℃로 5% CO2-습윤에서 항온처리하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였다. 24시간동안 항온처리한 후, 세포를 함유하지 않은 상청액을 모으고, 4℃에서 20분동안 1,000xg로 원심분리하고, 0.2㎛ 세공을 갖는 필터(밀리포어, 독일)에 통과시켜서 무균화하고, 분석할 때까지 분액물로 -80℃에서 보관하였다. 세포의 생존도는 게놈 DNA와 함께 항온처리하기 전후에 트립판 블루 배제에 의해 결정하였다. 모든 실험에서 PBMC의 95 내지 98%가 생존하였다. 모든 사이토카인에 대해 실시된 투약량 의존도 실험은 최대 억제가 75㎍㎖-1 농도에서 관찰되었음을 나타내었다. 상기 농도는 다른 실험에서 이용하였다.
2.4 효소- 결합된 면역흡착 분석( ELISA )에 의한 사이토카인의 조사
IL-4, IL-5 및 IFN-γ의 농도는 세포를 함유하지 않은 상청액중에서 특수 ELISA(BD OptEiATM 세트 인간 IL-4, 5 및 IFN-γ, 독일 하이델베르그)에 의해 정량화하였다. 조사의 검출 한계는 IL-4에 대해서는 0.5㎍㎖-1, IL-5에 대해서는 0.5㎍ ㎖-1 및 IFN-γ에 대해서는 1㎍㎖-1이었다. 샘플의 광학 밀도값을 ELISA 플레이트 판독기의 450 및 570nm에서 읽었다. 실험을 적어도 2회 되풀이하고, 3회 반복하여 실시하였다.
2.5 통계 분석
시험의 실험 데이터는 평균값±S.E.M.로 출력되었고, t-시험에 의한 파라미터를 갖지 않는 통계 분석을 실시하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
락토바실러스와 비피도박테리움은 IL-4 및 IL-5을 억제하고, 건강한 제공자의 SEA 또는 Dpt-자극된 PBMC에 의해 IFN-γ 생성을 유발하였다. 이는 황색포도상구균 초항원이 건강한 기증자의 PBMC로부터 고 농도의 IL-4 및 IL-5를 유발하고, 열-사멸된 유산균은 2-유형 사이토카인 프로파일의 분비를 억제할 수 있음을 보여주었다. 또한, 상기 연구는 알레르기 환자가 증가된 함량의 IL-4 및 IL-5를 가졌음을 보여주었다. 세로무늬 먼지 진드기, Dpt(83.8%) 및 큰다리 먼지 진드기(Dermatophagoides farinae), Df(78.4%)가 알레르기 비염을 갖는 환자에 있어서 가장 널리 퍼진 원인이 되는 알레르겐이다. 이에, 본 발명자들은 또 다른 초항원인 황색포도상구균 장관독 A(SEA) 및 Dpt을 이용하여 상기 관찰결과를 확인하였다.
락토바실러스 및 비피도박테리움 박테리아의 생존 균주가 PBMC와 함께 예비 항온처리될 때, SEA 및 Dpt에 의한 IL-4의 생성은 양성 대조군(락토바실러스 및 비 피도박테리움과 함께 예비 항온처리를 하지 않음)에 의해 유발된 것에 비해 크게 감소되었다. 흥미롭게도, PBMC가 그램-음성 대조군 균주 TG1과 함께 예비 항온처리될 때에는 유의한 억제가 관찰되지 않았다(도 1). 4개의 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주 또는 TG1중 어떠한 것도 기본적인 IL-4 생성을 유발하지 않았음에도 불구하고, 모든 4개의 균주는 IFN-γ의 생성을 유도하였다. SEA 및 Dpt에 의해 PBMC가 자극될 때, IFN-γ 방출의 농도는 또한 크게 증가하였다. 락토바실러스 및 비피도박테리움 박테리아를 이용한 경우 뿐만 아니라 TG1을 이용한 경우에서도 상승작용 효과가 관찰되었다. 결과적으로, 락토바실러스와 비피도박테리움은 TH1 및 TH2 사이토카인 둘다의 분비에 대해 반대 방향으로 영향을 줄 수 있는 것으로 보인다.
사이토카인의 생성은 시간 및 투약량에 좌우된다.
4개의 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주를 사용하여 실시된 다른 실험은 TH2 사이토카인의 억제가 시간 및 투약량에 좌우됨을 보여주었다. SEA를 첨가하기 이전에 PBMC가 프로바이오틱 박테리아에 의해 자극될 때, TH2 사이토카인 생성에 대한 증가 억제 영향은 PBMC에 대한 박테리아의 비에 따라 증가하였다. 최대 증가 억제는 10:1의 비(PBMC에 대한 박테리아)에 상응하는 2 x 107 CFU 박테리아 ㎖-1에서 관찰되었다(도 2, A 및 B).
상기 효과는 IL-4 및 IL-5의 생성에 대해서도 또한 관찰되었다. 예컨대, L. 가세리 균주의 경우, IL-4 생성의 증가 억제 비율이 SEA에 반응하여 40.19% ± 3% (1:1 비)로부터 54.22% ± (10:1 비)로 증가하였다. IL-5 생성의 억제 비율은 43.77% ± 8% (1:1 비)로부터 73.17% ± 5% (10:1 비)로 증가하였다. 또한, 건강한 제공자의 PBMC중에서 Dpt에 반응한 IL-4 생성의 억제 비율은 34.61% ± 4% (1:1 비)로부터 47.33% ± 5% (10:1 비)로 증가하였다. IL-5 생성의 증가 억제 비율은 45.72% ± 4%로부터 77.59% ± 6%로 증가하였다. TH2 사이토카인과 대조적으로, 본원에서 시험된 균주는 IFN-γ의 기본적인 생성을 유도하였는데, 이는 박테리아/세포 비에 좌우된 것으로 보인다. 이는 프로바이오틱 박테리아가 SEA에 의한 자극에 반응하여 IFN-γ의 생성에 크게 영향을 주는 것을 보여줄 수 있다는 것에 주목할만하다(도 1과 2, C).
IL -4 및 IL -5의 생성에 대한 생존 프로바이오틱 박테리아의 시간-의존적 증가-억제 효과
건강한 제공자의 PBMC(2 x 106㎖-1에서 n=4)를 SEA(2㎍/㎖)에 의해 자극하였다. 단핵세포를 SEA 자극전에 항온처리하기 이전에 L.GG 균주(10:1 비)와 함께 1.3 및 5시간동안 예비 항온처리하거나 또는 이들을 L.GG 균주 및 초항원에 의해 동시에 자극하거나 또는 SEA 자극한지 1.3 및 5시간 후에 L.GG를 첨가하고, 세포 배양물을 24, 48 및 72시간동안 예비 항온처리하였다. 전술한 시간에서, 세포를 포함하지 않은 상청액을 채취하고, 원심분리 및 무균화 이후에 -20℃에서 보관하였다. IL-4 및 IL-5의 농도를 측정하고, 최대 증가 억제는 SEA에 의한 자극 이전에 생존 박테리아와 함께 PBMC를 3시간 항온처리한 경우에 관찰되었음을 보여주었다. 마찬가지로, 최대 증가 억제는 48시간 항온처리에서 관찰되었다(데이터는 도시되지 않음). 이러한 시간-간격은 다른 실험에서 사용하였다.
락토바실러스 및 비피도박테리움은 알레르기 환자의 알레르겐-자극된 PBMC로부터의 TH2 사이토카인의 생성을 억제한다. 이어서, 락토바실러스 및 비피도박테리움이 TH1와 TH2 사이토카인 간의 불균형을 보정할 수 있는 능력은 알레르겐에 의한 자극의 더욱 관련된 모델에서 평가하였다. 환자(세로무늬 먼지 진드기에 대한 알레르기)의 PBMC가 락토바실러스 및 비피도박테리움의 다양한 생존가능한 균주와 함께 예비 항온처리될 때, 세로무늬 먼지 진드기 알레르겐에 의한 특이적 자극 이후에 유발된 IL-4 및 IL-5의 생성은 특히 박테리아/세포의 비에 의존하는 방식으로 크게 감소하였다. IL-5에 대한 이러한 효과는 조사된 프로바이오틱 박테리아의 균주 유형과 무관하다. IL-5의 억제는 예컨대, B.b.의 경우에는 57.31% ± 4.52%에 해당하고, B.l.의 경우에는 63.77% ± 5%에 해당하였다 (도 1). 또한, 알레르기 환자의 PBMC가 SEA에 의해 자극될 때에도 유사한 결과가 관찰되었다. 이 경우, IL-4 및 IL-5 생성이 세로무늬 먼지 진드기를 사용하여 관찰된 생성에 비해 매우 높았지만(도 1), 시험된 프로바이오틱 박테리아는 IL-5 분비를 L.GG에 대해서는 71.29% ± 4.10% 및 L.가세리에 대해서는 77.63% ± 3.52% 감소시켰다(도 1). 락토바실러스 및 비피도박테리움과의 동시 항온처리(coincubation)은 IFN-γ 생성을 크게 증가시켰다(도 1). 이러한 방식으로, 알레르기 환자의 PBMC의 IFN-γ 생성 증가 및 TH2 사이토카인의 생성 감소에 의해, 락토바실러스 및 비피도박테리움은 항-TH2 활성을 보이는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 알레르기 피험자의 PBMC에 의한 IL-4 생성에 대한 락토바실러스 및 비피도박테리움의 증가-억제 효과가 건강한 피험자에서보다 더 크다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다. 이와 대조적으로, 건강한 제공자의 PBMC에 의한 IL-5 생성에 대해 상기 박테리아가 갖는 증가-억제 효과는 알레르기 피험자에서보다 크다(도 1). 이와 대조적으로, 알레르기 피험자의 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-4 생성에 대해 B.l. 및 LgsBbBl이 갖는 증가-억제 효과는 건강한 피험자로부터의 것보다 컸고(p<0.05), 알레르기 피험자의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-4 생성에 대해 L.GG, B.b. 및 B.l.이 갖는 억제 효과는 건강한 피험자에서보다 컸다(p<0.01). 이와 대조적으로, 건강한 피험자의 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-5 생성에 대해 L.가세리, B.b. 및 B.l.이 갖는 증가-억제 효과는 알레르기 피험자에서보다 컸고(p<0.05), 건강한 피험자의 SEA-자극된 PBMC로부터의 IL-5 생성에 대해 LgsBbBl이 갖는 억제 효과는 알레르기 환자에서보다 컸다(p<0.01, 도 1).
프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA는 건강한 피험자의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-4 및 IL-5의 생성을 시간 및 투약량에 따라 억제한다.
동물 DNA 및 LPS와 비교되는 박테리아 DNA의 증가 억제 효과를 평가하기 위하여 4명의 건강한 피험자의 PBMC를 프로바이오틱 박테리아의 4개 균주인 L.GG, L.가세리, B.b., B.l. 및 LgsBbBl(L.가세리, B.b. 및 B.l.의 혼합물)로부터의 게놈 DNA, LPS 및 동물 DNA(송아지 흉선 DNA)와 함께 항온처리하였다. TH2 사이토카인의 억제를 BDoptEIA 시험 세트를 적용하여 관측함으로써 사이토카인의 생성을 증명 및 정량하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 프로바이오틱 박테리아의 DNA는 일반적으로 PBMC가 SEA 또는 Dpt 자극에 대한 반응으로 IL-4 및 IL-5을 생성하지 않도록 한다. 이와 대조적으로, LPS는 IL-4 및 IL-5의 생성을 감소시키지 않았다; 마찬가지로, LPS를 함유하지 않은 송아지 흉선 DNA는 IL-4 및 IL-5의 생성을 감소시키지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
건강한 피험자의 SEA -자극된 PBMC 에 의한 IL -4 및 IL -5의 생성에 대해 박테리아 DNA가 갖는 시간-의존적 증가-억제 효과
게놈 DNA에 대해 반응하는 시간 프로파일을 결정하기 위하여 몇몇 실험을 실시하였다. 건강한 제공자의 PBMC(n=4, 2 x 106㎖-1)를 SEA(2㎍㎖-1)에 의해 자극하고, SEA 자극 이전에 L.GG 또는 B.b.(30㎍㎖-1)의 게놈 DNA와 함께 1, 3 및 6시간동안 예비 항온처리하거나, 또는 게놈 DNA에 의해 동시에 자극하였다. 초항원 또는 게놈 DNA를 SEA 자극한지 1, 3 및 6시간후에 첨가하고, 세포 배양물을 24, 48 및 72시간동안 항온처리하였다. L.GG 및 B.b.의 게놈 DNA를 2개의 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주를 대표하는 것으로 선택하였다. 전술한 시간에서, 세포를 포함하지 않는 상청액을 채취하고, 원심분리 및 무균화후에 -80℃에서 보관하였다. IL-4 및 IL-5의 농도를 측정하고, 게놈 DNA 및 SEA와 함께 PBMC를 항온처리한지 t0 시간에 최대 증가 억제가 관찰되었고, 마찬가지로 24시간 항온처리후에 최대 억제에 도달하였음을 나타내었다. 이 시간은 다른 실험에서 사용하였다. B.b.의 게놈 DNA는 L.GG의 게놈 DNA보다 더 효과적인 IL-4 억제제로 확인되었다. 이와 대조적으로, L.GG의 게놈 DNA는 B.b.의 게놈 DNA보다 더 효과적인 IL-5 억제제임을 확인하였다.
건강한 피험자의 SEA -자극된 PBMC 로부터 IL -4 및 IL -5의 생성에 대해 박테리아 DNA 가 갖는 투약량-의존적 증가-억제 효과
건강한 피험자의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-4 및 IL-5 억제에 대해 박테리아 DNA가 갖는 증가-억제 효과를 조사하기 위하여 각 균주의 게놈 DNA를 다양한 농도, 특히 5 내지 105㎍㎖-1 범위의 PBMC 배양물에 도입하여서 IL-4 및 IL-5 생성에 대해 가장 큰 억제 효과를 갖는 투약량을 결정하였다(도 3). 상기 투약량 범위는 전술한 시험 결과를 기준으로 선택되었고, 이는 면역 세포에 의한 사이토카인의 생성이 3㎍㎖-1 이상의 대장균 DNA를 첨가한 후에 증명될 수 있음과 최적 자극은 >50㎍㎖-1 농도의 박테리아 DNA를 필요로 함을 나타내었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 게놈 DNA가 75㎍㎖-1 농도로 사용될 때에 IL-4 및 IL-5의 최대 억제가 관찰되었다. 사이토카인 반응의 3가지 다른 패턴이 명확하게 구별될 수 있었다.
게놈 DNA: 65㎍㎖-1 농도에서 EL-4 및 EL-5 생성을 억제하는 B.b.-DNA 및 L.GG-DNA를 예외로 하고 모든 균주는 75㎍㎖-1 농도에서 IL-4 및 IL-5의 생성을 억제하였다.
모든 게놈 DNA는 5 내지 45㎍㎖-1 범위의 농도로 첨가될 때에 IL-4 및 IL-5의 생성을 보다 낮은 정상 상태(steady-state) 수준으로 억제하였다. 이와 대조적으로, 모든 게놈 DNA는 85 내지 105㎍㎖-1 농도 범위로 사용될 때에 IL-4 및 IL-5 생성의 투약량-의존적 증대를 나타내었다. 다른 게놈 DNA에 비해, B.b. 및 L.GG DNA는 SEA 자극에 반응하여 IL-4 및 IL-5 생성의 더욱 효과적인 억제제인 것으로 나타났다. 또한, B.b.의 게놈 DNA는 105㎍㎖-1 농도에서 IL-5 생성에 대해 가장 낮은 억제 영향을 나타내었다.
알레르기 시험 피환자의 SEA -자극된 PBMC 에 의한 IL -4 및 IL -5 생성에 대해 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA 가 갖는 증가-억제 효과
프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA가 갖는 증가-억제 효과를 연구하기 위하여 L.GG DNA, Bl DNA 및 LgsBbBl DNA로부터의 75㎍㎖-1의 PBMC(2 x 106㎖-1)를 24시간동안 항온처리하였다. SEA 자극에 대한 반응으로서 IL-4 생성 억제의 3가지 다른 패턴이 명확하게 구별될 수 있었다: L-GG 및 LgsBbBl의 게놈 DNA는 가장 강한 억제 효과인 37.4% ± 4% 및 39.56% ± 5.1%을 각각 나타내었다. L.가세리 DNA는 가장 낮은 억제 효과(19.14% ± 2%)를 나타내었고, B.b.B.l.는 유사한 패턴(24.47% ± 3.28%)을 나타내었다. 역으로, L.가세리 DNA는 SEA 자극에 대한 반응으로서 IL-5 생성에 대해 가장 큰 증가-억제 효과(61.41% ± 3.74%)를 나타내었고, LgsBbBl DNA는 가장 낮은 억제(46.31% ± 4%)를 나타내었으며, L.GG, B.b. 및 B.l.의 게놈 DNA는 동일한 억제 패턴을 나타내었다(데이터는 도시되지 않음). 또한, 본 발명자들은 생존 박테리아와 함께 게놈 DNA의 억제 효과 및 SEA 자극에 대한 반응으로서 IL-4 및 IL-5 생성에 대해 게놈 DNA가 갖는 억제 효과를 건강한 피험자 및 알레르기 피험자 간에 비교하였다. 건강한 피험자 및 알레르기 피험자에 있어서 IL-4 생성에 대해 생존 박테리아가 갖는 증가-억제 효과는 이들의 게놈 DNA의 영향보다 크다. 이와 대조적으로, 알레르기 피험자의 게놈 DNA의 증가-억제 효과는 건강한 피험자에서보다 더 크다(L.가세리는 예외). 결과적으로, 게놈 DNA는 알레르기 피험자에서 SEA 자극에 대한 반응으로서 IL-4 생성을 감소시키는데 더 효과적이다.
요약하면, 건강한 피험자 및 알레르기 환자의 PBMC에서 SEA 자극에 대한 반응으로서 IL-5 생성에 대해 생존 박테리아가 갖는 증가-억제 효과는 IL-4 생성에 대해 갖는 효과와 동일하였다(예컨대, 생존 박테리아의 억제 효과는 건강한 피험자 및 알레르기 피험자 둘다에서 이들의 게놈 DNA의 억제 효과보다 더 컸다). 그러나, 건강한 제공자에서 IL-5 생성에 대해 게놈 DNA가 갖는 증가-억제 효과는 알레르기 피험자에서보다 더 컸다. 결과적으로, 게놈 DNA는 건강한 제공자에서 IL-5에 대해 더 효과적인 억제제이다. Dpt 자극과 관련하여, 알레르기 피험자의 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-4 생성에 대해 L.GG 및 LgsBbBl의 게놈 DNA가 갖는 억제 효과는 건강한 피험자의 경우에서보다 더 컸다(p>0.05). 유사한 패턴이 L.가세리, B.b. 및 B.l.의 게놈 DNA에서 얻어졌다. 또한, 건강한 피험자의 Dpt-자극된 PBMC로부터 IL-5 생성에 대해 L.가세리, B.b., B.l. 및 LgsBbBl의 게놈 DNA가 갖는 억제 효과는 알레르기 피험자의 경우에서보다 더 컸다. 그러나, 건강한 피험자에서 IL-5 생성에 대해 L.GG DNA가 갖는 증가-억제 효과는 알레르기 피험자에서와 동일하였다. 결과적으로, L.GG의 게놈 DNA는 건강한 피험자 및 알레르기 피험자의 Dpt-자극된 PBMC의 IL-5 생성을 동일한 방식으로 조절할 수 있다.
검토
알레르기는 소위 알레르겐(예: 화수분, 곤충, 독, 약품 또는 식품)이라고 불리우는 특정 물질에 대한 면역 시스템의 과민 반응이다. 일부 실험 연구는 알레르기 질환이 TH2 사이토카인을 상대적인 과량으로 하고 TH1 사이토카인을 부족하게 하여 TH1/TH2 사이토카인 균형 혼란과 관련될 수 있음을 보여준다. 실제로, IL-4, IL-5, IL-3 및 IL-9는 알레르기 반응을 유발하고 유지하는데 관련된다. TH1로부터 TH2로의 면역 반응의 이동은 알레르기 질환의 대부분 유형에서 매우 명확하기 때문에 TH2 유형 사이토카인은 알레르기 질환에 우선적으로 관련된 것으로 생각되었다. 프로바이오틱 박테리아에 의한 알레르기 환자의 치료에서 얻어진 고무적인 결과에 의해 본 발명자들은 TH1/TH2 사이토카인과 알레르기 간의 상호작용을 밝혀낼 수 있었다. 결과적으로, 알레르기 요법에서 한가지 방법은 TH1/TH2 균형을 회복하기 위하여 프로바이오틱 박테리아를 투여하여서 TH1/TH2 균형을 변화시키는 것이다. 생 존 또는 사멸한 프로바이오틱 박테리아가 IL-4의 양을 유의하게 감소시키고 SFN-γ 사이토카인 양을 증가시킬 수 있는 능력에 대한 결과가 특히 흥미롭다. 또한, 최근 연구는 프로바이오틱 박테리아의 보호 효과가, 상피 투과성을 변화시키고 병원성 박테리아 침입으로부터 보호하는 가용성 인자를 방출함으로써 조정될 수 있음을 증명하였다. 이들 데이터는 상기 가용성 인자 또는 다른 상이한 세포질 박테리아 구성요소, 예컨대 DNA가 사이토카인의 유발 및 조정에 관련될 수 있는지에 대한 의문을 일으켰다. 이러한 관점으로부터, 본 발명자들은 인간 배양물 모델을 이용하여 사이토카인 IL-4 및 IL-5의 방출에 대한 생존 박테리아 및 L.GG, L.가세리, B.b., B.l. 균주 및 LgsBbBl(L-가세리 B.b. 및 B.l.의 혼합물)의 순수 게놈 DNA의 효과를 연구하였다. 그 결과는 프로바이오틱 박테리아의 다른 균주 및 이들의 게놈 DNA가 SEA- 또는 Dpt-자극된 PBMC로부터 생체외에서 활발하게 분비되는 사이토카인의 프로파일의 유의한 변화를 유발함을 나타내었다. 또한, 이들은 TH2 사이토카인의 생성을 감소시킴으로써 TH1/TH2 균형을 조정하고, TH1 사이토카인의 생성을 증가시킬 수 있다. 결과적으로, 상기 프로바이오틱 박테리아는 TH2 사이토카인의 생성에 대한 억제 효과의 결과로서 알레르기 질환에서 유용한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 우선 건강한 피험자 및 알레르기 피험자의 PBMC를 SEA 또는 Dpt에 의해 자극하였다(TH2 사이토카인-생성 세포 모 델로서). 많은 연구자들은 PBMC가 초항원에 의한 자극 이후에 TH2 사이토카인을 분비한다고 보고하였다. 본 연구에서 SEA 또는 Dpt-자극된 PBMC가 생존 프로바이오틱 박테리아 및 이들의 게놈 DNA와 함께 예비 항온처리될 때, TH2 사이토카인의 생성이 감소되었지만, 대장균의 존재하에서는 감소되지 않았다. 또한, 이러한 억제 효과는 투약량에 의존하여서, 2 x 107CFU㎖-1 농도(10:1 비의 박테리아 대 PBMC에 해당함)에서 생존 박테리아의 억제 효과가 IL-4 및 IL-5 생성에 대하여 최대치에 도달하였다. 이러한 투약량-의존적 효과는 또한 그램-양성 박테리아의 일부 균주와 함께 항온처리한 후에 건강한 피험자의 단핵세포에 의한 IL-10 및 IL-12의 생성에 대하여 생체외에서 보고되었다. 상기 연구는 또한 생존 프로바이오틱 박테리아 뿐만 아니라 이들의 게놈 DNA도 SEA- 또는 Dpt-자극된 PBMC에 의해 IL-4 및 IL-5 생성을 억제할 수 있음을 나타내었다. 본 연구의 가장 중요한 요점은 우선, 이들이 집에서 발견되는 극소 미생물인 집먼지 진드기에 민감한 알레르기 환자의 세포에 대하여 게놈 DNA 또는 프로바이오틱 박테리아가 유익한 효과를 제공한다는 점이다. 집먼지 진드기는 먼지 알레르기의 주요한 원인이다. 다른 보고서는 모두 식품 알레르기 또는 공기 알레르겐에 의해 야기되는 알레르기 질환에 대해 생존 또는 사멸 프로바이오틱 박테리아가 갖는 유익한 효과에 관한 것뿐이다. 본 발명의 데이터는 SEA- 또는 Dpt-자극 이전에 또는 이와 동시에(게놈 DNA의 경우) 프로바이오틱 박테리아 및 이들의 게놈 DNA가 첨가될 때에도 억제 효과가 관찰되기 때문에, 프로바이오틱 박테리아 및 이들의 게놈 DNA는 TH2 사이토카인의 억제에 필요한 신호 경로의 직접 또는 간접 조절에 의해 작용한다는 것을 시사한다. 일부 실험 연구는 IL-4 및 IL-5의 생성 조정이 다인자 과정이고, 일부 사이토카인, 예컨대 IFN-γ은 IL-4 생성의 가능한 조절자로서 기재되어 있음을 나타낸다. 또한, IL-12는 인간 PBMC에 의한 IFN-γ 생성을 유발하는데 있어서 뛰어난 사이토카인이라고 보고되었다. 본 발명의 연구에서, 프로바이오틱 박테리아 및 이들의 게놈 DNA는 PBMC에 의해 IL-12 생성을 증가시킬 수 있다(데이터는 도시되지 않음).
이러한 측면에서, 박테리아 DNA를 SEA-자극된 PBMC 배양물에 첨가하였고, 흥미롭게도, 상기 실험은 박테리아 DNA 및 SEA 처리에 의한 자극 이후에 다양한 IL-4 및 IL-5 사이토카인 생성을 나타내었다. 프로바이오틱 박테리아의 박테리아 DNA는 IL-4보다 IL-5 분비를 훨씬 크게 감소시켰다. 본 발명의 데이터는 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA가 건강한 피험자 및 알레르기 피험자의 SEA- 및 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-4 및 IL-5 생성에 대한 억제제로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 또한, 최근 연구는 열-사멸된 프로바이오틱 박테리아가 SEA-자극된 PBMC에 의해 IL-4 및 IL-5 생성을 감소시킴을 보고하였다. 제조 과정, 위장관 및 고온(70℃)이 박테리아 생존도에 영향을 주는 점을 고려할 때, 상기 연구의 결과는 열-사멸된 박테리아에 의해 방출되어 PBMC에 첨가된 게놈 DNA의 가능한 억제 효과를 보여준다. 다양한 논문이 L.GG의 게놈 DNA와 같은 박테리아 DNA에 존재하는 CPG 모티프상의 다양한 사이토카인의 반응을 기재하고 있다. 본 연구에서 증명된 사이토카인의 균주-특이적 방출이 각 균주의 CPG 모티프 및 게놈 서열에 관련되었는지를 아는 것이 흥미로울 것이다.
본 발명자들이 아는 한, 본 출원은 건강한 피험자 및 알레르기 피험자의 SEA- 또는 Dpt-자극된 PBMC로부터의 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA의 면역-조정 효과를 보여주는 첫번째 보고서이다. 박테리아 DNA 및 SEA- 또는 Dpt-자극에 대한 반응으로서 IL-4 및 IL-5 억제의 속도 및 크기에 대해 관찰된 차이는 면역 반응에 대한 생존 또는 사멸된 프로바이오틱 박테리아 및/또는 박테리아 구성요소의 영향에 대한 흥미로운 정보이다. 프로바이오틱 물질에 대한 정보 증가는 흥미롭지만, 가까운 장래에는 어떠한 프로바이오틱 DNA(각각의 균주 또는 조합물)가 특정 질환에 대해 가장 큰 결과를 갖는지가 확인되어야 한다. 장래에 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA의 역할을 예방 및 치료 제제로서 정의하기 위하여는 잘-정리된 무작위 임상 시험이 추가로 필요하다.
본 발명의 더욱 상세한 설명 및 특징이 실시예와 관련하여 일련의 실험 결과와 함께 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 그러나, 이는 본 발명을 제한하려는 것이 아니고, 설명하려는 것이다.
도 1은 (배지를) 포함하지 않거나 또는 SEA 및 Dpt에 의해 자극된 PBMC의 사이토카인 조정을 나타낸 것이다.
도 2는 건강한 피험자의 PBMC의 SEA 자극에 의한 IL-4(A), IL-5(B) 및 (IFN-γ)의 생성에 대해 생존 프로바이오틱 박테리아가 갖는 투약량-의존적 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 삭제됨
도 4는 건강한 피험자(A, n=5) 및 알레르기 피험자(B, n=5)의 SEA- 또는 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-4, IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대해 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA가 갖는 증가-억제 효과를 나타낸다.
도 5는 건강한 피험자의 PBMC에 의한 IL-4(A), IL-5(B) 및 IFN-γ(C)의 생성에 대해 게놈 DNA가 갖는 투약량-의존적 증가-억제 효과를 나타낸다.
도면에 대해서 아래에 상세히 설명한다.
도 1
(배지를) 포함하지 않거나 또는 SEA 및 Dpt에 의해 자극된 PBMC의 사이토카인 조절
건강한 피험자(A, n=8) 및 알레르기 피험자(B, n=8)의 PBMC를 SEA-초항원(2㎍㎖-1), Dpt(2㎍㎖-1)에 의해 자극하기 전에 또는 아예 자극하지 않고 10:1의 박테리아-대-세포의 비로 프로바이오틱 박테리아의 4개 균주, LgB.b.B.l. (프로바이오틱 박테리아 및 그램-음성 대조군 박테리아(대장균 TG1)의 혼합물)를 갖거나 또는 (PBMC를) 갖지 않는 배지와 함께 3시간동안(2 x 106 세포/㎖) 예비 항온처리하였다.
IL-4, IL-5 및 IFN-γ은 상청액중에서 여러 시간동안 항온처리한 후에 특이적 ELISA 연구에 의해 정량화하였다. 별표는 대조군에 비교한 TH2 및 TH1 사이토카인 생성의 특정 억제 또는 자극(*p<0.05, **p<0.01)을 나타낸다.
도 2
건강한 피험자의 PBMC의 SEA 자극에 의한 IL-4(A), IL-5(B) 및 (IFN-γ)의 생성에 대해 생존 프로바이오틱 박테리아가 갖는 투약량-의존적 억제 효과
4명의 건강한 제공자의 PBMC(2 x 106 세포㎖-1)를 0.025, 0.25, 1, 2.5, 5, 10 및 25 박테리아-대-세포 비에 해당하는 5 x 104, 5 x 105, 2 x 106, 5 x 106, 2 x 107, 및 5 x 107 농도의 프로바이오틱 박테리아의 4개 균주인 L.GG, L.가세리, B.b., B.l.와 함께 3시간동안 배양한 후에 SEA 2㎍㎖-1에 의해 자극하였다. 48시간 항온처리한 후에, IL-4, IL-5 및 IFN-γ은 특이적 ELISA에 의해 측정하였다. 오차막대는 평균값의 표준 오차를 나타낸다.
도 3 삭제됨
도 4
건강한 피험자(A, n=5) 및 알레르기 피험자(B, n=5)의 SEA- 또는 Dpt-자극된 PBMC에 의한 IL-4, IL-5 및 IFN-γ의 생성에 대해 프로바이오틱 박테리아의 게놈 DNA가 갖는 증가-억제 효과
5명의 건강한 피험자 및 5명의 알레르기 피험자의 PBMC를 SEA(2㎍㎖-1) 또는 Dpt(2㎍ 투여㎖-1에 해당하는 2000 SQ-EML-1)로 자극하기 이전에 75㎍㎖-1 농도의 프로바이오틱 박테리아의 4개 균주인 L.GG, L.가세리, B.b., B.l. 및 LgBbBl(L.가세 리, B.b. 및 B.l.의 혼합물)의 게놈 DNA와 함께 48시간동안(2 x 106세포㎖-1) 항온처리하였다. 배지 및 LPS(100ng㎖-1)을 대조군으로 사용하였다. IL-4, IL-5 및 IFN-γ은 상청액중 24시간 항온처리한 후에 특이적 ELISA 연구에 의해 정량화하였다. 별표는 대조군(배지)에 비교되는 사이토카인 생성의 뛰어난 억제(*p<0.05, **p<0.01)를 나타냈다. 데이터를 평균값 ± SEM으로 표기하였다.
도 5
건강한 피험자의 PBMC에 의한 IL-4(A), IL-5(B) 및 IFN-γ(C)의 생성에 대해 게놈 DNA가 갖는 투약량-의존적 증가-억제 효과
4명의 건강한 제공자의 PBMC를 박테리아 게놈 DNA의 다양한 농도(5 내지 105㎎㎖-1)와 함께 배양하였다. IL-4(A) 및 IL-5(B)의 생성을 24시간 항온처리후에 측정하였다. 데이터를 평균값 ± SEM으로 표기하였다.

Claims (11)

  1. 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 프로바이오틱(probiotic) 그램-양성 박테리아가 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한(viable) 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 존재하는 것을 특징으로 하는,
    인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 약제.
  2. 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아가 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 존재하는 것을 특징으로 하는,
    인체의 TH1-TH2 균형을 TH1이 증가하고/하거나 TH2가 감소하도록 이동시키는 약제.
  3. 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아를 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 사용하는 것을 특징으로 하는,
    인간의 알레르기 반응을 예방, 억제 또는 제거하는 약제의 제조방법.
  4. 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아를 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로 사용하는 것을 특징으로 하는,
    인체의 TH1-TH2 균형을 TH1이 증가하고/하거나 TH2가 감소하도록 이동시키는 약제의 제조 방법.
  5. 인간의 알레르기를 예방, 억제 또는 제거하는 약제의 제조에 있어서,
    구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로서 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아의 용도.
  6. 인체의 TH1-TH2 균형을 TH1이 증가하고/하거나 TH2가 감소하도록 이동시키는 약제의 제조에 있어서,
    구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로서 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아의 용도.
  7. 인간의 알레르기 반응을 치료 및/또는 예방 및/또는 위험도 감소에 있어서,
    구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이 들의 게놈 DNA로서 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아의 용도.
  8. 인체의 TH1-TH2 균형을 TH1이 증가하고/하거나 TH2가 감소하도록 하는 이동시키는 치료 및/또는 예방 및/또는 위험도 감소에 있어서,
    구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로서 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 그램-양성 박테리아의 용도.
  9. 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 그램-양성 박테리아가 실질적인 활성 성분으로, 구체적으로는 생존가능한 박테리아 및/또는 불활성화된 박테리아 및/또는 이들의 게놈 DNA로서 존재하는 것을 특징으로 하는
    식품 또는 식품 보충제.
  10. 경구 사용 및/또는 좌제 투여, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 흡입용 액체로 제조되는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 약제.
  11. 박테리아 균주가 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 및/또는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 및/또는 비피도박테리움 비피 둠(Bifidobacterium bifidum) 및/또는 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum)인 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 따른 의약.
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