CN101678052A - 用于在人中预防、抑制或消除变态反应的益生性革兰氏阳性细菌 - Google Patents

用于在人中预防、抑制或消除变态反应的益生性革兰氏阳性细菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在人中预防、抑制或消除变态反应的药物，其中作为主要的活性成分而包含益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。

Description

用于在人中预防、抑制或消除变态反应的益生性革兰氏阳性细菌
本发明涉及用于在人中预防、抑制或消除变态反应的药物。
针对诸如下列的物质的变态反应是众所周知的并且对于越来越多的人来说是一个日益增长的问题：花粉(枯草热)或其他植物组分、猫毛和其他动物毛、带有其中所包含的房尘螨粪便的粉尘、昆虫毒素、食物例如乳或坚果、或者香料及其他化妆品组分。
其原因是机体自身的防御系统对于这些物质作出如此的反应，就好像它们实际上是有害的侵入物，例如寄生虫。此外，该反应的程度是过度的。
在这种机体自身的防御反应的过程中，白细胞、淋巴细胞发挥了重大作用。淋巴细胞的一种形式是T-淋巴细胞或辅助细胞(TH-细胞)，其分泌各种介质——细胞因子，以用于调控防御反应。首先存在有减少或阻止变态反应的细胞因子，其次存在有通过作为调节物对于作用细胞(Aktorzellen)例如肥大细胞发挥刺激作用而引发炎症反应(也称为变态反应)的其他细胞因子。根据这种影响，将所有TH-细胞分成两组，即TH1-细胞和TH2-细胞。TH1-细胞产生抗变应性细胞因子，例如γ-干扰素(IFN-γ)或白介素-2(IL-2)。TH2-细胞产生引发变态反应的介质，例如白介素IL-3、IL-4、IL-5和IL-10。白介素-4刺激肥大细胞以产生抗体，E型免疫球蛋白(IgE)，其在过敏反应中以非常大的量存在。
TH1-细胞和TH2-细胞的数目之间的比例对于机体针对侵入的病原体的免疫应答来说是决定性的。它在具有变态反应的患者中显著低于在健康人中。已知新生儿或早产儿也具有非常低的值，从而母体生物体不会错误地攻击婴儿的细胞。
因此，TH1-TH2比例是每个人的重要的特征数据，并且也正逐渐为更广泛的公众所知晓。
一般地推测，由于过度卫生以及传染病减少而导致的肠道菌丛的改变和/或在非常早的儿童期中细菌刺激的缺乏使得产生对于该比例值的偏离的素质感受性(
Figure G2007800522207D00021
)，并因而引起变应性过度敏感。
因此，甚至在幼年期中，在变应原侵入的情况下就已经可能出现炎症反应，例如感冒和粘膜肿大，甚至于体温升高。
已知许多对抗或抑制所出现的症状的药物。它们具有这样的缺点，即它们中的一部分非常昂贵，引发一些不希望的副作用，并且必须由患者不断地进行服用。
在这个背景之上，本发明的目的是鉴定这样的活性物质，即所述活性物质是已知的，并且可以以工业规模生产，因此可容易获得且可加工；产生低成本；在健康个体的环境中也已经以边际量(marginaleMengen)存在，并因而在一定的限度内与人类生物体相容；并且不是在症状的水平上，而是在由介质引发时进攻变态反应。
为了达到这个目的，本发明提出了这样的药物，其中包含益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
“益生”这一性质在Brockhaus中被解释为两种生物体的共生，从而有益于一个伙伴，却不损害另一个伙伴。在本发明的情况下，第二种生物体即细菌有益于人类生物体。在此，细菌自身未受损害，因而仍是活的。这包括，在口服施用的情况下，尽可能多的细菌未受伤害地通过胃(其中具有它的酸、酶和其他消化活性物质)。
术语“益生”还意味着，对于人的不利影响是可忽略不计的或者至少是极小的，而被归类为有益的效应占优势地存在。
术语“益生菌剂(Probiotikum)”意指当消费足够的量时，对于宿主生物体具有促进健康的影响的微生物制剂。益生性乳酸细菌(乳杆菌属)已使用了最长时间。益生菌剂可以作为特别配制的食品或者以药物的形式进行施用。
益生菌剂的健康促进效应在各情况下是菌株特异性的。已知这样的益生细菌菌株，根据基于证据的医学而可证实，它们促进乳糖消化，抑制肠中的病原菌，以及限制或抑制腹泻。
其他细菌菌株增强感染保护，降低胆固醇水平，以及降低结肠中的癌症的风险。
这些效应在广泛应用之前已在体外成功地得到证实。由此，用一系列在实验室中进行的实验来验证本发明的健康促进效应是合法的。
借助于下文所描述的实验，测定在确定的条件下从人类血细胞级分(PBMC-血细胞(外周血单核细胞))中释放出哪些细胞因子。对于一系列实验，从健康人的血液中分离出这些血细胞，以及对于第二个系列的实验，从对于室尘具有变应性的过敏反应患者的血液中分离出这些血细胞。
关于刺激，添加葡萄球菌A型肠毒素(SEA)并且在进一步的系列中添加尘螨属(Dermatophagoides)(Dpt)，因为室尘变应症患者通常对于这些也是具有变应性的。由此模拟了引起过敏反应的物质的侵入。
作为TH1反应的代表，测量了γ-干扰素。借助于分泌的白介素4和5(IL-4和IL-5)来记录TH2-模式。
可能牵涉变应性疾病的传播增加的因素据推测包括肠道菌丛的改变或在儿童期中细菌刺激的缺乏。TH2-细胞因子增加IgE的产生且刺激肥大细胞。相反地，γ-干扰素(IFN-γ)(TH1-细胞因子)有助于抑制IgE合成。以这种方式，“TH1∶TH2”这一表述的失衡可以有助于变应性疾病的引发和维持。乳杆菌属细菌(其属于肠内的天然微生物区系)应当能减少变应性表现的频率和严重度，并且调节TH1/TH2应答。功能机制仍未阐明。
目标：
我们的实验目标是测定益生细菌对于健康的人和具有针对房尘螨的过敏反应的患者的TH1和TH2类型细胞因子的产生所发挥的影响，以及阐明细菌基因组DNA对于针对葡萄球菌肠毒素A(SEA)和屋尘螨(Derma tophagoidespteronyssinus)(DPT)的TH1/TH2应答的影响的分子基础，并且将其与活细菌的影响相比较。
方法：
与健康供体的那些相比较，将具有针对房尘螨的过敏反应的患者的PBMC与或不与SEA和DPT变应原一起温育24和48小时。通过测量TH1/TH2细胞因子产生来评估与活的益生细菌一起预温育的效应以及它们的基因组DNA的效应，它们同时添加至培养物中并温育24小时。
结果：
所测试的活的革兰氏阳性益生细菌及其基因组DNA显示，它们抑制经SEA和DPT刺激的TH2细胞因子(EL4和EL5)的分泌，并且扩大了IFN-γ的刺激。这种效应不仅依赖于剂量，而且依赖于所选择的细菌菌株。对照，即革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli)TG1，未引起显著的抑制。益生细菌减少了变应性PBMC的IL-4细胞因子的产生，特别是在用SEA和DPT再次刺激后，甚至比在健康的人中更加有效。相反地，健康受试者中的IL-5抑制更明显地显著。细菌DNA也抑制IL-4和IL-5的释放，但仅以稍微更低的程度。EL4的抑制在变应性受试者的PBMC的情况下比在健康受试者的情况下更显著，相反地，在健康受试者中这是对于EL5的情况。
概述：
由所测试的益生细菌及其基因组DNA调节的针对变应原的TH1/TH2应答显示出抗TH2活性。因此，益生细菌的各种菌株及其基因组DNA在预防变应性疾病中可以是有用的。
1.引言
变应性疾病的病因的学说仍是不明了的，尽管人的实验研究表明，遗传先决条件、肠粘膜的免疫应答和肠细菌对于变应性疾病的发病机理作出了贡献。一些研究提出，TH2细胞因子，特别是IL-4、IL-5、IL-9和IL-13，通过调节IgE的产生和刺激肥大细胞而在发病机理中发挥了极其重要的作用。TH2淋巴细胞以高水平产生IL-4、IL-5、IL-9或IL-13，可以在变应性应答的发展和过程中发挥决定性的作用；与此相反，IFN-γ，所谓的TH1细胞因子，具有抑制IgE合成的能力。有缺陷的IFN-γ表达常常与由IgE介导的过敏反应相关联。TH1/TH2细胞因子的比例的失调在很大程度上可以认为是在疾病例如支气管哮喘或特应性皮炎中引发和维持变应性炎症过程的原因。
已提出，特别是新生儿的TH2细胞因子特性谱、通常降低TH1/TH2比例的衰老、现代的卫生习惯、密集的食品灭菌和/或由于根据人工配方进行饲喂而引起的新生儿肠道菌丛的改变，在TH1/TH2平衡的改变之中发挥了主要作用。所获得的这个领域中的知识已为许多新疗法准备好了基础。一种方法是简单地使用益生细菌，以便增加没有以足够量产生的那些细胞因子，或者减少以太大规模产生的那些细胞因子，因为益生细菌调节TH1/TH2平衡。
一般将益生细菌归类为安全的，并且已经被人或动物所消费。乳杆菌属和双歧杆菌属细菌是人胃肠道中分布最广的微生物。对于益生细菌的免疫刺激效应，特别是对于其抗变应性效应的兴趣正逐渐增加。在变应性疾病中细菌的重要作用使得可能通过经由益生处理而改变肠道微生物区系来预防或治疗这些偏离。益生细菌可以通过调节内源性菌丛或免疫系统而直接或间接地发挥作用。已提出，使用新术语“免疫生物剂(Immunobiotics)”来称呼经由粘膜免疫系统来促进健康的细菌，其与仅具有局限于局部的作用的那些不同。已报道了对于益生菌的各种免疫应答，例如促进炎症的细胞因子的分泌，淋巴细胞的增加和氧化氮的形成。此外，还已显示，整个细胞，由LGG或LGG的DNA所分泌的某些可溶性组分，细胞壁的组分例如乳酸杆菌的肽聚糖或脂磷壁酸质，引发炎性免疫应答并显示出免疫生物性活性。已证明，不仅施用到肠道中的活细菌，而且分离的益生菌DNA，都是有活性的，即使其是经皮下注射的。
已报道，细菌DNA中的未变性的CpG基序对于小鼠的B-细胞来说是促有丝分裂的，并且引发巨噬细胞和树突细胞(DC)产生炎性细胞因子。并且，CpG寡脱氧核苷酸(ODNs)和细菌DNA引发小鼠的B-淋巴细胞和天然杀伤细胞产生白介素6(EL-6)、白介素12(EL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)。此外，CpG DNA诱导B-细胞增加以及未受影响的和激活的T-细胞划分成T-辅助细胞1和2。特定的CpG ODNs(D-型)在激活NK-细胞和引发浆细胞样树突细胞产生α-干扰素(IFN-α)方面是特别有效的，而其他ODNs(K-型)是B-细胞的特别有效的激活剂。近来已证明，Toll-样受体9(TLR9)在引发由CpG DNA而引起的细胞激活中起着关键作用。
在对于卵清蛋白致敏的小鼠中进行的实验显示，在将乳酸细菌施用到胃中后，抑制了特殊的依赖于IgE-和TH2-特性谱的炎症应答。此外，最近的报道提出，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG可以在人受试者中减少变应性疾病的症状，与它能够通过激活被整合在细胞因子的信号传导功能之中的转录因子而引发先天免疫应答一样。将该细菌菌株给予哺乳母亲和新生儿导致抑制了婴儿中特应性湿疹的风险。体外实验已显示，用各种乳酸细菌刺激健康供体的PBMC或单核细胞诱导了IL-12的分泌，IL-12是极其重要的促TH1-细胞因子，其牵涉变应性疾病的发展的控制。LAB影响TH2细胞因子的产生的功能机制仍有待鉴定，所述TH2细胞因子负责启动变应性疾病的发展。考虑到在双歧杆菌属和乳杆菌属细菌的DNA的染色体中存在有未变性的DNA序列(CpG基序)，我们决定在这项研究中检查乳杆菌属和双歧杆菌属细菌的四种菌株以及其染色体DNA对于由健康和过敏反应受检者的经SEA和DPT刺激的PBMC所进行的IL-4、IL-5和IFN-γ的产生所发挥的影响。所研究的乳杆菌属和双歧杆菌属细菌显示出抗TH2活性和促TH1-细胞因子——IFN-γ。
2.方法和材料
2.1.细菌培养
在该研究中中所使用的细菌菌株如下：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(92164)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)(PA 16/8)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)(MG  20/5)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(SP 07/3)和LgsB.bB.I(加氏乳杆菌、双歧双歧杆菌和长双歧杆菌的混合物)。于37℃，在补充有0.05％L-半胱氨酸的MRS培养基(MRS；Merck，Darmstadt，Deutschland)中，以厌氧方式(厌氧系统，具有气塞的MACS-VA500工作站和气塞，DonWhitley Scientific Limited UK)培育双歧杆菌属和乳杆菌属细菌菌株(0.02％的于-80℃在30％甘油中贮存的菌株的接种物)16小时。在进行收获并于PBS中进行洗涤之前，将新制备的培养物的连续溶液施加在包含MRS-琼脂培养基的平板上，并进行培养以用于计数。益生细菌组的菌落形成单位的计数(CFU·ml-1)通过在平板上施加重复的10倍溶液而获得。将平板在37℃下厌氧温育24-48小时。然后，细菌用PBS洗涤3次，并且调整至1010、107和101CFU·ml-1的终浓度。将细菌悬浮液于-80℃在包含30％甘油的MRS溶液中进行贮存。对于所有细菌菌株，通过将OD600对新制备的、重复溶解的培养物的琼脂平板计数进行作图而生成标准的生长曲线。为了计算在新制备的培养物中的活细菌的计数，给所述曲线配置对数输出，其获得了超过98.5％的所有值(数据未显示)。革兰氏阴性大肠杆菌TG1(产品编号BU-00035)购自Maxim Biothec Inc.，并且在LB培养基中于37℃生长18小时且如上进行收获。
2.2.从细菌中制备基因组DNA
通过用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行提取来纯化益生细菌的纯培养物的基因组DNA。为了获得完全的细胞破碎，通过使酶促裂解从2小时延长到7小时来稍微地修改该方法。随后，使DNA沉淀，用冷的(-20℃)95％乙醇进行灭菌，并且溶解在双蒸水(ddH2O)中。所有DNA制备物的浓度和纯度通过测量OD260吸收或者OD260/280和OD260/230比率来获得。仅使用OD260/280比率＞1.8和OD260/230比率≥2的DNA。用TritonX-114D从DNA中去除内毒素，并且还通过使用鲎变形细胞试验(QCL-1000，CAMBREX，Deutschland)就其脂多糖(LPS)的含量来进行检查。LPS含量小于0.01U内毒素·μg-1。
为了测定DNA制剂中LPS或其他细菌污染物的生物活性，用DNA酶I(Sigma)使DNA降解。当以75μg·ml-1的浓度加入经降解的DNA时，不存在低于基准水平的可检测的对于经由PBMC的细胞因子的抑制(在DANN-破碎处理前测量的)。
2.3.PBMC的分离和培养
2.3.1.PBMC与益生细菌的预温育，以及使用SEA和Dpt的进一步刺激
招募8位过敏反应患者和8位健康供体以用于该研究。按照基尔大学伦理委员会对于在研究中使用人类受检者的要求，在他们登记参与这项研究之前从所有受检者取得口头和书面同意。将静脉血从供体中引导入肝素化的Vacutainer中，并用0.9％NaCl进行1∶1稀释。然后，通过根据渐增的密度进行离心而从肝素化的经稀释的血液中分离出新鲜的外周血单核细胞(PBMC)(1.077g·ml-1)(Lymphoprep，AXIS-SHIELD PoC AS，Oslo，Norwegen)。将所述细胞引入至补充有10％(v/v)热激活(56℃，1小时)的胎牛血清、庆大霉素(50μg·ml-1)(Sigma)、青霉素-链霉素(1％)和丙酮酸钠溶液(0.23mmol·1-1)(Sigma)的RPMI-1640培养基(Sigma，München，Deutschland)(作为完全培养基进行定购)(以乳状液形式)。所有组分均购买经内毒素检测的，如通过LAL所测定的。在具有24个孔的容器中，在完全培养基中以2×106个细胞·ml-1的浓度培养这些细胞。同时，为了进行刺激，将活的益生细菌的四种菌株和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌TG1)添加到所述培养物中。如对于细菌计数而言所需要的，益生细菌和其他细菌在被添加到培养物中之时是活的。将仅用培养基进行培养的细胞用作未刺激的对照。在平底96孔微量滴定板(Nune，Roskilde，
Figure G2007800522207D00081
)中准备作为具有200μl/孔的终体积的培养物对于IL-4和IL-5来进行的关于剂量依赖性的实验，其中使用2×106个单核细胞以及5×104、5×105、2×106、5×106、2×107和5×107个细菌/ml，这相应于0.025、0.25、1、2.5、10和25个细菌/单核细胞。它们表明，使用2×107CFU的细菌/ml(相应于10∶1(细菌∶PBMC)的比率)时观察到最大抑制。在进一步的实验中使用这一浓度。对于健康供体和对于过敏反应患者，PBMC和细菌之间的最终比率(细菌∶PBMC的比率)为10∶1。对于对照处理，仅将培养基添加到PBMC溶液中。然后，在37℃下温育3小时后，用SEA(2μg·ml-1)或Dpt(2000SQ-E ml-1，等价于2μg剂量·ml-1)进一步刺激PBMC，并在含5％CO2的湿润的培养箱中于37℃温育48小时。所有实验一式两份地进行。在温育48小时后，将培养基于4℃在1,000×g下离心20分钟。无细胞的上清液通过经过具有0.2μm的孔径大小的滤器(Millipore，Deutschland)来进行灭菌，并贮存于-80℃直至使用。在与细菌一起进行温育之前和之后，通过用台盼蓝进行排除来测定细胞的生存力。
2.3.2.使用SEA、LPS和基因组DNA来进行刺激
通过根据渐增的密度进行离心(1.077g ml-1)(Lymphoprep，AXIS-SHIELD PoC AS，Oslo，Norwegen)而从4位健康供体的肝素化的外周血中分离出新鲜的PBMC。细胞在具有10％(v/v)热激活(56℃，1小时)的胎牛血清、庆大霉素(50μg·ml-1)(Sigma)、青霉素-链霉素(1％)和丙酮酸钠溶液(0.23mmol·l-1)(Sigma)的RPMI-1640培养基(Sigma，München，Deutschland)(完全培养基)中。所有组分均购买经内毒素检测的。在平底96孔微量滴定板(Nune，Roskilde，)中建立作为具有200μl/孔的终体积的培养物对于IL-4和IL-5来进行的关于剂量依赖性的所有实验，其中使用2×106个单核细胞以及5、10、25、50、75和100μg基因组DNA/ml。它们表明，使用75μg DNA·ml-1时观察到最大抑制。在进一步的实验中使用这一浓度。在24孔平板(Nunc，Roskilde，
Figure G2007800522207D00092
)中，在完全培养基中，以2×106个细胞·ml-1的浓度培养这些细胞。同时，将益生细菌的基因组DNA(75μg·ml-1)、小牛的基因组DNA(75μg·ml-1Sigma，München，Deutschland)、SEA(2μg·ml-1)、大肠杆菌的LPS(20ng·ml-1，Sigma，München，Deutschland)添加到培养物中，并且在37℃、5％CO2-湿润的条件下温育24小时。所有实验进行三次。在温育24小时后，收集无细胞的上清液并于4℃在1000×g下离心20分钟，并且通过经过孔径为0.2μm的滤器(Millipore，Deutschland)进行灭菌，并且以等分试样贮存于-80℃直至分析。在与基因组DNA一起进行温育之前和之后，通过用台盼蓝进行排除来测定细胞的生存力。在所有实验中，95-98％的PBMC是活的。对于各细胞因子来进行的关于剂量依赖性的实验表明，在75μg·ml-1的浓度时观察到最大抑制。在进一步的实验中使用这一浓度。
2.4.借助于酶联免疫吸附测定法(ELISA)来进行的细胞因子的研究
在无细胞的上清液中，借助于特异的ELISA(用于人IL-4、5和IFN-γ的BD Opt EIATM Set，Heidelberg，Deutschland)来定量IL-4、IL-5和IFN-γ的含量。该测试的检测极限对于IL-4而言为0.5pg·ml-1，对于IL-5而言为0.5pg·ml-1，和对于IFN-γ而言为1pg·ml-1。在ELISA平板阅读器上于450和570nm处读取样品的光密度值。实验至少一式两份地进行重复，并且进行三次。
2.5.统计学分析
实验的数据借助于±S.E.M来给出，并且使用t-检验来进行非参数化的统计学分析。小于0.05的P值被认为是统计学上显著的。
结果
乳杆菌属和双歧杆菌属细菌抑制IL-4和IL-5，并且引发健康供体的经SEA或Dpt刺激的PBMC产生IFN-γ。显示出，链球菌超级抗原引发高含量的来自健康供体的PBMC的IL-4和IL-5，并且通过加热杀死的乳酸细菌能够抑制2型细胞因子-特性谱的分泌。此外，研究还显示，过敏反应患者具有增加的IL-4和IL-5含量。屋尘螨，Dpt(以83.8％)，和粉尘螨(Derma tophagoides farinae)，Df(以78.4％)，是在具有过敏性鼻炎的患者中分布最广的致病性变应原。现在，我们已用另一种超级抗原证实了这些观察结果：葡萄球菌肠毒素A(SEA)和Dpt。
当乳杆菌属和双歧杆菌属细菌的活菌株与PBMC一起进行预温育时，与由阳性对照(未与乳杆菌属和双歧杆菌属细菌一起预温育)所引发的相比较，由此得到的由SEA和Dpt所引起的IL-4的产生高程度地减少。有趣的是，当PBMC与革兰氏阴性对照菌株TG1一起预温育时，未观察到显著的抑制(图1)。
尽管所述4种乳杆菌属和双歧杆菌属细菌菌株以及TG1均不引发基础的IL-4产生，但所有4种菌株均诱导IFN-γ的产生。此外，当用SEA和Dpt刺激PBMC时，IFN-γ释放的含量强烈增加。不仅用乳杆菌属和双歧杆菌属细菌，而且用TG1，均观察到协同效应。因此，乳杆菌属和双歧杆菌属细菌看起来能够以相反的方向影响TH1以及TH2细胞因子的分泌。
细胞因子的产生依赖于时间和剂量。
用4种乳杆菌属和双歧杆菌属细菌菌株来进行的进一步的实验显示，TH2细胞因子的抑制依赖于时间和剂量。当在添加SEA前用益生细菌刺激PBMC时，对于TH2细胞因子产生所发挥的增长抑制效应随着“细菌∶PBMC”的比率而增加。在2×107CFU的细菌·ml-1(相应于10∶1的比率(细菌∶PBMC))时观察到最大的增长抑制(图2，A和B)。
对于IL-4和IL-5的产生也观察到了这种效应。例如，对于加氏乳杆菌菌株而言，对于响应于SEA而引起的IL-4产生所发挥的增长抑制的百分比从40.19％±3％(1∶1的比率)提高至54.22％±(10∶1的比率)。对于IL-5产生所发挥的抑制的百分比从43.77％±8％(1∶1的比率)增加至73.17％±5％(10∶1的比率)。此外，在健康供体的PBMC中，对于响应于Dpt而引起的IL-4产生所发挥的抑制的百分比从34.61％±4％(1∶1的比率)提高至47.33％±5％(10∶1的比率)。对于IL-5产生所发挥的增长抑制的百分比从45.72％±4％增加至77.59％±6％。与TH2-细胞因子相反，我们的测试菌株诱导IFN-γ的基础产生，这似乎依赖于细菌/细胞的比率。值得注意的是，可以表明，益生细菌高程度地影响作为对于用SEA进行刺激的响应的IFN-γ的产生(图1和2，C)。
活的益生细菌对于IL-4和IL-5产生所发挥的依赖于时间的增长抑制效应
用SEA(2μg/ml)刺激健康供体的PBMC(n＝4，以2×106·ml-1)。在SEA刺激前在温育前将单核细胞与L-GG(10∶1的比率)一起预温育1.3和5小时，或者同时用L-GG菌株和超级抗原刺激它们，或者在SEA刺激后1.3和5小时加入L-GG，并且在24、48和72小时的时间段内使细胞培养物进行预温育。在上述时间点处，收获无细胞的上清液，并且在离心和灭菌后贮存于-20℃。测量IL-4和IL-5的浓度，并且显示出，在用SEA刺激前使PBMC与活细菌预温育3小时的情况下观察到最大的增长抑制。同样地，在温育48小时的情况下也观察到最大的增长抑制(数据未显示)。在进一步的实验中使用该时段。
乳杆菌属和双歧杆菌属细菌抑制过敏反应患者的经变应原刺激的PBMC的TH2细胞因子产生
接下来，在更加相关的通过变应原进行刺激的模型中评估乳杆菌属和双歧杆菌属细菌纠正TH1-细胞因子和TH2-细胞因子之间的失衡的能力。当将患者(对于屋尘螨具有变应性)的PBMC与乳杆菌属和双歧杆菌属细菌的活菌株一起进行预温育时，在用屋尘螨变应原进行特异刺激后所引发的IL-4和IL-5的产生大规模地减少，更确切地说以依赖于“细菌/细胞”比率的方式。对于IL-5的这种效应不依赖于所研究的益生细菌的菌株类型。IL-5的抑制例如在B.b.的情况下相应于57.31％±4.52％，和在B.1.的情况下相应于63.77％±5％(图1)。此外，当用SEA刺激过敏反应患者的PBMC时，也观察到类似的效应。在这种情况下，尽管与用屋尘螨所观察到的产生相比较，IL-4和IL-5的产生是非常高的(图1)，但所测试的益生细菌对于L-GG而言使IL-5的分泌减少71.29％±4.10％，和对于L-gasseri而言使IL-5的分泌减少77.63％±3.52％(图1)。与乳杆菌属和双歧杆菌属细菌的共温育高程度地增加了IFN-γ的产生(图1)。以这种方式，通过减少过敏反应患者的PBMC的TH2细胞因子的产生以及通过增强IFN-γ的产生，乳杆菌属和双歧杆菌属细菌看起来显示出抗TH2活性。在这个情形下，有趣的是注意到，乳杆菌属和双歧杆菌属细菌对于由过敏反应受检者的PBMC所进行的IL-4产生所发挥的增长抑制效应高于在健康受检者的情况下。与此相反，这些细菌对于由健康供体的PBMC所进行的IL-5产生所发挥的增长抑制效应高于在过敏反应受检者的情况下(图1)。与此相比，B.1.和LgsBbB1对于由过敏反应受检者的经Dpt刺激的PBMC所进行的IL-4产生所发挥的增长抑制效应高于健康受检者的情形(p＜0.05)，以及L-GG、B.b.和B.1对于由过敏反应受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的I L-4产生所发挥的抑制效应高于在健康受检者的情况下(p＜0.01)。与此相反，L-Gassery、B.b和B.1对于由健康受检者的经Dp t刺激的PBMC所进行的I L-5产生所发挥的增长抑制效应大于在过敏反应受检者的情况下(p＜0.05)，以及LgsBbB1对于由健康受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的IL-5产生所发挥的抑制效应大于在过敏反应患者的情况下(p＜0.01，图1)。
依赖于时间和剂量，益生细菌的基因组DNA抑制由健康受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的IL-4和IL-5的产生
为了与动物DNA和LPS相比较来评估细菌DNA的增长抑制效应，将4位健康受检者的PBMC与4种益生细菌菌株(L-GG、L-gasseri、B.b、B.1)及LgsBbB1(L-gasseri、B.b.和B.1的混合物)的基因组DNA、LPS和动物DNA(小牛胸腺DNA)一起进行温育。通过使用BDoptEIA测试装置来监测TH2细胞因子的抑制，以检测并定量细胞因子的产生。如图4中所示的，益生细菌的DNA阻止正常PBMC作为对于经由SEA或Dpt进行刺激的响应而产生IL-4和IL-5。与此相反，LPS未减少IL-4和IL-5的产生；同样地，无LPS的小牛胸腺DNA未减少IL-4和IL-5的产生(数据未显示)。
细菌DNA对于由健康受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的IL-4和IL-5产生所发挥的依赖于时间的增长抑制反应
进行了一些实验以测定对于基因组DNA的应答的时间过程。用SEA(2μg·ml-1)刺激健康供体的PBMC(n＝4，以2×106·ml-1)，并且在SEA刺激前与L-GG或B.b.的基因组DNA(30μg·ml-1)一起预温育1、3和6小时，或者用基因组DNA同时进行刺激。在SEA刺激后1、3和6小时加入超级抗原或基因组DNA，并且使细胞培养物在24、48和72小时的持续时间内进行温育。作为乳杆菌属和双歧杆菌属细菌菌株的代表，选择L-GG和B.b.的基因组DNA。在上述时间点处，收获无细胞的上清液，并且在离心和灭菌后贮存于-80℃。测量IL-4和IL-5的浓度，并且显示出，在PBMC与基因组DNA和SEA温育t0小时时观察到最大抑制(数据未显示)；同样地，在温育24小时后达到最大抑制。在进一步的实验中使用该持续时间。经证实，B.b的基因组DNA是比L-GG的基因组DNA更有效的IL-4抑制剂。与此相反，证实L-GG的基因组DNA是比B.b的基因组DNA更有效的IL-5抑制剂。
细菌DNA对于由健康受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的IL-4和IL-5产生所发挥的依赖于剂量的增长抑制反应
为了研究细菌DNA对于健康受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的IL-4和IL-5产生所发挥的增长抑制效应，将每种菌株的基因组DNA以各种不同的浓度(更确切地说在5-105μg·ml-1的范围内)引入PBMC培养物中，以测定哪种剂量对于IL-4和IL-5产生具有最大的抑制效应(图4)。基于上文描述的测试结果选择了这个剂量范围，所述测试结果显示，在加入至少3μg·ml-1大肠杆菌后可以检测到由免疫细胞所进行的细胞因子的产生。DNA和最佳刺激需要浓度为＞50μg·ml-1的细菌DNA。如图4中所示的，当以75μg·ml-1的浓度使用基因组DNA时，观察到IL-4和IL-5的最大抑制。可以清楚地区分出细胞因子应答的3种不同的模式。
基因组DNA：所有菌株在75μg·ml-1的浓度下抑制IL-4和IL-5的产生，除了B.b-DNA和L-gg DANN外，它们在65μg·ml-1的浓度下抑制EL-4和EL-5的产生。
当它们以5-45μg·ml-1的浓度范围添加时，所有基因组DNA将IL-4和IL-5的产生抑制至更低的稳定水平。与此相反，当它们以85-105μg·ml-1的浓度范围进行使用时，所有基因组DNA显示出剂量依赖性地增强了IL-4和IL-5的产生。与其他基因组DNA相比较，B.b和L-gg DNA看起来是对于响应于SEA刺激而引起的IL-4和IL-5产生而言的更有效的抑制剂。此外，B.b.的基因组DNA在105μg·ml-1的浓度下显示出最低的对于IL-5产生所发挥的抑制效应。
益生细菌的基因组DNA对于由过敏反应受检者的经SEA刺激的PBMC所进行的EL-4和EL-5产生所发挥的增长抑制效应
为了探究益生细菌的基因组DNA的增长抑制效应，将PBMC(2×106·ml-1)与75μg·ml-1的L-gg DNA、B1 DNA和LgsBbBE DNA一起温育24小时。可以清楚地区分出对于响应于SEA刺激而引起的IL-4产生所发挥的抑制作用的3种不同模式：L-G和LgsBBL的基因组DNA显示出最强的抑制效应，即分别为37.4％+/-4％和39.56％+/-5.1％。L-Gasseri DNA显示出最低的抑制效应(19.14％+/-2％)，以及B.b.、B.1.显示出相似的模式(24.47％+/-3.28％)。相反地，L-Gasseri DNA显示出最大的响应于SEA刺激而引起的I L-5产生所发挥的增长抑制效应(61.41％+/-3.74％)，LgsBbB1 DNA显示出最低的抑制(46.31％+/-4％)，以及L-GG、B.b.和B.i.的基因组DNA显示出相似的抑制模式(数据未显示)。此外，我们比较了基因组DNA和活细菌的抑制效应，以及比较了在健康受检者和过敏反应受检者之间基因组DNA对于响应于SEA刺激而引起的IL-4和IL-5产生所发挥的抑制效应。活细菌对于由健康受检者和过敏反应受检者所进行的IL-4产生所发挥的增长抑制效应高于其基因组DNA的影响。与此相反，在过敏反应受检者中基因组DNA的增长抑制效应大于在健康受检者中(除了L-Gasseri外)。因此，在过敏反应受检者中，基因组DNA在减少响应于SEA刺激而引起的IL-4产生方面更有效。
总之，在健康和过敏反应患者的PBMC中，活细菌对于响应于SEA刺激而引起的IL-5产生所发挥的增长抑制效应与对于IL-4产生所发挥的效应相同(例如，在健康受检者以及过敏反应受检者中，活细菌的抑制效应高于其基因组DNA)。但是，在健康供体中基因组DNA对于IL-5产生所发挥的增长抑制效应大于在过敏反应受检者中。因此，基因组DNA是在健康供体中IL-5的更有效的抑制剂。关于DPT刺激，L-GG和LgsBbB1的基因组DNA对于由过敏反应受检者的经DPT刺激的PBMC所进行的IL-4产生所发挥的抑制效应高于在健康受检者的情况下(p＞0.05)。对于L-Gassery、B.b和B.1.的基因组DNA获得了相似的模式。此外，L-Gassery、B.b、B.1和LgsB.bB.1的基因组DNA对于健康受检者的经DPT刺激的PBMC的IL-5产生所发挥的抑制效应高于过敏反应受检者的情形。但是，在健康受检者中L-GG DNA对于IL-5产生所发挥的增长抑制性影响与在过敏反应受检者中相同(图3)。因此，L-GG的基因组DNA可以以相同的方式调节健康受检者和过敏反应受检者的经DPT刺激的PBMC的IL-5产生。
讨论
过敏反应是免疫系统针对被称为变应原的特定物质(例如花粉、昆虫、毒物、药物或食物)的超敏反应。一些实验研究表明，可以将变应性疾病与TH1/TH2细胞因子-平衡的紊乱(TH2细胞因子相对占优势，和TH1细胞因子缺乏)相关联。事实上，IL-4、IL-5、IL-3和IL-9牵涉变态反应的引发和维持。推测，TH2型细胞因子优先地牵涉变应性疾病，因为“TH2至TH1免疫应答偏移”在大多数类型的变应性疾病中是非常明显的。在用益生细菌治疗过敏反应患者时所获得的鼓舞人心的结果促使我们去阐明TH1/TH2细胞因子和过敏反应之间的相互作用。因此，在过敏反应的治疗中的一种策略是通过施用益生细菌来改变TH1/TH2平衡，以便恢复TH1/TH2-平衡。特别感兴趣的是在下列方面的结果：活的或杀死的益生细菌显著减少IL-4的量并增加IFN-γ细胞因子的量的能力。此外，目前的研究证明，可以通过释放可溶性因子来介导益生细菌的保护效应，所述可溶性因子改变上皮的通透性并且保护免于致病性细菌侵袭。这些数据提出了这样的问题，即是这种可溶性因子还是其他不同的细胞质细菌组分例如DNA可能牵涉细胞因子的引发和调节。从这个视角出发，我们通过使用人培养物模型来研究了L-GG、L-gasseri、B.b、B.1.菌株和LgasBbBL(L-gasserie、B.b.和B.1.的混合物)的活细菌以及纯的基因组DNA对于细胞因子IL-4和IL-5的释放的影响。结果显示，益生细菌的不同菌株及其基因组DNA引发细胞因子特性谱的显著变化，所述细胞因子在体外由经SEA或Dpt刺激的PBMC主动分泌。此外，它们可以通过减少TH2细胞因子的产生并增加TH1细胞因子的产生来调节TH1/TH2平衡。因此，由于它们对于TH2细胞因子产生所发挥的抑制效应，此类益生细菌可以在变应性疾病中发挥有用的效应。
为了研究这种效应，我们首先用SEA或Dpt刺激健康受检者和过敏反应受检者的PBMC(作为产生TH2-细胞因子的细胞模型)。众多研究者报道了，PBMC在用超级抗原刺激后分泌TH2细胞因子。当在这项研究中将经SEA或Dpt刺激的PBMC与活的益生细菌及其基因组DNA一起预温育时，TH2细胞因子的产生减少，但在大肠杆菌存在下则不是如此。此外，这种抑制效应依赖于剂量，从而在2×107CFU·ml-1的浓度(相应于10∶1的“细菌∶PBMC”的比率)时，在IL-4和IL-5产生方面，活细菌的抑制效应达到其的最大值。在与革兰氏阳性细菌的某些菌株一起温育后，在体外对于由健康受检者的单核细胞所进行的IL-10和IL-12的产生也报道了此种依赖于剂量的效应。这项研究还显示，不仅活的益生细菌而且其基因组DNA均可以抑制由经SEA或Dpt刺激的PBMC所进行的IL-4和IL-5产生。这项研究的最重要的要点是，首次介绍了基因组DNA或益生菌株对于过敏反应患者的细胞的有利效应，所述过敏反应患者对于房尘螨致敏，所述房尘螨是在住宅中发现的微观生物体。它们是涉及粉尘的过敏反应的主要原因。
其他报告全部仅涉及活的或杀死的益生细菌对于由食物过敏反应或气源性变应原引起的变应性疾病的有利效应。我们的数据暗示，益生细菌及其基因组DNA通过直接或间接地调节对于抑制TH2细胞因子而言所需的信号途径来发挥作用，因为甚至当在SEA或Dpt刺激之前或同时(对于基因组DNA来说)添加益生细菌及其基因组DNA时，也观察到了抑制效应。一些实验研究表明，IL-4和IL-5的产生的调节是多因素过程，并且某些细胞因子例如IFN-γ被描述为IL-4产生的可能的调节剂。此外，报道了，IL-12是在引发由人PBMC产生IFN-γ中的首要细胞因子。在我们的研究中，益生细菌及其基因组DNA能够增加由PBMC所进行的IL-12产生(数据未显示)。
在这个方面，将细菌DNA添加至经SEA刺激的PBMC培养物中，并且有趣的是，这个实验显示了在用细菌DNA进行刺激和SEA处理后的各式各样的IL-4和IL-5细胞因子产生。益生细菌的细菌DNA使IL-5分泌减少的程度大于使IL-4分泌减少的程度。我们的数据暗示，益生细菌的基因组DNA可以用作关于健康受检者和过敏反应受检者的经SEA或Dpt刺激的PBMC的IL-4和IL-5产生而言的抑制剂。此外，目前研究报道了，通过加热杀死的益生细菌减少由经SEA刺激的PBMC来进行的IL-4和IL-5产生。考虑到制备过程、经过胃肠道和高温(70℃)影响细菌的生存力，这些研究的结果显示了基因组DANN的可能的抑制效应，所述基因组DANN由被添加至PBMC中的通过加热杀死的细菌释放。各种不同的文章描述了各种细胞因子对于细菌DNA(例如L-GG的基因组DNA)中所包含的CPG-基序的应答。感兴趣的是了解细胞因子的菌株特异性的释放(其在这项研究中得到了证实)是否与每种菌株的基因组序列和CPG-基序相关。
就我们所知，这个报道是这样的首次报道，所述报道显示了益生细菌的基因组DNA对于健康受检者和过敏反应受检者的经SEA或Dpt刺激的PBMC的免疫调节效应。所观察到的在响应于细菌DNA以及SEA或Dpt刺激而引起的IL-4和IL-5抑制的速度和程度方面的差异是关于活的或杀死的益生细菌和/或细菌组分对免疫应答的影响的令人感兴趣的信息。越来越多的关于益生菌的了解是令人兴奋的，但在不久的将来必须确定哪种益生菌DNA(单种菌株或组合)在特定的疾病中具有最强的效应。还需要经良好组织的随机临床实验，以便将来阐明益生细菌的基因组DNA作为预防试剂和治疗试剂的作用。
在下文中，将借助于实施例以及系列实验的结果来更详细地说明本发明的进一步的细节和特征。然而，它们不应当限制本发明，而只是解释它。附图的概略性的描述如下：
图1
没有SEA和DPT刺激(培养基)或者具有SEA和DPT刺激的PBMC的细胞因子调节。
图2
活的益生细菌对于经由健康受检者的PBMC的SEA刺激而引起的IL-4(A)、IL-5(B)和IFN-γ的产生所发挥的依赖于剂量的抑制效应。
图3
取消
图4
益生细菌的基因组DNA对于由健康受检者(A，n＝5)和过敏反应受检者(B，n＝5)的经SEA或DPT刺激的PBMC所进行的IL-4、IL-5和IFN-γ的产生所发挥的增长抑制效应。
图5
基因组DNA对于由健康受检者的PBMC所进行的IL-4(A)、IL-5(B)和IFN-γ(C)的产生所发挥的依赖于剂量的增长抑制效应。
详细地，所述附图显示了：
图1
没有SEA和DPT刺激(培养基)或者具有SEA和DPT刺激的PBMC的细胞因子调节。
在用SEA-超级抗原(2μg/ml)、DPT(2μg/ml)进行刺激之前或者不进行刺激，以10∶1的“细菌∶细胞”的比率，将健康受检者(A，n＝8)和过敏反应受检者(B，n＝8)的PBMC与没有(PBMC)或者具有4种益生细菌菌株、LgB.bB.L(益生细菌的混合物)和革兰氏阴性对照细菌(大肠杆菌TG1)的培养基一起预温育3小时(以2×106个细胞/ml)。
在温育小时后，在上清液中通过特异的ELISA测试来定量IL-4、IL-5和IFN-γ。星号指明了与对照相比较而言对于TH2和TH1细胞因子产生所发挥的特别的抑制或刺激(*p≤0.05，**p≤0.01)。
图2
活的益生细菌对于经由健康受检者的PBMC的SEA刺激而引起的IL-4(A)、IL-5(B)和IFN-γ的产生所发挥的依赖于剂量的抑制效应。
在用2μg·ml-1的SEA进行刺激前，将4位健康供体的PBMC(2×106个细胞/ml)与4种益生细菌菌株(L-GG、L-Gassery、B.b.、B.1.)以5×104、5×105、2×106、5×106、2×107、5×107的浓度(相应于0.025、0.25、1、2.5、5、10和25个细菌对细胞的比率)一起培养3小时。在温育48小时后，用特异的ELISA来测量IL-4、IL-5和IFN-γ。误差条显示了平均值的标准误差。
图3
取消
图4
益生细菌的基因组DNA对于由健康受检者(A，n＝5)和过敏反应受检者(B，n＝5)的经SEA或DPT刺激的PBMC所进行的IL-4、IL-5和IFN-γ的产生所发挥的增长抑制效应。
在用SEA(2μg·ml-1)或DPT(2000SQ-E ml-1，相应于2μg剂量·ml-1)进行刺激前，将5位健康受检者和5位过敏反应受检者的PBMC与4种益生细菌菌株(L-GG、L-Gasseri、B.b.、B.1.)和LGBBBL(L-Gasseri、B.b.和B.1.的混合物)的基因组DNA以75μg·ml-1的浓度一起温育48小时(以2×106个细胞·ml-1)。
将培养基和LPS(100ng·ml-1)用作对照。在24小时的温育时间后，通过特异的ELISA测试来定量IL-4、IL-5和IFN-γ的产生。星号标明了与对照(培养基)相比较而言细胞因子产生的显著抑制(*p≤0.05，**p≤0.01)。数据表示为平均值+/-SEM。
图5
基因组DNA对于由健康受检者的PBMC所进行的IL-4(A)、IL-5(B)和IFN-γ(C)的产生所发挥的依赖于剂量的增长抑制效应。
将4位健康供体的PBMC与各种浓度(5-105μg·ml-1)的细菌基因组DNA一起进行培养。在温育24小时后，测量IL-4(A)和IL-5(B)的产生。数据表示为平均值+/-SEM。

Claims (11)

1.用于在人中预防、抑制或消除变态反应的药物，其特征在于，包含益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
2.用于使人体中的TH1-TH2比例朝着TH1上升和/或TH2下降的方向移动的药物，其特征在于，包含益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
3.制备用于在人中预防、抑制或消除变态反应的药物的方法，其特征在于，使用益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
4.制备用于使人体中的TH1-TH2比例朝着TH1上升和/或TH2下降的方向移动的药物的方法，其特征在于，使用益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
5.益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌在制备用于预防、抑制或消除人的过敏反应的药物中的用途，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为存活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
6.益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌在制备用于使人体中的TH1-TH2比例朝着TH1上升和/或TH2下降的方向移动的药物中的用途，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
7.益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌用于治疗人变态反应和/或预防人变态反应和/或在人变态反应的情况下降低风险的用途，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
8.益生性革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌用于朝着TH1上升和/或TH2下降的方向来治疗人体中的TH1-TH2比例，和/或预防性地使人体中的TH1-TH2比例朝着TH1上升和/或TH2下降的方向移动，和/或风险降低性地使人体中的TH1-TH2比例朝着TH1上升和/或TH2下降的方向移动的用途，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
9.食品或食品补充剂，其特征在于，所述食品或食品补充剂包含革兰氏阳性细菌例如乳杆菌属和双歧杆菌属细菌作为主要的活性成分，所述益生性革兰氏阳性细菌更确切地说作为活的细菌和/或灭活的细菌和/或其基因组DNA存在。
10.根据前述权利要求中任一项的药物，其特征在于，将所述药物制成用于口服使用，或者用于作为栓剂进行施用，或者用于皮下注射，或者用于静脉内注射，或者作为用于吸入的液体。
11.根据前述权利要求中任一项的药物，其特征在于，细菌菌株为鼠李糖乳杆菌GG，和/或加氏乳杆菌，和/或双歧双歧杆菌，和/或长双歧杆菌。
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