KR20100014133A - 피라졸로피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

피라졸로피리미디논, 기도 평활근, 만성폐쇄성 폐질환, 기도질환, 호흡기 질환, 천식

Description

피라졸로피리미디논 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물{Pharmacological composition comprising pyrazolopyrimidinone compound or pharmaceutical acceptable salt thereof for the prevention and treatment of respiratory disease}

본 발명은 호흡기 질환 예방 및 치료에 관한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

호흡기 질환은 기관지와 폐에 관련된 질병으로, 만성폐쇄성 폐질환, 기관지확장증, 기관지천식, 폐암, 기관지선종 등을 포함하는 질환을 의미한다.

호흡기 질환 중 만성폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 유해입자나 가스등의 흡입에 의하여 폐내에 비정상적인 염증반응이 유발되고 이와 함께 점진적이고 비가역적인 기류제한 (airflow limitation)을 나타내는 질환으로서 만성 기관지염 (chronic bronchitis)이나 폐기종 (emphysema)등을 포함하는 질환이다. 원인으로는 유전 형질 및 기도과민성과 같은 숙주요인과 흡연, 감염, 직업 또는 환경적 노출과 같은 외부요인 등이 알려져 있다. 이 중에서 특히 흡연이 가장 중요한 위험인자로 알려져 있는데 비록 개인의 유전형질 등으로 인하여 차이가 크지만 흡연기간과 기류제한과는 명백한 상관관계가 있음이 보고되고 있다 (MacNee NW, Proc Am Thorac Soc, 2005). 전 세계적인 유병율은 성인에서 약 5 내지 10%로 추정되고 있으며 (Halbert RJ et al., Chest, 2003; Halbert RJ et al., Eur Respir J, 2006), 최근 중남부 아메리카 지역을 대상으로 한 연구에서는 7.8에서 19.7%가 GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) 분류 기준 1단계이상의 COPD 환자인 것으로 보고된 바 있다 (Menezes et al., Lancet, 2005). 국내 유병율은 GOLD 분류 기준의 1단계이상이 18세 이상 45세 이하에서 7.8% (남성 10.9%, 여성 4.9%)이었으며, 45세 이상에서는 17.2% (남성 25.8%, 여성 9.6%)로 나타나 남성이 여성에 비하여 2배 이상 높았으며, 연령이 증가할수록 유병율도 높아지는 것으로 나타났다. 또한, COPD의 가장 큰 위험인자로 알려져 있는 흡연에 따른 COPD 발병 빈도는 흡연자가 비흡연자에 비하여 3배 이상 높았으며 (26.9% 대 8.8%), 흡연량이 증가할수록 발병빈도도 비례하여 증가하는 것으로 나타났다 (10개피이하, 11~19개피, 20개피 이상에서의 빈도는 각각 12.8, 18.8, 35.6%)(The national COPD Survey Committee, Am J Respir Cirt Care Med, 2003). 증상으로는 기침, 객담, 객혈, 기도폐쇄로 인한 호흡곤란 등이 대표적이며 이로 인한 사회 경제적 비용은 점점 증가하고 있는 실정이다. 미국의 경우 1993년 COPD에 의한 직접적인 의료비 지출이 약 147억 달러에 이르렀으며, 이로 인한 노동력 혹은 생산성 감소와 함께 조기사망과 같은 간접적인 비용까지 감안하면 약 239억 달러에 이르는 사회적 비용이 소요된 것으로 추산되었다 (Sullivan SD et al., Chest, 2000). 2002년에는 이러한 비용이 더욱 증가하여 약 321억 달러에 이르는 것으로 조사되었다 (National Heart, Lung, and Blood Institute, 2004). 또한, 건강한 상태로 살아가는 시간이 상실되었음을 나타내는 지표인 장애보정 생존연수 (DALYs; disability-adjusted life years) 기준으로 1990년 12위이었던 COPD가 2020년에는 5위로 올라설 것으로 예상되고 있을 만큼 건강한 삶을 위협하고 있는 질환이기도 하다.

현재 만성폐쇄성 폐질환에 대해 사용 중인 약물은 크게 부신피질호르몬제, 기관지 확장제 및 병용요법으로 분류할 수 있다. 부신피질 호르몬제는 약효의 제한성으로 인해 중증 이상 혹은 재발이 잦은 COPD 환자에 사용되며 근육 나약감, 기능성 감소, 호흡부전과 같은 부작용이 유발되기 때문에 장기간의 사용은 권장되지 않는다. 기관지 확장제는 다시 β2 작용제, 항콜린제, 및 methylxanthines등으로 분류된다. β2 작용제는 기도평활근 확장을 유도하는데 다시 속효성 및 지속성 약물로 세분되며 빈맥, 진전, 저칼륨혈증, 속성 내성 (tachyphylaxis)과 같은 부작용이 있다. 항콜린제의 일반적인 부작용은 구강건조이며, 일부 약물흡입을 위한 마스크 사용으로 인해 녹내장 등이 유발된 사례가 보고되고 있다. Xanthine 유도체들은 포스포디에스테라제 (이하 PDEs; phosphodiesterase)를 비선택적으로 억제하여 기관지 확장이나 항염증 작용등을 나타내는데 비선택적 억제작용으로 인하여 용량 의존적으로 두통, 불면, 오심, 속 쓰림, 심방 및 심실 부정맥, 대발작 간질등의 부작용이 보고되고 있다 (유지홍, 월간 의약정보, 2007).

최근 이러한 단점을 극복하고자 PDEs에 대한 선택적 억제제를 이용한 새로운 치료제의 개발이 활발하게 진행중이다. PDEs는 3’5’-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 혹은 3’5’-cyclic guanosine monophosphate (cGMP)와 같은 cyclic nucleotide들을 가수분해하는 효소로서 사람에서는 11개 family, 44개 이상의 이종효소가 존재하는 것으로 알려져 있다 (Chung KF, Eur J Pharmacol, 2006). 이 들 가운데 포스포디에스테라제 4형(PDE-4) 저해제를 이용한 치료제 개발이 가장 활발하게 진행중이다. PDE-4는 T 세포, B 세포, 호산구, 호중구와 같은 염증세포 뿐만 아니라 기도 평활근 세포등에 존재하고 있으며 cAMP를 가수분해하는 효소이다 (Houslay MD and Adams DR, Biochem J, 2003). 세포내 증가된 cAMP가 염증유발 사이토카인의 분비를 억제하여 항염증 작용을 나타내고 기관지 평활근 이완을 통한 기관지 확장을 유도하여 COPD와 같은 기관지 질환에 대한 치료제로서 주목받아 왔다. 그러나 대표적인 PDE-4 억제제인 rolipram의 경우 구토와 메스꺼움이라는 부작용이 문제가 되었으며, 보다 PDE-4에 대한 선택성을 높인 2세대약물들이 개발되고 있으나 상기 부작용의 발현이 쉽게 해결되고 있지 못한 실정이다.

이러한 가운데 포스포디에스테라제 5형(PDE-5)가 COPD를 포함한 기도질환의 새로운 약물 타깃으로 주목받고 있다. PDE-5는 혈관내피세포 뿐만 아니라 폐장 혈관 평활근, 기관지 혈관 및 기도 평활근에 존재하며 cGMP를 가수분해하는 효소이다(Sebkhi A, Circulation, 2003; Yanaka N, Eur J Biochem, 1998). 대표적인 PDE-5 억제제인 sildenafil의 경우, 기니픽을 이용한 전임상 연구에서 기도과민성 및 폐포액내 백혈구 침윤 감소를 유도하였으며 (Toward TJ, Am J Respir Crit Care Med, 2004), 2명의 COPD 환자를 대상으로 한 간이 임상 실험에서 초당 최대 호흡량 (FEV1)을 각각 24 및 12% 개선시킨 바 있다 (Charan NB, Chest, 2001).

한편, 본 발명자들은 상기 신규한 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 합성하고, 이 화합물이 PDE-5 억제제로 사용될 수 있음을 보고한 바 있다(WO 00/027848, 대한민국 등록특허 제0353014호). 또한, 본 발명자들은 PDE-5 억제제인 상기 피라졸로피리미디논 화합물에 대한 연구를 계속 수행하던 중, 상기 피라졸로피리미디논 화합물이 전립선 비대증 및 이에 수반되는 하부요로증상(대한민국 특허출원 06-30724호 및 국제 특허 출원 PCT/KR06/1242호), 간문맥압 항진증(대한민국 특허출원 05-99900호 및 국제 특허 출원 PCT/KR05/3526호) 및 만성심부전 (대한민국 특허출원 07-56392호)에 대하여 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하고 특허출원 한 바 있다.

본 발명의 피라졸로피리미디논 화합물은 기존의 PDE-5에 대한 선택성이 획기적으로 개선되어 부작용이 크게 경감되었으며 최대혈중 농도 도달시간이 1시간으로 신속하게 약효가 발현되며 체내 반감기가 12시간으로 약효 발현시간이 지속적으로 나타나 1일 복용이 가능하게 되었다. 또한, 경구투여 후 조직분포에 대한 연구결과 폐장 조직내 약물 분포가 우수하며, 기도평활근 이완 작용, 기도과민성 개선작용, 폐포손상 및 염증세포침윤 억제작용이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 폐장내로의 조직분포가 우수하며 기도평활근에 존재하는 PDE-5 활성의 선택적 억제를 통하여 부작용의 발현 없이 효과적으로 기도확장을 유도하고 기도 과민성을 개선시키는 만성 폐쇄성 폐질환, 만성기관지염, 폐기종 및 천식 등과 같은 기도질환 예방 및 치료를 포함한 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 피라졸로피리미디논 화합물인 하기 화학식 1로 표시되는 5-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸아미도설포닐)페닐]-1-메틸-프로필-1,6-디하이드록시-7H-피라졸로(4,3-디)피리미딘-7-온 (5-[2-propyloxy-5-(1-methyl-2-pyrolidinylethylamidosulphonyl)phenyl]-1-methyl-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo(4,3-d)pyrimidin-7-one) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물은 포스포디에스트라제 5형 저해제의 일종으로, 포스포디에스트라제 5형에 대한 저해 활성이 강력하면서도 선택성이 우수하고, 용해도가 개선되어 흡수가 빠르며 생체이용율 및 체내분포 용적이 크고 동일기전의 약물인 실데나필 또는 바데나필에 비하여 체내 반감기가 3배 정도 긴 특징이 있다.

상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물은 158~161℃의 융점, 각각 6.5 및 12.5 정도의 pKa₁, pKa₂ 값을 갖는 수화물이나 용매화물이 아닌 백색 또는 미백색을 띠는 분말로써 물에 용해되기 어려우나, 초산, 메탄올, 클로로포름에는 잘 용해된다.

상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물은 크게 3단계의 합성과정을 거쳐 제조되며, 이의 제조방법은 국제공개특허 WO 00/027848 및 대한민국 등록특허 제0353014호)에 기재되어 있으며, 이를 개략적으로 살펴보면 다음과 같다.

제1단계에서는 4-[2-프로필옥시-5-(클로로설포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 제조한다. 이의 제조를 위해, 일정량의 4-[2-프로필옥시벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 0 ℃로 냉각한 일정량의 클로로설폰산에 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 교반, 여과, 세척 및 건조 등의 과정을 거쳐서 4-[2-프로필옥시-5-(클로로설포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 얻는다.

제2단계에서는 상기 제1단계에서 제조된 피라졸 화합물로부터 4-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸아미도설포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 제조한다. 이의 제조를 위해, 0 ℃에서 제1단계로부터 제조된 일정량의 4-[2-프로필옥시-5-(클로로설포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸의 디클로로메탄 용액에 일정량의 2-(2-아미노에틸)-1-메틸 피롤리딘을 가하여 교반하고, 반응 종료 후 상기 반응용액을 디클로로메탄으로 희석하고, 이 유기층을 세척, 건조, 농축 및 여과 등의 과정을 거쳐서 4-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸 아미도설포닐)벤즈아미도]-1-메틸-3-프로필-5-카바모일 피라졸을 얻는다.

제3단계에서는 상기 제2단계에서 얻은 화합물로부터 본 발명의 피라졸로피리미디논 화합물인 5-[2-프로필옥시-5-(1-메틸-2-피롤리디닐에틸 아미도설포닐)페 닐]-1-메틸-3-프로필-1,6-디히드로-7H-피라졸로(4,3-d)피리미딘-7-온을 제조한다. 이를 위해, 제2단계에서 합성된 일정량의 피라졸 화합물을 t-부탄올에 녹이고 이 용액에 일정량의 칼륨 t-부톡사이드를 가하여 일정시간 환류 교반한다. 반응 완결 후 반응액을 냉각, 희석, 세척, 건조시킨 후, 감압 증류, 용매 제거 및 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 일정량의 순수한 본 발명의 상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 얻을 수 있게 된다.

본 발명에서 약제학적으로 허용되는 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 염을 의미하며, 예를 들어, 나트륨염, 마그네슘염, 칼륨염, 칼슘염, 황산염, 황산수소염, 염산염, 베실레이트염, 캠실레이트염 등이 있다.

본 발명의 조성물은 호흡기 질환 중, 기도질환 예방 및 치료용이 보다 바람직하며, 만성폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 폐기종, 천식의 예방 및 치료용이 보다 더 바람직하다.

본 발명은 PDE-5에 대한 선택적 저해 작용이 우수한 피라졸로피리미디논 화합물들을 이용하여 기도평활근의 효과적인 이완을 유도하며 기도과민성을 개선시키고 이와 함께 폐장조직내로의 약물분포가 우수하여 만성폐쇄성 폐질환, 만성기관지염, 폐기종, 천식 등과 같은 기도질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 평활근 이완작용을 통한 기도 확장 작용, 기도과민성 개선 작용, 폐포손상 및 염증세포 침윤 억제 작용, 또는 포스포디에스테라제 5형(PDE-5) 효소를 선택적으로 억제하는 작용에 의하여 기도 질환 예방 및 치료한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 인체를 포함한 포유동물에게 투여하여 만성폐쇄성 폐질환, 만성기관지염, 폐기종, 천식 등과 같은 기도질환을 포함하는 호흡기 질환의 예방 및 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 만성폐쇄성 폐질환, 만성기관지염, 폐기종 또는 천식 등과 같은 기도질환을 포함하는 호흡기 질환의 예방 및 치료위한 용도를 제공한다. 예를 들어, 상기 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물을 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 약품 또는 건강식품 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 약제학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 흡입 등의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직한 투여 경로는 경구투여이다. 또한, 제제화할 경우에는 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

더불어, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여량 또는 복용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 구체적인 구성 약물의 복용량은 성인 기준으로 화학식 1의 경우 25~200mg을 1일 1회 내지 수회에 나누어 복용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 PDE -5에 대한 높은 선택적 억제작용을 통하여 부작용의 발현 없이 효과적으로 기도확장을 유도하고 기도과민성 개선작용 효과를 나타내며, 폐포손상 및 염증세포침윤 억제 작용 효과를 나타낸다.

또한 본 발명의 화합물은 경구투여시 신속한 약효발현과 혈중 약물 농도가 12시간 이상 효과적으로 유지되어 1회/일 복용으로 만성 폐쇄성 폐질환, 만성기관지염, 폐기종 및 천식 등과 같은 기도질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 복용하였을 경우 효과적으로 폐장내에 분포하여 상기 언급한 기도질환의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여 아래와 같이 랫드에 경구 투여 후 조직분포를 평가하였다. 또한 기니픽 적출 기관지를 이용하여 상기 화학식 1에 의한 기관 수축억제작용을 평가하였으며 기도질환 기니픽 모델을 이용하여 기도저항성 개선작용을 평가하였다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예및 제조예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이하 실시예 및 제조예에서 사용된 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물은 동아제약(주)에서 국제공개특허 WO 00/027848에 따라 제조한 것을 이용하였다.

<실시예 1> 경구투여에 의한 폐장내 분포 평가

본 발명의 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물의 효과적인 체내분포를 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

Sprague-Dawley 계통의 웅성 흰쥐(체중 250g)에 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물(구입처, 동아제약(주)) 및 Sildenafil 을 각각 30mg/kg의 용량으로 경구투여하고 30분, 2시간, 6시간 및 24시간 후 폐장을 적출하여 조직분포를 평가하였다. 폐장내 농도는 고성능액체크로마토그래피법 (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)을 이용하여 정량하였다. 이동상으로는 20mM 인산칼륨/아세톤니트릴 (72:28, v/v)을 사용하였으며 분당 1.5ml의 속도로 흘려주었으며 292nm 파장에서 자외선 감지기를 이용하여 측정하였다. 역상 (reversed-phase) 컬럼을 사용하였으며 측정한계는 0.1/g이었다.

[표 1] 랫드 경구투여 후 조직분포 평가 결과^{1 )}

실험결과 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물은 약물 투약 24시간 이후까지 고농도로 폐장내 분포하였으며, 그 농도는 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물의 PDE-5에 대한 IC50(2.9ng/ml)값에 비하여 매우 높았다. 이러한 결과는 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물이 폐장내에서 강력한 PDE-5 억제 작용을 나타낼 수 있음을 의미한다. 즉, 본원 발명의 화합물은 다른 PDE-5 저해제가 시간이 경과함에 따라 조직 내 농도가 급격히 감소하는 것과는 달리 꾸준하게 농도가 유지되며, 종래 다른 PDE-5 저해제와 비교할 때 폐장내에서 조직 친화도가 크다는 것을 알 수 있다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 화합물은 종래의 다른 폐질환 치료제 보다 더욱 효과적인 폐질환 치료제이며, 안정하게 사용할 수 있음이 확인된다.

<실시예 2> 기니픽 적출 기관에 대한 화학식 1 화합물의 기관 수축억제작용 평가

본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물의 기관 수축 억제 작용을 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

Hartley 계통의 웅성 기니픽(체중 300g)을 에테르로 마취한 후 방혈치사하여 기관을 적출하고 재빨리 Krebs-Henseleit 완충액에 옮겼다. 적출된 기관에서 결합조직 혹은 지방조직을 제거하고 3-4mm 길이로 절단하여 95% O₂, 5% CO₂가 방출되는Krebs-Henseleit 완충액 (37°C)이 든 organ bath로 옮겼다. 준비된 환상형의 기관 조직을 polygraph(Grass Instruments)에 연결된 force transducer에 연결하여 장력을 측정하였으며 1시간 동안 0.3g의 기준장력하에서 안정화시켰다. 이 후 히스타민(histamine) 10㎛을 처리하여 수축반응이 유발되는 조직만을 선별하여 평가하였다.

화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 10, 50, 및 100㎛농도가 되도록 처치하고 10분 후 다시 10㎛의 히스타민을 처치하여 수축을 유도하였다. 화합물을 처치하기 이전의 수축반응에 대비 전처치 후 유발된 수축반응의 상대적 퍼센트를 평가한 결과는 표2와 같으며, 이를 도식화하면 도 1과 같다(도1에서 나타낸 값은 평균 ± 표준오차이며, **은 p<0.01에서 통계학적인 유의성을 나타냄을 의미한다.

[표2]

[¹⁾수축반응(%)=(화합물 처치 후 수축장력/화합물 처치 이전의 수축장력)X 100].

실험결과, 용량 의존적으로 기관 수축 억제 작용이 관찰되었으며, 이는 본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물이 기관지 수축 억제작용을 통하여 만성 폐쇄성 폐질환, 만성기관지염 및 폐기종등의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

< 실시예 3> 기도 질환 기니픽 모델에서 화학식 1 화합물의 기도과민반응 억제 작용 평가

본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물의 기도과민반응 (AHR, Airway Hyper-responsiveness) 개선 작용을 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

Hartley 계통의 웅성 기니픽(체중 300g)에 난백알부민 (ovalbumin) 10ug과 알루미늄 수산화물 (aluminium hydroxide) 100mg을 복강내 투여하여 감작하였다.

감작 14일 후 난백알부민 100ug을 1시간 동안 흡입시켜 기도질환을 야기하고 15일째 히스타민에 (1mM, 20초 흡입) 대한 기도과민반응을 체적변동 측정기 (plethysmography, OCP-3000, Allmedicus Co., Ltd., U.S.A.)를 이용하여 3분간 측정하였다 (Toward TJ et al., Am J Respir Crit Care Med, 2004).

화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(3, 10mg/kg)은 감작 후 13일째, 2차 난백알부민 야기 30분 전 및 6시간 후에 복강내 투여하였다. 시험동물수는 군당 5마리씩으로 하였으며 그 결과는 하기 [표 3]와 같다. 결과는 기도과민반응의 지표인 enhanced pause(Penh)로 표기하였고 그 계산식은 다음과 같다; Penh = ([expiratory time/relaxation time]-1) × (peak expiratory flow/peak inspiratory flow).

[표 3] 기도과민반응 개선 작용 평가 결과

실험결과, 기도폐색을 나타내는 지표인 Penh (enhanced pause)에 있어서 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물이 농도의존적인 개선작용을 나타내었으며, 특히 10mg/kg 투여군에서 매체대조군 대비 통계적으로 유의있게 감소하였음을 확인하였다.

<실시예 4> 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에서 화학식 1 화합물의 기도과민반응 억제 작용 평가

본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물의 기도과민반응(AHR, Airway Hyper-responsiveness) 억제 작용을 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

C57BL/6 웅성 마우스(체중 20-22 g)를 1일 3회, 1주 5일, 총 8주간 담배연기에 노출시켰다. 1회 노출은 다음과 같이 구성하였다; 담배 1개비(타르 8.5 mg, 니코틴 0.9 mg)로 1리터의 연기를 유발하여 6분 동안 동물을 노출시키고 1분간 환기, 다시 담배 1개비로 1리터의 연기를 유발하여 6분간 노출시키고 1분간 환기한 다음 마지막으로 담배 1개비로 1리터의 연기를 유발하여 6분간 노출시킨다. 따라서 동물들은 1일 3회(오전, 정오, 오후), 1일 총 54분(담배 9개비)간 담배 연기에 노출되었다(Valenca SS et al., Toxicol Pathol,2004;Valenca SS et al., Nitric Oxide,2009). 노출은 0.025 m³의 공간에서 전신노출 법을 사용하여 진행하였다(Mauderly JL et al., Exp Pathol,1989). 동물을 담배연기에 노출시키기 시작한지 3주 후, 기관에 MicroSprayer™ aerosoliser (IA-1C; Penn-Century, Philadelphia, PA, USA)를 삽입하여 멸균 생리식염수에 녹인 elastase(3 U, Sigma St. Louise, MO, USA)를 50 μl씩 주입하였다(Pang B et al., Infect Immun,2008; Kinoshita Tetal., Biochem Biophys Res Commun,2007; Bivas-Benita Metal.,Eur J Pharm Biopharm,2005; Hoidal J R et al.,Am Rev Respir Dis,1983). 총 8주간의 시험 후 기도과민반응을 체적변동 측정기(plethysmography)를 이용하여 3분간 측정하였다(Kirschvink N et al., Toxicology,2005). 결과는 기도과민반응의 지표인 enhanced pause(Penh)로 표기하였고 그 계산식은 다음과 같다; Penh = ([expiratory time/relaxation time]-1) × (peak expiratory flow/peak inspiratory flow).

화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(3 mg/kg, 10 mg/kg) 및 대조약물인 실데나필(3mg/kg, 10 mg/kg)은 질환을 유발하는 8주간 1일 1회 경구투여 하였으며 그 결과는 하기 [도 2]와 같으며, 이를 수치화하여 나타내면 표 4와 같다. (도 2에서 나타낸 값은 평균 ± 표준오차(SEM)이며, *는 정상군(Na) 대비, +는 매체대조군(Vehicle) 대비, #는 실데나필(10 mg/kg) 투여군 대비 통계학적 유의성을 나타냄을 의미한다(P<0.05). 또한 도 2에서 Udenafil은 이건 명세서의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물을 의미한다)

[표4]

즉, 도2 및 표4에 나타난 실험결과 Penh에 있어서 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(Udenafil) 및 실데나필은 농도의존적인 기도과민반응 억제 작용을 나타내었으며, 특히 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 10 mg/kg 투여군은 실데나필(3 mg/kg, 10 mg/kg) 투여군과 대비하여 통계학적으로 유의하게 기도과민반응을 억제하였음을 확인하였다.

<실시예 5> 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에서 화학식 1 화합물의 염증세포침윤 억제 작용 평가

본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물의 염증세포침윤 억제 작용을 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<실시예 4>에 제시된 방법으로 질환 유발 및 화합물 투여를 진행한 후 기도에 22G 카테터(catheter)를 삽입하였다. 0.1% bovine serum albumin과 0.05 mM EDTA를 함유한 멸균 생리식염수로 bronchoalveolar lavage fluid(BALF)를 분리한 후 hematology system(ADVIA190, Bayer HealthCare)을 이용하여 WBC differential count(백혈구 백분율)를 진행하였다(D’hulst AI et al., Eur Respir J,2005).

화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(3mg/kg, 10 mg/kg) 및 대조약물인 실데나필(3mg/kg, 10 mg/kg)을 8주간 투여한 결과는 하기 [표 5]와 같다.

[표 5] 염증세포침윤 억제 작용 평가 결과

총 백혈구 수를 측정한 결과 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 10 mg/kg 투여군에서 매체대조군 대비 통계학적으로 유의한 억제효과가 관찰되었다. 실데나필 투여군에서는 감소 경향은 관찰되었으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다. BALF내 호중구 및 호산구 비율을 측정한 결과 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 10 mg/kg 투여군에서 매체대조군 대비 유의성 있게 각각 45.8% 및 59.6%의 염증세 포 침윤 억제 효과가 관찰되었다. 이 결과를 통해 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물이 유의한 염증세포침윤 억제 작용을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 6> 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에서 조직학적 분석을 통한 화학식 1 화합물의 폐포 손상 및 염증세포침윤 억제 작용 평가

본 발명의 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물의 폐포 손상 및 염증세포침윤 억제 작용을 평가하고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<실시예 4>에 제시된 방법으로 질환 유발 및 화합물 투여를 진행한 후 기도를 통해 10% 포르말린을 25 cmH₂0의 압력으로 주입하여 15분간 유지시켰다. 기도를 묶은 후 폐를 적출하여 24시간 이상 10% 포르말린 용액에 고정시켰다(Nakanishi Y et al., Am J Respir Crit Care Med,2009). 이후 얻어진 조직시료는 H&E 염색(조직염색법)을 한 후 peribronchial 및 perivascular inflammation을 평가하였으며(McKay A et al., J Immunol,2004) mean linear intercept법을 활용하여 폐포강 크기를 측정하였다(Thurlbeck WM, Am Rev Respir Dis,1967; Hautamaki RD et al., Science,1997). 이때 사용한 현미경은 Axioskop2 plus(ZEISS, Germany)이며, 도3 및 도4의 배율은 200배이다.

또한, destructive index를 통해 폐포벽 파괴를 측정하였고 활용한 기준은 다음과 같다; at least two alveolar wall defects (1), at least two intraluminal parenchymal rags in alveolar ducts (2), clearly abnormal morphology (3), classic emphysematous changes (4) (Saetta M et al., Am Rev Respir Dis,1985;Robbesom A A et al.,Mod Patho l,2003).

화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(10 mg/kg) 및 대조약물인 실데나필(10 mg/kg)을 8주간 투여한 결과는 하기 [표 6], [도 3] 및 [도 4]와 같다(도3에서, A, 무처치군; B, 매체대조군; C, 실데나필(10 mg/kg) 투여군; D, 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물(10 mg/kg) 투여군이며; 도4에서, A, 무처치군; B, 매체대조군; C, 실데나필(10 mg/kg) 투여군; D, 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물(10 mg/kg) 투여군이다).

[표 6] 폐포 손상 억제 작용 평가 결과

Mean linear intercept법을 활용하여 폐포강 크기를 측정한 결과 실데나필 10 mg/kg 및 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 10 mg/kg 투여군에서 매체대조군 대비 통계학적으로 유의한 폐포강 확장 억제효과가 관찰되었다. 그리고 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물은 실데나필 대비 통계학적으로 유의한 손상 억제 효과를 나타내었다.

또한, Destructive index를 통해 폐포벽 파괴를 측정한 결과 실데나필 및 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 모두 매체대조군 대비 유의성 있게 각각 42.3% 및 49.2%의 폐포벽 파괴 억제 효과를 나타내었다[표 6][도 3].

[도 4]와 같이 조직학적 방법으로 염증세포침윤을 평가한 결과 실데나필(10 mg/kg)과 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물(10 mg/kg) 모두 매체대조군 대비 현저한 억제효과를 나타냈었다.

이 결과를 통해 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물이 유의한 폐포 손상 및 염증세포침윤 억제 작용을 나타냄을 확인하였다.

< 제제예 > 경구투여를 위한 약제학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 흡입제의 제조

화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물 100㎎

난황 레시틴 100mg

α-토코페롤 2mg

아스코르빈산 3mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 흡입제 제조방법에 따라서 정제수를 총 부피가 10ml이 되도록 가하여 제조하였다.

도 1은 기니픽 적출 기관에 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물을 전처치한 후 히스타민을 이용하여 수축반응을 유발하였을때 수축억제 작용을 나타낸 그래프이다.

도 2는 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 및 실데나필을 적용한 후 각각의 기도과민반응 억제 작용을 평가하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 및 실데나필을 적용한 후 폐포 손상을 평가한 군별 대표도면이다.

도 4는 만성 폐쇄성 폐질환 동물모델에 화학식 1 피라졸로피리미디논 화합물 및 실데나필을 적용한 후 염증세포침윤을 평가한 군별 대표도면이다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1의 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.

   <화학식 1>

   
2. 제1항에 있어서, 호흡기 질환이 기도질환인 약제학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 기도질환은 만성폐쇄성 폐질환, 만성 기관지염, 폐기종, 또는 천식인 약제학적 조성물.
4. 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 질환 예방 및 치료가 평활근 이완작용을 통한 기도를 확장 작용 및 기도과민성 개선 작용에 의해 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
5. 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기도 질환의 예방 및 치료가 포스포디에스테라제 5형(PDE-5) 효소를 선택적으로 억제하는 작용에 의하여 이루어지는 것인 약제학적 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 경구투여용 제형인 약제학적 조성물.
7. 제6항에 있어서, 경구투여용 제형이 1회/1일 투여용인 약제학적 조성물.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식1의 피라졸로피리미디논 화합물을 25~200mg 함유한 약제학적 조성물.
9. 제3항에 있어서, 기도질환이 천식인 약제학적 조성물.

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