KR20100005364A

KR20100005364A - 새송이버섯 파치를 함유하는 발효사료조성물 및 이의제조방법

Info

Publication number: KR20100005364A
Application number: KR1020080065365A
Authority: KR
Inventors: 전효곤; 주준영; 이현욱
Original assignee: 한국생명공학연구원; (주)머쉬토피아
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2010-01-15

Abstract

본 발명은 새송이버섯(Pleurotus eryngii) 파치를 함유하는 발효사료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (1) 새송이버섯 파치를 분쇄한 후 물 및 설탕을 첨가한 다음 고압멸균하는 단계; 및 (2) 바실러스, 효모 및 젖산균을 이용하여 순차적으로 발효시키는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법에 의하여 제조되는 발효사료는 장내 미생물 및 효소의 균형을 촉진시키고, 고부가가치의 생균 및 발효대사물질을 포함한 사료로써 유용하게 이용될 수 있다.

새송이버섯, 발효사료, 지오바실러스 스테아로터머필러스(ATCC12980), 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23, 락토바실러스 플랜타럼(KCTC13104).

Description

새송이버섯 파치를 함유하는 발효사료조성물 및 이의 제조방법{Fermented feed composition containing broken articles of Pleurotus eryngii and a method for preparation thereof}

본 발명은 새송이버섯(Pleurotus eryngii) 파치를 함유하는 발효사료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (1) 새송이버섯 파치를 분쇄한 후 물 및 설탕을 첨가한 다음 고압멸균하는 단계; 및 (2) 바실러스, 효모 및 젖산균을 이용하여 순차적으로 발효시키는 단계를 포함하는 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조되는 발효사료조성물에 관한 것이다.

우리가 지속적으로 섭취하고 있는 식용버섯에는 생체에 유용한 기능성 생리활성물질이 다량 함유되어 있을 뿐만 아니라, 장기간 섭취해도 부작용이 없는 것으로 알려져 있어, 기능성 사료의 소재로 개발할만한 가치가 매우 높은 무공해 천연소재의 하나이다.

새송이 버섯의 학명은 Pleurotus eryngii이며 백색목재부후균의 한 가지로서 큰느타리버섯 또는 왕느타리버섯으로도 알려져 있다. 원산지는 남유럽 일대이며, 북아프리카·중앙아시아·남러시아 등지에도 분포한다. 1975년 송이과로 분류되었으나 1986년 느타리버섯과로 재분류되어 큰느타리버섯으로 명명되었다가, 다시 진미(眞味)버섯이라는 가칭을 거쳐 새송이버섯으로 최종 명명되었다. 팽나무버섯(팽이버섯)과 마찬가지로 톱밥을 주원료로 하는 병재배(甁栽培) 방식으로 기른다. 초기에는 오뚝이 모양 또는 눈사람 모양으로 자라다가 성숙해지면서 갓의 표면이 불룩한 형태에서 수평한 형태로 변한다. 대는 흰색이고, 갓은 연한 회색을 띤다. 자실체의 균사조직이 치밀하여 육질이 뛰어나고, 탁월한 맛은 자연산 송이와 비슷하다. 대부분의 버섯은 항산화력을 지닌 비타민 C가 없거나 매우 적은 데 비하여 새송이버섯은 비타민 C가 느타리버섯의 7배, 팽이버섯의 10배나 많이 함유하고 있다. 일반 버섯에 주로 함유된 비타민 B1, 비타민 B2 및 나이아신 등은 검출되지 않지만, 다른 버섯에는 거의 없는 비타민 B6가 많이 함유되어 있고, 악성빈혈 치유인자로 알려진 비타민 B12도 미량 함유되어 있다. 전당 함량이 높은 편이고, 조지방 함량은 표고버섯의 2배이다. 필수아미노산 10종 가운데 9종을 함유하고 있고, 칼슘과 철 등 신진대사를 원활하게 도와주는 무기질의 함량도 다른 버섯에 비하여 매우 높다. 대와 갓의 구분이 확실하고, 대가 굵으면서 곧으며, 갓의 끝부분이 두껍고 짙은 황토색이며, 대의 부분이 촉촉하면서 조금 단단하며, 버섯 자체의 수분이 적고 갓 밑부분이 노랗게 변색되지 않은 것이 좋은 상품이다. 미나리과(산형과)·분과·부처꽃과 등 초본식물의 뿌리에 질병을 유발시키는 병원균으로도 보고되어 있다.

식용버섯을 이용하여 개발된 기존의 제품은 거의 모두가 가공식품으로서, 느타리버섯, 표고버섯, 양송이버섯 등을 주재료로 이용하고 있다. 그런데 이들 버섯은 파치가 생성되지 않아 버섯자체를 가공재료로 이용할 수밖에 없기 때문에 가공제품의 생산단가가 높아진다는 결정적인 문제점을 안고 있다. 그러나 새송이버섯의 경우, 수확 후 버섯을 다듬을 때 1차적으로 균체 파치가 20% 정도 생성되고, 2차적으로 5% 정도의 버섯 파치가 자연적으로 생성되며, 상품성이 낮아 생버섯으로의 시장성이 거의 없는 등외버섯 파치가 20% 정도 생산되는 특성을 가지고 있는데, 이것을 가공소재로 이용하게 되면 가공제품의 생산단가가 현저히 낮아진다는 강점을 지니고 있다. 또한, 새송이버섯의 등외버섯 파치는 연간 15,000톤, 버섯 파치는 연간 3,750톤 및 균체 파치는 15,000톤 정도 생성되고 있어, 총 33,750톤을 가공소재로 이용할 경우, 새송이버섯 시장에서 유통되는 물량 중 25% 정도를 줄일 수 있는 이상적인 결과를 초래하여, 새송이버섯 시장가격의 상승과 안정을 유도할 수 있는바, 이의 경제적인 가치는 매우 높다고 판단된다.

생균제(probiotics)는 가축의 생산성 향상을 목적으로 하는 유익한 미생물을 제제화한 사료첨가제 또는 동물약품으로서, 장내 세균의 이상 발효에 의해 야기되는 제반증상을 치료 내지는 개선한다. 생균제는 항생제와는 반대로 미생물을 활성화시키는 작용이 있다. 생균제에 사용되는 미생물은 호기성간균, 통성혐기성구균, 유산균 및 효모 등으로서, 일반적으로 살아있는 상태로 투여된다. 생균제는 일반적으로 인체용과 가축용으로 나누어진다.

날씨가 불순하거나 사료가 바뀌는 경우 또는 가축이 이동하는 경우, 대장균, 살모넬라균, 포도상 구균 등의 유해 미생물이 비정상적으로 증식하여 장내 미생물의 균형이 깨어지게 되며, 이 때 발생되는 설사는 경우에 따라 가축에 치명적일 수 도 있다. 지금까지 보고에 의하면, 이러한 장내 미생물의 균형을 개선시키기 위한 신규의 단일 미생물 및 그 미생물을 포함하는 생균제가 한국 공개특허공보 제 1998-78353호[락토바실러스(KCTC 315BP)] 및 제 1998-25282호[바실러스 서브틸리스 SY8-24(KFCC-11027)]에 게재되어 있다. 그러나, 한국 공개특허공보 제 1998-25282호[바실러스 서브틸리스 SY8-24(KFCC-11027)]의 경우 내생포자의 수율이 나타나 있지 않고 단지 둘시톨 이용능만을 특징으로 하고 있어 내열성이 요구되는 사료 첨가제로 이용하기에 부적합하였다. 또한, 한국 공개특허공보 제 1998-78353호에 기재된 락토바실러스만으로는 충분한 장내 미생물 및 효소의 균형을 개선시키는 효과를 얻을 수가 없을 뿐만 아니라 펠렛화 과정을 거치면 대부분(90%) 이상 사멸하여 기대하는 효과를 얻을 수가 없었다.

이에, 본 발명자들은 발효에 사용된 혼합균주로 소화기 중부에 정착하여 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성 능력이 우수한 지오바실러스 스테아로터머필러스(Geobacillus sterothemophilus), 소화기 말단에 정착하여 젖산으로 전환시켜 장내 흡수를 용이하게 하고 비타민 B의 합성 및 비타민 E의 흡수를 촉진하는 사카로마이세스 칼스베르제니시스(Saccharo-myces Carlsbergensis), 및 소화기 상단에 정착하여 유기산을 생성하여 저분자 탄수화물을 분해하는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)를 사용하여 새송이버섯 부산물을 발효시킴으로써 장내 미생물 및 효소의 균형이 개선되고, 고부가가치의 생균 및 발효대사물질을 포함한 사료조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 새송이버섯 파치를 바실러스, 효모 및 젖산균을 이용하여 순차적으로 발효시켜 제조한 장내 미생물 및 효소의 균형이 개선되고, 고부가가치의 생균 및 발효대사물질을 포함한 발효사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 새송이버섯(Pleurotus eryngii) 파치를 분쇄하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 분쇄된 새송이버섯에 물 및 설탕을 첨가한 혼합물을 고압멸균하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 고압멸균된 혼합물에 바실러스균을 접종한 후 배양하여 설탕으로부터 과당 및 레반(levan)을 형성시키는 단계;

4) 상기 단계 3)의 배양물에 효모를 접종한 후 배양하여 알코올 발효시키는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 배양물에 젖산균을 접종한 후 배양하여 젖산 발효시키는 단계를 포함하는 발효사료 조성물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 발효사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 발효사료 조성물은 새송이버섯의 파치를 이용하기 때문에 경제적이며, 유용한 복합 미생물을 이용함으로써 장내 미생물 및 효소의 균형을 개선시키고, 고부가가치의 생균 및 발효대사물질을 포함함으로써 양질의 사료조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 용어 '파치'란 깨어지거나 흠이 나서 못 쓰게 된 물건으로서 상품성이 낮아 시장성이 없는 것을 의미한다.

본 발명은

1) 새송이버섯(Pleurotus eryngii) 파치를 분쇄하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 배양물에 효모를 접종한 후 배양하여 알코올발효시키는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 배양물에 젖산균을 접종한 후 배양하여 젖산발효시키는 단계를 포함하는 발효사료조성물 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 순차적 발효의 이유는 새송이버섯 파치의 경우 미생물발효에 필요한 탄소원이 부족하여 설탕으로 보충하여야 하는데, 이때 바실러스로 설탕분자 중에 프락토스를 이용하여 레반을 생성하고 남은 글루코스로 효모와 유산균을 배양하기 때문이다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 상기 새송이버섯 파치는 재배하거나 시판되는 새송이버섯으로부터 유래한 깨어지거나 흠이 나서 상품성이 떨어진 것은 모두 가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 혼합물은 새송이버섯 50 ~ 70 중량%, 물 25 ~ 35 중량% 및 설탕 5 ~ 25 중량%로 구성되는 것이 바람직하고, 새송이버섯 60 중량%, 물 30 중량% 및 설탕 10 중량%로 구성되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 고압멸균은 고압멸균기(Autoclave)를 이용하는 것이 바람하고, 이때 조건은 100 ~ 140℃에서 10분 ~ 30분 동안 멸균하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 바실러스균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 폴리미샤(Bacillus polymyxa), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리티커스(Bacillus amylolyticus) 및 바실러스 스테아로터머필러스(Bacillus sterothemophilus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 지오바실러스 스테아로터머필러스(Geobacillus sterothemophilus)를 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 설탕을 기질로 사용하여 폴리감마글루탐산(poly-gamma-glutamic acid) 또는 레반을 생성하는 바실러스균은 모두 사용가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 효모는 사카로마이세스 세례비제(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르제니시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 포르모센시스(Saccharomyces formosensis), 사카로마이세스 플라길리스(Saccharomyces flagilis), 사카로마이세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 로부스투스(Saccharomyces robustus), 사카로마이세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 세이크(Saccharomyces sake) 및 사카로마이세스 윌리누스(Saccharomyces willinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23(Saccharomyces Carlsbergensis Saflager S-23)을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 포도당에서 알코올을 생성하는 효모는 모두 사용가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 5)의 젖산균은 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 사 용하는 것이 바람직하고, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 항균활성을 나타내며 유기산을 생성하는 젖산균은 모두 사용가능하다.

본 발명자들은 상기 제조방법을 이용하여 삼각플라스크 및 20리터 배양기에서 각각 발효사료를 제조하였다. 우선, 새송이버섯 파치와 물의 급수 비율을 2 : 1의 질량비로 혼합하여 분쇄한 후 설탕을 10% 첨가한 다음 고압멸균하여 배지를 제조하였다. 상기 배지에 전배양된 지오바실러스 스테아로터머필러스를 접종하여 배양하였다. 상기 지오바실러스 스테아로터머필러스 접종 48시간 후, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23를 접종하여 배양하였다. 상기 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23 접종 48시간 후, 전배양된 락토바실러스 플랜타럼을 접종 후 배양하여, 접종 48시간 후에 완료시켰다.

또한, 본 발명자들은 상기 발효사료를 제조하는 과정에서 바실러스, 효모 및 젖산균의 순차적인 삼단계 발효의 진행 여부를 확인하기 위하여, 상기 지오바실러스 스테아로터머필러스, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23 및 락토바실러스 플랜타럼을 접종한 각각의 시점부터 8시간 마다 시료를 회수하여 생균수 및 pH를 측정하였다.

삼각플라스크에서 제조한 경우, 지오바실러스 스테아로터머필러스 균주는 초기 접종 상태인 6.8×10⁵ CFU/ml를 유지하며 변화가 없었고, 사카로마이세스 칼스베 르제니시스 사프라거 S-23 효모는 초기 상태 2.8×10⁶ CFU/ml에서 상기 효모 접종 후 32시간이 지난 시점에서 5.0×10⁸ CFU/ml을 유지하였고, 상기 효모 접종 56시간이 지나면서 감소하기 시작하였으며, 락토바실러스 플란타럼 균주는 초기 접종 상태가 8.4×10⁶ CFU/ml을 유지하였으나 시간이 지남에 따라 점차적으로 증가하여 4.0×10⁸ CFU/ml까지 증가하였다(도 1 참조).

20리터 배양기에서 제조한 경우, 지오바실러스 스테아로터머필러스 균주는 초기 접종 후 점점 증가하여 접종 후 48시간 후에 8.7×10⁸ CFU/ml, 접종 후 96시간 후에 9.0×10⁸ CFU/ml까지 증가하였다가 감소하기 시작하였고, 사카로마이세스 칼스베르제니시스는 7.9×10⁸ CFU/ml의 초기 접종 상태에서 9.1×10⁸ CFU/ml까지 증가 후 감소하였으며, 락토바실러스 플랜타럼은 7.7×10⁷ CFU/ml으로 시작되어 8.2×10⁸ CFU/ml까지 증가하였다(도 4 참조).

시간의 경과에 따라 pH의 변화는 삼각플라스크 및 20리터 배양기의 경우 동일하게 나타났으며, 제조시 초기 pH가 시료 자체의 pH인 4.9였고, 지오바실러스 스테아로터머필러스 접종 후 pH 변화가 미미하였으며, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 접종 후 16시간 후 pH 4.6을 나타내었으며, 락토바실러스 플란타럼 접종 후 점차 낮아지기 시작하여 최종 pH 4.3을 나타내었다(도 1 및 도 4 참조). 이는 상기 미생물의 발효에 의한 젖산 생성 때문에 pH가 감소하는 것을 알 수 있다.

따라서, 생균수 및 pH의 변화를 확인함으로써 순차적인 삼단계 발효의 진행 여부를 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 상기 발효사료를 제조하는 과정에서 삼단계 발효의 진행 여부를 확인하기 위하여, 박층크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography; TLC) 및 포도당 분석 키트(Glucose Assay kit)를 이용하여 각각 배양시간에 따른 설탕의 정성적 변화 및 포도당 함량 변화를 측정하였다. 설탕의 정성적 변화 분석 결과, 초기 미생물 접종 상태에서는 설탕과 약간의 올리고(oligo)당이 검출되었으나, 배양시간이 지남에 따라 설탕의 양은 줄어들면서 과당과 포도당이 검출되었다. 배양 후 72시간이 경과 되면서 포도당은 완전히 소모되어 과당과 포도당이 증가되어 72시간에 최대값을 나타내었으며, 이후 과당과 포도당이 소모되며 96시간 이후에는 설탕, 과당 및 포도당이 완전히 검출되지 않고 약간의 올리고당만이 검출되었다(도 2 참조). 포도당의 함량 분석 결과, 미생물 배양 후 24시간까지 포도당 18 g/L생성되었으며 이후 72시간에 22 g/L까지 생성된 후 급속히 감소하기 시작하여 120시간 이후에는 포도당이 검출되지 않았다(도 3 참조).

따라서, 설탕 및 포도당의 함량 변화를 확인함으로써 삼단계 발효의 진행 여부를 알 수 있었다.

본 발명의 사료조성물은 상기 새송이버섯 파치의 발효 산물 이외에도, 당해 기술분야에 공지된 일반적인 사료 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 사료 조 성물은 곡물 가루, 당질, 비타민, 아미노산, 단백질, 지질, 광물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 곡물 및 곡물 부산물이 사용될 수 있는데, 예컨대 평지씨, 면실, 대두, 밀기울，미강，탈지강，맥강，옥수수겨，맥아근，대두피,감자 전분，고구마 전분，옥수수 전분，커피박，잠사，잠분，해조분，타피오카，대두박，면실박，임자박，채종박，아마박，호마박，옥수수글루텐，밀글루텐，낙화생박，야자박，해바라기씨박，주정박，옥수수배아박，고추씨박，장유박，맥주박 중에서 하나 또는 2종 이상이 혼합될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 수용성 및 수불용성 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드와 같은 당 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 당질로서 보다 상세하게는, 포도당, 만노오스, 프룩토오스, 백당, 맥아당, 셀로비오스, 젖당, 트레할로오스, 멜리비오스, 라피노오스, 에스크린, 살리신, 아미그달린, 만니톨, 솔비톨, 소르보스, 멘티토오스 등을 들 수 있으며, 당밀, 자당뿐만 아니라 올리고당도 병용하여 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 임의의 아미노산 성분에는 아르기닌, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산나트륨, 글리신, 프롤린, 세린, 시스테인, 및 이들의 동족체, 및 이들의 염이 있다.

본 발명의 사료 조성물에 임의로 첨가할 수 있는 비타민에는 티아민· HCl, 리보플라빈, 피리독신·HCl, 니아신, 니아신아미드, 이노시톨, 염화콜린, 판토텐산 칼슘, 바이오틴, 폴산, 아스코르브산, 및 비타민 A, B, K, D, E 등이 있다. 이 중, 특히 비타민 A, 비타민 B군 및 비타민 E는 항산화 물질로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 지방산은, 예를 들어, 대두유, 평지씨유, 옥수수유, 홍화유, 해바라기유, 라이스유, 비프스테이크 식물유, 달맞이꽃유, 유리지치유, 아마인유 등의 식물유, 및 가다랭이, 고등어, 정어리 등의 어유 및 각종 미생물 유래의 트리글리세라이드 등의 유지를 가수 분해 처리함으로써 수 득할 수 있다. 그리고, 상기에서 얻어지는 지방산의 금속염으로서 지방산의 칼슘염 및 마그네슘염 또한 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 사장석, 벤토나이트, 맥반석 등 공지의 바이오세라믹 물질이 소량 첨가되어 항균 기능 등을 배가시킬 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 약제 성분을 첨가할 수 있고, 특히 항생제, 생균제, 감미제, 제산제, 지사제 등의 인공적 화학약품을 포함시켜도 본 발명의 범주안에 들지만, 전술한 이유에서와 같이 항생제, 생균제, 감미제와 같은 약품은 포함시키지 않는 것이 비용 및 육류 품질의 측면에서 권할 만하다. 이외에도, 본 발명의 사료 조성물은 칼슘원으로서 패각류를, 철, 망간, 구리, 아연, 몰리브덴의 미네랄원으로서 게 껍질, 소라 껍질 등을 소량 첨가할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 삼각플라스크배지에서 발효사료 조성물의 제조

<1-1> 배지의 제조

새송이버섯 파치(경남 진주시 대곡면소재 (주)머쉬토피아) 1490 g에 745 ml의 물을 첨가한 후, 설탕 250 g을 첨가하여 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후 250 ml 플라스크(flask)에 50 ml씩 분주하여 고압멸균기(Autoclave)를 이용하여 121℃에서 15분간 고압멸균하여 발효를 위한 배지를 제조하였다.

<1-2> 삼단계 발효

지오바실러스 스테아로터머필러스[Geobacillus sterothemophilus (ATCC12980)]는 LB 브로스(Broth)[효모 추출물(yeast extract) 0.5%, 트립톤(tryptone) 1%, 소금(NaCl) 1%)를 이용하여 24시간 전배양(37℃, 250 rpm)후, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 플라스크 배지에 1% 수준으로 접종한 후 배양(37℃, 250 rpm)하였다. 상기 지오바실러스 스테아로터머필러스 접종 후 시료를 회수하고 8시간 마다 시료를 회수하여 생균수 및 pH를 측정하였다. 지오바실러스 스테아로터머필러스 접종 후 48시간이 지난 후에 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23[Saccharo-myces Carlsbergensis Saflager S-23(주식회사 비전바이오캠에서 시판중인 활성건조 효모를 구입)]을 0.5 g/L이 될 수 있도록 접종 후 20℃에서 정 치 배양하였다. 상기 효모 사프라거 S-23 접종 후 시료를 회수하고 각 8시간 마다 시료를 회수하여 생균수 및 pH 측정하였다. 마지막으로 락토바실러스 플랜타럼[Lactobacillus plantarum(KCTC13104)]은 MRS 배지[DifcoTMLactobacilli MRS 브로스(Broth) + 락토오즈(lactose) 0.5%]에 24시간 전배양(37℃, 250 rpm)후 사프라거 S-23 배양 48시간 후에 시료의 1%를 접종하였다. 상기 접종 시점에서 8시간 마다 시료를 회수하여 생균수 및 pH를 측정하였다. 배양은 락토바실러스 플랜타럼 접종 후 48시간에 완료시켰다.

< 실시예 2> 삼단계 발효중 균수 및 pH 의 변화

상기 실시예 <1-2>에서 지오바실러스 스테아로터머필러스, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23, 및 락토바실러스 플랜타럼을 순차적으로 접종한 후 각각의 단계에서 시료를 회수하고 8시간마다 시료를 회수하여 생균수 및 pH 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 지오바실러스 스테아로터머필러스 균주는 접종 상태인 6.8×10⁵ CFU/ml 유지하며 변화가 없었다. 지오바실러스 스테아로터머필러스 균주 접종 48시간 후에 맥주발효 효모인 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23 균주를 배양하였다. 초기 상태 2.8×10⁶ CFU/ml에서 상기 효모 접종 후 32시간(도 1의 80시간)이 지난 시점에서 5.0×10⁸ CFU/ml을 유지하였고, 접종 후 56시간(도 1의 104시간)이 지나면서 감소하기 시작하였다. 지오바실러스 스테아로 터머필러스 균주 접종 96시간 후에 락토바실러스 플란타럼 균주를 접종하였다. 초기 상태는 8.4×10⁶ CFU/ml을 유지하여 시간이 지남에 따라 점차적으로 증가하여 4.0×10⁸ CFU/ml까지 확인하였다(도 1).

또한, 배양 후 시간의 경과에 따라 pH의 변화를 측정하여 보았다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 사료 제조시 초기 pH는 시료 자체의 pH인 4.9를 나타내었고, 지오바실러스 스테아로터머필러스 접종 후 pH 변화가 미미하였으며, 사카로마이세스 칼스베르제니시스 접종 후 16시간 후에는 pH 4.6을 나타내었으며, 락토바실러스 플란타럼 접종 후에는 점차 낮아지기 시작하여 최종 pH는 4.3이였다(도 1).

< 실시예 3> 삼단계 발효중 설탕의 변화

상기 실시예 <1-2>의 삼단계 배양 중 배양시간에 따른 설탕의 변화는 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography; TLC)(MERCK Silica gel 60 F25)를, 배양 시간에 따른 포도당 함량변화는 Glucose(GO) Assay kit(SIGMA GAGO-20)를 이용한 방법으로 확인하였다. 시료는 초기 접종상태(0 hr)부터 24시간(hr) 단위로 1 ml씩 취한 후 원심분리(7000rpm, 10min)를 행하여 상등액을 회수한 후 10배 및 100배로 각각 희석하였다. 상기 10배 희석액은 TLC 측정에, 100배 희석액은 키트를 이용한 포도당(Glucose) 측정에 사용하였다.

<3-1> 설탕의 정성적 변화량 측정

배양시간에 따른 설탕의 정성적 변화량을 알아보기 위하여 사용한 TLC는 MERCK사의 Silica gel 60 F254가 도포된 플레이트에 10배 희석된 시료 1 ul씩 스포팅하여 건조시킨 후 CH₃CN : H₂O(8.5 : 1.5) 용액으로 1회 전개시킨 후 다시 건조 후 3회 반복 실시하여 10% H₂SO₄를 이용하여 발색하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 초기 접종상태에서는 배지 성분의 설탕(도 2-C)과 약간의 올리고(oligo)당(도 2-D)이 검출되었으나, 배양시간이 지남에 따라 설탕의 양은 줄어들면서 과당(도 2-A)과 포도당(도 2-B)이 검출되었다. 배양 후 72시간이 경과 되면서 포도당은 완전히 소모되어 과당과 포도당이 증가되어 72시간에 최대값을 나타내었으며, 이후 과당과 포도당이 소모되며 96시간 이후에는 설탕, 과당 및 포도당이 완전히 검출되지 않고 약간의 올리고당만이 검출되었다(도 2).

<3-2> 포도당의 변화량 측정

배양시간에 따른 포도당의 변화량을 측정하기 위하여 SIGMA사에서 생산된 키트를 사용하였다. 아스파라길러스 나이저에서 생산된 500 유닛(unit) 글루코스 옥시데이스(Glucose oxidase)와 100 퍼풀로갈린 유닛(purpurogallin unit)의 펄옥시데이스(peroxidase)를 38 ml의 증류수에 녹인 후 0.1 mg/ml의 오르토-다이아니시딘 디하이드로클로라이드(o-Dianisidine dihydrochloride) 용액 0.8 ml을 혼합하여 시 약 1을 제조하였다. 96 웰플레이트에 시료 50 ul를 취한 후 각 시료에 시약 1을 100 ul 넣고 실온에서 90초간 반응 후 12 N H₂SO₄ 100 ul를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 Bio-RAD사(model 608)의 마이크로 플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정 후 포도당량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 배양 후 24시간까지 포도당 18 g/L가 생성되었으며 이후 72시간에 22 g/L까지 생성된 후 급속히 감소하기 시작하여 120시간 이후에는 포도당이 검출되지 않았다(도 3).

< 실시예 4> 20리터 배양기에서 발효사료 조성물의 제조

새송이버섯 파치와 물의 급수 비율을 질량비 2 : 1로 혼합하여 분쇄한 후 설탕을 10% 첨가한 배지를 이용하여 20 L 배양기에서 배양 중 상기 실시예 <1-2>와 같은 방법으로 미생물을 삼단계로 접종하면서 <실시예 2>와 같은 방법으로 발효시간별 생균수를 확인해 보았다. 전 배양 배지로서 레반 형성 배지(설탕 10%, 효모추출물 0.25%, Na₂HPO₄ 0.3%, NaH₂PO₄ 0.3%, MgCl₂ 0.07%)를 사용하였으며, 배양 후 10% 접종하여 접종 농도를 6.9×10⁶ Log CFU/ml 균수를 나타내었다. 또한, 20 L 발효통을 사용하여 배양할 때 진탕을 통하여 균체 증식이 원활하게 이루어질 수 있게 하였으며, 배양 후 48시간이 지난 시점에서 사카로마이세스 칼스베르제니시스를 접종하여 배양하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 접종 후 지오바실러스 스테아로터머필러스는 8.7×10⁸ CFU/ml상태가 되었으며, 접종 후 96시간 후에 9.0×10⁸ CFU/ml까지 증가하였다가 감소하기 시작하였다. 사카로마이세스 칼스베르제니시스는 7.9×10⁸ CFU/ml의 초기상태에서 9.1×10⁸ CFU/ml까지 증가 후 감소하였다. 락토바실러스 플랜타럼은 7.7×10⁷ CFU/ml으로 시작 되어 8.2×10⁸ CFU/ml까지 증가 후 배양이 완료되었다(도 4).

또한, 배양 후 시간의 경과에 따라 pH의 변화를 측정한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 상기 실시예 <2-2>의 경우와 큰 차이가 없었다(도 4).

도 1은 멸균된 삼각플라스크 배지에서 새송이버섯 파치의 발효시간별 pH 변화 및 미생물 생균수를 나타내는 그래프이다.

도 2는 멸균된 삼각플라스크 배지에서 새송이버섯 파치의 발효중 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatograph; TLC)를 사용한 배양시간에 따른 설탕의 변화를 나타내는 그림이다:

S: 설탕(대조군);

F: 과당(대조군);

G: 포도당(대조군);

A: 과당;

B: 포도당;

C: 설탕; 및

D: 올리고당.

도 3은 멸균된 삼각플라스크 배지에서 새송이버섯 파치의 발효중 배양시간에 따른 글루코오즈의 농도변화를 나타내는 그래프이다.

도 4는 멸균된 20리터 배양기에서 새송이버섯 파치의 발효시간별 pH 변화 및 미생물 생균수의 변화를 나타내는 그래프이다.

Claims

1) 새송이버섯(Pleurotus eryngii) 파치를 분쇄하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 배양물에 젖산균을 접종한 후 배양하여 젖산발효시키는 단계를 포함하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 혼합물은 새송이버섯 50 ~ 70 중량%, 물 25 ~ 35 중량% 및 설탕 5 ~ 25 중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 2항에 있어서, 상기 혼합물은 새송이버섯 60 중량%, 물 30 중량% 및 설탕 10 중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 고압멸균은 100 ~ 140℃에서 10분 ~ 30분 동안 고압멸균하는 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 바실러스균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 폴리미샤(Bacillus polymyxa), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리티커스(Bacillus amylolyticus) 및 바실러스 스테아로터머필러스(Bacillus sterothemophilus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 바실러스균은 지오바실러스 스테아로터머필러스[Geobacillus sterothemophilus(ATCC12980)]인 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 효모는 사카로마이세스 세례비제(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르제니시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 포르모센시스(Saccharomyces formosensis), 사카로마이세스 플라길리스(Saccharomyces flagilis), 사카로마이세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 로부스투스(Saccharomyces robustus), 사카로마이세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 세이크(Saccharomyces sake) 및 사카로마이세스 윌리누스(Saccharomyces willinus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 효모는 사카로마이세스 칼스베르제니시스 사프라거 S-23(Saccharo - myces Carlsbergensis Saflager S-23)인 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 5)의 젖산균은 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특 징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항에 있어서, 단계 5)의 젖산균은 락토바실러스 플랜타럼[Lactobacillus plantarum(KCTC13104)]인 것을 특징으로 하는 발효사료 조성물 제조방법.

제 1항의 제조방법에 의해 제조된 발효사료 조성물.