CN115644304A - 一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺 - Google Patents
一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其通过枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、乳酸菌分步发酵，研究了不同发酵条件对发酵饲料中益生菌活菌数、乳酸浓度、短链脂肪酸浓度、胞外蛋白浓度、氨基酸浓度的影响，获得益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的优化工艺，有利于维持发酵饲料中微生物菌种的高活性，提高乳酸、短链脂肪酸、胞外蛋白、氨基酸等营养成分含量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，属于生物技术领域，具体涉及一种通过优化分步发酵条件来降解香菇菇脚中纤维素含量及提高菇脚发酵饲料中益生菌活菌数、氨基酸、乳酸、乙酸等含量的方法。
背景技术
益生菌发酵饲料是一种无毒无抗的生物饲料，是指通过微生物的代谢和繁殖对植物性农副产品等原料进行分解转化，是指通过微生物的代谢和繁殖对植物性农副产品等原料进行分解转化，将饲料中的多糖、蛋白质、脂肪等大分子物质和抗营养因子转变为更有利于动物采食、吸收的小分子物质，是富含高活性益生菌及其代谢产物的绿色无毒饲料。
香菇菇脚是香菇柄基部1～3cm的部分，是蘑菇生产过程中产生的以蘑菇根部以及少量菌糠为主的废弃物。随着我国食用菌产业的快速发展，菇脚的产量也迅速增加，数量庞大，目前在农业生产中，菇脚往往被当做普通垃圾直接处理，或焚烧或填埋，或用作堆肥和栽培再利用，一方面造成环境污染，另一方面对菇脚的整体资源利用率及经济效益低。但菇脚的活性成分齐全，富含畜禽所需的18种氨基酸和多糖、纤维素、蛋白质、多肽、氨基酸、黄酮、皂苷、多酚等多种生物活性物质，营养价值丰富，是不可多得天然资源。
益生菌发酵香菇菇脚，能降解其中的纤维素大分子物质同时促进小分子物质释放，将废弃物资源转化为富含活性益生菌及其代谢产物的绿色饲料。利用益生菌发酵菇脚废弃物，能将大量的废弃物资源利用起来，将其变成动物饲料用于农业生产，不但能够减少环境的污染，同时还能形成可持续的农业发展模式。益生菌枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌对产品在发酵过程中起到主导性作用。枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌在发酵中不仅能各司其职，同时相互之间会产生一定协作或拮抗关系。菇脚纤维素含量较高，影响动物消化吸收。
枯草芽孢杆菌具有降解纤维素这种抗营养物质的能力，能将其降解为小分子物质，同时枯草芽孢杆菌好氧发酵消耗反应体系中氧气，可为乳酸菌和酵母菌提供厌氧环境。乳酸菌与酵母菌不仅存在互补机制，而且代谢产物之间能够产生相互促进或抑制作用。酿酒酵母可以通过新陈代谢产生丙酮酸、氨基酸和维生素等促进乳酸菌的生长，乳酸菌为酵母菌提供能量来源，如葡萄糖和半乳糖等单糖，但是乳酸菌产生的低pH环境会强烈抑制酵母菌生长，因此有必要针对益生菌对香菇菇脚的发酵进行工艺改进及调整。
发明内容
针对上述现有技术中的不足之处，本发明提出一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，通过枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、乳酸菌分步发酵发酵，研究了不同发酵条件对发酵饲料中益生菌活菌数、乳酸浓度、短链脂肪酸浓度、胞外蛋白浓度、氨基酸浓度的影响，获得益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的优化工艺。
为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其包括如下步骤：
S1、制备种子液：枯草芽孢杆菌在LB培养基中培养，获得枯草芽孢杆菌种子液；酿酒酵母菌在YPD培养基中培养，获得酿酒酵母菌种子液；乳酸菌在LB培养基中培养，获得乳酸菌种子液；
S2、制备菇脚：将自然风干后的菇脚粉碎，过20-40目筛子；
S3、制备液体发酵培养基：以0.1g/L的MgSO4·H2O、1g/L的NaCl、0.1g/L的CaCl2加水混合制备液体发酵培养基；
S4、加入氮源：S3步骤中制备的液体发酵培养基中加入氮源，氮源的添加量为10g/L，氮源种类分别为硫酸铵、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆或尿素中的一种或多种；
S5、加入菇脚：将S2步骤制备的菇脚与S4步骤制备的培养基掺混均匀，使得混合后料水比为1:3w/v～1:5w/v；
S6、接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚：接种枯草芽孢杆菌种子液，透气封瓶膜封口，120rpm摇床培养，发酵时间为36h～60h，发酵温度为35℃～45℃，接种量为20％～40％；
S7、接种酿酒酵母发酵：S6步骤中的混合物质中接入酿酒酵母菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵12h，发酵温度为30℃～40℃，接种量为15％～25％；
S8、接种乳酸菌发酵：S7步骤中的混合物质中接入乳酸菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵24h～48h，发酵温度为30℃～40℃，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:4～1:1，接种量为15％～25％；
S9、S8步骤获得的混合物质即得发酵饲料。
进一步的，在S6、S7、S8步骤中，接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚36h～60h的发酵培养基中，先接种酿酒酵母菌厌氧发酵12h，再接入乳酸菌与酿酒酵母菌在厌氧条件下共同培养24h～48h。
进一步的，S1步骤中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌活化操作步骤：在超净工作台内，用接种环分别在前期保存于冰箱的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌斜面培养基上轻轻挑取1环于新鲜配制的液体种子培养基内，摇匀密封，然后放置37℃恒温摇床内培养12h～24h；取种子培养液2mL于200mL培养基内继续在37℃恒温摇床内扩大培养12h～24h。
进一步的，S1步骤中，LB培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、0.5～1.0％的NaCl。
进一步的，S1步骤中，YPD培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、1.0～2.0％葡萄糖。
进一步的，S4步骤中，所述氮源为玉米浆。
进一步的，S8步骤中，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:2。
本发明的有益效果：以玉米浆作为氮源、料水比为1:3w/v～1:5w/v、发酵时间为36h～60h、发酵温度为35℃～45℃、接种量为20％～40％，进行枯草芽孢杆菌发酵降解菇脚，发酵后粗纤维降解率明显提高，为35.48％，同时半纤维素、纤维素、木质素降解率分别为31.48％、39.29％、22.34％，枯草芽孢杆菌活菌数、胞外蛋白浓度分别为8.85lgcfu/mL、0.94mg/mL；当酿酒酵母发酵12h后再接种乳酸菌发酵24h～48h，酿酒酵母和乳酸菌发酵温度为30℃～40℃，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:4～1:1，接种量为15％～25％时，酿酒酵母活菌数、乳酸菌活菌数、游离氨基酸浓度、乙酸浓度、乳酸浓度水平明显提高，分别为8.35lgcfu/mL、8.51lgcfu/mL，8.04μg/mL、9.26mg/mL、29.68mg/mL。同时，在发酵中，逐渐积累了包括有机酸、氨基酸及其衍生物、糖类及其衍生物、酯类等，这些物质的富集将有利于提高发酵菇脚饲料的消化吸收，丰富发酵菌脚的营养和功能成分。
其中有机酸包括苯乳酸、乳酸、没食子酸、10E，12Z-十八碳二烯酸、乙酸、戊酸、原儿茶酸、香豆酸、奎尼酸、2-羟基肉桂酸；
氨基酸及其衍生物包括GABA(γ-氨基丁酸)、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸-苯丙氨酸、酪氨酸-亮氨酸；
糖类及其衍生物包括L-古洛糖、甜菊糖苷、藻糖苷E；
酯类包括9，10-二羟基十八烷酸酯、乙酰柠檬酸三丁酯、香草酸甲酯、丁酸乙酯等。
附图说明
图1为氮源种类对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响对比图；
图2为发酵温度对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响对比图；
图3为枯草芽孢杆菌接种量对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响对比图；
图4为料水比对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响对比图；
图5为发酵时间对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响对比图；
图6为发酵温度对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响对比图；
图7为酿酒酵母和乳酸菌菌种比例对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响对比图；
图8为酿酒酵母和乳酸菌接种量对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响对比图；
图9为乳酸菌的发酵时间对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响对比图；
图10为菇脚发酵过程中的代谢物热图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图来进一步详细说明本发明。
本实施例中使用到的枯草芽孢杆菌是从重庆市江津区玉米秸秆堆表层土壤中通过初筛、复筛得到的一株名称为Bacillus subtilis Z2的产纤维素酶的菌株，该枯草芽孢杆菌的保藏编号为：CCTCC NO:M 2020002，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC31487)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。乳酸菌是从重庆市沙坪坝区泡菜中通过初筛、复筛得到的一株名称为Lactobacillus planturum LP24的植物乳杆菌。
本发明公开的益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，该工艺包括如下步骤：
S1、制备种子液：枯草芽孢杆菌在LB培养基中培养，获得枯草芽孢杆菌种子液；酿酒酵母菌在YPD培养基中培养，获得酿酒酵母菌种子液；乳酸菌在LB培养基中培养，获得乳酸菌种子液；其中，LB培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、0.5～1.0％的NaCl；YPD培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、1.0～2.0％葡萄糖；
S2、制备菇脚：将自然风干后的菇脚用粉碎机粉碎，过20-40目筛子；
S3、制备液体发酵培养基：以常规配方将0.1g/L的MgSO4·H2O、1g/L的NaCl、0.1g/L的CaCl2加水混合制备液体发酵培养基；
S4、加入氮源：S3步骤中制备的液体发酵培养基中加入氮源，氮源的添加量为10g/L，氮源种类分别为硫酸铵、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆或尿素中的一种或多种，优选玉米浆；
S5、加入菇脚：将S2步骤制备的菇脚与S4步骤制备的培养基掺混均匀，使得混合后料水比为1:3w/v～1:5w/v；
S6、接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚：接种枯草芽孢杆菌种子液，透气封瓶膜封口，120rpm摇床培养，发酵时间为36h～60h，发酵温度为35℃～45℃，接种量为20％～40％；
S7、接种酿酒酵母发酵：S6步骤中的混合物质中接入酿酒酵母菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵12h，发酵温度为30℃～40℃，接种量为15％～25％；
S8、接种乳酸菌发酵：S7步骤中的混合物质中接入乳酸菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵24h～48h，发酵温度为30℃～40℃，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:4～1:1，接种量为15％～25％；此步骤优选，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:2。
S9、S8步骤获得的混合物质即得发酵饲料。
其中，在S6、S7、S8步骤中，接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚36h～60h的发酵培养基中，先接种酿酒酵母菌厌氧发酵12h，再接入乳酸菌与酿酒酵母菌在厌氧条件下共同培养24h～48h。
而S1步骤中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌活化操作步骤：在超净工作台内，用接种环分别在前期保存于冰箱的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌斜面培养基上轻轻挑取1环于新鲜配制的液体种子培养基内，摇匀密封，然后放置37℃恒温摇床内培养12h～24h；取种子培养液2mL于200mL培养基内继续在37℃恒温摇床内扩大培养12h～24h。
下面分别试验了发酵培养基的氮源种类、发酵温度、枯草芽孢杆菌接种量、料水比和枯草芽孢杆菌发酵时间对好氧发酵过程中枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响并进行了发酵条件的正交优化实验；分别试验了发酵温度、酿酒酵母和乳酸菌菌种比例、酿酒酵母和乳酸菌接种量、乳酸菌的发酵时间对酵母菌、乳酸菌厌氧发酵积累乳酸、短链脂肪酸、胞外蛋白、氨基酸等营养成分含量的影响，并进行了发酵条件的正交优化实验。对发酵前的菇脚取样(CK组)，对接种枯草芽孢杆菌发酵36h-60h后的发酵液取样(Ta组)，对接种酿酒酵母发酵12h后的发酵液取样(Tb组)，对接种乳酸菌发酵24h-48h后的发酵液取样(Tc组)，利用代谢组学技术对发酵饲料发酵过程中的代谢物进行分析。
1.氮源种类对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响
选用硫酸铵、尿素、玉米浆、蛋白胨和酵母浸粉5种氮源。研究不同种类氮源对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响。如图1所示,当玉米浆为氮源时，枯草芽孢杆菌活菌数、胞外蛋白浓度及纤维素酶活最高。其中枯草芽孢杆菌的活菌数为8.26lgcfu/mL，胞外蛋白浓度、半纤维素降解率、纤维素降解率、木质素降解率、滤纸酶活、CMC酶活均最高，分别为0.51mg/mL、24.64％、28.74％、15.77％、1.81U/mL、11.44U/mL。
2.发酵温度对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响
不同发酵温度条件下(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)枯草芽孢杆菌还原糖、纤维素酶合成及纤维素降解性能变化的研究。如图2所示，当温度为40℃，枯草芽孢杆菌活菌数、FPase、CMCase酶活、胞外蛋白浓度、半纤维素，纤维素和木质素降解率最高，分别为8.78lgcfu/mL、2.29U/mL、12.95U/mL、0.67mg/mL、26.7％、32.79％、15.52％。
3.枯草芽孢杆菌接种量对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响
取枯草芽孢杆菌种子液稀释到约6.0lgcfu/mL备用。按照不同接种量(10％、20％、30％、40％、50％)接种枯草芽孢杆菌进行发酵。如图3所示，在30％接种量条件下，枯草芽孢杆菌活菌数、胞外蛋白浓度、FPase和CMCase分别达最高水平8.41lgcfu/mL、0.72mg/mL、2.35U/mL、13.92U/mL。半纤维素、纤维素、木质素降解率分别为27.97％、34.93％、19.32％。
4.料水比对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响
不同料水比条件下(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)枯草芽孢杆菌还原糖、纤维素酶合成及纤维素降解性能变化的研究。如图4所示，当料水比为1:4时，胞外蛋白含量、纤维素酶活力FPase、CMCase、半纤维素、纤维素、木质素降解率均达到最高水平，分别为0.71mg/mL、2.45U/mL、13.67U/mL、27.82％、33.94％、20.42％。
5.发酵时间对枯草芽孢杆菌降解菇脚纤维素特性的影响
不同发酵时间对(0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h)枯草芽孢杆菌还原糖、纤维素酶合成及纤维素降解性能变化的研究。如图5，枯草芽孢杆菌活菌数在48h时达到8.25lgcfu/mL,胞外蛋白浓度0.57mg/mL，半纤维素降解率、纤维素降解率、木质素降解率、滤纸酶活、CMC酶活分别为25.32％、30.99％、14.51％、2.03U/mL、11.38U/mL，60h时，半纤维素降解率、纤维素降解率、木质素降解率、滤纸酶活、CMC酶活分别为26.00％、31.78％、15.23％、2.10U/mL、11.49U/mL。发酵60h时与48h相比，虽然还原糖浓度、胞外蛋白浓度、半纤维素降解率、纤维素降解率、木质素降解率、滤纸酶活、CMC酶活都略高，但均未超出5％，考虑到延长发酵时间会增加时间成本，因此选择48h作为发酵时间。
6.枯草芽孢杆菌降解菇脚的发酵条件正交实验优化
在单因素实验的基础上，采用正交实验考察接种量、温度、料水比对发酵结果的影响。如下表1所示，最优的参数组合为B2 A2 C2，即温度40℃，接种量30％，料水比1：4。按照温度40℃，接种量30％，料水比1：4进行枯草芽孢杆菌发酵降解菇脚，发酵后枯草芽孢杆菌活菌数、胞外蛋白浓度、FPase和CMCase分别为8.85lgcfu/mL、0.94mg/mL、3.06U/mL、16.92U/mL，粗纤维降解率为35.48％，同时半纤维素、纤维素、木质素降解率分别为31.48％、39.29％、22.34％，较优化前分别提高了33％、46％、43％。
表1枯草芽孢杆菌降解菇脚的发酵条件正交实验优化
7.发酵温度对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响
不同发酵温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响。如图6所示，当温度为35℃时，酿酒酵母、乳酸菌活菌数、游离氨基酸含量、乳酸含量、乙酸含量最高，分别为8.28lgcfu/mL、8.33lgcfu/mL、6.84μg/mL，、23.77mg/mL、3.76mg/mL。
8.酿酒酵母和乳酸菌菌种比例对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响
取酿酒酵母菌种子液稀释到约6.0lgcfu/mL备用，乳酸菌(LP-24)种子液在接种量与酿酒酵母保持不变的情况下按照不同的菌种比例(4:1、2：1、1：1、1：2、1：4)稀释到适宜浓度。如图7所示，在菌种比例为1：2时，酿酒酵母、乳酸菌活菌数、乙酸浓度、乳酸浓度最高，分别为8.15lgcfu/mL、8.42lgcfu/mL、5.48mg/mL、25.27mg/mL。
9.酿酒酵母和乳酸菌接种量对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响
不同接种量(5％、10％、15％、20％、25％)对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响。如图8所示。在20％接种量条件下，酿酒酵母、乳酸菌LP-24活菌数、游离氨基酸浓度、乙酸浓度、乳酸浓度均达最高水平，分别为8.29lgcfu/mL、8.44lgcfu/mL、6.71μg/mL、7.17mg/mL、24.24mg/mL。
10.乳酸菌的发酵时间对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响
乳酸菌不同发酵时间(5％、10％、15％、20％、25％)对酵母菌、乳酸菌共培养特性的影响。如图9所示，当发酵36h时，酿酒酵母、乳酸菌LP-24活菌数、游离氨基酸浓度、乙酸浓度、乳酸浓度分别达最高水平8.17lgcfu/mL、8.25lgcfu/mL、6.38μg/mL、6.74mg/mL、20.43mg/mL。
11.酵母菌、乳酸菌共培养特性发酵条件的正交实验优化
在单因素实验的基础上，采用正交实验考察菌种比例、接种量、发酵时间对共培养结果的影响。从下表2可知，最优的参数组合为B2A2C2，即最佳发酵条件为：接种量20％，菌种比例1：2，发酵时间36h。按照接种量20％，菌种比例1：2，发酵时间36h进行共培养发酵降解菇脚。结果表明：酿酒酵母和乳酸菌LP-24活菌数分别为：8.35lgcfu/mL、8.51lgcfu/mL，枯草芽孢杆菌活菌数为8.84lgcfu/mL，游离氨基酸浓度、乙酸浓度、乳酸浓度、pH值分别为8.04μg/mL、9.26mg/mL、29.68mg/mL、4.37。
表2酵母菌、乳酸菌共培养特性发酵条件的正交实验优化
12.菇脚发酵过程中的代谢物热图
对发酵前的菇脚取样(CK组)，对接种枯草芽孢杆菌发酵36h～60h后的发酵液取样(Ta组)，对接种酿酒酵母发酵12h后的发酵液取样(Tb组)，对接种乳酸菌发酵24-48h后的发酵液取样(Tc组)，利用代谢组学技术对发酵饲料发酵过程中的代谢物进行分析。如图10所示，在发酵中，逐渐积累了包括有机酸、氨基酸及其衍生物、糖类及其衍生物、酯类等，这些物质的富集将有利于提高发酵菇脚饲料的消化吸收，丰富发酵菌脚的营养和功能成分。有机酸包括苯乳酸、乳酸、没食子酸、10E，12Z-十八碳二烯酸、乙酸、戊酸、原儿茶酸、香豆酸、奎尼酸、2-羟基肉桂酸；氨基酸及其衍生物包括GABA(γ-氨基丁酸)、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸-苯丙氨酸、酪氨酸-亮氨酸；糖类及其衍生物包括L-古洛糖、甜菊糖苷、藻糖苷E；酯类包括9，10-二羟基十八烷酸酯、乙酰柠檬酸三丁酯、香草酸甲酯、丁酸乙酯等。这些物质的富集将有利于提高发酵菇脚饲料的消化吸收，丰富发酵菌脚的营养成分和功能成分。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (7)
1.一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备种子液：枯草芽孢杆菌在LB培养基中培养，获得枯草芽孢杆菌种子液；酿酒酵母菌在YPD培养基中培养，获得酿酒酵母菌种子液；乳酸菌在LB培养基中培养，获得乳酸菌种子液；
S2、制备菇脚：将自然风干后的菇脚粉碎，过20-40目筛子；
S3、制备液体发酵培养基：以0.1g/L的MgSO4·H2O、1g/L的NaCl、0.1g/L的CaCl2加水混合制备液体发酵培养基；
S4、加入氮源：S3步骤中制备的液体发酵培养基中加入氮源，氮源的添加量为10g/L，氮源种类分别为硫酸铵、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆或尿素中的一种或多种；
S5、加入菇脚：将S2步骤制备的菇脚与S4步骤制备的培养基掺混均匀，使得混合后料水比为1:3w/v～1:5w/v；
S6、接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚：接种枯草芽孢杆菌种子液，透气封瓶膜封口，120rpm摇床培养，发酵时间为36h～60h，发酵温度为35℃～45℃，接种量为20％～40％；
S7、接种酿酒酵母发酵：S6步骤中的混合物质中接入酿酒酵母菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵12h，发酵温度为30℃～40℃，接种量为15％～25％；
S8、接种乳酸菌发酵：S7步骤中的混合物质中接入乳酸菌种子液，不透气膜封口，培养箱内静置发酵24h～48h，发酵温度为30℃～40℃，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:4～1:1，接种量为15％～25％；
S9、S8步骤获得的混合物质即得发酵饲料。
2.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：在S6、S7、S8步骤中，接种枯草芽孢杆菌发酵菇脚36h～60h的发酵培养基中，先接种酿酒酵母菌厌氧发酵12h，再接入乳酸菌与酿酒酵母菌在厌氧条件下共同培养24h～48h。
3.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：S1步骤中，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌活化操作步骤：在超净工作台内，用接种环分别在前期保存于冰箱的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和乳酸菌斜面培养基上轻轻挑取1环于新鲜配制的液体种子培养基内，摇匀密封，然后放置37℃恒温摇床内培养12h～24h；取种子培养液2mL于200mL培养基内继续在37℃恒温摇床内扩大培养12h～24h。
4.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：S1步骤中，LB培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、0.5～1.0％的NaCl。
5.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：S1步骤中，YPD培养基中含有0.5～1.0％酵母提取物、1.0～2.0％蛋白胨、1.0～2.0％葡萄糖。
6.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：S4步骤中，所述氮源为玉米浆。
7.根据权利要求1所述一种益生菌分步发酵香菇菇脚制备发酵饲料的工艺，其特征在于：S8步骤中，酿酒酵母与乳酸菌菌种比例为1:2。
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