KR20090131720A

KR20090131720A - 배추출물을 포함하는 간암 치료용 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20090131720A
Application number: KR1020080057616A
Authority: KR
Inventors: 김정상; 윤중식
Original assignee: 동신대학교산학협력단
Priority date: 2008-06-19
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2009-12-30
Also published as: KR101011703B1

Abstract

본 발명은 배 추출물을 주성분으로 포함하는 간암 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 배 추출물을 포함하는 간암 치료 및 예방용 의약품 및 식품 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배 추출물을 함유하는 간암 치료용 의약 및 식품 조성물은 천연물에서 유래한 것으로 부작용이 없으며 간암 세포를 현저하게 억제하므로 간암 또는 간경화 치료제 및 관련 질환의 치료용 식품 성분으로 이용할 수 있다.

배, 간암

Description

배추출물을 포함하는 간암 치료용 조성물 및 그의 제조 방법{Anti-hepatic cancer composition comprising extracts from pear and process for preparing the same}

본 발명은 배 추출물을 주성분으로 포함하는 간암 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 배 추출물을 포함하는 간암 치료용 의약품 및 식품 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

간은 우리 몸에서 인체의 화학공장이라고 할 수 있는 만큼의 많은 기능을 수행하며, 각종 대사작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 매우 중요한 장기이다.

간경화는 만성간염이나 알코올성 간질환등에 의한 장기간에 걸친 지속적인 간손상에 의해 발생하게 되는데 간경화가 되면 간기능의 저하가 현저해지고 간을 통과하는 혈류에 장애가 생기므로 복수, 위장출현, 간성 혼수 등의 합병증이 흔히 발생하게 된다. B형, C형 간염바이러스에 의한 만성 간염 바이러스의 보균자 혹은 간경화를 오랜동안 앓고 있던 사람에게서 간암이 발생할 수 있는데 진단시 이미 심하게 진행되었거나 간기능 저하가 심하여 치료가 어려운 경우가 많다.

종래 간암의 치료를 위해서는 암부위를 절제하는 것이 가장 효과적인 방법으로 알려져 있으나 질병의 상태에 따라 수술이 위험하거나 시행하지 못할 경우에는 항암제를 사용하고 있다. 이 경우에는 간동맥을 통하여 항암제를 직접 간암조직 내로 주입하거나 항암제 투여후에 암종으로 연결된 혈관을 폐색시키는 치료 방법을 많이 사용하고 있으나 대부분의 간암은 사망으로 이어지기 때문에 이미 발병한 간암의 치료보다는 예방이 우선되어야 한다.

한편, 배는 예로부터 한방의 중요 약재로 활용될 만큼 인체에 유익한 과일로 알려져 왔고, 본초강목, 동의보감 등에 의하면 배는 맛은 달고 차가우며, 무독하고, 즙을 내어 복용하면 효율성이 뛰어 난 것으로 알려져 왔고 특히 기관지 등에 좋고 감기 등으로 목이 아플 때 도움이 된다고 알려져 있다. 그 외에도 배는 담, 가래, 기침, 해열, 진통, 이뇨 촉진(다이어트 효과), 숙취해소, 종기 등의 치료에 효능이 알려져 있고, 식품분야에서는 고기를 연하게 하는 것으로 알려져 있고 최근에는 항암제로서의 효과도 발표되고 있다.

지금까지 배는 주로 식품 분야에서 설탕과 탄산이 함유된 탄산음료 대신에 천연물을 주재로 한 음료로서 갈아 만든 배 등의 캔음료 제품의 형태로 출시되고 있으며, 특허출원 제2001-78358(2001.12.12)에는 배를 주로 하는 음료의 조성물 및 그의 제조 방법이 개시되어 있다.

그러나, 배를 소재로 하여 항암제, 특히 간암 치료용 의약 또는 예방용 식품 조성물로서 개발하려는 시도는 아직 주목할 만한 성과가 없는 실정이다.

본 발명자들은 배가 갖는 기능성을 극대화한 기능성 상품으로서 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 후술하는 바의 배즙 추출물을 주성분으로 포함하는 조성물이 간암의 치료에 상당히 우수한 효능을 나타낼 뿐만 아니라 천연물에 기인한 것으로서 부작용이 없다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명 목적은 배즙 추출물 및 필요에 따라 천연 생약 추출물을 유효 성분으로 포함하는 간암 치료용 의약품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바의 조성물을 포함하는 간암의 예방과 만성피로와 또는 기타 합병증들을 막음으로써 체력증강을 도모하기 위한 건강 기능성 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 배 추출물을 함유하는 간암 치료 및 예방용 의약 및 식품 조성물은 천연물에서 유래한 것으로 부작용이 없으며 간암 세포를 현저하게 억제하므로 간암치료제 및 관련 질환의 치료용 식품 성분으로 이용할 수 있다

본 발명은, 일면에 있어서, 배즙 추출물, 및 필요에 따라 천연 생약 추출물을 유효 성분으로 포함하는 간암 치료용 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 간암 치료용 조성물의 유효 성분인 배(Pyrus serotina Rehd)는 칼리 51.0, 나트륨 8.0 , 칼슘 8.0, 마그네슘 6.0, 인 14.0, 요드 6.0, 규소 3.0 mg/100g 를 포함하고 있는 강알칼리성 식품으로서 예로부터 널리 이용되고 있다. 특히, 비타민 B1 0.06mg, B2 0.04mg , C 4.0mg으로 다른 과실에 비하여 높거나 같은 편이다. 과피에는 페놀성 화합물인 아르부틴(arbutin), 클로로게닉산(chlorogenic acid), 에피카테친(epicatechin) 등이 존재한다.

본 발명에서 사용되는 배의 품종은 특별한 제한이 없고, 배의 상태에도 별 영향을 받지 않으므로 본 발명은 특히 당도가 떨어져서 상품화에 미치지 못하거나 수확 전에 기상 변화 등으로 인한 낙과들을 활용할 수 있는 대처 방안에도 유력하게 적용할 수 있다

본 발명에 따른 간암 치료용 조성물에 있어서, 배 추출물은 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 구체적으로는, 배를 흐르는 물에서 2-3회 세척한 다음, 세척한 과실에서 과즙을 얻기 위한 목적으로 햄머밀(hammer mill)에서 파쇄하여 압력을 14-15 lb/in²으로, 온도를 120℃로 유지하면서 약 3시간 정도 가열하면서 농축하고 압착법을 사용하여 배 박을 제거한다. 재차 압력을 14-15 lb/in²으로, 온도를 120℃로 유지하면서 약 3시간 정도 가열 멸균한 후에 후 포장하고 냉각한다.

본 발명의 조성물에 배와 한약재 추출물이 혼합되는 경우에는 상기한 배의 추출 방식에 준하여 천연 생약 성분을 추출하여도 무방하다.

별법으로, 본 발명에 따른 배즙 추출물은 물 또는 탄소수 1-4개의 함수 또는 무수 저급알코올, 메탄올, 에탄올, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 이용하여 1회 이상 여과 농축시켜 얻을 수 있다.

다른 별법으로는 상기한 천연 생약 추출물은 10 ~ 35 ℃의 온도, 바람직하게는 실온에서, 물 또는 50 ~ 90%, 바람직하게는 70% C_1-4 저급 알코올, 더욱 바람직하게는 메탄올에 3 ~ 14일, 바람직하게는 약 1주일 동안 암실에서 침지시키는 단계, 상기 용액으로부터 상층액을 회수하여 회전진공농축기를 이용 45 ~ 55℃, 바람직하게는 50℃에서 증발시켜 조추출물을 얻는 단계, 상기 회수된 조추출물을 동결건조시키는 단계, 및 이를 용매, 바람직하게는 PBS에 현탁하는 단계, 및 필터를 사용하여 여과하는 단계에 의해 제조될 수 있다. C_1-4 저급 알코올은 메탄올, 메탄올, 프로판올 등을 포함한다. 상기 여과는 0.2㎛ 필터를 사용하는 것이 적합할 수 있다.

본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 상기 배즙의 추출물을 주성분으로 함유하고, 여기에 효능 및 기능성을 더욱 부가하기 위한 천연 식물 추출물, 구체적으로는 지구자, 오미자, 백화사설초, 황기, 적작약, 감초, 하별갑, 및 산사자로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 천연 식물성 유래의 생약 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 간암 치료용 조성물에 있어서, 효능을 증대시키기 위한 추가의 생약 성분은 지구자 추출물을 포함할 수 있다.

지구자 또는 지구자나무(Hovenia dulcis var. koreana)는 헛개나무라고도 하며 갈매나무과에 속하는 교목으로서, 최대 직경 1ｍ까지 자라며 국내에서만 자생하는 특산수종이다. 전국에 분포해 있지만 목재, 약용으로 마구 쓰이는 바람에 현재 는 희귀종으로 1천 내지 2천 그루에 불과한 것으로 알려져 있다. 이 나무의 열매와 줄기는 오래 전부터 한방에서는 숙취 해소에 효능이 있는 것으로 전해져 왔으며, 이를 이용하여 숙취해소용 음료나 건강식품 제품으로의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

또한, 오미자는 혈압강하 및 진해 거담작용을 갖고 있어서 한약재로 널리 이용되고 있을 뿐 아니라 위액 분비의 조절 및 담즙분비 촉진작용을 갖고 있어서 건강 식품의 성분으로 널리 이용되고 있다. 특히 오미자는 단맛, 쓴맛, 신맛, 매운맛, 짠맛 등이 복합된 특이한 맛을 갖고 있으며 고유의 특이한 향을 나타내므로 다류와 주정 음료의 원료로도 이용되고 있다.

오미자는 통상의 방법에 의해 추출하는 것이 사용가능하나, 물과 각각의 재료를 용기에 넣고 물의 중량을 기준으로 1~5중량부로 혼합하여 고압멸균솥에 넣고 2~5 시간 동안 추출하여 여과하여 농축한 액을 재료로 사용하거나 분말 건조화하여 분말상태로 사용할 수도 있다.

백화사설초는 주로 심장, 간장에 작용하여 항종양작용 및 항균, 소염작용을 하며 청열 해독작용이 있어서 HBsAg를 억제하고 SGPT 치를 낮추며 황달 등 간질환의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

황기(Astragalus membranaceus Bunge)는 콩과의 다년생 초본으로, 우리나라 중북부지역에 자생하며, 약용을 목적으로 재배되고 있으며, 간장을 보호하고, 면역을 촉진하며, 심장을 튼튼하게 하고, 이뇨작용 등의 약리적인 효능을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 또한 황기는 체내의 진액을 만들고, 비, 폐장의 열을 내려 갈 증을 없애는 작용이 강하다. 이러한 이유로 예로부터 원기회복이나 자양강장을 목적으로 하는 약재로서 이용되어 온 것으로, 별다른 독성이 보고된 바 없어 인체에 대한 안전성은 확인받은 것이라 할 수 있다.

적작약은 주로 간장, 비장에 작용하여 항염, 항궤양작용 등을 나타내며 또한 항균, 해열, 진통, 진정, 항경련작용이 있다.

감초는 항염, 항궤양효과, 면역반응을 억제하는 작용, 혈중 지질 농도를 낮추는 작용을 하며 항종양작용과 간보호효과가 알려져 있으며, 하별갑은 간과 비장에 작용하여 기운을 북돋우며 해열작용이 있고, 내장의 종양, 부인과의 양성종양 및 만성 말라리아로 인한 비장종대의 치료에 이용된다.

산사자는 위장효소의 증가 및 소화촉진효과가 있어 건위소화제로 널리 이용되며 심근수축력을 증가시키는 작용이 있으며, 협심증, 심계항진, 고혈압, 비만, 동맥경화증등에 유효하다.

위와 같은 추가의 식물 추출물은 단독으로 추출하는 경우에는 배즙 추출물과 동일한 방식으로 얻을 수도 있으며, 물이나 통상의 유기 용매 추출법 또는 그 분야에서 잘 알려진 통상의 추출법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물에서는 상기한 바와 같은 보조 생약 성분들 각각의 고유약리작용이 서로 조화를 이루고 상호 보완작용을 하여 각각의 성분을 단독으로 사용하거나 또는 일부 성분만을 배합하여서는 얻어질 수 없는 우수한 간암의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

본 발명의 조성물은 또한 간경화 및 간암을 더욱 강력하게 예방 및 치료하기 위해 필요에 따라 강황, 울금, 백삼, 구기자, 삼칠, 천마, 자충, 천산갑, 우황, 내복자, 흑지마, 자근, 시호, 동충하초, 당귀 등으로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 보조 생약 성분을 첨가하여 더욱 바람직한 효과를 나타내게 할 수 있으며, 이러한 성분의 선택 및 첨가량은 당업자에게는 자명할 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 항암제 조성물은 각각의 성분의 작용이 조합되어 나타나므로, 인체를 보호하면서도 간암을 치료함과 동시에 허약해진 신체기능을 북돋아주어 우수한 치료효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 간암 치료용 조성물 및(또는) 건강 기능성 식품 중의 상기 배즙의 함량은 특히 제한되지는 않으나, 예를 들면 조성물의 중량을 기준으로 0.1 내지 99.9%로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물에서 추가 생약제 성분은 상기 보조 생약 성분이 단독 또는 혼합하여 첨가되는 경우에 이들의 첨가량은 중량을 기준으로 하여 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.1 ~ 20 중량%로 배합하여 사용하는 것이 적합하다.

본 발명에 따른 간암 치료 및 예방용 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한 이것을 사용 전에 적당 한 담체의 첨가에 의해 액상으로 만들 수 있는 건조품으로 할 수도 있다.

본 발명의 제약 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다.

의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.

한편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 단백분해효소를 포함하는 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.

본 발명의 의약 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법은 특히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 그 제제형태, 투여방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10㎍∼2,000 ㎎/㎏이다. 그러나, 당업자는 특정 시약의 약물동력학적인 특성 및 그의 투여 모드 및 경로; 수여자의 나이, 건강, 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과 등의 공지의 요인에 따라서 투여량이 변화함은 이해할 것이다.

본 발명의 항암제 조성물은 후술하는 시험예로부터 확인할 수 있는 바와 같이 간암 환자의 예방 및 치료효과를 가지므로 간암 또는 간경화에 관련된 각종 증상을 적절히 치료할 수 있을 뿐 아니라 부작용이나 독성이 거의 없으므로 간암의 예방 및 개선을 위한 건강 기능성 식품 조성물로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 상기 배추출물 및, 필요에 따라, 생약 추출물을 유효 성분으로 포함하는 간암 예방용 건강 기능성 식품 조성물 및 그의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물의 제형은, 당해 분야에서의 통상적인 방법에 따라, 예를 들면 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 경구제, 파우치제, 또는 드링크제 등의 음료수의 형태로 제형화시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 섭취량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 개체의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10 mg∼2000 ㎎/㎏이다. 물론 섭취량은 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 원하는 조성물의 형태에 따라 통상의 보조제 또는 첨가제, 또는 감미료, 예를 들면 감초, 맥류약엽분말, 서양산사자추출물, 세 인트존스워트, 셀레늄효모, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다. 이들은 본 발명의 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.

음료수는, 예를 들면, 상기 한약재 배 추출액 0.01~20 중량%, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~2 중량% 등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 기능성 음료수로 제조할 수 있다.

<실시예>

이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험 결과에 대한 통계는 SAS(statistical Analysis System) 프로그램에 의하여 각 실험군 별로 평균값과 표준오차를 계산하였고 α=0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

실시예 1: 기능성 배 음료 시작품 제조

배 10kg을 각각 흐르는 물에서 2회 깨끗이 세척한 다음, 이를 한데 모아 햄머밀로 분쇄하였다. 상기 혼합물을 120℃의 온도 및 14-15 lb/in²의 압력으로 3시간 동안 가열농축하고 압착법을 사용하여 배즙 박을 제거한 후 액상 성분만을 추출하였다. 이를 재차 압력을 14-15 lb/in²으로, 온도를 120℃로 유지하면서 약 3시간 정도 가열 멸균하였다. 상기 액상 성분은 각각 2배 및 4배로 농축하여 후속 시험에 사용하였다. 아울러, 오미자 100g 및 지구자 37.5g 백화사설초 37.5g, 황기37.5g, 적작약37.5g, 37.5g, 하별갑 37.5g, 산사자 37.5g도 같은 방식으로 추출하여 후속 실시예에서 적절히 배합하여 사용하였다.

실시예 2: 간암 치료용 파우치의 제조

실시예 1에서 얻은 배즙 추출액 100g에 첨가제로서 감초 1g을 첨가하여 이를 통상의 방식으로 진공포장하여 파우치를 제조하였다.

실시예 3: 음료수의 제조

실시예 1에서 얻은 배즙 추출액 100 g과 한약재 추출액(오미자 100 g 및 지구자 37.5 g 백화사설초 37.5 g, 황기 37.5 g, 적작약 37.5 g, 37.5 g, 하별갑 37.5 g, 산사자 37.5 g) 1ℓ를 넣고, 여기에 구연산 20g, 아스파탐 17 g 및 비타민 C 30 g을 첨가한 후 나머지를 정제수로 첨가하여 음료수 10 ℓ를 제조하여 저온 살균하였다. 결과적으로 본 발명 음료수는 종래의 음료수 제품과 입안 감촉, 맛 그리고 종합평가 면에서 양호한 반응을 얻었다.

실험예 1: 체중 및 혈액학적 검사

체중 220±10g의 8주령 웅성 흰쥐(Sprague-Dawley strain)를 샘타코(주)(오산, 대한민국)로부터 구입하여 동신대학교 한의과대학 동물사육실(22℃±1, 12시간 dark, 12시간 light)에서 1주 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

실험군은 정상군(그룹 I), DEN(diethylnitrosamine, Sigma Co., USA) 200㎎/㎏을 0.9% 생리식염수에 용해시켜 복강내로 1회 투여하고, 2주후부터 사염화탄소(Carbon tetrachloride, CCl₄)를 옥수수유(corn oil)에 50%로 희석하여 1 ㎖을 복강 내로 3주간 3회 투여한 대조군(그룹 II)과 간암 유발 후, 실시예 1에서 추출한 배즙을 농축하여 60㎎/㎏으로 구강 투여한 실험군(그룹 III)으로 설정하였다. 대조군과 실험군의 체중은 2주 간격으로 실험 기간 동안 측정하였으며, 체중 측정 12 시간 전에 절식시켰다. 도 1은 각 시험군 및 대조군의 처리하여 시험 8주후의 체중의 변화를 나타내는 그라프도이다. 그룹 I, 정상군; 그룹 II, CCl₄및 DEN에 의해 유발된 간암 래트; 그룹 III, 간암유발 후 배추출물(60㎎/㎏) 투여 군.

흰쥐의 체중을 8주 동안 측정한 결과, 도 1에서 보여주는 바와 같이 정상군에 비하여 DEN을 투여하여 간암을 유발시킨 4주 이후부터 체중의 감소가 있었다. 대조군이 가장 낮게 나타났으며, 시험 그룹 I이 다소 높았으나 통계적인 유의성은 없었다.

이어서, 대조군과 실험군의 흰쥐는 우레탄(200㎎/㎏)을 복강 투여하여 마취한 다음 흉곽을 열고 심장 채혈을 하였다. 채혈된 혈액은 EDTA 병(bottle)에 넣은 다음 곧바로 혈구측정기(K-800, Sysmax, Japan)를 사용하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB), 헤마토크릿(hematocrit, Hct), 혈소판(PLT)를 각각 측정하였다.

혈액학적 변화를 관찰하기 위하여 DEN을 투여하여 간암을 유발시킨 5주부터 4주 동안 배 추출액을 투여하고, 시험 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2는 시험 물질 투여 후 백혈구의 변화를 나타내는 그라프도이다. 도 3은 시험 물질 투여 후 적혈구의 변화를 나타내는 그라프도이다. 그룹 I, 정상군; 그룹 II, DEN 및 CCl₄에 의해 유발된 간암 래트; 그룹 III, 배추출물(60㎎/㎏) 투여 그룹.

8 주후 쥐를 희생하여 백혈구를 분석한 결과, 도 2에서 보듯이 대조군의 백혈구 수는 정상군에 비하여 증가하고, 실험군에서는 다소 감소하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 적혈구는 대조군에서는 정상군에 비하여 감소하였으나, 실험군에서는 정상군과 비슷한 소견이었다. 대조군에서 적혈구의 수가 감소하는 것으로 보아 간암이 진행되어 보다 많은 적혈구의 파괴가 진행되는 것으로 사료되었으며, 실험군에서는 정상군과 유사한 결과를 보여 주는 것으로 보아 배즙 추출액의 간에서 적혈구의 파괴를 억제해 주는 것으로 해석된다.

시험예 2: 트랜스아미나아제 활성 측정

혈중 GOT와 GPT의 활성 측정은 340nm에서 흡광도(photometer 5010, Germany)의 변화를 측정하였다. ｒ-GTP 활성 측정은 Reitman-Frankel의 방법(참조문헌: Reitman S, Frankel S. 1957. A colorimetic method for the determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase. Am J Clin Pathol 2: 56-63.) 에 따라 키트(kit) 시약(아산제약)을 사용하여 측정하였다. r-GTP 기질액 1.0mL을 시험관에 넣고 37℃에서 5분간 방치한 다음 혈청 0.02mL을 넣어 잘 혼합한 다음 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 정색시액 3.0mL을 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 10분간 방치하였다가 635nm에서 분광광도계(Kontron, Italy)로 측정하하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 시험물질 투여후 트랜스아미나아제 활성의 변화를 나타내는 그라프도이다. 그룹 I, 정상군; 그룹 II, DEN 및 CCl₄에 의해 유발된 간암 래트; 그룹 III, 배추출물(60㎎/㎏) 투여 그룹.

간기능에 미치는 영향을 밝히기 위하여 흰쥐의 간을 적출하여 GOT와 GPT의 활성을 측정한 결과 대조군에서는 정상군에 비하여 모두 증가하였으나, 실험군에서는 정상군보다는 높았으나 대조군에 비하여 낮았다.

시험예 3: 흰쥐 간조직으로부터 SOD 추출 및 활성도 측정

대조군과 실험군 흰쥐의 혈액을 신속히 분리하여 SOD (Superoxide Dismutase)를 추출하였다. 혈액을 10,000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 SOD 활성을 측정하기 위한 효소원으로 이용하였다. 단백질 정량은 바이오-라드 에세이(Bio-Rad assay)를 이용하였으며, -70℃의 deep freezer에 보관하면서 실험에 이용하였다. SOD 활성도는 SOD 에세이 키트(Dojindo, Japan)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정 후 SOD 활성도를 계산하였다. 도 5는 시험물질 투여후 혈청내 SOD 활성의 비교를 나타내는 그라프도이다. 각 시험군은 상기 시험예의 것과 같다. 흰쥐의 혈청에서 SOD의 활성을 측정한 결과 정상군에 비하여 대조군에서는 높았으며, 실험군에서는 낮았다(도 5 참조). 이와 같이 대조군에서 SOD의 활성이 높게 나타나는 것은 간 손상의 진행이 정상군에 비하여 현저히 높게 나타남을 알 수 있었다.

시험예 4: 흰쥐의 간조직으로부터 카탈라아제 추출 및 활성도 분석

카탈라아제(catalase) 활성도 측정은 Aebi H(1983)의 방법[참조 문헌: Aebi H, Catalase. In: Bergmeyer HU. ed. Methods of enzymatic analysis, 3rd ed. Weinheim: Verlag Chemie, 1983: 273-285.]에 준하여 50mM 인산칼슘 완충액(pH 7.2)에 기질인 10mM H₂O₂에 효소액을 가하여 최종 반응액이 3.0㎖이 되게한 다음 25℃에서 30초간 반응시키면서 240㎚ 파장에서 소실되는 H₂O₂의 양을 측정하였다. 효소 활성도의 단위는 15 초간에 1㎎의 단백이 반응하여 환원시킨 H₂O₂를 μM로 나타내었다. 도 6은 시험물질 투여 후 혈청 내의 카탈라아제 활성의 비교를 나타내는 그라프도이다. 각 시험군은 상기 시험예의 것과 같다. 카탈라아제의 활성은 정상군과 대조군에서 낮게 나타났으나 실험군에서는 정상군과 대조군에 비하여 높았다(도 6 참조). 정상군에서 카탈라아제 활성이 낮은 것은 간세포의 손상이 미약한 결과이기 때문이다. 그러나 실험군에서는 앞서 SOD의 활성은 높으나 카탈라아제의 활성이 낮은 것은 간세포에 과산화수소의 농도가 높아져 간세포의 손상을 가속화 시켰을 것으로 보이며, 배즙 추출액을 투여한 실험군에서는 카탈라아제의 활성이 높게 나타나는 것으로 보아 과산화수소의 농도를 낮추어 간세포의 손상을 억제하였을 것으로 사료된다.

시험예 5: 전체 RNA 추출 및 RT-PCR(역전사중합효소연쇄반응)

흰쥐의 간을 획득하여 Trisol(Sigma, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 역전사(reverse transcription)는 DEPC-DW로 최종부피를 50㎕로 맞춘 후 총 RNA에 RT-premix (바이오니아, USA) 혼합 용액을 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT 반응은 65℃에서 10분 동안 RNA를 변성시키고, 42℃에서 1시간 동안 역전사하여 cDNA를 합성하고, 95℃에서 5분 동안 MuLV 역전사 효소를 불활성화시키는 과정으로 진행되었다. PCR 반응은 10 mM Tris-Hcl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl_2,1 mM dNTP, 1 unit Taq polymerase, 10 pmol 5′과 3′ COX-2 프라이머 그리고 RT 생성물을 첨가하고 PCR 수행하였다. PCR 사이클은 95℃, 10분 동안 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 온도는 60℃에서 40초, 72℃에서 40초 동안 신장(extention) 과정을 거쳐 PCR 생성물을 얻었다. GAPDH는 내부 콘트롤(internal control)로 수행하였다. 이렇게 얻어진 생성물은 1.5% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 UV (Kodak, USA)에서 관찰하였다.

RT-PCR에서 mRNA의 증폭에 설계된 프라이머 목록

프라이머	서열	생성물 크기
1. p53	F:5'-GTCGGCTCCGACTATACCACTATC-3' R:5'-CTCTCTTTGCACTCCCTGGGGG-3'	246 bp
2. Bax	F:5'-GGCGATGAACTGGACAAC-3' R:5'-CCGAAGTAGGAAAGGAGGC-3'	299bp
3. Bcl-2	F:5'-CGGGAGAACAGGGTATGA-3' R:5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3'	149bp
4. c-myc	F:5'-CTCTTCTTCCTCGGACTCGC -3' R:5'-GCGCAGGGCAAAAAAGCTAC -3'	484bp
5. β-actin	F:5'-AATGCATCCTGCACCACCAA-3' R:5'-GTAGCCATATTCATTGTCAT-3'	189bp

도 7은 처리된 시료(c-myc, p53, Bax, Bcl-2, β-actin)의 유전자 발현의 비교를 나타내는 전기영동 사진을 나타낸다. 각 시험군은 상기 시험예의 것과 같다.

상기 결과로부터, 정상군과 간암 유발군들에서 종양 유전자인 p53, c-myc과 Bax mRNA 발현 정도를 살펴보면, 정상군에 비해 간암을 유발한 대조군에서 p53, c-myc과 Bax의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 간암 유발후 6주간 배즙을 투여한 실험군에서의 경우 p53, c-myc과 Bax mRNA 발현이 정상군과 유사한 양상으로 나타났다. 종양 억제 유전자로 알려진 Bcl-2 mRNA의 경우는 배즙을 투여한 실험군에서 대조군보다 더 증가됨이 관찰되었다.

시험예 6: 간 조직의 광학현미경관찰

광학현미경 관찰을 위하여 생쥐의 간 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 4%의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 파라핀으로 포매한 후 마이크로톰(microtome)을 사용하여 5 ㎛ 두께로 절편을 제작하였다. 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 이중 염색한 다음 영구표본을 제작하여 카메라현미경(Olympus BX51TF, Japan)을 이용 사진을 촬영하였다. 도 8는 래트 간의 처리 시료별 조직학적 절편의 현미경 사진을 나타낸다. 각 시험군은 상기 시험예의 것과 같다. 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색을 하였으며, 확대 배수는 x 200이다.

도 8에서 보듯이 정상군(I)의 간조직에 비하여 DEN과 사염화탄소를 투여한 대조군(II의 간 조직에서는 핵의 모양이 불규칙하고 세포질의 염색성이 고루지 못할 뿐만 아니라 세포질에서는 다양한 크기의 지방과립 처럼 보이는 액포들이 관찰되었다. 또한 동굴모세혈관은 내강이 매우 팽창되어 있었다. 이와 같은 결과는 사염화탄소에 의한 간손상과 DEN에 의한 간암생성 진행되고 있음을 알 수 있었다.

시험예 7: 간조직의 세포 사멸 관찰

간 조직의 절편에 존재하는 세포사멸 핵을 밝히기 위하여 Apoptag in situ apoptosis detection kit(Intergen™)을 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 조직 절편을 슬라이드 글라스에 부착시켜 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거한 다음 농도가 낮은 순으로(100%, 90%, 70%)으로 함수 과정을 거친 다음 5 분 동안 PBS에서 배양하였다. 염색은 프로테나아제(protenase) K(20㎍/㎖; Sigma)에서 15 분 동안 배양한 후, 증류수로 세척하고, 그 다음 3% H₂O₂(vol/vol, in PBS)에서 5 분 동안 배양하여 고유 퍼록시다아제(endogenous peroxidase)의 활성을 억제하였다. 평형 완충액을 30초 동안 처리 한 다음 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 효소를 37 ℃에서 1 시간 동안 처리하였다. 정지(Stop) 완충액을 처리 한 다음 슬라이드 글라스를 수세하였다. DAB 발색시약을 5분 동안 처리한 다음 메틸 그린(methyl green)으로 대조 염색한 다음 탈수과정을 거친 후 커버슬립(coverslips)을 봉합하였다. 이후 동일한 방법으로 사진을 촬영하였다. 도 9는 래트 간의 처리 시료별 조직학적 절편의 현미경 사진을 나타낸다. 각 시험군은 모든 시험예에서 동일한 것을 사용하였다. 화살표는 사멸 세포를 나타내고, CV는 중심 정맥을 나타내며, TUNEL 에세이를 사용하였다. 확대 배수는 x 200 배이다. 도 9는 보듯이 정상군 흰쥐의 간조직에서는 세포사멸핵이 소수 관찰되었으나(I), DEN과 사염화탄소를 투여한 대조군에서는 다수의 세포사멸핵들이 관찰되었다(II). 그러나 배즙을 투여한 실험군에서는 세포사멸핵들이 정상군에서와 같이 매우 감소하였다(III).

이상의 시험예의 결과를 정리하면 본 발명의 배즙 추출물은 간암 세포의 사멸에 유효한 효능을 가지고 있는 것으로 확인되었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 배즙 추출물은 간암의 치료에 유요하므로 이를 요하는 환자에 대하여 치료약 또는 예방용 건강 기능성 식품으로 제공할 수 있는 것이 가능하게 되었다.

도 1은 각 시험군 및 대조군의 처리하여 시험 8주후의 체중의 변화를 나타내는 그라프도.

도 2는 시험 물질 투여 후 백혈구의 변화를 나타내는 그라프도.

도 3은 시험 물질 투여 후 적혈구의 변화를 나타내는 그라프도.

도 4는 시험물질 투여후 트랜스아미나아제 활성의 변화를 나타내는 그라프도.

도 5는 시험물질 투여후 혈청내 SOD 활성의 비교를 나타내는 그라프도.

도 6은 시험물질 투여 후 혈청 내의 카탈라아제 활성의 비교를 나타내는 그라프도.

도 7은 처리된 시료의 유전자 발현의 비교를 나타내는 전기영동 사진.

도 8은 래트 간의 처리 시료별 조직학적 절편의 현미경 사진.

도 9는 래트 간의 처리 시료별 조직학적 절편의 현미경 사진.

Claims

배를 햄머밀로 파쇄하고, 압력을 14-15 lb/in²으로, 온도를 120℃이상으로 유지하면서 약 3 시간 정도 가열 농축한 다음 압착법을 사용하여 배즙 박을 제거하고, 이를 재차 동일한 조건에서 약 3시간 정도 가열 멸균시킴으로써 얻거나 또는 배 원료를 물 또는 탄소수 1-4개의 함수 또는 무수 저급알코올, 메탄올, 에탄올, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 이용하여 1회 이상 여과 농축시켜 얻어짐을 특징으로 하는 배 추출물을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 추가로 지구자, 오미자, 백화사설초, 황기, 적작약, 감초, 하별갑 및 산사자로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 천연 생약 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
제1항에 따른 배즙 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 예방용 기능성건강 식품 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물이 경구제, 파우치제, 드링크제, 음료수의 형태로 제공되는 조성물.