CN105687422A - 一种树莓组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树莓组合物，其由包括树莓、葛根、陈皮和甘草的原料制成。本发明还涉及所述组合物在制备用于治疗或抑制癌症的药物或食品中的用途。本发明的组合物可以极好地降低树莓对胃肠道的刺激作用，有良好的口感，同时还可明显提高树莓的化学预防效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种树莓组合物，其由包括树莓、葛根、陈皮和甘草的原料药材制成。本发明还涉及所述组合物的制备方法以及所述组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物或食品中的用途。
背景技术
癌症是多种基因突变积累、最终突变能遗传、细胞复制失控的结果。癌症的发生发展经历8～20年的癌前病变期，现在普遍的认识是：癌症是可以预防的。目前单一化学成分物质在化学预防取得了一些成果，例如维A酸对头颈部肿瘤、雌激素替代剂对乳腺癌、阿斯匹林和其它消炎药对结肠癌；这些化学预防剂本身都是药物，有严重的毒副作用，例如，维A酸对肝的损害，雌激素替代剂对子宫内膜增厚、子宫癌和中风的风险，阿斯匹林引发胃溃炎和穿孔，等等。
因此，开发安全无毒的化学预防剂非常必要。全食物途径的化学预防剂就成为了研究的热点。
树莓为蔷薇科悬钩子属(Rubus)的多年生落叶性灌木型果树。栽培学上所说的树莓包括分类学上的树莓(RubuscorchorifoliusL.f.；Raspberry)和黑莓(blackberry)以及它们的杂交种。树莓和黑莓同为悬钩子属，但分属于不同的亚属，树莓属于空心莓亚属(Idaeobatus)，黑莓属于实心莓亚属(Eubatus)。分类学上的树莓又分黑树莓、红树莓等多个种。本发明所述的树莓是指蔷薇科悬钩子属的可食用果实，优选黑树莓、红树莓和黑莓的果实，进一步优选黑树莓、红树莓和黑莓的冻干果。
在我国，树莓作为食用和药用果已经有两千年以上的历史，树莓鲜果很容易腐坏，成熟果摘下来后三个小时就会坏掉。由于以前保鲜技术落后，故在我国采摘半熟果炮制，称覆盆子。近现代，各国驯化野生树莓种植成功，并引种到世界各地。随着发现树莓对现代人疾病的防治作用，掀起一股树莓的热潮，和其它浆果一道被称为“第三代黄金水果”。随着科技的发展，水果保鲜技术大大提高，新鲜树莓果可以进入了百胜家的餐桌，药用的树莓也可能不仅止于半熟果加工的覆盆子了。市面上还有冻干果、果汁、果浆和喷雾干燥粉等产品可供选用。
最近二十年树莓的应用研究最大的成就是发现对癌症的防治作用。美国学者GaryD.Stoner近二十年来研究了包括黑树莓、红树莓和黑莓在内的多种浆果对癌症的化学预防作用(GaryD.Stoner，WholeFoodApproachtoCancerPrevention：BerriesasanExample，化学进展，第25卷第9期，1480～1491)。黑树莓等含有多种具有潜在化学预防作用的化合物，包括维生素A、C、E，硒，钙，以及大量多酚类物质，包括花青素，鞣花，槲皮素，阿魏酸和香豆酸，各种类胡萝卜素，β-谷甾醇等。临床前研究表明，黑树莓冻干粉末可以抑制动物的口腔、食道、结肠和乳腺中肿瘤的发生发展。在人体实验中，黑树莓冻干粉末对口腔、食道和结肠的癌前病变具有预防作用，且在其剂量水平下不引起毒性或仅引起少量毒性。黑树莓预防癌症的机理可能包括抑制细胞增殖、炎症和血管生成，并且促进细胞调亡、黏附和分化。分子生物学研究表明，黑树莓保护性地调控了多个和上述细胞功能相关的基因表达。GaryD.Stoner等人一系列的研究结果表明，与黑树莓有相似组成的其它浆果类食物也有同样的保护作用。
树莓(包括树莓汁、树莓粉)的酸度很大，对胃有直接的剌激作用，可引起慢性肠胃炎；另外，其口感很差，对牙齿剌激性很强，尤其是中老年人，服用后感觉牙齿酸软。这些不利方面大大阻碍了树莓的利用和食用。人们曾试图通过调味的方法来解决上述问题，但是使用各种香精、甜味剂获益却很少，并不能制备得到符合中老年人(对化学预防迫切需要的人群)口感追求的产品。特别地，作为一种理想的化学预防剂，应满足人们期望的天然的、安全无毒、可以长期服用等目的。制酸药如质子泵抑制剂、铝、镁制剂等，作为药物具有一定毒性，伦理上也不应给予健康人配伍使用。质子泵抑制剂虽然可以抑制胃酸的分泌，但不能抵制树莓的外来酸性刺激。铝镁等金属药物制剂有胃粘膜保护作用，但是不能保护上消化道；更严重的是，这些金属制剂和植物药配伍有发生络合、沉淀等潜在的破坏药物稳定性、影响药效甚到至发生毒性的可能。本发明人试图通过加碱降低酸性的办法来解决问题，但是效果不明显，而且在制药工业过程中使用强碱，可能会破坏一些酸碱敏感的活性成份。
树莓除了具有上述酸性大、口感差和对胃肠道剌激性的缺点外，单独服用树莓还需要非常大的服用量才能见效。食管异型增生公认是食管癌的癌前病变，可以作为食管癌前的标志物。一项人食管异型增生的临床试验和一项直肠癌的化学预防试验表明，树莓冻干粉的口服剂量高达60g/天才有效果，这相当于每天需服用600g左右的树莓鲜果，因为树莓含有大约90％的水分。果肉冻干粉仅用于人群研究，因为种子粉会引起一些人肠道紊乱。在Barrett食管患者口服黑树莓粉的试验中(32或者45g/天，连续6个月)，15％的患者报告了偶尔腹泻、便秘、上腹部痛的临床症状；在连续服用黑树莓粉(60g/天(20g/次，每天3次))9个月的家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者Ib期临床试验中也观察到类似的胃肠道影响。胃和上消化道慢性炎症的患者也是癌症高风险人群，可以预见，树莓对于这类人群的胃肠道剌激更严重。与GaryD.Stoner的临床观察不同，本发明人发现，在健康人中进行黑树莓和红树莓冻干粉用Gary同样的方法冲水服用，不到一半的志愿者能坚持试验一周。另外，其种籽中含有丰富的花青素和鞣质酸等，GaryD.Stoner的研究证明来源于黑树莓或者树莓果肉的粉末和果粉可以同等地抑制化学诱导的大鼠食管癌。如果使用去籽的果肉粉，而丢弃籽里面的化学预防物质则是一种很大的浪费。
因此，有必要降低或消除树莓对胃肠道的剌激作用，同时维持或提高树莓的化学预防效果，以促进树莓在生物医药中的开发利用。
发明内容
本发明人在广泛的组方筛选实验中，出乎意料地发现，由树莓、葛根、陈皮和甘草制得的组合物可以极好地降低树莓对胃肠道的刺激作用，同时还可明显提高树莓的化学预防效果，从而很好地解决了以上问题。
本发明中使用的树莓、葛根、陈皮、甘草都是常见药食同源的中药材。
树莓蔷薇科悬钩子属(Rubus)的多年生落叶性灌木型植物的果实。美国学者GaryD.Stoner等人的研究证明了包括黑树莓、红树莓和黑莓在内的多种浆果对癌症具有相似的化学预防效果，本发明中所涉及的树莓是指蔷薇科悬钩子属的可食用果实，不作区分。优选黑树莓、红树莓和黑莓的果实。进一步优选黑树莓、红树莓和黑莓的冻干果。所述冻干果，是指鲜果或鲜果全桨在低温冻结冰后，通过冷冻干燥方法除去水份得到的果实。这种低温干燥方法对有效成份的破坏少。
葛根葛根为豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd.)Ohwi)的干燥根，民间传统的的葛根还包括甘葛(PueraruaeThomsonii)，民间传统药食常不作区分，中国药典收载的葛根和甘葛性味归经和功效主治用法一样，味甘辛，性平，具有解肌退热，透疹，生津，升阳止泻之功效。中医多用于治疗表证发热、项背强痛、麻疹不透、热病口渴、阴虚消渴、热泄热痢、脾虚泄泻等症；西医常用于治疗心绞痛、高血压、突发性耳聋、视网膜动静脉阻塞、心肌梗死、颈椎病、脑供血不足、偏头痛等病。本发明中所涉及的葛根包括野葛和甘葛，不作区分，但优选野葛。
陈皮为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮。药材分为“陈皮”和“广陈皮”。果实成熟后，剥取果皮，晒干或低温干燥。陈皮为我国传统中药，资源十分丰富。据药典记载，其主要成分有橙皮甙、挥发油，药理作用能抑菌、兴奋心脏、扩张血管、抑胃肠运动，历来被用作健脾理气、和中消滞等。
甘草豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根及根茎。功效益气补中；缓急止痛；润肺止咳；泻火解毒；调和诸药。药理作用具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增强免疫功能等作用。在本发明中，优选使用它的提取物。
COX-2异常表达对肿瘤的发生具有重要的促进作用[KawabeA，ShimadaY，UchidaS，etal.Expressionofcyclooxygenase-2inprimaryandremnantgastriccarcinoma：comparingitwithp53accumulation，Helicobcterpyloriinfection，andvascularendothelialgrowthfactorexpression[J].JSurgOncol，2002，80(2)：79-88.]。COX-2可能经多种途径促进细胞增生、抑制细胞凋亡、调节肿瘤新生血管形成和增加癌细胞的侵袭性等而发生致癌和促癌作用。吴汉平等研究结果显示，胃癌细胞中高表达的COX-2受抑制后，癌细胞在体内外增生均减慢，表明COX-2高表达与肿瘤细胞增生等恶性表型密切相关[吴汉平等，环氧合酶-2反义核酸抑制胃癌细胞的恶性表型[J].中华内科杂志，2002，41(6)：534-537]。动物实验发现，COX-2表达增加PGE前列腺素合成，前列腺素可诱导细胞增生并刺激Bcl-2蛋白表达，后者可抑制细胞凋亡，使细胞增生和凋亡失去平衡而促进肿瘤发生[KimJM，etal.Upregulatedcyclooxygenase-2inhibitsapoptosisofhumangastricepithelialcellsinfectedwithHelicobacterpylori[J].DigDisSci，2000，45(9)：2436-2443；JooYE，RewJS，SeoYH，etal，Cyclooxygenase-2overexpressioncorrelateswithvascularendothelialgrowthfactorexpressionandtumorangiogenesisingastriccancer，JClinGastroenterol，2003，37(12)：28-33.]。
本发明人通过对树莓及其潜在组合物的和水提物醇提取物体外对肿瘤细胞株的抑制作用和对肿瘤细胞株合成COX-2蛋白调节作用的研究，发现树莓、葛根、陈皮和甘草组合物(HGCG)对癌细胞有较强的抑制作用和抑制肿瘤细胞株合成COX-2蛋白的作用，其作用在潜在的树莓组合物中是最强的，而且比任何一种三味组合物的活性都显著提高。
体外细胞实验的树莓的水溶性成份和酯溶性成份对癌细胞的抑制作用是等同的，相比单剂量的树莓粉或其它组合，树莓、葛根、陈皮和甘草的组合物(HGCG)抗癌作用优势明显，表明了HGCG组合物的抗癌用途。研究中癌细胞COX-2蛋白的表达水平也和癌细胞抑制的结果一致。COX-2在癌症的产生和发展中都有重要意义，可能是癌症防治的一个重要靶标，COX-2上下游的信号通道非常复杂，组合物HGCG可能对COX-2上下游的信号通道产生了强烈的作用。发明人的研究表明，HGCG的水提取物与醇提取物的作用是基本等同的。
进一步的动物模型的体内化学预防试验结果表明，HGCG组合物的原粉和提取物(水提取物)对大鼠结肠癌的预防作用等同，体内试验也表明，HGCG组合物的作用也大大强于单纯黑树莓和其它组合物的化学预防作用，这表明可以大大降低黑树莓的食用量，因此，HGCG组合物是一个很有应用前景的化学预防剂。
小鼠胃黏膜影响试验表明，树莓对小鼠胃黏膜有较强的损伤作用，而HGCG组合物对小鼠胃黏膜则几乎没有刺激性。志愿者试食体验的结果和动物胃黏膜损伤试验的结果是一致的。单纯的树莓以及其它组合物对口腔、食管、胃以及下消化道的刺激性较强，部分志愿者中途退出了试验，而本发明的HGCG组合物组体验到较好的口感、没有发生消化道不适或其它副作用，百分百地完成了试食试验。
在本方面的第一个方面，提供了一种组合物，其由包括树莓、葛根、陈皮和甘草的原料药材制成。本发明的组合物，可以作为药物组合物或食品组合物使用。
特别地，在一个优选的方面，上述组合物中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓10～90份、葛根10～90份、陈皮1～15份、甘草1～50份。
在一个优选的实施方案中，上述组合物中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓50～80份、葛根20～70份、陈皮3～15份、甘草6～50份。
在一个更优选的实施方案中，上述组合物中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓30～70份、葛根20～50份、陈皮3～15份、甘草6～50份。
在一个更优选的实施方案中，上述组合物中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓40～60份、葛根20～30份、陈皮3～15份、甘草6～50份。
在一个更优选的实施方案中，上述组合物中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓40～60份、葛根20～30份、陈皮5～10份、甘草20～40份。
在本发明的一些优选的方面，本发明的组合物由树莓、葛根、陈皮和甘草作为原料药材制成。特别地，在一个优选的方面，本发明所述的组合物由按重量计10～90份的树莓、10～90份的葛根，1～15份的陈皮和1～50份的甘草制成。在一个优选的实施方案中，本发明所述的组合物由按重量计50～80份的树莓、20～70份的葛根、3～15份的陈皮和6～50份的甘草制成。在一个更优选的实施方案中，本发明所述的组合物由按重量计30～70份的树莓、20～50份的葛根、3～15份的陈皮和6～50份的甘草制成。在一个更优选的实施方案中，本发明所述的组合物由按重量计40～60份的树莓、20～30份的葛根、3～15份的陈皮和6～50份的甘草制成。在一个更优选的实施方案中，本发明所述的组合物由按重量计40～60份的树莓、20～30份的葛根、5～10份的陈皮和20～40份的甘草制成。
在本发明的另一些方面，作为本发明组合物的原料的药材除了上述树莓、葛根、陈皮和甘草外，还可以同时包括其他药材作为原料。
本发明组合物的原料药材可以直接采用，也可以经过适当加工(包括粉碎)后采用，还可以经过提取(例如溶剂提取，优选水或醇类作为提取溶剂)后采用。优选地，本发明的组合物为上述原料药材中的一种或几种经提取后的提取物组合而成或所述原料药材中的一种或几种经提取后的提取物与其余原料药材或原料药材的粉末组合而成。特别优选的，甘草和/或陈皮以其提取物形式使用。更特别优选地，甘草提取物以其提取物使用，例如水提取物，特别是水煮提取物。本发明的组合物可以是上述原料药材分别经溶剂提取后组合而成，还可以将上述所需量的原料药材混合后一并进行提取；提取溶剂可以是水或醇，特别是水或乙醇或乙醇水溶液，例如80％的乙醇。
本发明的组合物可以采取合适的形式，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、混悬液或凝胶的形式。制剂可以采用药学领域公知的赋形剂或载体等辅料，可以采用常规方法制备。
本发明还涉及一种食品，其包含上述组合物或由上述组合物制成。本发明所述的食品可以是诸如压片糖果、饮料、固体饮料、糖浆、口服液、果脯、糕点、肉类或香肠等形式。
在本发明的另一方面，提供了制备本发明所述组合物的方法，包括以下步骤：将树莓干果、葛根和陈皮分别粉碎，按比例与预先准备好的甘草提取物混合即得。
在一个优选的实施方案中，本发明所述组合物的制备方法包括将各味原药材按比例称取，用适量水煮提取1-3次，合并提取液，过滤，浓缩至干即得。
在本发明的又一个方面，还提供了本发明所述组合物在制备药物或食品中的用途。在本发明一个优选的方面，提供了所述组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。本发明所述的癌症选自口腔癌、结肠直肠癌、小肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌以及乳腺癌。
在本发明的又一个优选的方面，还提供了本发明所述组合物在制备用于预防癌症的食品中的用途。
具体实施方式：
为了更好地理解和实施本发明，下面结合具体实施例进一步说明本发明。
需要说明的是，除非另有说明，本发明组合物中各组分的比例均为重量比。
实施例
制备实施例1树莓粉的制备
树莓冻于果用粉碎机粉碎到150目以上。
同法制备葛根粉、陈皮粉和甘草粉。
制备实施例2树莓水提取物的制备
树莓用10倍重量的水回流提取1次，过滤，滤渣再用6倍重量的水提取1次，合并提取液，浓缩至干，粉碎到200目以上。
同法制备葛根水提取物、甘草水提取物和陈皮水提取物。
制备实施例3树莓醇提取物的制备
树莓冻干果粉碎，过60目筛，用80％乙醇提取两次，分别是10倍和6倍体积重量比，蒸去溶剂，加水复溶，过滤除去不溶物，滤液浓缩至干，粉碎到200目以上。
同法制备葛根醇提取物、甘草醇提取物和陈皮醇提取物。
制备实施例4树莓组合物散剂的制备
制备实施例1的树莓粉、葛根粉、陈皮粉和制备实施例2的甘草水提取物按以下重量份数比例混合：树莓粉50份、葛根粉30份、陈皮粉10份和甘草水提取物10份。
制备实施例5树莓组合物片剂的制备
按以下重量份数比例混合称取制备实施例1的树莓粉、葛根粉、陈皮粉和制备实施例2的甘草水提取物，树莓粉50份、葛根粉23份、陈皮粉5份、甘草水提取物3份，乳糖14份，HPMCE154份，硬脂酸镁1份。HPMCE15用50％的酒精配制成3％的溶液，树莓粉、葛根粉、陈皮粉、甘草水提取物、乳糖混合，用HPMCE15溶液制剂，过30目筛，烘干，整粒，拌入硬脂酸镁，上机压片。
制备实施例6树莓组合物胶囊的制备
按以下重量份数比例混合称取制备实施例1的树莓粉、葛根粉、陈皮粉和制备实施例2的甘草水提取物，树莓粉50份、葛根粉23份、陈皮粉5份、甘草水提取物3份，牛磺酸0.1份，葡萄糖酸锌0.1份，乳糖14份，HPMCE154份，硬脂酸镁0.8份。HPMCE15用50％的酒精配制成3％的溶液，树莓粉、葛根粉、陈皮粉、甘草水提取物、乳糖混合，用HPMCE15溶液制剂，过30目筛，烘干，整粒，拌入牛磺酸、葡萄糖酸锌和硬脂酸镁，装入胶囊。
制备实施例7树莓组合物凝胶剂的制备
按以下重量份数比例混合称取制备实施例1的树莓粉80份和制备实施例2的葛根水提取物6份、陈皮水提取物3份和甘草水提取物3份，黄原胶7.5份，阿巴斯甜0.5份。将黄原胶溶于热水，加入其他物料，高速搅拌，将制得的凝胶装入容器中即得。
制备实施例8树莓组合物片剂的制备
按以下重量份数比例混合称取制备实施例1的树莓粉和陈皮粉以及制备实施例2的葛根水提取物和甘草水提取物：树莓粉60份、葛根粉10份、陈皮粉8份、甘草水提取物7份，牛磺酸0.1份，葡萄糖酸锌0.1份，乳糖10份，HPMCE154份，硬脂酸镁0.8份。HPMCE15用50％的酒精配制成3％的溶液，与树莓粉、葛根粉、陈皮粉、甘草水提取物、乳糖混合，用HPMCE15溶液制剂，过30目筛，烘干，整粒，拌入牛磺酸、葡萄糖酸锌和硬脂酸镁，上机压片即可。
制备实施例9树莓组合物提取物片剂的制备
按以下重量份数比例混合称取的树莓50份、葛根30份、甘草30份和陈皮15份，总重量10倍体积的75％乙醇回流提取2次，浓缩干燥，加入HPMCE1510份制粒。过30目筛，烘干，整粒，拌入牛磺酸0.1份，葡萄糖酸锌0.1份，和硬脂酸镁0.8份，上机压片。
制备实施例10树莓组合物散剂的制备
制备实施例1的树莓粉、葛根粉、陈皮粉和制备实施例2的甘草水提取物按以下重量份数比例混合，树莓粉50份、葛根粉30份、陈皮粉10份、甘草水提取物5份、低聚果糖20份。
效果实施例1提取物和提取物组合物对大肠癌细胞系LOVO细胞、子宫颈癌Hela细胞增殖及COX-2蛋白表达的影响
药液制备
按下表1重量比例配伍药物组合物，按制备实施例2和3的方法制备组合物的水提物和醇提物，干燥，粉碎。并用培养基配制成所需药液浓度备用。
表1组合物的重量份数
体外细胞活力抑制试验
1细胞株
LOVO(人结肠癌细胞)和Hela(人宫颈癌细胞)来源于中山大学实验动物中心细胞库。
2试验设计
2.1细胞密度确定及不同条件下对CCK8的影响
细胞复苏后，培养至对数生长期，根据预实验确定细胞浓度为LOVO：3×104细胞/mL，Hela：2×104细胞/mL。预试验中也表明了较高浓度的药物和10％血清均不影响CCK8颜色。
2.2药物浓度设计
加入后的终浓度为2-200mg/L(2、5、10、20、40、80、160、200mg/L)。
2.3操作步骤：
细胞培养条件：37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养。
培养基：含10％胎牛血清的DMEM培养基。
细胞复苏后，培养至对数生长期细胞；
取1-3瓶细胞，倒去培养液，用PBS洗2次，每瓶用0.25％胰酶1mL消化；
细胞可脱壁后加入3-5mL培养液中止消化，洗下细胞吸至离心管中；
1000转/分钟离心3分钟，吸去上清，加1-2mL培养液吹打均匀，用细胞计数板进行细胞浓度计数；
根据计数结果，用培养基将细胞调节至相应浓度；
种板至96孔板(最外圈各孔加PBS，中间用3个孔不加细胞液，只加培养基)，100μL/孔，培养24h；
将前一天培养基吸出，每孔加入已配好的给药组药液和阳性药组药液，100μL/孔，每个药物浓度用3个复孔；
孵育48h后，观察细胞形态，加入CCK-810μL/孔，孵育4h后，在450nm酶标仪读板并拍照。
2.4结果处理和分析
细胞生长抑制率＝(1-实验组OD/对照组OD)×100％
用Origin70软件以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定药物的半数抑制浓度IC50(生长-抑制浓度)，即细胞存活率达到一半时的药物作用浓度。
2.5统计学分析
所有资料经SPSS17.0医学统计软件处理，计量资料以x±s表示，两样本间参数比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有显著性。
3结果
检测出各孔OD值后，计算各个药物不同药物浓度对各个细胞的抑制率，并对应于药物浓度的反对数作图，计算出IC50，结果如表2所示。
表2树莓组合物对人癌细胞生长和COX-2表达的抑制作用
注：a，与组合物1组比较，p＜0.01；b，与组合物1组比较，p＜0.05；c，与组合物9组比较，p＞0.05；d，与对照组比较，p＞0.01。。
结果表明，组1与组组2，组9与组11比较无显著性差异，说明黑树莓和红树莓对肿瘤细胞抑制效果无差异；组3～7虽然相比组1或组2对肿瘤细胞抑制效果有提高，但统计学无显著性差别；与组1相比，含树莓、葛根、陈皮和甘草的组9、10、11和13对肿瘤细胞抑制效果显著性提高，有统计学意义。
westernblot检测LOVO细胞株COX-2蛋白表达变化
细胞接种及分组同上，收集20mg/L受试物浓度的细胞，用PBS漂洗，参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，蛋白样品加入1/5体积的5×上样缓冲液，沸水煮沸5min后离心，以每孔20μg/孔上样，行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入1∶1000稀释的鼠抗人COX-2蛋白，4℃过夜，β-actin作为内参，TBST洗膜3次，加入1∶1000稀释的辣根酶标记的兔抗鼠IgG，室温孵育2h，同样洗膜3次，ECL显色，观察各条带深浅变化。
用GelDocXR凝胶成像分析系统，以目的蛋白的面积积分灰度值与β-actin蛋白带的面积积分灰度值之比表示目的蛋白的表达水平。所有资料经SPSS17.0医学统计软件处理，计量资料以x±s表示，两样本间参数比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有显著性。
结果发现，与对照组相比，树莓及其组合物能降低COX-2蛋白的表达，其中树莓、葛根、陈皮和甘草的组合物对LOVO细胞表达COX-2蛋白的抑制最显著(P＜0.01)。
效果实施例2树莓组合物对大鼠结肠癌的预防作用
试验药物：
试药1黑树莓100g按制备实施例1的方法粉碎，加饲料100g混合成试药。
试药2黑树莓100g，葛根50g，陈皮20g，按制备实施例1的方法粉碎，加饲料30g，混合成试药。
试药3黑树莓100g，葛根50g，甘草水提取物20g，黑树莓、葛根按制备实施例1的方法粉碎，甘草水提取物按制备实施例2的方法制备，各提取物混合加饲料30g，混合成试药。
试药4黑树莓100g，葛根50g，陈皮20g，甘草浸膏20g，黑树莓、葛根和陈皮按制备实施例1的方法粉碎，甘草水提取物按制备实施例2的方法制备称取份量，各组分混合加饲料10g，混合成试药。
试药5黑树莓100g，葛根50g，陈皮20g，甘草水提取物20g，黑树莓、葛根和陈皮混合，按制备实施例2的方法提取干燥，甘草水提取物按制备实施例2的方法制备，称取份量粉碎混合，加饲料至总重200g，混合成试药。
试药6黑莓100g按制备实施例1的方法粉碎，加饲料100g混合成试药。
试药7黑莓100g，葛根50g，陈皮20g，甘草水提取物20g，黑莓、葛根和陈皮按制备实施例1的方法粉碎，甘草浸膏按制备实施例2的方法制备称取份量，各组分混合加饲料10g，混合成试药。
饲料制备：
基础饲料粉碎后，分别称取试药1至7，使其中树莓含量符合下表3，搅拌均匀，压制成形，干燥备用。
表3饲料的配制
Wistar大鼠225只，随机分为9组，即对照组、模型组和以上7个药物组，每组25只。
动物1～3周自由摄食普通饲料。实验第1周除对照组外各组大鼠给予二甲基肼(DMH)40mg/kg腹股沟皮下注射，隔天1次，共3次；第2周给予所有大鼠含1％葡聚糖硫酸钠的水自由饮用；第3周大鼠恢复自由饮用灭菌自来水。从第4周开始至实验结束，除对照组和模型组自由摄食普通饲料外，其它组自由摄食含树莓组合物的相应饲料。于实验第10周各组随机抽取大鼠10只，3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取结肠观察各组大鼠异常隐窝病灶(ACF)形成情况，结果见表4。实验第20周，剩余所有大鼠3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取结肠观察各组肿瘤形成情况，结果见表5。
大鼠结肠ACF计数方法：取大鼠结肠，用冰生理盐水冲洗干净，纵向剖开，平铺于塑料板上，10％甲醛固定4～6h后，用0.2％亚甲蓝浸泡30s，40倍光学显微镜下计数ACF个数。
大鼠结肠肿瘤检查方法：结肠去脂肪组织，沿肠系膜附着处纵向剖开整个肠道，用生理盐水冲洗干净肠组织，平铺于塑料板上，黏膜面向上，记录肿瘤的部位、形态和大小。肿瘤标本用10％甲醛固定，石蜡包埋，常规切片和HE染色，肿瘤分类参考Teague提出的大鼠肿瘤分类标准。
免疫组化检测结直肠组织中COX-2的表达
第10周的大鼠，每组随机选取5个蜡块标本，免疫组化法检测环氧化酶-2(COX-2)蛋白的表达，组织切片脱蜡，抗原热修复，放入3％的过氧化氢溶液中，室温孵育10min，滴加封闭液，室温孵育10min，滴加按1∶200稀释的一抗，4℃过夜，0.01mol/LPBS洗2min×3次，滴加聚合HRP标记抗羊IgG(SV-0003)，37℃孵育30min，PBS冲洗，2min×3次DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染脱水，透明，封片观察，每张切片在高倍镜(40×10)下随机选取5个视野，采用数码摄像(Nikoneclipse80i多功能生物显微镜)及图像分析软件(image-ProPlus6.0)进行图像采集及分析，比较各组阳性染色部位的平均光密度。
统计学处理所有数据均以均数±标准差X±S表示，采用SPSS17.0软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
免疫组化结果
COX-2蛋白主要定位于细胞浆，阳性染色为棕黄色，在正常结直肠黏膜中二者均主要表达在腺腔呈弥漫性表达，在不典型增生组织中主要表达在腺体的边缘，不典型增生组织的COX-2蛋白表达明显高于正常组织。各给药组COX-2蛋白平均光密度较模型组降低(P＜0.05)，试药4组和试药5组对COX-2蛋白表达的抑制作用最强。各组小鼠结直肠部位COX-2免疫组化阳性表达结果见表4。
表4第10周各组大鼠结肠ACF形成和COX-2表达情况
a与模型组比较P＜0.05，b与试药1组比较P＜0.05，c与试药6组比较P＜0.05，d与试药4组比较P＞0.05
表5第20周各组大鼠结肠结肠癌发病情况
a与模型组比较P＜0.05，b与试药1组比较P＜0.05，c与试药6组比较P＜0.05
结果表明，树莓、葛根、甘草和陈皮的组合的预防大鼠结肠癌的效果优于单用树莓，该组合明显提高树莓的化学预防效果，并且与单用树莓相比有显著性差异，同时也优于其它组合。结果还表明，树莓、葛根、甘草和陈皮组合物的原粉和提取物对大鼠结肠癌的预防效果是等同的。另外，实验结果证明，在本发明的组合物中，树莓具体采用黑树莓、红树莓还是黑莓，对大鼠结肠癌的预防效果是基本等效的。
效果实施例3树莓组合物对小鼠胃黏膜的影响
试验药物：
试药1黑树莓100份：按实施例1的方法粉碎，过200目筛，以下同。
试药2黑树莓100份，葛根50份，陈皮20份，按制备实施例1的方法粉碎成200目，混合成试药。
试药3黑树莓100份，葛根50份，甘草浸膏20份，黑树莓、葛根按制备实施例1的方法粉碎成200目，甘草浸膏按制备实施例2的方法制备称取，各成份混合成试药。
试药4黑树莓100份，葛根50份，陈皮20份，甘草浸膏20份，黑树莓、葛根和陈皮按实施例1的方法粉碎成200目，甘草浸膏按制备实施例2的方法制备称取，各组分混合。
实验方法
昆明种小鼠随机分为正常对照组及以上四个试药组，每组10只，将试药溶悬于0.5％羟甲基纤维素溶液中，制成含黑树莓粉10g.100mL-1的试液。全部小鼠禁食24h后，自由饮水至实验前2h，试验组灌胃给予相应药物0.2mL·10g-1，正常对照组灌胃给0.5％羟甲基纤维素溶液0.2mL.10g-1，每天2次，连续给药7天。
胃黏膜损伤程度检测
最后一次喂药4h后，采用颈椎脱臼法处死所有小鼠，剖腹，结扎贲门及幽门，取出胃，向胃腔注入4％甲醛溶液1mL并将胃浸泡于该甲醛溶液中10min以固定。将胃沿大弯剪开，把胃黏膜洗净后展平于平板上，检测胃黏膜损伤程度。按黏膜损伤的面积评分并计算损伤指数：≤1.0mm2为1分，＞1.0mm2且≤2.0mm2为2分，＞2.0mm2且≤3.0mm2为3分，依此类推。全胃评分的总和为该小鼠的胃黏膜损伤指数，并按下式计算除正常对照组外各组胃黏膜损伤抑制率。
小鼠胃黏膜损伤外观结果
正常对照组小鼠胃黏膜光滑，皱襞完整规律，附有较多的黏液，罕见糜烂、溃疡、出血点。试药1组小鼠胃黏膜光滑、皱襞范围减少，胃黏膜伴有糜烂、溃疡、出血等损伤，呈点状、条索状、片状或出血坏死斑，损伤部位多见于胃体和胃窦部。试药2组和试药3组小鼠胃黏膜糜烂、溃疡的程度比模型组明显降低，胃黏膜损伤表现以点状的糜烂为主，可见少许出血点。试药4组胃黏膜光滑，皱襞完整规律，附有较多的黏液，少见糜烂、溃疡、出血点。
小鼠胃黏膜损伤指数检测结果
与正常对照组比较，试药1～3组小鼠胃黏膜损伤指数均明显升高(P＜0.01)；与试药1～3组比较，试药4组小鼠胃黏膜损伤指数明显降低(P＜0.01)。试药1组和正常对照组比较小鼠胃黏膜损伤指数无明显区别。各组小鼠胃黏膜损伤指数比较见表6。
表6各组小鼠胃黏膜损伤指数比较(x±s，n＝10)
注：a与正常对照组比较，P＜0.01，b与试药1组比较，P＜0.01。
效果实施例4人体试食试验评价树莓组合物的口感、牙龈剌激和肠胃反应
试药：
试药1黑树莓100份：按制备实施例1的方法粉碎。
试药2黑树莓100份，葛根50份，陈皮20份，按制备实施例1的方法粉碎，混合成试药。
试药3复方黑树莓粉：黑树莓100份，葛根50份，甘草浸膏20份，黑树莓、葛根按制备实施例1的方法粉碎，甘草浸膏按制备实施例2的方法制备，各提取物混合成试药。
试药4黑树莓100份，葛根50份，陈皮20份，甘草浸膏20份，黑树莓、葛根和陈皮按制备实施例1的方法粉碎，甘草浸膏按制备实施例2的方法制备，各组分混合。
以上组合物，各包装成含试药5克/袋。
健康志愿者，40名，男女各半，年龄35～45岁，随机分成5组，每组8人，分别给予试药1-4，嘱咐餐后两小时服用，每天2次，每次2袋，温水冲服，连续7天，第二天起至第8天每天上午电话访问志愿者，详细记录口感、牙龈刺激和/或肠胃反应方面的情况。评分标准：主诉口感很好，喜欢喝-1分；口感可以接受0分；口感不好，但能接受1分；口感很差，非常难喝2分；感觉牙龈酸软3分；服后有胃灼烧感4分；因感觉不适退出试验5分；因胃疼中止试验6分。主诉两种或两种以上情况的，按分值高的评分。脱离实验的从第二天起至实验结束，每天评分6分。
统计学处理所有数据均以均数±标准差X±S表示，采用SPSS17.0软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
试食结果见表7。
表7人体试食评价对消化道的刺激性
注：a与试药1组比较，P＜0.01；b与试药2组比较，P＜0.01；c与试药3组比较，P＜0.01。
上述实验结果表明，试药2-4在口感、牙龈刺激和肠胃反应的综合方面要明显优于试药1；而且试药4与试药2、3相比有也有显著差异。这表明本发明的由包括树莓、葛根、陈皮和甘草的原料药材制成的组合物相比于单纯的树莓具有明显改善的耐受性和可接受性。此外，本发明人还采用红树莓和黑莓分别替代黑树莓用在本发明的组合物中进行了上述效果实施例3和4的试验，结果均表明所制得的组合物对小鼠胃黏膜损伤指数明显降低，并且在口感、牙龈剌激和肠胃反应的综合方面明显具有优势。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (13)
1.一种组合物，其由包括树莓、葛根、陈皮和甘草的原料药材制成。
2.权利要求1所述的组合物，其中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓10～90份、葛根10～90份、陈皮1～15份、甘草1～50份。
3.权利要求1～2中任一项所述的组合物，其中使用的树莓、葛根、陈皮和甘草按重量计分别为树莓40～60份、葛根20～30份、陈皮3～15份、甘草6～50份。
4.权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中所述组合物为所述原料药材中的一种或几种经提取后的提取物与其余原料药材或原料药材的粉末组合而成。
5.权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、混悬液或凝胶的形式。
6.一种食品，其包含权利要求1～4中任一项所述的组合物或由权利要求1～4中任一项所述的组合物制成。
7.权利要求1～5中任一项所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：将树莓干果、葛根和陈皮分别粉碎，按比例与预先准备好的甘草提取物混合即得。
8.权利要求1～5中任一项所述的组合物的制备方法，包括将各味原药材按比例称取，用适量水煮提取1-3次，合并提取液，过滤，浓缩至干即得。
9.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备药物或食品中的用途。
10.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自口腔癌、结肠直肠癌、小肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌以及乳腺癌。
12.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备用于预防癌症的食品中的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述食品为压片糖果、饮料、固体饮料、糖浆、口服液、果脯、糕点、肉类或香肠形式的食品。
Priority Applications (1)
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