KR20090128239A

KR20090128239A - 대장균 특이적 박테리오파아지 및 이를 이용한 대장균오염의 예방 또는 통제 방법

Info

Publication number: KR20090128239A
Application number: KR1020080054305A
Authority: KR
Inventors: 조영욱; 안상희; 신수안; 최향; 박민태; 강인혜; 김효진; 김철하
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2009-12-15
Also published as: KR101023995B1

Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli) 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지 및 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 효과적으로 예방 또는 통제하기 위한 상기 박테리오파아지의 용도에 관한 것이다.

박테리오파아지, 대장균 오염, 아미노산

Description

대장균 특이적 박테리오파아지 및 이를 이용한 대장균 오염의 예방 또는 통제 방법{Escherichia coil specific bactriophage and method of preventing or controlling E. coli contamination using the same}

박테리오파아지(bacteriophage)는 1917년 프랑스의 세균학자 데렐(d'Herelle)에 의해 발견된 세균 바이러스의 일종으로 파아지(phage)라고도 불린다. 박테리오파아지는 생존을 위해 세균에 감염되어 그 세포 내에서만 증식하며, 박테리오파아지와 그 숙주 간의 관계는 높은 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다. 다른 바이러스들과 마찬가지로 박테리오파아지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 구성된다. 세균을 감염시킬 때 파아지는 세균의 표면에 달라붙어 자신의 유전물질을 세포 내로 주입하며, 이후 파아지는 용균성(lytic) 또는 용원성(lysogenic) 생활사(life cycle)를 따른다. 용균성 파아지는 숙주의 세 포 기구들이 파아지 자신의 구조물들을 만들게 한 후 세포를 파괴하거나 용해시켜 새로운 파아지 입자들을 방출시킨다. 용원성 파아지는 자신의 핵산을 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세포를 파괴하지 않고 세포와 함께 복제된다. 일정한 조건이 되면 용원성 파지는 용균성으로 전환될 수 있다.

항균성 약물로서 용균성 박테리오파아지는 감수성 있는 세균에 감염된 후에, 그들을 완전히 파괴하고 계속해서 세균 세포를 공격해서 파괴시키는 새로운 박테리오파아지를 생성하면서 내부에서 복제하는 특성 때문에 세균에 의한 감염을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대되었다. 이러한 과정은 시험관 내 및 생체 내 양쪽 모두에서 일어날 수 있다. 그러나 박테리오파아지는 생체 내에서 세균을 죽이는 효과가 시험관 내에서의 세균을 죽이는 효과만큼 효율적이지 못했으며, 1940년대에 항생제의 개발로 인해서 서방에서의 박테리오파아지에 대한 연구는 내리막길을 걷게 되었다. 동유럽과 인도 등 일부 국가에서는 연구가 꾸준히 진행되어왔으며, 최근 들어 항생제의 오남용으로 인해 항생제 내성을 가진 박테리아의 출현으로 다시 많은 관심을 받고 있는 생명체이다.

기존에 박테리오파아지를 이용한 질병의 예방 및 치료제(Atterbury et al., Appl. Envion. Microbiol. 73(14):4543-4549 (2007)), 음식물의 이상부패를 막는 소독제나 세척제(PCT 1998-08944, PCT 1995-31562, EP 1990-202169, PCT 1990-03122), 혹은 진단을 위한 파이지 디스플레이 기술의 개발(Ripp et al., J. Appl. Microbiol. 100(3):488-499 (2006)) 등이 있었으나, 박테리오파아지를 세균에 의한 오염을 방지하기 위해 대량 발효에 적용하는 사례는 없었다.

아미노산, 핵산 등의 유용한 물질을 생산하기 위한 미생물의 배양시, 원치않는 세균에 의한 오염은 배양에 의한 생산 효율 저하를 유발하고, 심각한 경우 배양의 중단을 초래한다. 따라서, 미생물 배양에 의한 발효에서 세균 오염의 예방 및 통제는 매우 중요하다.

코리네박테리움 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성 세균으로서, 발효로 만들어지는 대부분의 L-아미노산을 생산하는 균주로 이용되고 있다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에 사용되고 있다. L-라이신은 주로 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 직접발효법에 의해 생산되고 있기 때문에 발효과정의 개선에 의한 L-라이신의 생산성 향상은 큰 경제적 효과가 있다. 발효과정의 개선을 위해, 주로 균주 개량이나 배지 개발 등이 시도되었으나, 미생물 배양을 통한 L-아미노산 생산방법의 개선이 여전히 요구된다.

이에, 본 발명자들은 코리네박테리움과 같이 대장균이 아닌 미생물의 배양에 의한 발효에서 손실을 최소화하여 발효 효율을 극대화시키기고자 주요 오염원 중 하나인 대장균에 대해 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지를 선별하고 이를 이용하여 상업적인 대량발효시에 발생할 수 있는 대장균에 의한 오염을 효과적으로 예방 또는 통제하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지를 이용하여, 미생물의 배양에 의한 대규모 발효에서 대장균 오염을 효과적으로 예방 또는 통제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 꼬리 단백질(tail protein) 및 서열번호 2 내지 서열번호 37로 표시되는 염기서열로 구성된 핵산 분자를 포함하는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae family), T1-유사 파아지 속(T1-like phage genus)에 속하는 박테리오파아지를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지는 박테리오파아지 YS01 KCCM10947일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지는 박테리오파아지가 감염된 대장균 발효액으로부터 분리될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 박테리오파아지 YS01의 전자투과현미경 사진을 보여준다. 이에 따르면, 본 발명에서 분리된 박테리오파아지는 형태상, 형태형(morphotype) B1의 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하며, 부분 염기서열 분 석을 통하여 분석한 결과 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 꼬리 단백질(tail protein)을 갖는 것을 특징으로 하는, 박테리오파아지 RTP와 높은 유사성을 보이는 T1-유사 파아지(T1-like) 파아지로 밝혀졌다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지는 대장균에만 특이적으로 감염되며, 그 성장이 온도에 의존적인 것으로 확인되었다. 하나의 박테리오파아지가 하나의 세균에 감염되어서 그 안에서 자가 복제되어 나올 때의 방출수(burst size)는 1,000개 이상이었으며, 세균배양의 일반적인 온도인 37℃에서보다 일반적인 발효온도인 30℃에서 더 원활한 감염을 보였다. 따라서, 상기 박테리오파아지는 발효산업에서 대장균 오염을 효과적으로 예방 또는 통제하기 위해 사용하기에 적합할 수 있다.

본 발명은 또한 i) 대장균이 아닌 미생물을 종모 배양하는 단계, 및

ii) 상기 종모 배양된 미생물을 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지와 함께 본 배양용 배지에 접종하는 단계를 포함하는, 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법은 대장균이 아닌 미생물을 종모 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 대장균이 아닌 미생물은 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.

본 발명에 따른 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법은 종모 배양된 미생물을 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테 리오파아지와 함께 본 배양용 배지에 접종하는 단계를 포함한다.

대부분의 발효산업에서 오염이 일어나는 대부분의 경우가 종모배양에서 본배양으로 넘어가는 시기에 발생한다. 이 시점에서 다른 세균들보다 기회감염의 확률이 높은 대장균을 통제하기 위한 수단으로 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지를 첨가할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 꼬리 단백질(tail protein) 및 서열번호 2 내지 서열번호 37로 구성된 염기서열로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae family), T1-유사 파아지(T1-like phage genus) 속에 속하는 박테리오파아지일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지는 기탁번호 KCCM10947인 박테리오파아지 YSO1일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지는 본 배양용 배지 1L 당 10^4 pfu 내지 10^6 pfu의 농도로 접종될 수 있다.

일반적으로 배양 시 수득되는 박테리오파아지의 농도가 10^9 pfu/ml 임을 감안할 때 본 배양용 배지 1L 당 투입되는 10^4 pfu 내지 10^6 pfu는 아주 적은 양이므로 산업적인 스케일을 생각하더라도 경제적으로 저렴하게 배양하여 분리한 후 적용할 수 있는 박테리오파아지를 이용하여 L-아미노산 발효에서 대장균 오염을 예방 및 통제할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리오파아지를 접종하는 본 배양용 배지 의 온도는 30℃ 내지 33℃일 수 있으며, 바람직하게는 30℃일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 새로운 특성의 박테리오파아지 발굴을 통하여 대장균 이외의 미생물 특히 코리네박테리움 속을 이용한 L-아미노산 발효공정에서 대장균에 의한 오염을 항생제를 사용하지 않고 천연의 방법으로 효과적으로 통제할 수 있다. 또한 극소량의 박테리오파아지를 이용하면서도 대장균 오염을 예방하고 통제하는 효과가 높아 경제적이라 할 수 있다.

실시예1 : 대장균에 감염하는 박테리오파아지의 분리 및 배양

(1) 대장균에 감염하는 박테리오파아지의 분리

박테리오파아지가 감염된 대장균 발효액에 1%의 클로로포름을 첨가해서 2분간 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 0.45㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. 상기에서 수득된 여과액을 LB(Luira Bertani) 플레이트(트립톤 10g; 효모 추출물 5g; NaCl 10g; 아가 20g; 총 용량을 1L로 채우는 양의 H₂O)에 펴 바른 후, 그 위에 대장균 W3110 배양액 (OD₆₀₀=0.8)을 0.7% 한천배지(아가 7g; 총 용량을 1L로 채우는 양의 H₂O)에 섞어 부어준 뒤 굳히고 18시간 동안 30℃에 서 배양하였다. 하나의 용균반을 와이드포어 피펫(wide-pore pippet)으로 취해서 500ul SM 완충액(NaCl 5.8 g; MgSO₄7H₂O 2 g; 1M Tris-Cl (pH7.5) 50ml; 총 용량을 1L로 채우는 양의 H₂O)에 넣고 6시간 동안 실온에 정치하였다. 이를 원심분리해서 대장균에 감염하는 박테리오파아지를 포함하는 상등액을 취했다.

(2) 대장균에 감염하는 박테리오파아지의 배양

상기 (1)에서 준비한 상등액 10ul를 0.7% 한천배지 14ml 및 대장균 W3100 배양액 (OD₆₀₀=0.8) 500ul와 혼합하고 50mm 직경의 LB 플레이트에 부어 굳힌 후 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 완전 용균이 일어난 플레이트에 15ml의 SM 완충액을 분주하고, 5시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 그 후, 상기 플레이트에서 SM 완충액을 회수하고, 1%의 클로로포름을 첨가해서 2분간 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.

모든 실험은 상기 (2)에 기재된 방법으로 반복 배양 증식하여 사용하였다. 상기 배양에 의해 수득된 박테리오파아지의 농도는 1.0 * 10^9 pfu/ml였다.

실시예 2: 박테리오파아지 순수분리 및 형태관찰

박테리오파아지를 순수분리하기 위해서 대량배양을 실시했다. 대장균 W3110 을 LB 배지(트립톤 10g; 효모 추출물 5g; NaCl 10g; 총 용량을 1L로 채우는 양의 H₂O)에 접종 후, 30℃에서 16시간 동안 배양하여 시험관당 1.0 x 10^10 cfu가 되도록 분주하였다. 4000g에서 10분간 원심분리한 후 이를 3ml SM 완충액에 재부유시켰다. 실시예 1에서 수득된 박테리오파아지를 5.0 * 10^8 pfu로 접종한 후 30℃에서 20분간 진탕배양하였다. 이를 200ml 새로운 LB 에 2개 시험관씩 접종한 후 30℃ 에서 8시간 동안 진탕배양하였다. 그 후, 4ml의 클로로포름을 첨가하고 10분간 진탕배양하였다. DNase I과 RNase A를 최종농도 1ug/ml 되도록 접종하고 30분간 실온에 정치시켰다. 1M NaCl과 10% PEG를 첨가한 뒤 4℃에서 3시간 정치시켰다. 4℃, 11,000g에서 10분간 원심분리후 상등액을 제거하였다. 와이드포어 피펫으로 4ml SM 완충액에 상기 원심분리에서 수득된 침전물을 재부유한 후 20분간 실온에 정치하였다. 4ml 클로로포름을 첨가한 후 잘 섞어주고 4℃, 3,000g에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 따로 분리하였다. 글리세롤 밀도 구배법(밀도: 40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리(35,000rpm, 1시간, 4℃)를 통하여 박테리오파아지를 정제하였다.

상기 정제된 박테리오파아지를 0.01% 젤라틴 용액에 희석한 후, 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 고정하였다. 이를 탄소-코팅된 운모 플레이트(carbon-coated mica plate: 약 2.5 *2.5 mm)에 떨어뜨려 10분간 적응시킨 후, 멸균증류수로 세척하였다. 탄소 필름을 구리 그리드(copper grid)에 끼워 4% 우라닐 아세테이트로 30-60초간 염색하고, 건조시킨 후, JEM-1011 투과전자현미경으로 80kV에서 배율 120,000배 내지 200,000배로 검경하였다. 도 1은 실시예 1 및 실시예 2를 통해 분 리되고 정제된 박테리오파아지의 전자투과현미경 사진을 도시한다. 그 결과, 분리된 박테리오파아지가 형태학적으로 분류상 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하는 것을 확인하고, 이를 YS01로 명명하였다. 박테리오파아지 YS01을 2008년 5월 15일자로 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10947로 기탁하였다.

실시예 3: 박테리오파아지의 유전적 특성 분석

(1) 박테리오파아지의 gDNA 분리

실시예 2에서 초원심분리를 통해 정제된 박테리오파아지의 gDNA 를 추출하였다. 구체적으로 정제된 박테리오파아지 배양액에 최종농도 20mM의 EDTA(pH8.0), 50ug/ml의 프로테아제(Protease) K, 및 0.5%의 SDS를 첨가하였다. 잘 섞어준 후 56℃에서 1시간 동안 정치하였다. 동일 양의 페놀(pH8.0)을 첨가하고 잘 섞어준 후 실온에서 3,000g로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 취해서 동일 양의 PC(페놀:클로로포름=1:1)를 첨가하고 잘 섞어준 후 실온에서 3,000g로 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리 후 상등액을 취해서 동일 양의 클로로포름을 첨가하고 잘 섞어준 후 실온에서 3,000g로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 취한 후 3M 아세트산 나트륨을 1/10의 비율로 첨가하고 혼합한 후 그 부피의 2배량의 차가운 EtOH를 첨가하고 -20℃에서 1시간 정치하였다. 0℃에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리 후 상등액을 완전히 제거하고, 바닥에 침전된 gDNA를 100ul의 물에 녹인 후 -20℃에서 냉동 보관한다.

(2) 염기서열 분석

분리한 박테리오파아지의 유전자적 특성을 알아보기 위해서 상기 (1)에서 수득된 박테리오파아지의 gDNA 5 ㎍을 StuI과 SmaI 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pBluescript SK+(Stratagene사)를 사용하였으며 EcoR V 제한효소로 자른 후 CIP(Calf Intestinal Phosphatase)로 처리하였다. 상기와 같이 처리된 gDNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 16℃에서 5시간 동안 라이게이션(ligation)을 진행하였다. 이에 의해 수득된 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 도입시켰다. 박테리오파아지의 gDNA 단편을 포함하는 벡터에 의한 형질전환체를 암피실린(ampicillin)과 X-gal이 포함된 LB 플레이트에서 청백 콜로니 선별법을 통해 백색의 콜로니만을 선별하였다. 이에 의해 선별된 콜로니를 암피실린이 포함된 LB 배지에서 30℃에서 16시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 상기에서 배양된 대장균으로부터 플라스미드 정제키트(Promega 사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이를 EcoR V 제한효소로 처리하여 그 크기를 확인하였으며 크기가 1kb 이상 되는 것을 골라 각각 서열번호 38과 39의 M13 정방향(forward) 프라이머와 M13 역방향(reverse) 프라이머(Invitrogen사)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 유전자 서열은 분리된 박테리오파아지 YS01의 전체 유전체를 구성하는 부분서열로서 서열번호 2 내지 37로 표시하였다.

상기에서 얻어진 유전자 서열을 NCBI blast 프로그램을 이용하여 분석한 결과가 하기의 표 1 및 표 2에 기재된다. 염기서열 분석 결과 박테리오파아지 YS01은 박테리오파아지 RTP와 높은 유사성을 보이는 T1-유사 파아지로 밝혀졌다.

표 1. blastn 을 이용한 분석 결과

단편 (서열번호)	organism	gene	identities	Gaps
1 (2/3)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	389/558 (69%)	48/558 (8%)
2F (4)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	93/108 (86%)	0/108 (0%)
2R (5)	Bacteriophage RTP	complete genome	582/722 (80%)	0/722 (0%)
	Bacteriophage JK06 virion	complete genome	569/725 (78%)	2/725 (0%)
	Phage TLS	complete genome	462/667 (69%)	9/667 (1%)
3 (6/7)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	88/104 (84%)	0/104 (0%)
4 (8/9)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	149/182 (81%)	0/182 (0%)
6 (12/13)	Bacteriophage JK06 virion	complete genome	245/331 (74%)	2/331 (0%)
6 (12/13)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	291/430 (67%)	10/430 (2%)
7 (14/15)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	89/104 (85%)	0/104 (0%)
8 (16/17)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	579/720 (80%)	0/720 (0%)
	Bacteriophage JK06 virion	complete genome	565/722 (78%)	2/722 (0%)
	Bacteriophage TLS	complete genome	457/662 (69%)	9/662 (1%)
	Enterobacteria phage T1	complete genome	467/709 (65%)	22/709 (3%)
10 (20/21)	Enterobacteria phage RTP	complete genome	422/606 (69%)	48/606 (7%)
10 (20/21)	Bacteriophage JK06 virion	complete genome	98/131 (74%)	8/131 (6%)
11 (22/23)	Bacteriophage RTP	complete genome	297/346 (85%)	0/346 (0%)
	Bacteriophage JK06	complete genome	272/347 (78%)	2/347 (0%)
	Phage TLS	complete genome	264/376 (70%)	11/376 (2%)
12 (24/25)	Bacteriophage RTP	complete genome	149/182 (81%)	0/182 (0%)
13 (26/27)	Bacteriophage RTP	complete genome	422/606 (69%)	48/606 (7%)
13 (26/27)	Bacteriophage JK06	complete genome	95/124 (76%)	3/124 (2%)
14 (28/29)	Bacteriophage RTP	complete genome	89/104 (85%)	0/104 (0%)

비고: 단편의 번호에 병기된 F 및 R은 각각 정방향(Forward) 및 역방 향(Reverse)를 의미함. 즉, 서열번호 2F는 M13 정방향 프라이머를 이용하여 판독된 결과를 나타내고, 서열번호 2R은 M13 역방향 프라이머를 이용하여 판독된 결과를 나타냄. 또한, 단편에 대해 두 개의 서열번호가 기재된 경우, 정방향/역방향 프라이머로 판독한 결과가 하나의 단편으로 연결되는 경우에 해당함.

표 2. blastx 를 이용한 분석 결과

단편 (서열번호)	organism	protein	identities	Positive
1 (2/3)	Bacteriophage RTP	hypothetical protein rtp26	90/171 (52%)	101/171 (59%)
1 (2/3)	Enterobacteria phage T1	hypothetical protein T1p49	46/93 (49%)	62/93 (66%)
2F (4)	Bacteriophage TLS	TtpM	116/236 (49%)	156/236 (66%)
2F (4)	Enterobacteria phage T1	putative tail tape protein	101/236 (42%)	155/236 (65%)
2R (5)	Bacteriophage TLS	YfiJ	176/241 (73%)	208/241 (86%)
4 (8/9)	Enterobacteria phage RTP	hypothetical protein rtp15	59/61 (96%)	60/61 (98%)
6F (12)	Bacteriophage JK06	putative tail tape protein	139/249 (55%)	178/249 (71%)
6F (12)	Enterobacteria phage RTP	putative tail tape protein	96/161 (59%)	123/161 (76%)
6R (13)	Bacteriophage JK06	putative minor tail protein	78/111 (70%)	90/111 (81%)
6R (13)	Enterobacteria phage RTP	putative minor tail protein	73/113 (64%)	88/113 (77%)
8 (16/17)	Enterobacteria phage RTP	hypothetical protein rtp67	215/240 (89%)	228/240 (95%)
8 (16/17)	Bacteriophage TLS	YfiJ	175/240 (72%)	207/240 (86%)
11F (22)	Enterobacteria phage RTP	hypothetical protein rtp69	80/93 (86%)	90/93 (96%)
11F (22)	Bacteriophage JK06	hypothetical protein JK_50	66/93 (70%)	78/93 (83%)
11R (23)	Enterobacteria phage RTP	hypothetical protein rtp67	111/116 (95%)	113/116 (97%)
11R (23)	Bacteriophage JK06	hypothetical protein JK_52	102/117 (87%)	110/117 (94%)

실시예 4: 박테리오파아지 YS01 의 감염범위 조사(대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum ) 및 살모넬라 종 ( Salmonella spp .) 에 대한 감염도 비교)

대장균이 아닌 다른 세균, 즉, 살모넬라 및 코리네박테리움 속 세균에 대한 박테리오파아지 YS01의 용균 활성을 조사하였다. 각 세균을 OD₆₀₀=0.8까지 배양한 뒤 이를 0.7% 한천 배지에 섞고, LB 플레이트에 부어 굳혔다. 박테리오파아지 YS01을 SM 완충액을 이용하여 10^8 pfu부터 10^3 pfu까지 10배씩 희석시키고, 각 희석액을 상기 LB 플레이트에 10ul씩 떨어뜨린 후 30℃에서 16시간 동안 배양하여 플라크의 생성 유무를 관찰하였다. 본 실험에 사용된 세균 및 그 감염 여부가 하기의 표 3에 기재된다.

표 3. 박테리오파아지 YS01의 감염범위 조사

균주명	플라크 생성 여부
E. coli (W3110)	O
E. coli (MG1655)	O
E. coli (BL21)	O
E. coli (DH5α)	O
살모넬라 갈리나룸( Salmonella gallinarum )	X
살모넬라 풀로룸( Salmonella pullorum )	X
살모넬라 티피무리움( Salmonella typhimurium )	X
살모넬라 엔테리티디스( Salmonella enteritidis )	X
살모넬라 더비( Salmonella derby )	X
코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum )	X

실시예 5: 박테리오파아지 YS01 의 일-단계 생장 곡선( One - step growth curve)(감염도 테스트)

박테리오파아지 YS01의 배양온도에 따른 감염능력을 조사하였다. 대장균 W3110을 LB 배지에서 각각 30℃ 및 37℃에서 OD=0.5까지 배양한 후 2배 농축시켰다. 상기 농축된 대장균 배양액에 분리된 박테리오파아지 YS01을 감염다중도(MOI: Multiplicity of Infection)=0.0005로 접종한 후 5분간 정치하였다. 상기 반응액을 원심분리하여 균체를 분리한 다음 이를 다시 새로운 LB 배지에 부유시켰다. 그 후, 각각 30℃ 및 37℃ 배양하며 30분까지는 5분 간격으로, 80분까지 10분 간격으로 배양액으로부터 시료를 2개씩 채취해서 하나는 클로로포름을 처리하고 다른 하나는 처리하지 않았다. 도 2는 30℃에서 배양된 박테리오파아지 YS01의 일-단계 생장 곡선을 도시한다. 상기와 같은 배양에 의해 수득된 배양액을 단계 희석해서 10ul씩 대장균 (W3110) 배양액 (OD₆₀₀=0.8)을 0.7% 한천 배지에 섞고 플레이트에 부어 굳힌 LB 플레이트에 떨어뜨린 뒤 각각 30℃ 및 37℃에서 18시간 동안 배양하여 용균 여부를 관찰하였다. 관찰 결과 박테리오파아지 YS01은 37℃보다 30℃에서 원활한 감 염을 일으키는 것으로 확인되었으며, 30℃에서의 방출수(burst size)가 1,000 이상임을 알 수 있었다. 도 3은 박테리오파아지 YS01의 배양 온도에 따른 감염 능력을 도시한다.

실시예 6: 대장균 W3110 에 대한 박테리오파아지 YS01 의 정균 능력( clearance ) 분석

박테리오파아지 YS01의 액체 배지 상에서의 대장균에 대한 정균 능력을 알아보기 위해 다양한 조건으로 정균 실험을 수행하였다. 250ml 플라스크에 35ml의 LB 액체배지를 넣은 후 W3110:YS01을 각각 1:1, 500:1, 1,000:1, 10,000:1, 100,000:1, 500,000:1, 및 10,000,000:1의 조건으로 접종하였다. 접종 후 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하며 시간별로 OD의 변화를 측정하였다. 박테리오파아지 YS01을 접종하지 않은 음성 대조군에 비해서 실험군은 W3110:YS01 = 10,000:1의 조건에서도 2시간 이후부터 우수한 정균 능력을 보였으며, 10,000,000:1의 조건에서도 정균 능력이 있음이 확인되었다. 도 4는 박테리오파아지 YSO1의 다양한 비율의 숙주 세포에 대한 정균 능력을 도시하는 정균 곡선(clearance curve)이다.

실시예 7: 라이신 발효시 대장균의 감염 예방에 대한 적용예

코리네박테리움을 이용한 라이신 발효시 박테리오파아지 YSO1의 효과를 평가하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881을 배양하여 L-라이신을 생산하였다.

먼저 종 배지 25 ml(포도당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCL 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍: pH 7.0, 공정수 1 리터 기준)를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 KFCC10881을 접종하고 30℃에서 72시간 동안 200 rpm으로 교반하면서 배양하여 종 배양액을 준비하였다. 그 후, 본 배양용 발효배지(포도당 50g, (NH₄)₂SO₄ 40g, 대두 단백질 2.5g, 콘스팁 고체 (Corn Steep Solids) 5g, 요소 3g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCL 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 3000㎍, CaCO₃ 30g: pH 7.0, 공정수 1 리터 기준)에 상기 종 배양액을 접종하고, 박테리오파아지 YS01을 일정 농도로 첨가 한 후, 박테리오파아지 YS01이 대장균을 감염시키고 발효에 미치는 효과를 살펴보았다. 접종시 대장균 W3110과 박테리오파아지 YS01을 하기의 표 4에 기재된 것과 같은 비율로 접종하였으며, 비교를 위해서 대장균 W3110 또는 박테리오파아지 YS01을 단독 접종하여 그 효과를 평가하였다. 대장균 W3110과 박테리오파아지 YS01에 대해 각각 고 역가 및 저 역가의 2가지 조건을 실험하였다. 표 4에 기재된 바와 같이, 대장균 W3110으로만 감염된 군에서는 발효 종료시 대장균이나 박테리오파아지를 전혀 접종하지 않은 정상 대조군 대비 54% 정도의 L-라이신 생산량을 보여 대장균 W3110의 L-라이신 발효에 대한 부정적인 효과를 확인하였으며, 박테리오파아지 YS01를 단독으로 접종한 군에서는 정상 대조군 대비 L-라이신 생산량의 변화가 없어 박테리오파아지 YS01은 단독으로 라이신 발효에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 대장균 W3110과 박테리오파아지 YS01을 함께 접종한 복합 투여군에서는 대장균 W3110:박테리오파아지 YS01의 비율이 10,000:1인 실험군에서도 정상 대조군과 거의 동일한 양의 L-라이신 생산량을 보였다. 도 5는 대장균 W3110, 박테리오파아지 YS01 및 이들의 조합에 의한 L-라이신 발효에 대한 영향을 도시한다.

표 4. YS01의 L-라이신 발효에의 영향 평가

라이신 생산 균주	조건	W3110 ( cfu )	YS01 ( cfu )	L-라이신 (g)
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881	음성 대조구(N.C.)	x	x	18.78
	YS01 (고 역가)	x	1.0 * 10^8	18.86
	YS01 (저 역가)	x	6.7 * 10^5	18.67
	W3110 (고 역가) : YS01 = 150 : 1	1.0 * 10^8	6.7 * 10^5	18.34
	W3110 (고 역가) : YS01 = 10,000 : 1	1.0 * 10^8	1.0 * 10^4	18.82
	W3110 (저 역가) : YS01 = 150 : 1	1.0 * 10^7	6.7 * 10^4	18.36
	W3110 (저 역가) : YS01 = 10,000 : 1	1.0 * 10^7	1.0 * 10^3	18.35
	양성 대조군(고 역가)	1.0 * 10^8	x	10.22
	양성 대조군(저 역가)	1.0 * 10^7	x	12.30

도 1은 본 발명에서 분리된 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지 YS01의 전자투과현미경 사진이다.

도 2는 30℃에서 배양된 박테리오파아지 YS01의 일-단계 생장 곡선을 도시한다.

도 3은 박테리오파아지 YS01의 온도에 따른 감염능력을 도시한다.

도 4는 박테리오파아지 YSO1의 정균 곡선(clearance curve)을 도시한다. N.C.는 음성 대조군을 나타낸다.

도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서 대장균 W3110, 박테리오파아지 YS01 및 이들의 조합에 의한 L-라이신 발효에 대한 영향을 도시한다.

<110> CJ Corporation <120> Escherichia coil specific bactriophage and method of preventing or controlling E. coli contamination using the same <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Bacteriophage YS01 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(236) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(236) <223> tail protein <400> 1 Lys Val Asn Asp Ile Gly Thr Ser Leu Ala Gly Gly Ile Pro Ile Trp 1 5 10 15 Leu Ile Ala Ile Gln Gln Gly Gly Gln Ile Lys Asp Ser Phe Gly Gly 20 25 30 Ile Ala Asn Thr Ala Arg Phe Ala Leu Ala Ala Ile Asn Pro Leu Thr 35 40 45 Ala Val Val Gly Thr Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ala Leu Gly Val Ala 50 55 60 Ala Tyr Gln Ala Asp Lys Asn Thr Arg Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr 65 70 75 80 Leu Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Ser Thr Ala Gln Ile Asn Gln Val 85 90 95 Val Asp Gly Ile Glu Arg Ser Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ile Gln 100 105 110 Glu Ile Ala Asn Ser Leu Val Ala Asn Gly Asn Leu Thr Leu Thr Gln 115 120 125 Ile Asp Lys Ile Thr Lys Ala Thr Ala Gln Trp Ala Thr Val Thr Ser 130 135 140 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Claims

대장균(Escherichia coli) 특이적 감염 및 사멸능을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 꼬리 단백질(tail protein) 및 서열번호 2 내지 서열번호 37로 구성된 염기서열로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae family), T1-유사 파아지(T1-like phage genus) 속에 속하는 박테리오파아지.
제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 기탁번호 KCCM10947인 박테리오파아지 YSO1것인 박테리오파아지.
i) 대장균이 아닌 미생물을 종모 배양하는 단계, 및

ii) 상기 종모 배양된 미생물을 대장균 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 박테리오파아지와 함께 본 배양용 배지에 접종하는 단계를 포함하는, 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 꼬리 단백질(tail protein) 및 서열번호 2 내지 서열번호 37로 구성된 염기서열로 표시되는 핵산 분자를 포함하는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae family), T1-유사 파아지(T1-like phage genus) 속에 속하는 박테 리오파아지인 것인 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 기탁번호 KCCM10947인 박테리오파아지 YSO1것인 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대장균이 아닌 미생물은 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움인 것인 미생물의 배양에 의한 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 상기 박테리오파아지를 본 배양용 배지 1L 당 10⁴pfu 내지 10⁶ pfu농도로 접종하는 것인 L-아미노산 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 상기 박테리오파아지를 접종하는 본 배양용 배지의 온도는 30℃ 내지 33℃인 것인 L-아미노산 발효에서 대장균의 오염을 예방 또는 통제하는 방법.