KR20090123195A - 시력 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼추출물(바람직하게는 인삼 추출 발효물) 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 시력 개선용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 빌베리 추출물, 비타민 A 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함한다. 본 발명의 조성물은 시력 감퇴에 중요한 역할을 하는 세포 조직내의 산화적 스트레스를 효과적으로 방어하여, 시력 개선에 매우 우수한 효능을 발휘한다. 특히, 백내장의 치료 또는 예방에 매우 우수한 효능을 발휘하며, 자연물-유래 물질을 유효성분으로 이용하기 때문에 인체에 안전하다.

시력, 백내장, 인삼 추출물, 발효, 빌베리, 비타민 A, 컴파운드 K

Description

시력 개선용 조성물{Compositions for Improving Eyesight}

본 발명은 시력의 개선 또는 백내장 치료를 위한 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 개선 또는 백내장 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

컴퓨터, TV 및 휴대폰 등 전자기기의 사용빈도가 증가함에 따라 유아, 청소년 및 중년층의 시력저하는 물론 노년층의 성인병으로 인한 시력저하로 인하여 안경을 쓰는 인구가 날로 증가하고 있다. 시력저하를 예방하기 위한 비타민이나 약물들이 개발되어 유통되고 있으나 의약품으로 분류되어 의사나 약사의 처방 없이 손쉽게 구입하기 어려운 단점이 있다.

한편, 시력 보호 및 강화를 위하여 다양한 연구들이 있었다. 예를 들어, 대한민국 특허 제539633호는 1일 용량 기준으로약 420 ㎎ 내지 약 600 ㎎의 비타민 C; 약 400 IU 내지 약 540 IU의 비타민 E;약 17.2 ㎎ 내지 약 28 ㎎의 베타-카로틴 형태의 비타민 A;약 60 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 아연; 및 약 1.6 MG 내지 약 2.4 ㎎의 구리를 함유하는 망막 건강 강화용 조성물을 개시하고 있다. 대한민국 특허 제622045호는 시력보호 효능이 있는 디글리세라이드 유지 조성물의 제조방법을 개시하고 있으며, 구체적으로, A) 모노글리세라이드, 지방산, DHA(DOCOSAHEXAENOIC ACID)를 혼합하여 교반하고, 온도 200 내지 250℃, 0.001 TORR 내지 0.5 TORR 감압하에서 1 내지 4시간 동안 반응시키는 단계; 및 B) 상기 A)단계의 교반된 반응 혼합물을 0.001 TORR 내지 0.5 TORR 감압하, 200 내지 250℃에서 분자 증류시키는 단계;를 포함하는 DHA를 포함하는 디글리세라이드 유지 조성물의 제조방법을 개시하고 있다.

대한민국 특허출원공개 제2002-0087834호는 시각 기능의 퇴보 과정을 저지하고 이를 되돌릴 수 있는 신경보호 및 망막보호 안과 약물로서, 활성 성분이 고도의 안정성을 가진 효소 변환 안지오텐신 1 내지 안지오텐신 2에 대한 저해체로 구성되는 것을 특징으로 하는 약물을 개시하고 있다.

대한민국 특허출원 제2005-0008702호는 안토시아닌이 다량으로 함유되어 있는 빌베리 추출물을 주성분으로 하는 시력보호용 조성물 및 그 제조방법을 개시하고 있다.

인삼 사포닌은 담마란(dammarane) 타입의 트리테르펜(triterpene)인 비당부의 R1, R2 및 R3 위치의 알코올성 OH기에 글루코스(glucose), 람노스(rhamnose), 자일로스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)와 같은 당류가 에테르결합된 구조를 가지며, 현재까지 인삼에서 총 29종이 밝혀졌다. 상기 인삼 사포닌의 각 성분은 1964년 Shibata가 인삼에 함유된 배당체란 뜻으로 진세노사이드(ginsenoside)라 명 명하였으며, 박층크로마토그래피(TLC)에서 분리된 이동거리 순으로 올레아닌(oleanine)계 사포닌인 진세노사이드-Ro와 진세노사이드-Ra, -Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1, -Rg2, -Rg3 및 -Rh등으로 명명하였다.

이러한 인삼 사포닌은 750여종의 식물에 함유된 다른 식물의 사포닌과는 화학구조가 상이할 뿐 아니라 약리효능도 다른 것으로 밝혀졌다. 특히, 인삼사포닌은 약성이 매우 온화하고 과량투여에 의한 독성이 없을 뿐만이 아니라 용혈작용도 거의 없다는 것이 밝혀졌다.

한편, 최근에는 사포닌의 대사물에 관한 연구가 진행되면서, 인삼 사포닌의 효능이 사포닌 자체보다는 사포닌이 장내세균에 의해 분해된 장내세균 대사물이 활 성본체임이 시사되어지고 있으며, 이에 인삼의 사포닌 성분 중 어글리콘에 당(글루코스)이 하나 붙은 구조로 이루어진 진세노사이드 Rh1, Rh2 및 F1과 컴파운드 K 등이 암세포증식 억제작용, 종양증식 억제작용, 항암제의 항암활성 증대작용 등의 약리작용이 있는 것으로 알려지고 있다. 인삼 사포닌으로부터 당의 일부를 제거하는 것에 의해 얻은 컴파운드 K에 관한 연구가 활발히 진행되고는 있으나, 아직까지 이를 시력 개선 또는 백내장의 예방 및 치료에 이용하는 기술에 관하여는 연구된 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다.

본 발명자들은 시력 개선, 특히 수정체의 질환 또는 이상(disorders)을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였고, 이러한 물질을 가능한 천연물에서 얻으려 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인삼 추출물 또는 컴파운드 K가 인간수정체 상피 세포주에서 산화 스트레스를 효과적으로 방어하고, 산화 스트레스와 관련된 TG2(transglutaminase 2)의 활성을 감소시켜 결국 백내장을 효과적으로 억제함으로써 시력을 개선한다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 시력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 백내장 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인삼 추출물 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 시력 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인삼 추출물 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 시력 개선, 특히 수정체의 질환 또는 이상(disorders)을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였고, 이러한 물질을 가능한 천연물에서 얻으려 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인삼 추출물 또는 컴파운드 K가 인간수정체 상피 세포주에서 산화 스트레스를 효과적으로 방어하고, 산화 스트레스와 관련된 TG2(transglutaminase 2)의 활성을 감소시켜 결국 백내장을 효과적으로 억제함으로써 시력을 개선한다는 것을 발견하였다.

본 발명의 조성물은 인삼 추출물 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서 이용되는 인삼은 특별하게 제한되지 않으며, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 인삼은 고려삼(Panax ginseng) 또는 전칠삼(P. notoginseng)이다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 인삼은 다양한 형태로 가공된 모든 인삼, 예컨대, 수삼, 미삼, 백삼 및 홍삼을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 빌베리 추출물, 비타민 A 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하며, 보다 바람직하게는 빌베리 추출물 및 비타민 A를 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서 이용되는 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에 탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있으며, 보다 바람직하게는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 가장 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올을 이용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인삼 추출물은 발효 처리된 것이다.

인삼 추출물의 발효 처리는 당업계에 공지된 다양한 발효 방법에 따라 실시할 수 있다.

발효 처리는 (i) 발효 미생물을 추출물에 직접 접종하여 실시하거나, (ⅱ) 발효 미생물을 배양한 배지(예컨대, 조효소액)를 이용하여 실시하거나 또는 (ⅲ) 또는 목적하는 다당체의 구조 변화를 야기할 수 있는 효소를 직접 이용하여 실시할 수 있다.

또한, 추출하기 이전에 인삼을 우선적으로 발효하고 이어 추출함으로써 인삼 추출 발효물을 얻을 수 있다.

발효에 이용되는 미생물은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 미생물 및 유산균(lactic acid bacteria)을 포함한다.

아스퍼질러스(Aspergillus) 속 미생물이 이용되는 경우에는, 바람직하게는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 피큠(Aspergillus ficuum), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae)로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물이 이용되며, 보다 바람직하게는, 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 오라이재 및 아스퍼질러스 소재이고, 가장 바람직하게는 아스퍼질러스 소재이가 이용된다.

본 발명에 적합한 유산균은 당업계에 공지된 다양한 유산균을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “유산균”은 탄수화물 대사의 주산물로서 유산을 생산하는 박테리아 군을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 유산균은, 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 프로리오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 페디오코커스(Pediococcus)으로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균이다. 보다 바람직하게 는, 본 발명에서 이용되는 유산균은 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostoc mensenteroides), 스트렙토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 엔테로코커스 파에시엄(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리엄 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리엄 브라베(Bifidobacterium brave) 및 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 유산균이다.

보다 더 바람직하게는 본 발명에 적합한 유산균은 김치로부터 분리한 김치 유산균이며, 보다 더욱 더 바람직하게는, 베타-글루코시다아제 활성을 지닌 김치 유산균이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 발효 처리된 인삼 추출물은 컴파운드 K, 컴파운드 Y, 진세노사이드 Rh2 또는 그의 혼합물을 포함한다. 발효 전의 인삼 추출물에는 컴파운드 K, 컴파운드 Y 및/또는 진세노사이드 Rh2이 포함되어 있지 않지만, 발효 후에는 생물전환에 의하여 상기 성분이 인삼 추출물 발효물에 포함된 다. 또한, 상기 성분은 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물의 활성에 중요한 역할을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 발효 처리된 인삼 추출물은 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 F2 및 프로토파낙사다이올로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종, 보다 바람직하게는 최소 2종의 성분, 가장 바람직하게는 3종의 성분이 발효 전의 인삼 추물물과 비교하여 인리치먼트된 것이다. 발효 전 및 후의 인삼 추출물을 비교하면 상기 성분이 인리치먼트 되어 있으며, 이 인리치먼트된 성분은 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물의 활성에 중요한 역할을 한다.

진세노사이드 Rd와 연관하여 사용하여 용어 “인리치먼트”는 발효 전과 비교하여 발효 후의 진세노사이드 Rd의 함량이 1.5-20배, 바람직하게는 2-15배, 보다 바람직하게는 2-10배, 가장 바람직하게는 2.5-5배 증가된 것을 의미한다. 진세노사이드 F2와 연관하여 사용하여 용어 “인리치먼트”는 발효 전과 비교하여 발효 후의 진세노사이드 F2의 함량이 1.5-20배, 바람직하게는 2-15배, 보다 바람직하게는 2-10배, 가장 바람직하게는 2.5-5배 증가된 것을 의미한다. 프로토파낙사다이올과 연관하여 사용하여 용어 “인리치먼트”는 발효 전과 비교하여 발효 후의 프로토파낙사다이올의 함량이 1.5-20배, 바람직하게는 2-15배, 보다 바람직하게는 2-10배, 가장 바람직하게는 2.5-5배 증가된 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에서, 인삼 추출물(바람직하게는, 인산 추출 발효물)의 함량은 특별하게 제한되지 않으며, 조성물 전체 중량에 대하여 인삼 추출물 1-99 중 량%, 바람직하게는 3-80 중량%, 보다 바람직하게는 5-50 중량%, 가장 바람직하게는 10-30 중량%를 포함한다. 빌베리 추출물의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 1-99 중량%, 바람직하게는 3-80 중량%, 보다 바람직하게는 5-50 중량%, 가장 바람직하게는 10-30 중량%를 포함한다. 비타민 A의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001-1 중량%, 바람직하게는 0.001-0.5 중량%, 보다 바람직하게는 0.005-0.2 중량%, 가장 바람직하게는 0.005-0.1 중량%를 포함한다.

본 발명의 조성물을 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 인삼 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 인삼 추출물(바람직하게는, 인삼 추출 발효물) 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 인간수정체 상피 세포주에서 산화 스트레스를 효과적으로 방어하고, 산화 스트레스와 관련된 TG2(transglutaminase 2)의 활성을 감소시킴으로써, 시력 개선에 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 백내장의 치료 또는 예방에 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(ⅳ) 본 발명의 조성물은 자연물-유래 물질을 유효성분으로 이용하기 때문에 인체에 대한 안전성이 매우 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명 이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 빌베리 추출물의 제조

구입한 빌베리를 상온에서 분쇄기로 잘게 부수어 건조시킨 후, 이 분말을 50℃ 감압 하에서 주정으로 5시간 1회 환류냉각 추출하였다. 추출물을 여과한 후, 45℃ 수욕 상에서 감압 농축하여 농축물을 얻었다. 이어, 분획 여두에 농축물을 옮기고, 농축물의 15배수의 증류수 및 5배수의 에틸아세테이트를 첨가하여 잘 흔들어 준 후, 상층액을 얻었다. 상층액을 분무 건조 하여 빌베리 추출분말을 수득하였다.

실시예 2: 인삼 추출 발효물의 제조

<1> 인삼 추출물의 제조

구입한 인삼 1 kg에 10배수의 주정(70% 에탄올)을 가한 후, 5시간씩 2회 60℃로 환류 냉각 추출하였다. 이어, 인삼의 잔사와 주정 추출물을 분리하고, 남은 인삼의 잔사에 10배수의 정제수를 가한 후, 5시간씩 2회, 80-90℃로 환류냉각 추출하였다. 주정추출물과 정제수추출물을 감압 동결건조하여 인삼추출물을 얻었다.

<2> 발효용 조효소액 준비 및 균주의 제조

<2-1> 발효용 조효소액 준비

아스퍼질러스 속 미생물인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger KCCM 60317, A. niger KCCM 35404, A. niger KCCM 60357, A. niger KCCM 60332), 아스퍼질러스 오라이재(A. oryzae KCCM 12089), 아스퍼질러스 소재(A. sojae KCCM 60354), 아스퍼질러스 아와모리(A. awamori KCCM 60246) 및 아스퍼질러스 피큠(A. ficuum KCCM 60350) 등을 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 상기 미생물들을 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지(Conda, Spain), 25℃에서 7일간 배양한 후 본 배양에 사용하였다. 밀기울에 초기 수분을 60-70%로 조절하고 인삼추출물을 중량대비 1% 첨가하고 121℃에서 1시간동안 멸균하여 준비한 인삼추출물이 포함된 배지에 PDA에서 배양한 균주를 접종한 후, 25℃ 에서 다시 7일간 배양하였다. 배양한 배지를 여과하여 상기 아스퍼질러스 속 미생물을 제거하고 조효소액(crude enzyme solution)을 수득하였다. 본 실시예에서 가장 좋은 활성을 보이는 미생물인 아스퍼질러스 소재를 이용하여 조효소액을 수득하였다.

<2-2> 발효용 균주 준비

각종 김치류에서 베타-글루코시다아제 활성을 지닌 유산균 균주를 분리한 후, MRS 배지(deMan Rogosa Sharpe, Difco^TM, Becton Dickinson and Company, USA), 37℃에서 계대배양 후 보관하였다. 본 배양은 MRS 액상 배지에 앞서 분리한 균주의 단일 콜로니를 접종한 후, 37℃에서 4일간 50 rpm으로 진탕배양하여, 발효시 접종 균주로 사용하였다.

<3> 인삼추출물의 발효

<3-1> 조효소액의 사용

상기 <1>에서 제조된 인삼추출물에 15 내지 20배수의 정제수를 넣고 pH를 5.0 내지 5.5로 조절한 후, <2-1>에서 준비한 조효소액을 넣고 35℃-55℃에서 바람직하게는 46℃에서 96시간동안 발효시킨 후, 동결건조하여 인삼 추출물 발효물 분말을 얻었다.

<3-2> 발효용 유산균 균주 사용

상기 <1>에서 제조된 인삼추출물에 15 내지 20배수의 정제수를 넣고 pH를 5.0 내지 5.5로 조절한 후, <2-2>에서 준비된 유산균을 중량대비 1% 접종하여 37℃에서 96시간동안 발효시킨 후, 동결건조하여 인삼 추출물 발효물 분말을 얻었다.

<3-3> 인삼추출물과 인삼추출물 발효물의 인삼사포닌(진세노사이드) 성분의 분석

상기 인삼추출물과 발효물의 인삼사포닌 성분의 발효 전후 변화 양상을 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters, Inc. USA)를 이용하여 확인하였다.

검출기로는 증발광산란검출기(ELSD)와 자외선(UV) 검출기(203 nm)를 이용하고, 이동상으로 HPLC용 용매인 물과 아세토나이트릴에 0.05% 트라이플루오릭 초산(trifluoric acetic acid)을 넣어 분석에 사용하였다. 4.6 X 250 mm 크기의 C₁₈ 역상 컬럼을 이용하여 물과 아세토나이트릴의 농도구배를 통해 각 물질들을 분리, 검출하였다. 인삼사포닌의 표준물질은 자체 분리한 것을 이용하였다. 그 결과는 아래 표 1과 같다.

발효전후의 주요 인삼 사포닌의 변화

인삼사포닌	발효 전(mg/g)	발효 후(mg/g)
		유산균 사용	조효소액 사용
진세노사이드 Rb1	12.75	4.10	0.40
진세노사이드 Rc	10.74	3.34	0.18
진세노사이드 Rb2	8.57	2.22	0.09
진세노사이드 Rd	6.05	13.46	18.25
진세노사이드 F2	3.19	5.66	11.35
컴파운드 Y	0	1.09	2.30
컴파운드 K	0	0.05	4.09
진세노사이드 Rh2	0	1.08	2.25
프로토파낙사다이올(PPD)	0.87	1.57	3.26

상기 결과를 통하여 배당체 형태의 인삼사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc 및 Rb2가 비배당체 혹은 결합된 당이 줄어든 형태의 인삼사포닌인 진세노사이드 Rd와 F2 및 컴파운드 Y와 K, 프로토파낙사다이올로 변환됨을 확인할 수 있다.

실시예 3: 조성물의 제조

상기 실시예 1과 실시예 2에서 얻은 빌베리 추출물 17%(w/v), 인삼 추출물 조효소액 발효물 17%(w/v), 비타민 A 0.01%(w/v) 및 잔량의 정제수를 포함하는 본 발명의 시력 개선용 조성물을 제조하였다.

실시예 4: 컴파운드 K( Compound K)의 생산

인삼 가루 및 농축액(진세노사이드 Rb1, Rc 및 Rb2가 농축된 샘플)을 정제수에 10배 이상 희석하였다. 희석된 샘플에 펙티나아제(pectinase) 계열의 효소(Novozyme, 스위스)를 반응 부피의 0.5% 양으로 넣고 효소반응을 시켰다. 효소반응 조건은 50℃에서 5-7일간 150 rpm으로 진탕배양 하는 것이다. 배양 종료 후, 샘플 부피의 1/5배 노말부탄올로 재추출한다. 노말부탄올 분획물을 클로로포름, 메탄올 및 정제수로 컬럼크로마토그래피를 시행하였다. 용매조건은 클로로포름, 메탄올 및 정제수를 3:1:0.1(v/v/v)의 비율로 먼저 시행한 후 순차적으로 2:1:0.1(v/v/v) 및 1:1:0.1(v/v/v)의 비율로 시행하였다. 최종적으로 메탄올만으로 시행하였다. 상기와 같이 분획된 세 번째 분획물(클로로포름/메탄올/정제수, 1:1:0.1(v/v/v))을 이용하여 다시 메탄올과 정제수로 컬럼크로마토그래피를 시행하였다. 용매 조건은 메탄올 및 정제수를 10:1(v/v)의 비율로 먼저 시행한 후 순차적으로 5:1(v/v), 3:1(v/v), 2:1(v/v) 및 1:1(v/v)의 비율로 시행하였다. 상기와 같이 분획된 다섯 번째 분획물(메탄올/정제수, 1:1(v/v))을 컴파운드 K(순도 98% 이상)로 지칭하였다. 컴파운드 K 의 화학구조는 자기공명장치(NMR, Varian사 Inova-300, USA) 와 질량 분석기 (Mass Spectrophotometer, Waters사 ZQ2000, USA)를 이용하여 분석 및 확인하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 생물전환(발효) 전후에 따라 컴파운드 K의 생성을 HPLC로 확인할 수 있었다.

실시예 5: 실시예 2의 각 성분의 효능 평가

인 비트로 실험

<1-1> 세포 배양

본 발명에서 사용한 조성물의 유효성분이 시력 개선효과를 갖는지 알아보기 위하여 인간수정체 상피 세포주(Human lens epithelial cell)에서 조성물의 항산화효과를 조사하였다. 이는 대표적인 시력저하 현상인 백내장의 주요 원인 중 하나가 수정체 세포의 산화 스트레스에 의한 피해이기 때문이다. 상기 세포주는 서울대학교 의과대학 생화학교실 김인규 교수로부터 제공 받았으며, 세포주를 75 cm² 배양 플라스크에 20% FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA)를 포함한 MEM 배지(Gibco, USA)를 사용하여 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 70-80%정도 자랄 때까지 배지를 매일 바꾸어 주었으며, 효능 실험 시 세포를 분주할 때는 0.05% 트립신 EDTA로 배양 플라스크에서 떼어낸 세포를 24 웰-플레이트에 세포수 5 x 10⁴ 으로 분주한 후, 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 다시 26시간 배양하였다. 각 실험군은 각 6개의 웰로 하였다.

<1-2> 효능 평가 - 세포 독성(MTT 분석)

본 실험의 목적은 인간수정체상피 세포주에 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 발생하였을 때, 실시예 2의 성분이 산화 스트레스로 유발된 세포 독성에 방어 효과가 있음을 MTT 실험 방법으로 증명하기위한 것이다.

다음의 방법을 이용하여 시험하였다. 배양 배지의 FBS농도를 20%에서 1%로 바꾸어 주면서, 실시예 2의 <1> 인삼추출물 100 ㎍/ml, <3-1> 인삼추출물 유산균발효물 100 ㎍/ml 및 <3-2> 인삼추출물 조효소액발효물 100 ㎍/ml을 처리하고 4시간 동안 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 그 후, 100 μM 농도의 과산화수소를 처리하고 배양기에서 24시간동안 배양하였다. 정상군은 과산화소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다. MTT 용액(3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, USA)을 각 플레이트 웰에 담겨있는 배지 양의 1/10 정도인 50 ㎕ 넣고 3시간 동안 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양 한 후, 배지를 새 튜브에 옮겼다. 이 때, 노란색의 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)이 세포내의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan) 결정물로 바뀌어 플레이트 웰 바닥에 침착되었다.

이렇게 형성된 결정물을 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Sigam, USA)로 녹인 후, 30분간 실온에서 흔들어 혼합시키고 ELISA 리더(Beckmann, USA)로 파장 595 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이러한 과정들을 2회 반복하고, 세포의 생존율은 ‘세포의 생존율(%) = 각 웰의 흡광도/대조군 웰의 흡광도 X 100’으로 나타내고, 통계 처리(one-way ANOVA, PRISM) 후 데이터를 관찰하였다.

도 2에 있어서, 그래프의 X축은 실험군을 나타내고, Y축은 세포 생존율을 정상군에 대한 상대적 비교치로 나타낸 것이다. 그래프를 보면 정상군과 비교하여 대조군에서 과산화수소에 의한 세포 생존율의 저하를 볼 수 있고, 인삼추출물(인삼), 인삼추출물 유산균발효물(발효(유)) 및 인삼추출물 조효소액 발효물(발효(효)) 실험군에서 세포 생존율의 증가를 볼 수 있었다. 이상 도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 실시예 2의 조성물들은 과산화수소가 유발한 산화 스트레스 방어 효과를 통하여 세포 생존율 향상에 효능이 있음을 보여주었다.

실시예 6: 실시예 3의 조성물의 효능 평가

<1> 인 비트로 실험

<1-1> 세포 배양

실험 방법은 상기한 실시예 5의 <1-1>과 같다.

<1-2> 효능 평가 - 세포 독성(MTT 분석)

실험 방법은 상기한 실시예 5의 <1-2>와 같다. 실험군은 상기 실시예 3의 조성물을 10 ㎍/ml(실험군 1), 20 ㎍/ml(실험군 2), 50 ㎍/ml(실험군 3) 및 100 ㎍/ml(실험군 4)의 농도로 처리하였다. 정상군은 과산화소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다. 도 3에서 정상군과 비교하여 대조군에서 과산화수소에 의한 세포 생존율의 저하를 볼 수 있고, 4가지 농도의 모든 조성물 처리군에서 대조군의 결과와 비교하여 세포 생존율의 증가를 볼 수 있었다. 이 결과는 본 발명의 실시예 3의 조성물은 과산화수소가 유발한 산화 스트레스의 방어 효과를 통하여 세포 생존율 향상에 효능이 있음을 보여주었다.

<1-3> 효능 평가 - 항산화 효능(TG2 레벨)

백내장의 주요한 원인으로 알려져 있고 분자 수준의 기전에서 중요한 역할을 하는 TG2(transglutaminase 2, 도 4)의 활성 측정을 통하여 상기 실시예 3의 조성물의 항산화 효능 정도를 검사하였다.

세포 배양 실험 방법은 상기한 실시예 5의 <1-1>과 같다. 배양 배지의 FBS농도를 20%에서 1%로 바꾸어 주면서, 실시예 3의 조성물을 실험군에 따라 각각 10 ㎍/ml(실험군 10), 20 ㎍/ml(실험군 20), 50 ㎍/ml(실험군 50) 및 100 ㎍/ml(실험군 100)의 농도로 처리하고 4시간 동안 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 그 후, 100 μM 농도의 과산화수소를 처리한 후, 배양기에서 24시간동안 배양한 후, 세포 배양액을 제거하고 세포를 수거하여 총 단백질을 추출하였다. 정상군은 과산화수소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다.

추출한 세포단백질은 브래드포드법으로 정량을 하였다. 브래드포드 시약(Bradford reagent, Biorad, USA)을 1:5의 비율로 증류수에 희석하고, BSA(Bolvin Serum Albumin) 스탠다드를 준비하였다(0 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg, 8 mg 및 10 mg, Sigam, USA). 각 스탠다드 및 추출한 세포단백질 1 μl씩을 1 ml 브래드포드 시약 희석액에 넣어주고 볼텍스 반응 후, 5분간 상온에 방치한 후 ELISA 리더를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5-(바이오틴아미도) 펜틸아민(5-(biotinamido) pentylamine, Pierce)을 추출한 단백질에 결합시켰다. 세포 추출단백질과 5-(바오틴아미도) 펜틸아민은 결합하여 α-크리스탈린(α-crystallin)과 반응을 일으켜 응집되었다. 응집된 α-크리스탈린은 특이적인 단클론항체를 이용하여 검출하였다. 이러한 과정들을 2회 반복하고, TG2 활성은‘TG2 활성(상대값) = 각 실험군의 α-크리스탈린 응집량 / 대조군의 α-크리스탈린 응집량’으로 나타내고, 통계 처리(one-way ANOVA, PRISM) 후 데이터를 관찰하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 본 실험의 결과 과산화수소를 첨가하여 산화스트레스를 부여한 대조군에 비해 같은 조건에서 본 발명의 실시예 3의 조성물을 투여처리했을 때의 실험군들은 TG2 활성의 감소가 보였다. 하지만 농도 의존적인 결과를 보이지는 않았다.

<1-4> 효능 평가 - 항산화 효능(GSH 레벨)

본 실험은 인간수정체 상피 세포주에 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 발생하였을 때, 실시예 3의 조성물의 항산화 효과의 입증을 위한 것이다. GSH는 식물과 동물에서 광범위하게 분포되어 있는 트리펩타이드이다(3개의 아미노산의 결합체, γ-glutamylcysteinylglycine). GSH는 생체이물(xenobiotics)의 해독작용을 담당하는 글루타치온 트랜스퍼라아제(glutahione transferase)에 기질을 제공하고, 과산화수소의 감소에 역할을 하는 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase)에 대한 전자 공여체이다. 즉, GSH는 체내 항산화반응에서 필수적인 역할을 하는 성분으로서 이 성분의 체내 함유의 정도로 체내 산화정도를 간접적으로 평가할 수 있다. 본 실험은 다음의 방법을 이용하여 실험하였다.

상기한 실시예 5의 <1-1> 세포 배양 실험에서 배양 배지의 FBS농도를 20%에서 1%로 바꾸어 주면서, 실시예 3의 조성물을 실험군에 따라 각각 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하고 4시간 동안 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 정상군은 과산화수소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다. 그 후, 100 μM 농도의 과산화수소를 처리한 후, 배양기에서 24시간동안 배양한 후, 500 x g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후, 초음파분쇄기(Bandelin, Germany)를 이용하여 세포를 파괴시킨 다음 10,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 분리된 상층액과 동량의 10% 메타인산(metaphosphoric acid, Sigam, USA)을 혼합하여 다시 10,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 상층액을 분리하였다. 상층액은 인산 수용액(Sigma, USA) 으로 10배로 희석하여 측정 샘플을 각각 제작하였다. 각각의 측정 샘플 200 μl에 200 μl의 DTNB 시약(5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), Sigma, USA)와 200 μl 의 GSSG 환원제(glutathione disulfide)를 첨가한 후, 25℃, 5분간 배양하였다. 이 후, NADPH 시약(Sigma, USA)을 첨가하여 반응을 개시 시키고, 3분 동안 ELISA 리더로 파장 412 nm에서 관찰하고 결과를 도출하였다. 실험 샘플은 과산화수소 반응 후 12시간과 24시간 후의 세포를 수확하여 실험을 진행하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, 세포에 산화 스트레스가 부여된 대조군은 정상군에 비해서 GSH(환원-글루타치온)의 레벨이 감소되었다. 실험군 결과에서는 산화 스트레스에 대한 방어효과를 보이면서 GSH 농도의 증가를 보였다. 특히, 실시예 3의 조성물 100 ㎍/ml의 농도로 처리한 실험군의 결과는 정상군과 유사한 결과를 보였다. 그러나, 모든 실험군에서 시간별 차이(12시간 ,24시간)는 적은 부분 보였지만 유사한 경향을 보였다. 본 실험 결과는 본 발명의 실시예 3의 조성물의 항산화효과를 세포내의 환원물인 GSH 레벨 정도로 증명한 것이다.

<1-5> 효능 평가 - 항산화 효능(지방과산화 - MDA 함량)

세포에서 산화 스트레스가 발생하였을 때, 지질 성분과 활성 산소가 결합하여 지질의 페록시데이션(lipid peroxidation) 형태인 말론디알데히드(MDA: Malondialdehyde)를 생성한다. 이 말론디알데히드는 생체 내에서 반응성이 매우 높기 때문에 이 물질을 제거하는 것(항산화 과정)이 세포의 정상적인 생리적 활동을 위해 반드시 필요하다. 말론디알데히드는 TBA(Thiobarbituric acid)와 반응하여 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substance)를 생성한다. 생성된 물질은 파장 532 nm에서 흡광도를 나타내는 붉은색을 띠는 복합체이다. 실시예 3의 조성물의 지질 성분에 대한 항산화 효능을 검증하기 위하여 다음의 방법을 이용하여 실험하였다.

상기한 실시예 5의 <1-1> 세포 배양 실험에서 배양 배지의 FBS농도를 20%에서 1%로 바꾸어 주면서, 실시예 3의 조성물을 실험군에 따라 각각 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하고 4시간 동안 37℃로 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 100 μM 농도의 과산화수소를 처리한 후, 배양기에서 24시간동안 배양하였다. 정상군은 과산화소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다. 그 후, 1% 인산 수용액(Sigma, USA) 3 ml 및 0.6% TBA(Sigam, USA) 1 ml의 혼합물 1 ml를 세포 배양 배지에 첨가하여 60분 동안 항온수조에서 끓이고, 얼음 위에서 식힌 후, n-부탄올(덕산, 한국)을 첨가하여 볼텍스 믹스로 1분 동안 섞어 주었다. 그 후, 20분 동안 20,000 rpm으로 원심분리 후, 분리된 유기 용매 층은 새로운 튜브에 옮겨, ELISA 리더로 파장 532 nm에서 흡광도를 읽었다. 말론디알데히드 스탠다드 커브는 농도 0-200 μM에 범위에서 확립하였다. 실험 샘플은 과산화수소 반응 후 12시간과 24시간 후의 세포 배양배지로 실험을 진행하였다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, 세포에 산화 스트레스가 부여된 대조군은 정상군에 비해서 말론디알데히드의 레벨이 급격히 증가되었다. 실험군 결과에서는 말론디알데히드 레벨의 증가가 억제됨을 보였다. 특히, 실시예 3의 조성물 100 ㎍/ml 농도의 실험 결과는 정상군과 유사한 레벨의 말론디알데히드의 감소를 보였다. 모든 실험군에서 시간별(12시간 ,24시간)로 다른 실험 결과가 나타났는데, 시간의 흐름에 따라 세포의 산화 스트레스 정도가 심해짐을 볼 수 있었다. 정상군과 대조군을 포함하는 각 실험군에서 유사한 경향으로 시간에 흐름에 따라 5-8%의 말론디알데히드 레벨의 증가를 보였다. 한편 실시예 3의 조성물 40 ㎍/ml 농도의 실험군에서는 24시간 배양에서 12시간 배양 때 보다 현격한 산화 스트레스의 변화를 보였다. 본 실험 결과는 본 발명의 실시예 3의 조성물의 항산화효과를 세포내의 지질 산화물인 말론디알데히드 레벨 정도로 증명한 것이다.

<2> 인 비보 실험

<2-1> 실험동물의 준비

본 발명의 조성물을 대상으로 시력개선효과를 알아보기 위하여 인위적으로 백내장을 유발 래트에서 백내장의 발생 및 진행이 억제되는지를 실험하였다.

임신한 10주령 암컷 래트 5마리를 중앙 동물 실험으로부터 분양 받아 1주간 본사 실험 동물실 환경에 적응시켜 실험 준비를 하였다. 동물실 사육조건으로는 온도 21± 2℃, 상대습도 55± 5%, 환기횟수 10-20회/시간, 형광등 조명 12시간/하루(오전 9시 00분 점등 시부터 오후 9시 00분 소등 시까지) 및 조도 150-300 Lux로 하였으며, 실험동물은 1군에 3마리씩 폴리카보네이트 사육상자에 넣고 사육하였다.

<2-2> 백내장의 유도

임신한 암컷 래트가 새끼를 출산하면 새끼가 14일 될 때까지 기다렸으며, 한 암컷이 10~15마리의 새끼를 출산하였다. 13일이 되었을 때, 각 암컷의 새끼를 섞이지 않게 하면서 수컷 및 암컷 각 5마리씩 한 실험군에 총 10마리씩 나누어 라벨링하였다. 출생한지 14일이 되었을 때, 오후에 세레나이트(Selenite)를 PBS에 녹여서 20 nmol/g의 농도로 피하주사를 단회 실시하였다. 세레나이트 투여 14일 후 새끼 래트 수정체에 백내장 현상이 나타났다.

<2-3> 효능 검사

(1) 실험군은 정상군, 대조군(백내장 유발), 실험군 1(실시예 3의 조성물 10 mg/kg 투여), 실험군 2(실시예 3의 조성물 20 mg/kg 투여), 실험군 3(실시예 3의 조성물 50 mg/kg 투여) 및 실험군 4(실시예 3의 조성물 100 mg/kg투여) 로 실험 설계하였다.

(2) 수정체 혼탁도 관찰: 형광등이 장착된 실체 현미경(Olympus, Japan)에서 다크 필드 사진 기술(dark field photography technique; Chand D., EL-Aguizy H., Richards R.D. and Varma S.D.(1982), Sugar cataracts in vitro : Implication of oxidative stress and aldose reductase Ⅰ. Exp. Eye Res. 35:491-497)을 사용해 CCD 카메라로 혼탁도를 관찰하여 혼탁정도에 따른 등급을 설정하였다.

본 실험의 결과 세레나이트 투여로 백내장을 유발한 랫트에서 14일간의 조성물의 농도별 투여가 도 8과 같은 결과를 보였다. 도 8에서 확인할 수 있듯이, 정상군의 경우 백내장이 전혀 유발되지 않았으며, 대조군과 실험군은 백내장이 유발되었다. 대조군에 비해 각 실험군에서 백내장의 감소 효과가 보였고, 특히 본 발명의 실시예 3의 조성물 50 mg/kg의 농도인 실험군 3에서 가장 좋은 효과를 보였다.

실시예 6: 컴파운드 K의 효능 평가

<1> 인 비트로 실험

<1-1> 세포 배양

상기한 실시예 5의 <1-1>과 같은 방법으로 실험하였다.

<1-2> 효능 평가 - 세포 독성(LDH 레벨)

본 실험의 목적은 인간수정체상피 세포주에 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 발생하였을 때, 컴파운드 K가 산화 스트레스로 유발된 세포독성 세포 차원에서 방어효과가 있음을 젖산탈수소효소(LDH: Lactate dehydrogenase) 분석 방법으로 증명하고자 한 것으로, 다음의 방법을 이용하여 시험하였다.

실험군은 상기 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 10 mM(실험군 1), 20 mM(실험군 2), 30 mM(실험군 3) 및 50 mM(실험군 4)의 농도로 하였다. 인간수정체상피세포에 처리하여 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 30분 배양하고, 다시 100 μM 과산화수소를 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 정상군은 과산화수소를 처리하지 않았고, 대조군은 다른 첨가물 없이 과산화수소를 100 μM 처리하였다. 처리 및 배양 후, 세포 배양배지(산화 스트레스로 사멸한 세포가 함유)를 새로운 96-웰 실험 플레이트에 50 ㎕씩 분주하고 LDH 시약(Promega, USA)을 50 ㎕ 첨가하여 반응 시켰다. 37℃의 암순응 상태에서 30분간 쉐이킹 반응 시킨 후, 1 N HCl을 50 ㎕ 첨가하여 반응을 중지시켰다. 또한 살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 남은 배양 배지를 제거하고, 0.1% 트리톤 X-100 용액을 50 ㎕ 첨가하여 50 rpm으로 15분 동안 쉐이킹 시킨 후, 배양 배지의 LDH를 측정한 같은 방법으로 반응시켰다. 배양 배지 반응물과 세포 반응물 각각을 ELISA 리더를 이용 하여 파장 490 nm에서 측정하고 결과를 도출하였다. LDH에 의한 세포 독성은 ‘백분율 = 배양 배지 유리 LDH / 살아있는 세포 유리 LDH의 값’으로 계산하여 실험 대조군과 비교한 값을 나타내었다.

도 9에 있어서, 그래프의 X축은 실험군을 나타내고, Y축은 세포생존율을 나타낸 것이다. 그래프에서 나타났듯이 정상군(Nor)과 비교하여 대조군(Ctrl)에서 과산화수소에 의한 세포 생존율의 저하를 볼 수 있었다. 즉, LDH를 많이 유리시켰음을 볼 수 있었다. 또한, 산화 스트레스를 부여한 실시예 4의 조성물 컴파운드 K 투여 각실험군에서 세포 생존율의 증가를 볼 수 있었다. 그러나 실험상 높은 농도 처리군인 실험군 4에서는 오히려 대조군과 비슷한 결과를 보여 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 30 mM까지는 농도-의존적으로 효능을 보임을 알 수 있었다. 도 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드 K는 과산화수소에 의한 유발된 산화 스트레스에 방어 효과가 있음을 보여주었다.

<1-3> 효능 평가 - 항산화 효능(TG2 레벨)

상기한 실시예 5 <1-3>의 실험 방법과 동일하게 실험을 진행하였다. 실험군은 과산화수소를 처리하지 않은 군인 정상군(0 μM)과 과산화수소(100 μM 및 200 μM)를 처리하고 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 처리하지 않은 세가지 실험군(-CK) 및 같은 조건에서 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 30 mM 농도로 처리한 세가지 실험군(+CK)등 총 6개의 실험군으로 실험을 진행하였다.

도 10에서 확인할 수 있듯이, 본 실험의 결과 과산화수소를 첨가하여 산화스트레스를 부여한 대조군(-CK)에 비해 같은 조건에서 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 30 mM 농도로 세포에 투여처리했을 때(+CK) TG2 활성의 감소를 보여주었다. 이 결과는 과산화수소의 농도가 100 μM 뿐 아니라 200 μM에서도 유의한 결과를 보였다. 본 실험의 결과, 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 과산화수소에 의한 산화 스트레스 방어 효과가 있음을 보여주었다.

<1-4> 효능 평가 - 항산화 효능(GSH 레벨)

상기한 실시예 5 <1-4> 의 실험방법과 동일하게 실험을 진행하였다. 실험군은 정상군(NT)과 과산화수소 100 μM를 처리한 대조군(H₂O2), 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 실험군(CK)에 30 mM의 농도로 처리하였다. 실시예 5 <1-4> 와는 다르게 실험 샘플은 반응 후, 6시간, 12시간 및 24시간 후의 세포를 수확하여 실험을 진행하였다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, 세포에 산화 스트레스가 부여되었을 때, 정상군과 비교하여 대조군의 GSH(환원-글루타치온)의 레벨이 감소되는데 실험군에서 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 30 mM 농도로 이를 억제함을 보여주었다. 한편, 각 시간대별로 나타난 실험 결과는 유사한 경향을 보이고 큰 차이를 나타내지 않았다. 본 실험의 결과, 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 과산화수소에 의한 산화 스트레스 방어 효과가 있음을 보여주었다.

<1-5> 효능 평가 - 항산화 효능(MDA 함량)

상기한 실시예 5 <1-4>의 실험방법과 동일하게 실험을 진행하였다. 실험군은 정상군(NT)과 과산화수소 100 μM를 처리한 대조군(H₂O₂), 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 실험군(CK)에 30 mM의 농도로 처리하였다. 실시예 5 <1-4> 와는 다르게 실험 샘플은 반응 후, 6시간, 12시간 및 24시간 후의 세포 배양배지를 수확하여 실험을 진행하였다.

도 12에서 확인할 수 있듯이, 세포에 산화 스트레스가 부여되었을 때, 정상군과 비교하여 대조군의 말론디아레히드의 레벨이 증가되는데, 실험군에서 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 30 mM 농도로 이를 억제함을 보여주었다. 정상군의 경우 시간의 경과와 상관없이 말론디알데히드의 일정한 농도를 보였고, 대조군은 시간이 경과함에 따라 증가됨을 보였다. 또한, 실시예 4의 조성물 컴파운드 K 처리 실험군은 시간이 경과함에 따라 약간의 증가를 보였지만, 대조군에 비해 상대적으로 적음을 보였다.

본 실험의 결과, 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드 K 30 mM 첨가가 지방 산화정도를 나타내는 말론알데히드 레벨을 감소시킴으로써 과산화수소에 의한 산화 스트레스 방어 효과가 있음을 보였고, 시간-의존적으로도 효과가 있음을 보였다.

<2> 엑스 비보 ( ex vivo ) 실험

<2-1> 실험동물의 준비

본 발명의 조성물이 함유하는 유효성분의 시력 개선 효과를 알아보기 위하여 실험동물로부터 적출한 수정체 배양을 통하여 수정체에 대한 조성물의 항산화효과를 시험하였다. 5주령의 웅성 래트를 중앙 동물실험에서 분양 받아 1주간 본사 실험 동물실 환경에 적응시켜 실험 준비를 하였다. 동물실 사육조건으로는 온도 21± 2℃, 상대습도 55± 5%, 환기횟수 10-20회/시간, 형광등 조명 12시간/하루(오전 9시 00분 점등 시부터 오후 9시 00분 소등 시까지) 및 조도 150~300 Lux 로 하였으며, 실험동물은 1군에 3마리씩 폴리카보네이트 사육상자에 넣고 사육하였다. 실험 동물을 CO₂ 가스로 마취한 후, 혈액 방혈로 희생시킨 직 후 래트의 안구를 적출하였다.

<2-2> 수정체 적출 및 배양

안구를 요오드 용액에 30초간 넣어 소독 후 안구에서 수정체를 후방 접근법(Posterior Approach)을 이용해 실체 현미경 하에서 적출해 내었다. 이때 수정체에 수술 도구의 금속이 직접 닿지 않도록 하였다(Spector A. and Garner W.H. (1981), Hydrogen peroxide and human cataract. Exp. Eye Res. 33(6): 673-681).

적출된 수정체는 M199 배지(Sigma, USA)에 넣고 CO₂ 5%, 공기 95% 및 37℃로 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. M199 배지에는 겐타마이신(gentamycin, Gibco, USA)을 5 mg/l 농도로, 펀지존(fungizone, Gibco, USA)을 0.5 ㎍/ml 농도로 넣었다. 모든 수정체는 처음 24시간 동안에는 처리를 하지 않고 M199 컨트롤 배지에서 배양해 손상된 수정체를 제거한 후 실험하였다.

<2-3> 수정체에 대한 조성물의 항산화 효과

적출한 래트 수정체를 1-2 mM 농도의 H2O2 및 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 첨가한 M199 배지에서 24시간 동안 배양하면서, 투미니아 등의 방법(Tumminia S.J., Qin C., Zigler J.S. and Russel P. (1994), The integrity of mammalian lenses in organ culture. Exp. Eye Res. 58:367-374) 에 따라 조직 배양 1시간 만에 배지의 단백질 양이 7 ㎍/ml 이상인 수정체는 버렸고 나머지 수정체 중에서도 배양 24시간까지 현미경 관찰로 손상이 발견되지 않은 수정체만 실험에 사용하였다. 실시예 4의 조성물 컴파운드 K는 30 mM의 농도로 첨가하였다. 수정체 손상 시 수정체에서 배양 배지로 빠져 나오는 단백질의 양과 현미경 관찰로 손상 여부를 판단하였으며, 이러한 관찰에 의하여 항산화 효능을 시험하였다.

도 13에서 확인할 수 있듯이, 엑스 비보 실험을 실시한 결과, 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드 K가 30 mM 농도로 산화 스트레스에 의한 백내장을 억제하는 것을 보여주었다.

<3> 인 비보 실험

<3-1> 실험동물의 준비

실시예 5 <2-1> 실험 방법과 같음.

<3-2> 백내장의 유도

실시예 5 <2-2> 실험 방법과 같음.

<3-3> 효능 검사

(1) 실험군은 정상군, 대조군(백내장 유발), 실험군 1(실시예 4의 조성물 컴파운드 K 1 mg/kg 투여) 및 실험군 2(실시예 4의 조성물 컴파운드 K 5 mg/kg 투여) 로 실험 설계하였다.

(2) 수정체 혼탁도 관찰: 실시예 5 <2-3> (2)와 실험 방법이 같음.

도 14에서 확인할 수 있듯이, 세레나이트 백내장 동물모델에서 정상군과 비교하여 세레나이트 투여군(대조군)에서 백내장 유발을 확인하였다. 또한, 백내장이 유발된 실험군에서 실시예 4의 조성물 컴파운드 K를 투여하였을 때, 백내장의 생성을 현저히 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, 실험 시 실험동물의 급작스러운 폐사는 있지 않았고, 본 동물실험 후 간을 조직 고정한 다음 분석한 결과 본 발명의 실시예 4의 조성물 컴파운드의 K의 독성은 보이지 않았다.

도 1은 발효 전후에 따라 컴파운드 K(Compound K)의 생성 여부를 HPLC 데이터로 확인한 것을 보여주는 그래프이다.

도 2는 인삼추출물, 인삼추출물 유산균 발효물 및 인삼추출물 조효소 발효물 등 실시예 2 성분의 항산화 효능을 MTT 분석에 의하여 확인함으로써 세포 수준에서 산화 스트레스로 유발된 세포독성에 방어 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.

도 3은 실시예 3의 조성물의 항산화 효능을 MTT 분석에 의하여 확인함으로써 본 발명의 조성물이 세포 수준에서 산화 스트레스로 유발된 세포독성에 방어 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.

도 4는 TG2가 백내장의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 기전을 나타내는 모식도이다.

도 5는 세포수준에서 산화 스트레스를 발생하였을 때 활성이 증가하는 TG2 의 활성을 본 발명의 실시예 3의 조성물을 투여함으로써 그 활성을 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 6은 세포수준에서 산화 스트레스를 발생하였을 때 그 양이 감소하는 GSH의 레벨을 본 발명의 실시예 3의 조성물을 투여함으로써 증가시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 7은 세포수준에서 산화 스트레스를 발생하였을 때 생성되는 말론디알데히드를 본 발명의 실시예 3의 조성물을 투여함으로써 그 레벨을 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 실시예 3의 조성물을 세레나이트 투여로 백내장이 유발된 래트에 투여 시 백내장 감소의 효과를 보여주는 사진이다.

도 9는 세포수준에서 산화 스트레스를 발생하였을 때, 본 발명의 실시예 4의 조성물인 컴파운드 K가 산화 스트레스로 인한 항세포독성 효과가 있음을 LDH 실험 방법으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 10은 세포수준에서 본 발명의 실시예 4의 조성물인 컴파운드 K 투여 시 TG2 활성의 감소를 보여주는 그래프이다.

도 11은 세포수준에서 본 발명의 실시예 4의 조성물인 컴파운드 K의 항산화 효과를 GSH 레벨을 측정하여 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 세포수준에서 본 발명의 실시예 4의 조성물인 컴파운드 K가 말론디알데히드 레벨을 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 13은 수정체 조직 배양을 활용하여 본 발명의 실시예 4의 컴파운드 K가 백내장 억제 효능을 보인다는 것을 엑스 비보 실험 결과로 보여주는 사진이다.

도 14는 세레나이트 백내장 동물모델에서 본 발명의 실시예 4의 컴파운드 K가 래트의 수정체에서 백내장의 생성을 억제하는 실험결과를 보여주는 사진이다.

Claims (6)

1. 인삼추출물 발효물 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 시력 개선용 조성물.
2. 인삼 추출물 또는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 인삼 추출물은 발효 처리된 것을 특징으로 하는 시력 개선용 조성물.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 빌베리 추출물, 비타민 A 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시력 개선용 조성물.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 발효 처리된 인삼 추출물은 컴파운드 K, 컴파운드 Y, 진세노사이드 Rh2 또는 그의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시력 개선 용 조성물.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 발효 처리된 인삼 추출물은 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 F2 및 프로토파낙사다이올로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분이 발효 전 인삼 추출물과 비교하여 인리치먼트(enrichment)된 것을 특징으로 하는 조성물.

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