KR20090116547A - 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기또는 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 금불초(Inula japonica Thunberg )의 꽃인 선복화(Inula flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 선복화 추출물이 COX-2 의존적인 PGD2 생성을 억제하며, 알레르기 및 천식 질환 동물모델에서 알레르기 반응의 주된 항체인 IgE의 생성에 필수적인 IL-4와 알레르기 천식반응에 관여하는 IL-5 및 LTC4 생성을 효과적으로 억제함을 확인함으로서, 상기 조성물은 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.
선복화(Inula flos), 항염증, 항천식, 항알레르기
Description
본 발명은 금불초(Inula japonica Thunberg )의 꽃인 선복화(Inula flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.
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천식은 비만세포와 같은 대표적인 염증세포와 호산구, T-림프구 등의 각종 체액성 염증 매개물에 의하여 발생되는 만성 염증성 질환으로 가역적인 기도폐색과 기관지 과민증을 특징으로 갖으며(월간 의약정보 DI(천식), pp 19-24, 2004(12)), 이의 병태에는 여러 가지 매개물질이 관여한다. 천식에 관여하는 물질로는 SRS-A(slow reacting substance of anaphylaxis)로 알려진 5-리폭시게나제(lipoxygenase)의 대사산물인 류코트리엔(Leukotriene, LT라 함)C4, D4, E4이외, 염증성 사이토카인(cytokine)인 인터루킨(Interleukin, IL라 함)-4, -5, -6등이 관여함이 알려져 있다 (Barnes P. J, et al., Inflammatory mediators of asthma: an update, Pharmacol Rev , 50, pp 515-596, 1998; Galli S, et al., Mast-cell-leukocyte cytokine cascades in allergic inflammation, Allergy 50, pp 851-862, 1995).
기관지 천식 역시 일종의 염증반응으로 일어나는 질환으로 염증은 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있으며, 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유 라디칼(free radical), 단백 질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다. 염증의 과정은 급성 염증 및 만성 염증의 두 가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여 진다(Coico R, et al., Immunolgy-a Short Course, Wiely-Liss, INC. Fifth Edition, p16-18, 2003).
알레르기의 원인이 되는 항원물질을 알레르기 항원이라 하며 알레르기 항원이 호흡기를 통하거나 소화기, 혹은 피부를 통하여 우리 몸에 들어오게 되면 알레르기 항원에 특이한 IgE 항체가 생성되어 알레르기 유발세포 표면에 부착되고, 이때 알레르기 항원이 다시 신체에 들어오면 알레르기 유발세포 표면의 IgE 항체와 결합하고 자극받은 알레르기 유발세포는 히스타민을 포함한 여러 가지 매개물을 내보낸 후 호산구를 비롯한 여러 종류의 염증세포가 몰려들어 염증반응이 일어난다(Johansson SG, et al., A revised nomenclature for allergy: An EAACI position statement from the EAACI nomenclatuure task force, Allergy 56, pp 813-824, 2001; Johansson SG, et al., Revised nomenclature for allergy for global use: Report of the Nomenclature Review Committee of the World Allergy Organization, J. Allergy Clin . Immunol, October 2003, pp 113:832-836, 2004).
염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등의 포 스포리파아제 A2(phospholipase A2), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다.
프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 PGA2, PGB2는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta . Physiol . Lat . Am, 1981;31, pp 85-91, 1981; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am . J. Physiol , 267, pp 602-608, 1994), PGD2, PGE1은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다(Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res. 449, pp281-293, 1988, Collins DR, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1), Neuroscience , 110, pp 351-360, 2002). 특히 PGD2는 기관지 천식환자의 평활근을 수축하여 천식을 악화시키는 주범으로 알려져 있다(Shiraishi Y, et al., Cyclooxygenase-2/prostaglandin D2/CRTH2 pathway mediates double-stranded RNA-induced enhancement of allergic airway inflammation, J. Immunol ., 180, pp 541-549, 2008). 류코트리엔(Leukotriens, LT 라 함)은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B4(LTB4), 류코트리엔 C4(LTC4), 류코트리엔 D4(LTD4) 및 류코트리엔 E4(LTE4)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A4로서 알려진 에폭시드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB4, LTC4, LTD4, LTE4)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기성 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 알레르기성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C4 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy, Eur . J. Pharmacol ., 533, pp 40-56, 2006; Kitamura S, Leukotriene (B4, C4, D4, E4), Nippon Rinsho ., Suppl 8, pp 28-33, 2005).
국화과에 속하는 다년생인 금불초(Inula britannica L. var. chinensis REG = Inula japonica Thunberg)는 꽃만 약재로 삼아 선복화라 불리며, 금불초 지상부에는 세스퀴테르페노이드 락톤(sesquiterpenoid lactone), 브리타닌(britanin) 및 이눌린(inulin)이 함유되어 있다. 꽃인 선복화에는 퀘르세틴(quercetin), 이소퀘르세 틴(isoquercetin), 카페인산(caffeic acid), 클로로겐산 (cholorogenic acid), 이눌린(inulin) 및 타락스테롤(taraxasterol) 등 다량의 스테롤(sterol) 성분이 함유된 것으로 알려져 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, pp 1054-1056, 1998).
선복화 추출물에 대한 과학적인 연구결과로서는 항당뇨병 효능이 보고되었으나(Shan JJ, et al., Anti-diabetic and hypolipidemic effects of aqueous-extract from the flower of Inula japonica in alloxan-induced diabetic mice, Biol . Pharm , Bull ., 29, pp 455-459, 2006), 지금까지 선복화 추출물의 염증, 알레르기 또는 천식 질환 치료 및 예방 효과와 관련된 용도에 관해서는 상기 문헌 어디에도 교시되거나 기재된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 COX-2 의존적인 PGD2 생성을 억제하며, 알레르기 및 천식 질환 동물모델에서 알레르기 반응의 주된 항체인 IgE의 생성에 필수적인 IL-4와 알레르기 천식반응에 관여하는 IL-5 및 LTC4 생성의 억제를 측정하므로써 항염증, 항알레르기 및 항천식 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 선복화(Inula flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 선복화(Inula flos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 “추출물”은 선복화의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 “조추출물”은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 “극성용매 가용 추출물”은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 “비극성용매 가용 추출물”은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 염증, 알레르기 또는 천식 질환은 급성 염증, 만성 염증, 기관지염, 기관지천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 또는 알레르기성 피부염, 바람직하게는 급성 염증, 만성 염증, 기관지천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 보다 바람직하게는 기관지 천식 또는 알레르기 비염을 포함한다.
보다 구체적으로, 본원에서 정의되는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 치료 또는 예방 활성효과는 COX-2 의존적인 PGD2 생성을 억제하며, IL-4와 IL-5 및 LTC4 생성을 억제하는 활성을 통하여 작용함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 조추출물은 건조된 선복화 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 에탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로, 바람직하게는 냉침추출법으로 약 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 3회 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 선복화 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 에탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 선복화 추출물을 대상으로 한 COX-2 의존적인 PGD2 생성 억제실험, 류코트리엔 생성 실험 및 오브알부민 유도 천식 동물 모델실험을 통하여 본 발명의 추출물이 COX-2 의존적인 PGD2 생성을 억제하며, 알레르기 및 천식 질환 동물모델에서 호산구 유주인자인 에오탁신과 알레르기 반응의 주된 항체인 IgE의 생성에 필수적인 IL-4와 알레르기 천식반응에 관여하는 IL-5 및 LTC4 생성을 억제하는 활성을 나타냄을 확인하여 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공의 유용함을 확인하였다.
따라서 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 선복화 추출물을 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 선복화 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 선복화 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법 에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로 골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 상기 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이를 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
또한, 상기 추출물을 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같 이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 선복화(Inula flos) 추출물은 COX-2 의존적인 PGD2 생성을 억제하며, 알레르기 및 천식 질환 동물모델에서 알레르기 반응의 주된 항체인 IgE의 생성에 필수적인 IL-4와 알레르기 천식반응에 관여하는 IL-5 및 LTC4 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예
1. 실험재료의 준비
세포 배양액인 RPMI-1640, Modifed Eagle Medium(MEM) non-essential amino acids solution, fetal bovine serum (FBS), streptomycine, penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 SCF, LPS, IL-10, 오브알부민(ovalbumin, OVA), 알룸(Alum), PBS등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다. PGD2 및 LTC4의 EIA kit 는 Cayman사(Ann Arbor, USA)에서 구입하였고, IgE와 IL-5을 위한 EIA kit는 BD Bioscience사 (San Jose, USA)와 IL-4 측정용 EIA kit는 Biosource사(Camarillo, USA)에서 구입하였다.
참고예
2. 세포 배양
쥐 골수 유래의 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 골수에서 분리하여, 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100㎍/ml streptomycine을 포함한 RPMI-1640 배지와 IL-3(쥐의 비장세포에 pokeweed mitogen으로 자극하여 얻은 상층액을 final 20%되도록 넣은 배양액)로 약 3주 정도 배양하여 90%이상의 균질한 BMMC를 얻었다.
참고예
3. 시료준비
하기 실험예에 사용하기 위한 시료로서 실시예 1 내지 5의 선복화 추출물을 DMSO 용매에 녹여 농도를 100, 50, 10, 0.5μg/㎖로 희석하였고, 상기 참고예2 에서 제작한 비만세포에서 PGD2 생성에 미치는 영향의 경우는 농도를 100, 90, 85, 80, 75μg/㎖로 희석하여 사용하였으며, LTC4 생성에 미치는 영향의 경우는 농도를 3.1, 1.6, 0.8, 0.4μg/㎖로 희석하여 사용하였다.
실시예
1.
선복화
에탄올 가용성 추출물의 제조
(주)옴니허브(http://www.omniherb.com/)에서 구입한 선복화(600g)를 70% 에탄올 4L에 60도에서 24시간 침지시킨 후 실온에서 추출액을 수득하고, 다시 70% 에탄올 4L를 가하여 2회 더 추출하여 추출액을 모은 후, 상기 각 추출액을 여과한 여 과물을 감압 회전농축기(Vaccum rotary evaporator; 일본 Nihon Seiko사, VR-205c)로 용매를 증발시키는 감압 농축 및 건조과정을 통하여 선복화 70% 에탄올 추출물 90g(수율 : 15.0%, 이하 ILC 라 함)를 수득하였다.
실시예
2.
헥산
가용성 추출물의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 선복화 에탄올 조추출물 80g을 물에 현탁하고 헥산 1ℓ를 첨가하여 용해한 다음 이를 분획하여 헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 헥산 가용성 분획층에 용해되는 성분만을 분리해서 농축, 감압 여과하여 헥산 가용성 추출물 7.3g(수율 : 9.13%, 이하 ILH 라 함)를 수득하였다.
실시예
3. 에틸아세테이트 가용성 추출물의 제조
상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물에 에틸아세테이트 1ℓ를 첨가하여 용해한 다음 이를 분획하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 에틸아세테이트 가용성 분획층에 용해되는 성분만을 분리해서 농축, 감압 여과하여 에틸아세테이트 가용성 추출물 12.5g(수율 : 17.2%, 이하 ILE 라 함)를 수득하였다.
실시예
4.
부탄올
가용성 추출물의 제조
상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물에 부탄올 1ℓ를 첨가하여 용해한 다음 이를 분획하여 부탄올 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 부탄올 가 용성 분획층에 용해되는 성분만을 분리해서 농축, 감압 여과하여 부탄올 가용성 추출물 15g(수율 : 24.9%, 이하 ILB 라 함)를 수득하였다.
실시예
5.
수가용성
추출물의 제조
상기 실시예 4에서 부탄올 가용성 분획층을 제외한 나머지 수가용성 분획물을 분리하여 농축, 감압 여과하여 수가용성 추출물 31.8g(수율 : 70.4%, 이하 ILW 라 함)을 수득하였다.
실험예
1.
COX
-2 의존적인
PGD
2
생성 억제 측정
본 발명의 실시예들에서 수득한 선복화 추출물들의 알레르기성 질환에 대한 저해정도를 확인하기 위해 프로스타글란딘 D2 (PGD2)의 생성량을 측정하였다. 측정은 PGD2 EIA kit (Cayman, PGD2-MOX EIA kit, product no. 512011)를 사용하였다.
참고예 2의 BMMC 배양 3주 후 세포농도 2Ｘ105cells에 상기 실시예 1에서 수득한 선복화 추출물 (ILC) 을 30분간 전 처리한 후 100ng/ml의 SCF, 100ng/ml의 LPS 및 100 U/ml의 IL-10 혼합자극제(Sigma 사)를 처리한 다음, 세포 자극 8시간 후의 상층액의 PGD2를 PGD2 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 이때 COX-1(시클로옥시게나제-1)에 의해서 생성되는 PGD2의 생성을 억제시키기 위하여 BMMC에 아스피린(aspirin) 10㎍/㎖을 1시간 전에 미리 전 처리한 후 사용하였다. 세정완충용액(washing buffer)으로 4회 세정하고 기질용액 (substrate solution)을 200 ㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 반응정지 용액 (stop solution)을 처리한 후에 450 nm에서 흡광도를 ELx800(BIO-TEK, Instrument, Inc, USA)으로 측정하였다.
실험결과, 도 1에서 보이는 바와 같이 선복화 추출물의 농도 의존적으로 PGD2의 생성이 억제됨을 확인할 수 있었으며, IC50은 83.98㎍/㎖ 이었다.
실험예
2.
류코트리엔
생성에 대한 영향 분석 실험
실시예 1에서 제조된 선복화 추출물(ILC)의 LTC4 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기 실험을 실시하였다(Chang HW et al.. Planta . Medica ., 70(5), pp 474-476, 2004).
참고예 2의 BMMC 배양 3주 후 비만세포에 선복화 추출물을 농도별로 미리 30분간 전처리 한 후 SCF 자극제(Sigma 사, S9915)를 15분 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 LTC4 정량은 LTC4 EIA(Enzyme linked immuno assay, Cayman 사, product no. 520211) kit를 이용하여 측정하였다.
그 실험결과, 하기 도 2에 보이는 바와 같이 선복화 추출물이 LTC4 생성을 용량 의존적으로 저해하였으며, IC50은 1.23㎍/㎖ 이었다. 또한 순차적으로 용매 분획한 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 추출물의 LTC4 생성저해의 IC50 농도는 각 2.5 ㎍/㎖, 0.36㎍/㎖, 3.06㎍/㎖임을 확인할 수 있었다.
실험예
3.
오브알부민(Ovalbumin)으로
유도한 천식 동물 모델
3-1. 호산구 침윤에 대한 영향 측정
실시예 1에서 제조된 선복화 추출물(ILC)의 항천식 효능에 미치는 영향을 검토하기 위하여 천식반응시 유도되는 IL-4, IL-5 및 혈청 IgE 농도는 ELISA kit를 사용하여 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
즉, 쥐 (Balb/c 암컷 쥐, 6주령, 3마리)에 오브알부민 100㎍/ml(Sigma사, product no. A5503)을 PBS에 녹여서 같은 볼륨(Volume)의 알룸 (Alum, 1mg, Pierce사, product no. 77161, Rockford, USA)으로 섞어서 200ml를 복강으로 0일, 7일, 14일, 총 3번 투여했다. 4주째의 처음 3일은 하루 2번 경구투여하고 마지막 날은 1회 경구투여를 함으로써 4일 동안 총 7회의 경구투여를 하고, 2주째 둘째날 및 넷째날 오전, 선복화 추출물들을 경구투여 후, 1% 오브알부민을 에어졸 형태로 쥐의 코에 분한다. 그리고 5일째 되는날 오전에 쥐를 희생시킨 후, 기관지에 직접 인산염 완충액 염수(PBS) 용액 1.5 ml을 투여하여 기관지폐세정액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 얻었다. 그 후 세정액을 사이토스핀(Shandon Cytospin4, Thermo, USA)으로 슬라이드 글라스에 도포한 후 딥 퀵(Diff-Quick)(국제시약주식회사, Japan) 염색법으로 염색하고 광학 현미경(Carlzeiss, KF2, German)을 사용하여 200개의 세포로부터 염색된 호산구 숫자를 계산하였다(도 3-A 참조).
그 실험결과, 오브알부민으로 유도한 천식쥐의 폐조직에서 얻은 BALF에서 총 백혈구(100%) 중 호산구의 수는 60%이었으나, 선복화 추출물을 투여한 결과에서 호산구의 수는 40%로 감소됨을 확인할 수 있었다.
3-2. 단백질 발현측정
천식유도 동물 모델에서 호산구수의 감소는 호산구 유주인자인 에오탁신(Garcia-Zepeda EA, et al., Nature Medicine, 2(4), pp 449-456, 1996)의 발현여부를 통해 측정가능하며, 알레르기 질환에 대한 효과는 알레르기 반응의 주된 항체인 IgE의 생성에 필수적인 IL-4의 유전자(Arm JP, et al., Advance Immunology, 51, pp 323-382, 1992) 및 IL-5의 유전자(Hamid Q. et al., J. Clinic Invest, 87, pp 1541-1546, 1991) 및 IL-13의 유전자(Huang SK, et al., J. Immunol., 155, pp 2688-2694, 1995)를 EIA kit로 측정함으로서 확인할 수 있다. 유전자 발현의 생성물인 단백질의 억제를 천식유도 동물을 5일째 되는 날 오전에 희생시킨 후, 5일째 되는 날 오전에 죽인 후, 기관지폐세정액에 있는 사이토카인(IL-4, IL-5), 혈청 IgE를 EIA kit를 사용하여 측정하였다 (도 3-B, 3-C, 3-D 참조).
실험결과, 오브알부민으로 유도한 천식쥐의 BALF에 있는 IL-4, IL-5 양과 혈청 IgE는 오브알부민으로 유도하지 않은 대조군 (control) 쥐의(3마리) BALF에 있는 IL-4는 약 12배정도, IL-5 10배 정도 IgE는 6배정도로 현저히 증가되었으나, 선복화 추출물을 투여한 결과 IL-4는 control과 비슷한 양으로 급격한 감소(89%)를 보였다. 또한, IL-5와 혈청 IgE의 양도 39%와 24%로 각각 감소됨을 확인할 수 있었다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1.
산제의
제조
선복화 추출물(ILE) 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예
2. 정제의 제조
선복화 추출물(ILC) 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예
3. 캅셀제의 제조
선복화 추출물(ILE) 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예
4. 주사제의 제조
선복화 추출물(ILC) 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예
5.
액제의
제조
선복화 추출물(ILB) 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예
6. 건강 식품의 제조
선복화 추출물(ILC) 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예
7. 건강 음료의 제조
선복화 추출물 (ILC) 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
도 1은 선복화 추출물에 대한 쥐 골수유래 비만세포(mouse bone marrow-derived mast cells, BMMC)에서 시클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 의존적인 프로스타글란딘 D2(prostaglandin D2, PGD2) 생성 억제 도이고,
도 2는 기관지 천식 및 알레르기 반응을 일으키는 류코트리엔 C4(leukotriene C4, LTC4)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제의 저해활성 실험결과를 나타낸 도이며,
도 3-A는 선복화 추출물의 오브알부민 또는 알룸으로 유도한 천식모델의 기관지폐세척액(BALF)이 천식관련 단백질 생성량에 미치는 결과를 호산구 수로 나타낸 도이고,
도 3-B는 선복화 추출물의 오브알부민 또는 알룸으로 유도한 천식모델의 기관지폐세척액(BALF)이 천식관련 단백질 생성량에 미치는 결과를 IL-4 양으로 나타낸 도이며,
도 3-C는 선복화 추출물의 오브알부민 또는 알룸으로 유도한 천식모델의 기관지폐세척액(BALF)이 천식관련 단백질 생성량에 미치는 결과를 IL-5 양으로 나타낸 도이고,
도 3-D는 선복화 추출물의 오브알부민 또는 알룸으로 유도한 천식모델의 혈청으로부터 천식관련 단백질 생성량에 미치는 결과를 IgE 양으로 나타낸 도이다.
Claims (9)
- 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 선복화의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물인 약학조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매로부터 가용한 추출물을 포함하는 약학조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로 로메탄 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함하는 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 염증, 알레르기 또는 천식 질환은 급성 염증, 만성 염증, 기관지염, 기관지천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 또는 알레르기성 피부염인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
- 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알레르기 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 제 8항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 건강기능식품.
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