KR101010743B1

KR101010743B1 - 복합 생약 추출물（ｋｒｊｓ）을 유효성분으로 함유하는염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101010743B1
Application number: KR1020080072673A
Authority: KR
Inventors: 박선동; 허숙경; 이효승; 윤현정
Original assignee: 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2011-01-25
Also published as: KR20100011449A

Abstract

본 발명은 금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)이 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO, PGE₂, iNOS 발현, COX-2 발현 및 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)의 함량을 유의적으로 저해하는 효과를 확인함으로써, 상기 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.), 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.), 복합 생약 추출물(KRJS), NO, PGE₂, iNOS, COX-2, 염증성 사이토카인, 염증성 질환

Description

복합 생약 추출물（ＫＲＪＳ）을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the extract of complex herbs(KRJS) as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Shi YL et al., Cell death and apoptosis-induced effect of toosendanin. Chi . J. Neurosci ., 20, pp461-466, 2004

[문헌 2] Kim HM et al., Comparative studies of adriamycin and 28-deacetyl sendanin on in vitro growth inhibition of human cancer cell lines. Arch. Pharm . Res ., 17(2), pp100-103, 1994

[문헌 3] Shi YL et al., Cure of experimental botulism and antibotulismic effect of toosendanin. Acta . Pharmacol . Sin., 25, pp839-348, 2004

[문헌 4] Lirussi D et al., Inhibition of Trypanosoma cruzi by plant extracts used in chinese medicine. Fitoteria ., 75, pp718-723, 2004

[문헌 5] Shi YL et al., Electrophysiological analysis on the presynaptic blocking effects of toosendanin on neuromuscular transmission. Acta. Physiol . Sin., 33, pp259-265, 1981

[문헌 6] Kim BS et al., Effect of Melia toosendan fructus on liver function (Ⅰ) - Effect of each fractions from meliae toosendan fructus on drug metabolism enzyme system and bile secretion. Kor . J. Pharmacogn ., 24(1), pp63-71, 1993

[문헌 7] Ryu MY et al., Effect of Melia toosendan fructus on liver function (Ⅱ) - Effect of seed oil on lipid metabolism in rats. Kor . J. Pharmacogn., 25(3), pp272-279, 1994

[문헌 8] Chang CK et al., DL-tetrahydropalmatine may act through inhibition of amygdaloid release of dopamine to inhibit an epileptic attack in rats. Neurosci . Lett ., 20(307), pp163-169, 2001

[문헌 9] Lin MT et al., Antihypertensive effects of dl-tetrahydropalmatine: an active principle isolated from Corydails. Clin Exp . Pharmacol . Physiol ., 23, pp738-742, 1996

[문헌 10] Chueh FY et al., Hypotensive and bradycardic effects of dl-tetrahydropalmatine mediated by decrease in hypothalamic serotonin release in the rat. Jpn . J. Pharmacol ., 69, pp177-180, 1995

[문헌 11] 木村正康. 漢方藥理學, 東京, 南山堂, pp177-179, 1997

[문헌 12] Hung TM et al., Anti-amnestic activity of pseudocoptisine from Corydalis Tuber. Biol . Pharm . Bull ., 31(1), pp159-162, 2008

[문헌 13] Jung JW et al., Keum-ryung-ja-san, an traditional herbal prescription, ameliorates depressive behaviors in mice. J. Appl . Pharmacol ., 14, pp114-122, 2006

[문헌 14] Desai A et al., cytotoxicity and apopotosis enhancement in brain tumor cells upon coadministration of paclitaxel and ceramide in nanoemulsion formulations. J. Pharm . Sci ., 97(7), pp2745-2756, 2008

[문헌 15] Wang S. et al., J. Ethnopharmacol ., 114(3), pp458-462, 2007

[문헌 16] Heo et al., J. Immunol ., 179(9), pp6305-6310, 2007

[문헌 17] Heo et al., J. Leukoc . Biol ., 79(2), pp330-338, 2006

염증 (inflammation)은 외부 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나이다. 염증반응이 일어나면 여러 가지 염증 인자들 (pro-inflammatory mediators)이 만들어지는데 이로 인하여 임상적으로는 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등의 증상이 나타난다. 염증 인자에는 유도적 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)에 의해서 만들어지는 산화질소 (nitric oxide, NO)와 시클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해서 만들어지는 프로스타글란딘E₂(prostaglandinE₂, PGE₂) 등이 있다. 이러한 염증 인자는 염증반응의 전사인자인 핵 전사인자-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)를 활성화시키며, 그 결과 과량의 NO와 PGE₂를 생성하여 염증을 일으킨다 (Lee TH et al., Mol . Cells ., 23(3), pp398-404, 2007; Nishida T et al., Dig . Dis . Sci ., 52(8), pp1890-1896, 2007). 포유동물 세포의 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase, NOS)의 경우, 유사 형태가 3종류 존재하는데, 신경성 산화질소 합성효소 (neuronal NOS, nNOS), 내피세포 산화질소 합성효소 (endothelial NOS, eNOS) 그리고 iNOS이다. 그 중에서 특히 iNOS가 염증반응에 관여한다. nNOS와 eNOS는 항상 발현되어있으며, iNOS의 경우 인터페론-γ (Interferon-γ), 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS), 그리고 여러 가지 염증성 사이토카인의 자극이 있을 때 발현된다. 보통 eNOS는 강력한 혈관확장제로서 혈관의 항상성 (vascular homeostasis) 유지에 중요한 역할을 한다.

산화질소 (nitric oxide, NO)는 급성, 만성 염증반응을 조절하기도 한다. 염증반응에 있어서 iNOS의 전사단계에서의 발현조절은 NO의 지속시간과 생성정도를 결정하는데 있어서 대단히 중요하다. 그러므로 iNOS의 발현조절기전 및 iNOS의 효소활성은 만성염증관련 질환의 개선을 위한 새로운 항염증 약제를 분리하고자 하는 연구에서 약제작용의 표적으로 이용되고 있다.

PGE₂는 COX에 의해서 아라키돈산 (arachidonic acid)으로부터 생산된다. COX에 대해서는 1990년대 초반에 주로 연구되었는데, 이 또한 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, 프로스타글란딘을 생산하여 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로, COX-2는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포 (Macrophage)에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현, 이에 따른 NO와 PGE₂의 생산은 면역세포의 대표적인 염증인자이다.

또 다른 염증인자로서는 염증성 사이토카인인 종양 괴사 인자-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-1β (interleukin-1β, IL-1β), IL-6, 단핵구 화학주성 단백질-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) 등을 포함한다.

최근, 천연자원은 여러 치료제의 선도 물질로서 개발되어 제약 산업에 소중한 자원으로서 이용되어 왔다. 그러므로 천연자원에서 항염증 질환의 예방 및 치료 물질을 개발하여 사용하는 것은 인공적인 화학물질보다 부작용을 줄일 수 있을 뿐 만 아니라 가격면에서도 경쟁력이 있다.

금령자는 천련자라고도 명명되며 멀구슬나무과 식물 천련(Melia toosendan Sieb. et Zucc.)의 열매를 말하는 것으로,금령자의 주성분인 투센다닌 (toosendanin)에 대한 연구가 주로 진행되어 왔다. 투센다닌에 대한 실험 연구로는 암세포에 대한 아포토시스 효과 및 성장억제 효과, 항보튤리누스 효과, 항균 효과, 아세틸콜린 분비억제 효과, 간의 약물대사효소 및 담즙 분비활성 효과, 항고지혈증 효과 등이 보고되어 있다 (Shi YL et al., Cell death and apoptosis-induced effect of toosendanin. Chi . J. Neurosci ., 20, pp461-466, 2004; Kim HM et al., Comparative studies of adriamycin and 28-deacetyl sendanin on in vitro growth inhibition of human cancer cell lines. Arch . Pharm . Res ., 17(2), pp100-103, 1994; Shi YL et al., Cure of experimental botulism and antibotulismic effect of toosendanin. Acta . Pharmacol . Sin., 25, pp839-848, 2004; Lirussi D et al., Inhibition of Trypanosoma cruzi by plant extracts used in chinese medicine. Fitoteria ., 75, pp718-723, 2004; Shi YL et al., Electrophysiological analysis on the presynaptic blocking effects of toosendanin on neuromuscular transmission. Acta . Physiol ., 33, pp259-265, 1981; Kim BS et al., Effect of Melia toosendan fructus on liver function (Ⅰ) - Effect of each fractions from meliae toosendan fructus on drug metabolism enzyme system and bile secretion. Kor . J. Pharmacogn ., 24(1), pp63-71, 1993; Ryu MY et al., Effect of Melia toosendan fructus on liver function (Ⅱ) - Effect of seed oil on lipid metabolism in rats. Kor . J. Pharmacogn ., 25(3), pp272-277, 1994).

현호색은 양귀비과에 속한 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 덩이줄기를 말하는 것이다. 현호색의 약리작용에 대한 연구는 진정 작용, 항고혈압 작용, 근이완 및 진경 작용, 항건망증 작용 그리고 위산분비 억제 및 항궤양 작용 등이 보고되어 있다 (Chang CK et al., DL-tetrahydropalmatine may act through inhibition of amygdaloid release of dopamine to inhibit an epileptic attack in rats. Neurosci . Lett ., 20(307), pp163-166, 2001; Lin MT et al., Antihypertensive effects of dl-tetrahydropalmatine: an active principle isolated from Corydails. Clin . Exp . Pharmacol . Physiol ., 23, pp738-742, 1996; Chueh FY et al., Hypotensive and bradycardic effects of dl-tetrahydropalmatine mediated by decrease in hypothalamic serotonin release in the rat. Jpn . J. Pharmacol ., 69, pp177-180, 1995; 木村正康. 漢方藥理學, 東京, 南山堂, pp177-179, 1997; Hung TM et al., Anti-amnestic activity of pseudocoptisine from Corydalis Tuber. Biol . Pharm . Bull ., 31(1), pp159-162, 2008).

금령자와 현호색의 생약 복합 추출물을 이용한 실험 연구는 마우스의 행동연구를 통한 항우울 효과를 검증한 것 (Jung JW et al., Keum-ryung-ja-san, an traditional herbal prescription, ameliorates depressive behaviors in mice. J. Appl. Pharmacol ., 14, pp114-118, 2006) 외에는 거의 전무한 실정이며 특히 금령 자와 현호색의 생약 복합 추출물을 이용한 항염증 활성에 관한 연구는 보고되지 않고 있다. 동맥경화 질환과 같은 만성 염증성 질환(chronic inflammatory disease)에 대한 예방효과를 알아보기 위하여 약재의 메탄올 추출물을 전 처리하여 본 실험에서 선택한 약재가 염증성 질환에 대해 예방효과가 있는지를 알아보는데 관심을 두었다.

이에 본 발명자들은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 복합 생약 추출물(KRJS)을 처리하여 세균성 LPS로 유도된 NO 생성량, PGE₂ 생성량, iNOS와 COX-2의 발현 및 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성량 저해 기능을 확인함으로써 항염증 효과에 대한 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 복합 생약 추출물(KRJS)은 금령자 및 현호색의 상대배합 중량비 (w/w)가 1: 1~10, 바람직하게는 1: 1~5, 보다 바람직하게는 1: 1~2를 포함함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 10~100% 메탄올, 보다 바람직하게는 60~100% 메탄올 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 동맥경화증, 결막염, 아토피, 관절염, 비염, 궤양성 대장염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식, 바람직하게는 동맥경화증, 관절염, 고혈압, 당뇨병 또는 암, 보다 바람직하게는 동맥경화증 또는 고혈압을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)은 하기와 같이 제조될 수 있다. 금령자 및 현호색의 상대배합중량비 (w/w)가 1: 1~10, 바람직하게는 1: 1~5로 혼합하는 제 1단계; 이에 1 내지 5배, 바람직하게는 3배의 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 100% 메탄올로 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃에서 24시간 내지 60시간, 바람직하게는 40시간 내지 50시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하는 제 2단계; 상기 제 2단계를 1 내지 7회, 바람직하게는 2 내지 4회 추출하여 반복하는 제 3단계; 상기단계에서 얻은 추출액을 여과농축 및 동결 건조시키는 제 4단계를 포함하는 제조방법을 통해 본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)을 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 복합 생약 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함한다.

본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골 (macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 복합 생약 추출물(KRJS)의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 복합 생약 추출물(KRJS)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이를 첨가할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

또한, 염증성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때 식품 또는 음료 중의 복합 생약 추출물(KRJS)의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100 ml 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)은 천연 과일주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS) 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 복합 생약 추출물(KRJS)은 RAW 264.7 세포에서 LPS 처리로 유도된 염증 인자의 지표인 NO의 생성량, PGE₂의 생성량, iNOS의 발현도, COX-2의 발현도, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성량을 유의적으로 저해하는 항염증 효과를 보여 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로서 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 복합 생약 추출물( KRJS )의 제조

금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)은 동국대학교 한의과대학 방제학 교실에서 선별된 것을 정선하여 각각 150g, 150g씩 혼합하여 6배량의 100% 메탄올을 가한 다음, 48시간 동안 37℃에서 추출하여, 이 과정을 3회 반복하여 여과한 후 농축하고 동결 건조를 통해 본 발명의 시료 (이하 "KRJS"라 명명함) 19.9 g (수율 6.6%)를 수득하였다.

참고예 1. 실험재료의 준비

세포 배양액인 Dulbecco's Modifided Eagle Medium (DMEM, 11995), fetal bovine serum (FBS, 16000-044), streptomycin-penicillin (15140-122) 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (NY, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 Sodium Dodesyl Sulfate (SDS, 161-0302), Acrylamide (161-0100), Bis (161-0201)는 Bio-Rad사 (CA, USA)에서 구입하였고, hydrogen peroxide (H₂O₂, 216763) 6-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA, D-6863), CAPS (C-2632), tween 20 (P5927) 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS monoclonal antibody (mAb, sc-651)는 Santa Cruz Biotechnology사 (CA, USA)에서, COX-2 mAb (4842)와 β-actin mAb (4967)는 Cell Signaling Technology사 (MA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사 (CA, USA)에서 구입하였다. Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (WI, USA)에서 구입하였고, 각종 cytokine 측정을 위한 ELISA kit (IL-1β, EMIL1B5; IL-6, EM2IL6; TNF-α, EMTNFA5) 는 Pierce Biotechnology사 (IL, USA) 에서 구입하였으며, PGE₂ assay kit (KGE004)는 R&D사 (MN, USA)에서 구입하였다. Protein assay reagent (80-6147-45)는 Bio-Rad사 (CA, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.

참고예 2. 세포배양

마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행 (KCLB))를 10% FBS과 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하여 하기 실험에 사용하였다. 또한 모든 실험결과는 평균과 표준 편차로 표시하고 유의성 검증은 시그마 플롯 (Sigma Plot, Window용 version 7.0)을 이용하여 student's t-test (p<0.001)를 실시하여 실험군과 대조군(#) 또는 실험군과 LPS 시험군(*)간의 유의성을 표기하였다.

실험예 1. MTS 분석법

상기 실시예 1에서 수득한 추출물(KRJS)의 세포에 대한 독성 측정을 위해 문헌 (Desai A, Vyas T, Amiji M. Cytotoxicity and apopotosis enhancement in brain tumor cells upon coadministration of paclitaxel and ceramide in nanoemulsion formulations. J. Pharm . Sci . 97(7):2745-56, 2008)에 기재된 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) 분석 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예 2의 방법으로 배양된 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×10⁴cells/well 분주하고, 상기 실시예 1에서 수득한 추출물(KRJS)을 각각 농도별 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 μg/ml)로 18시간 동안 처리하였다. well당 20 ㎕의 MTS 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader, DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 추출물을 처리하지 않은 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율 (평균값± 표준편차)로 표시하였다.

실험결과, 도 1에서 나타내는 바와 같이 KRJS를 각각 농도별 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 μg/ml)로 18시간 동안 처리한 결과, 400 μg/ml의 농도까지는 독성이 나타나지 않았음을 확인하였으나, 400 μg/ml 이상의 농도에서는 독성이 나타남을 확인하였다. 따라서 RAW 264.7의 세포 생존율에 영향을 주지 않는 KRJS 200 μg/㎖과 400 μg/㎖의 농도를 선별하여 다음 실험을 진행하였다.

실험예 2. NO 의 생성량 측정

NO의 생성량을 측정하기 위해 문헌 (Wang S et al., J. Ethnopharmacol ., 114(3), pp458-462, 2007)에 기재되어 있는 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.

상기 참고예 2의 방법으로 배양된 RAW 264.7 세포에 상기 실시예 1에서 수득한 KRJS를 전처리 하고 1시간 후 100 ng/ml의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 배양액 50 ㎕와 같은 양의 그리스 반응액 (Griess Reagent)을 넣어주고 10분간 상온에서 반응시킨 후 Automatic ELISA reader (precision microplate reader, Molecular Devices, BIO-TEX EL800uv-PC, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산 나트륨 (sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.

실험결과, 도 2-A에 나타난 바와 같이 LPS 100 ng/ml의 농도로 처리하였을 때, 아무 처리도 하지 않은 대조군에 비하여 NO의 생성량이 약 20배 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 KRJS 200 μg/㎖의 농도를 1시간 동안 전 처리하였을 때, LPS-유도된 NO의 생성감소율이 약 92.7%, 400 μg/ml의 농도에서는 95.7%로 뚜렷한 감 소효과를 확인할 수 있었다 (도 2 참조).

실험예 3. PGE ₂ 의 생성량 측정

PGE₂의 양을 측정하기 위해 상용 경쟁적 효소 면역분석 킷트 (commercial competitive enzyme immunoassay kit, R&D systems, Minneapolis)를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참고예2의 방법으로 배양된 RAW 264.7 세포에 상기 실시예 1에서 수득한 KRJS를 200 ㎍/ml, 400 ㎍/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다. 18 시간 후 세포 배양액을 goat anti-mouse로 코팅 (coating)된 96 well plate에 각각의 배양액을 100 ㎕씩 주입 (loading)한다. 여기에 primary antibody solution 50 ㎕와 PGE₂ conjugate 50 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 방치시켰다. 세척 완충용액 (washing buffer)로 4회 세척하고 기질용액 (substrate solution)을 200 ㎕씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 반응정지 용액 (stop solution)을 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 2-B에 나타난 바와 같이, LPS 100 ng/ml의 농도에서 아무 처리도 하지 않은 대조군에 비해 PGE₂ 생성량이 약 10배 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, KRJS를 처리한 실험군은 200 μg/ml의 농도에서는 21.5%의 감소효과, 400 μg/ml의 농도에서는 52.5%의 감소효과를 확인할 수 있었다 (도 2 참조).

실험예 4. 웨스턴 블롯 분석법 ( Western blot analysis )

iNOS 및 COX-2 단백질 발현 측정을 하기 위해 허 등의 방법 (Heo et al., J. Immunol., 179(9), pp6305-6310, 2007)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석법을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예 1에서 수득한 KRJS 200 ㎍/ml, 400 ㎍/ml을 한시간 동안 전처리 한 후 LPS 100 ng/ml을 처리하여 18시간 동안 참고예 2의 방법으로 배양된 세포에 ice-cold Tris buffered saline (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 137 mM NaCl)으로 3회 세척한 후, 용해 완충액 (lysis buffer: TBS, 1% NP-40, 1 mM sodium orthovanadata, 10 ㎍/㎖ aprotinin, 10 ㎍/㎖ leupeptin 및 1 mM PMSF)을 넣어 4℃에서 30분간 반응시키고 12,000×g에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 모았다. 동일한 양의 단백질을 7.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리시킨 후, 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane, Whatman, Germany)에 전이 (transfer)하였다. 이 멤브레인을 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 블로킹 용액 (blocking buffer: 5% non-fat milk와 0.1% Tween20을 함유한 TBS 용액)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 각 단백질에 대한 항체 (anti-iNOS 및 anti-COX2)를 가하여 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 이어서 0.1% Tween20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, 2차 항체 (anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-conjugated antibody)로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후에 X-ray film (AGFA, Belgium) 상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용 하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.

실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LPS 100 ng/ml를 처리했을 때, iNOS와 COX-2의 발현이 대조군에 비해 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, KRJS 200 μg/㎖, 400 μg/㎖의 농도를 1시간 동안 전 처리했을 때, LPS 100 ng/ml에 의해 유도되는 iNOS 및 COX-2의 발현이 효과적으로 저해됨을 확인할 수 있었다 (도 3 참조).

실험예 5. 세포 배양액 내의 사이토카인 ( cytokines ) 측정

염증을 나타내는 지표로써, 세포 배양액 내의 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)의 양을 측정하기 위해 허 등의 방법 (Heo et al., J. Leukoc. Biol ., 79(2):330-338, 2006)을 이용하여 ELISA 분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 하기와 같이 수행하였다.

상기 참조예 2의 방법으로 배양된 RAW 264.7 세포에 상기 실시예 1에서 수득한 KRJS 200 μg/㎖, 400 μg/㎖의 농도로 1시간 처리한 후 LPS 100 ng/ml를 처리하여 18시간 후 세포 배양액을 적절한 농도로 희석한 후, 사이토카인으로 코팅된 96 well plate에 50 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 방치시켰다. 워싱 완충액 (washing buffer)로 3회 세척하고 100 ㎕의 비오티닐화 항체 반응액 (biotinylated antibody reagent)를 각각의 well에 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 3회 세척한 다음, 100 ㎕의 스트렙타비딘-HRP 용액 (streptavidine-HRP solution)을 각각의 well에 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 다시 세척 완충용액 (washing buffer)로 3회 세척하였다. 여기에 di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxybenzalmalonate (TMB) 기질을 100 ㎕씩 처리하여 5~30분간 반응시킨 후 100 ㎕의 반응 정지용액 (stop solution)을 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 LPS에 의해 유도되는 TNF-α의 생성량은 KRJS 200 μg/㎖, 400 μg/㎖ 농도 처리에서 각각 85.7%, 99.1% 감소하였다. 또한 LPS에 의해 유도되는 IL-1β의 생성량은 KRJS 200 μg/㎖, 400 μg/㎖ 농도 처리에서 각각 83.1%, 89.3% 감소하였으며, LPS에 의해 유도되는 IL-6의 생성량은 KRJS 200 μg/㎖, 400 μg/㎖ 농도 처리에서 각각 94.5%, 99.2% 감소함을 확인할 수 있었다 (도 4 참조).

본 발명의 복합 생약 추출물(KRJS)을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 조제

KRJS 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 조제한다.

제제예 2. 정제의 제조

KRJS 10 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

KRJS 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

KRJS 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

KRJS 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적정량

통상 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

KRJS 1000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

KRJS 1000 mg

구연산 1000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수 전체 900 ml

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

R13-2005-013-01000-0

[부처명]

과학기술부(한국과학재단)

[연구사업명]

기초의과학연구센터 육성사업

[연구과제명]

in vivo 모델을 이용한 심혈관질환 예방 및 치료 효과를 갖는 천연물질의 작용기전 해명

[주관기관]

한국과학재단, 동국대학교, 경상북도

[연구기간]

2005. 6. 1 ~ 2010. 2. 28

도 1은 복합 생약 추출물(KRJS)의 농도별 세포독성에 미치는 효과를 측정한 도이고,

도 2는 복합 생약 추출물(KRJS)의 LPS-유도된 NO와 PEG₂ 생성량에 미치는 효과를 측정한 도이며,

도 3은 복합 생약 추출물(KRJS)의 LPS-유도된 iNOS 및 COX-2 발현에 미치는 효과를 측정한 도이며,

도 4는 복합 생약 추출물(KRJS)의 LPS-유도된 TNF-α (A), IL-1β (B) 및 IL-6 (C) 에 미치는 효과를 측정한 도이다.

Claims

금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 금령자 및 현호색의 상대 배합중량비(w/w)가 1 : 1~10인 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 동맥경화증, 결막염, 아토피, 관절염, 비염, 궤양성 대장염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%으로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
금령자(천련자, Melia toosendan Sied. et Zucc.) 및 현호색(Corydalis turtschaninovii Bess.)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 건강기능식품.