KR20090115111A

KR20090115111A - 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거를 위한 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20090115111A
Application number: KR1020097008247A
Authority: KR
Inventors: 라파에르 바크하우스; 옌스 에베르하르드트; 마르코 마인하르트; 게르트 보른만
Original assignee: 아비소 게엠베하 메카트로닉 시스템
Priority date: 2006-09-22
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2009-11-04
Also published as: EP2064310A2; CA2664135C; EP3159399A1; EP2064310B1; JP2010504086A; US9822331B2; US10900009B2; WO2008034868B1; US20110124037A1; EP3159399B1; WO2008034868A2; WO2008034868A3; US20180030397A1; KR101150444B1; CA2664135A1; JP5244801B2

Abstract

물리적 파라미터를 기초로 세포 및/또는 세포 군체를 선택하는 제1 검출 단계를 수행하는 것에 의해 세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체를 자동 제거하고, 위치 데이터를 획득하고, 선택된 세포 및/또는 세포 군체와 관련하여 획득된 위치 데이터를 위치 데이터베이스에 저장하는 방법이 개시된다. 식별된 세포 및/또는 세포 군체 중에서 특별한 성질을 갖는 특별한 세포 및/또는 세포 군체의 선택을 위해, 세포 및/또는 세포 군체의 적어도 하나의 추가 파라미터를 식별하는 것에 의해 적어도 하나의 제2 검출 단계를 수행하고, 제1 및 제2 검출 단계의 데이터로부터 비교 데이터를 생성하고, 상기 비교 데이터를 기초로 세포 및/또는 세포 군체를 선택하고, 위치 데이터를 위치 데이터베이스로부터 수집 유닛으로 전송한다.

Description

세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거를 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR AUTOMATED REMOVAL OF CELLS AND/OR CELL COLONIES}

본 발명은 세포 및/또는 세포 군체(cell colonies)의 자동 제거를 위한 방법과 그 방법의 이용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법의 실행을 위한 장치에 관한 것이다.

생물학적 또는 의학적 연구, 보건 업무의 체계 내에서, 세포 배양에 있어 세포 및/또는 세포 군체의 분류 및 선택은 극히 다양한 기준을 참조로 하여 수행되어야 한다. 그와 동시에, 세포 및/또는 세포 군체는 특정하여 선택된 후 다른 샘플 용기나 세포 배양물 내로 옮겨져야 한다.

지속 성장하고 있는 생물 공학과 의학적 연구 시장의 현재 특징은 수동적인 것에 크게 의존하는 세포 배양 선택 및 관리로부터 특정 기준을 참조로 세포 선택 및 분리를 행하는 부분 및 완전 자동화 시스템으로의 변화에 있다. 이 분야에 있어 변동성이 큰 특성과 그에 따른 거동을 갖는 크게 상이한 세포형(cell types)에 기인하여, 세포형에 적합한 특별한 해법이 많이 개발되고 있다.

이 분야에서 대학과 상업적 연구의 영역에서 사용되는 세포열(cell lines)은 연구 과업의 변화에 따라 변화되는 것이 빈번하기 때문에, 특별한 용도만을 갖는 이들 고가의 장치의 구입은 소규모 연구팀에게는 경제적 관심사가 아니다.

이제까지는 배지(media)로부터 입자(particles)의 제거를 위해 상업적으로 구매가능한 다양한 플라스틱 팁을 사용하거나, 고착성의 배지로부터 입자를 채취하기 위해 확장 개구를 갖는 특별한 플라스틱 팁을 사용하거나, 스크레이핑(scraping; 박리)에 의해 다른 크기의 강력 고착된 입자를 채취하기 위해 금속 모세관을 사용하거나, 작거나, 비고착성 또는 거의 비고착성인 입자의 분리를 위해 어댑터에 삽입되는 유리 모세관을 사용하는 것에 의해 실제적 도구화가 수행되어 왔다.

이러한 작업의 자동화를 위한 상대적으로 범용의 사용 가능한 장치는 강력 고착된 세포와 세포 군체의 분리와 배양 관리 용도로 유용하지 않다. 주요 문제는 세포가 샘플 용기에 강력 고착되는 것이다. 예컨대, 독일 특허 문헌 DE 197 42 163 C2에 설명된 방법으로서, 샘플 용기로부터 세포막의 결합을 해제시키기 위한 효소의 사용으로 표적 복제(targeted cloning)를 행하는 공지된 방법은, 원하는 효과가 발휘되기 전에 효소의 작용 시간이 너무 짧다는 이유와, 또한 효소의 사용에 의해 야기되는 세포막에 대한 손상에 의한 세포사(cell death)와 생명력의 심각한 저하에 기인하여 실패한 바 있다. 따라서, 이러한 세포의 표적 선택의 자동화는 공지된 방법으로는 가능하지 않다. 이러한 문제점들은 줄기 세포 연구 분야에서 특히 생기는 문제점이다.

지금까지는 다른 직경의 스테인레스 강제(鋼製) 스크레이핑 삽입관(scraping cannulas), 원추형 어댑터에 접착된 유리 또는 금속의 스크레이핑 삽입관, 또는 소직경의 세라믹제 스크레이핑 삽입관에 의해 실제적인 도구화가 수행된 바 있다.

샘플의 오염 방지를 위한 멸균에 대한 통상의 높은 요구 조건에 기인하여, 사용되는 삽입관은 매 분리 사이클 후에 통상 교환하여야 한다. 높은 작업량의 경우, 이는 빈번히 발생하는 문제이므로 수동 작업은 합당하지 않다.

특히 세포 클론(clones)과 개별 세포의 분리, 격리(isolation) 및 처리를 위한 반자동 공정의 기계적 장치 및 로봇 시스템이 이미 다수가 공지되어 있다.

예를 들면, 독일 특허 문헌 DE 10 2004 027 661 A1은 세포 클론과 개별 세포의 격리 및 처리를 위한 로봇 시스템의 구동 구성체를 제시하고 있다. 상기 구동 구성체는 상이한 2-축 방향으로 이동 가능하고 분리 도구를 샘플로 이동시킬 수 있는 모터-구동식 슬릿을 구비한다.

독일 특허 문헌 DE 10 2004 046 740 A1은 세포 클론의 자동 격리 및 처리를 위한 툴(tool) 헤드를 기술하고 있다. 이 툴 헤드는 클로닝 돔(cloning dome)을 수용하는 피펫(pipette)을 수용하는 역할을 한다. 엇갈림 배치된 판 스트링(leaf spring)에 기인하여 상기 피펫 팁과 클로닝 돔 사이는 확정된 힘으로 폐쇄 가능하다.

독일 특허 문헌 DE 197 42 163 A1은 제거 중 세포 및/또는 세포 군체를 둘러싸고 상기 세포 및/또는 세포 군체를 용기로부터 구속 해제시키는 수세(rinsing) 공정이 내부에서 행해지는 클로닝 돔을 기술하고 있다. 상기 수세에 의해 구속 해제되는 세포 및/또는 세포 군체는 클로닝 돔을 통해 가스 흡인한다.

예컨대, 유럽 특허 문헌 EP 1 502 649 A1에는 동물 세포 군체를 채취하는 자동화된 방법이 개시되어 있다. 세포 배양물은 광학 소자로 스캐닝하여 세포 배양물의 화상 데이터가 생성된다. 이들 화상 데이터는 화상 처리 장치로 전송된다. 화상 처리 장치에서는 화상 데이터를 이용하여 형상 인식이 행해진다. 동시에, 세포 및/또는 세포 군체의 위치 데이터가 검출된다. 그렇게 결정된 위치 데이터는 위치 데이터베이스에 저장된다. 위치 데이터는 다시 위치 데이터베이스로부터 수집 유닛(harvesting unit)으로 전송된다. 상기 수집 유닛은 이전 결정된 위치 데이터에 따라 담체(carrier) 상에 고착된 세포 배양물의 공간적 위치로 이동된다. 다음, 세포 및/또는 세포 군체는 세포 배양물의 공간적 위치에서 상기 수집 유닛에 의해 채취된다. 채취 헤드 내의 중공의 바늘은 세포 배양물로부터의 흡인에 의해 세포 군체를 채취한다. 수집 유닛은 채취된 세포 및/또는 세포 군체를 목적지로 운반한 후 세포 및/또는 세포 군체를 거기에 침착시킨다.

유럽 특허 문헌 EP 1 754 537 A1은 세포 군체의 밝기가 요구되는 단백질의 함량에 대응하도록 세포 군체가 표지된 단백질에 접촉되는 동물 세포 군체의 선택 및 채취 방법을 기술하고 있다. 다음, 상기 세포 군체는 상기 밝기에 의해 선택된다.

그러나, 공지된 방법의 경우, 세포 군체의 위치 또는 특정 성질의 세포 군체만이 검출된다.

그러므로, 본 발명의 목적은 검출된 세포 및/또는 세포 군체로부터 특정 성질의 세포 및/또는 세포 군체를 선택하는 것이다.

상기 목적은 세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거를 위한 청구항 1의 특징을 갖는 방법과 청구항 27의 특징을 갖는 세포 및/또는 세포 군체의 제거 장치에 의해 달성된다. 종속 청구항들은 상기 방법 또는 장치에 대한 유리하거나 유익한 실시예와 특징을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 물질적인(corporeal) 및/또는 물리적인(physical) 파라미터를 참조로 세포 및/또는 세포 군체를 선택하고, 그 선택된 세포 및/또는 세포 군체의 위치 데이터를 검출하고, 그 검출된 위치 데이터를 위치 데이터베이스에 저장하는 제1 검출 단계를 수행하는 것에 의해 세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거를 포함한다.

이후, 세포 및/또는 세포 군체의 적어도 하나의 추가 파라미터를 검출하는 적어도 하나의 제2 검출 단계가 수행되며, 상기 제1 검출 단계의 데이터와 상기 제2 검출 단계의 데이터로부터 비교 데이터가 생성되며, 세포 및/또는 세포 군체는 상기 비교 데이터를 참조하는 것에 의해 선택되며, 상기 위치 데이터는 위치 데이터베이스로부터 수집 유닛으로 전송된다.

화상 처리 중에 상기 제1 검출 단계의 수행을 위해, 물질적 및/또는 물리적 파라미터, 특히 표면적, 크기 및/또는 외형 및/또는 스펙트럼 파라미터, 특히 밝기 및/또는 형광 강도(Fluorescence Intensity: FI)가 검출된다. 이러한 파라미터들은 요구하는 세포 및/또는 세포 군체의 식별을 위한 기준으로서 사용될 수 있고, 검출된 화상 정보의 이미지 포인트로부터 비교적 간단하게 도출될 수 있다.

상기 제2 검출 단계는 추가의 파라미터에 대하여 상기 이미 식별된 세포 및/또는 세포 군체의 조사를 위해 상기 스캐닝과 형상 인식 이후에 세포 및/또는 세포 군체의 추가 조사를 위해 도입된다. 이러한 분석 도중에, 스캐닝은 더이상 산란판(scattering plate) 전체에 대해 행해지지 않고, 형상 인식에서 관심 대상의 물질이 발견된 영역에 대해서만 행해진다. 이것은 실행 시간과, 형광 분석의 경우, 세포 및/또는 세포 군체에 대한 형광빛의 조사 시간을 최적화시키는데, 이때 상기 형광빛의 파장은 샘플의 표백 방지를 위해 가능한 한 단파장이어야 한다.

따라서, 본 발명의 기본적 사상은 복수의 특정 성질을 갖는 세포 및/또는 세포 군체를 세포 배양물에 위치시키고, 원하는 성질에 따라 이들을 선택, 채취 및 추가 처리하는 자동화된 다단계 공정에 있다.

유리한 실시예에서, 세포 배양물의 용기를 위한 지지대로서 xy 테이블이 제공된다. 이 경우, 세포 배양물의 스캐닝과 수집 장치의 접근은 상기 xy 테이블의 이동에 의해 실행된다. 그에 따라, 이 과정에서 상기 xy 테이블은 세포 배양물을 일련의 이미지가 기록 및 처리되는 개별 좌표점을 통해 화상 획득 유닛 아래로 점진적으로 가이드한다. 그런 다음, 식별된 위치는 상기 xy 테이블이 세포 배양물을 그 세포 배양물이 대응하는 좌표 위치 위에 위치되게 수집 유닛에 대해 변위시키도록 상기 수집 유닛에 의해 대응하는 방식으로 접근된다. 결국, 이미지 획득을 위한 고가의 변위 및 조정 기구와 수집 유닛을 제외하고 오직 하나의 조정 기구만이 양자의 처리 섹션에 필요하게 된다.

바람직하게, 세포 배양물의 부분 이미지가 스캐닝 중에 기록되고, 그 부분 이미지를 참조로 하여 상기 제1 및/또는 제2 검출 단계가 수행된다. 이것은 필요로 하는 화상 저장 장치와 검출 중의 화질과 관련하여 주요한 장점을 구성한다. 부가적으로, 소프트웨어적인 측면에서 불변(unchanged)인 화상 데이터와 그에 따른 물리적으로 가능한 최적의 해상도 및 화상 충실도에 대해 화상 인식이 이루어질 수 있다. 설정 배율에서 최대 해상도로 작동하는 것도 가능한 반면, 추가로 후술되는 결합된 이미지의 분석시, 화상 데이터의 양을 프레임 내에 유지하기 위해 확대 줌밍(zooming)이 통상 사용된다.

이에 대한 대안적인 방안으로, 세포 배양물을 커버하는 부분 이미지 전체가 스캐닝 처리 단계 중에 유리하게 기록된다. 이 경우, 부분 이미지의 화상 데이터가 화상 처리 유닛에 결합되어 세포 배양물의 개괄적(전체) 이미지의 화상 데이터를 형성한다. 이러한 과정은 현미경 이미징의 상태에서는 세포 배양물 중 하나의 섹션만이 검출될 수 있는 반면, 세포 배양물의 영역에서 세포 또는 세포 군체의 절대 위치는 후속하는 제거를 위해 반드시 알고 있어야 하므로 유익한 과정이다. 이러한 상태에서, 세포 배양물의 개괄적 이미지는 본질적으로 부분 이미지의 모자이크로 이루어진다.

위치 데이터의 검출 중에, 식별된 형상의 형상 무게 중심이 형성된다. 이 경우, 형상 무게 중심의 좌표는 식별된 형태에 대한 위치 데이터로서 위치 데이터베이스에 저장된다. 검출된 형태 또는 형상과 관련하여, 이러한 유익한 과정은 상대적으로 작은 데이터 양으로 그 위치를 정의한다. 이 경우, 하나의 형태에 속하는 이미지 포인트들은 합성되어, 결정된 세포 또는 세포 군체의 위치를 특정하는 기준 이미지 포인트를 형성한다.

형상 인식과 위치 데이터의 검출은 식별된 형상 간의 거리의 결정을 포함하는 것이 유리하다. 본 발명의 본 실시예에 따라, 무엇보다도 검출된 세포 또는 세포 군체가 여전히 검출된 그룹에 속하는지 또는 검출된 세포나 세포 군체가 개별적으로 제거되어야 하는지가 특정될 수 있다. 이 경우, 특히 결정된 위치 데이터에 인접한 세포 또는 세포 군체가 한번의 액세스로 제거될 수 있는 범위가 주어진 수집 도구에 대해 고려될 수 있다. 보다 멀리 떨어진 세포 또는 세포 군체는 개별적으로 접근되어야 한다.

위치 데이터의 스캐닝, 형상 인식 및/또는 검출 중에, 화상 데이터는 모니터 상에 유익하게 실시간 디스플레이된다. 이에 따라, 전체 공정을 모니터링하고 필요한 경우 조정할 수 있다.

제2 검출 단계는, 다양한 파라미터들이 검출되고 개별 단계에서의 파라미터들이 상이한 노출형(types of exposure)으로 기록되는 다수의 임의의 개별 단계로 이루어진다. 따라서, 제2 검출 단계에서는 다수의 상이한 형광 채널과 여기 파장이 스캐닝되고 평가될 수 있다. 이 경우, 소프트웨어는 화상 데이터보다 데이터 집중도가 덜한(less data-intensive) 입자 데이터를 수집할 뿐이다.

본 발명의 유리한 실시예에서, 세포 및/또는 세포 군체의 선택은 제1 상호 작용(interactive) 선택 리스트에 의해 물질적 및/또는 물리적 파라미터들을 참조로 행해진다. 세포 및/또는 세포 군체의 선택은 제2 상호 작용 선택 리스트 또는 상호 작용 산포도(scatter diagram)에 의해 비교 데이터를 참조로 행해진다. 상기 산포도에서, 2개의 상이한 입자값이 결과 리스트로부터 서로에 대해 이미지화된다. 세포 및/또는 세포 군체의 자동화된 선택은 상기 상호 작용 선택 리스트 또는 상기 상호 작용 산포도에 기인하여 가능하다.

상기 제1 상호 작용 선택 리스트는 제1 검출 단계로부터의 데이터 및/또는 화상 데이터와 형상 무게 중심의 좌표를 적어도 포함한다. 상기 제2 상호 작용 선택 리스트는 제2 선택 단계와 제1 선택 리스트로부터의 데이터 및/또는 비교 데이터를 적어도 포함한다. 선택 리스트의 도움으로, 위치 데이터베이스를 수동으로 관찰하고, 자동 확인된 세포 또는 세포 군체의 체크 및 선택이 가능하다. 결국, 선택 에러는 수정될 수 있다. 또한, 이들 데이터의 저장은 화상 데이터의 저장에 비해 덜 복잡하다.

세포 및/또는 세포 군체의 선택은 로직 필터에 의해 행해짐이 바람직하다. 그에 따라, 세포 및/또는 세포 군체는 개별 형광체 또는 명시야(bright field) 신호의 존부에 의해 논리적으로 필터링될 수 있다.

용기 바닥에 부착된 고착성 세포 배양물에서 세포 및/또는 세포 군체의 채취는 다음의 유익한 단계에 따라 수행된다: 우선, 팁을 취하여 팁에 효소 또는 용매를 충전한다. 다음, 클로닝 돔(cloning dome)을 취하여 세포 및/또는 세포 군체를 클로닝 돔으로 둘러싼다. 다음, 상기 팁에 수용된 효소 또는 용매를 팁으로부터 클로닝 돔의 내부로 분산시킨다. 그에 따라, 클로닝 돔은 수세되어 세포 및/또는 세포 군체를 구속 해제(분리)시킨다. 이후, 세포 및/또는 세포 군체를 흡인하게 된다.

강력 고착된 세포 배양물에서 세포 및/또는 세포 군체의 채취는 다음의 유익한 단계에 따라 행해진다:

우선, 삽입관의 팁에 세포 및/또는 세포 군체를 수용한다. 다음, xy 평면에서 삽입관 팁을 상대 이동시켜 세포 및/또는 세포 군체를 박리시킨다. 이후, 박리된 세포 및/또는 세포 군체를 삽입관 내로 채취한다. 이러한 과정은 세포 또는 세포 군체가 기제(base)에 강력 고착되고 용매나 효소에 의한 구속 해제가 세포나 세포 군체에 대한 파괴나 손상의 위험성을 크게 증가시킬 수 있을 때 추천된다.

대안적인 실시예에서 삽입관 팁 및/또는 xy 테이블의 상대 이동은 삽입관 팁에서의 흡인 및/또는 수세 공정과 결합된다. 이것은 줄기 세포의 채취시 특히 유익하다.

원하는 바의 결정된 세포 및/또는 세포 군체나 및/또는 군체의 부분 영역을 삽입관 튜브에 수용하고, 크로스 테이블 상에서 샘플 용기 및/또는 툴(tool)의 상대 이동으로 샘플 용기의 바닥으로부터 구속 해제하여 삽입관 내로 채취하면, 대응하는 세포 및/또는 군체는 종래의 방법에 비해 상당히 짧은 시간과 실질적으로 보다 부드러운 방식으로 분리될 수 있다. 세포의 특정 종류에 대한 이들 공정의 자동화는 본 발명의 방법을 사용하는 것에 의해 최초로 가능하다.

강력 고착된 세포의 분리를 위한 이러한 새로운 종류의 기술을 적용하는 주요 분야는 동물과 인간의 줄기 세포 분야의 연구이다. 고형 세포 그룹(세포 론(lawns))의 영역으로부터 표적화된 분리도 본 발명의 방법에 의해 가능하다.

따라서, 세포 군체의 부분 영역(예, 기 분화된(already-differentiated) 줄기 세포로 둘러싸인 미분화된(undifferentiated) 줄기 세포)의 표적화된 분리도 자동화된 방식으로 가능하다.

종래의 진동법(oscillating methods)에 비해, 전술한 박리 방법(scraping method)은 진동에 기인하여 개별 세포가 군체 그룹으로부터 제어 불가 상태로 분리되는 바람직하지 않은 현상이 거의 일어나지 않는다는 장점을 더더욱 갖는다. 수집되는 군체의 구조는 여전히 확실하게 보존된다.

반고형의 영양 기질, 특히 우무(agar) 또는 메틸 셀룰로오스로부터 세포 및/또는 세포 군체를 채취하기 위해 다음의 단계들이 유익하게 수행된다:

우선, 팁을 취한다. 다음, 팁을 세포 및/또는 세포 군체 위에 위치시키고 팁으로 세포 및/또는 세포 군체를 포위한다. 다음, 세포 및/또는 세포 군체와 세포 및/또는 세포 군체 주위의 영양 기질을 팁 안으로 흡인한다.

위치 고정된 개별 세포는 다음의 단계에 따라 유익하게 채취된다:

제1 단계에서, 모세관에 유체, 특히 공기 또는 액체를 보정된 양으로 충전시킨다. 모세관 개구를 개별 세포 및/또는 개별 군체 위에 위치시킨다. 개별 세포 및/또는 개별 군체 근처의 배지(medium)를 모세관 내로 흡인하며, 이 경우 개별 세포 및/또는 개별 세포 군체는 모세관 내로 채취된다.

유익한 변형례에서, 보정된 양의 유체를 모세관에 충전하는 것은 화상 처리 유닛에서 화상 데이터 평가와 함께 모세관의 이미지 획득을 수반한다.

삽입관 또는 모세관인 팁의 사용 가능한 직경을 초과하는 크기의 세포 군체는 분할하여 연속적으로 수집되는 것이 바람직하다. 이 방식으로, 비교적 큰 세포 군체도 수집 가능하다.

대안적으로, 삽입관 또는 모세관인 팁의 도움으로 세포 군체로부터 개별 부분이 분리된다. 이 방식으로, 특정 성질을 갖는 세포 군체의 영역은 다른 영역으로부터 분리 수집될 수 있다. 이러한 방법은 분화된 줄기 세포에 의해 둘러싸인 미분화 줄기 세포의 수집에 특히 적합하다.

추가의 대안적 실시예에서, 고형 세포 그룹으로부터 개별 부위가 분리된다. 이 방식으로, 원하지 않는 특성의 부위로부터 소망의 특성을 갖는 특정 부위를 분리할 수 있다.

침전(settling)에 의해 분류되는 세포 및/또는 세포 군체는 침착 용기(depositing container)에 침착되는 것이 바람직하고, 그 침착된 세포 및/또는 세포 군체의 위치 데이터는 검출 및 처리된다. 따라서, 수집된 세포 및/또는 세포 군체가 항목(밀도, 형광 등)에 따라 분류되는 침착 용기에 침착되는 것이 가능하고, 이는 하류 방향 공정(downstream process)에 유용할 수 있다. 또한, 각각의 수집 공정 이후, 화상 처리 소프트웨어는 로봇 제어기가 세포 및/또는 세포 군체를 침착 완료한 용기와 그 용기의 위치에 관한 정보를 수신하여 전체 공정의 완전한 기록(logging)을 보장한다.

본 발명의 방법은 줄기 세포, 생물학적 및/또는 화학적 입자나 고형물, 특히 비드(bead)를 제거하는데 사용되는 것이 바람직하다.

세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체를 제거하기 위한 장치는 세포 배양물 내의 세포 및/또는 세포 군체의 위치를 검출하는 화상 획득 유닛 및 화상 평가 유닛과, 상기 세포 및/또는 세포 군체의 검출된 위치를 저장하는 제어 및 저장 유닛과, 상기 세포 및/또는 세포 군체의 검출된 위치에서 상기 세포 및/또는 세포 군체를 제거하는 제거 툴(tool)을 갖는 수집 유닛과 조합되어 상기 세포 배양물의 현미경적 스캐닝을 위한 현미경 유닛을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 장치의 제공은 완전히 다른 복수의 세포형을 단일의 장치로 처리할 수 있는 방법을 지시하여야 한다. 이를 위해, 상기 모듈형 장치에 상이한 도구와 소프트웨어 시퀀스를 장착하는 것이 가능하다.

독일 특허 문헌 DE 10 2004 027 661에 따른 구동 기구와 독일 특허 문헌 DE 10 2004 046 740에 따른 툴 헤드에 사용되는 세포형별 제거 헤드를 갖는 이들 장치는 광범위한 개별 세포와 세포 군체를 분리하기 위해 자동화된 세포 수집에 사용되는 여러 방법을 실시할 수 있다.

이들 방법에서, 클론 또는 입자의 구속 해제 및/또는 채취를 위해 다른 크기, 형상 및 소재의 모세관이 통상적으로 사용된다.

이들 다른 형태의 삽입관을 위하여 주로 표준 어댑터를 제공하는 것에 의해 광범위한 적용을 위한 동일한 툴을 주로 사용할 수 있으며, 이는 비용 효율을 높이고 개발 비용 및 개발 시간을 크게 줄여준다.

상기 장치의 일 실시예에서, 제거 툴은 용해액 또는 효소액을 충전시킬 수 있는 팁과, 상기 팁에 결합될 수 있고, 선택된 세포 및/또는 세포 군체를 커버하며, 상기 팁 내부에 수용된 상기 액을 충전할 수 있는 클로닝 돔과, 상기 팁과 상기 클로닝 돔을 위한 로딩 및 흡입 기구로 이루어진다.

다른 실시예에서, 제거 툴은 다른 직경의 삽입관들의 구성을 내장한 매거진 형태로 제공되며, 상기 매거진으로부터 삽입관의 자동 제거 및 그것의 결합을 위한 커플링 유닛이 교환 가능한 헤드에 제공된다.

상기 삽입관은 다른 크기, 형태 및/또는 소재로 형성되는 것이 바람직하다. 그에 따라, 수집 대상의 세포 및/또는 세포 군체의 특성에 적합화되는 것이 가능하다.

이들 및 다른 방법은 사용 가능한 삽입관의 범위를 보완하는 것에 의해 장차 실시 가능하며, 그에 따라 툴에 대한 약간의 기계적 변형과 시퀀스 소프트웨어에 대한 적합화에 의해 큰 기술 개발 비용없이 보다 광범위한 어플리케이션이 개발될 수 있다.

추가의 실시예에서, 그 선단부가 확장된 단면 형상인 흡입 팁을 갖는 제거 툴이 제공된다.

마지막으로, 추가의 유익한 실시예의 제거 툴에는 삽입관과, 상기 삽입관에 수용된 다량의 유체를 모니터링하는 화상 기록 기구와, 상기 삽입관의 화상 정보를 처리하는 화상 처리 기구와, 세포 및/또는 세포 군체를 상기 삽입관 내로 흡입하는 흡입 기구가 제공된다.

이하 예시적인 실시예들을 참조로 하여 상기 방법과 장치를 상세히 설명한다. 첨부 도면은 예시를 목적으로 제공된다. 동일 참조 번호는 동일 부분이나 동일 효과를 갖는 공정 단계에 사용된다.

도면에서:

도 1은 예시적인 일 실시예의 방법을 실시하는 장치를 도시하며,

도 2는 팁과 클로닝 돔을 구비하는 예시적인 제거 툴을 도시하며,

도 3은 다수의 삽입관과 어댑터를 갖춘 툴 헤드를 구비한 예시적인 삽입관 매거진을 도시하며,

도 4는 선단부가 확장된 단면 형상인 예시적인 흡입 팁에 대한 2가지 실시예를 도시하며,

도 5는 보정을 위한 화상 기록 기구를 갖는 예시적인 모세관을 도시하며,

도 6은 부분 이미지를 기록하고 그 부분 이미지를 결합하여 전체 이미지를 형성하는 것을 포함하는 제1 공정 단계를 도시하며,

도 7은 세포와 세포 군체에 대해 선택된 예시적인 부분 이미지를 도시하며,

도 8은 선택된 세포 및 세포 군체의 개략적 형상 인식을 도시하며,

도 9는 식별된 세포 및 세포 군체의 개략적 형상 무게 중심과 위치 좌표를 도시하며,

도 10은 본 발명의 장치를 사용한 자동 세포 수집의 기본적 시퀀스의 예시적인 흐름도를 도시한다.

도 1은 세포 및/또는 세포 배양물을 제거하기 위한 장치의 예시적인 실시예 를 도시한다. 상기 장치는 다수의 광학 성분, 특히 편광 프리즘(1a)과 빔 유도 및 현미경적 이미지화를 위한 렌즈계(1b)를 구비하는 구성을 갖는 현미경 유닛(1)을 포함한다. 상기 현미경 유닛(1)은 통상 CCD 카메라 또는 CCD 어레이인 화상 기록 유닛(2)에 결합된다. 상기 화상 기록 유닛(2)으로부터 판독되는 화상 정보의 처리를 위해 화상 평가 유닛(3a)이 제공된다. 상기 화상 처리 유닛(3a)은 화상 처리 소프트웨어가 구동되고 있는 개인용 컴퓨터(PC)(3)로 이루어진다. 제어 및 저장 유닛(4)이 더 제공되는데, 이 유닛은 개인용 컴퓨터(3)에 일체화되고, 그 기능은 추가의 소프트웨어 성분에 의해 실시된다. 상기 제어 및 저장 유닛(4)은 모니터 또는 디스플레이(4a)를 구비한다.

상기 장치는 변위 메커니즘 상에 설치되는 수집 모듈(5)을 더 포함한다. 상기 변위 메커니즘은 리프팅 칼럼(5a)과 변위 드라이브(5b)로 이루어진다. 상기 리프팅 칼럼(5a)과 변위 드라이브(5b)는 보다 큰 변위 거리를 위해 구성되며, 수집 모듈(5)을 샘플 용기 내에 위치된 세포 배양물(8) 측으로 이동시키고 수집 모듈(5)의 대략적 조정과 제거된 세포 및/또는 세포 군체의 대응하는 분리 스테이션 측으로 제거 툴(10a)을 이동시키기 위해 사용된다.

전술한 현미경 유닛(1)은 투과 현미경으로서 구성된다. 이를 위해, 전환 가능한 일련의 조명 필터(7)를 갖는 조명(6)이 제공된다. 상기 조명(6)은 샘플 용기 내의 세포 배양물(8)을 투과 조명한다. 상기 세포 배양물(8)은 xy 테이블(9)의 형 태의 지지대 상에 고정되며, xy 테이블에 의해 세포 배양물(8)은 조명(6)과 그 하부의 편광 프리즘(1a)으로 구성된 광학 구성 아래의 x 및 y 방향으로 수 마이크로미터의 현미경적 조정의 정확도로 이동될 수 있다. 이 경우, xy 테이블(9)의 조정 좌표는 상기 제어 및 저장 유닛(4)으로 전송되거나 제어 및 저장 유닛(4)에 의해 조정된다.

상기 현미경 유닛(1)은 모터 구동식 xy 테이블(9)을 갖춘 상업적으로 구매 가능한 현미경 스탠드로 이루어진다. 선택적으로, 이러한 현미경 유닛(1)은 상업적으로 구매 가능한 형광 기구도 장착할 수 있다. 상기 형광 기구는 최대 3개의 필터 큐브(여기 필터, 2색 미러 및 방출(emission) 필터로 이루어짐)를 수용할 수 있으며, 상업적으로 구매 가능한 가스 버너 또는 유리 섬유로 연결된 외부 조명(6)에 의해 조명될 수 있다. 형광 기구 내의 대응하는 트리플(triple)- 또는 쿼드-밴드(quad-band) 필터 큐브로 형광 물질을 동시에 스캔하기 위해 방출 필터를 조명(6) 앞의 모터 구동식 필터 휠 내로 배치하는 것도 가능하다. 또한, CCD 칩을 갖는 화상 기록 유닛(2)은 샘플의 스캐닝이 가능한 현미경 유닛(1) 상에 설치된다. 상업적으로 구매 가능한 위상차 슬라이더(phase contrast sliders)를 사용하는 것에 의해 물리적으로 최적인 위상차 조명이 가능하다.

상업적으로 구매 가능한 개인용 컴퓨터는 네트워크 접속을 통해 기초 장치(basic device)에 연결된다. 이 컴퓨터 상에는 상업적으로 구매 가능한 표준 화 상 처리 소프트웨어가 구동되며, 상기 화상 처리 소프트웨어는 그 소프트웨어를 위해 특별히 프로그래밍된 로봇 제어기 및 특별히 개발된 모듈과 함께 상기 장치의 구동과 화상 데이터의 분석을 행한다.

xy 테이블(9)의 이동과 관련하여 후에 상술되는 바와 같이, 세포 배양물의 전체 영역이 스캔되고, 그에 따라 세포 배양물의 다수의 현미경적 개별 이미지가 화상 검출 유닛에 의해 기록된다.

xy 테이블의 이동은 식별된 세포 또는 세포 군체의 제거를 위해 세포 배양물을 위치시키는 역할도 한다. 이를 위해, xy 테이블이 식별된 세포 및 세포 군체의 이전에 결정된 위치로 조정되어 수집 모듈(5)로 하여금 세포 또는 세포 군체를 제거할 수 있도록 하는 한편 수집 모듈(5)은 변위 메커니즘에 의해 세포 배양물(8) 위로 위치된다.

샘플 용기 내에 위치된 세포 배양물(8)로부터 세포 또는 세포 군체를 제거하는 것은 제거 툴(10a)을 세포 배양물(8) 내로 하강시키고, 세포 또는 세포 군체와 그 분리물을 채취하는 것을 필요로 한다. 이를 위해, 제거 모듈(5)은 하강 또는 흡입 메커니즘을 갖춘 툴 헤드(10)를 구비한다. 상기 제거 툴(10a)은 툴 헤드의 단부에 위치된다. 채집된 세포 또는 세포 군체는 분리용 전지(11)에 침착된다. 이것은, 리프팅 칼럼과 변위 드라이브에 의해 개별 구동될 수 있고 제거된 세포 및 세포 군체가 상기 툴 헤드에 의해 침착될 수 있는 테스트 튜브 또는 튜브의 열로 이루어진다.

또한, 상기 분리용 전지는 후에 상술되는 바와 같이 원하는 대로 툴 헤드(10)에 결합될 수 있는 제거 툴(10a)의 제공을 위한 매거진으로서 분할 구성될 수도 있다.

기본적으로, 본 명세서에 기술되는 기능은 저장 및 제어 유닛(4)에 의해 제어되며, 실질적으로 완전 자동화되어 실시된다. 그러나, 모니터나 디스플레이 상의 기능의 모니터링에 기인하여 사용자는 키 패드와 마우스와 같은 공지의 입력 수단과 저장 및 제어 기구 내부에서 구동하는 소프트웨어 성분에서의 대응하는 사용자 인터페이스에 의해 상기 기능에 영향을 미치는 여러 가지 가능성을 가지고 있다.

따라서, 특히, 현미경 기구의 제어에 액세스하는 것에 의해 증폭도(magnification factor)의 조정과 화상 기록 기구의 해상력의 변화가 가능하다. 또한, 조명과 조명 필터의 제어에 의해, 스펙트럼 범위의 변조가 가능하거나 현미경 기구의 형광 또는 암시야(dark field) 동작으로의 전환이 가능하다.

또한, 현미경 유닛에 의해 결정된 개별 세포 또는 세포 군체가 메뉴-제어되 는 방식으로 선택되고 분리용 전지(11)의 특정 위치로 할당될 수 있도록 수집 모듈(5)의 작동이 가능하다. 또한, 선택된 세포 또는 세포 군체에 따라, 선택된 세포를 소정의 방식으로 제거하기 위해 툴 헤드(10)의 원추형 리셉터클(32)로부터 특정의 제거 툴(10a)을 취할 수 있는 수집 모듈의 작동 모드가 선택될 수 있다.

이점으로부터, 각각의 경우에 선택된 분리 방법에 따르면, 상이한 제거 툴(10a)이 상이한 삽입관(15, 18) 및/또는 모세관과 상이한 시퀀스의 도움으로 입자를 분리하고 이를 대응하는 타겟 용기 내로 전달하는 동작을 행하게 된다. 이들 방법은 이후 상술된다.

제거 툴(10a)은 드라이드 구성부의 상단부에 위치되며, 어플리케이션에 따라 자유롭게 변경될 수 있다. "효소를 사용한 고착성 세포 군체 수집", "효소를 사용하지 않고 스크레이핑에 의한 고착성 세포 군체 수집", "우무(agar)로부터의 수집", "메틸 셀룰로스로부터의 수집", "위치 고정된 개별 세포로부터의 수집" 등의 어플리케이션을 위해 5개의 상이한 제거 툴(10a)이 사용될 수 있다. 이들 제거 툴(10a) 모두는 제거 툴(10a)이 적소에 배치될 때 개인용 컴퓨터 소프트웨어가 정확한 어플리케이션을 자동 실행하고 정확한 소모 용품(consumables)을 공급 리셉터클로 공급하도록 어플리케이션-특정 소프트웨어 파트가 제거 툴(10a)에 직접 장착되는 공통점을 갖는다. 툴 헤드(10)로서 일부의 제거 툴(10a)에 사용되는 구조의 경우, 독일 특허 문헌 DE 10 2004 046 740 을 참조한다. 이하 전술한 개별 어플리 케이션에 대하여 설명한다.

모든 어플리케이션은 스캐닝 및 분석 공정이 동일한 방식으로 행해진다는 공통점을 갖는다. 상기 공정은 어플리케이션과 그에 따른 입자의 수집 또는 채취 중에 사용되는 제거 툴(10a)에 따라서만 상이하다.

효소에 의한 고착 세포 군체의 수집

이 방법은 샘플 용기의 바닥에 고착된 세포 군체의 완전한 분리 또는 부분적 분리에 사용된다(이들 세포종의 경우 세포의 생존과 세포의 증식을 위해 고착이 필요함).

하기에 추가로 설명되는 바와 같이 수집을 위해 위치되는 사용자 관심 대상물의 스캐닝 및 검출의 공정 단계가 수행된다. DE 10 2004 046 740에 따른 툴 헤드는 DE 197 42 163 C3에 따른 클로닝 컵(13)을 취하기 위해 우선 상업적으로 구매 가능한 플라스틱제 팁(12)을 취한 후 이 팁(12)에 각각의 세포형에 맞게 최적화된 (가능하게는 온도 제어된) 효소 또는 용매를 충전하는 것에 의해 수집을 위해 준비된다. 분리 대상의 군체는 이 컵(13)에 담겨지고, 상기 팁(12)으로부터 클로닝 컵(13)의 내부와 그에 따라 관심 대상물로 효소 또는 용매를 대응하는 수세 사이클 및 시간으로 투여하여 결국 팁(12) 안으로 클로닝 컵(13) 내부 부피를 차지하는 것에 의해 원하는 군체는 샘플 용기로부터 분리된 후 다른 샘플 용기로 옮겨져서 거 기에서 처리 및 연구될 수 있다.

도 2는 이러한 목적의 제1 제거 툴(10a)을 도시한다. 특히 용매 또는 효소와 같은 액체를 충전할 수 있는 팁(12)은 클로닝 컵(13)과 결합된다. 여기에 도시된 팁(12)은 단부 콘(12a)을 갖는 피펫 또는 삽입관 형태의 관형 구조로 이루어지는데, 상기 단부 콘은 클로닝 컵(13)의 수납 콘(13a)에 삽입되어 거기에 확실히 결합된다. 상기 팁(12)은 유리하게는 우선 액체를 충전하고 세포 배양물(8) 외측의 클로닝 컵(13)을 수용한다. 그렇게 형성된 팁(12)과 클로닝 컵(13)의 결합체는 세포 배양물(8) 내의 선택된 세포 또는 세포 군체 위에 배치된다. 그런 다음, 팁(12) 내부의 클로닝 컵(13) 안으로 액체가 투여된다. 그렇게 분리된 세포는 클로닝 컵(13)으로부터 팁(12) 안으로 흡입된다. 이러한 제거 툴(10a)은 고착성 세포와 세포 군체, 즉 용기의 바닥에 고착된 세포와 세포 군체에 특히 적합하다. 그에 따라 클로닝 컵(13)은 그 반경에 의해 정해지는 세포 배양물(8)의 부위를 커버한다. 클로닝 컵(13)의 반경은 이 경우 세포 개체군의 밀도에 따라 선택되어야 한다. 클로닝 컵(13)의 특별한 장점은 비교적 한정된 정확도로 전술한 바의 xy 테이블(9)에 의해 실행되는 제거 툴(10a)과 세포 배양물(8) 간의 상대적 위치 설정의 수행이 가능하다는 것이다.

경험상 효소 또는 용매의 작용하에서 세포 구조의 손상이 일어남을 보여주므로 고착성 세포 및 세포 군체의 제거를 위해 세포의 기계적 분리도 이용될 수 있 다. 이를 위해, 선택된 세포 또는 세포 군체는 삽입관(15)의 팁으로 포위된 후 삽입관(15)과 용기의 상대 이동의 결과에 따른 스크레이핑에 의해 기제로부터 분리된다. 인가 강도 또는 고착 강도에 따라, 삽입관(15)은 예컨대, 유리, 플라스틱 또는 금속 등의 다양한 소재로 이루어지며, 내부 직경이 상이하며, 상이한 구성의 복수의 삽입관(15)은 하나의 매거진 내에 용이하게 유지될 수 있다.

멸균도와 작업량에 대한 요구 조건에 따라, 삽입관(15)은 수동 또는 자동으로 변경될 수 있다. 삽입관 매거진(14)은 삽입관(15)의 자동 변경을 위해 사용된다. 도 3은 내부에 다수의 삽입관(15)을 수용하는 삽입관 매거진(14)을 도시한다. 이 구성은 이 목적으로 따로 마련된 도 1에 도시된 분리형 매거진(11)의 일부로서 구성될 수 있다. 이 목적으로 제공되는 교환 가능한 헤드(16)는 삽입관 매거진(14)으로부터 삽입관(15)을 파지하여 추출하기 위한 어댑터(16a)를 구비한다.

교환 가능한 헤드(16)는 삽입관(15) 위로 이동된 후 하강된다. 헤드는 삽입관(15)을 파지한 후 세포 배양물 위로 이동시킨다. 거기에서 xy 테이블(9)이 선택된 세포 또는 세포 군체의 위치로 변위된다. 삽입관(15)은 하강하여 세포를 포위한다. xy 테이블(9)은 비로소 느린 요동 운동을 행하고, 이에 따라 세포를 흡입하는 삽입관(15)에 부압(negative pressure)이 생성된다.

기계적 동작에 의한 강력 고착성 세포 군체(줄기 세포, 공급자 세포(feeder cells) 상의 세포 등)의 수집

이 방법은 샘플 용기의 바닥에 강력 고착된 세포 군체의 완전한 분리 또는 부분적 분리에 사용된다(이들 세포종의 경우 세포의 생존과 세포의 증식을 위해 고착이 필요함).

DE 2004 046 740에 따른 툴 헤드(10)는 제거 툴(10a)로서 삽입관(15)을 사용하는 것에 의해 전술한 툴 헤드(10)와는 다르다. 어플리케이션에 따라, 상기 삽입관(15)은 상이한 소재(플라스틱, 유리, 금속)로 이루어질 수 있고, 수집될 군체의 크기에 따라 내경 및 외경이 상이하다. 멸균도와 작업량에 대한 요구 조건에 따라, 삽입관(15)은 수동으로(통상 수집 공정 사이의 살균 단계와 결합됨) 또는 자동으로 변경될 수 있다(특별한 삽입관(15)은 팁(17)과 유사한 랙(racks)에 제공됨).

하기에 추가로 설명되는 바와 같이 수집을 위해 위치되는 사용자 관심 대상물의 스캐닝 및 검출의 공정 단계가 수행된다. 분리 대상의 군체를 삽입관(15)으로 포위한다(삽입관의 단부는 샘플 용기의 바닥 위에 위치함). 가능하게는 시린지(syringe)의 흡입 및 수세 공정과 결합하여 삽입관(15)을 상대 이동시키는 것(용기 바닥에 포위된 군체의 스크레이핑 및 그에 따른 변위)으로 강력 고착된 군체를 수동으로 분리한다.

상기의 상대 이동은 xy 테이블(9), 제거 툴(10a) 또는 양자를 조합하여 이동시키는 것에 의해 이루어진다. 삽입관(15) 내부의 세포 분해 효소를 추가로 이용하는 것도 가능하다.

군체의 분리 후, 분리 군체는 삽입관(15) 내에 흡입된 후 다른 용기로 전달된다. 이후 삽입관(15)은 어플리케이션에 따라 멸균이 행해지거나 새로운 삽입관(15)이 채택된다. 이후 다음의 군체가 수집될 수 있다.

삽입관(15)을 갖는 이러한 툴 헤드(16)는 다양한 세포형을 위한 효소에 의해 고착성 세포를 수집하기 위한 전술한 팁(12)을 갖는 툴 헤드(10)의 경우 분리와 이에 필요한 시간 도중에 문제점이 발생한 후에 제작된 것이다. 세포의 분리를 위한 효소는 세포막에 작용한다. 강력 고착성 세포의 경우 필요한 과도한 효소량과 과도한 효소 작용 시간은 세포의 손상 또는 파괴를 가져오는 경우가 많다. 그러나, 장치의 주요 어플리케이션은 수집후 추가로 배양되어 증식되는 살아 있는 세포의 분리에 있다. 따라서, 이들 강력 고착성 세포의 분리가 가능하도록 이들 세포형을 위한 자동화 가능한 신규의 방법을 필요로 하였다.

편평한 단부를 가지고 다른 직경 및 소재로 된 삽입관(15)과 이 삽입관(15)을 파지, 분배 및 저장할 수 있는 DE 10 2004 046 740에 따른 원추형 어댑터를 사용하고, 또한 삽입관(15)을 집기 위한 DE 10 2004 046 740에 따른 툴 헤드(10)는 물론, 자동 시퀀스를 갖는 대응하는 장치의 도움으로, 강력 고착성 세포형에 대한 수집을 연속적으로 수행할 수 있다.

삽입관(15)의 사용에 부가하여, 개별 세포 및/또는 세포 군체의 부드러운 분리를 위한 상대 이동의 이용은 본 발명의 또 다른 특징이다. 상기 상대 이동은 삽입관(제거 툴의 이동), 샘플(xy 테이블(9)의 이동), 또는 양자에 의해 행해진다. 각각의 세포종에 따라 방향, 이동 및 속도가 결정된다.

삽입관(15)의 직경의 선택은 분리 대상의 세포 및/또는 군체의 크기를 참조하여 행해진다. 어댑터로서 원추형 리셉터클(32)(독일 특허 출원 DE 10 2004 046 740 참조)을 사용하는 것에 의해, 크게 변화하는 이들 삽입관 크기 및 소재는 동일한 툴로 취급될 수 있다. 특히 소직경 또는 비금속 소재의 특별한 삽입관(15)은 대응하는 원추형 어댑터 내에 접합될 수 있다.

분리형 매거진(11) 내에 세포를 적치하고 선택적으로 멸균 공정을 행한 후, 삽입관(15)은 이제 삽입관 매거진(14) 내에 적치되고 새로운 삽입관(15)이 제거될 수 있다.

이하 공급자 세포를 참조로 본 발명의 방법을 설명한다.

공급자 세포를 채취하는 것으로 공급자 세포의 군체를 수집하는 것은 스크레이프 모듈에 의해 행해진다. 상기 군체는 스크레이프 모듈의 금속 모세관에 의해 완전히 포위되거나, 군체 일부가 금속 모세관에 의해 압인된다. 이를 위해, 수집 중에 금속 모세관을 배양 접시의 바닥에 배치한다. 스크레이프 이동을 이용하여 군체를 둘러싸는 공급자 세포 또는 그 군체 아래에 위치된 공급자 세포를 분리 및 채취한다. 이들 채취물을 타겟 웰(well) 내에 배치한다. 이것은 통상 우려스럽지 않은데, 이는 공급자 세포가 더 이상 분할되어 일정 시간 후 죽는 것이 아니기 때문이다.

공급자 세포를 채취하지 않고 공급자 세포의 군체를 수집하는 것은 유리 모세관으로 행해진다. 이를 위해, 표적으로 하는 군체 위로 0-50㎛ 거리에서의 흡입에 의해 상기 군체의 상부 부위를 채취한다.

상기 군체는 3차원 대상물이므로, 흡입력은 군체의 엣지 영역 또는 군체 외부의 부위가 아니라 배양 접시 바닥에서 멀어지는 방향을 향하는 군체의 상부 부위에만 작용한다. 그에 따라, 채취 대상의 조각의 크기 및 깊이는 모세관 직경, 군체로부터의 거리, 흡입량 및 흡입 속도에 의해 특정되며, 각각의 세포형에 따라 경험적으로 결정되어야 한다. 결국, 주변 공급자 세포나 하부에 배치된 부분이 아닌, 오직 세포 또는 일부의 군체만이 수집된다. 또한, 동일 위치에서의 반복된 채취에 의해 군체 중 다수의 복제물(유전학적으로 동일함) 조각을 수집하는 것도 가 능하다. 이를 위해, 군체로부터 모세관 팁의 거리는 항상 동일한 흡입력을 생성하기 위해 매번 재조정되어야 한다.

반고형 영양 기질(우무, 메틸 셀룰로오스)로부터의 군체 수집:

이 방법은 영양 배지 내부 또는 기제 상에 위치된 세포 군체의 완전 또는 부분적 제거에 사용된다.

하기에 추가로 설명되는 바와 같이 수집을 위해 위치되는 사용자 관심 대상물의 스캐닝 및 검출의 공정 단계가 수행된다. DE 10 2004 046 740에 따른 툴 헤드(10)는 상업적으로 구매 가능한 플라스틱 팁(이전에 단축화됨)에 비해 그 채취 부피와 관련하여 그 선단부의 내경이 큰 것을 특징으로 하는 특별한 플라스틱 팁(17)을 들어 올리는 것에 의한 수집을 위해 마련된다. 상기 팁(17)은 분리 대상의 군체 위에 위치되거나, 군체가 상기 팁에 의해 포위된다. 군체 근처의 영양 배지 또는 특별 팁(17)의 함유물을 흡입하는 것에 의해, 군체는 영양 배지에 흡입된 후 다른 샘플 용기로 운반되고 추가 처리되어 연구될 수 있다.

우무(Agar):

우무로부터의 수집시, 많은 경우, 우무로 둘러싸인 군체 내로의 삽입이면 충분하므로 입자들은 제거 툴(10a)의 팁(17)에 고착되고 이 고착 입자는 영양 배지로 충전된 타겟 웰 내에 수세 제거된다. 따라서, 이러한 용도의 특별한 툴은 입자의 흡입을 위한 n개의 시린지 드라이브를 필요로 한다.

도 4는 그 선단이 확장된 내경을 가지고 반고형 영양 배지, 특히 우무 또는 메틸 셀룰로오스로부터 세포를 제거하는 예시적인 2개의 팁(17)을 도시한다. 상기 팁(17)은 유리 또는 플라스틱으로 이루어지는 것이 유리하다. 상기 팁은 이전에 선택된 세포 위에 위치된 후 하강됨으로써 세포 또는 세포 군체는 팁의 선단 내에 포위된다. 내부 함유된 세포 또는 세포 군체와 더불어 영양 배지는 이후 상기 확장된 팁에 의해 채취된 후 분리형 매거진으로 운반될 수 있다.

위치 고정된 개별 세포의 수집:

이 방법은 샘플 용기의 바닥에 위치되고 대체로 그 위치에 위치 고정되어 있으나 고착되지 않거나 최소한의 정도로만 고착된 개별 세포 또는 작은 세포 군체의 제거에 사용된다.

하기에 추가로 설명되는 바와 같이 수집을 위해 위치되는 사용자 관심 대상물의 스캐닝 및 검출의 공정 단계가 수행된다. 그러나, DE 10 2004 046 740에 따른 툴 헤드(10)는 이 용도로 플라스틱 팁이 아닌 모세관을 채택한다. 이 모세관은 세포형과 어플리케이션 요구 조건에 따라 연결된 시린지 드라이브를 통해 공기 또는 유체가 충전되고, 화상 처리에 의해 보정된 후 그에 따라 수집 공정을 위해 마련된다.

모세관 개구(세포 및 군체의 크기에 따라 직경이 다름)는 분리 대상의 세포 또는 군체 위에 위치된다. 개별 세포 또는 군체 주변의 영양 배지 또는 버퍼를 흡인하는 것에 의해, 원하는 세포 또는 군체가 배지와 함께 채취된 후 다른 샘플 용기로 운반되어 추가 처리되고 연구될 수 있다.

도 5는 위치 고정된 개별 세포의 제거를 위한 삽입관(18)을 도시한다. 이러한 삽입관(18)은 샘플 용기의 바닥에 위치되어 거기에 위치 고정된 방식으로 유지되지만 고착되지는 않는 개별 세포 또는 세포 군체의 제거에 적합하다. 삽입관에는 공기 또는 유체가 충전되며, 삽입관(18)의 유체 높이(18a)는 이미지 획득 시스템(19)에 의해 기록된 후 보정된다. 세포 또는 세포 군체의 제거를 위해, 삽입관(18)의 개구는 세포 또는 세포 군체 위에 위치된다. 세포 위의 영양 배지 또는 버퍼를 흡입하는 것에 의해, 배지와 더불어 이들 세포 또는 군체는 삽입관(18) 내부로 유입된 후 운반될 수 있다. 이 경우, 삽입관 개구의 직경은 세포의 크기에 맞게 적합화될 수 있다.

이 방법과 이후의 다른 방법은 장치의 베이스 플랫폼과 DE 2004 027 661에 따른 그 축방향 시스템을 보완하고 완전한 현미경 광학 기기를 사용하는 것에 의해 실시될 수 있다.

이하 세포 검출 및 화상 처리 공정을 상세히 설명한다.

우선, 사용자는 대응하는 타겟 플레이트, 소모 용품 및 액체와 함께 공급 리셉터클을 적재하고, 현미경 크로스 테이블에, 수집 대상의 세포 배양물이 위치된 시작 플레이트를 장착한다. 이들 플레이트는 화상 처리 소프트웨어에서 자유롭게 정의된 후 보정될 수 있다. 이들 플레이트는 이후 스캐닝될 수 있다.

스캐닝을 위해 테이블은 광학 카메라 시스템의 이미지 섹션에 대응하는 패턴으로 이동된다. 그에 따라, 완전한 플레이트의 내용이 이미지 대 이미지로 스캐닝될 수 있다. 이들 개별 이미지 중 하나가 스캐닝 된 후, 그레이 임계값(grey threshold values) (및 그에 따른 휘도차)를 기초로 입자 검출이 즉시 행해진다. 이러한 검출 이전에 예컨대, 콘트라스트를 최적화하거나 양질의 검출을 위한 이미지 제공을 위해 대응하는 수학적 필터(mathematical filters)를 사용할 수 있다. 이러한 검출은 이미지 대 이미지로, 즉 스캐닝 중에 행해진다. 이 경우, 엣지-중첩 입자는 소프트웨어에 의해 자동으로 식별되고 결합을 통해 하나의 입자를 형성한다. 그러므로, 이러한 방식의 검출은 엣지-중첩 검출로서도 구성된다. 결국, 우선적으로, 식별된 입자가 위치되는 경우와 그렇지 않은 경우의 이진법(binary form)으로 나타나는 소위 입자 맵(map)만이 유지되는 것이다. 따라서, 메모리에는 화상 데이터가 비경제적으로 유지될 필요가 없고, 단지 검출 결과의 맵이 유지된다. 선택적으로, 단축된 크기의 전체 이미지가 생성되고 저장될 수 있다. 이미지 처리를 위한 이미 언급된 필터 외에도, 검출 후 다른 필터를 사용할 수 있다. 따라서, 식별된 입자는 형태학적(형태, 크기 등) 및 질적인 파라미터(밀도, 휘도차 등)와 관련하여 평가 및 필터링될 수 있다. 이 과정은 입자 분석이 가능할 수 있는 저 품질의 전체 이미지가 아닌 100% 해상도로 기록되는 개별 이미지를 참조하여 행해진다는 장점을 갖는다.

잔류 입자 모두는 입자 리스트로 출력된 후, 사용자에 의해 개별적으로 접근, 평가 및 재처리될 수 있다.

도 6은 세포 배양물(8)을 좌측 부분 이미지로 개략적으로 도시한다. xy 테이블(9)의 이동에 의해, 세포 배양물은 일련의 개별 현미경 이미지(20)로 스캐닝된다. 개별 이미지의 크기는 현미경 유닛(1)에 설정된 증폭도에 의존한다. 증폭도가 작을수록 개별 이미지(20)에 의해 커버되는 세포 배양물(8)의 섹션이 커지고, 세포 배양물(8)의 전체 기록을 위해 필요한 개별 이미지(20)의 수가 적으며, 다음의 후속하는 이미지 섹션을 현미경 유닛 아래로 가져가기 위해 xy 테이블(9)에 의해 실행되는 스텝 이동이 커진다.

따라서, xy 테이블(9)의 스텝 이동을 현미경 유닛(1)의 증폭도에 매칭시키는 것이 필요하다. 이러한 매칭은 저장 및 제어 유닛(4)에 의해 행해진다. 이 경우, 기록된 개별 이미지(20) 각각은 xy 테이블(9)의 위치에 의해 이미지 및 y 좌표로 특유하게 식별 가능하다. 동시에, 포함된 이미지 포인트의 개별 이미지(20) 내부에 주어진 좌표는 개별 이미지의 좌표에 쉽게 링크될 수 있다. 결국, 각각의 개별 이미지 내의 각각의 이미지 포인트는 스캐닝된 세포 배양물(8) 내의 위치를 고유하게 특정한다.

세포 배양물(8)의 기록된 개별 이미지(20)를 참조로, 후술되는 제1 및/또는 제2 검출 단계를 수행하여 특정된 파라미터에 따라 세포 및/또는 세포 군체를 선택할 수 있다.

대안적으로, 그렇게 기록된 개별 이미지(20)는 화상 평가 유닛(3a)에서 결합되어 전체 세포 배양물(8)의 전체 이미지(21)를 형성한다. 이러한 결합은 한편으로는 각각의 개별 이미지(20)의 엣지에 기록된 구조가 완전하게 되어 완전한 대상물을 형성하기 때문에 적합하다. 다른 한편, 전체 이미지(21)는 사용자가 스캐닝된 세포 배양물(8)을 끊어짐 없이 연속적으로 실행 가능하게 개관할 수 있게 한다. 상기 전체 이미지(21)는 이를 위해 화상 처리 소프트웨어에 의해 처리되어 모니터 상으로 다양한 해상도 단계로 사용자에게 디스플레이될 수 있다. 전체 이미지(21)의 생성과 관련하여, 개별 이미지(20)의 좌표와 인접 개별 이미지 내의 이미지 포인트의 좌표의 매칭을 수행하여 동일 이미지 범위의 중첩을 제거한다.

세포 검출, 즉 개별 이미지(20) 내의 세포 또는 세포 군체의 자동 식별은 후 술되는 형상 인식에 의해 수행된다. 도 7은 이를 위해 내부에 세포(22) 및 세포 군체(23)를 포함하는 현미경 이미지 내의 전체 이미지(21)로부터 취한 예시적인 개별 이미지(20)를 도시한다. 신뢰성 있는 세포의 형상 인식을 위한 필수 조건은 현미경 이미지 내에서 세포 또는 세포 군체와 그 배경 간의 콘트라스트가 충분히 커야 한다는 것이다. 이것은 현미경 검사의 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 가능성 있는 첫 번째 방법은 현미경 유닛(1)의 광학계를 세포의 존재가 예상되는 세포 배양물(8)의 이미지 면에 포커싱하는 것을 포함한다. 고착성 세포의 경우, 이것은 세포 배양물의 샘플 용기의 바닥 면이다. 우무 등의 반고형 영양 배지 내의 세포는 통상 우무의 표면 상에 위치되어 거기에서 포커싱될 수 있다.

세포 배양물 내의 다른 이미지 면에 위치될 수 있는 세포 또는 세포 군체의 경우, 미생물학적 대상물의 형광 표지를 포함하는 기술을 사용할 수 있다. 이를 위해, 식별 대상의 세포는 형광 표지자로 표지되는 한편, 대응하는 여기 파장을 갖는 광이 조명 시스템을 통해 조사된다. 표지자의 형광 파장 영역에서의 이미지 획득 중에 세포 또는 세포 군체는 충분한 색채 대비를 형성하는 발광 또는 광 구조체로서 어두운 배경과 구별된다.

도 8은 화상 처리의 다른 개략적 단계를 도시한다. 좌측 다이어그램은 그레이 톤으로 전환되는 개별 이미지(20)를 도시한다. 그레이 톤으로의 전환은 세포가 현미경 이미지 내의 배경으로부터 충분히 강하게 구별될 때 특히 유익하다. 물론, 이미지의 단일 색상값의 강조 또는 일 색상값으로의 이미지의 감력(또는 약화: reduction)도 가능하다. 유사하게, 검출 대상의 세포의 이미지 포인트의 색상값은 기준으로서 미리 정해질 수 있으며, 이때 개별 이미지(20) 내의 각 이미지 포인트는 이 기준값과 비교된다.

미리 정해진 기준값, 즉 색상값, 그레이 레벨 및 유사 값에 대응하는 이미지 포인트는 화상 처리 중에 결합되어, 그 형상, 크기 및 외형을 분석할 수 있는 포인트 세트를 형성한다. 세포(22)는 예컨대, 그 엣지가 상당히 평탄하게 이어지는 이미지의 특정 영역을 콤팩트하게 둘러싸는 비교적 큰 폐쇄형 형상(24)을 특징으로 한다. 다른 한편 세포 군체(23)는 이미지 영역 내에 작고 밀착된 개별 구조들의 조합(25)을 형성한다. 양자의 형태는 통상 사용되는 이미지 검출 기법의 범위 내에서 쉽게 식별될 수 있다.

식별된 형태를 기초로, 형상의 위치 및 서로로부터의 상호 거리를 계산하는 추가의 화상 처리 단계가 수행된다. 위치의 결정은 세포 또는 세포 군체의 후속하는 제거를 위해 중요하며, 거리의 결정은 발견된 세포 또는 세포 군체가 단일 제거 공정에 의해 제거되어야 하는지 또는 세포 배양물의 다른 인접 세포와 함께 제거되어야 하는지 여부를 특정하는데 필요하다.

도 9는 위치와 거리의 결정을 위한 한 예를 나타낸다. 도 9의 다이어그램은 도 8에 개략 도시된 화상 처리의 결과를 이용한다. 여기 도시된 예에서, 식별된 형상, 즉 세포 또는 세포 군체에 속하는 이미지 포인트 세트 각각에 대해 형상 무게 중심(S1, S2, S3)이 계산된다. 상기 모드와 그에 따른 계산이 행해짐으로써 그 계산을 위해 선택되는 이미지 섹션의 크기가 사용자에 의해 미리 특정될 수 있다. 결국, 식별된 세포의 그룹이 세포 군체 또는 개별 세포의 그룹으로서 취급되어야 하는 포인트가 역으로 정해질 수 있다.

여기 도시된 예에서, 그 자체의 형상 무게 중심(S1 또는 S2)은 x1 또는 x2의 x 좌표와 y1 또는 y2의 y 좌표로 각각 할당되는 개별 형태(24) 각각에 대해 계산된다. 밀착 인접 배열된 형태(25)의 경우, x3와 y3의 좌표를 갖는 형상 무게 중심(S3)이 계산되는데, 이는 이들 구조의 전체 조합에 대해 적용되어 이들 형상의 중간 범위에 자리한다. 형상 무게 중심의 계산과 그 좌표의 특정 및 저장에 의해, 세포 또는 세포 군체는 그 위치가 고유하게 식별된다. 상기 좌표는 세포 또는 세포 군체의 화상 데이터와 함께 위치 데이터베이스에 저장되며, 그 위치 데이터베이스의 검색을 통해 고유하게 위치될 수 있다.

식별된 형상과 그에 따른 세포 또는 세포 군체의 거리의 결정을 위해, 결정된 좌표를 사용하며, 이 경우, 2개의 임의의 형상 무게 중심(Si, Sj) 사이의 거리(|Sij|)와 그 좌표[(xi; yi) 또는 (xj; yj)]는 다음의 피타고라스 정리를 이용하여 계산된다:

이 계산은 결정된 세포 또는 세포 군체가 미리 특정된 한계 내에서 서로 밀착 배열된 것으로 판명될 수 있으면 화상 처리의 일부로서 자동으로 행해질 수 있다. 또한, 위치 데이터베이스의 편집의 일부로서 사용자에 의한 수동 거리 계산도 물론 가능하다. 이 경우, 마우스 클릭으로 특히 개별 세포를 표시할 수 있고 화상 처리 프로그램으로 표시된 세포간의 거리를 계산하는 소프트웨어 측에 대화형 그래픽 사용자 안내(interactive graphical user guidance) 수단과 이미지 편집이 사용된다.

사용되는 표준 화상 처리 소프트웨어는 그래픽적 평가, 리포트 생성기 등 검출 이미지와 결과에 대한 추가의 기록을 위해 확장 가능성을 갖는다. 그러므로, 공정의 연속적인 기록이 가능하다.

제2 검출 단계에서는 추가의 파라미터와 관련하여 이미 식별된 입자의 연구가 가능하다. 이러한 분석에서는 더 이상 시작 플레이트 전부가 스캔닝되지 않고, 제1 분석 단계에서 관심있는 세포 물질이 발견된 부위만이 스캐닝된다. 이것은 실행 시간과 그리고 형광 분석의 경우, 샘플의 표백 방지를 위해 최소한으로 유지되어야 하는 형광빛의 샘플 조사 시간을 최적화한다. 제2 검출 단계는 임의의 공정수의 개별 단계로 이루어질 수 있는데, 각 단계는 다른 노출형으로 취할 수 있다. 따라서, 이 제2 검출 단계에서는 다수의 상이한 형광 채널 및 여기 파장이 스캐닝되고 평가될 수 있다. 이 경우 소프트웨어는 화상 데이터보다 데이터 집적도가 적은 입자 데이터만을 수집한다.

상기 제2 검출 단계의 말미에, 획득된 모든 데이터는 대응하는 원래 입자에 대하여 이미 활용 가능한 입자 리스트 내에 삽입된다. 결국, 대응하는 중첩 효과가 얻어져서 제1 분석에 따른 데이터를 동일 입자에 대한 제2 분석으로부터의 데이터와 비교할 수 있다. 따라서, 예컨대, 명시야 입자의 영역(영역, 제1 분석)으로 나눠지는 형광 영역(영역, 제2 분석)의 계수는 항체 형성을 위한 품질 특성을 산출한다(미소 크기의 명시야 군체의 경우 형광 신호가 밝고 커지면, 상기 군체의 항체 생성은 증가한다).

이 입자 리스트는 개별 형광 또는 명시야 신호의 존부에 의해 논리적으로 더욱 필터링될 수 있다. 또한, 사용자는 2차원 산포도에 의해 입자 필터링이 가능하다. 이 경우, 결과표로부터의 2개의 다른 입자 값이 서로에 대해 이미지화된다.

상기 결과표를 완전히 필터링하면, 상기 리스트는 라인 정확도로 자동으로 또는 개별적으로 수집될 수 있다. 실제 수집 공정의 수행을 위해, 화상 처리 소프트웨어로부터의 신호에 응답하여 공정을 개시하는 AVISO 로봇 제어 소프트웨어가 사용된다. 이 경우 화상 처리 소프트웨어는 크로스 테이블의 위치 설정을 수행하 고, 각각의 경우 다음 순번의 수집 대상물이 카메라의 관측 필드에서 정중앙에 위치되도록 하여 이전에 그 위치로 보정 완료된 수집 툴이 세포에 정렬되어 세포를 채취할 수 있도록 하는 것을 보장한다.

2개의 소프트웨어 성분 간의 통신은 양방향으로 이루어진다. 이것은 수집 과정의 개시 이전에 화상 처리 소프트웨어가 다중-웰(multi-well) 플레이트 사용시 입자 직경 또는 위치 지수를 로봇 제어부로 전송하는 것을 포함한다. 결국, 각각의 수집 후보에 대해 수집 공정을 유연하게 수행할 수 있는 위치로 시퀀스 제어가 행해진다. 이러한 것의 전형적인 어플리케이션은 입자의 크기가 상이함을 고려하여 최적의 수집 결과를 얻기 위해 다른 형태, 크기 및 소재의 자동 변경 가능한 삽입관 및/또는 모세관의 사용이다. 하류 방향 공정에 크게 유용할 수 있는 항목(밀도, 형광체,...)에 따라 분류되는 분배 용기에 침착되는 세포를 수집하는 것도 가능하다. 이와 무관하게, 각각의 수집 공정 후에, 화상 처리 소프트웨어는 어느 용기와 이 용기 내의 어느 위치에서 로봇 제어기가 세포(들)를 침착하였는지에 대한 정보를 획득하여 전체 공정의 완전한 기록을 보장한다.

사용 가능한 삽입관 직경을 초과하는 크기의 입자는 연속적으로 분할(in parts) 수집될 수 있다. 군체 일부(예, 분화 줄기 세포로 둘러싸인 미분화 줄기 세포)만의 분리도 가능하다.

수집 대상의 군체, 부분 군체 또는 개별 세포는 각각의 경우 현미경의 광축으로 현미경 크로스 테이블에 의해 위치 설정된다. 수집전의 입자의 이미지가 기록 및 저장된다. 성공적인 수집의 증거로서 동일 과정이 수집후에 행해진다. 양자의 이미지는 이 입자를 위한 타겟 용기의 대응하는 웰에 할당되어 추가의 연구를 위해 상기 웰 내의 입자 상태가 정확하게 기록된다.

세포 또는 세포 군체의 좌표가 비로소 세포의 제거에 사용된다. 이를 위해, 수집 모듈은 설명된 바와 같이 세포 배양물(8) 위로 이동되며, 그에 따라 xy 테이블(9)이 각각의 좌표로 접근한 후 제거 툴(10a)을 갖는 툴 헤드(10)의 수집 모듈(5)을 대응하는 좌표로 하강시키고 세포 제거가 수행되도록 한다.

도 10은 본 발명의 장치를 사용한 자동화된 세포 수집의 기본적 시퀀스를 나타낸다. 공정 시작시, 식별 및 수집 파라미터를 확정한다. 이들 파라미터를 참조로 하여, 세포 및/또는 세포 군체의 동시 식별과 함께 스캐닝 공정을 행한다.

이로부터 결정되는 데이터는 세포 및/또는 세포 군체의 발견 결과 리스트에 저장한다. 발견된 세포 및/또는 세포 군체는 이 결과 리스트로부터 더 필터링될 수 있다. 이러한 필터링은 수동의 재처리, 즉 세포 및/또는 세포 군체의 제거/추가/분리/결합, 또는 발견된 세포 및/또는 세포 군체에 추가적인 분석 기능을 적용하는 것에 의해 행해진다. 예를 들면, 상이한 형광체에 대한 시험을 행할 수 있 다.

이 방식으로 세포 및/또는 세포 군체의 선택 후에 자동 수집을 시작할 수 있다. 이를 위해, 우선, 그 크기를 고려할 때 현재의 제거 툴로 세포 및/또는 세포 군체를 수집할수 있는지 여부와 제거 툴의 회수 영역 내에 다른 세포 및/또는 세포 군체가 위치되는지 여부를 분석하여야 한다. 수집이 가능하다면, 수집이 행해진다. 수집의 결과는 전후 이미지의 기록을 포함하는 수집 결과 리스트에 저장한다. 그런 다음, 가능하다면 수집 후에 다음의 세포 및/또는 세포 군체를 위해 전술한 수집의 가능성의 분석을 새로이 행한다.

수집이 불가능하면, 우선 그 이유를 결정하고, 그 결과를 전후 이미지의 기록을 포함하는 수집 결과 리스트에 저장한다. 이것은 가능하다면 수집 후에 다음의 세포 및/또는 세포 군체를 위한 전술한 분석 이후 다시 행한다.

최종의 세포 및/또는 세포 군체의 수집 후에 공정은 자동 종료된다.

도 11은 툴 헤드(10)에 부착되는 리셉터클(32)을 도시한다. 상기 리셉터클(32)은 스텝(28)에서 크기 분류되는 외부 콘(26)을 구비한다. 상기 외부 콘(26)은 여기에서 팁으로서 리셉터클(32)의 외부 콘(26)의 상대 대향부를 형성하는 내부 콘(27)을 갖는 제거 툴(10a)을 수용한다. 리셉터클(32)의 외부 콘(26)과 제거 툴(10a)의 내부 콘(27)의 결합으로 인해 리셉터클(32)과 제거 툴(10a) 사이에는 강력하지 않은 분리 가능한 연결이 이루어진다.

도 12는 리셉터클(32)의 대안적 실시예를 도시한다. 상기 리셉터클(32)은 내부 콘(31)을 포함한다. 상기 내부 콘(31)은 여기서는 모세관으로서 상기 리셉터클(32)의 내부 콘(31)의 상대 대향부를 형성하는 외부 콘(30)을 구비하는 제거 툴(10a)을 수용한다. 리셉터클(32)의 내부 콘(31)과 제거 툴(10a)의 외부 콘(30)의 결합으로 인해 리셉터클(32)과 제거 툴(10a) 사이에는 강력하지 않은 분리 가능한 연결이 이루어진다.

매우 다양하고 빈번히 새로이 개발되는 사용되는 소비 용품을 위해 교환 가능한 삽입관 형태를 가지고 그 크기와 구성이 매칭된 다른 원추형 리셉터클(32)을 사용하는 것에 의해 매우 균일한 툴 형상을 유지할 수 있다.

상기 원추형 리셉터클(32)은 툴에 의해 수용될 때 높은 정확도로 부분적으로 위치되는 소비 용품(삽입관)을 자체 중심 정렬되도록 한다. 원추형 리셉터클(32)의 높은 안정성과 균일한 하중 분포에 기인하여, 예컨대, 위치 정렬의 정확도를 해하지 않고 스크레이핑을 하거나 리셉터클(32) 내의 교환 가능한 삽입관을 헐겁게 하는 동안 상대적으로 높은 수평 방향 힘을 교환 가능한 모세관에 인가하는 것이 가능하다.

동시에, 상기 고리부(리셉터클)는 소직경의 유리 모세관과 같은 민감한 소비 용품의 장착하여 이들을 다수 자동화된 공정으로 공급하는 것을 가능케 한다. 이를 위해 96개의 랙이 사용된다.

개별 세포 및/또는 세포 군체의 자동화된 연구 및 분리를 위해 동일한 종류의 툴에 매우 다양한 크기, 형태 및 소재의 광범위한 자동 교환 가능한 모세관 및 삽입관의 연결을 위해 다양한 원추형 리셉터클(32)을 사용하는 것이 가능하다.

유리, 금속 또는 세라믹제 모세관의 사용이 가능하다.

참조 리스트

1 현미경 유닛

1a 편광 프리즘

1b 렌즈계

2 화상 기록 유닛

3 PC(개인용 컴퓨터)

3a 화상 평가 유닛

4 제어 및 저장 유닛

4a 모니터, 디스플레이

5 수집 모듈

5a 리프팅 칼럼

5b 변위 드라이브

6 조명

7 조명 필터

8 세포 배양물

9 xy 테이블

10 툴 헤드

10a 제거 툴

11 분리용 전지

12 팁

12a 단부 콘

13 클로닝 컵

13a 수납 콘

14 삽입관 매거진

15 삽입관

16 교환 가능한 헤드

16a 어댑터

17 팁

18 위치 고정된 개별 세포용 삽입관

18a 유체 레벨

19 보정 이미지 획득

20 개별 이미지

21 전체 이미지

22 세포

23 세포 군체

24 세포 형태

25 세포 군체 구조

S1 제1 형상 무게 중심

S2 제2 형상 무게 중심

S3 제3 형상 무게 중심

x1 제1 x 좌표

x2 제2 x 좌표

x3 제3 x 좌표

y1 제1 y 좌표

y2 제2 y 좌표

y3 제3 y 좌표

26 외부 콘

27 내부 콘

28 스텝

30 외부 콘

31 내부 콘

32 리셉터클

Claims

세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체를 자동 제거하는 방법으로서,

-물질적 및/또는 물리적 파라미터를 참조로 세포 및/또는 세포 군체를 선택하고,

-상기 선택된 세포 및/또는 세포 군체의 위치 데이터를 검출하고 상기 검출된 위치 데이터를 위치 데이터베이스에 저장하는

제1 검출 단계를 실행하는 것을 포함하고,

-상기 제1 검출 단계에서 관심있는 물질이 발견된 부위에만 있는 세포 및/또는 세포 군체의 적어도 하나의 추가의 파라미터를 검출하는 적어도 하나의 제2 검출 단계를 실행하고,

-상기 제1 및 제2 검출 단계의 데이터로부터 비교 데이터를 생성하고 그 비교 데이터를 상기 위치 데이터에 할당하고,

-상기 물질적 및/또는 물리적 파라미터와 함께 상기 비교 데이터를 참조로 하고 또한 다른 세포형에 대한 특정의 기준을 참조로 하여 복수의 특정의 성질을 갖는 세포 및/또는 세포 군체를 선택하고,

-상기 비교 데이터에 링크된 상기 위치 데이터를 상기 위치 데이터베이스로 부터 수집 유닛으로 전달하는

단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항에 있어서, 세포 배양물의 용기를 위한 지지대로서 xy 테이블이 제공되며, 상기 xy 테이블의 이동에 의해 상기 세포 배양물의 스캐닝과 상기 수집 유닛의 이동이 실행되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 스캐닝 중에 상기 세포 배양물의 부분 이미지가 기록되며, 상기 제1 및/또는 제2 검출 단계는 상기 부분 이미지를 참조로 실행되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스캐닝 중에, 상기 세포 배양물을 커버하는 상기 부분 이미지 전체가 기록되며, 상기 부분 이미지의 화상 데이터는 화상 평가 유닛에 결합되어 상기 세포 배양물의 전체 이미지의 화상 데이터를 형성하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제4항에 있어서, 위치 데이터의 검출 중에, 세포 또는 세포 군체의 식별된 형태에 속하는 이미지 포인트 세트 각각으로부터 형상 무게 중심을 계산하는 것에 의해 식별된 형상의 형상 무게 중심이 결정되고, 상기 형상 무게 중심의 좌표는 상 기 식별된 형태에 대한 위치 데이터로서 위치 데이터베이스에 저장되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제5항에 있어서, 형상 인식과 위치 데이터의 검출은 상기 식별된 형상 간의 거리의 결정을 포함하고, 결정된 좌표가 사용되고, 2개의 임의의 형상 무게 중심(Si, Sj) 간의 거리(|Sij|)와 그 좌표[(xi; yi) 또는 (xj; yj)]는 다음의 피타고라스 정리:

를 이용하여 계산되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐닝, 상기 형상 인식 및/또는 상기 위치 데이터의 검출 중에, 화상 데이터가 모니터 상에 실시간 디스플레이되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 검출 단계는 다양한 파라미터가 검출되는 임의의 다수의 개별 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제8항에 있어서, 상기 개별 단계들의 파라미터들은 제2 검출 단계에서 다수의 상이한 형광 채널과 여기 파장이 스캐닝 및 평가되도록 상이한 노출형으로 기록되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상호 작용 선택 리스트에 의해 물질적 및/또는 물리적 파라미터를 참조로 세포 및/또는 세포 군체의 선택이 행해지고, 상기 상호 작용 선택 리스트는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 선택과 위치 데이터베이스의 수동 관찰과 자동화된 방식으로 발견된 세포 및/또는 세포 군체의 조사 및 선택을 허용하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 상호 작용 선택 리스트 또는 상호 작용 산포도에 의해 비교 데이터를 참조로 세포 및/또는 세포 군체의 선택이 행해지고, 상기 상호 작용 선택 리스트 또는 상기 상호 작용 산포도는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 선택을 허용하고, 상기 상호 작용 선택 리스트는 위치 데이터베이스의 수동 관찰과 자동화된 방식으로 발견된 세포 및/또는 세포 군체의 조사 및 선택을 허용하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제10항에 있어서, 상기 제1 상호 작용 선택 리스트는 형상 무게 중심의 좌표 와 상기 제1 검출 단계로부터의 화상 데이터 및/또는 데이터를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제11항에 있어서, 상기 제2 상호 작용 선택 리스트는 상기 제1 선택 리스트와 제2 검출 단계로부터의 데이터 및/또는 비교 데이터를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및/또는 세포 군체의 선택이 로직 필터에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 고착성 세포 배양물에서 세포 및/또는 세포 군체의 채취가:

-팁을 취하여 그 팁에 효소 또는 용매를 충전하고,

-클로닝 돔을 취하여 그 클로닝 돔으로 세포 및/또는 세포 군체를 덮고,

-상기 팁으로부터 상기 클로닝 돔 내부로 상기 효소 또는 용매를 분배하고,

-상기 클로닝 돔을 수세하여 상기 세포 및/또는 세포 군체를 분리하고,

-상기 세포 및/또는 세포 군체를 흡입하는

단계들을 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 강력 고착성 세포 배양물에서 세포 및/또는 세포 군체의 채취가:

-삽입관의 팁으로 세포 및/또는 세포 군체를 포위하고,

-상기 포위된 세포 및/또는 세포 군체의 박리를 위해 xy 면에서의 상기 삽입관 팁의 상대 이동 및/또는 xy 테이블의 상대 이동을 실시하고,

-상기 박리된 세포 및/또는 세포 군체를 상기 삽입관 내로 채취하는

단계들을 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제15항에 있어서, 상기 삽입관 팁 및/또는 xy 테이블의 상대 이동은 상기 삽입관 팁에서의 흡입 및/또는 수세 공정과 결합되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 반고형 영양 기질, 특히 우무 또는 메틸 셀룰로오스로부터 세포 및/또는 세포 군체의 채취가:

-팁을 취하고,

-상기 팁을 세포 및/또는 세포 군체 위로 위치시킨 후 그 세포 및/또는 세포 군체를 포위하고,

-상기 세포 및/또는 세포 군체와 그에 인접한 영양 기질을 상기 팁 내로 흡 입하는

단계들을 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 고정된 개별 세포 및/또는 개별 군체의 채취가:

-모세관에 유체, 특히 공기 또는 액체를 보정된 양으로 충전하고,

-상기 모세관의 개구를 개별 세포 및/또는 개별 군체 위에 위치시키고,

-상기 개별 세포 및/또는 개별 군체 근처의 배지를 상기 모세관 내로 흡입하고, 상기 개별 세포 및/또는 개별 세포 군체는 상기 모섹관 내로 채취되는

단계들을 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제19항에 있어서, 상기 모세관에 보정된 양의 유체를 충전하는 것은 화상 처리 유닛에서의 화상 데이터 평가와 관련하여 모세관의 이미지 획득이 수반되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팁, 상기 삽입관 또는 상기 모세관의 사용 가능한 직경보다 크기가 큰 세포 군체는 연속으로 분할 수집되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팁, 상기 삽입관 또는 상기 모세관의 도움으로 세포 군체로부터 개별 부분이 분리되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 세포 그룹으로부터 개별 영역이 분리되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 침전에 의해 분류되는 세포 및/또는 세포 군체가 침착 용기 내에 침착되고, 그 침착된 세포 및/또는 세포 군체의 위치 데이터가 검출 및 처리되는 것을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 자동 제거 방법.
제16항 또는 제17항에 따른 방법으로 줄기 세포를 제거하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생물학적 및/또는 화학적 입자를 제거하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 고형물, 특히 비드를 제 거하는 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따라 세포 배양물로부터 세포 및/또는 세포 군체를 제거하는 장치로서, 세포 배양물(8) 내의 세포 및/또는 세포 군체의 위치를 검출하는 화상 획득 유닛(2) 및 화상 평가 유닛(3)과, 상기 세포 및/또는 세포 군체의 검출된 위치를 저장하는 제어 및 저장 유닛(4)과, 상기 세포 및/또는 세포 군체의 검출된 위치에서 상기 세포 및/또는 세포 군체를 제거하는 제거 툴(10a)을 갖는 수집 유닛(5)과 조합되어 상기 세포 배양물(8)의 현미경적 스캐닝을 위한 현미경 유닛(1)을 특징으로 하는 세포 및/또는 세포 군체의 제거 장치.
제28항에 있어서, 상기 제거 툴(10a)은 용해액 또는 효소액을 충전시킬 수 있는 팁(12)과, 상기 팁(12)에 결합될 수 있고 선택된 세포 및/또는 세포 군체를 커버하며 상기 팁(12) 내부에 수용된 상기 액을 충전할 수 있는 클로닝 돔(13)과, 상기 팁(12)과 상기 클로닝 돔을 위한 로딩 및 흡입 기구를 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
제28항에 있어서, 상기 제거 툴은 다른 직경의 삽입관(15)들의 구성을 내장한 매거진(14) 형태로 제공되며, 상기 매거진(14)으로부터 삽입관(15)의 자동 제거 및 그것의 결합을 위한 커플링 유닛이 교환 가능한 헤드(16)에 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
제30항에 있어서, 상기 삽입관(15)은 다른 크기, 형태 및/또는 소재로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
제28항에 있어서, 상기 제거 툴은 그 선단부가 확장된 단면 형태인 흡입 팁(17)을 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
제28항에 있어서, 삽입관(18)을 갖는 제거 툴(10a)과, 상기 삽입관(18) 내에 함유되는 유체의 양을 모니터링하는 화상 획득 기구(19)와, 상기 삽입관(18)의 화상 정보를 처리하는 화상 처리 기구와, 세포 및/또는 세포 군체를 상기 삽입관(18) 내로 흡입하는 흡입 기구를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제28항에 있어서, 내부 콘(31) 및/또는 외부 콘(26)으로부터 형성되고 제거 툴(10a)을 유지하는 리셉터클(32)을 갖는 툴 헤드(10)를 포함하고, 상기 제거 툴은 상기 리셉터클(32)에 적합화된 내부 콘(27) 및/또는 외부 콘(30)을 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
제34항에 있어서, 상기 리셉터클(32)의 상기 내부 콘(31) 및/또는 외부 콘(26)은 상기 제거 툴(10a)이 유지되는 스텝(28)을 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.