KR20090097964A - 단핵세포 증량 방법 - Google Patents

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Abstract

본 방법은 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포 내에서 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해하는 단계; 및 하나 이상의 시토킨 또는 시토킨 수용체 시그널링 작용제 존재하에 상기 세포들을 증량시키는 단계를 포함하는, 생체외에서 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 증량하는 방법에 관한 것이다.
단핵세포, 마크로파지, 수지상 세포, 배양, MafB, c-Maf

Description

단핵세포 증량 방법{A METHOD FOR EXPANDING MONOCYTES}
본 발명은 장기 배양에서, 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 생성하고, 유지하며 증량하는 방법에 관한 것이다.
단핵세포는 골수(BM)에서 생성되어 혈류로 방출되고, 순환으로부터 떠나 상이한 타입의 조직-마크로파지 또는 수지상세포를 생성시킨다. 단핵세포, 그 후손 및 골수에서의 직접 전구체는 '단핵식균시스템(mono-nuclear phagocyte system; MPS)'으로 명명된다. 이들은 골수내의 과립구/마크로파지 콜로니 형성 유닛 (CFU-GM) 전구세포에서 유래되며, 단핵 세포 및 과립 세포를 생성한다. 생체내 단핵 계통의 성숙과정은 단핵모세포단계에서 전단핵세포 단계를 거쳐 성숙단핵세포로 진행된다(Goud TJ et al. 1975). IL-3, GM-CSF 및 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF)는 단핵세포의 생체내 생성을 자극한다 (Metcalf D et al. 1990). 생체외에서, GM-CSF와 함께 배양된 조혈전구세포는 CFU-GM를 과립구로의 분화를 유발시키고, FL 및 SCF의 첨가는 과립세포 계통에서 단핵세포 계통으로의 분화로 바꾼다(Gabbianelli M et al. 1995; Willems R et al. 2001 ).
최근의 연구에 따르면 마우스와 인간에 있어서, 비록 특이적 표면 마커 발현이 종마다 상세한 부분은 다를 수 있으나, 전반적인 단핵세포 및 그 후손의 분화 경로는 상당히 보존적인 것으로 나타났다(Gordon S et al. 2005). 보다 상세한 분화 경로에 관한 실험은 동물 모델을 이용하여 상당한 정도로 가능하다. 마우스 단핵세포는 골수내 조혈줄기세포(HSC)로부터 연속적인 동시적 단계 및 수개의 중간 전구체단계를 통해 상승적인 제한된 분화 포텐셜로 유래된다(Shizuru JA et al. 2005; Kondo M et al. 2000). 이러한 분화 시리즈는 모든 골수 세포들을 생성하는 일반적인 골수 전구세포(CMP)를 거쳐 과립구-마크로파지 전구세포(GMP)가 되며, 이는 단핵세포 및 과립세포들을 생성하고, CFU-GM 전구세포와 동일하거나 유사하다. 그러나 골수에서 더욱 직접적인 단핵세포전구세포는 단핵세포중간단계를 거쳐 마크로파지나 수지상 세포를 생성할 수 있는 마크로파지수지상세포 전구세포(MDP)로 나타났다 (Fogg et al 2006).
새로이 형성된 단핵세포는 24시간 내 BM을 떠나 말초 혈액으로 이동한다. 순환 단핵세포는 말초 혈관의 상피 세포에 부착하여 다양한 조직내로 이동할 수 있으며(van Furth R. et al. 1992), 이들 조직에서 마크로파지나 수지상세포로 분화할 수 있다. 이러한 부착과 이동은 표면 단백질, 림포사이트-기능 관여된 항원-1 (LFA-1), CD11 및 항원-4 (VLA-4)가 관련하여, 이들은 부착 분자의 인테그린 슈퍼패밀리에 속한다(Kishimoto TK et al. 1989). 이러한 인테그린들은 상피세포상에서 셀렉틴과 작용한다. 단핵세포 유래된 마크로파지는 고도의 이종성을 보이며, 이는 침윤된 조직내 적응된 형태적 그리고 기능적 특이성을 반영한다. 이들의 해부학적 위치에 따라 고유의 이름을 가질 수 있다(예, 중추신경계에서는 미세아교세포로 지칭되며, 간에서는 쿠퍼세포로 지칭된다).
일부 상주 마크로파지 집단이 어떤 조건하에서 인 시투로 증식할 수 있는지 여부는 여전히 논쟁의 여지가 있으나, 대부분의 마크로파지는 증식능이 거의 없거나, 매우 제한적으로 보인다(Gordon S, et al., 2005). 조직 마크로파지 집단의 갱신은 따라서 단핵세포의 유입과 이들의 국소적 분화에 의존한다(Crofton RW et al. 1978; Blusse van Oud Alblas A et al; 1981). 비록 이러한 조직 침윤 단핵세포는 매우 제한적인 증식능을 갖지만, 혈류를 순환하는 단핵세포는 순환하지 않으며 엑스 비보에서 M-CSF로 자극되었을때, 증량하기 보다는 신속하게 마크로파지로 분화된다.
조직으로의 단핵세포의 동원은 항상성 상태와 염증상태에서 다르며, 인간 및 포유동물 모델에서 확인된 바 있는 두개의 서로 다른 단핵세포가 관련된 것으로 보인다(Gordon S, et al. 2005). 염증이 있는 동안에는 단핵세포생성이 증가되어 단핵세포의 수가 증가된다(Shum DT et al. 1982; van Waarde D et al. 1977). 또한 염증성 매개자, IL-1, IL-4, IFN-γ 및 TNF-α는 내피세포상의 셀렉틴의 발현을 상향조절하여, 단핵세포가 조직으로 이동하는 것을 촉진한다. 이 사이토킨은 또한 단핵세포상에서 인테그린 부착분자의 발현을 조절한다(Pober JS et al. and 1990). 염증 부위에서 단핵세포는 표면 γ수용체(CD64, CD32) 및 보체 수용체(CD11b, CD11 c)를 통한 옵손화된 미생물 또는 면역 복합체의 식균작용에 관련된다. 미생물은 반응성 산소와 질소 대사체 및 수개의 가수분해 효소(산 포스파타제, 에스테라제, 리소자임 및 갈락토시다제)에 의해 상승적으로 살해된다 (Kuijpers T. 1989; Hibbs JB et al. 1987). 특히 단핵세포 유래 마크로파지 및 수지상 세포는 항원제시에 의 해 T 세포를 자극하고, 이로써 적응면역반응의 인식 및 활성화 단계에 관련된다(Nathan CF. 1987). 단핵세포는 또한 염증, 증식 및 면역반응에서 중요한 역할을 하는 다수의 생체활성 산물을 분비하며, 이들 산물은 성장 인자(GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1) 및 항증식인자 (IFNs, TNF)를 포함한다.
리포폴리사카라이드(LPS) 또는 엔도톡신은 그람-음성 박테리아 외막의 주요 통합 구조성분이며, 주요 미생물학적 염증 개시제 중 하나이다. LPS는 단핵세포의 표면상에 발현하는 CD14 당단백과 결합하며 TLR4을 활성화하여 톨 수용체 경로를 자극한다. 다른 PAMPs (병원체 수분 분자 패턴) 또한 다른 TLR 수용체를 통해 염증 반응을 개시할 수 있다. LPS 또는 다른 PAMPS 결합은 TNF-α, IL-1 , -6, -8 및 -10의 생성을 유발한다 (Wright SD. Et al; 1990; Dobrovolskaia MA et al. 2002; Foey AD. et al. 2000).
상기 다른 LPS 또는 다른 PAMPs이외에, 인비트로에서 시토킨 생산에 대한 가장 중요하고 효율적인 자극은, CD40 리간드 (CD40L) (Wagner DH. Et al. 1997; Shu U. et al. 1995; Alderson MR. et al. 1993)를 통한 단핵세포의 직접적인 세포-세포 접촉이다 (Wey E. et al. 1992; Parry SL. Et al. 1997). 이러한 상호작용은 암의 면역 감시에서 중요하다. 따라서 단핵세포와 CD40L-감염 세포와의 인큐베이션은 인간 멜라노마 세포주에 대한 항종양 활성을 결과한다. 또한 기능적인 상호작용이 단핵세포와 중요한 항-종양 활성을 갖는 세포 타입인 NK 세포간에 존재하는 것으로 개시되어 있다. 직접적인 세포-세포 접촉(Miller JS. Et al. 1992) 및 활성화된 단핵세포에 의한 IL-12, TNF-α, IL-15 또는 IL-1 β와 같은 가용성 인자의 방 출 모두는 증식, IFN-γ의 생성 (Carson WE et al. 1995; Tripp CS. et al. 1993) 및 공배양된 NK 세포의 시간 의존적 방식의 세포독성 잠제력의 증가를 유발한다(Chang ZL. et al. 1990; Bloom ET. et al. 1986).
최종적으로 마크로파지는 또한 상처 치유 및 조직 복구에 관련되어 있으며, 이들은 찌꺼기를 제거하여 영양 기능을 하며, 조직 복구에 참여하는 다른 세포 타입의 소집 및 활성을 조율한다 (Gordon S et al. 2003).
수지상 세포(DCs)는 선천 면역계의 구성성분이다. 이들은 항원제시세포로서 1차 면역반응 유발이라는 고유한 능력을 갖는다 (Banchereu et al. 2000). 이들은 혈액 및 상주세포가 되는 비-임파성 말초조직내에서 순환 단핵세포 또는 순환 DC 전구세포로부터 유래된다(Bancherreau J. et al. 1998, 2000) (Geissmann, 2007) (Wu and Liu, 2007). 미성숙 DCs (iDCs)는 톨-유사 수용체를 포함하는 세포 표면 수용체를 통해 병원체를 인식한다(Reis e Sousa C. 2001). 항원을 섭취한후 DCs는 성숙하며 임파절로 이동한다. 성숙 DCs (mDCs)는 효율적인 항원제시세포이며 (APCs), T 세포 프라이밍을 매개한다(Banchereau J. et al. 1998,2000). 또한 DCs의 중요한 역할은 마우스 및 인간에서 NK 세포 활성화이다. 미성숙 및 박테리아에 의해 활성화된 인간 단핵세포-유래 DCs 양자모두는 시토킨 분비를 유발하며, NK 세포에 의한 세포독성을 유발한다(Ferlazzo G. et al. 2002; Fernandez NC. et al. 1999).
Stanley et al(1978, 1986)은 M-CSF 존재하에서 골수에서 쥐 마크로파지의 인 비트로 분화를 기술한 바 있다. 전구세포가 M-CSF에 반응하여 초기에 증식하는 반면, 이들은 종국적으로 성숙 마크로파지로 분화하며, 최종적으로 세포 주기에서 회피된다(Pixley and Stanley, 2004). 따라서 이러한 방식으로 생성된 마크로파지는 한정된 시간동안 생존할 지라도, 이들은 동질적이지 않으며, 배양에서 더이상 증량할 수 없다. 유사하게 인간 단핵세포도 M-CSF에 반응하여 증식하지 않으며 다만 마크로파지 분화를 나타내는 형태학적 변화를 개시한다(Becker et al., 1987). 비록 다수의 단핵세포들을 환자로부터 백혈구 교환요법(leukapheresis) 및 유출( elutriation)에 의해 수득할 수 있다하더라도 (Stevenson et al., 1983), 이러한 세포들은 증식되지 않고 수일내 마크로파지로 분화되며 배양에서 유지되지 않는다.
본 발명은 장기 배양(long term culture)에서, 단핵세포 및 마크로파지를 생성하고, 유지하며 증량하는 새로운 인비트로 방법을 제공하는 것이다. 본 발명자는 단핵세포 및 마크로파지내에 MafB 및 c-Maf의 발현을 불활성화시킴으로써, 상기 단핵세포 및 마크로파지를 배양내에서 수주 또는 수달동안 증량하고 유지시키는 것이 가능함을 입증하였다.
인 비트로 생성된 마크로파지 뿐 아니라 성숙 골수 MafB 및 c-Maf 결핍 마크로파지 및 혈액 단핵세포는 배양에서 계속적으로 증식한다. 본 발명의 방법은 따라서 단핵세포 및 단핵세포 유래 세포의 증식을 필요로 하는 치료학적 접근 및 단핵세포, 단핵세포 유래 마크로파지(파골세포 포함) 및 수지상 세포에 표적하는 약물에 대한 스크리닝 또는 환자에서 특정한 방식으로 특정한 약물에 대한 반응 검사, 또는 환자에서 단핵세포 또는 단핵세포 유래 세포의 배양 및 증량에 의한 단핵세포 또는 단핵세포 유래 세포 의존적 질병의 분자학적 기초를 연구하는데 유용하다.
본 발명은 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 증량시키는 엑스비보 방법을 제공하며, 본 방법은 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포 내에서의 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해하는 단계; 및 하나 이상의 시토킨, 예컨대 M-CSF의 존재하에 상기 세포들을 증량시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적은 또한 상기 방법으로 수득가능한 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 MafB 및 c-Maf를 발현하지 않거나 또는 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성이 없거나 저해된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 제공하는 것이다.
이러한 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 약학적으로 허용가능한 담테와 조합되는 약학적 조성물에 유용하다.
본 발명의 특별한 목적은 항원 분자를 갖는 수지상 세포를 포함하는 백신용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 약물 스크리닝에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 쥐 단핵세포를 생성하고 증량하는 방법을 제공하며, 이는
i) afB 및 c-Maf를 발현하지 않는 마우스에서 유래된 단핵세포를 분리하는 단계,
ii) 상기 단핵세포를 M-CSF의 존재하에 배양하는 단계.
정의
RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 산물의 "코딩 서열" 또는 "인코딩"하는 서열은 발현되었을 때, RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소들을 생산하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소에 대한 아미노산서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 단백질에 대한 코딩 서열은 개시 코돈(통상 ATG) 및 종지 코돈을 포함한다.
"유전자(gene)"는 하나 이상의 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 특정 아미노산 서열에 대응하거나 이를 코딩하는 DNA 서열을 의미하며, 이는 상기 유전자가 발현될 조건 등을 결정하는 조절 DNA 서열, 즉 프로모터 서열 등을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있으며, 하부 (3' 방향)코딩서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 구조 유전자가 아닌 일부 유전자는 DNA에서 RNA로 전사될 수는 있으나, 아미노산 서열로 번역되지는 않는다. 다른 유전자는 구조 유전자의 조절자로서 또는 DNA 전사의 조절자로서 기능한다. 특히 유전자라는 용어는 단백질을 코딩하는 게놈 서열, 즉 조절자, 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 서열을 지칭한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 특정 단백질(예, MafB 또는 c-Maf)에 대한 참조는 천연 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 기원 또는 제조방법에 관계없이 상기 아미노산 서열의 변이체 또는 변이 형태를 포함한다. 천연 아미노산 서열을 갖는 단백질은 자연에서 수득된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질이다(예, 자연발생의 MafB 또는 c-Maf). 이러한 천연 서열 단백질은 자연에서 분리하거나 표준 재조합 및/또는 합성법을 사용하여 제조될 수 있다. 천연 서열 단백질은 특이적으로 자연 발생적인 각뿔(truncated) 또는 가용 형태, 자연 발생적인 변이 형태(예, 교대 접합 형태), 번역후 변경을 포함하는 자연 발생적 대립 변이체 및 형태를 포함한다. 천연 서열 단백질은 당화, 인산화, 유비퀴틴화, 수모화(sumoylation) 또는 일부 아미노산잔기의 기타 변경 등과 같은 번역후 변경이 후속하는 단백질을 포함한다.
"돌연변이체" 및 "돌연변이"는 예를 들면 DNA, RNA, cDNA와 같은 유전적 물질에서의 검출가능한 변화, 또는 이러한 변화 결과, 과정, 기전 등을 지칭한다. 이들은 유전자 구조(예, DNA 서열)가 변경되는 유전적 돌연변이, 돌연변이 과정에서 생성되는 유전자 또는 DNA, 및 변경된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현되는 발현 산물(예, 단백질 또는 효소)를 포함한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 돌연변이는 유전자의 코딩 영역에서(즉, 엑손), 인트론에서, 또는 상기 유전자의 조절 영역(즉, 인핸서, 반응 인자, 억제자, 시그널 서열, 폴리아네닐화 서열, 프로모터)에서 일어날 수 있다. 일반적으로 돌연변이는 개체에서 상기 개체에 의해 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드의 서열을 상응하는 대조 집단에서 발현하는 핵산 또는 폴리펩티드와 비교함으로써 동정한다. 돌연변이가 상기 코딩 서열에서 존재하는 경우, 상기 돌연변이는 유전자 산물에서 다른 아미노산으로 한 아미노산이 대체된 경우인 "과오(missense)"돌연변이 또는 종지 코돈으로 한 아미노산이 대체된 경우인 "난센스(non sense)" 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 엑손-인트론 스플라이싱에 대한 시그널을 생성하거나 파괴하는 곳인 스플라이싱 부위에서 일어날 수 있으며, 이로써 변경된 구조의 유전자 산물을 생성할 수 있다. 유전적 물질의 돌연변이는 "무증상(silent)"일 수 있는데, 즉 이러한 돌연변이는 발현 산물의 아미노산 서열의 변경을 초래하지 않는다.
변이체는 유사한 아미노산 서열을 갖는 천연서열단백질과 기능적 동등체인 단백질로서, 어느 정도는 천연단백질의 하나 이상의 활성을 보유한다. 변이체는 활성을 보유하는 단편도 포함한다. 변이체는 또한 천연 서열과 실질적으로 동등한 단백질을 포함한다(즉, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99%의 서열 동등성을 갖는 것들). 이러한 변이체는 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 아미노산 변경을 갖는 단백질을 포함한다. "결실"은 관련 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 없는 것을 지칭한다. "삽입"은 관련 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 추가된 것을 지칭한다. "치환"은 폴리펩티드에서 하나 이상이 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체된 것을 의미한다. 통상적으로 이러한 변경은 자연에서 보존적이어 변이체 단백질의 활성은 천연 서열 단백질과 실질적으로 유사하다 (예를 들어 Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company를 참조). 치환의 경우, 다른 아미노산을 대체하는 아미노산은 일반적으로 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는다. 삽입 및 결실은 통상 1 내지 5 아미노산의 범위에서 이루어지며, 삽입 위치에 따라 더 많은 아미노산이 삽입되거나 제거될 수 있다. 변이체는 본 기술분야에 공지된 방법인 특정위치돌연변이 (site directed mutagenesis) (Carter, et al. (1985); Zoller et al. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487), 카세트 돌연변이(Wells et al. (1985) Gene 34:315), 제한 선택 돌연변이(Wells, et al. (1986) Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415), 및 PCR 돌연변이 (Sambrook et al., 2001 )등으로 제조될 수 있다.
두 아미노선 서열이 아미노산의 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상이 동일하거나 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상 유사한 경우(기능적으로 동일하다), 두 아미노산은 서열은 "실질적으로 상동"이거나 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게 유사하거나 상동적인 서열은 예를 들면 GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램, 또는 BLAST, FASTA 등과 같은 서열 비교 알고리즘을 사용한 정렬에 의해 동정한다.
"발현"은 유전자 또는 핵산의 발현이라는 맥락에서 사용될 때, 유전자내에 함유된 정보가 유전 산물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전 산물은 유전자의 직접적인 전사 산물(예, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 형태의 RNA) 또는 mRNA의 번역에서 생성된 단백질일 수 있다. 유전 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 에디팅과 같은 과정에 의해 변경된 메신저 RNAs 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 수모화, ADP-리보실화, 미리스틸화(myristilation) 및 당화에 의해 변경된 단백질(예, MafB 또는 c-Maf)을 포함한다.
"발현 저해제"는 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하는 천연 또는 합성 화합물을 지칭한다.
"활성 저해제"는 본 발명에서 일반적 의미를 가지며, 단백질의 활성을 감소시키거나 억제할 수 있는 화합물(천연이든 아니든)을 지칭한다.
"c-Maf"는 c-Maf 원종양 유전자(proto-onocogene)를 지칭하며, 이는 AS42 바이러스의 v-Maf 종양 유전자와 서열상 동일하며, 닭배아섬유아세포를 변형할 수 있다 (Nishizawa et al. PNAS 1989). C-Maf 및 다른 Maf 패밀리 일원은 서로 및 Fos 및 Jun과 함께 호모다이머 및 헤테로다이머를 형성할 수 있으며, 이는 서로 짝을 이루는 AP-1 단백질의 공지된 성질과 일치한다(Kerppola, T. K. and Curran, T. (1994) Oncogene 9:675-684; Kataoka, K. et al. (1994) MoI. Cell. Biol. 14:700-712). c-Maf 호모다이머가 결합하는 DNA 표적 서열은 c-Maf 반응 인자(MARE)로 지칭되며, 각각 코어 TRE (T-MARE) 또는 CRE (C-MARE) 팔린드롬을 함유하는 13 또는 14 bp 인자이며, c-Maf는 또한 복합체 AP-1/MARE 부위 및 5' AT 풍부 연장을 갖는 MARE 하프 부위를 포함하는 이들 공통 부위에서 분기된 DNA 서열에 결합할 수 있다(Yoshida et al., NAR2005). c-Maf는 퍼킨제 뉴런-특이적 프로모터 L7(Kurscher, C. and Morgan, J. I. (1994) MoI. Cell. Biol. 15:246-254), α,β γ-결정(Ring et al. Development, 2000, Kim et al. PNAS 1999 ; Kawauchi et al. JBC1999, Yang et al., JMB 2005), 인슐린 (Matsuoka , et al. MCB, 2003) 및 p53 (Hale et al., JBC 2000) 프로모터를 포함하는 수개의 프로모터들로부터의 전사를 자극하고 조기 골수 프로모터 AND/CD13과 같은 다른 프로모터의 전사를 억제하는 것으로 밝혀졌다(Hedge et al., 1998). c-Maf는 또한 T 헬퍼 2 (Th2) 세포의 분화를 유발하는 것으로 밝혀졌으며 (Ho et al., 1996), 이는 조직 특이적 인터루킨-4 (IL-4)의 전사를 활성화하는 능력때문이다 (Kim et al. 1999). 또한 골수 세포주내 c-Maf의 과발현은 마크로파지 분화를 유발한다(Hegde et al., 1999). 마우스 c-maf 원종양 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 및 마우스 c-Maf 단백질의 예측 아미노산 서열이 기술되었다 (Kurscher, C. and Morgan, J. I. (1995) MoI. Cell. Biol. 15:246-254; 및 진뱅크 기탁 번호 S74567). 닭 c-maf 원종양 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 닭 c-Maf 단백질의 예측 아미노산 서열 또한 기술되었다 (Kataoka et al. 1994, 진뱅크 기탁 번호 D28596). 인간 c-maf 원종양 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 인간 c-Maf 단백질의 예측 아미노산 서열 또한 기술되었다 (US 특허 6,274, 338 및 진뱅크 기탁 번호 BD106780).
"MafB"는 MafB 전사인자를 지칭한다. 이 유전자는 다양한 세포 타입에서 발현되며 (렌즈 상피세포, 이자 내분비선, 연골세포, 신경 및 조혈 세포를 포함하여), 카복시-말단 영역에 전형적인 bZip 모티프를 포함하는 311 아미노산 단백질을 코딩한다. bZip 도메인에서, MafB는 v/c-Maf 뿐 아니라 다른 Maf-관련 단백질과 광범위한 상동성을 공유한다. MafB는 류신 반복 구조를 통해 호모다이머를 형성하며 특이적으로 Maf-인식 인자 (MAREs)팔린드롬, 복합체 AP-1/MARE 부위 또는 AT 풍부 5' 연장을 갖는 MARE 하프부위와 결합한다 (Yoshida, et al. 2005). 또한 MafB 는 c-/v- Maf 또는 Fos와 지퍼구조를 통해 헤테로다이머를 형성할 수 있으나, Jun이나 다른 Maf 패밀리 일원들과는 그렇지 않다(Kataoka et al., 1994). MafB는 또한 크레이슬러(kreisler), kr 또는 KrmH ('크레이슬러 Maf 류신 지퍼 1 ')로도 알려져 있는데, 크레이슬러 돌연변이 마우스에서 x-ray 유발 염색체 마이크로-반전은 크레이슬러 표현형에 관련된 개발 후뇌에서 조직 특이적인 MafB 발현의 소실을 유발하기 때문이다(Cordes et al., 1994) (Eichmann et al., 1997). 조혈시스템에서 MafB는 골수성 계통에서 선택적으로 발현되며 다능성 전구세포에서 마크로파지로의 골수성 분화동안 연속적으로 상향조절된다. 실제로 이러한 유도는 단핵세포성 분화에서 MafB의 중요한 역할을 반영한다. 따라서 형질전환된 닭 골수모세포내에서(Kelly et al., 2000, Bakri et al.2005) 및 인간 골수성 전구세포(Gemelli et al., 2006) 에서의 MafB의 과발현은 전구세포 증식의 저해(Tillmanns et al., 2007) 및 마크로파지의 신속한 형성을 자극하고(Kelly et al., 2000, Bakri et al.2005, Gemelli et al., 2006), 반면 MafB의 주요 음성 버젼은 상기 과정을 저해하는바(Kelly et al., 2000), 이는 MafB 유도가 조혈 세포내 단핵세포성 프로그램의 특이적이고 중요한 결정자임을 말해준다. 닭 (Kataoka, K. et al. 1994), 마우스 (Cordes et al. 1994) 및 인간(Wang et al. 1999) MafB 유전자의 뉴클레오타이드 서열, 및 상기 MafB 단백질의 예측 아미노산 서열들 또한 기술되었다 (진뱅크 기탁 번호 N M_001030852 (gallus gallus), NM_010658 (mus musculus), NM_005461 (homo sapiens) D28600).
"단핵 세포"는 말초 혈액의 큰 단핵성 포식세포이다. 단핵세포는 직경 10 내지 30 μm 의 범위로 크기가 상당히 다양하다. 핵 대 세포질 비율은 2:1 내지 1:1이다. 핵은 종종 밴드 형성 (말편자) 또는 콩팥모양 (신장-형태)이다. 윗부분이 접힐 수 있어 뇌모양의 회선을 나타낸다. 핵소체는 보이지 않는다. 염색체 패턴은 미세하며 실타래 모양의 가닥으로 배열된다. 세포질이 풍부하며 수많은 미세한 아주르 친화성 과립을 가지며 청회색을 띠고, 김사 염색에서는 간 유리 형상을 나타낸다. 액포도 존재한다. 더욱 바람직하게 특이적 표면 항원의 발현을 사용하여 단핵 세포인지 여부를 결정한다. 인간 단핵세포의 주 표현 마커는 CD11b, CD11c, CD33 및 CD115를 포함한다. 일반적으로 인간 단핵세포는 CD9, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD15, CDw17, CD31, CD32, CD33, CD35, CD36, CD38, CD43, CD49b, CD49e, CD49f, CD63, CD64, CD65s, CD68, CD84, CD85, CD86, CD87, CD89, CD91, CDw92, CD93, CD98, CD101, CD102, CD111 , CD112, CD115, CD116, CD119, CDw121 b, CDw123, CD127, CDw128, CDw131 , CD147, CD155, CD156a, CD157, CD162, CD163, CD164, CD168, CD171 , CD172a, CD180, CD206, CD131a1, CD213a2, CDw210, CD226, CD281, CD282, CD284, CD286를 발현하며 임의로 CD4, CD14, CD16, CD40, CD45RO, CD45RA, CD45RB, CD62L, CD74, CD142 및 CD170, CD181 , CD182, CD184, CD191, CD192, CD194, CD195, CD197, CX3CR1를 발현한다. 마우스 단핵세포의 주 표현 마커는 CD11 b+, CD115, F4/80+를 포함한다. 일반적으로 마우스 단핵세포는 CD11a, CD1 1b, CD16, CD18, CD29, CD31, CD32, CD44, CD45, CD49d, CD115, CD116, Cdw131, CD281, CD282, CD284, CD286, F4/80를 발현하며, 임의로 CD49b, CD62L, CCR2, CX3CR1 및 Ly6C를 발현한다. 민감성 타겟 세포와 접촉하면, 단핵세포는 또한 IFNs, TNFs, GM-CSF, G-CSF, M-CSF 및 IL-1과 같은 다수의 시토킨들을 생성한다.
"마크로파지 세포"는 식균 성질을 나타내는 세포이다. 마크로파지의 형태는 조직마다 상이하며, 정상 및 병적 상태에서 서로 다르고, 모든 마크로파지가 형태만으로 동정될 수 있지는 않다. 그러나 대부분의 마크로파지는 둥글거나 톱니모양의 핵을 가지고, 골기체가 잘 발달되어 있으며, 엔도사이토성 액포가 풍부하고, 리소좀 및 파고리소좀이 풍부하며, 세포질막이 러플이나 미세융모로 둘러싸인 큰 세포이다. 선천 및 적응 면역에서 마크로파지의 핵심 기능은 식균작용 및 후속하는 노화 또는 아폽토시스 세포, 미생물 및 종양세포의 분해 및 시토킨, 케모킨 및 다른 가용성 매개자의 분비 및 T 림포사이트에 대한 외부 항원(펩티드)의 표면제시이다. 마크로파지는 포유류 골수내 공통 골수 전구세포 및 과립구-단핵구 전구세포에서 유래되며, 전구세포 단계를 거쳐 종국적으로 단핵세포로 발전한 후 말초 혈류로 들어간다. 다엽성 핵을 갖는 중성구와 달리, 단핵세포는 콩팥 형태의 핵을 가지며 분화 및 활성화동안 큰 세포체를 갖는다. 수명 동안 일부 단핵세포는 모세혈관의 내피에 부착하고 이를 통해 모든 기관내로 이동하여 상재성 조직 마크로파지 또는 수지상 세포로 분화한다(후술). 단핵세포 기원이외에도 제한된 자기 재생능이 조직 마크로파지의 일부 서브집단에서 보고된 바 있다. 림프절 및 비장과 같은 임파조직은 특히 마크로파지가 풍부하게 존재한다. 일부 기관에서 마크로파지는 특별한 이름을 가지며, 하기 표 1에 요약하였다.
[표 1]
기관 마크로파지 집단
뼈 파골세포
중추신경계 소교세포
결합조직 조직구
태반유모융모 호프바우어세포.
신장 혈관사이세포
간 쿠퍼세포
복강 복강 마크로파지
폐기도 폐포 마크로파지
피부 표피 및 진피 마크로파지
비장 가장자리구역 마크로파지, 금속친화성 마크로파지, 적수 마크로파지, 백수 마크로파지
본 발명에서, 마크로파지는 소교세포(microglia), 조직구(histiocytes), 호프바우어세포(Hofbauer cells), 혈관사이세포(mesangial cells), 쿠퍼세포(Kupffer cells), 복강 마크로파지(peritoneal macrophages), 폐포 마크로파지(alveolar macrophage), 표피 또는 진피 마크로파지(epidermal or dermal macrophages), 가장자리구역 마크로파지(marginal zone macrophages), 금속친화성 마크로파지(metallophilic macrophages), 적수 마크로파지(Red pulp macrophages), 백수 마크로파지(white pulp macrophages) 및 파골세포(osteoclasts)로 이루어진 군에서 선택된다. 골수 또는 태아의 간에서 유래된 마크로파지는 특히 유용하다.
파골세포는 뼈 특이적인 특정 세포 타입의 단핵세포성 식균 시스템으로서, 뼈의 미네랄화된 구성성분들을 분해함으로써 이 조직에서 중요한 항상성 및 리모델링 기능을 담당하고 있다. 배양에서, 파골세포들은 골수의 CFU-GM 전구세포 및 혈액 단핵세포를 M-CSF 및 RANKL에서 배양하여 이로부터 유래될 수 있다. 파골세포 발달을 위한 이들 시토킨의 중요성은 파골세포 결핍 및 이들 두 인자 중 하나의 결실을 갖는 마우스에서의 골경화증에 의해 강조된다. 비록 생체내에서는 공식적으로 나타나지는 않았지만, 순환 혈액 단핵세포가 파골세포 전구체로서 기능한다는 것이 광범위하게 추정되고 있다. 비정상적 파골세포 발달 및/또는 활성은 골다공증, 골화석증 및 골관절염과 같은 고 빈도이며 치료대책이 한정적인 인간 쇠약성 질환에서 주요한 역할을 한다(Boyle WJ et al. 2003; Teitelbaum SL et al. 2003).
마크로파지는 중요한 시토킨 공급원이다. 기능적으로 수많은 산물은 하기 5개의 주요 군으로 분류된다:(1) 염증촉진 반응(proinflammatory response)을 매개하는 시토킨, 즉 염증 세포를 추가적으로 소집하는 것을 도우는 시토킨(예, IL-1 , II-6, TNFs, CC 및 IL-8 및 단핵세포-화학주성 단백질 1과 같은 CXC 케모킨); (2) T 세포 및 자연 살해(NK)세포 활성화를 매개하는 시토킨 (예, IL-1 , IL-12, IL-18); (3) 마크로파지 그 자체에 피드백 효과를 발휘하는 시토킨 (예, IL-1, TNFs, IL-12, IL-18, M-CSF, IFNα/β, IFNγ); (4) 마크로파지를 하향조절하고 및/또는 염증을 종결하는 것을 도우는 시토킨(예 IL-10, TGFβs), (5) 상처 치유에 중요한 시토킨(예, EGF, PDGF, bFGF, TGFβ). 마크로파지에 의한 시토킨의 생성은 LPS와 같은 미생물 산물, 타입 1 T-헬퍼 세포와의 상호작용, 또는 프로스타글란딘, 류코트리엔을 포함하는 가용성 인자, 및 가장 중요하게는 다른 시토킨 (예, IFNγ)에 의해 촉발될 수 있다. 일반적으로 인간 마크로파지는 CD11c, CD11b, CD18, CD26, CD31, CD32, CD36, CD45RO, CD45RB, CD63, CD68, CD71, CD74, CD87, CD88, CD101, CD119, CD121b, CD155, CD156a, CD204, CD206 CDw210, CD281, CD282, CD284, CD286 및 서브세트 매너로 CD14, CD16, CD163, CD169 CD170 및 MARCO을 발현한다. 쥐 단핵세포는 추가적으로 F4/80을 발현하나 CD11c는 발현하지 않는다. 활성화된 마크로파지는 추가적으로 CD23, CD25, CD69 및 CD105을 발현한다.
"수지상 세포" (DC)는 항원제시세포로서, 인비보, 인비트로, 엑스비보 또는 숙주나 개체내에 존재하거나 조혈성 줄기세포, 조혈성 전구세포 또는 단핵세포에서 유래될 수 있다. 수지상 세포 및 이들의 전구체는 다양한 림프성 기관, 예컨대 비장, 림프절 및 골수와 말초 혈액에서 분리될 수 있다. DC는 수지상 세포체에서 여러 방향으로 연장되는 얇은 시트(라멜리포디아) 형상의 특징적인 모양을 갖는다. DCs는 구조적으로 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 발현하며, 이들은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 대해 펩티드 항원을 제시한다. 또한 인간 피부 및 점막 DCs는 CD1 유전자 패밀리, MHC 클래스 I-관련 분자들을 발현하며, 이들은 미생물의 지질 또는 당지질 항원을 제시한다. DC 막에는 T세포와 부착하게 하거나 (예, 세포간 부착 분자 1 또는 CD54) 또는 B7-1 및 B7-2(각각 CD80 및 CD86로도 알려져 있다)와 같은 T-세포 활성화를 같이 자극하는 분자들이 다량 존재한다. 일반적으로 DCs는 CD85, CD180, CD187, CD205, CD281, CD282, CD284, CD286 및 서브세트 매너로 CD206, CD207, CD208 및 CD209을 발현한다.
"정제" 및 "분리"는 폴리펩티드 또는 뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 지칭하는 분자가 다른 생물학적 거대분자가 실질적으로 없는 상태로 존재하는 것을 지칭한다. 세포 또는 세포집단에 관련하여 사용되는 경우, 상기 세포 또는 세포 집단이 다른 세포 또는 세포집단이 실질적으로 없는 상태로 존재하는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 "정제된"은 중량 또는 수로 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 생물학적 거대 분자 또는 동일한 타입의 세포가 존재하는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 "분리된" 핵산 분자는 그 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다;그러나, 상기 분자는 조성의 기본적인 특성에 유해하게 영향을 미치지 않는 다른 부가적인 염기나 부분을 포함할 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 척추동물, 바람직하게 포유동물, 예를 들면 마우스와 같은 쥐, 고양이, 개 및 영장류이다. 가장 바람직한 본 발명의 개체는 인간이다. 가장 바람직하게 본 발명의 방법에 따라 증량된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 인간 세포이다. 본 발명에서, "치료" 또는 "처치"는 상기 용어가 적용되는 질병 또는 상태, 또는 상기 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 예방하거나 그 진행을 역전하거나 경감 또는 저해하는 수단을 의미한다.
장기 배양에서 단핵세포를 생성하고 증량하는 방법
본 발명자들은 단핵세포내에서 MafB 및 c-Maf의 발현을 불활성화함으로써, 상기 단핵세포를 수개월동안 배양에서 생성하고, 유지하고 증량시키는 것이 가능함을 입증하였다.
따라서 본 발명은 생체외 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포의 증량 방법을 제공하며, 상기 방법은 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포 내에서 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해하는 단계; 및 하나 이상의 시토킨 또는 시토킨 수용체 시그널링 작용제 존재하에 상기 세포들을 증량시키는 단계를 포함한다.
상기 출발 물질로서 기능하는 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 본 기술분야의 기술에 의해 분리될 수 있다.
출발 단핵세포를 분리하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있으며, Fluks AJ. (1981 ); Hardin JA. et al. (1981 ); Harwood R. (1974); Elias JA et al (1985); Brandslund I et al. (1982); Pertoft H et al. (1980); Nathanson SD et al. (1977) ; Loos H et al. (1976), Whal SM. et al. (1984)등에 의해 개시된 방법을 포함한다. 마크로파지 및 수지상 세포는 분화에 의해 단핵세포에서 인비트로 유도할 수 있다(Stanley et al., 1978, 1986;Gieseler R et al. 1998, Zhou et al. 1996; Cahpuis et al 1997, Brossart et al. 1998, Palucka et al 1998). 마우스 마크로파지 및 DC는 비장현탁액 (Fukao, T., and Koyasu, S.., 2000; Fukao, T., Matsuda, S., and Koyasu, S. 2000), 복강 (Mishell, B. B. and Shiigi, S. M. (1980) 또는 가장 일반적으로는 다양한 시토킨 칵테일을 사용하여 간 또는 골수 전구세포로부터(Ardavin et al., 2001 ), 수득될 수 있다.
단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 분리하는 다른 표준 방법은 개체에서 세포 집단을 수득하는 단계 및 상이한 항체 결합을 사용하여 하나 이상의 특정 분화 단계에 있는 세포를 분화 항원에 대한 항체로 결합하는 단계로 이루어진다. 형광 활성화된 세포 분류법(FACS) 또한 분리된 세포 집단에서 선택된 분화 항원을 발현하는 원하는 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 마그네틱 비드를 사용하여 세포 집단(MACS)에서 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 분리할 수 있다. 예를 들면, 단클론성 세포 타입 특이적 항체를 라벨한 마그네틱 비드를 사용하여 제대혈액, 말초혈액 또는 PBMCs, 흉막액, 복강액, 또는 윤활액 또는 비장 및 림프절과 같은 다양한 조직에서 인간 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포를 양성 선택할 수 있다. 다른 방법으로는 비-단핵세포의 고갈에 의한 단핵세포의 분리(음성 선택)을 들 수 있다. 예를 들면 비-단핵세포는 CD3, CD7, CD19, CD56, CD123 및 CD235a에 대해 선택된 단클론 항체의 칵테일로 자기적으로 라벨할 수 있다. 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포를 분리하는 키트도 Miltenyi Biotec (Auburn, CA, USA), Stem Cells Technologies (Vancouver, Canada) 또는 Dynal Bioech (Oslo, Norway)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
수지상 세포 및 단핵세포를 분리하고 제조하는 방법은 또한 국제출원WO2004066942 및 미국 특허 제 6,194, 204호에도 기술되어 있다.
대체 방법으로서, 단핵세포 전구 집단을 골수나 제대혈액에서 유도하고, M-CSF내 배양에 의해 엑스 비보로 단핵세포로 분화할 수 있다.
추가적인 대체예로서, 수지상 세포 및 마크로파지는 분리된 단핵세포에서 유도할 수 있다.
예를 들면, 단핵세포는 본 기술분야에서 공지된 기술로 마크로파지로 분화될수 있다. 단핵세포에서 마크로파지로의 분화는 마크로파지 콜로니-자극 인자(M-CSF)에 의해 유발되며, 최근 연구에 따르면 적정한 재조합 인간 M-CSF-유도 분화는 분비된 인터루킨 6 (IL-6)의 자가분비에 관여되며, 이 인터루킨은 단핵세포상에서 기능적 M-CSF 수용체의 발현을 상향조절하며, 마크로파지 세포독성, 수퍼옥사이드 생성, 식균능, 화학주성 및 2차 시토킨 분비를 증강시킨다 (Akira, 1996). IL-6 및 M-CSF의 상호작용은 단핵세포의 마크로파지로의 분화를 조절하며 GM-CSF/IL-4-처치 단핵세포에서 DC 분화를 억제한다(Chomarat et al, 2000, Mitani et al., 2000).
또한 인간 단핵세포는 또한 소수성 백내에서 7일간의 배양에 의해 마크로파지로 분화할 수 있다 (Chokri et al., 1989). 다른 기술 또한 D'Onofrio C et al. (1983) 또는 Gersuk G, et al. (2005)에 기술되어 있다. 다른 방법은 Salahuddin et al. (1982) 및 Hashimoto et al. (1997)에 의해 기술된 방법을 포함한다.
단핵세포는 본 기술분야에 알려진 기술에 의해서 수지상 세포(DCs) 로 분화될 수 있다. 예를 들면 과립세포-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 인터루킨-4 (IL-4)는 단핵세포를 DCs로 분화시킨다. GM-CSF, IL-4, 및/또는 IFN-γ 및/또는 CD40 리게이션을 사용하여 인간 혈액 단핵세포를 수지상 세포로 분화시키는 복수의 방법들이 본 기술분야에 잘 공지되어 기술되어 있다(Gieseler R et al. 1998, Zhou et al. 1996; Cahpuis et al 1997, Brossart et al. 1998, Palucka et al 1998). LC 세포, DC 서브세트은 또한 TGF-β을 사용하여 유도될 수 있다(Strobl et al. 1997).
단핵세포를 파골세포로 분화하는 방법들은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면 M-CSF 및 RANKL은 단핵세포를 OCs로 분화시킨다 (Yasuda, H. et al. 1998; Hsu, H. et al. 1999).
단핵세포의 마크로파지 또는 수지상 세포로의 분화는 MafB 및 c-Maf의 저해 전에 또는 후에 일어날 수 있다.
예를 들면, 특정 실시형태에서, 상기 방법은:
- 단핵세포를 분리하는 단계;
- 상기 단핵세포에서 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해하는 단계;
- 단핵세포를 마크로파지 또는 수지상 세포로 분화시는 조건에서, 상기 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성의 저해된 단핵세포를 배양하는 단계를 포함한다.
이러한 분화를 위해, M-CSF와 같은 시토킨을 채용할 수 있다.
MafB 및 c-Maf의 부재는 M-CSF가 마크로파지 분화에 효과를 내기전에 이에 반응하여 세포 증량기(cell expansion phase)를 연장시키므로, 후술하는 일시적 저해 방법을 사용하여 MafB 및 c-Maf 저해를 종결시킴으로써 증량기의 종결 및 마크로파지 분화를 개시할 수 있다. 또는 M-CSF 농도는 매질내 감소될 수 있고 IL-6과 함께 직접 보충될 수 있다.
c-Maf 및 MafB의 발현 또는 활성 저해는 어떠한 기술에 의해서 성취되어도 좋다.
일 특정 실시형태에서, MafB 및 c-Maf의 발현은 siRNA 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임을 사용하여 저해된다.
안티센스 RNA 분자 및 안티센스 DNA 분자를 포함하는 안티센스올리고뉴클레오타이드는 MafB 및 c-Maf mRNA에 결합하여 그 번역을 직접 차단하고 따라서 단백질 번역을 방지하거나 또는 mRNA 분해를 증가시키고, 따라서 c-Maf 및 MafB 단백질 수준을 감소시키고, 그 세포내 활성도 감소시킨다. 예를 들면, 약 15개 이상의 염기를 가지며 MafB 및 c-Maf를 코딩하는 mRNA 전사체 서열의 고유한 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 종래의 포스포디에스테르 기술에 의해 합성될 수 있다. 안티센스 기술을 사용하여 서열이 알려져 있는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다 (예를 들면 U.S. 특허 6,566,135; 6,566,131 ; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091 ; 6,046,321 ; 및 5,981,732를 참조). c-Maf에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 특이적인 방법은 미국 특허 6,274,338에 기술되어 있다.
작은 저해성 RNAs (siRNAs) 또한 본 발명에서 c-Maf 및 MafB의 발현 저해제로서 기능할 수 있다. C-Maf 및 MafB 유전자 발현은 단핵 세포를 작은 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 작은 이중 가닥 RNA의 생성을 유발하는 벡터 또는 구축체와 접촉시켜 c-Maf 및 MafB의 발현이 특이적으로 저해되도록 하여 감소시킬 수 있다(즉, RNA 간섭 또는 RNAi). 서열이 알려져 있는 유전자에 적합한 dsRNA 또는 dsRNA-인코딩 벡터를 선택하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); U.S. Pat. Nos. 6,573,099 and 6,506,559; 및 국제출원 WO 01/36646, WO 99/32619, 및 WO 01/68836 참조). c-Maf에 대해 siRNAs를 제조하는 특이적인 방법도 미국 특허 6,274,338에 기재되어 있으며, MafB에 대해서는 참조 Kim et al. 2006에 기재되어 있다.
리보자임(Ribozymes) 또한 본 발명에서 c-Maf 및 MafB의 발현 저해제로서 기능할 수 있다. 리보자임은 RNA의 특이적 분해를 촉매할 수 있는 효소성 RNA 분자이다. 리보자임 활성 기전에는 리보자임 분자의 상보성 타겟 RNA에로의 서열특이적인 혼성화 및 이에 후속되는 엔도뉴클레오리틱 분해(endonucleolytic cleavage)가 연관된다. c-Maf 및 MafB mRNA 서열의 엔도뉴클레오라틱 분해를 특이적이고 효과적으로 촉매하는 공학적 헤어핀 또는 해머헤드 모티프 리보자임 분자가 본 발명의 범위내에서 유용하다. 어떤 잠재적 RNA 타겟내 특이적 리보자임 분해 부위는 리보자임 분해 부위를 위한 타겟 분자 스캐닝에 의해 초기에 동정되며, 이들은 통상 하기 서열, GUA, GuU 및 GUC을 포함한다. 일단 동정되면, 상기 분해 부위를 포함하는 타겟 유전자의 영역에 상당하는 약 15 내지 20 리보뉴클레오타이드의 짧은 RNA 서열이 예측되는 구조적 특징, 예를 들면 올리고뉴클레오타이드 서열을 부적합하게 하는 2차 구조등을 갖는지 여부에 대해 평가된다. 후보 타겟의 적합성은 예를 들면 리보뉴클레아제 방어 검사를 사용하여 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 혼성화 적합성을 테스트하여 평가할 수 있다.
c-Maf 및 MafB 발현 저해제로서 유용한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임은 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 이들은 화학적 합성 기술, 예를 들면 고체상 포스포라마다이트 화학 합성 기술 등을 포함한다. 또는 안티센스 RNA 분자는 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열을 인비트로 또는 인비보 전사하여 생성할 수 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 광범위한 벡터내에 삽입될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 다양하게 변경될 수 있다. 가능한 변경으로는 비제한적으로, 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 부가하거나, 또는 올리고뉴클레오타이드 백본내에 포스포디에스테라제 연결 대신 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 2'-O-메틸을 사용하는 것이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임은 단독으로 또는 벡터와 함께 수송될 수 있다. 가장 넓은 의미에서, "벡터"는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임을 단핵 세포내로 수송을 촉진할 수 있는 어떤 매체를 지칭한다. 바람직하게, 벡터는 벡터가 없는 경우 초래되는 분해 정도에 비해 감소된 분해 정도로 핵산을 세포내로 수송한다. 일반적으로 본 발명에서 유용한 벡터는 비제한적으로, 본 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임 핵산 서열을 삽입 또는 포함하도록 조작된 플라즈미드, 파지미드, 바이러스, 바이러스 또는 박테리아에서 유래되는 기타 매개체를 포함한다.
단핵세포내로 siRNAs, 리보자임 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 수송하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 비제한적인 예로, 트랜스펙션, 전기천공법, 마이크로주입법, 리포펙션법, 칼슘 포스페이트 매개된 트랜스펙션 또는 유전자서열을 함유하는 바이러스 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체 매개의 유전자 이동, 마이크로세포 매개의 유전자 이동, 스페로플라스트 융합( spheroplast fusion) 등을 포함한다. 외래 유전자를 세포내로 도입하는 수많은 기술들이 본 기술분야에서 공지되어 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 단 이때 수여자 세포의 발생학적 및 생리학적으로 필요한 기능이 훼손되지 않아야 한다. 상기 기술은 유전자를 세포내로 안정하게 이동시켜 세포내에서 유전자가 발현될 수 있고, 상기 세포의 후손에 의해 유전되며 발현된다. 통상 이동 방법은 선택적인 마커의 세포내 이동을 포함한다. 이후 세포는 전달된 유전자를 발현하는 세포들을 분리 선택한다. 이러한 세포들은 개체내로 전달된다. 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 코딩 유전자의 단핵세포로의 일시적 전달을 위해 상기 기술을 변형할 수 있으며, 이로써 항구적인 유전적 변경없이 단핵세포의 일시적인 엑스비보 또는 인비보 증량을 가능하게 할 수 있다.
일 실시형태에서, MafB 및 C-Maf의 발현은 프로모터 활성, RNA 프로세싱 또는 단백질 안정성에 작용하는 화합물에 의해 저해될 수 있다.
다른 실시형태에서, MafB 및 C-Maf의 활성 저해는 야생형 MafB 및 C-Maf와 경쟁하는 돌연변이 MafB 및 C-Maf 폴리펩티드를 사용하여 성취될 수 있다.
이러한 기술은 일반적으로 "우세 음성 돌연변이체(dominant negative mutants)" 기술로 지칭된다. 우세 음성 돌연변이체는 상응하는 야성형 천연 버젼에 대해 천연 펩티드의 생물학적 활성에 요구되는 활성 부위에서의 아미노산 잔기 위치를 변경하는 위치에서, 서열에서 한 위치 이상이 변경된 폴리펩티드 또는 핵산 코딩 영역 서열을 말한다.
예를 들면, 우세 음성 돌연변이체는 DNA 결합 및 트랜스 활성화를 위해 MafB 및 C-Maf의 경쟁적 저해제로 활동할 수 있는 N-말단 효과자가 없는 끝이 잘린(truncated) MafB 및 C-Maf 분자로 이루어질 수 있다 (Kelly et al. 2000). c-Maf/MafB 억압의 효율성은 저해 기능을 증강하는 억압자 도메인에 융합함으로써 더 개선할 수 있다.
본 발명의 방법은 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 인 비트로에서 우세 음성 돌연변이체에 노출시킴으로써 달성된다. 상기 노출은 우세 음성 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 세포를 트랜스팩션함으로써 이루어지고, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 우세 음성 돌연변이체를 발현시켜 MafB 및/또는 c-Maf 활성을 저해시킨다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 트랜스팩션하는 방법은 전술한 방법으로 구성된다.
상기 노출은 또한 단핵세포, 마크로파지 및/또는 수지상 세포를 직접 우세음성돌연변이체에 노출함으로써, 예를 들면 상기 세포를 바람직하게 내재화 부분(internalization moiety)과 결합된 펩티드와 접촉시킴으로써 매개될 수 있다. 적합한 내재화 부분은 본 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, HIV의 TAT 폴리펩티드 또는 안테나페디아(Antennapedia) 또는 다른 호메오단백질(homeoproteins)에서 유도된 펩티드 내재화 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또는 리포좀 및 타겟 세포의 표면 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편 또는 리간드에 의해 매개되어 전달될 수 있다.
또는 활성저해제는 인산화, 아세틸화, 메틸화, 리보실화, 유비퀴틴화, 소 유비퀴틴 양 분자 변경(수모화, 네딜화 등)와 같은 효소적 번역후 변경 저해제 분자, 또는 형성 또는 조-활성화제 또는 조-억제자와의 상호작용을 변경하는 분자로 구성될 수 있다.
또는 활성 저해제는 DNA 결합, 다이머화 또는 조인자 상호작용의 저해자로 구성될 수 있다.
활성 저해자들은 거대분자 또는 소유기분자들을 포함할 수 있다. "소유기분자"는 일반적으로 의약품으로 사용되는 유기 분자와 유사한 크기의 분자를 지칭한다. 상기 용어는 생물학적 거대분자(예, 단백질, 핵산 등)을 배제한다. 바람직한 소유기분자의 크기 범위는 약 5000 Da 까지, 바람직하게는 2000 Da 까지, 가장 바람직하게는 약 1000 Da 까지이다.
상술된 방법은 하나 이상의 시토킨의 존재하에 상기 세포를 증량하는 단계를 포함한다.
시토킨은 비제한적인 예로, SCF, Flt3 리간드, II-3 및 M-CSF를 포함한다. 이러한 시토킨은 상업적으로 입수가능하다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 세포들은 M-CSF존재하에서 유지되고 증량된다. 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF)는 콜로니 자극인자(CSFs)로 지칭되는 단백질 패밀리의 일원이다. M-CSF는 분비 또는 세포 표면 당단백질로서, 두 서브유닛이 디설파이드 본드로 결합되고 전체 분자 중량은 40 내지 90 kD이다 (Stanley ER et al. 1997). 수개의 분비 및 막 결합 변이체가 알려져 있다(Pixley and Stanley, 2004). M-CSF는 마크로파지, 단핵세포, 파골세포, 내피세포, 인간 관절 조직 세포, 예를 들면 연골세포 및 윤활 섬유모세포에 의해, 인터루킨-1 또는 종양괴사인자-알파와 같은 단백질에 반응하여 생성된다. M-CSF는 다능성 조혈성 전구 줄기세포에서 마크로파지 콜로니의 생성을 자극한다 (Stanley E. R., et al., MoI. Reprod. Dev., 46:4-10 (1997)). M-CSF는 단핵세포/마크로파지의 기능, 활성화 및 생존의 중요한 조절자이다. 재조합 쥐 또는 인간 M-CSF는 R&D SYSTEMS, ABCYS, PREPOTECH, SIGMA 또는 STEM CELL TECHOLOGIES에 의해 시판되고 있다.
배양 매질내 M-CSF 농도는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게 5 내지 50 ng/l이며, 특히 바람직하게는 10 ng/l이다.
또는 쥐 M-CSF (ATCC에서 수득가능: CCL-1) 공급원으로서 L929 섬유모세포의 20% 상등액을 함유하는 배양 매질내에 상기 세포를 배양할 수 있다. 인간 M-CSF 공급원으로서는 KPB-M15 세포주를 사용할 수 있다.
이와 같이 수득된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 한달 이상, 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 또는 12 개월 동안 배양될 수 있다.
MafB/c-Maf 결핍 세포:
본 발명의 방법은 치료학적 분야에서 큰 관심의 대상인 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포의 생성을 결과한다.
본 발명은 따라서 전술된 방법에 의해 수득가능한 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 분리된 형태이다.
본 발명은 또한 MafB 및 c-Maf을 발현하지 않는 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 MafB 및 c-Maf 유전자가 결핍되어 있다.
상기 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 어떤 종에서 부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 쥐나 인간 기원이다.
상기 세포가 수지상 세포인 경우, 상기 세포를 항원으로 감작(sensitize)하는 것이 유용하다. 이를 위해 수지상 세포를 관심 항원 분자 또는 항원성 펩티드와 약 30분 내지 5시간 동안 접촉할 수 있다("펩티드 또는 항원 펄싱"). 또는 수지상 세포를 항원 또는 항원 펩티드를 발현하는 세포 또는 세포막, 항원 또는 항원 펩티드를 포함하는 리포좀 또는 항원 또는 항원 펩티드를 코딩하는 RNAs와 접촉시킬 수 있다.
본 발명은 특히 전술한 수지상 세포, 즉 MafB 및 c-Maf이 결핍되며, 항원성 분자를 더 적재(loaded)한 수지상 세포에 관한 것이다.
상기 항원성 분자는 면역반응을 일으킬수 있는 분자를 지칭한다. 항원분자의 예로는 바이러스성 단백질 또는 펩티드, 박테리아성 단백질 또는 펩티드, 또는 암 항원, 예컨대 MART-1, MAGE, BAGE, PSA, p53, Rb, Ras 등을 들 수 있다.
마우스 단핵세포
본 발명은 또한 쥐 단핵세포(murine monocyte)를 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) MafB 및 c-Maf 인자가 결핍된 마우스에서 유래된 단핵세포를 분리하는 단계 및
ii) 상기 세포를 M-CSF 존재하에서 배양하는 단계.
MafB 및 c-Maf가 결핍된 마우스 배아는 MafB 결핍 마우스와 c-Maf 결핍 마우스를 교배하여 수득할 수 있다. MafB 결핍 마우스의 생성은 이미 개시된 바 있다 (Blanchi B. et al., 2003). c-Maf 결핍 마우스의 생성 또한 이미 기술되었다 (Kim JL. et al. 1999). MafB 및 c-Maf 결핍 조혈 시스템을 갖는 마우스는 조사된 마우스를 MafB 및 c- Maf 결핍 태아 간 세포로 재구성함으로써 수득될 수 있다. 이러한 방법은 하기 실시예에 기술된다.
본 발명은 또한 loxP/Cre 리콤비나제 시스템(loxP/Cre recombinase system)을 사용하여 MafB 및 c-Maf의 조직 특이적 결실에 의해 수득될 수 있는 MafB/Cmaf 결핍 쥐 단핵세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전술한 방법에 의해 수득가능한 MafB/Cmaf 결핍 쥐 단핵세포에 관한 것이다.
MafB/c-Maf 결핍 쥐 마크로파지, 또는 수지상 세포는 전술한 분화 기술을 통해 수득될 수 있다.
세포 치료
본 발명에 따라, 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포는 쉽고 효율적으로 인비트로에서 생성될 수 있다. 다수의 인 비트로 증량된 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포를 수득할 수 있는 능력은 치료적 분야에서 새로운 기회를 연다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 상기에서 정의된 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항원 분자를 적재한 상기 정의된 수지상세포를 포함하는 백신용 약학적 조성물을 제공한다.
단핵식균시스템 (단핵세포 및 마크로파지)은 숙주내에서 항상성을 담당하는 기관내에 분포되어 있다. 이러한 시스템은 지속적인 조직 손상 또는 대사 장애가 존재하는 모든 질병 과정에 관련된다. 마크로파지 및 단핵 세포는 급성 및 만성 염증을 매개하며, 식균작용 및 피브린 분해작용에 의한 죽은 세포 및 피브린의 제거를 통해 복구를 촉진하고, 혈관 생성(혈관 형성)을 유발하고 섬유모세포 침범 및 세포외 매트릭스 생성을 조절한다. 이들은 열을 포함하는 숙주의 조직적인 반응을 동원하고, 스트레스 호르몬 및 다른 호르몬을 방출 및 대사하고, 다른 세포의 대사 활성을 증강시키며, 조직에 혈류가 더욱 흐르게 영향을 주며 모세혈관 투과성에 영향을 미치는 매개자를 생성한다. 마크로파지는 그 자체가 기능에 있어 상당한 이질성을 나타내며, 종종 특정 숙주 반응의 전개에 의존하여, 예컨대 단백분해 활성 또는 염증촉진 및 항염증 시토킨 생성과 같은 성질의 저해제 및 활성화제를 발현한다.
따라서 본 발명은 단핵 세포 부분의 결핍에서 초래되는 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에 MafB 및 c-Maf 발현 또는 활성이 저해된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포, 바람직하게는 MafB 및 c-Maf 결핍 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 암, 급성 또는 후천적 면역 결핍증, 만성 또는 급성 상해, 상처, 퇴행성 질환, 자가면역 질환, 만성 염증 질환, 동맥경화증, 다발성 관절염, 골관절염, 골다공증, 염증 질환(예, 바이러스 또는 박테리아 감염), 및 대사 질환으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.
면역결핍증은 후천적이거나 선천적이거나 또는 방사선치료/화학치료요법의 결과로서 기인되는 것들을 포함한다. AIDS는 특히 고려된다. 또한 본 발명은 항원-특이적 암 면역요법의 발전 가능성을 제공한다.
본 발명에 따른 마크로파지는 HIV 감염 치료에 유용할 수 있다. 중성구(다형핵백혈구[PMNL]) 및 마크로파지 세포의 기능부전은 실제 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1) 감염 결과로서 발생한다. 마크로파지는 PMNL 아폽토시스소체(apoptotic body)를 섭취하여 조기 염증 해결에 기여한다. 최근 연구에서 PMNL 아폽토시스소체에 대한 손상된 마크로파지 식균작용이, HIV-감염 개체에서 특히 결핍 식균 활성에 의한 기회 감염 동안, 염증 상태의 지속에 기여하는 것으로 제안되었다(Torre D et al. 2002). 따라서 전술한 마크로파지 생성 방법은 HIV 감염된 개체의 치료에 유용하다.
사이클로포스파미드(CP)와 같은 항암제를 사용하는 화학요법을 받고 있는 환자들은 혈액 백혈구감소증과 함께 조직 마크로파지 집단 크기가 굉장히 감소한다. 이러한 환자들은 따라서 그램-음성 박테리아성 폐렴을 포함하는 기회감염에 특히 민감하다. 이러한 기회 감염은 화학요법을 받고 있는 암환자의 통상적인 치사원인이다 (Santosuosso M, et al. 2002). 따라서 전술한 마크로파지 생성 방법은 화학요법을 받고 있는 개체의 치료에 유용하다.
마크로파지는 세포 대 세포 접촉에서 전구체 세포 아폽토시스를 저해할 수 있으며 조직 복구를 위한 효율적인 세포 생착을 위한 기질 지지대로서 기능할 수 있다(예를 들어 WO2005014016를 보라). 특히 마크로파지는 근육성 전구체 세포 아폽토시스를 저해할 수 있다. 따라서 전술한 바와 같이 마크로파지를 생성하는 방법은 질환 또는 손상으로부터 유발될 수 있는 뼈나 근육 병변과 같은 병변 치료에 유용하다. 이는 예를 들면 뼈 골절 또는 근육 파열일 수 있다. 본 발명의 특정 일 실시형태에서, 상기 병변은 심장 병변 또는 손상일 수 있다. 특히, 예를 들면 심근 경색, 심부전, 관상동맥 혈전증, 확장 심근병증 또는 어떠한 유전적 결함에 의해 초래되거나 후속하는 심근부전 등일 수 있다. 따라서 전술한 바와 같이 마크로파지 생성 방법은 침윤심장근육병증 또는 안트라사이클린 독성으로 인한 심장근육병, 또는 HIV 감염에 따른 심장근육병 등과 같이, 치료의 진전에도 불구하고, 예후가 나쁜 급성 심부전의 치료에 유용하다.
따라서 전술한 바와 같은 마크로파지 생성 방법은 척수 손상의 치료에 유용하다. 완전 척수 손상(SCI)의 치료는 실제 피부 조직과 공배양에 의해 상처 치유 표현형을 습득한 마크로파지의 자가이식으로 구성된다(Schwartz M et al. 2006).
마트로파지는 상처 치유에 필수적이며, 따라서 전술한 바와 같이 마크로파지 생성 방법은 상처 치유의 증진 및/또는 조직 손상의 복구에 유용하다. 상처 치유 과정은 3상으로 이루어진다. 염증상 동안에는 수많은 효소와 시토킨이 마크로파지에 의해 분비된다. 이들은 상처 찌꺼기를 제거하는 콜라게나제, 섬유모세포를 자극(콜라겐의 생성을 위해)하고 혈관형성을 촉진하는 인터루킨 및 종양괴사인자(TNF); 및 상처를 입은 치유 피부에서 각질세포를 자극하는 형성 성장 인자α (TGFα)를 포함한다. 이 단계는 조직 복구 과정, 즉 증식상으로 들어가는 전이단계이다.
마크로파지는 만성 염증 및 자가 면역질환에서 중요한 역할을 하며, 통상 이 조건하에서 특이적인 방식으로 활성화되거나 과활성화된다. 단핵세포는 전술한 방법을 유전적으로 변경하거나 약물학적으로 처치하거나 또는 시토킨이나 성장인자와 같은 생활성 물질에 의해 활성화하거나 자극하여 개체에 도입되기전에 원하는 표현형을 가지도록 증폭하여 원하지 않는 활성을 갖는 마크로파지와 경쟁하거나 대신한다.
암은 대부분의 선진국에서 2번째 주된 치사원인이며 프랑스 및 미국에서 각각 매년 약 150,000 및 550,000명이 치사한다. 모든 암의 반이상이 치료될 수 있음에도 불구하고, 수술이나 방사성 요법에 의해 치료되지 않는 평균적인 암 환자는 여전히 다른 어떠한 치료에 의해서도 치료될 가능성이 10% 미만이다 (A. Grillo-Lopez, 2003). 암감시 및 암예방에서 면역시스템이 매우 중요한 역할을 한다는 것은 오랫동안 가설화되어 왔으며, 최근 인정되고 있다.
마크로파지는 암의 백혈구 침윤물의 중요한 구성성분이며 암 형성 및 진전에 긍정적인 영향 및 부정적인 영향 모두를 나타내며, 최종 결과는 대부분 암 관련 마크로파지(TAM)의 미세환경 의존적인 극성화에 의존한다. 엑스비보 증폭 및 변경된 마크로파지는 따라서 마크로파지에 원하는 극성 프로파일을 갖도록 하거나 암 부위에 치료적 유전자 구축체 또는 시약을 운반하는데 치료학적으로 유용하다. (Bingle et al., 2002) (Mantovani et al., 2002). 또한 수지상 세포(DC)는 나이브 T 세포(naive T cells)를 초회감작하여 암 재발에 대해 장기적인 방어를 제공할 수 있는 효과 세포가 되도록 한다. 이러한 두 타입의 세포에 기반한 세포 치료는 암 환자 치료에 매우 유망한 도구로 보인다. 따라서 전술한 바와 같은 마크로파지 및/또는 수지상 세포의 생성 방법은 암 질환의 치료에 유용하다.
수지상 세포는 박테리아 추출물 및 인터페론-감마를 짧게 처치하여 성숙되도록(성숙 DC) 유도할 수 있다. 또한 암에 대한 치료적 백신화는 동물 모델에서 장기적인 방어를 제공하는 것으로 나타났다. 암(또는 암 세포주) 용해물은 CD8 및 CD4 T 세포 반응을 촉발하는 복수의 암 항원의 매력적인 공급원을 구성한다. 따라서 수지상 세포를 이러한 암 항원과 함께 펄스(pulse)하는 것은 암 치료 수단이 된다.
따라서 본 발명의 방법은 마크로파지 및/또는 수지상 세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물의 제조에 유용하다. 암은 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구인두암, 후두인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담도암, 소장암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식관 암(자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모막암종 및 임신영양모세포병을 포함), 남성 생식관 암(전립선암, 정낭암, 고환암 및 배아세포종 포함), 내분비선암(갑상선암, 부신암 및 뇌하수체암 포함), 피부암 및 헤만지오마(hemangiomas), 흑색종(melanomas), 육종(뼈, 연조직에서 발생하는 것과 카포시 육종 포함) 및 뇌암, 신경암, 별아교세포종과 같은 안암, 신경아교종, 글리오마(gliomas), 아교모세포종, 레티노블라스토마(retinoblastomas), 신경종, 뉴로블라스토마(neuroblastomas), 신경집종 및 수막종, 및 백혈병, 호지킨 및 비호지킨 림프종과 같은 조혈성 악성에서 유래되는 암들을 포함한다. 암 치료에 있어서, 예를 들면 수지상 세포는 암 항원과 함께 펄스될 수 있으며, 예를 들면 이미 발병한 암의 치료를 위해 또는 전술한 바와 같이 암 형성을 예방하기 위해 투여된다.
다른 실시형태에서 본 발명의 수지상 세포는 암 세포와 융합될 수 있으며, 환자에 투여되어 융합된 수지상 세포는 항원제시세포로서 항원을 면역 시스템에 제시한다. 수지상 세포는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 다른 세포, 예컨대 암세포에 융합될 수 있다. 예를 들면 수지상 세포를 암세포와 융합시키는 방법 및 동물에 투여하는 방법은 Gong et al. (Nat. Med. 3 (5): 558- 561 (1997)) and Guo et al. (Science 263: 518-520 (1994))에 상세히 개시되어 있다. 암 세포는 환자에 표적화될 어떠한 형태의 암 세포도 무방하며, 예컨대 유방암, 간암, 피부암, 설암, 췌장암, 전립선암, 예컨대 방광암 등과 같은 요로암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 림프절암, 예컨대 후두암과 같은 호흡기관암, 식도암, 폐암, 예컨대 위암, 대장암, 소장암, 결장암, 직장암과 같은 소화기관암, 골암, 혈액암, 갑상선암, 및 고환암 또는 예컨대 수지상 세포 등과 같은 다른 세포에 융합하기에 적합한 것으로 본 기술분야에 알려져 있는 어떠한 암 세포주를 들 수 있다.
수지상 세포를 병원성(바이러스, 박테리아 또는 기생충) 항원으로 적재하여 감염성 질환에 대응하는데 상기와 유사한 백신화 프로토콜이 적용된다.
바람직한 일 실시형태에서, 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포는 투여될 개체에서 직접 수득된다. 그 경우 이식으로 자가적이다. 그러나 다른 실시형태에서 이식은 비자가적으로 이루어질 수 있다. 비자가 이식의 경우, 수여자는 바람직하게 이식된 세포 거부 반응의 우려를 경감하기 위해 면역억제제를 투여한다. 본 발명에 따른 세포 투여방법은 비제한적으로 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내 및 경막외 투여를 포함한다. 세포들은 어떤 편리한 경로로 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여경로는 바람직하게 정맥 또는 피부내 투여이다. 이식된 단핵세포 및/또는 마크로파지 및/또는 수지상 세포는 특정 질병 또는 질환의 치료에 효과적이며 그 역가는 질병 또는 상태의 성질에 의존하고 표준적인 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한 인비트로 검사를 선택적으로 채용하여 적정 용량 범위를 정할 수 있다. 제제에서 채용될 정확한 용량은 투여경로 및 질병 또는 질환의 심각성에 의존하며, 시술자 및 각 개체의 상황에 따라 결정된다.
약학적 조성물:
본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 이 조성물은 치료학적으로 유효한 양의 본 발명에 의해 제조된 단핵세포 및/또는 마크로파지 및/또는 수지상 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 전술한 "치료학적으로 유용한 양"의 세포는 어떠한 의학적 치료에 적응가능한 합리적인 이점/위험 비율로 질병 또는 질환을 치료하기에 충분한 세포 양을 의미한다. 그러나 본 발명 조성물의 전체 하루 용법은 주치의의 건전한 의학적 판단 범위내에서 결정된다. 어느 특정 환자를 위한 치료학적으로 유용한 용량의 특정 수준은 치료될 질환, 질환의 심각성; 채용되는 특정 화합물의 활성; 채용되는 특정 조성물, 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강 상태, 성 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 채용되는 특정 화합물의 배설 속도; 치료 지속 기간; 사용되는 특정 세포와 조합 또는 동시에 사용되는 약물 등 의학분야에 잘 알려져 있는 인자 등을 고려하여 결정된다.
약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 비제한적으로, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 이들의 조합을 포함한다. 담체 및 조성물은 살균될 수 있다. 제형은 투여 모드에 적당하게 되어야 한다. 필요한 경우, 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 인간에 정맥 투여되도록 적응된 약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제형화된다. 통상적으로 정맥 투여용 조성물은 멸균등장수성완충액이다. 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 조작 방법:
본 발명의 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포는 관심 단백질을 코딩하는 치료학적으로 관심 핵산을 발현하도록 추가적으로 유전공학적으로 조작될 수 있다.
적합한 관심 유전자는 성장 인자를 포함한다. 예를 들면 본 발명의 세포는 개체에 유전공학적으로 조작된 세포의 이식에 의해 혜택을 주는 유전자 산물을 산출하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 이러한 유전자 산물은 비제한적인 예로, 항염증인자, 예컨대 항-TNF, 항-IL-1, 항-II-6, 항-IL-2 등을 들 수 있다. 또는 본 발명의 세포는 거부 위험을 낮추기 위해 MHC 발현을 "녹아웃"하도록 유전공학적으로 변경될 수 있다.
마크로파지는 근육 세포 또는 간세포와 융합될 수 있는 것으로보고 되었으며, 이들 세포에서 유전적 결함을 교정할 수 있다 (Camargo et al., 2003) (Camargo et al., 2004) (Willenbring et al., 2004). 따라서 본 발명의 세포는 유전 질환에서 돌연변이된 정상 또는 과활동성 유전자 변이체의 복수 또는 단일 카피를 발현하도록 조작될 수 있다. 비제한적 예로서 간에서의 효소결핍이나 뒤시엔느 근위축증에서 디스트로핀을 들 수 있다.
마크로파지는 암 침윤물의 중요한 구성성분이다. 본 발명의 세포에 의해 발현될 적합한 관심 유전자는 항종양활성을 갖는 유전자 일 수 있다.
또한 본 발명의 세포는 siRNA 또는 안티센스 또는 세포내 안정적으로 또는 일시적으로 도입되는 siRNA 또는 안티센스에 의해 유전자 발현을 저해하도록 조작될 수 있다. 저해를 위한 타겟은 비제한적으로 염증성 시토킨, 프로테아제, 전사인자 및 염증 경로에 영향을 주는 효소 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 세포는 분화 및/또는 증식을 촉진하는 성장 인자를 발현하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다.
본 발명의 단핵세포, 마크로파지 및 수지상 세포는 관심 분자를 갖도록 추가적으로 유전공학적으로 조작될 수 있다. 적합한 관심 분자(또는 유전자)는 프로테아제 저해제 또는 프로테아제의 녹다운제, 염증 매개체, 시토킨, 케모킨, 프로테아제의 발현을 전반적으로 저해하는 전사 인자 또는 이들의 우세 버젼, 또는 항염증 매개체, 시토킨, 케모킨, 프로테아제를 전반적으로 유도하는 전사 인자 또는 이들의 우세 버젼 등을 들 수 있다. 관심 유전자는 선택적으로 마크로파지의 M1/M2 극성화에 효과를 나타내는 시토킨 및 효소(11-4,11-10,11-13, TGFβ), 또는 파골세포 분화를 저해하는 시토킨 (항 RANKL, OPN), 또는 성장인자 및 상처치유를 자극하는 프로테아제 저해제(such as PDGF, EGF, SLPI) 또는 항 바이러스 펩티드를 코딩할 수 있다.
상기 유전자의 수송은 전술한 바와 같이 본 기술분야에 알려져 있는 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다.
재생 의학:
도너 기관의 부적절한 공급때문에 동종이식에 대한 대안이 절실히 요청된다. 세포 대체 치료는 간, 췌장 또는 소도세포 이식에 대한 유망한 대안이 될 수 있다. 이러한 요법은 또한 이식이 불가능하거나 적응증이 아닌 기관 시스템에서도 치료 선택 기회를 제공할 수 있다. 최근 줄기세포나 전구세포 뿐 아니라, 성숙 단핵세포나 마크로파지를 포함하는 수임 골수-단핵세포(committed myelo-monocytic cells)도 기관 재생, 특히 간이나 이자의 재생을 목적으로 하는 표적화되고 잘 조정된 세포 치료에 상당한 잠재력을 제공하는 것으로 나타났다. 쥐 및 인간 기원의 이러한 성숙한 골수-단핵세포들은 상이한 마우스 모델에서 간이나 베타섬 췌장 조직에 상당히 기여하며 이들 기관에서 조직 특이적 기능을 수행하는 것으로 보고되었다(Camargo, F. D., Green, R., et al, 2003; Willenbring, Bailey et al. 2004; Ruhnke, Ungefroren et al. 2005). 그 기전은 아직 완전히 명쾌하게 알려진 것은 아니나, 이러한 관찰은 손상된 기관에 마크로파지를 직접 투여하거나 그 증식성 전구세포들을 체계적으로 이식하는 것이 매우 매력적이며 비침습적인 치료학적 전략이 될 수 있음을 보여준다. 그러나 단핵세포를 배양에서 충분한 수로 증폭시키기 어렵다는 사실은 이러한 접근의 임상적 응용의 전망을 어둡게 한다.
본 발명의 방법에서 수득되는 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포들은 재생 의학 예를 들면 손상된 기관에 직접 투여하거나 전신적 이식에 사용될 수 있다.
스크리닝 방법:
어떤 질병에서는 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 파괴하거나 그 수를 줄이거나 또는 감염된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 표적하거나 치료하는 것이 요망된다. 이런 경우 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포에 표적하는 약물을 개발하는 것이 요망된다.
단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 생성하는 본 발명의 방법은 이러한 약물을 스크리닝하는데 유용할 수 있다.
본 약물 스크리닝 방법은 상기 정의된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 후보 화합물과 접촉하는 단계 및 상기 화합물이 상기 세포와 결합하고 선택적으로 파괴하여 그 증식을 억제하거나 그 행동을 변경시키는 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 특히 상기 후보 화합물은 특정 자극, 예를 들면 시토킨에 반응하는 상기 세포의 행동(예, 분화 능력)을 변경할 수 있다.
예를 들면, 수개의 병원체는 마크로파지내에서도 침입 및 생존을 위해 공포 경로(vacuolar pathway)를 사용하는 다양한 전략에 의해 식균 과정을 전복할 수 있다. 다른 예로는 유기체가 섭취되지 않고(마이코플라즈마), 효소적으로 옵소닌을 파괴하고, 융합 및 산성화를 방해하고(마이코박테리아), 새로운 막을 소집하거나(레지오넬라), 다른 기관을 소집하는 것을 들 수 있다. 크루스파동편모충 및 칸디다 알비칸스는 리소좀을 신속하게 소집하여, 그들 자신의 분화를 촉진한다. 리슈만편모충은 파고리소좀내에서 자유롭게 증식할 수 있는 반면 리스테리아 모노시토게네스는 리소좀막을 파괴하고 세포질내로 들어가 세포내 이동 및 세포내 전파를 위한 액틴 폴리머화를 개시한다. 브루셀라속 박테리아는 포유동물 숙주의 마크로파지내에서 증식하고 생존할 수 있는 세포내 병원체이다. 이 병원체는 여러가지 전략을 사용하여 마크로파지의 방어 기전을 피하고 증식에 필요한 기관들을 생성한다. 최종적으로 통성 세포내 병원체 살모넬라 엔테리카는 마크로파지에서 프로그램화된 세포 치사를 유발한다.
따라서 전술한 바와 같은 마크로파지 생성 방법은 마이코플라즈마, 마이코박테리아, 레지오넬라, 크루스파동편모충(Trypanosoma), 리슈만편모충(Leishmanias), 리스테리아(Listeria), 브루셀라 또는 살모넬라와 같은 병원체에 대한 약물을 스크리닝하는데 유용할 수 있다.
마크로파지는 또한 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)의 체내 초기 감염, 전염 및 지속에 기여한다. 다른 HIV 균주에 의한 마크로파지감염에 영향을 주는 기지 인자는 CD4 및 바이러스 침입에 대한 케모킨 조수용체(chemokine coreceptors)이다.
따라서 전술한 바와 같은 마크로파지 생성 방법은 HIV 감염에 대한 약물 스크리닝에 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 만성 염증 및 자가면역(다발성 관절염, 크론병 또는 다발 경화증), 또는 마크로파지 관련된 염증성 종양이 강하게 기여하는 암에 대해 사용되기 위한 마크로파지 내 염증반응을 저해하는 약물의 스크리닝에 유용하다.
또한 전술한 바와 같은 마크로파지 생성 방법은 상처 치유 또는 흉터 경감을 촉진하는 약물 스크리닝에 유용하다.
또한 전술한 바와 같은 마크로파지 생성 방법은 골관절염 및 골다공증에 사용되기 위한 파골세포 분화 저해제의 스크리닝에 유용하다.
도 1: wt(야생형; 흰색) 또는 MafB/c-Maf 이중 결핍 (검은색) E14.5 배아에서 온 20,000 태아 간 세포들을 재조합 SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, 및 EPO를 함유하는 시토킨 혼합을 함유하는 반고형 매질 (A) 또는 10ng/ml의 재조합 M-CSF만을 함유하는 반고형 매질(B), GM-CSF만을 함유하는 반고형 매질 (C), G-CSF만을 함유하는 반고형 매질 (D) 또는 II-3만을 함유하는 반고형 매질 (E)에서 인큐베이션하였다. 12일 후 콜로니를 계수하고, CFU-M, CFU-E, CFU-GEMM, CFU-GM 및 CFU-G의 평균수를 표시하였다. 실험은 두번 수행하였으며, 오차치는 각 유전자형에 대해 세개의 배아에서 평균 표준오차를 표시하였다.
도 2: wt(다이어몬드) 또는 MafB/c-Maf 이중 결핍 (사각형) E14.5 배아에서 온 10,000 태아 간 세포들을 10ng/ml의 재조합 M-CSF, GM-CSF, 또는 II-3을 함유하는 반고형매질내에서 인큐베이션하였다. 매 8일마다 콜로니를 계수하고, 매질에서 세척하고 동일농도 및 조건하에서 다시 플레이트하였다. 검사는 두번 행해졌으며, 두번의 독립적인 시험은 동일한 결과를 나타내었다.
도 3: 표시된 바와 같은 wt, MafB 결핍, c-Maf 결핍 또는 MafB/c-Maf 이중 결핍 E14.5 배아에서 온 태아 간 세포들을 M-CSF 공급원으로서 L-세포 조건화된 매질내에서 9일간 단핵세포/마크로파지로 분화하고, 표시된 농도의 재조합 M-CSF로 24시간 시뮬레이션하고 18시간의 BrdU 포함후 S-상에서의 세포를 모니터랑하여 증식을 분석하였다. 자극되지 않은 배양에 대한 자극된 배양에서의 증식 비율을 증식 지수로 표시하였다. 오차치는 세개의 샘플에서 평균 표준 오차를 표시하고, 두개의 독립적인 실험은 동일한 결과를 나타내었다.
도 4: MafB/c-Maf 이중 결핍 E14.5 태아 간 세포의 M-CSF 콜로니 검사에서 반고형 매질에서 상기 세포들을 세척하고 이들을 M-CSF 공급원으로서 L-세포 조건화된 매질내에서 인큐베이션함으로써, 세개의 독립적인 단핵세포 배양을 유도하였다. 4일마다 매질을 변경하였으며, 배양물을 계수하고, 배질 전체에 완전히 증식하였을때 계대배양하였다. 계대배양시 유도된 세포전체수를 산출하여 나타내었다.
도 5: MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양의 표현형 및 기능적 특성화. A는 MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양에서 온 시토스핀을 김사염색한 것으로 단핵세포/마크로파지 모양이 균일한 것을 보여준다. B는 MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양의 상대비(phase contrast) 포토마이크로그라프이다. C는 골수 계통 항원에 대해 염색한 MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양의 FACS 프로파일이고, D는 다른 계통 항원에 대해 염색한 MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양의 FACS 프로파일이다. 세포들은 단핵세포/마크로파지 항원(Mac-1, F4/80 및 FcgRI I/Ill)에 대해서는 거의 100% 양성이었으나, 과립구 마커 Gr-1, 전구세포 마커 c-kit 및 CD34, 적혈구 마커 Ter1 19, 및 T-림프구 마커 CD3 및 CD4에 대해서는 음성이었다. 이들은 모두 B-림프구 마커 CD19에 음성을 나타내었다 (미도시). E는 MafB/c-Maf 이중 결핍 단핵세포 배양 (DKO 세포)를 PE-코팅 라텍스 비드와 인큐베이션하고 식균작용의 측정 으로서 섭취된 형광 비드에 대한 FACS를 분석하여 도시한 것이다. 비교를 위해 RAW 267 마크로파지 세포주의 식균능을 양성대조로 나타내고, 음성대조는 비드와 인큐베이션하지 않은 세포를 나타내었다.
도 6: 노화 마우스의 MafB/c-Maf 결핍 혈액에서 단핵 세포 배양의 유도. A-D. 2개월이 되었을 때 wt 또는 MafB/c-Maf 이중 결핍 태아 간 세포로 재구성한 22 개월된 마우스의 말초 혈액에서 수득한 100,000 백혈구 세포(WBC)를 100ng/ml 재조합 M-CSF를 함유하는 반고형 매질에서 인큐베이션하고 12일 후 콜로니 형성을 분석하였다. wt (A) 또는 MafB/c-Maf 결핍 (B) 샘플에서의 콜로니를 광학현미경으로 관찰하여 나타내고, (C)는 wt 또는 MafB/c-Maf 결핍 샘플의 콜로니 전체수를 나타낸 것이다. 오차치는 각 유전자형의 두 개별적인 마우스에서 두 샘플을 취하고 이들의 평균의 표준 오차를 나타낸 것이다. B의 각 콜로니를 확대하여 D. E에 나타내고, F는 wt 또는 MafB/c-Maf 결핍 재구성 마우스의 말초혈액에서 채취한 100,000 WBC를 M-CSF 공급원으로서 L-세포 조건화된 매질내에서 배양하고, 계수하고 8일마다 계대배양하였다. MafB/c-Maf 결핍 단핵세포 매양의 상대비 포토마이크로그라프를 E에 도시하였으며, 각 계대배양수마다 산출된 전체 세포수를 F에 나타내었다.
물질 및 방법
마우스 : 본 출원인은 129Sv-C57BL/6 배경에서 MafB 결핍 마우스의 생성 및 mafB 및 gfp에 대한 프라이머를 사용하고 PCR에 의해 이들의 유전자형을 밝히고, 그 녹아웃 대립유전자에서 mafB를 대체하는 것을 보고한 바 있다 (Blanchi et al. 2003). c-Maf 결핍 마우스의 생성 또한 이미 기술되어 있다 (Kim et al. 1999). MafB+/- 및 c-Maf+/- 마우스들을 교배하여 MafB;c-Maf+/-;+/- 마우스를 수득하고, 이를 상호교배하여 MafB;c-Maf-/-;-/- 배아를 수득하였다. 모든 실험은 특정 병원체가 없는 조건하에서 유지된 마우스를 사용하여 기관의 가이드라인에 따라 수행되었다.
태아 간 세포 제조 : 배아는 배아일 E14.5에 무균적으로 수집되었다. 각 배아의 간으로부터 채취한 세포들을 1차 세포 매질(IMDM, 20% FCS, 1 % 페니실린/스트렙토마이신)에서 넣어 단일 세포현탁액을 제조하고, 그 유전자형을 PCR로 확인할 때 까지 4℃에서 보관하였다.
콜로니 분석 : 2x104 태아 간세포를 제조자 지시에 따라 시토킨 혼합물(SCF, Epo, GM-CSF, II-3, II-6)을 함유하는 MethoCult M3232 또는 10 ng/ml 쥐 rM-CSF, 10 ng/ml 쥐 rGM-CSF, 10 ng/ml 쥐 rG-CSF 또는 10 ng/ml 쥐 rll-3 (Pepro Tech Incorporation)로 보충된 MethoCult M3234 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)를 함유하는 반고형 매질내 접종하였다. 간략하게 매질을 함유하는 세포 300ml을 매질을 함유하는 300ml 시토킨과 혼합하고, 이를 1400ml의 메틸셀룰로스 매질에 넣고 격렬하게 혼합한 후 이들 각각의 혼합물 900ml을 두개씩 35mm 플레이트에 플레이팅하였다. 4, 6, 9 및 12 일 후, 두 플레이트에서 16 세포 이상의 콜로니 크기 및 전체수를 계수하였다.
재플레이팅 분석(Replating assays) : 플레이트당 1x104 태아간세포를 50 ng/ml 쥐 rM-CSF, 쥐 rGM-CSF 또는 쥐 rll-3 (allPepro Tech Incorporation)를 보충한 메틸셀룰로스 (M3234, Stem Cells Technologies)를 포함하는 반고형 매질내에 접종하였다. 8일 후, 콜로니를 계수하고 매질내에서 단일 세포 현탁액이 수득될 때 까지 세포를 반복하여 세척하여 메틸셀룰로스를 제거하였다. 1x104 세포를 동일한 조건하에서 재플레이팅하고 8일 후 콜로니 형성을 다시 계수하였다. 재플레이팅은 3번 반복하여 수행하였다.
액체 배양에서 MafB/c-Maf 결핍 세포의 성장 : 4번째 플레이팅 후, 오직 MafB/c-Maf 결핍 세포만이 M-CSF 조건하에서 콜로니를 나타내었다. 반복하여 매질을 세척하여 메틸셀룰로스를 제거하고, 20% L-세포 상등액이 M-CSF 공급원으로서 보충된 액체배지 1x104/100 ml DMEM/10% 열불활성 FCS/1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% Na-피루베이트에 넣었다. 재조합 쥐 M-CSF에서의 배양은 동일한 성장 특성을 나타내었다. 4일마다 부분적으로 매질을 교체하고 8일 마다 완전히 매질을 교체하면서 1:4로 나누었다.
L-세포 상등액 제조 : L929 섬유모세포 (ATCC: CCL-1에서 수득가능)을 쥐 M-CSF 조건화된 매질로서 사용하였다. L-세포들을 배양하고 L-세포 성장 매질내 (DMEM, 10% FCS HI, 1 % Na 피루베이트, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 유지하였다. 상등액을 생성하기 위해, 세포는 70% 합류(confluency)가 될 때까지 성장시키고 매질은 L-세포 상등액 매질로 변경하였다(IMDM, 2% FCS HI, 1 % Na 피루베이트, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신). 5일 후 상등액을 수거하고 5일간 더 매질을 추가하였다. 두번째 상등액을 수거한 후 둘다 저류한 후 0.22mm 필터기로 여과하고 -20℃에서 분취액으로 저장하였다.
FACS 분석 : 항체 염색을 위해 세포들을 여과된 FACS 매질 (02% FCS 및 필요한 경우 PBS내 FcgII/III 차단 항체)내에 1x106 내지 1x107 세포수/ml로 재현탁하고, 적절하게 희석된 플루오로크롬 단클론 항체로 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 마우스 항원에 대해 직접적으로 플루오로크롬 라벨된 항체는 BD나 eBiosciences에서 구매하였다. PBS로 두번 세척한 후, 세포들은 FACSCalibur 또는 FACS Canto machine (Becton-Dickinson, San Jose, CA)으로 분석하였다. 데이타는 Cell Quest® (Becton-Dickinson) 또는 Flowjo® 소프트웨어로 분석하였다.
식균작용 분석 : 형광 비드 (분자 프로브, 1 μM, F-8851)를 멸균 PBS로 1회 세척하고, DMEM/10% FCS에 재현탁한 후 10초간 10 간격으로 소니케이션하였다. 25 μl의 비드 용액을 마크로파지와 24-웰 플레이트에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포는 PBS로 완전히 세척하고, 1% PFA로 고정한 후 FACSCalibur(Beckton Dickinson)를 사용하여 유세포분석하였다.
골수 재구성 마우스 : 재구성 실험을 위해, 동일한 유전자형(MafB;c-Maf-/-;-/- 또는 WT)의 태아간세포로부터 단일세포현탁액을 채우고, 100μm 게이지를 통과하여 여과하고, 1x HBSS 또는 PBS로 1회 세척하고, 주입을 위해 PBS 또는 HBSS에 재현탁하였다. 200μl 의 PBS/HBSS내 1x106 FL 세포를 치사량으로 조사된 (900- 1000 rad) 나이 및 성-매치된 Ly5.1 수용자 마우스의 꼬리 정맥내 주입하였다. 주입은 세포 전달 전 최소한 4시간 전에 시행하였으며, 마우스는 이식후 4주간 음용수에 항생제를 넣어 유지시켰다.
증식 분석 : 태아간세포를 M-CSF 함유 매질내에서 9일간 분화하고, PBS로 세척하고, 96 웰 바닥평면 플레이트내에서 20,000 세포/웰의 농도로 지시된 농도의 재조합 M-CSF를 함유하는 매질 200μl내에 위치시켰다. 36h BrdU를 최종 농도 1OnM로 가한 후, 18시간 후 세포 증식 ELISA BrdU 비색 키트(Roche cat # 1 647 229)를 사용하여 항 BrdU-항체로 고정하고 라벨링하였다. 간략하게, 웰들을 세척 용액으로 5회 세척하고, 10Oμl 검출 시약으로 인큐베이션하였다. 20분후, ELISA 반응은 25μl의 1 M H2SO4 를 가하여 중지시키고, 산물을 비색분광계를 사용하여 450nm에서 측정하였다.
결과
MafB, c-Maf 이중 결핍 태아 간세포는 증강된 단핵세포 콜로니 형성력을 나타낸다 : MafB 결핍은 신생아적으로 치사성이므로, E14.5 태아 간에서 조혈에 대한 MafB/c-Maf 이중 결핍의 영향을 분석하였다. 계통 특이적 표면 마커에 대한 FACS 염색 결과, MafB/c-Maf 결핍 E14.5 태아간에서 계통 분포에 아무런 이상이 없는 것으로 드러났다. 특이적 시토킨에 반응하여 증식할 수 있는 세포수를 정량하기 위해, E14.5 배아에서 온 MafB/c-Maf 결핍 또는 야생형(WT) 대조 세포를 메틸 셀룰로스 매질내 시토킨 혼합(II-3, II-6, GM-CSF, SCF 및 Epo; 도 1A) 또는 개별적인 골 수성 시토킨(M-CSF, GM-CSF, G-CSF 또는 II-3, 도 1B-E)과 함께 배양하였다. 단핵세포 콜로니 (CFU-M)는 MafB/c-Maf 결핍 태아간세포에서 야생형 태아간세포에 비해 단핵세포 성장을 지지하는 모든 조건하에서(M-CSF, GM-CSF, IL-3 및 혼합 조건) 상당히 증가한 반면, 다른 형태의 콜로니는 정상 범위에 존재하였다. 또한 이러한 단핵 세포 콜로니의 상승은 개별적인 MafB 또는 c-Maf 결핍 태아간세포에서는 나타나지 않았다 (미도시). 이는 MafB 및 c-Maf 모두가 소실되어야 골수성 시토킨에 반응하여 단핵세포 콜로니를 산출하는 세포수가 증가하는 것을 나타낸다.
MafB, c-Maf 이중 결핍 CFU-M 단핵세포는 M-CSF에서 상승된 자가 재생능을 갖는다 : MafB/c-Maf 결핍 단핵세포성 세포들이 자가 재생능(self renewal potential)을 유지하는지 여부를 분석하기 위해, MafB/c-Maf 결핍 CFU-M 콜로니에서 세포의 연쇄적 재플레이팅능(serial replating ability)를 테스트하였다. 상기 분석에서 콜로니는 세척하여 메토셀(methocell)을 제거하고, 신선한 메토셀 배양내 동일한 시토킨 조건하에서 재플레이팅하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, GM-CSF 및 II-3 조건하에서 야생형 및 MafB/c-Maf 결손형 모두 3회 까지는 재플레이팅이 가능하였으나, 4번째 재플레이팅부터는 콜로니가 형성되지 않았다. M-CSF 조건하에서는 야생형(WT) 및 MafB/c-Maf KO 세포간에 극명한 차이가 나타났다. 야생형의 경우 2번째 재플레이팅후 콜로니가 없어진 반면, MafB/c-Maf 결핍 세포는 4번째 재플레이팅까지 M-CSF내에서 형성되는 콜로니수가 계속 증가하였다. 이는 MafB/c-Maf 결핍 태아간 유래 단핵세포성 세포는 특이적인 세포 재생능을 가지며, M-CSF내에서 증량 능을 가짐을 보여준다.
MafB/c-Maf 결핍 단핵세포는 M-CSF에 반응하여 증강된 증식을 나타낸다 : 전술한 증강된 자가 재생능이 증강된 M-CSF 의존성 MafB/c-Maf 결핍 단핵세포의 증식에 기인한 것인지 여부를 테스트하기 위해, 야생형, MafB 결핍, c-Maf 결핍 또는 MafB/c-Maf 결핍 E14.5 배아의 태아간세포를 9일간 단핵세포로 분화하고 이들 세포들을 36시간 동안 상이한 농도의 M-CSF로 자극하였다. M-CSF에 대한 이들의 DNA 합성 속도를 모니터하고, 18시간 후 자극 및 비자극 세포내에서 BrdU 삽입 속도를 비교하여 증식 지수를 확립하였다. 도 3에 보인 바와 같이, 야생형(wt), MafB 결핍 또는 c-Maf 결핍 단핵세포는 M-CSF에 대해 거의 전혀 증식성 반응을 나타내지 않았다. 반면 MafB/c-Maf 결핍 단핵세포는 M-CSF에 반응하여 현저한 증식 증강을 나타내었다. 이는 관찰된 MafB/c-Maf 결핍 단핵세포의 계속적인 증량은 M-CSF에 반응하여 증식능력이 매우 증강되었기 때문임을 의미한다.
MafB/c-Maf 결핍 단핵세포는 수개월동안 M-CSF 배양에 유지될 수 있으며 10 10 배 이상 증량된다: 상기와 같은 MafB/c-Maf 결핍 단핵세포의 증강된 세포 재생력 및 M-CSF 의존성 증식능이 얼마나 오랫동안 유지될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, CFU-M 단핵세포성 콜로니를 액체 배양에 취하고 M-CSF 함유 매질내에서 배양하였다. 이 조건에서 상기 세포는 계속 증식하고 배양에서 증량하였다. 4개의 세포 집단이 상이한 배아 및 재플레이팅 분석에서 독립적으로 유도되었으며, M-CSF 함유 매질내에서 최소한 15회 까지의 계대배양 또는 4개월 동안 어떠한 성장 저하 또는 위기 없이 유지되었다. 16회 계대배양시 두 집단이 위기(crisis)를 맏았으나, 나머지 두 집단은 24번째 계대배양 또는 6.5 개월간 전혀 어떠한 위기의 징후도 나타내지 않았으며, 이중 하나는 위기나 성장 저하없이 18개월간 배양내에서 계속적으로 유지되었다. 이들 집단(DKO 42, 46 및 56로 지칭)의 15회 계대배양까지의 성장 곡선을 도 4에 나타내었다. 각 계대배양에서 동결된 세포는 다시 배양내에 쉽게 합해졌다. 유도된 집단 또한 클로닝가능하였으며, 초기 계대배양 집단의 개별적인 세포에서 유래된 6개 이상의 독립적인 세포주가 수립되었다.
장기 배양에서 위기없이 수득가능한 세포의 전체수를 산출한 결과 1010이상의 증식 인자를 나타내었다. 이러한 큰 증식인자를 묘사하자면, 일상적인 혈액 분석의 통상적인 부피(약 5ml)에 존재하는 단핵세포는 이론적으로 유사하게 증폭되는 경우 천만명의 전체 단핵세포를 생성시키는데 충분한 양이 된다.
M-CSF 배양내에서 c-Maf/MafB 결핍 단핵세포성 세포는 정상적인 단핵세포/마크로파지 표현형을 갖는다 : M-CSF 존재하 연장된 기간동안 계속적으로 배양된 c-Maf/MafB 결핍 세포는 단핵세포/마크로파지 표현형을 유지한다. 도 5A에 나타낸 바와 같이 c-Maf/MafB 결핍 세포는 김사/메이-그룬왈드 염색에서 전형적인 마크로파지 형태를 나타내었다. 상대비하 배양내에서 이들의 형상은 전형적인 마크로파지 배양보다 덜 평탄하였으며, 이는 이들의 계속적인 증식의 지표로 보인다 (도 5A). FACS 분석 또한 c-Maf/MafB 결핍 세포 전체 집단이 전형적인 단핵세포/마크로파지 마커 F4/80, Mac-1 (CD11b), M-CSFR (CD115) 및 FcgRII/III(CD16/CD32)를 발현하나 선택된 T-세포 마커(CD3, CD4, CD8), B-세포 마커(CD19), 적혈구 마커(Ter-119), 과립구 마커 (Gr-1) 는 발현하지 않음을 보여주었다(도 5C,D). 소량의 M-CSF를 함유하고, 높은 함량의 M-CSF을 함유하지 않은 배양에서, CD11c는 상향조절되는 것으로 관찰되었으며, 이 세포들이 계속적인 M-CSF 존재에 의해 억압될 수 있는 DC 분화에 대한 잠재력을 가짐을 제안한다. 또한 c-Maf/MafB 결핍 세포는 야생형 원 마크로파지 또는 마크로파지 세포주와 비슷하거나 더 높은 정도로 다량의 형광성 라텍스 비드를 정량적으로 포식할 수 있는 것으로 보아, 전형적인 단핵세포/마크로파지 기능을 나타냄을 알 수 있다(도 5E).
이러한 모든 결과는 배양내 계속되는 증식에도 물구하고 모든 세포들은 완전히 분화되고 기능적인 단핵세포/마크로파지의 성숙 표현형을 유지한다는 것을 보여준다.
c-Maf/MafB 결핍 단핵세포 및 마크로파지는 인비보에서 악성을 나타내지 않는다 : 인비트로에서 증강된 재플레이팅 효율은 인비보에서 백혈병을 유발할 수 있는 악성 변형된 세포에 대해서도 나타난다. 이러한 가능성을 조절하기 위해, 치사량으로 조사된 수용자 마우스를 c-Maf/MafB 결핍 태아간세포로 재구성하고, 재조합된 마우스를 일정 기간내 골수성 백혈병이나 골수증식성 질환이 발생되는지 여부를 관찰하였다. 지금까지 8마리의 마우스가 6-8 주령에 재조합되어, 8, 11, 14 및 22월령에 분석되었으며, 이중 22달은 마우스의 최대 수명에 가깝다. 전체 관찰 기간동안 마우스는 정상적으로 보였으며, 어떠한 불편한 징후도 나타내지 않았다. 22달 까지 정기적으로 혈액 검사를 수행하였으며, 그 결과 백혈구 수는 정상적이었으며, 모세포(blast)나 비정상 세포의 징후없이 형태학적으로도 정상이었다. FACS 분석결과 단핵세포는 정상 CD115+, CD11b+, F4/80+ 표현형을 나타내었으며, 미성숙 또는 전구세포 표면 마커를 발현하는 세포수의 증가가 관찰되지 않았다. 희생시켜 검사한 결과, 백혈병에 관련한 어떠한 거시적 징후도 없었고, 비장도 정상 크기였으며 건강한 외관을 유지하였다. 혈액, 골수, 비장 및 복강 삼출물에서 얻은 시토스핀에 대한 FACS 분석 및 조직학적 검사 결과 백혈병이나 골수증식성 질환에 관련한 어떠한 징후도 없었다. 골수에서도 전구세포 표면 마커 프로파일(CMP, GMP)을 갖거나 또는 모세포나 미성숙 형태를 갖는 세포의 수의 증가도 관찰되지 않았다. 이는 c-Maf/MafB 결핍 단핵세포 및 단핵세포 유래 세포가 정상적으로 기능하고 혈액학적인 병리를 유발함 없이 조혈 시스템에 장기간 기여할 수 있음을 보여준다.
노화 마우스에서 온 c-Maf/MafB 결핍 모노사이트는 M-CSF 배양에서 증량될 수 있다: 증강된 세포 재생능을 갖는 c-Maf/MafB 결핍 단핵세포/마크로파지가 배아세포에서 뿐 아니라 완전히 분화된 성인 세포 또는 노화된 동물에서 까지 유도될 수 있는지 여부를 분석하였다. MafB/c-Maf 결핍 조혈 시스템을 갖도록 재조합된 마우스로부터 얻은 단핵세포가 M-CSF 배양에서 증량되고 M-CSF 함유 메토셀 배지내에 서 콜로니를 생성하는지 여부를 테스트하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 야생형 재조합된 마우스의 단핵세포는 예측했던대로 M-CSF 메토셀 배양에서 콜로니를 형성하지 않았다. 반면 c-Maf/MafB 결핍 백혈구 세포는 CFU-M 단핵세포성 콜로니를 생성하였으며, M-CSF 배양에서 증량되었다. 이와 함께, 관찰된 표현형은 배아성 세포에 특이적인 것이 아니며, MafB/c-Maf 결핍은 성인 마우스의 완전히 분화된 단핵세포에도 연장된 자가 재생력을 부여함을 보여주었다.
배양에서 증량된 c-Maf/MafB 결핍 단핵세포/마크로파지는 정맥 주입후 말초 조직으로 돌아간다 : M-CSF 배양에서 증량된 c-Maf/MafB 세포가 정상 단핵세포와 같이 순환으로부터 말초 조직으로 돌아갈것인지 여부를 테스트하기 위해, 1x106 Ly5.2+ c-Maf/MafB 결핍 단핵세포/마크로파지를 정맥으로 Ly5.1+ 숙주에 재주입하고, 4, 24 및 48 시간후 순환혈 및 말초조직에서 그 존재를 분석하였다. CD11b+ 도너 세포가 4시간째 부터 계속 복막에서 검출되었으며, 비장에서는 24시간째부터 계속 검출되었다. 이는 배양에서 증량된 c-Maf/MafB 세포가 생체내에서 단핵세포 유래된 세포 집단에 기여함을 보여준다.
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Claims (17)

  1. 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포에서 MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성을 저해하는 단계; 및 하나 이상의 시토킨 존재하에 상기 세포들을 증량시키는 단계를 포함하는, 생체외에서 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 증량하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임을 사용하여 상기 MafB 및 c-Maf의 발현을 저해하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 야생형 MafB 및 c-Maf과 경쟁하는 돌연변이 MafB 및 c-Maf 폴리펩티드를 사용하여 상기 MafB 및 c-Maf의 활성을 저해하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시토킨이 M-CSF인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 방법에 따라 수득가능한 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포.
  6. MafB 및 c-Maf을 발현하지 않거나, MafB 및 c-Maf의 발현 또는 활성이 없거나 저해된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포.
  7. 제6항에 있어서, MafB 및 c-Maf 유전자가 결핍된 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 쥐 기원인 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 기원인 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 소교세포, 조직구, 호프바우어세포, 혈관사이세포, 쿠퍼세포, 복강 마크로파지, 폐포 마크로파지, 표피 또는 진피 마크로파지, 가장자리구역 마크로파지, 금속친화성 마크로파지, 적수 마크로파지, 백수 마크로파지 및 파골세포로 이루어진 군에서 선택되는 마크로파지.
  11. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 항원분자를 적재한 수지상 세포.
  12. 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 항원 분자를 적재한 제11항의 수지상세포를 포함하는 백신용 약학적 조성물.
  14. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 암, 급성 또는 후천적 면역 결핍증, 만성 또는 급성 상해, 상처, 퇴행성 질환, 자가면역 질환, 만성 염증 질환, 동맥경화증, 다발성 관절염, 골관절염, 골다공증, 염증 질환 및 대사 질환으로 구성된 군에서 선택되는 질병 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도.
  15. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 재생의학용 의약품의 제조에 사용하는 용도.
  16. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 단핵세포, 마크로파지 또는 수지상 세포를 약물 스크리닝에 사용하는 용도.
  17. 하기 단계를 포함하는 쥐 단핵세포의 생성 및 확장 방법:
    i) MafB 및 c-Maf를 발현하지 않는 마우스에서 유래되는 단핵세포를 분리하는 단계;
    ii) M-CSF 존재하에 상기 단핵세포를 배양하는 단계.
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