KR20160093596A

KR20160093596A - 사멸 리간드에의 이식전 노출에 의한 조혈 전구체의 활성화

Info

Publication number: KR20160093596A
Application number: KR1020167012049A
Authority: KR
Inventors: 샤이 야코니
Original assignee: 셀렉트 바이오테라퓨틱스 리미티드
Priority date: 2013-10-09
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2016-08-08
Also published as: CN112608897A; CA2926048C; JP2016538253A; IL244982B; EP3054961A1; JP6818099B2; AU2014333391A1; EP3054961A4; CA2926048A1; JP2021059584A; EP3054961B1; JP2019205462A; US20160263158A1; CN105683364A; IL244982A0; WO2015052716A1; AU2014333391B2; RU2016116732A

Abstract

본 발명은 조혈 줄기 및 전구 세포를 이식 전 TNF 수퍼패밀리의 리간드에 노출시킴으로써 상기 세포의 생착을 향상시키고 상기 세포의 이식 결과를 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이식에서의 사용을 위하여, 본 발명의 방법에 따라서 활성화된 조혈 줄기 및 전구 세포의 집단을 제공한다.

Description

사멸 리간드에의 이식전 노출에 의한 조혈 전구체의 활성화{ACTIVATION OF HEMATOPOIETIC PROGENITORS BY PRETRANSPLANT EXPOSURE TO DEATH LIGANDS}

조혈모 줄기 및 전구 세포 이식은 종양학에서 종래의 치료 양상으로서, 다양한 화학방사선요법-저항성 악성 종양에서 치유 능력을 가지고 있다. 이식 절차에 있어서 개선 및 점진적인 발전은, 선천성 결함, 선천성 및 후천성면역결핍증, 비정상적인 면역, 자가면역질환 및 장기 및 조직 이식에 대한 내성 유도를 포함하여, 비종양학적 장애에서 조혈 이식의 광범위한 이행으로의 길을 연다.

TNF 패밀리는 19개의 공지된 수용체/리간드 상호작용을 포함하며, 상기 상호작용은 체세포에서 아포토시스 유도의 일반적인 활성을 공유한다.

뮤린 및 인간 세포를 사용한 스트레스 조혈작용 및 이식 모델에서 실행된 연구는 아포토시스 및 자극의 이중 매개체로서 종양괴사인자(TNF) 패밀리 수용체 역할에 대한 논란이 많은 증거 및 해석을 산출하였다[1 내지 4]. 한편, 전통적인 개념은 아포토시스의 매개체로서 이들 수용체의 역할에 의해 지배되어 왔다. 따라서, Fas/FasL 상호작용은 분화의 원위 단계에서 클론 확장의 억제와 유사하게, 조혈 전구체 발달의 음성 조절제인 것으로 간주된다[5 내지 7]. 이러한 개념은 Fas 수용체가 시험관 내 조혈 전구체 기능을 억제하고[8, 9], 클론형성 활성을 억제하며[10, 11], 면역저하 마우스[12, 13] 및 인간[11]에서 인간 세포 생착을 손상시킴을 나타내는 데이터를 기반으로 한다.

아포토시스 및 억제 신호를 전달하는, TNF 패밀리의 수용체 발현의 낮은 수준으로 인하여 전구체는 아포토시스로부터 보호됨이 시사된 바 있다[8 내지 10].

한편, 여러 가지 TNF 패밀리 수용체의 급성 상향조절이 수용체 골수로의 호밍(homing) 및 수용체 골수에서의 파종 후 공여 세포에서 관찰된다.

WO 제2007/138597호에 기재된 바와 같이 아포토시스에 대한 조혈 전구체의 저항성은 이식 설정에서 몇 가지 중요한 의미를 가진다. 그 양상 중 하나에서, WO 제2007/138597호는 표현형-기반 선택에 대한 대체로서 기능적 특징을 기반으로 하는 이식을 위한 전구체의 농축을 위해 아포토시스 도전을 사용하는 것을 제안한다. 이러한 효과적이면서 신뢰할 수 있는 선택 절차는 간단하고 저렴하며, 공여 이식편에서 CD34 및 CD133과 같은 마커를 낮은 수준으로 발현하거나 발현하지 않는 전구체를 포함한다. 추가적으로, 아포토시스-기반 세포 준비는 이식편대숙주(GvHD) 이펙터 및 자가반응성 T 세포, 공여 이식편으로부터 악성 세포를 제거하는 뚜렷한 장점을 가진다[33, 34].

본 발명자들은 시험관 내에서 조혈 세포 작용에 대한 TNF 패밀리 수용체의 부정적인 영향이 사이토카인-자극 골수 및 UCB 세포로 제한되며[8 내지 20, 23, 27], 이는 사이토카인 회수에 의해 추가로 두드러짐을 이전에 증명해 보인 바 있다[35]. Fas를 발현하는 CD34⁺ 전구체의 부분은 생착 잠재력의 점진적인 손실과 연관된 확장된 생체외 배양 동안 자발적인 아포토시스에 대하여 과도한 민감성을 나타내지만[12, 13], 이러한 현상은 Fas 수용체 가교와 독립적이다[28, 31]. 아포토시스에 대한 내재하는 전구체 저항성은 이식 후 생체 내에서 지속되며, 이식 전 조건화에 의해 가해진 손상에 의해 야기되는 해시(hash) 골수 환경 내 생착을 위하여 아포토시스-둔감성 전구체를 우선적으로 처리한다[28]. 전구체의 이러한 특징은 전구체를 면역조정을 위한 면역 세포의 효과적인 대체물로 만들어, 막 FasL 단백질의 이소성 발현에 의해 달성되는, 생체 내에서 거부반응을 매개하는 숙주대이식편(host versus graft; HvG) 동종 면역 반응을 완화시킨다[36, 37].

본 발명은 TNF 패밀리 수용체의 활성화에 의한 조혈 세포 생착의 개선에 관한 것이다. 사멸 수용체의 활성화가 조혈 전구체의 생착 및 기능에 해롭다는 전통적인 개념과 달리, 본 발명자들은 수용체-매개 아포토시스에 대하여 본질적으로 저항성인 전구체에서 이들 수용체의 유도 활성을 보여준다. 생체 외에서 Fas-리간드, TNF-α 및 TRAIL 및 이들의 조합에의 노출은 SCID 마우스에서 정량적인 제노키메라 현상을 향상시키고 생체 내에서 골수 재구성을 개선시킨다. 골수 전구체 활성의 유도는 또한 배양물에서 입증된다. 상세한 예는 신선한 제대혈 및 저온보존된 동원 말초혈에 있어서, 조혈 전구체의 활성화가 공여 세포 이식편의 일반적인 공급원을 포함하고 저장과는 관계가 없음을 입증하는 것으로 나타내어진다. 다양한 공급원 유래 전구체의 활성화에 필요한 리간드의 농도 및 시간은 다양하며 이에 따라서 최적화되었다. 본 발명에 따르면, 공여 조혈 이식편은 전구체 활성화를 위하여 TNF 수퍼패밀리의 리간드에 노출되어, 우수한 양적 및 질적 생착 및 재구성을 달성한다.

그러므로, 본 발명의 양상 중 제1 양상에서, 본 발명은 줄기 및 전구 세포(stem and progenitor cell; SPC) 이식을 필요로 하는 수용체에서 SPC의 생착을 향상시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은,

a. 공여체로부터 얻은 생물학적 샘플을 생체 외에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 SPC의 집단을 포함하는 단계; 및

b. 상기 접촉 단계(a) 후, 상기 SPC를 상기 수용체에 이식하는 단계를 포함하며, 여기서 이식된 SPC는 향상된 생착을 나타낸다.

다른 양상에서, 본 발명은 이식 방법에서 사용하기 위한 세포의 집단(population of cells)을 제공하며, 여기서 상기 세포는 생착 특징이 향상된 줄기 및 전구 세포(SPC)이고, 상기 생착 특징이 향상된 SPC의 집단은 공여체로부터 얻은 생물학적 샘플을 생체 외에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 것에 의해 얻어지며, 상기 생물학적 샘플은 SPC의 집단을 포함한다.

도 1a는 배지에서 인큐베이션시키고 500 ng/ml TRAIL에 사전 노출시킨 세포로 이식된 마우스의 생존을 나타내는 그래프(n=20). 여기에서 제시된 4주를 초과한 시점에서는 추가적인 사망이 없었다. 도 1b는 250 ng/ml FasL 키메라 단백질, 20 ng/ml TNFα 및 이들의 조합으로 사전 인큐베이션된 세포의 수용체의 생존율을 나타내는 그래프(n=20). 도 1c는 해당하는 실험군에서 이식 후 3주째에 공여 키메라 현상의 수준을 나타내는 그래프(각 군에서 n=6). 도 1d는 GR-1⁺ 골수 세포, CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 및 B220⁺ B 림프구를 나타내는 사멸 리간드에 사전 노출된 세포로 그래프팅된 마우스에서 계통 키메라 현상을 나타내는 그래프.
도 2a는 실험 초기를 나타내는 개략도. 도 2b는 배지에서 24, 48 및 72시간 이식전 인큐베이션하면서(각각 n=12, 10, 5) 신선한 UCB(n=27)에 있어서 인간 항-CD45 단일클론성 항체로, 그리고 FasL(각각 n=8, 8, 8)로, TNF-α(각각 n=7, 7, 5), TRAIL(각각 n=7, 8, 9)로 염색함으로써 결정된 인간 키메라 현상의 백분율을 나타내는 그래프. 도 2c는 종-특이적 CD45를 사용하여 뮤린 골수에서 인간 세포 키메라 현상의 대표적인 측정 결과를 나타내는 모식도.
도 3a는 이식 후 12주째에 뮤린 골수에서 인간 UCB 세포로부터 발전한 계통의 모식도. 이식된 세포, 즉 CD34⁺ 및 계통-음성(lin^-) 전구체, CD3⁺ T 세포, CD19⁺ B 림프구, CD33⁺ 골수 세포는 이식 전 20 ng/ml TNF-α로 사전 인큐베이션하였다. 도 3b는 48시간 동안 50 ng/ml FasL, 20 ng/ml TNF 및 1.5μg/ml TRAIL로 48시간 동안 사전 인큐베이션한 세포의 이식 후 12주째에 골수에서 인간 세포 생착의 백분율을 나타내는 그래프(각 군에서 n=7 내지 12). 도 3c는 CD14⁺ 단핵구를 포함하여 사멸 리간드를 이용한 24 내지 48시간 동안 사전 노출 후 정성적인 생착을 나타내는 모식도.(각 군에서 n=4 내지 7). 증가된 골수-단구 부분이 묘사되어 있다.
도 4a는 대조군과 TNFα 처리 UCB 세포를 비교하는 일차 및 2차 수용체의 생착 백분율을 나타내는 그래프. 도 4b는 24시간 또는 48시간 동안 TNF 또는 대조군(배지)으로 처리된 UCB 세포의 수용체에서 골수 콜로니의 수를 나타내는 그래프.
도 5a는 배지에서 그리고 50 ng/ml FasL 또는 1.5μg/ml TRAIL로 인큐베이션한 후 UCB 세포에서 Fas, TNF 수용체 및 TRAIL 수용체의 부분 발현의 모식도각 군에서 n=5 내지 9). 도 5b는 FasL, TNF-α 및 TRAIL로 48시간 인큐베이션한 후 단핵(MNC) UCB 세포, CD34⁺ 및 계통-음성 전구체(lin^-)의 증식 지수를 나타내는 그래프(각 군에서 n=4 내지 7). 우측 패널은 ModFit 시뮬레이션 소프트웨어를 사용한 CFSE 희석으로부터 증식의 실증 측정 결과를 제시한다. 도 5c는 리간드를 이용한 48시간의 인큐베이션 후 CD34⁺ 및 lin^- 전구체에서 세포 주기 단계를 나타내는 그래프. 우측 패널은 요오드화프로피디움을 사용하여 DNA 함량의 측정 결과에 대하여 나타내는 것이다(각 군에서 n=4 내지 7).
도 6a는 실험 초기를 나타내는 개략도. 도 6b는 신선한 UCB(대조군)에 있어서, 그리고 배지에서 및 사멸 리간드를 이용하여 24 내지 72시간 동안 인큐베이션한 후에 10³개의 파종된 세포 당 발현된 골수 콜로니 형성을 나타내는 그래프(각 시점에서 n=6 내지 14). 도 6c는 CD34⁺ 전구체에서 Fas 발현 백분율을 나타내는 그래프(n=9). 도 6d는 메틸셀룰로스 배양물에서 골수 전구체 활성을 나타내는 그래프(n=7 내지 15).
도 7a는 신선한 샘플에서 및 각각의 리간드를 이용한 인큐베이션 후 Fas 발현%를 나타내는 그래프(신선한 샘플에 있어서 n=29, 인큐베이션한 샘플에 있어서 n=11); 도 7b는 신선한 샘플에서 및 각각의 리간드 TNF-R1(신선한 샘플에 있어서 n=7, 인큐베이션한 샘플에 있어서 n=5) 및 TNF-R2(신선한 샘플에 있어서 n=12, 인큐베이션한 샘플에 있어서 n=10)를 이용한 인큐베이션 후 Fas 발현%를 나타내는 그래프; 도 7c는 신선한 샘플에서 및 각각의 리간드 TRAIL-R1(DR4, n=9) 및 TRAIL-R2(DR5, n=8)를 이용한 인큐베이션 후 Fas 발현%를 나타내는 그래프. 도 7d 내지 도 7f는 동족 리간드에 의한 수용체 혼선 및 유도의 결과의 모식도: 도 7d는 수용체의 유도된 발현, 도 7e는 세포 증식의 감쇠, 도 7f는 하부 막 신호전달 경로의 모식도를 기반으로 한 아포토시스.
도 8a는 배지에서 및 리간드를 이용한 인큐베이션 후 11개 mPB 샘플의 이식 후 인간 항-CD45 염색으로부터 결정된 바와 같은 인간 공여체 키메라 현상의 누적 수준을 나타내는 그래프(각 실험 군에서 n=9 내지 17 마리 마우스). 도 8b는 CD34⁺ 및 계통-음성(lin^-) 전구체, CD3⁺ T 세포, CD19⁺ B 림프구 및 CD33⁺ 골수 세포를 포함하여 이식 후 12주째에 숙주 골수에서 계통의 단면 분포의 모식도(각 군에서 n=4 내지 7).
도 9a는 CFU/10³ mPB 세포의 수를 나타내는 그래프. 도 9b는 리간드를 이용하여 4 및 16시간 동안 인큐베이션한 후 큰 골수 콜로니(50개 초과의 세포) 및 작은 골수 콜로니(30 내지 50개 세포)의 분할을 나타내는 그래프(n=5 내지 11).

본 발명은 줄기 및 전구 세포 활성화를 유도하기 위한 TNF 패밀리 수용체의 이용에 관한 것이다. 아포토시스 조직은 대부분의 원시적인 줄기 및 전구 세포를 포함하여 모든 세포에서 잘 보존되어 있기 때문에, 이러한 경로는 영양 신호전달에 사용된다. 본 발명에 따르면, 조혈 세포 이식편은 생체 내에서 추후 활성을 유도하기 위하여 이식 전에 TNF 패밀리 수용체의 리간드의 다양한 조합에 노출된다.

본 발명은 줄기 및 전구 세포(SPC)에 대한, 특히 조혈 줄기 및 전구 세포(hSPC)에 대한 TNF 패밀리 수용체의 이식전 활성은 조혈 전구체 생착 및 재구성을 조성함으로써 이식 결과를 개선시킨다는 신규한 발견을 기초로 한다. 각각의 개별적인 수용체가 조혈 줄기 및 전구 세포의 비교적 작은 부분에 노출되지만, 상기 세포는 신선한 제대혈(UCB) 전구체의 대략 50%로 발견된다. 그러므로, 결합 활성은 전구체의 상당한 부분의 활성에 영향을 미치는 능력을 가진다. 결과는, TNF 패밀리 수용체 활성화가 생체 내에서 조혈 전구체 활성의 유도에 충분하다는 것을 입증한다.

더욱이, TNF 패밀리 수용체 활성화는 추가적인 사이토카인 및 성장 인자의 부재 하에서 비교적 단기간 동안 TNF 패밀리 리간드를 이용하여 실행된다. 이러한 접근법은 이식편의 이식전 제조의 조건을 위하여 실현가능하며, 이는 보통 인자를 지지하고 자극하는 것을 포함하지 않는다.

추가적으로, 본 발명은 자가 이식편 유래 잔류 악성 세포의 배제 및 GvHD에 원인이 있는 아포토시스-민감성 하위세트의 제거를 위하여 아포토시스에 대한 전구체의 저항성을 사용하는 이식편 제조의 아포토시스-매개 메커니즘과 상이하다. 전구체의 영양 이식전 활성화를 획득하기 위한 노출 시간, 리간드의 농도 및 활성화된 수용체의 성질은 아포토시스에 대한 이들의 불감성을 기초로 하는 전구체의 기능적 음성 선택과 상이하다(WO 제2007/138597호).

제대혈은 조혈 줄기 및 전구 세포의 풍부한 공급원이며, 이의 사용은 이식에 의한 악성 및 비악성 장애의 치료에서 기하급수적으로 증가한다. 공여 세포의 공급원으로서 UCB의 주요 한계점은 성인 수용체의 이식에 필요한 임계값 미만의 전구체의 작은 수, 및 무형성간 및 감염에의 숙주 노출의 위험한 기간을 연장시키는 느린 생착이다. 이들 한계점의 제안된 해결책은 여러 가지 코드 단위의 공동 이식 및 전구체의 생체외 확장을 포함한다. 본 발명자들에 의해 아포토시스에 대하여 저항성인 UCB 전구체의 기능적 선택은 표현형 마커(CD34, CD133)를 기초로 한 분리와 비교하여 유효수를 증가시킨다는 것이 이전에 입증된바 있다. 게다가, 아포토시스에 민감하게 되는 분화된 세포의 제거는 행하여지지 않은 아포토시스-불감성 전구체에 이점을 부여함으로써 UCB 전구체의 생체외 확장의 수율을 개선시킨다.

본 발명은 전구체의 이식전 활성화에 의해 생착 시간을 단축시키는 추가적인 접근법을 제공하며, 이는 가속화된 정량 및 정성적인 조혈 재구성을 지속하고 이를 초래한다.

조혈 전구체의 다른 일반적인 공급원은, 기동 작용체를 이용한 골수의 자극 후 분리반출법에 의한 단핵 세포의 수집을 기반으로 하는 동원 말초혈(mPB)이다. 본 발명자들은 mPB 이식편으로부터 T 및 B 림프구의 기능적 음성 선택이 GvT 활성을 지속하면서 GvHD의 중증도를 상당하게 감소시킨다는 것을 이전에 입증한 바 있다[38]. 이러한 절차는 GvHD 능력을 감소시키면서 T 세포의 이식편 촉진 효과를 유지함으로써 생착 효율을 상당히 개선시킨다.

본 발명은 전구체의 이식전 활성화에 의핸 정량적 및 정성적 mPB 세포 생착을 향상시키는 추가적인 접근법을 제공한다.

TNF 패밀리의 수용체의 낮은 수준의 발현으로 인하여, 전구체가 아포토시스로부터 보호되며, 이는 아포토시스 및 억제 신호를 전달함이 이전에 제안된 바 있다[8 내지 10]. 지지 증거는 항체 및 가용성 FasL의 차단에 의한 조혈 세포의 명백한 보호이며[14 내지 16], 이는 Fas 삼량체화를 방지함으로써 아포토시스 방지 효과를 발휘한다[2]. 시험관내 실험은 아포토시스의 유도를 통하여[19, 20], 사이토카인-활성화 조혈 세포[17, 18]의 기능에 대한 TNF-α의 해로운 효과를 입증한 바 있으며, 이는 동족 수용체를 이용한 직접 상호작용[18, 21, 22] 및 Fas 수용체의 간접적 상향 조절[8 내지 10] 둘 다에 의해 매개된다. 이들 모든 연구에서, 세포는, TNF-α 수용체[12, 16, 18]를 이용한 혼선에 의한 유도된 Fas 발현을 포함하여, 극적인 표현형 및 기능성 변화[23]와 연관된 생체외 다양한 사이토카인 및 케모카인, 조건을 이용한 다양한 시기 동안 배양되었다. 세포 기능에서의 변화는 TNF 패밀리 수용체의 해로운 영향에 기인하였으며, 이는 손상된 호밍, 세포 주기의 유도 및 생착 잠재력의 손실을 야기하였다[24 내지 27]. 이들 데이터는, 이식편대숙주 질환에 있어서 이러한 경로의 개선으로 인하여, Fas 및 TNF 수용체의 중화가 특히 이식 설정에서 조혈 세포 기능에 이로울 수 있음을 시사한다.

한편, 여러 가지 TNF 패밀리 수용체의 급성 상향조적은 수용체 골수로의 호밍 및 수용체 골수에서의 파종 후 바로 공여체 세포에서 관찰된다. 대부분의 원시 조혈 줄기 및 전구 세포는 스트레스 조건 하에서 Fas[28], TNF[29], 및 종양괴사인자-관련 아포토시스-유도 리간드(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing 리간드: TRAIL) 수용체[30]를 편재하여 상향조절한다. 이들 수용체의 생리학적 중요함은 Fas[31] 및 TNF 수용체[29]가 부족한 전구체의 결함이 있는 생착 및 장기간 재구성 잠재력에 의해 강조된 바 있다.

세포 활성은 불가역적인 음성 조절의 주요 메커니즘인 활성화 및 사멸의 메커니즘에 의해 꼭 맞게 조절된다. 세포 생존력을 제어하는 아포토시스 조직은 모든 세포에서 발현되는 잘 보존된 경로이지만, 줄기 및 전구 세포는 수용체-매개 아포토시스에 대하여 크게 저항성이다. 이식 후 TNF 패밀리 수용체의 발현을 상향조절하는 뮤린 조혈 전구체는 아포토시스 신호전달에 대하여 크게 불감성임이 입증된 바 있다[28, 29]. 이들 데이터는, Fas(고려 중임), TNF-R1[32] 및 TRAIL-R1[30]에 의해 매개되는 아포토시스에 대하여 저항성인 제대혈(UCB) 및 동원 말초혈(mPB)로부터 유래된 인간 전구체로 확장되었다.

본 기술과는 대조적으로, 본 발명은 이식된 세포의 적어도 부분을 활성화시킴으로써 이식 결과를 개선시키기 위하여 이식 전에 TNF 수퍼패밀리의 리간드에 조혈 줄기 및 전구 세포를 노출시키는 것에 관한 것이다. 이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 효과는 TNF 수퍼패밀리 수용체에 의해 매개되는 영양 자극을 수반한다. Fas-리간드, TNF-α, 및 TRAIL 또는 이들의 조합에 대한 수용체 중 각각의 하나의 활성화는 정량적 및 정성적 조혈 재구성을 향상시킨다. TNF 수퍼패밀리 수용체의 생체 외 이식전 활성화는 생체 내에서 전구 세포의 후속 거동을 조절하는 능력을 가져서, 조기 조혈 재구성을 향상시키고 이식전 기간 및 활성화된 수용체의 유형에 따른 특정 계통을 발전시킨다. 특정 설정에서 이식편의 공급원, 항원 차이, 공여체 접종물의 크기(전구체 수), 수용체의 상태 및 예상 사망률에 따라서, 리간드의 특성, 농도, 조합, 노출의 기간은 다양하게 설정된다. 수용체는 리간드의 적용에 의한 수용체의 활성화 이전에 또는 활성화에 부수적으로 상향조절될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 양상 중 제1 양상에서, 본 발명은 줄기 및 전구 세포(SPC) 이식을 필요로 하는 수용체에서 SPC의 생착을 향상시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은,

b. 상기 접촉 단계(a) 후, 상기 SPC를 상기 수용체에 이식하는 단계를 포함하고, 여기서 이식된 SPC는 향상된 생착을 나타낸다.

다른 양상에서, 본 발명은 이식 방법에서 사용하기 위한 세포의 집단을 제공하며, 여기서 상기 세포는 생착 특징이 향상된 줄기 및 전구 세포(SPC)이고, 상기 생착 특징이 향상된 SPC의 집단은 공여체로부터 얻은 생물학적 샘플을 생체 외에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 것에 의해 얻어지며, 상기 생물학적 샘플은 SPC의 집단을 포함한다.

구체적인 실시형태에서, 상기 SPC는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)이다.

본 명세서에서 사용된 어구 " 줄기 및 전구 세포(SPC)의 향상된 생착 "은 세포 이식의 효율, 질 또는 신속함에 있어서의 개선, 또는 TNF 수퍼패밀리의 구성원에 의한 세포의 활성화 및 시험관 내 노출로부터 생길 수 있는 가속화된 정량적 및 정성적 조혈 재구성에 있어서의 개선과 관련된다. 예를 들어, 향상된 생착은 골수, 림프구, 혈소판 또는 적혈구 재구성 또는 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 세포 생착을 평가하기 위한 방법은, 예를 들어 하기 상세히 기재된 바와 같이 세포 이동 및 다른 시험관내 기법뿐만 아니라, 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)의 조직학, 면역학 및/또는 방사선학 평가를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 " 생체 외 "는 생물학적 샘플의 형태로 살아있는 유기체(바람직하게는 인간)로부터 제거된 세포를 유기체의 외부(예를 들어, 시험 플라스크)에 유지시키고 선택적으로 증식시키는 공정을 말한다.

본 명세서에서 사용된 어구 " 세포의 집단 "은 세포의 동종 또는 이종의 분리된 집단을 말한다. "SPC 또는 HSPC의 집단 "은 각각 줄기 및 전구 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포의 동종 또는 이종의 분리된 집단을 말한다.

본 명세서에서 사용된 용어 " 줄기 및 전구 세포 "는 조직 또는 신체에서 세포 덩어리를 생성하는 원인이 되는 가장 먼저 재생 가능한 세포의 집단 및 매우 초기의 전구 세포(이는 어느 정도 더 분화되지만, 아직 분화되지 않았고 용이하게 복귀하여 가장 먼저 재생 가능한 세포의 집단의 일부분이 될 수 있음)를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 " 조혈 줄기 및 전구 세포 "는 모든 혈액 세포 계통을 생성하는 원인이 되는 줄기 및 전구 혈액 세포를 말한다.

특정 실시형태에서, 줄기 세포는 줄기 세포 마커, 예컨대 CD34+, CD34+/CD38-, CD133+, CD34+/Lin- 또는 당업계에 공지된 다른 줄기 세포 마커에 의해 식별될 수 있다.

SPC의 공급원은 제대혈(UCB), 동원 말초혈(mPB), 또는 골수일 수 있다. 즉, 구체적인 실시형태에서, SPC 또는 HSPC의 집단을 포함하는 생물학적 샘플은 제대혈(UCB), 동원 말초혈(mPB), 또는 골수로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이식을 위한 세포의 준비 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 조직(예를 들어, 제대혈 및 골수 흡인)은 멸군 절차를 사용하여 제거된다. 이식을 위하여 준비된 세포는 생리학적 용액에 유지되거나, 현탁액 또는 고정된 기질 상에서 배양될 수 있다. 세포를 지지할 수 있는 적합한 배양 배지는 HEM, DMEM, RPMI, F-12 등을 포함한다. 필요하다면, 배지는 세포 대사에 필요한 보충물, 예컨대 글루타민 및 다른 아미노산, 비타민, 미네랄, 트랜스페린 등을 함유할 수 있다. 배지는 또한 효모, 박테리아 및 곰팡이에 의한 오염을 방지하는 항생제, 예컨대 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 등을 함유할 수 있다. 배양에서, 조건은 생리학적 조건에 가까워야 한다(바람직하게, 약 6 내지 약 8의 pH, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도).

세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라서 제대혈(UCB)로부터 얻어질 수 있으며, 예를 들어 세포는 (사전 동의의 수령 후) 정상적인 만삭 분만 후 UCB로부터 얻어진다. 샘플은 예를 들어 루빈스테인(Rubinstein) 등(PNAS USA 1995; 92 (22): 10119-10122)에 따라서 산후 24시간 이내에 수집되고 냉동될 수 있다. 사용 전, 세포는 2.5% 인간 혈청 알부민을 함유하는 덱스트란 완충제 중에서 해동되고, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 구배 상에서 적층된 다음 30분 동안 800 x g에서 원심분리될 수 있다. 계면 층의 단핵 세포를 수집하고 0.5% HSA를 함유하는 인산-완충 식염수(PBS)로 3회 세척할 수 있다.

생물학적 샘플을 새로 수확, 보존 또는 저온-보존할 수 있다. 새로운 또는 배양된 세포 준비물을, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 필요할 때까지 저온 보존할 수 있다. 세포를 특정 저온보존제를 함유하는 등장액, 바람직하게는 세포 배양 배지 중에서 현탁시킬 수 있다. 이와 같은 저온보존제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 글라이콜 등을 포함한다. 이식을 위한 세포의 준비 및 저장을 위한 추가 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Handbook of Transplantation; Kipshidze and Serruys, eds. London, UK, 2004]에 상세히 개시되어 있다.

구체적인 실시형태에서, 상기 향상된 생착은 골수, 림프구, 혈소판 또는 적혈구 재구성 또는 활성을 증가시키는 것을 포함한다.

" 종양괴사인자( TNF ) 수퍼패밀리 "는 현재 인간에서 19개의 리간드와 29개의 수용체로 이루어져 있으며, 3가지 추가적인 TNF 수퍼패밀리 수용체가 마우스에서 확인되었다. 대부분의 TNF 리간드는 세포외 도메인이 특이적 메탈로프로테이나제에 의해 절단되어 가용성 사이토카인을 생성할 수 있는 II형 막관통 단백질이다. TNF 수퍼패밀리 리간드용의 수용체는 올리고머, I형 또는 III형 막관통 단백질이다. TNF 수퍼패밀리의 구성원은 4-1BB/TNFSF9, APRIL/TNFSF13, B AFF/B Ly S/TNFSF 13B, CD27 리간드/TNFSF7, CD30 리간드/TNFSF8, CD40 리간드/TNFSF5, EDA/엑토디스플라신, EDA-A1/엑토디스플라신 A1, EDA-A2/엑토디스플라신 A2, Fas 리간드/TNFSF6, GITR 리간드/TNFSF18, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신, 림포톡신 베타/TNFSF3, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40 리간드/TNFSF4, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, TRAIL/TNFSF10, TRANCE/TNFSF11/RANKL, TWEAK/TNFSF12를 포함한다.

이 패밀리에서 모든 수용체 및 리단드는 상당한 구조적 상동성(약 85%)을 보인다. 그러나, 별개의 활성 말단이 패밀리 내에서 교차 활성 없이 동족 수용체에 리간드의 선택적인 결합을 매개한다. TNF는 2개의 동족 수용체를 가지고, TRAIL은 4개의 막-연관 수용체 및 1개의 가용성 수용체를 가지며, 이 중 3개(가용성 수용체를 포함함)는 신호 도입 없이 리간드에 결합하는 수용체를 유인하는 것으로 고려된다. TNF 패밀리 내에서, Fas는 아포토시스의 공통적인 집행자인 것으로 고려되며, Fas는 패밀리의 다른 구성원과 비교하여 여러 가지 별개의 특징을 제시한다[1, 2]. Fas의 활성화는 수용체 삼량화를 필요로 하고, 따라서 FasL의 활성 아이소폼은 생리학적 조건 하에서 결합된 막이며 약리학적 사용을 위하여 올리고머를 생성하기 위한 컨쥬게이션을 필요로 한다. 삼량화 없이 Fas의 결찰은 아토포시스 신호 전달을 차단하므로, FasL의 가용성 아이소폼은 아토포시스 방지 활성을 가진다.

구체적인 실시형태에서, TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 Fas 리간드(FasL), 종양괴사인자 α(TNF-α), 및 종양괴사인자-관련 아토포시스 유도 리간드(TRAIL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구체적인 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 UCB이고, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 18시간 내지 약 48시간 동안이다.

다른 구체적인 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 골수이고, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 12시간 내지 약 32시간 동안이다.

다른 구체적인 실시형태에서, 상기 생물학적 샘플은 mPB이고, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 3시간 내지 약 18시간 동안이다.

구체적인 실시형태에서, SPC는 약 10 ng/ml 내지 약 20 ng/ml 농도의 TNF-α, 및/또는 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml 농도의 FasL, 및/또는 약 500 ng/ml 내지 약 1500 ng/ml 농도의 TRAIL과 함께 인큐베이션된다.

구체적인 실시형태에서, SPC는 임의의 추가적인 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자의 부재 하에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 함께 인큐베이션된다.

본 명세서에서 사용된 TNF 수퍼패밀리의 구성원의 " 단편 또는 유도체 "는 상기 정의된 바와 같은 생착을 증가시키는 것에 대하여, 완전 단백질의 활성을 유지하는 단백질의 임의의 부분에 관한 것이다.

구체적인 실시형태에서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 표면, 예를 들어 비드에 컨쥬게이션된다. 컨쥬게이션은 링커를 통한 것일 수 있다.

구체적인 실시형태에서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 TNFα 및 FasL의 조합이다.

하기 실시예에서 입증한 바와 같이, TNF 패밀리의 리간드에의 뮤린 골수-유래 전구체의 이식전 노출은 제한된 희석 조건 하에서 수용체 생존율을 개선시켰다. 추가적으로, 리간드의 각각 하나를 가지는 전구체의 활성화는 실질적으로 정량적 및 정성적 조혈 재구성을 개선시켰다. 이들 데이터는 (TNF 패밀리의 리간드에의 노출을 통해) 뮤린 전구체를 활성화시키고 조기 생착을 향상시켜 방사능처리한 마우스를 구조하는 TNF 패밀리 수용체의 능력을 입증한다.

이식전 TNF 패밀리 리간드에의 이식전 노출은 인간 UCB 및 mPB 세포의 정량적인 생착을 개선시킨다. SCID 재구성 세포(SRC)는 인간 세포에 대한 가장 믿을 수 있는 대용 분석법인 것으로 고려되며, 상기 분석법은 인간 재구성 세포(HRC)와 관련되어 있다. 그러나, 인간 세포 샘플과 개별적인 마우스의 생착의 생물학적 가변성 간의 광범위한 가변성은 이러한 분석법의 상당한 결점이다. 추가적으로, 인간 세포는 사이토카인 및 성장 인자의 부분적인 마우스-인간 상용성의 조건 하에서 발달한다. 그러므로 생착에 대한 사멸 리간드의 영향의 비교 분석은 비교적 다수의 인간 샘플(65 UCB 단위)을 사용하여 실행되었으며, 각각 하나는 3 내지 7 수용체로 이식된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, TNF 패밀리 수용체의 이식전 활성화는 신선한 UCB 세포 및 저온보존된 mPB 샘플의 우수한 정량적 생착을 초래한다. 전반적으로, TNF 수퍼패밀리의 리간드에의 인간 세포의 이식전 노출은 SCID 제노키메라에서 정량적인 인간 세포 생착을 개선시킨다.

TNF 패밀리 리간드에의 이식전 노출은 인간 UCB 및 mPB 세포의 정성적인 생착을 조절한다. B 림프구 및 골수 세포는 SCID 마우스에서 인간 전구체로부터 발달하는 제1 인간 계통이다. 실시예에서 나타낸 바와 같이, B 림프구의 부분은 향상되었으며, 우수한 골수 생착이 TNF 패밀리 리간드와 함께 인큐베이션한 UCB 세포의 수용체에서 입증되었다. 따라서, 개선된 정량적인 생착은 전구체의 조기 생착 및 향상된 기능의 결과이다. 추가적으로, TNF 패밀리 수용체의 이식전 활성화 시기는 조혈 전구체 기능의 질을 조절한다.

TNF 수용체의 결찰을 통한 조혈 전구체의 활성화는 뮤린 및 인간 세포에서 공통적인 경로로서 진화한다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 우수한 정량적 및 정성적 생착에 의해 강조된 바와 같이 생체 내에서 활성화는 계속된다. 이러한 증거는 TNF 수퍼패밀리 수용체의 활성화에 의해 매개되는 향상된 생착 및 조기 전구체 활성을 나타낸다.

제대혈은 골수 및 동원 말초혈과 비교하여 조혈 전구체의 풍부한 공급원이다. SRC의 높은 빈도는 10⁷ mPB 세포와 비교하여 UCB 세포가 이식된 마우스에서 우수한 수준의 인간 키메라 현상에서 명백하였다. 제대혈 이식의 주요 제한점은 전구체의 수가 낮고, 생착의 느린 속도이다. UCB 전구체는, 이의 타고난 원시 특성, 및 골수 스트로마와의 상호작용에 있어서 이전의 경험 부재 때문에, 활성을 개시하는 것이 느리다. 오래가는 다계통 인간 조혈 재구성은 골수에서 이식된 전구체에 의해서만 매개된다. 본 발명은 2가지 제한점에 영향을 미치는 능력, 즉 보다 이른 생착 및 개선된 정량적인 재구성을 가진다.

본 발명은 임의의 유형의 이식, 즉 여러 가지 공급원의 공여 세포 및 다양한 조건의 수용체로부터의 이식에서의 사용에 적합하다. 가능한 합병증은 종종 이식전에 평가될 수 있으며, 임상적으로 관련된 이식편의 이식전 조절을 시킨다. 생착까지의 시간은, 혈소판 회복 전에 치료될 수 없는 무형성, 출혈 및 정맥 폐쇄성 사건의 기간 동안 수혈의 필요조건인 감염에의 감수성에 대한 중요한 영향을 가지는 이식의 중요한 파라미터 중 하나이다.

G-CSF의 이식후 투여는 TNF 패밀리 수용체 결찰을 통한 전구체의 이식전 활성화 후 공여 세포 생착을 높이는 데 더 효과적인 것으로 고려된다.

동원 말초혈은 광범위한 용도를 가지는 세포의 접근 가능한 공급원이며, 이는 성숙한 공여 T 세포에 의해 매개되는 잠재적으로 치명적인 GvHD에 의해 제한된다. 아포토시스-민감성 T 세포의 기능적 결핍에 의한 GvHD 중증도의 감소에 추가적으로[36, 38], 제안된 접근법은 생착을 증대시킴으로써 이식편대종양 반응성에 대하여 영향을 미칠 가능성이 있다. 이식 동안 면역억제의 기간은 종양 세포의 제한되지 않는 성장으로 인하여 위험하다.

전구체 활성화의 진정한 특성은 2차 이식 실험에 의해 강조된다. 전구체 활성화에 의해 도입된 의문점 중 하나는, 단기간 및 장기간 조혈 재구성 능력이 부여된 전구체의 분화를 통한 소멸을 야기하는지 여부이다. 증가된 B 림프구 및 골수 자손은 일차 SCID 수용체의 골수에서 계통-음성 세포에서의 상호 감소에 의해 수반되었다. 그러나, 1차 수용체에서 우수한 정량적인 재구성에 따라서, 순차적인 2차 수용체의 재구성이 또한 개선되었다. 이론에 의해 제한되고자 하는 것은 아니지만, 이들 결과는 TNF 패밀리 수용체가 소멸보다는 전구체 활성화에 의해 생착을 개선시키는 것을 나타낸다.

앞서 나타낸 바와 같이, 전구체는 자극 인자, 예컨대 과립구 마크로파지콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 줄기 세포 인자(SCF)와의 상승 작용을 통해 클론 형성 활성에 관여하도록 유도된다[29, 30]. 이들 신호는 뮤린 세포에서 Fas, TNF-R1 및 TRAIL-R2(뮤린 TRAIL 수용체만 해당)에 의해 매개된다[29 내지 31]. 일관되게, 배양물에 계속적으로 존재하는 리간드의 영양 신호는 인간 UCB 및 mPB 샘플의 활성화를 자극하는 성장 인자로 상승 작용한다[36, 38]. 이들 신호는 TNF-R1 및 TRAIL-R1에 의해 일차적으로 매개되며, 이는 Fas의 더 작은 양성 영향을 가진다. 동시에, TNF 패밀리 리간드는 말기에 분화되는 자손에서 음성 조절자로서 작용하며, 이는 개별적인 수용체 간의 상당한 변화를 가지는 콜로니의 크기를 감소시킨다[29 내지 31]. 인간 세포의 이들 대용 분석법의 한 가지 상당한 제한점은 콜로니의 발달에 대한 사멸 세포의 부정적인 영향이며, 이는 사멸 리간드에 의핸 민감성 세포의 아포토시스의 유도에 의해 과장된다[29, 32]. 그러므로, 배양물이 정제된 전구체로 개시되더라도 분화된 자손은 아토포시스에 민감성으로 되므로, 배양물에서 리간드의 진정한 영양 효과는 내인성 인자에 의해 매개되는 과소평가이다.

본 발명에 따른 줄기 및 전구 세포 활성화의 메커니즘은 1차 수용체의 골수로부터 수확된 세포의 골수 콜로니의 증가된 수에 의해 예시된다. 심지어 이식후 12주째에, 클론형성 활성은 TNF-α로 전처리된 세포의 수용체에서 증가되었다. 이러한 시험관내 분석은 생체 내의 향상된 골수 활성과 일관되며, 상기 향상된 골수 활성을 입증한다. 그러므로, TNF 수퍼패밀리 수용체를 통한 이식전 전구체 활성화는 이식후 결과를 뒷받침하였다.

시험관내 클론형성 분석법은 생체 내에서 관찰된 TNF 패밀리 수용체 결찰의 결과를 입증하기 위해 실행되었다. 반고체 메틸셀룰로스 배양물에서 클론형성 활성은 SCID 재구성 세포와 비교하여 더 헌신적인 전구체의 하위세트의 활성을 반영하며, 상기 전구체는 성장 인자, 예컨대 SCF, IL-3 및 GM-CSF에 의해 자극된다. 클론형성 분석법은 주로 UCB 및 mPB 세포의 TNF 패밀리 리간드와 함께 단기간 인큐베이션 한 후 향상된 활성을 확인한다. 이들 데이터는 TNF 패밀리 수용체에 의한 헌신적인 조형 전구체의 자극을 입증한다. 중요하게도, 여기에서 실행된 클론형성 분석법은, 사멸 세포의 상당 수가 배양물에 포함되어 있었으므로, TNF 패밀리의 진정한 유도 효과의 과소평가이다. 사멸 세포의 존재는 실질적으로 반고체 배양물에서 클론형성 활성을 억제한다[32]. 이들 분석은 직접적인 영양 효과를 입증하며, 사멸 세포의 제거에 의해 달성된 생존가능한 집단 내에서 증가된 전구체 빈도와는 구별된다[33, 34].

분화된 조혈 세포는 TNF 패밀리 수용체가 음성 조절의 주요 항상성 메커니즘이 되면서, 성숙 과정을 따라 아포토시스 신호전달에 대한 민감성을 획득한다. 이는 배양물에서 사멸 리간드의 존재 하에서 콜로니 크기의 감소로부터 명백하였다[29 내지 32]. 그러나, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, TNF-α의 유도 활성은 mPB 전구체의 사전 활성 후 큰 콜로니 크기에서 명백하였다. 리간드는 배양물에 존재하지 않았으며, 따라서 분화된 자손에 대하여 음성 조절을 가하지 않았다.

하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 전구체의 특징 중 일부는 TNF 패밀리 리간드와 함께 단기간 인큐베이션한 후 분석에 의해 드러났다. 수용체의 활성화는 유사분열이 중단된 세포의 부분에 영향을 미치지 않았다. 이들 세포는 SRC 하위세트를 함유한다[24 내지 26]. 게다가, 수용체의 활성화는 CD34⁺ 및 계통-음성 UCB 전구체의 증식을 유도하지 않았다. 이들 데이터는 TNF 패밀리 수용체가 자체의 수의 증폭 또는 증식 유도 없이 전구체 활성을 활성화시킴을 입증한다.

전통적인 도그마와는 대조적으로[8 내지 10, 17 내지 22, 27], TNF 패밀리 수용체의 활성화는 조혈 전구체 생존력 및 기능에 해로운 결과를 가지지 않음이 강조된다. 조혈 세포 기능에 대한 TNF 패밀리 수용체의 해로운 영향을 기록하는 이전 연구는, 성장 인자 및 지지 케모카인의 보충뿐만 아니라 이들의 회수에 의해 시험관 내에서 전구체를 자극하였다[12, 13, 16 내지 21, 27, 35]. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 실험은 임상 설정을 자극하도록 설계하였으며, 여기서 전구체는 이식 전에 지지 케모카인이 보충되고 이에 의해 자극되지 않는다. 이전 기술과 대조적으로, 본 발명의 발명자들은 전구체에서 TNF 수용체 활성화의 상당한 영양 활성을 발견하였다. 데이터는 수용체-매개 신호전달이 영양 경로를 유도하며, 이는 지속적인 활성화를 전달하고, 후속 전구체 기능을 지배함을 나타낸다.

하기 나타낸 바와 같이, 각각의 수용체가 신선한 UCB 세포의 소부분에서 발현되지만, 전구체 세포의 대략 50%는 수용체 중 하나를 통해 신호전달에 반응성이다. 인간 세포에서 영양 수용체는 TNF-R2의 공지되지 않은 활성을 가지는 TNF-R1[32], 및 TRAIL-R2의 활성에 길항작용하는 TRAIL-R1[30]이다.

본 발명은 하기 요소를 고려한다: a) 활성화의 표적 수용체, b) 리간드의 농도, c) 전구체 활성화를 달성하기 위한 수용체 결찰의 지속기간, d) 수용체 발현의 조절, 및 e) 적용된 리간드의 조합.

하기 비제한적인 실시예는 Fas, TNF 및 TRAIL 수용체의 활성화를 나타낸다. 이들 수용체의 각각의 하나는 조혈 전구체에서 영양 활성을 나타낸다. 뮤린 세포에서, 리간드의 최적 농도에서 3가지 수용체의 활성화의 유사한 결과가 있다. UCB 및 mPB 기원 둘 다의 인간 세포에서의 분산에서, TNF-R1 및 TRAIL-R1은 Fas보다 활성 유도에 있어서 더 강력하다. 인간 전구체 활성화를 위한 리간드의 효과적인 농도는 (1 내지 5x10⁷개 세포/ml의 현탁 농도에서) FasL 10 내지 50 ng/ml, TNF-α 10 내지 20 ng/ml, 및 TRAIL 500 내지 1500 ng/ml의 범위이다.

리간드에의 노출 지속기간은 상이하다. UCB 세포는 18 내지 48시간의 기간 동안, 골수 세포는 12 내지 32시간 동안, mPB는 3 내지 18시간 동안 인큐베이션된다. 영양 신호전달을 위한 인큐베이션의 기간은 상이하며, 일반적으로 전구체의 기증성 음성 선택을 위한 노출 시간보다 더 길다. 인간 세포의 이식전 인큐베이션의 기간은 극적인 표현형 변화에 의해 제한되며, 이들 세포는 배양물에서 생체 외 배양 3일 후 생착 잠재력의 손실을 겪는다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 72시간 동안 생체 외 배양 후 UCB 전구체의 생착 잠재력이 손실은 TNF 패밀리 수용체에 의해 매개되는 아포토시스 신호전달과 독립적이다. 그러므로, 일반적인 목표는 배양 기간을 최소한으로 단축시키는 것이다. 상기 상술한 바와 같이, 인큐베이션 시기는 도한 림프구 및 골수 분화의 우선적인 유도를 결정한다.

TNF 패밀리 리간드의 조합의 사용은 이식전 인큐베이션 조건의 조성물을 개별화하고 맞추는 기회를 제공한다. 하나의 이와 같은 조합은 FasL 및 TNF-α에 대하여 제시되며, 이는 각각의 리간드 단독과 유사한 영양 활성을 나타낸다.

아포토시스에 대한 전구체의 저항성은 수용체 발현의 조절에 의한 TNF 패밀리 리간드의 다양한 구성원에 대한 반응성의 패턴을 조절하는 기회를 제공한다. 예를 들어, Fas 및 TNF 수용체는 동족 리간드의 적용 전에 또는 이에 부수적으로 인터페론-γ에 의해 상향조절될 수 있다. 수용체 발현의 패턴의 조절은 전구체의 반응을 감쇠시키는 능력을 가진다. 몇몇 리간드의 사용은 생착을 촉진시키는 접근법으로서, 상이한 이식 설정 하에서 다양한 공급원으로부터의 세포의 전처리에 있어서 특정 정도의 유연성을 허용한다. 특히, TNF 패밀리 수용체 및 리간드 사이에는 교차-반응성이 없으며, 각각의 분자는 동족 수용체로 제한된다.

동족 리간드에 의한 직접적인 활성화 이외에, 유도 혼선이 다양한 수용체의 경향을 증가시킨다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, Fas 발현에 대한 TNF-α의 잘 특징지어진 유도 효과[8, 12]는 TNF 수용체 둘 다에 의해 매개된다. 추가적으로, 추가적인 유도 상호작용은 다음을 드러내었다: Fas는 TRAIL-R1의 발현을 유도하고, TRAIL은 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2 둘 다의 발현을 유도한다. 수용체 혼선의 기능성 결과는 Fas 및 TNF-R2를 동시 발현하는 세포의 추가적인 아포토시스 및 Fas 혼선에 대하여 반응하여 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2를 발현하는 전구체의 증식 유도를 포함한다. 그러나, Fas 및 TNF-R1 또는 TRAIL-R1의 결합 발현은 아포토시스에 대한 민감성을 증가시킨다. 사실, CD34⁺ UCB 전구체의 약 40%에서 Fas의 TNFα-유도 발현 및 FasL에 의한 가교는 반고체 배양물에서 골수 전구체의 자극에 손상을 주지 않는다. 대체로, 하기에 제시된 데이터는 TNF 패밀리 수용체 사이의 상당한 혼선을 강조하며, 이는 조혈 전구체에서의 아포토시스 신호전달과 구분된다.

상이한 리간드의 영향 사이의 차이점은 다양한 공급원으로부터의 조혈 세포의특정 하위세트에 대한 다양한 결과를 얻기 위한 혼합물 사용의 가능성을 제공한다. 그러나, 다른 고려사항이 리간드의 결정된 최적 조합, 예컨대 이식-관련 고려사항의 약간의 예로서 공여체-수용체 HLA 미스매치, ABO 부적합, (5x10⁶개 CD34⁺ 세포/kg의 대략적인 임계값에서) 이식에 이용가능한 세포 및 전구체의 절대수, 활성 악성 질환(아구악화) 대 최소 잔류 종양(1:10,000 악성 세포) 및 완전 관해, 호중구감소증 및 림프구감소증의 이식후 기간 동안 재활성화될 수 있는 기존의 감염(예를 들어, CMV, EBV, 수두, 헤르페스), 계속 진행중인 만성 GvHD(예를 들어, 이전의 성공하지 못한 이식 후), 급성 GvHD의 위험(예를 들어, 동일단상형 이식), 생착에 대한 숙주 저항성(예를 들어, 판코니 빈혈)에 대하여 영향을 미칠 수 있다. 유사한 기준이 자가면역 장애에 적용될 것이며, 상기 자가면역 장애로는 지배적인 비정상적인 골수(예를 들어, 류마티스 관절염) 또는 림프구 세포 병인(예를 들어, 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 염증성 잘 질환)이 있을 수 있다.

실시예

실시예 1: 사멸 리간드에의 뮤린 골수의 생체 외 노출원 전구체 기능을 향상시킨다

이 실시예는, 이식 전, 뮤린 골수-유래 전구체 생착에 대한 TNF 패밀리 수용체 활성화의 영향을 입증한다. 배지에서 그리고 사멸 리간드의 존재 하에서 18시간 동안 인큐베이션한 후 1.5x10⁵개의 계통-음성 동질유전자(CD45.1→CD45.2) 전구체를 850 rad TBI로 조건화된 수용체 마우스에 이식하였다. 대규모 세포 인큐베이션은 전구체의 클론형성 활성을 감소시키는 사멸 세포의 내용물에 의해 오염되므로[29, 31], 분리된 계통-음성 전구체는 제한된 희석 이식 전에 사멸 리간드에 노출시켰다. 마우스의 약 50%의 생존율이 세포의 경계선상의 수, 즉 1.5x10⁵개의 동질유전자 골수-유래 lin^- 전구체의 이식에 의해 수여된다. 18시간 동안 TRAIL(도 1a), FasL 및 TNF-α(도 1b)로 사전 자극된 1.5x10⁵개 lin^- 전구체의 이식은 실질적으로 개선된 우수한 생존율을 초래하였다. 추가적으로, Fas 수용체 발현을 유도하는 TNF-α에의 결합 노출, 및 FasL과의 수용체 가교는 제한된 희석 이식에 있어서 동일하게 우수한 생존율을 초래하였다(도 1b). 이들 데이터는 사멸 리간드를 이용한 뮤린 골수 세포의 단기간 이식전 자극이 제한된 희석 조건 하에서 생존율을 개선시키는 정도로 생리학적으로 중요함을 강조한다.

몇 가지 가능한 메커니즘 중에서 생착에 대한 수용체 활성화의 유도 효과를 입증하기 위하여, 공여 세포 발달을 혼합된 키메라에서 모니터링하였다. 사멸 리간드 중 어느 하나에 세포의 수용체를 사전 노출시키고, TNF-α 및 FasL의 조합은 이식 3주 후에 상승된 수준의 공여 키메라 현상을 나타내었다(도 1c). 혼합된 키메라에서 자손에 대한 사멸 수용체 활성화의 유도 효과를 개선하기 위하여, 골수 전구체의 자손은 면역표현형이었다. 골수 생착은 이식 후 3주째에 안정적이었으며, 이는 아마도 대부분 이들 이식 조건 하에서 포화값에 의해 야기된다(도 1d). 분산에서, 림프구 구획은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 둘다에서 보통의 감소 및 B 림프구에서 상당한 증가를 제시하였다. B 세포는 이식 후 발달하는 제1 림프구 계통이므로, 이들 데이터는 수용체 활성화와 전구체 기능의 유도 효과를 명확하게 나타낸다.

실시예 2

사멸 리간드에의 UCB 세포의 이식전 생체 외 노출은 생착을 향상시킨다

UCB 세포의 상당한 제한은 전구체의 수가 낮고, 이들 골수-미경험 세포의 생착의 느린 속도이다. 신선한 제대혈 단위는 배지에서 (케모카인의 보충 없이) 그리고 50 ng/ml FasL, 20 ng/ml TNF-α 및 1,500 ng/ml TRAIL을 이용하여 다양한 기간 동안(1 내지 3일) 인큐베이션 하였다. 초기 세포의 동일한 수는 2 용량의 25 μg/g 부설판으로 조건화된 면역저하 NOD.SCID 마우스로 이식하였다. 비교를 위하여, 동일한 UCB 단위로부터의 세포를 신선한 또는 배지-인큐베이션된 것으로서 및 사멸 리간드에의 노출 후 이식하였다. 뮤린 골수에서 이식 후 12주째에 판독을 실행하였다(도 2a). 9개의 코드 단위(각각의 코드 단위는 3개의 실험군에서 3~6 마리의 마우스의 이식을 위해 작용함)로부터의 이식 실험의 요약은 배지 단독과 비교하여 24~48시간 동안 FasL, TNF-α 및 TRAIL에의 이식전 노출 후 증가된 키메라 현상의 경향을 나타내었다(도 2b). 뮤린 골수에서 인간 키메라 현상의 실증 측정은 TNF-α와의 사전 인큐베이션에 대하여 나타내어져 있다. UCB 세포를 스트렙타비딘에 컨쥬게이션된 메탈로프로테이나제 절단 부위-결핍 FasL의 절단된 아이소폼에 사전노출될 때 유사한 결과가 얻어졌다[28, 31, 37]. 중요하게도, TNFα는 Fas 수용체 발현을 유도하지만(하기 참조), FasL과의 결합 인큐베이션은 인간 제노키메라 현상의 향상을 손상시키지 않는다. 2일 초과의 기간 동안 UB 세포의 인큐베이션은 리간드의 존재와 무관하게 생착 효율에서 현저한 감소와 연관된다. 이들 데이터는 TNF 수퍼패밀리의 사멸 리간드에의 이식전 노출에 의해 유도된 향상된 정량적인 UCB 세포 생착을 입증한다.

실시예 3

사멸 리간드에의 UCB 세포의 이식전 노출은 정성적인 골수 재구성을 향상시킨다

임상 설정에서 생착까지의 시간은, 감염에의 감소된 감수성과 연관된, 말초 순환에서 과립구의 안정적인 존재로부터 결정된다(500개 세포/dl 초과). 생체 내에서 UCB 전구체에 대한 사멸 리간드의 영향을 평가하기 위하여, 뮤린 골수에서 인간 조혈 계통을 평가하였다. 실시예는 인간 세포에 대한 게이트에서 약간의 T 세포 발달이 있는 우세한 B 림프구 자손을 나타내는 TNFα로 사전처리된 세포에 대하여 나타내어져 있다(도 3a). 도 2a에 나타낸 조건에 따라서 마우스에 이식하였다. 이식 전 사멸 리간드에의 UCB 세포의 사전 노출은 생착의 패턴을 조절하며, 골수-단핵구 자손(p<0.05)이 증가되고, B 림프구 키메라 현상이 증가되며, 이는 NOD.SCID 마우스에서 발달하는 제1 인간 조혈 계통이다(p<0.01, 도 3b). 인간 전구체 활성의 유도는 뮤린 골수에서 계통-음성 인간 세포의 수에서의 상호 감소와 일관되었다(p<0.005). 특히, 가장 큰 유도 효과는 UCB 세포의 인큐베이션 48시간 후 관찰하였으며, 생체 내에서 12주의 연장된 생착 기간 동안 지속하였다(도 3c). 이들 데이터는 사멸 리간드에 의한 이식전 유도 후 생체 내에서 향상된 조기 인간 골수 및 B 림프구 전구체 활성을 입증한다. SCID 재구성 세포(SRC)는 단기간 인간 재구성 세포의 활성과 가장 상관 관계가 높은 것으로 고려된다.

실시예 4

향상된 전구체 활성은 이차 재구성을 개선시킨다

SCID 재구성 세포의 활성화는 인간 전구체의 소멸을 야기하고 오래가는 생착을 손상시킬 수 있다. 그러나, 이식후 12주째에 뮤린 골수에서 인간 CD34⁺ 세포의 절대 함량은 각각 대조군 배지와 비교하여 24 및 48시간 동안 TNF-α에의 사전노출에 의해 34±30%(유의하지 않음), 및 21%±24%(유의하지 않음)만큼 증가하였다. 그러므로, 1차 수용체에서 생착된 인간 세포는 2차 수용체에서 생착의 기능적 분석에서 추가로 평가하였다. 1차 수용체는 도 1a에 나타낸 조건에 따라서 이식되었다. 제1 단계에서, 오래가는 재구성의 원인이 되는 전구체에 대한 TNF-α의 영향은 2차 수용체로의 1차 수용체의 골수 내용물의 이식에 의해 결정되었다. 이식후 12주째에, 배지에서 그리고 TNFα와 24시간 동안 사전 인큐베이션된 UCB 세포의 1차 수용체의 대퇴부 세포 함량의 절반을 이차 부설판-조건화된 NOD.SCID 마우스로 이식하였다. TNFα와 사전 인큐베이션된 세포의 1차 수용체의 대퇴부 내용물의 절반은 배지에서 24시간 동안 사전 인큐베이션한 5.3±3.1x10⁵의 인간 CD34⁺ 세포(유의하지 않음)와 비교하여 3.2±1.4x10⁵를 함유하였다. 인간 제노키메라 현상을 12주 후 골수에서 측정하였다(각 군에서 6마리 마우스 중 3 UCB 단위). 이차 NOD.SCID 수용체로 대퇴부 내용물의 절반의 이식은 TNF-α에 사전 노출 후 인간 키메라 현상의 증가된 수준을 나타내었으며(p<0.05, 도 4a), 인간 전구체에 대한 사이토카인의 해로운 영향의 부재를 입증하였다. 제2 단계에서, 생체 내 골수에서 고수 표현형의 명백한 증거가 시험관 내에서 인간 사이토카인으로 자극된 메틸셀룰로스 배지에서 추가로 평가되었다. 1차 수용체의 골수로부터 유래한 동일한 수의 CD34⁺ 인간 전구체를 인간 SCF, IL-3 및 GM-CSF로 자극한 반고체 메틸셀룰로스 분석에서 실험 종말점에서 평가하였다. 24시간(3 UCB 단위로부터 n=6) 및 48시간(3 UCB 단위로부터 n=7) 동안 사전 인큐베이션한 UCB 세포의 수용체의 콜로니를 배지에서(정규화됨) 사전 인큐베이션한 세포의 수용체에서 측정한 클론형성 활성으로 정규화하였다. 24 및 48시간 동안 TNF-α에의 노출 후 증가된 골수 클론형성 활성이 입증되었다(도 4b). 증가된 전구체 수 및 향상된 골수 증식은 (실증 리간드로서) 생체 외에서 TNF-α에의 노출에 의해 증가된 UCB 전구체의 효과적인 자기 재생을 나타낸다.

실시예 5

UCB 세포 사전 인큐베이션의 영향의 특성화

다음 단계에서, 본 발명자들은 이식전 인큐베이션 및 TNF 패밀리 리간드에의 노출 동안 UCB 세포의 특징 중 일부를 특성화하였다. UCB 세포에 대한 리간드의 영향은 동족 수용체의 발현에 따라 다르다. FasL 및 TRAIL의 다양한 영향을 가지면서, 모든 수용체는 배지에서 48시간 동안 인큐베이션된 UCB 세포에서 비교적 낮은 수준으로 발현한다(도 5a). TNF-α의 영향은 하기 상술되어 있다. 리간드 중 어느 하나에의 노출은 증식을 유도하지 않으며, 액체 배양물에서 대량 계통-양성 UCB 세포와 비교하여 CD34⁺ 및 계통-음성 전구체가 느리게 순환한다(도 5b). 유사하게, 리간드는 주기 단계에 영향을 미치지 않으며, 대략 50%의 계통-음성 전구체가 G0/G1 단계에서 발견되는 반면, 단지 소량의 CD34⁺ 전구체만이 유사 분열이 정지되어 있다(도 5b). SRC(및 인간 재구성 세포) 활성은 유사 분열이 정지된 전구체의 하위세트로 국한되므로, 이러한 패턴은 보존되고 향상된 생착과 일관된다[24 내지 26].

실시예 6

사멸 리간드에의 UCB 세포의 노출은 반고체 배양물에서 골수 전구체 활성을 향상시킨다

골수 전구체 활성에 대한 TNF 패밀리 리간드와의 UCB 세포 사전 인큐베이션의 영향은 SCF, IL-3 및 GM-CSF로 자극된 반고체 메틸셀룰로스 배양물에서 추가로 결정하였다(도 6a). UCB 세포는 1 내지 3일 동안 50 ng/ml FasL, 20 ng/ml TNF-α 및 1,500 ng/ml TRAIL에 노출시켰다. 전구체 자극을 결정하기 위하여, 전체 사전 인큐베이션된 세포의 동일한 수를 생존력과 관계없이(즉, 사멸 세포의 제거 없이) 반고체 메틸셀룰로스 배양물에 파종하였다. 배양물을 과립구 마크로파지콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-3(IL-3) 및 줄기 세포 인자(SCF)로 자극시켰다. 48시간 동안 모든 리간드에의 UCB 세포의 노출은 신선한 세포 및 대조군 배지에서의 인큐베이션과 비교하여 반고체 배양물에서 골수 전구체 활성을 자극하였다(도 6b). 비교 분석을 위하여, 동일한 UCB 샘플을 신선한 또는 대조군으로서 리간드에의 노출 후에 파종하였다. 한 가지 예외는 SRC 활성에서의 상당한 감소에도 불구하고, TRAIL과 함께 인큐베이션을 72시간 한 후 향상된 클론형성 활성이 있었다(도 2b). 48시간 동안 TNF-α에의 UCB 세포의 노출은 Fas 발현을 CD34⁺ UCB 전구체의 약 50%로 상향조절한다(도 6c). TNF-α는 Fas 발현의 강력한 유도자이므로, 본 발명자들은 시험관 내에서 전구체 활성에 대한 이 유도의 영향을 평가하였다. 50 ng/ml FasL 및 20 ng/ml TNF-α에의 UCB 세포의 결합 노출은 또한 골수 전구체 활성화에서 효과적이었으며, FasL 및 TNF-α 단독 각각의 영향과 비슷하였다(도 6d). 이들 데이터는 TNF-유도 Fas 발현이 전구체를 아포토시스에 대하여 민감하게 만드는 것은 아니지만, 이들의 영향은 첨가제 또는 상승제보다 불필요한 것임을 입증한다. 이들 시험관내 데이터는 생체 내 골수 전구체 활성에 대한 TNF 패밀리 리간드의 자극 효과와 일관되며, 상기 자극 효과를 설명한다.

실시예 7

TNF 패밀리 수용체의 혼선

TNF 수용체는 클론형성 분석에서 불필요한 활성을 나타내지만, 이들의 차등적인 영향은 다양한 과제를 이루기 위하여 리간드를 활성화시키는 것의 조합 적용을 필요로 할 수 있다. 이 실시예에서, 아포토시스 및 영양 영향에 민감하게 만들 수 있는 수용체 간의 유도 혼선의 존재를 평가하였다. 액체 배양물에서 사멸 수용체 발현의 역학을 조사하였다. 단핵구 UCB 세포를 72시간 동안 50 ng/ml FasL, 20 ng/ml TNF-α 및 1.5μg/ml TRAIL과 함께 인큐베이션하고, 수용체의 발현을 신선한 샘플에서 및 리간드 각각과 함께 인큐베이션한 후 CD34⁺ 전구체에 대하여 게이팅함으로써 결정하였다. 이전의 연구에 강조되어 있는 바와 같이[8, 12], TNF-α는 CD34⁺ UCB 전구체에서 Fas의 발현을 유도하는 유일한 리간드이다(도 7a). TNF 수용체의 발현에 대한 리간드의 영향 부재로부터의 분산에서(도 7b), FasL은 전구체에서 TRAIL-R1의 상당한 발현을 유도한다(도 7c). 추가적으로, TRAIL은 자체의 수용체를 유도하며, 이는 72시간의 연장된 인큐베이션 기간 후에 지속적인 양성 영향의 원인이 될 수 있다(도 6b). 요약하면, 현저한 혼선이 TNF 수용체와 Fas 둘 사이에서 관찰되지만(도 7d), 오직 TNFR2-유도 및 Fas는 FasL-매개 아포토시스에 대하여 감수성을 증가시켰고, TNFR1-유도 Fas 발현은 대체로 전아포토시스 활성이 없다(도 7f). 다른 상호작용은 Fas-유도 TRAIL-R1 발현이며(도 7d), 수용체 둘 다를 발현하는 세포에서 전아포토시스 결과 및 증식의 유도는 없다(도 7e). 이들 상호작용은 유도 혼선을 통해 수용체의 활성화에 의해 매개되는 영향의 특성을 정의한다.

실시예 8

사멸 리간드에의 mPB 세포의 노출은 생착을 증가시킨다

사멸 리간드의 영향이 UCB 세포의 선택적인 특성이 아님을 입증하기 위하여, 저온보존된 동원 말초혈(mPB) 세포를 이용하여 실험을 실행하였다. 저온보존된 mPB 샘플을 해동시키고, 4시간 동안 50 ng/ml FasL, 20 ng/ml TNF 및 1,500 ng/ml TRAIL과 함께 인큐베이션하였다. 비교 분석을 위하여, 동일한 mPB 단위로부터의 세포를 조작되지 않은 상태로(해동함), 또는 배지에서의 인큐베이션 및 리간드에의 노출 후 이식하였다. 전체 10⁷개의 세포(사멸 세포의 배제 없음)를 부설판-조건화된 NOD.SCID 마우스에 이식하고(도 2a에 나타낸 바와 같음), 골수를 12주 후에 분석하였다. 이들 샘플을 5일 동안 G-CSF로 동원 및 분리반출법에 의핸 단핵구 세포의 수집에 의해 구하였다. 이들 샘플은 DMSO로 냉동시키고, 해동 후 약 15% 사멸 세포를 함유하였다. 부설판 조건화된 NOD.SCID 마우스에의 이식(도 2a)은 UCB 세포 이식보다 공여 키메라 현상의 현저하게 더 낮은 수준을 나타내었다(도 8a). 그러나, FasL 및 TNF-α와의 세포의 이식전 인큐베이션은 대조군 배지 단독에서는 아니지만, 인간 제노키메라 현상의 수준을 상당히 증가시켰다. 이식 후 12주째에 뮤린 골수 분석은 FasL 및 TNF-α로 사전 처리된 세포의 수용체의 인간 B 림프구에서 상당한 증가를 나타내었으며(세포는 리간드와 함께 4 또는 16시간 동안 사전 인큐베이션함)(도 8b), 이는 제노키메라 현상에서 인간 세포 분화의 지배적인 조기 계통이다. 이들 데이터는 TNF 패밀리 수용체의 생체 외 활성화가 말초혈로 동원되고 저온보존된 인간 조혈 세포의 정량적이고 정성적인 생착을 조절함을 입증한다.

실시예 9

사멸 리간드에의 mPB 세포의 노출은 골수 전구체 기능을 향상시킨다

사멸 리간드의 영향의 추가적인 분석은 반고체 배양물 중 골수 전구체 분석으로 실행하였다. 저온보존된 mPB 세포를 해동하고, 사멸 리간드(50 ng/ml FasL 및 20 ng/ml)와 함께 4 및 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 GM-CSF, IL-3 및 SCF로 자극된 메틸셀룰로스 배양물 중에 전체 세포의 수를 동일하게 하여 파종하였다(사멸 세포의 제거 없음)(n=5 내지 11)(도 6a). 4시간 동안 FasL 및 TNF-α와의 짧은 인큐베이션은 콜로니의 수에 있어서 소량의 상승을 유도하며, 이는 16시간 동안 인큐베이션 후에 현저하게 향상하였다(도 9a). 골수 전구체 활성화의 추가 증거는 TNF-α에 의해 유도된 콜로니 크기의 증가로부터 명백하였다(도 9b). 전구체의 발달이 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 환경에 의해 영향을 받으므로, 사멸 리간드에 의한 전구체 활성화의 결과는 전구체 기능에 대하여 차별적인 결과를 가졌음은 놀라운 것이 아니다. 이들 데이터는 말초혈로 동원된 골수 전구체의 활성 이상의 사멸 리간드의 영양 효과를 입증한다.

참고문헌

Claims

줄기 및 전구 세포(stem and progenitor cell; SPC) 이식을 필요로 하는 수용체에서 SPC의 생착을 향상시키는 방법으로서,
a. 공여체로부터 얻은 생물학적 샘플을 생체 외에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계로서, 상기 생물학적 샘플은 SPC의 집단을 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 상기 접촉시키는 단계(a) 후, 상기 SPC를 상기 수용체에 이식하는 단계를 포함하되, 이식된 상기 SPC는 향상된 생착을 나타내는, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 SPC는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제2항에 있어서, 상기 향상된 생착은 골수, 림프구, 혈소판 또는 적혈구 재구성 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하는, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 Fas 리간드(FasL), 종양괴사인자 α(TNF-α), 및 종양괴사인자-관련 아포토시스 유도 리간드(TRAIL)로 이루어진 군으로부터 선택되는, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SPC 또는 HSPC의 집단을 포함하는 상기 생물학적 샘플은 제대혈(UCB), 동원 말초혈(mPB), 또는 골수로 이루어진 군으로부터 선택되는, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선하게 수확, 보존 또는 저온보존된, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 UCB이되, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 18시간 내지 약 48시간 동안인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수이되, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 12시간 내지 약 32시간 동안인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 mPB이되, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 3시간 내지 약 18시간 동안인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제6항에 있어서, 상기 TNF-α는 약 10 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 농도인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제6항에 있어서, 상기 FasL은 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 농도인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제6항에 있어서, 상기 TRAIL은 약 500 ng/ml 내지 약 1500 ng/ml의 농도인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 표면에 컨쥬게이트된, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제13항에 있어서, 상기 표면은 비드인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제13항에 있어서, 상기 컨쥬게이션은 링커를 통한, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 TNFα와 FasL의 조합인, SPC의 생착을 향상시키는 방법.
이식 방법에서 사용하기 위한 세포의 집단(population of cells)으로서, 상기 세포는 생착 특징이 향상된 줄기 및 전구 세포(SPC)이고, 상기 생착 특징이 향상된 SPC의 집단은 공여체로부터 얻은 생물학적 샘플을 생체 외에서 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 임의의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 것에 의해 얻어지며, 상기 생물학적 샘플은 SPC의 집단을 포함하는, 세포의 집단.
제17항에 있어서, 상기 SPC는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)인, 세포의 집단.
제18항에 있어서, 상기 향상된 생착 특징은 골수, 림프구, 혈소판 또는 적혈구 재구성 또는 활성의 증가를 포함하는, 세포의 집단.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 Fas 리간드(FasL), 종양괴사인자 α(TNF-α), 및 종양괴사인자-관련 아포토시스 유도 리간드(TRAIL)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포의 집단.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, SPC 또는 HSPC의 집단을 포함하는 상기 생물학적 샘플은 제대혈(UCB), 동원 말초혈(mPB), 또는 골수로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포의 집단.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 신선하게 수확, 보존 또는 저온보존된, 세포의 집단.
제18항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 UCB이되, 상기 접촉은 약 18시간 내지 약 48시간 동안인, 세포의 집단.
제18에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수이되, 상기 접촉은 약 12시간 내지 약 32시간 동안인, 세포의 집단.
제18항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 mPB이되, 상기 단계 (a)의 접촉은 약 3시간 내지 약 18시간 동안인, 세포의 집단.
제20항에 있어서, 상기 TNF-α는 약 10 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 농도인, 세포의 집단.
제20에 있어서, 상기 FasL은 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 농도인, 세포의 집단.
제20항에 있어서, 상기 TRAIL은 약 500 ng/ml 내지 약 1500 ng/ml의 농도인, 세포의 집단.
제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 표면에 컨쥬게이트된, 세포의 집단.
제29항에 있어서, 상기 표면은 비드인, 세포의 집단.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 컨쥬게이션은 링커를 통한, 세포의 집단.
제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원은 TNFα 및 FasL의 조합인, 세포의 집단.