JP2022091653A - 液体医薬組成物中で非常に安定な治療的に活性なアルデスロイキン - Google Patents

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Manuel Rodriguez Juan
セサル ヴェガ，フリオ
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Abstract

【課題】アルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の安定な液体医薬組成物、自己免疫疾患、炎症性障害、遺伝子治療及びがんの処置におけるその使用、ならびに前記組成物を調製するための方法を提供する。【解決手段】約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物であって、浸透圧調節物質が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む、医薬組成物である。【選択図】なし

Description

［関連出願への相互参照］
本出願は、２０１９年６月１３日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／３７０１２の一部継続であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年６月１３日に出願された米国仮出願第６２／６８４，２８８号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従った優先権の利益を主張する。
本開示は、溶液中で安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体を含む新しい医薬組成物及びそれらの医薬用途に関する。
インターロイキン２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の生存、増殖及び分化を調節する重要なサイトカインである（１）。これらの生物学的活性の発見は、１９９４年の転移性腎がん及び１９９８年の転移性黒色腫のがん免疫療法におけるＩＬ－２の臨床応用の承認をもたらした。その後、ＩＬ－２は、患者の腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球、ＴＩＬ）から抽出され、将来のがんの発生を避けるために患者に戻されるＴリンパ球のインビトロ増殖を促進する試薬として浮上した（２）。最近、ＩＬ－２は、抗原特異的Ｔ細胞受容体で形質導入されたＴ細胞（３）、又はがん処置のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で形質導入されたＴ細胞（４）の増殖にも使用されている。ＩＬ－２が免疫応答において二重の機能：ａ）炎症反応の活性化因子としての周知の活性、及びｂ）Ｔ制御性細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞）の増殖を誘導する炎症反応の下方調節因子としての機能（５）を有するという発見の結果、最近ＩＬ－２医療応用の新しい分野が浮上した。この一見逆説的な二重性は、高い又は低い親和性を持つ２種類のＩＬ－２受容体の存在と、それらの特定の細胞分布によって説明できる（５）。このＩＬ－２の二重性は、次のような相反する治療法：ａ）がんの元来の処置のように免疫応答を刺激するための高用量でのＩＬ－２の使用、及びｂ）自己免疫障害や炎症性障害の処置におけるような過剰な又は異常な免疫応答を抑制するための低用量でのＩＬ－２の使用をもたらした。
ほとんど（全てではなくとも）のＩＬ－２の現在の臨床応用は、アルデスロイキン（ｄｅｓ－ａｌａ－２ｓｅｒ１２５）（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標））という名称の天然ＩＬ－２の組換え変異バージョンを使用して行われる。米国特許第４，６０４，３７７号は、組換えＩＬ－２を、バルクを提供するマンニトールのような水溶性担体及び組換えＩＬ－２の水への溶解性を確保するのに十分な量のドデシル硫酸ナトリウムと混合する、無菌の安定な凍結乾燥製剤として整合性のある組換えＩＬ－２（アルデスロイキンを含む）の医薬組成物を、どのように調製するかを教示している。この製剤は、安定でヒト患者において忍容性の高い非経口投与のための水溶液注射に再構成するのに適している。他方、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）製品を調製するプロセスの詳細な説明は、最近、欧州特許第１，６８８，１４６号Ｂに開示されている。
したがって、本開示の特定の実施形態は、細胞の単離及び効果的な刺激に関する方法及び組成物、並びに免疫介在性疾患、がん、ウイルス感染、又は病原体媒介される感染症、神経障害などの処置及び／又は予防におけるこれらの細胞の使用のための方法を提供する。
特定の実施形態では、ＩＬ－２免疫療法を必要とする患者への非経口投与のための液体医薬組成物中で非常に安定なアルデスロイキンを調製する方法であって、一般に、以下のステップを含む：ａ）アルデスロイキン遺伝子を高発現するように操作された発現ベクターでトランスフェクトされた大腸菌株の培養、ｂ）細菌破砕、ｃ）アルデスロイキン凝集体を含む封入体の収集、ｄ）ＳＤＳ界面活性剤を使用するアルデスロイキン凝集体の溶解、ｅ）酸化化合物、例えば塩化第二銅による酸化、ｆ）セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ｇ）有機ニトリル、例えばアセトニトリルを用いた希釈、ｈ）Ｃ４カラムＨＰＬＣクロマトグラフィー、ｉ）ダイアフィルトレーション及びｊ）フィルター滅菌。
特定の実施形態では、ＩＬ－２免疫療法を必要とする患者への非経口投与のための、医薬的に適する水性ビヒクル中のアルデスロイキンを含む組成物であって、アルデスロイキンは、医薬液体組成物中で少なくとも１年間安定であることを確証する本開示の製造方法を使用して調製される。本開示のアルデスロイキンの組成物を用いて、１つ又は複数のプレフィルドシリンジ〔pre-filled syringe〕に整合性のある医薬品を調製することが可能であり、各シリンジは、箱に包装され、所与の処置に適した用量を含む。この製品は、患者への注射の前にいかなる操作を必要とせず、例えば微生物又は他の考えられる汚染を回避する。一方で、本開示の安定な液体アルデスロイキン調製物は、注入、輸液又は臨床栄養のための医学で一般的に使用される非経口溶液に有利に導入され、均一に分配され得る。最近、所与の薬物とアルデスロイキンからなる処置法が開発された（例えば、急性骨髄性白血病患者の第１の緩解を維持するために、ＣＥＰＬＥＮＥ（商標）（ヒスタミン二塩酸塩）が低用量のプロロイキン〔Proleukin〕と併用して投与される）。そのような処置のために、本開示の安定な液体アルデスロイキン調製物は、独特の組み合わせ調製物又は組み合わせキットを作製するためのベースとして役立ち得る。プロロイキンは、細胞療法手順で使用される感受性細胞のインビトロ増殖を誘導するためにも使用されている（５）。これらの手順において、低濃度で製剤化された本開示の安定な液体アルデスロイキンは、微生物汚染をもたらす可能性のある操作を回避するために、また細胞培養物中のアルデスロイキンの迅速及び均一な分布を取得するために非常に有利である可能性がある。これらはわずかな例であるが、当業者は、本開示の安定な液体アルデスロイキン調製物の他の応用を容易に想像することができる。事実、ＩＬ－２調製物は、ＮＫ、Ｔ細胞修飾Ｔ細胞、修飾ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、及び膜にＩＬ－２受容体を発現する他の全ての細胞の刺激に有用であり、様々な医療処置における薬物としての応用が見出され得る。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、非リンパ系細胞、細胞株、形質転換細胞又はそれらの組み合わせを含む、それらの膜におけるＩＬ－２受容体を発現する細胞を包含する医療処置のための薬物として使用される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、ＩＬ－２、例えば、配列番号１、配列番号２を、約０．００１ｍｇから約３ｍｇ／ｍＬの範囲、ＳＤＳを０．０００１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬ、非イオン性浸透圧調節物質、ｐＨ７～８リン酸緩衝液又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質及びｐＨ７～８のリン酸緩衝液からなる。特定の実施形態では、浸透圧調節物質は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む。特定の実施形態では、組成物は、ＩＬ－２タンパク質、例えば、配列番号１、加えて緩衝液、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０アミノ酸未満のものなど）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース、又はデキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、及び／又は他の安定剤、賦形剤、及び／又は保存剤を含み得る。組成物は、液体又は凍結乾燥物として製剤化することができる。医薬製剤に使用することができる成分のさらなる例は、本明細書に記載されているように、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２３ｒｄ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（２０２０）及びその他に提示されている。
特定の実施形態では、方法は、ＩＬ－２、例えば、配列番号１、配列番号２又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、それを必要とする対象である。
特定の実施形態では、それを必要とする対象は、炎症性障害に罹患している。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、傍腫瘍性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ（例えば、活動性）、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、小関節性若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身性発症若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸障害性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（セロネガティビティ、エンテソパシー、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節性リウマチ、多関節リウマチ、全身性発症関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸管性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（セロネガティビティ、エンテソパシー、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症〔ploymyalgia rheumatica〕、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆道硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群〔Sjogren's syndrome〕、乾癬、斑状乾癬、滴状乾癬、逆性乾癬、膿疱性乾癬、紅皮症性乾癬、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、ベーセット病、皮膚への影響を含むがこれらに限定されない、脱毛症、円形脱毛症、全身性脱毛症、動脈硬化症、狼瘡、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば活動性）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎、好酸球性気管支炎、ギランバレー症候群、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（例えば、バセドウ病）、アディソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主疾患、ステロイド不応性慢性移植片対宿主疾患、移植拒絶（例えば、腎臓、肺、心臓、皮膚など）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自発的妊娠喪失、脱毛症、白斑、限局性分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、最小変化疾患、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎などを含む。
特定の実施形態では、免疫障害は、炎症、移植片対宿主病、移植片拒絶、又は自己免疫障害である。特定の実施形態では、免疫障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。特定の態様では、ＧＶＨＤは慢性ＧＶＨＤである。特定の実施形態では、免疫障害は、移植片拒絶である。特定の実施形態では、移植は、臓器移植、骨髄又は他の細胞移植、複合組織移植、又は皮膚移植である。特定の実施形態では、免疫障害は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息又はシェーグレン症候群である。特定の実施形態では、免疫障害はがんである。
特定の実施形態では、免疫障害のリスクがあるか又は免疫障害に罹患している対象を処置する方法は、Ｔ細胞の単離された集団を取得すること、及びＩＬ－２、例えば、配列番号１を含む医薬組成物の存在下で、Ｔ細胞集団の増殖を誘導するのに十分な期間、Ｔ細胞の単離された集団を培養することを含む；ここで、Ｔ細胞は対象に養子導入される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、免疫抑制作用を有するＴリンパ球である。天然Ｔｒｅｇｓは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞として特徴付けられる。Ｔｒｅｇの遺伝的欠損を示すヒト及びマウスは、複数のＴ細胞媒介性臓器特異的自己免疫疾患を発症する。Ｔｒｅｇの定量的又は定性的な欠陥は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、多発性硬化症、ブドウ膜炎、筋炎など、多くのヒト自己免疫疾患で報告されている。逆に、Ｔｒｅｇの添加／回復は、これらの疾患のほとんどの動物モデルにおいて臨床的な改善を誘導する。
Ｔｒｅｇはまた、炎症性疾患の制御において主要な役割を果たすが、そのような疾患におけるそれらの作用機序はよく理解されていない。事実、ほとんどの炎症性疾患において、Ｔｒｅｇは、枯渇により疾患が悪化し、Ｔｒｅｇの添加によりそれが減少する。これは、例えば、アテローム性動脈硬化症において示されている。この疾患は炎症性疾患が主ではないが、その発症には炎症性成分／ループが含まれる。自発的にアテローム性動脈硬化症を発症するアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）欠損マウスでは、Ｔｒｅｇの枯渇によりプラーク形成が著しく悪化し、ポリクローナルＴｒｅｇの注射により疾患が大幅に改善された。ほとんどのＴｒｅｇはＣＤ４＋細胞であるが、抑制活性を有するＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球のまれな集団もある。
特定の実施形態では、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法は、それを必要とする対象に、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを投与することを含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、医薬組成物に含まれる。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、配列番号１、配列番号２、又はそれらの変異体を含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンはインビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で、安定を維持する。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を液体組成物中に含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、ヒトがんの動物モデルにおける測定で、液体組成物において少なくとも１年間、安定な治療活性を有する。
特定の実施形態では、それを必要とする対象における疾患又は障害に関連する免疫応答を制御する方法は、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を液体組成物中に含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、ヒトがんの動物モデルにおける測定で、液体組成物において少なくとも１年間、安定な治療活性を有する。特定の実施形態では、疾患又は障害は、自己免疫疾患、がん、炎症、ウイルス感染、細菌感染、神経変性障害、又はそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団の増殖を誘導する方法は、Ｔ細胞の単離された集団を取得すること、及びＩＬ－２、例えば配列番号１を含む医薬組成物の存在下でＴ細胞の単離された集団をＴ細胞の集団の増殖を誘導するのに十分な期間、培養することを含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。
特定の実施形態では、Ｔ細胞の刺激された集団を産生するインビトロ方法は、Ｔ細胞の単離された集団を取得すること、及びＩＬ－２、例えば配列番号１、配列番号２又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物の存在下でＴ細胞の単離された集団をＴ細胞の刺激された集団を生成するのに十分な期間、培養することを含む。
特定の実施形態では、それを必要とする対象における自己免疫疾患又は障害を処置する方法は、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を液体組成物中に含む。特定の実施形態では、アルデスロイキンは、ヒトがんの動物モデルにおける測定で、液体組成物において少なくとも１年間、安定した治療活性を有する。
特定の実施形態では、それを必要とする対象においてＴ細胞媒介性免疫応答を回復する方法は、治療有効量の（ｉ）約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物、（ｂ）治療用タンパク質をコードする発現ベクター；（ｉｉ）１つ又は複数の動員因子を投与することを含み、それにより、それを必要とする対象におけるＴ細胞媒介性免疫応答を回復させる。特定の実施形態では、ＩＬ－２は、配列番号１、配列番号２、それらの組み合わせ、又はそれらの変異体を含む。特定の実施形態では、浸透圧調節物質は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む。
特定の実施形態では、免疫不全疾患に罹患している対象を処置する方法であって、対象に：（ｉ）配列番号１をコードする発現ベクター；及び／又は（ｉｉ）配列番号１をコードする発現ベクターを含む細胞；及び／又は（ｉｉｉ）約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
特定の実施形態では、免疫療法を必要とする対象を処置する方法は、（ｉ）配列番号１をコードする発現ベクター；及び／又は（ｉｉ）配列番号１をコードする発現ベクターを含む細胞を対象に投与し、それにより対象を処置することを含む。特定の実施形態では、対象は、がん、免疫不全、免疫抑制、ウイルス感染、免疫障害、又はそれらの組み合わせに罹患している。特定の実施形態では、免疫障害、炎症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、又は自己免疫障害である。特定の実施形態では、免疫障害は、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息又はシェーグレン症候群である。特定の実施形態では、この方法は、ＩＬ－２を投与することをさらに含む。
特定の実施形態では、細胞は、自家細胞、同種異系細胞、ハプロタイプ一致細胞、ハプロタイプ不一致細胞、ハプロ同一細胞、異種細胞、細胞株又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、細胞は、幹細胞、臍帯血細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、人工多能性幹細胞、自家幹細胞、骨髄細胞、造血細胞、造血幹細胞、体細胞、生殖系列細胞、分化細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書のＩＬ－２分子は、ＩＬ－２アミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む本開示のＩＬ－２変異体を含む。これらには、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列（すなわち、配列番号１）に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＮ８８Ｒ変異を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－２変異体が含まれる。実施形態はまた、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激し、ＩＬ－２アミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＮ８８Ｒ及びＣ１２５Ｓ変異を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－２変異体を含む。実施形態はまた、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に刺激し、ＩＬ－２アミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬ－２変異体を含む。
本明細書で提供される任意の組成物又は方法は、本明細書で提供される他の組成物及び方法のいずれか１つ又は複数と組み合わせることができる。
組換えヒトインターロイキン２（アルデスロイキン）のアミノ酸配列（配列番号１） 動的光散乱によって測定された、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）と本開示の方法によって調製されたアルデスロイキンとの間の、アルデスロイキン／ＳＤＳ粒子サイズ範囲の比較。 ０～８℃で０、６又は１２ヶ月保存した後の、本開示の方法によって調製されたアルデスロイキンのアルデスロイキン／ＳＤＳ粒子サイズ範囲。
本開示の実施形態は、液体製剤中の非常に安定なＩＬ－２及び安定なＩＬ－２を製造する方法を対象とする。
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみの目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、及び生化学）の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有するものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含む」〔including〕、「含む」〔includes〕、「有する」〔have〕、「有している」〔having〕、「持つ」〔with〕、又はそれらの変形が、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、「含む」〔comprise〕という用語と同様の様式で包括的〔inclusive〕であると意図される。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存している。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内又は１を超える標準偏差を意味することができる。或いは、「約」は、所与の値又は範囲の最大２０％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味することができる。或いは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の５倍以内、また２倍以内の大きさのオーダー内を意味することができる。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。
本明細書で使用される「生物学的培地」は、インビトロで器官、組織、細胞などを増殖、培養及び維持するために使用される任意のタイプの培地である。生物学的培地はまた、任意の生体適合性薬剤、任意の医薬賦形剤、ビヒクルとしての水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの医薬的及び生理学的に許容される液体、組織又は臓器の培養液、対象にインビボで投与することができる任意の薬剤、アッセイ又は例えば核酸、ペプチドなどの生物学的試料の希釈又は維持のために使用することができる任意の薬剤を包含する。
本明細書で使用される場合、「がん」及び「がん性」は、典型的には制御されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、又は記載する。この定義には、良性及び悪性のがん、並びに休眠腫瘍又は微小転移巣が含まれる。がん〔cancer〕の例には、がん〔carcinoma〕、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんを含む）、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切断細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びマイグス症候群に関連する異常な血管増殖が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ケモカイン」という用語は、白血球の走化性及び活性化を選択的に誘導する能力を有する可溶性因子（例えば、サイトカイン）を指す。それらはまた、血管新生、炎症、創傷治癒、及び腫瘍形成のプロセスを引き起こす。ケモカインの例には、ＩＬ－８、マウスのケラチノサイト走化性物質（ＫＣ）のヒトホモログが含まれる。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫細胞を活性化又は刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合された抗原結合ドメインを指し、特定の実施形態では、ＣＡＲは膜貫通ドメインも含む。特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、マウス又はヒト化モノクローナル抗体の可変重鎖領域及び軽鎖領域を融合することに由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成される。或いは、（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた抗体からではなく）Ｆａｂ’ｓに由来するｓｃＦｖを使用することができる。様々な実施形態では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合され、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。「第１世代」ＣＡＲには、抗原結合時にＣＤ３ζシグナルのみを提供するものが含まれ、「第２世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものが含まれる。「第３世代」のＣＡＲには、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものが含まれる。ＣＡＲの第４世代には、ＣＡＲ構築物を含むベクターがサイトカインカセットを保有するサイトカイン殺傷（ＴＲＵＣＫＳ）に向けられたＣＡＲ Ｔ細胞が記載されている。ＣＡＲがライゲーションされると、ＣＡＲ Ｔ細胞は炎症誘発性サイトカインを腫瘍病変に沈着させる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。本明細書で使用され、当技術分野で一般的に使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という語句は、細胞外ドメインへの抗原の結合時に細胞に特殊な機能を行うように指示する細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を指す。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語はそれぞれ、本明細書において、「キメラ抗原受容体」という用語と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、原核細胞及び真核細胞を含む。一実施形態では、本開示の細胞は細菌細胞である。別の実施形態では、本開示の細胞は、酵母細胞などの真菌細胞である。別の実施形態では、本開示の細胞は、脊椎動物の細胞、例えば、鳥類又は哺乳動物の細胞である。好ましい実施形態では、本開示の細胞は、マウス又はヒトの細胞である。本明細書で使用される場合、「操作された」（操作された細胞においてのように）という用語は、例えば、その中にＩＬ－２タンパク質（例えば、スプライシングされた及び／又はスプライシングされていない形態のＩＬ－２）をコードする核酸分子又はその断片が導入されている細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「無細胞組成物」という用語は、インタクトな細胞を含まない単離された組成物を指す。無細胞組成物の例には、細胞抽出物及び単離されたタンパク質を含む組成物が含まれる。
本明細書で使用される「併用療法」という用語は、対象が両方の薬剤に同時に曝露されるように、２つ以上の異なる医薬品が重複したレジメンで投与される状況を指す。併用療法で使用される場合、２つ以上の異なる薬剤が同時に又は別々に投与され得る。この組み合わせ投与は、同じ投与形態での２つ以上の薬剤の同時投与、別々の投与形態での同時投与、及び別々の投与を含み得る。すなわち、２つ以上の薬剤を同じ投与形態で一緒に製剤化し、同時に投与することができる。或いは、薬剤が別々の製剤に存在する２つ以上の薬剤を同時に投与することができる。別の代替案では、第１の薬剤を投与し、その後に１つ又は複数の追加の薬剤を投与することができる。別の投与プロトコルでは、２つ以上の薬剤が、数分間隔、又は数時間間隔、又は数日間隔で投与され得る。
本明細書で使用される場合、「含む」〔comprising〕、「含む」〔comprise〕又は「含まれる」〔comprised〕という用語、及びそれらの変形は、アイテム、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義又は記載された要素に関して、包括的であるか、又はオープンエンドで、追加の要素を許可することを意味しており、それにより、定義又は記載された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどに、指定された要素－－又は適切な場合はその同等物が含まれ、及び他の要素が含まれても、依然として定義された項目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲／定義の範囲内であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、一般に、細胞間媒介物として他の細胞に作用するか、又はタンパク質を産生する細胞にオートクリン効果を有する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質を指す。このようなサイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）ｒＩＬ－２を含む、ＩＬ－１、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ－Ｆ、ＩＬ－１８からＩＬ－２９（ＩＬ－２３など）、ＩＬ－３１などのインターロイキン（「ＩＬ」）；ＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β１～３などの腫瘍壊死因子；及び白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、繊毛神経栄養因子（「ＣＮＴＦ」）、ＣＮＴＦ様サイトカイン（「ＣＬＣ」）、カルジオトロフィン（「ＣＴ」）、及びキットリガンド（「ＫＬ」）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。
「診断」又は「診断された」とは、病的状態の存在又は性質を特定することを意味する。診断方法は、その感度及び特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査陽性であった有病個体のパーセンテージ（「真陽性」のパーセント）である。アッセイにより検出されなかった有病個体は「偽陰性」である。病気ではなく、アッセイで陰性であった対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたものであり、ここで、「偽陽性」率は、検査陽性である疾患のない者の割合として定義される。特定の診断方法では、状態の確定診断を提供しない場合があるかもしれないが、その方法が診断に役立つ陽性の指標を提供するならば、それで十分である。
「発現ベクター」という用語は、転写可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。いくつかの場合では、転写産物がｍＲＮＡ分子である場合、これは次にタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイントモジュレーター」という用語は、免疫チェックポイントと直接的又は間接的に相互作用する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、例えば、Ｔ細胞活性化のためのポジティブシグナルを刺激することによって、免疫エフェクター応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を増加させる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、例えば、Ｔ細胞活性化（例えば、脱抑制）のネガティブシグナルを阻害することによって、免疫エフェクター応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を増加させる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、Ｔ細胞アネルギーのシグナルを妨害する。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、１つ又は複数の抗原に対する免疫寛容を低減、除去、又は防止する。
「インターロイキン」は、自然免疫及び獲得免疫システムの機能に重要な役割を果たすサイトカインの一群である。いくつかのインターロイキンは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、及び造血細胞の発達及び分化を促進する。多くのインターロイキンは、ヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、及び内皮細胞によって産生される。インターロイキンは、特定のインターロイキンに依存して、免疫機能を増強又は阻害することができる。
本明細書で使用される場合、ヒト組換えＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）という用語は、ヒトＩＬ－２コード化ＤＮＡ配列又はその非広範修飾でトランスフェクトされた微生物によって産生される非グリコシル化タンパク質である。事実、臨床診療において最も使用されるＩＬ－２ヒト組換えバージョンは、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標））という名称の、天然のヒトＩＬ－２アミノ酸配列の修飾バージョンであり、以下の修飾を有する：ａ）アルデスロイキンには天然のＩＬ－２に存在するＮ－末端アラニンがない。ｂ）アルデスロイキンは、アミノ酸位置１２５でシステインの代わりにセリンを有する。アルデスロイキンのアミノ酸配列を図１に示す。アルデスロイキン遺伝子の構築は、米国特許４５１８５８４Ａ及び関連する非米国特許に記載されている。米国ＦＤＡは、転移性腎細胞がん及び転移性黒色腫を有する成人の処置における使用のためにアルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標））を承認した。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）は、静脈内投与に意図された２０個の単回使用のバイアルに入った無菌の、白からオフホワイトの、凍結乾燥されたケーキとして提供される。注射用滅菌水１．２ｍＬで再構成すると、ＵＳＰ、各ｍＬには、約０．１７ｍｇの一塩基性及び０．８９ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウムでｐＨ７．５（７．２～７．８の範囲）に緩衝された、１８００万国際単位（１．１ｍｇ）のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）、５０ｍｇマンニトール、及び０．１８ｍｇドデシル硫酸ナトリウムが含まれる。再構成又は希釈されたＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）は、「ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）（アルデスロイキン）注射ラベル－ＦＤＡ」（参照ＩＤ：３１６５２５５）の再構成及び希釈の指示に記載されているように、冷蔵及び室温、２°～２５℃（３６°～７７°Ｆ）で最大４８時間安定である。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン２」（ＩＬ－２）という用語は、白血球（主にリンパ球）の活性を制御するサイトカインを意味する。このサイトカインは、微生物感染に対する免疫応答の一部であり、リンパ球の表面に存在する特定の受容体に結合することによってその効果を発揮する。ＩＬ－２はＩＬ－２受容体（例えば、リンパ球によって発現される）に結合し、白血球（例えば、白血球、リンパ球）の活性を制御し、自己免疫認識対非自己免疫認識において重要な役割を果たし、微生物感染因子に対する応答に関与する。ＩＬ－２は、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞への分化を促進し、未成熟Ｔ細胞の制御性Ｔ細胞への分化もまた促進する。がん治療において、ＩＬ－２は、免疫細胞の活性化及びそれに続く腫瘍細胞増殖の免疫細胞媒介性阻害を増加させることができる。
ＩＬ－２のさらなる情報については、「ＧｅｎｅＣａｒｄ」（受託番号ＧＣ０４Ｍ１２３８３１）に見出され得る。その他の受託番号としては：ＨＧＮＣ：６００１ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３５５８ Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０９４７１ ＯＭＩＭ：１４７６８０ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６０５６８が挙げられる。ＩＬ－２タンパク質には、天然ＩＬ－２タンパク質並びに変異ＩＬ－２タンパク質が含まれる。本明細書で使用される「天然」又は「野生型」ＩＬ－２配列は、天然源から精製されたか、又は組換え技術を使用して作製された、ヒトＩＬ－２配列（例えば、受託番号ＮＰ ０００５７７．２）を指す。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２配列は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）（アルデスロイキン）配列：（配列番号１）を含む：
PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT
ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET
TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT
ヒトＩＬ－２配列（例えば、受託番号ＮＰ ０００５７７．２）（配列番号２）：
MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN
YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL
RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS
TLT。
「免疫応答」という用語は、対象において抗原（例えば、腫瘍細胞抗原）により誘導、誘発、又は増強される任意の応答を指す。この用語には、免疫細胞（Ｂ細胞やＴ細胞など）の発生、成熟、分化、及び活性化、並びに抗原に対する抗体の産生が含まれる。この用語にはまた、免疫機能の調節に関与するサイトカインの発現又は活性の増加又は減少も含まれる。
本明細書で使用される場合、対象への治療の投与の文脈における「組み合わせ」という用語は、治療の利益のための複数の治療の使用を指す。投与の文脈における「ｎの組み合わせ」という用語はまた、少なくとも１つの追加の治療と共に使用される場合の、対象への治療の予防的使用を指すことができる。「ｎの組み合わせ」という用語の使用は、治療（例えば、第１及び第２の治療）が対象に投与される順序を制限するものではない。治療は、対象への２回目の治療の投与前（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、同時に又は続けて（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。治療は、治療が一緒に作用することができるように、順次、時間間隔内に、対象に投与される。特定の実施形態では、治療は、他の方法で投与された場合よりも増加した利益を提供するように、順次、時間間隔内に、対象に投与される。追加の治療法は、他の追加の治療法と共に、任意の順序で投与することができる。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。「キット」という用語には、研究及び臨床の両方の用途のためのキットが含まれる。反応アッセイの文脈において、そのような送達システムには、ある場所から他の場所への反応試薬（例えば、適切な容器内のサイトカイン、オリゴヌクレオチド、酵素など）及び／又は支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面による取扱説明書など）の貯蔵、輸送、又は送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬及び／又は支持材料を含む１つ又は複数の包装（例えば、箱）が含まれる。本明細書で使用される場合、「分割されたキット」という用語は、それぞれがキット全体の構成要素の一部分を含む２つ又はそれ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、目的の受取人に一緒に又は別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイで使用するための酵素を含んでもよく、一方、第２の容器は、オリゴヌクレオチド又はリポソームを含んでもよい。「分割されたキット」という用語には、連邦食品医薬品化粧品法のセクション５２０（ｅ）に基づいて規制される分析物特定試薬（ＡＳＲ）を含むキットが包含されることが意図されるが、それらに限定されない。実際に、全てのキット構成要素の一部分を各々含む２つ又はそれ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、「分割されたキット」という用語に含まれる。対照的に、「組み合わせキット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一の容器に（例えば、所望の構成要素のそれぞれを収容する単一の箱に）含む送達システムを指す。「キット」という用語には、分割されたキットと組み合わせキットの両方が含まれる。
「リンパ球」という用語は、Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」とも呼ばれる）、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」とも呼ばれる）、樹状細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む白血球のサブタイプを指す。Ｔリンパ球は胸腺で成熟し、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。Ｔリンパ球は、細胞表面に存在するＴ細胞受容体の存在によって他のタイプのリンパ球と区別される。Ｔリンパ球は、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、メモリー細胞、制御性（サプレッサー）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞を含む、いくつかのタイプに分類される。エフェクターＴ細胞は、いくつかのＴリンパ球タイプ（ヘルパー、キラー、及び制御性細胞を含む）を含む幅広いカテゴリーを指し、一般に刺激に応答する細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られているヘルパーＴ細胞は、他の種類の白血球を支援し、Ｂ細胞の血漿及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化の支援などの役割を果たす。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に抗原が提示されることによって活性化される。ＣＤ８．ｓｕｐ．＋Ｔ細胞としても知られている細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶に関連する。メモリーＴ細胞は、細菌及びウイルスなどの外来侵入者並びに腫瘍細胞をも認識する。メモリーＴ細胞がそれらの同族抗原に遭遇し、応答した後、２回目の遭遇で、これらの細胞はより強力で速い免疫応答を再現して開始することができる。制御性（サプレッサー）Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫寛容を維持するために重要である；それらの主要な役割は、免疫反応の終わり近くでＴリンパ球媒介性免疫を下方制御し、胸腺におけるネガティブ選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔリンパ球を阻害することである。獲得免疫系と自然免疫系を橋渡しするナチュラルキラーＴ細胞は、ＣＤ１ｄ分子によって提示される抗原を認識し、サイトカイン産生や細胞溶解性分子の放出などの機能を実行する。Ｂリンパ球は、抗体を分泌し、獲得免疫系の体液性免疫成分で機能する。さらに、Ｂリンパ球は抗原提示細胞として機能し、サイトカインを分泌することができる。骨髄で成熟するＢリンパ球は、細胞表面にＢ細胞受容体が存在することで他の種類のリンパ球と区別される。Ｂリンパ球の活性化は、Ｔリンパ球依存性又はＴリンパ球非依存性のいずれかであり得る。Ｂリンパ球は、形質芽細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ－１細胞、Ｂ－２細胞、制御性Ｂ（Ｂｒｅｇ）細胞など、いくつかの種類に分類される。自然免疫系の一部であるＮＫ細胞は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞に対する防御に大きな役割を果たし、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子の細胞表面の変化を認識することにより、これらの細胞を正常細胞と区別する。ＮＫ細胞は、サイトカインのインターフェロンファミリーによって活性化され、活性化されると、変化又は感染した細胞を破壊する細胞傷害性分子を放出する。
「モジュレーター」という用語は、目的の活性が観察される系における存在が、モジュレーターが存在しない場合の他の同等の条件下で観察されるものと比較して、その活性のレベル及び／又は性質の変化と相関関係を持つ実体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、モジュレーターが存在しない場合の他の同等の条件下で観察されるものと比較して、その存在下で活性が増加するという点で、活性化剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、モジュレーターが存在しない場合の他の同等の条件と比較して、その存在下で活性が低下するという点で、阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、その活性が目的である標的実体と直接相互作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、その活性が目的である標的実体と間接的に（すなわち、標的実体と相互作用する中間薬剤と直接）相互作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、目的の標的実体のレベルに影響を与える；代替的又は追加的に、いくつかの実施形態では、モジュレーターは、標的実体のレベルに影響を与えることなく、目的の標的実体の活性に影響を与える。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、目的の標的実体のレベル及び活性の両方に影響を与えるため、観察された活性の違いは、観察されたレベルの違いによって完全に説明されて、それに見合うようにはならない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「又は」という用語は、内容が明らかに他の指示をしない限り、「及び／又は」を含むその意味で一般的に使用される。
「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」という用語は、丸い核を有する任意の末梢血を指す。ＰＢＭＣには、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞）及び単球が含まれる。ＰＢＭＣは、例えば、多糖類フィコールを使用して、全血から抽出した後、勾配遠心分離することができる。遠心分離後、ＰＢＭＣは血漿の最上層と多形核細胞及び赤血球の最下画分の間に見出される。
「医薬的に許容される担体」という句は、治療剤を投与するための担体を指す。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれる。経口投与される薬物の場合、医薬的に許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤及び防腐剤などの医薬的に許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、及びラクトースが含まれ、コーンスターチ及びアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプン及びゼラチンを含むことができ、一方、潤滑剤は、存在する場合、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであろう。望まれる場合、胃腸管での吸収を遅らせるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングしてもよい。
本明細書で使用される場合、「二次活性剤」という用語は、ウイルス感染、例えば、呼吸器ウイルス感染症の予防又は処置に使用される任意の分子を指し、ウイルスに関連する鼻水、鼻づまり、喉の痛み、くしゃみ、肌寒さ、頭痛、筋肉痛、咳などの任意の症状を緩和する薬剤が含まれる。この用語は、ウイルスに関連する任意の症状を緩和する薬剤、例えば、解熱剤、抗炎症剤、化学療法剤などを含む。「二次活性剤」は、例えば、真核細胞のウイルス浸透、真核細胞のウイルス複製、ウイルス集合、感染真核細胞からのウイルス放出などの、少なくとも１つのウイルス作用を特異的に妨害するのに直接的又は間接的に有効であるか、又は真核生物又は哺乳類の宿主系におけるウイルス力価の増加を阻害する、もしくはウイルス力価レベルを減少させるのに効果的である化合物であり得る。ウイルス感染を予防又はその可能性を低下させる化合物も指す。この用語には、抗体、アプタマー、アジュバント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ケモカイン、サイトカイン、免疫刺激剤、免疫調節剤、Ｂ細胞モジュレーター、Ｔ細胞モジュレーター、ＮＫ細胞モジュレーター、抗原提示細胞モジュレーター、酵素、ｓｉＲＮＡ’ｓ、リバビリン、プロテアーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プリンヌクレオシド、ケモカイン受容体アンタゴニスト、インターロイキン、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、類似体、変異体など又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「安定」又は「非常に安定」は、インビトロでの生物学的活性、インビトロでの構造研究、及びインビボでの治療活性によって評価される、本明細書で具体化された製剤中での長期間にわたる分子、例えばＩＬ－２の活性及び／又は完全性を指す。ＩＬ－２の活性は、任意の標準アッセイにより測定できる。保存前と長期保存後、例えば、少なくとも１年間保存後の活性を比較できる。非常に安定なＩＬ－２は、最初にＩＬ－２が製剤化された時点での活性と比較して、同じか又はわずかに少ない活性を有するであろう。
「対象」、「患者」又は「個人」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、処置される哺乳動物対象を指し、ヒト患者が好ましい。いくつかの場合では、本発明の方法は、実験動物、獣医用途、及びマウス、ラット、及びハムスター；並びに霊長類を含むがこれらに限定されない、疾患の動物モデルの開発において使用を見出す。治療を必要とする患者は、特定の状態、疾患、又は障害を発症するリスクのあるものを含む（例えば、肥満などの遺伝的、環境的、又は物理的属性による）。治療が必要な患者には、状態、疾患、又は障害に苦しむものも含まれる。疾患又は障害には、例えば、自己免疫疾患、がん、炎症性疾患、神経学的疾患又は障害、神経炎症性疾患又は障害、心血管疾患、肥満、例えば、ウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は寄生虫などの感染性因子によって引き起こされる疾患又は障害が含まれる。
本明細書で使用される場合、「処置する〔treat〕」、「処置する〔treating〕」、「処置」などの用語は、障害及び／又はそれに関連する症状を軽減又は改善することを指す。除外しないものの、障害又は状態を処置することは、それに関連する障害、状態又は症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。本明細書に記載の任意の疾患の「処置」は、疾患の少なくとも１つの症状の緩和、疾患の重症度の低下、又はいくつかの場合では、疾患又は少なくとも１つの他の疾患に伴い得るより深刻な症状への疾患の進行の遅延又は予防を包含する。処置は、疾患が完全に治癒することを意味する必要はない。有用な治療薬は、疾患の重症度を低下させるか、疾患又はその処置に関連する症状の重症度を低下させるか、又は処置状態の後、ある頻度で発生する可能性のあるより深刻な症状又はより深刻な疾患の発症を遅らせるだけでよい。例えば、疾患が炎症性腸疾患である場合、治療薬は、腸内の異なる炎症部位の数、影響を受ける腸の総範囲を減少し、痛み及び／又は腫れを減少し、下痢、便秘、又は嘔吐などの症状を減少し、及び／又は腸の穿孔を予防することができる。患者の状態は、バリウム浣腸又は高位浣腸の後に行われるＸ線、内視鏡検査、結腸内視鏡検査、及び／又は生検などの標準的な技術によって評価することができる。適切な手順は、患者の状態や症状に応じて異なる。
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性又は良性を問わず、全ての腫瘍性細胞の成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及されるように相互に排他的ではない。
本明細書に引用された受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ提出物は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿、及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて、本明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
範囲：本開示全体を通して、本開示の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜性及び簡潔性のためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様に、全ての可能な副範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１から６などの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの副範囲を、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６と同様に、具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅と無関係に適用される。
安定なＩＬ－２製剤を製造する方法
本開示は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）の全ての構造的及び生物学的特性を満たしながらも、「インビトロ」での生物学的活性、「インビトロ」での構造研究及び「インビボ」での治療活性によって評価される場合、驚くべきことに溶液中で非常に安定している（少なくとも１年）製品をもたらすアルデスロイキンを調製するための新規の方法に一部基づいている。溶液中でほぼ安定なアルデスロイキンを調製するための例示的な方法は、以下のステップを含む：
ａ）アルデスロイキン遺伝子を高度に発現するように操作された発現ベクターでトランスフェクトされた大腸菌株の培養。細菌はＩＬ－２を産生するために好ましい微生物であり、細菌の中で大腸菌株が最も好ましい。大腸菌Ｂは、研究モデルとして、またライフサイエンス研究室及びバイオテクノロジー業界でのタンパク質発現の役割を果たす。プロテアーゼ欠損症、高レベルのグルコースでの低酢酸産生、及び透過性の向上（おそらく単純な細胞表面に起因する）などの特性により、大腸菌Ｂは遺伝子操作されたタンパク質の産生に望ましい宿主になっている。Ｂ株とＫ１２の違いには、べん毛成分遺伝子、ＤＮＡシトシンメチラーゼｄｃｍ、及びＢＬ２１（ＤＥ３）のｏｍｐＴの欠如が含まれる。Ｂ株には、Ｋ１２には見られない追加のＩＩ型分泌システムがあってもよい。ＢＬ２１（ＤＥ３）は、クローンされた遺伝子の高レベルの発現をＴ７プロモーターの制御下で指示できるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＥ３組換えファージも保有できる。組換えタンパク質の発現に使用される典型的な大腸菌株は：ＢＬ２１（標的タンパク質をｌｏｎ及びｏｍｐＴプロテアーゼから保護するＢ大腸菌株）及びそれらの誘導体、例えば：溶原性ＤＥ３（Ｔ７ポリメラーゼに基づく）、ｐＬｙｓＳ、ｐＬｙｓＥ（標的遺伝子の基礎発現を低下させるＴ７リゾザイムを発現する）、Ｏｒｉｇａｍｉ（大腸菌細胞質でのジスルフィド結合形成を可能にする）、Ｒｏｓｅｔｔａ（大腸菌ではめったに使用されないコドンを含むタンパク質の発現を向上させる）などである。同様のバージョンがＫ１２大腸菌の遺伝的バックグラウンドの下に存在する。大腸菌で組換えタンパク質を高発現させるための典型的なプラスミドベクターは以下の通りである：ｐＢＲ３２２オリジン及びＴ７／ｌａｃプロモーターに基づくｐＥＴシリーズ；ａｒａＢＡＤプロモーター及びｐＵＣオリジンを有するｐＢａｄ；また、ｔａｃプロモーター及びｐＢＲ３２２オリジンを有するｐＧＥＸ。融合タグ配列、プロテアーゼ切断部位、選択マーカー、及び株適合性の組み合わせは、高発現プラスミド変異体の最も通常のリストの源である。
発現ベクターは市販されており、アルデスロイキンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列がベクターに挿入されている。インスタントアッセイで使用される細胞は、真核生物又は原核生物由来である可能性がある。例えば、一実施形態では、細胞は細菌細胞である。別の実施形態では、細胞は真菌細胞、例えば酵母細胞である。別の実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、例えば、鳥類又は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、細胞はヒト細胞である。本開示の細胞は、内因性ＩＬ－２又はそのフラグメントを発現することができるか、又はそうするように操作することができる。例えば、ＩＬ－２又はそのフラグメントを発現するように操作された細胞は、タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより産生することができる。
特定の実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。最適なアルデスロイキン産生を得るために、様々な大腸菌株をトランスフェクトすることができる。
ａ）アルデスロイキン産生細菌は適切な増殖培地で培養することができる。例えば、培地は、各９リットルに、酵母エキス２１６グラム、大豆ペプトン１０８グラム、Ｋ２ＨＰＯ４ １１３グラム、ＫＨ２ＰＯ４ ２０．８グラム、グリセロール３６ｍｌ、消泡剤４ｍｌ（２％ｖ／ｖ）が含まれていてもよい。発酵条件は：温度：３７℃±０．５℃、攪拌：３５０ｒｐｍ±１０ｒｐｍ、気流：９Ｌ／ｍｉｎ±１Ｌ／ｍｉｎ、ｐＯ２：設定値４０％、攪拌カスケード：３５０ｒｐｍ～４４０ｒｐｍの間の運転で２１％～３６％の間、ｐＨ６．９５～７．５の間、及び入口空気圧酸素流の開始前で２ｂａｒであってもよい。この後、供給手順が続く。例えば、０．１％の濃度を維持するために、４０％ｐ／ｖのブドウ糖溶液を点滴で供給する。ＯＤ６００が５から１０に達したら、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などの適切な誘導剤を加えて操作濃度に到達させる。この時点で、グルコースの供給を減らして、グルコース濃度を約０．０１％に保ってもよい。培養は通常、接種後約１８～２４時間で停止することができる。培養後、遠心分離又はタンジェンシャルフィルトレーション〔tangential filtration〕により細菌を５～７倍に濃縮し、直ちに処理するか、２～８℃（２４時間以内）で保存するか、－２０℃（２４時間より長く）で保存することができる。
ｂ）培養後、アルデスロイキンは、主に封入体（Ｉｂ）と呼ばれる凝集体の形態で細菌の内部にある。このＩｂは、細菌の破砕（超音波処理など）によって単離できる。このために、細菌は、破砕処理を開始する前に、１７～２２℃の間の温度の精製水に懸濁することができる。この後、懸濁液を約１４００バールの圧力で破砕機のために２～３回循環させることができる。ライセートは直ちに処理するか、－２０℃で保存するべきである。Ｉｂは、遠心分離又はタンジェントろ過によってライセートの他の成分から分離され、洗浄される。Ｉｂ洗浄用の最終緩衝液はＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ８．０）でよい。Ｉｂ調製物は、さらに処理するまで－２０℃で保存するべきである。次に、Ｉｂを１０ｍＭリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳを含む、ｐＨ８．０の緩衝液に懸濁し、１時間撹拌する。次に、塩化第二銅の酸化溶液を加えて最終濃度を１００μＭにし、攪拌をさらに２時間続ける。この後、１００μＭの最終濃度に達するようにＥＤＴＡを追加するべきである。混合物は、下流の処理で使用されるまで２～８℃で保管するべきである。
ｃ）第１のクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩ ８０μｍ Ｂｉｏ－Ｒａｄ）カラムを使用して実行される。アルデスロイキン調製物をロードし、１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．３％ＳＤＳ、ｐＨ６．５の溶液で洗浄し、２５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３％、ｐＨ６．５の溶液で溶出する。
ｄ）第２のクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ Ｃ４カラムを使用して実行される。第１のクロマトグラフィーから回収されたアルデスロイキンを含む溶液を、アセトニトリルと混合する（９部のクロマトグラフィーＩプール溶出液及び１部のアセトニトリル）。ロード後、アセトニトリルの勾配を使用してアルデスロイキンを溶出する。アルデスロイキンを含む画分は、７３ｍＭリン酸ナトリウム、０．３％ＳＤＳを含む、ｐＨ７．４の溶液中に収集される。
ｅ）アルデスロイキン精製の最終ステップは、５ｋＤカセットを使用したダイアフィルトレーションである。アルデスロイキンは、ｐＨ７～８のリン酸緩衝液を使用して平衡化する。緩衝液には、このステップの前に得られた溶液のＩＬ－２の濃度に依存して、最大１％のＳＤＳと最大５０ｍｇ／ｍＬのマンニトールが含まれる場合がある。
驚くべきことに、本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ複合体は、実施例４及び６に記載されるように、それらは少なくとも１年間溶液中で安定であるため、ＥＰ １ ６８８ １４６ Ｂ１に記載されるように安定化のために凍結乾燥する必要がないことが見出された。
本明細書に開示される方法は、ＥＰ１ ６８８ １４６ Ｂ１によって教示される方法とは異なることに留意されたい。主な違いは次の通りである：
－ 封入体の溶解後、ＥＰ １ ６８８ １４６ Ｂ１の場合のように、ＩＬ－２を精製するための沈殿ステップは、本明細書に開示された方法では必要ない。
－ 本明細書に開示されるプロセスでは２つのクロマトグラフィーステップのみが使用されるが、ＥＰ１ ６８８ １４６ Ｂ１に開示されるプロセスは３つのクロマトグラフィーステップを含む。
－ ヒドロキシアパタイトは、最初のクロマトグラフィーステップとして本明細書で使用されるが、この固定相は、ＥＰ １ ６８８ １４６ Ｂ１で使用されることはない。
－ 本明細書のプロセスはＩＬ－２を沈殿させる必要がないため、高レベルのＳＤＳを使用してＩＬ－２を再可溶化する必要がない。このステップは、ＥＰ １ ６８８ １４６ Ｂ１によって教示されるＩＬ－２／ＳＤＳ微小凝集体の形成に重要であると考えられているため、この違いは特に重要である。
結論として、本開示の製造プロセスは、より少ないクロマトグラフィーステップで、下流でのＩＬ－２の沈殿及び再可溶化の必要なく、治療的に活性なＩＬ－２／ＳＤＳ微小凝集体を得る異なる方法を提供する。
実施例３及び４に示される動的光散乱アッセイによれば、本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体は、約８ｎｍにピークを持つ、４～１８ｎｍの間の拡張サイズ範囲を有する。再構成されたＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）も同様の分布曲線を示すが、この曲線の下の面積は、本開示の方法によって調製されたアルデスロイキン／ＳＤＳ粒子の曲線の下の面積よりも明らかに小さい。両方の場合に使用されるタンパク質の質量は同じであるため、この結果は、再構成時に、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）の一部が大きな凝集体のままである可能性があることを示唆している。事実、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）の全活性を測定するために、凍結乾燥製剤をＳＤＳ溶液に懸濁して凝集体の形成を避ける必要があることが報告されている（６）。
ＷＯ ２０１７０６８０３１ Ａ１は、患者への注射に適した、本質的に０．１から２０００万ＩＵ／ｍＬの濃度のインターロイキン－２からなる液体医薬組成物を記載しており、これを得ることができる。この組成物は、インターロイキン２の溶液中での安定性を維持するために、約０．０５から０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してもよいドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤を含む。したがって、任意の新規ＩＬ－２組成物の、微小凝集状態及び療法的活性を評価する必要がある。これに関して、実施例３及び４は、それぞれ、微小凝集状態及び安定性を示している。他方、実施例６は、本開示の方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の治療的価値を評価するためのアッセイを記載している。実施例６は、それらの膜においてＩＬ－２受容体を発現する細胞の使用を含む医学的処置における、これらの微小凝集体の療法活性の例示である。当技術分野ですでに知られているこれらの細胞の例は、ナチュラルキラー（ＮＫ）及びＴ細胞である。
治療学
ＩＬ－２を含む免疫療法が、特定の種類のがんに対する抗腫瘍免疫を増強するための効果的なアプローチであることは、よく確立されている。ＩＬ－２は、Ｔ細胞及びＢ細胞、単球、マクロファージ、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、並びにＮＫ細胞を含む多くの免疫細胞タイプへの刺激効果を有する（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ６：５９５－６０１，２００６）。耐久性のある治癒的抗腫瘍応答を提供する能力に基づいて、組換えヒトＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））の全身投与は、転移性黒色腫又は腎細胞がんを有する患者を処置するために承認されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２１０：４７４－４８４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４８４－４７５，１９８９；Ｆｙｆｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１３：６８８－６９６，１９９５；及びＡｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１７：２１０５－２１１６，１９９９）。残念ながら、この処置に関連するかなりの毒性は、腫瘍の部位での有効用量を達成することを困難にし、治療できる集団を制限している。例えば、許容用量でのＩＬ－２による全身処置は、実質的に全ての処置患者にリンパ系活性化を誘発するものの、これらの個人の少数で抗腫瘍応答が観察される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２１０：４７４－４８４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ４８４－４７５，１９８９）。結果として、高用量のＩＬ－２の使用は、経験豊富なスタッフによる専門的なプログラムに限定されており、一般に、応答性であり、優れた臓器機能を持つ患者に提供される（Ｔａｒｈｉｎｉ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，６：１２３４－１２３９，２００５）。ＩＬ－２を用いて表在性膀胱がん患者を局所処置（膀胱内）することによる、腫瘍の退縮と退行自由時間の延長が、多くの臨床研究で示されている（Ｄｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｒｏｌ，１５９：１１８３－１１８６，１９９８；及びＤｅｎ Ｏｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：９３１－９５０，２００８）。第２相試験において、シスプラチン不応性進行／転移性尿路上皮がん患者（その６５％が膀胱がんであった）にＩＬ－２を全身投与したところ、単剤又は併用サルベージ化学療法を使用して６～７ヶ月と観察された生存期間の中央値が１０ヶ月以上となったが、これはＩＬ－２療法に対する膀胱がんの感受性のさらなる証拠を示唆している（Ｋｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２１：２１－２６，２００３；及びＧａｌｌａｇｈｅｒ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，１１３：１２８４－１２９３，２００８）。しかしながら、これらの患者におけるＩＬ－２誘導毒性は重大であり、処置レジメンが制限された（Ｋｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ Ｏｎｃｏｌ，２１：２１－２６，２００３）。したがって、ＩＬ－２の治癒効果を高め、臨床的利益を損なうことなくその毒性を低減し、現在承認されている適応症を超えてその有用性を拡大する革新的な戦略が決定的に必要とされている。
したがって、本発明の治療方法（予防的処置を含む）は、一般に、治療有効量のＩＬ－２、例えば、配列番号１の、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）に対する投与を含む。「危険にさらされている」対象の決定は、対象又は医療提供者の診断試験又は意見（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義される）、家族歴など）による客観的又は主観的な決定により行うことができる。
特定の実施形態では、患者からの細胞は取得され、本明細書に具体化されたＩＬ－２組成物と共に培養され、増殖され、及び患者に再注入される。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、Ｔｒｅｇ集団の遺伝的又は物理的切除の壊滅的な結果によって証明されるように、免疫細胞の恒常性の維持に重要である。特に、Ｔｒｅｇ細胞は、他の免疫細胞に対してドミナントネガティブな調節を強制することによって免疫系の秩序を維持する。自然又はアダプティブ（誘導）Ｔｒｅｇに大まかに分類される；天然のＴｒｅｇはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞であり、胸腺から発生して移動し、免疫恒常性において重要な役割を果たす。アダプティブＴｒｅｇは非制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、胸腺の外側でＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒアルファ）発現を獲得し、典型的には、炎症並びに自己免疫及びがんなどの疾患プロセスによって誘導される。
ＴｒｅｇがＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＴＧＦベータなどの免疫抑制性可溶性因子の分泌、高親和性ＴＣＲやＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、細胞溶解活性など他の共刺激分子を介した細胞接触媒介性調節を含む、無数のメカニズムを通じて機能を発揮するという証拠が増えている。ＴＧＦベータの影響下で、アダプティブＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ前駆体から、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）を含む末梢部位で成熟し、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ／ＡＩＴＲを含むＴｒｅｇに典型的なマーカーの発現を獲得する。転写因子Ｆｏｘｐ３が上昇制御されると、Ｔｒｅｇ細胞はその抑制効果を開始する。これには、エフェクターＴ細胞の細胞周期停止又はアポトーシスを誘導する可能性のあるＩＬ－１０及びＴＧＦベータを含むサイトカインの分泌、及び樹状細胞の共刺激及び成熟の遮断が含まれる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象に投与されると、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）数を増加させる（すなわち、増殖）。例えば、本開示の本明細書に具体化されるＩＬ－２（例えば、配列番号１）を含む医薬組成物は、対象への投与後、投与前の対象の制御性Ｔ細胞数と比較して、対象における制御性Ｔ細胞数を増加させることができる。例えば、本開示のＩＬ－２分子を含む医薬組成物の対象への投与は、対象における制御性Ｔ細胞のレベルを、投与前の対象の制御性Ｔ細胞数と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍又は６０倍、増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、対象への投与後、ＩＬ－２（例えば、アルデスロイキン；配列番号１）の投与と比較して、対象における制御性Ｔ細胞数を増加させることができる。アルデスロイキンは、Ｎ末端アラニンが除去されている、ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）と比較してＣ１２５Ｓ置換を含むＩＬ－２変異体である。本開示の分子を含む医薬組成物を対象へ投与すると、等モル量のＩＬ－２（例えばアルデスロイキン）と比較して、対象における制御性Ｔ細胞のレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％又は５００％増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の分子は、対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）との比率を増加させることができる。ヒトにおいては、Ｔｒｅｇのレベルを増加させることにより慢性ＧＶＨＤの患者を処置するために、毎日の低用量ＩＬ－２療法が使用されてきた（Ｋｏｒｅｔｈ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１６ Ｊｕｌ．７；１２８（１）：１３０－７；及びＫｏｒｅｔｈ Ｊ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ Ｄｅｃ．１；３６５（２２）：２０５５－６６を参照されたい）。後者の試験では、ＩＬ－２（アルデスロイキン）を１２週間、毎日皮下注射して投与した。全体として、これらの試験の患者は、ベースライン（処置前のＴｒｅｇレベル）に対して５倍を超えるＴｒｅｇの増加、５倍を超えるＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比の増加、及び６１％の臨床応答率を達成した。臨床応答は、処置の第１週の終わりにＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比≧．０．２と強く関連しており、これはベースラインＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比のおよそ２．９倍の増加であった。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－２分子を含む医薬組成物の対象への投与は、Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比を少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４又は１．５に増加させることができる。Ｔｒｅｇ／Ｔｃｏｎｖ比は、本開示のＩＬ－２分子のいくつかの用量にわたって、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０用量にわたって、上記のレベルに維持され得る。
本開示のＩＬ－２分子はまた、制御性Ｔ細胞活性（例えば、免疫抑制活性）を増加させ得る。制御性Ｔ細胞機能は、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＣＤ３９を含むがこれらに限定されない１つ又は複数のバイオマーカーの発現を測定することによって決定することができる。Ｔｒｅｇ機能に必要なタンパク質であるＦＯＸＰ３のレベルは、高抑制性Ｔｒｅｇと相関している（Ｍｉｙａｒａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９ Ｊｕｎ．１９；３０（６）：８９９－９１１）。ＣＤ２５（ＩＬ２ＲＡタンパク質）のレベルは、Ｔｒｅｇの主要な免疫抑制メカニズムであるＩＬ－２消費の増加と関連している（Ｃｈｉｎｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１７（１１）：１３２２－１３３３）。
養子細胞療法。養子細胞療法（ＡＣＴ）（同種異系及び自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び組換え細胞（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ）療法を含む）は、多くの悪性疾患に選択される処置である（ＨＳＣＴ及び養子細胞療法アプローチのレビューについては、Ｒａｇｅｒ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ （２０１１） ２（６） ４０９－４２８；Ｒｏｄｄｉｅ ＆ Ｐｅｇｇｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１１） １１（４）：４７３－４８７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：（２０１５）１３６，１７５１－１７６８；及びＣｈａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ａｎｄ Ｘ．Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ，２０１３．２７（１）：５５－６２を参照されたい）。このような養子細胞療法には、同種及び自家造血幹細胞移植、ドナー白血球（又はリンパ球）注入（ＤＬＩ）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移入、又はＴ細胞もしくはＮＫ細胞（組換え細胞、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫを含む）の養子移入が含まれるが、これらに限定されない。放射線及び化学療法後にドナー由来細胞が造血を再構成する必要性を超えて、移植された細胞からの免疫学的再構成は、残存腫瘍細胞の排除に重要である。悪性腫瘍の治療オプションとしてのＡＣＴの有効性は、ドナー細胞の起源、組成及び表現型（リンパ球サブセット、活性化状態）、基礎疾患、移植前のコンディショニングレジメン、及び移植後免疫サポート（すなわち、ＩＬ－２療法）及び移植片内のドナー細胞によって媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果など、多くの要因の影響を受ける。さらに、これらの因子は、典型的にはコンディショニングレジメン及び／又は宿主内のドナー細胞の過剰な免疫活性（すなわち、移植片対宿主病、サイトカイン放出症候群など）から生じる、移植関連の死亡率とバランスをとらなければならない。
細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などは、例えば、腫瘍又はウイルス抗原に応答してエクスビボで増殖されると、治療上有効な量で対象に再注入される。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、そのような処置を必要とする哺乳動物、特にヒトに投与されたときの細胞の量が、関節リウマチ、がんなどの自己免疫疾患を処置するのに十分であることを意味する。
投与される細胞の正確な量は、年齢、体重、疾患の程度、及び対象の状態の個人差を考慮して、医師が決定することができる。
典型的には、Ｔ細胞療法の投与は、体重キログラムあたりの細胞数によって定義される。しかしながら、Ｔ細胞は移植後に複製及び増殖するため、投与される細胞用量は、最終的な定常状態の細胞数とは同じではないことになる。
一実施形態では、増殖した細胞を含む医薬組成物、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１０４から１０９細胞／ｋｇ体重の投与量で投与することができる。別の実施形態では、細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全ての整数値を含む、１０５から１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得る。
細胞を含む組成物は、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、当技術分野で公知の注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３１９：１６７６を参照されたい）。特定の対象のための最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、当業者によって容易に決定することができる。
特定の実施形態では、本明細書に具体化される組成物、例えば、免疫チェックポイントタンパク質又はその受容体に特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、及び抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体；ヒンジ領域；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞のいずれかの投与である。がん又はウイルス感染の処置のためのＴ細胞は、他の細胞ベースの治療法、例えば、幹細胞、抗原提示細胞などと組み合わせることができる。
養子ＮＫ細胞療法を利用するアプローチは非常に興味深いものとなった。自家ＨＳＣＴを受けている患者においては、血中ＮＫ細胞数は移植後、非常に早く回復し、ＮＫ細胞のレベルは良好な転帰と相関している（Ｒｕｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０，８９６－８９９）。自家ＮＫ細胞移植による治療戦略は、多くの要因により成功は限定的であるが、エクスビボで活性化された同種異系（又はハプロ同一）ＮＫ細胞の養子移植は、がんの有望な免疫療法戦略として浮上してきた（Ｇｕｉｌｌｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０２５－１０３６）。これらの細胞の活性は、自家ＮＫ細胞と比較して自己ＭＨＣ分子によって抑制される可能性が低い。腫瘍細胞に対するアロ反応性を利用したハプロタイプ一致ＮＫ細胞を用いた養子療法が安全であり、ＡＭＬ患者の有意な臨床活動を媒介できることが、多くの研究により示されている。これらの知見をさらに進めて、最近の研究では、ＮＫ細胞又はＮＫ前駆体（すなわち、幹細胞）のエクスビボでの活性化／増殖法、並びに移植前のコンディショニング及び移植後の免疫支持戦略の最適化；ＮＫ細胞株又は組換え腫瘍標的ＮＫ細胞の使用；治療用抗体、免疫調節剤（レナリドミド）、抗ＫＩＲ抗体及びチェックポイント抗体などの他の薬剤との併用療法の評価などに焦点が当てられている。
したがって、特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体でトランスフェクトされる。特定の実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、免疫チェックポイントタンパク質又はその受容体に特異的に結合する抗原結合分子、例えばｓｃＦｖ、及び抗原結合ドメイン；ヒンジ領域；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む。本明細書に示されるように、ＣＡＲ－ＮＫ細胞のエクスビボでのインキュベーションは、例えば、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト活性化され得る。
ＮＫ細胞は、インターロイキンγ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、及びＩＬ－８などのサイトカインの分泌を介してそれらの機能の一部を媒介する。ＮＫ細胞の細胞傷害性活性は、腫瘍細胞に対する効果的な細胞傷害性能力を維持しつつ、細胞傷害性活性の微調整制御を可能にし、健康な細胞に対する細胞傷害性を防止する、活性化受容体と阻害受容体のバランスによって調節される。実際、養子ＮＫ細胞転移の安全性と臨床的抗がん効果が複数の研究で実証されており、ＮＫ細胞の効果的ながん免疫療法としての可能性が強調されている（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７，６２８７－６２９７ （２０１１）；Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，２０９７－２１００，（２００２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０５，３０５１－３０５７，（２００５；Ｂａｃｈａｎｏｖａ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２３，３８５５－３８６３，（２０１４）；Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２８，９５５－９５９，（２０１０））。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１などを含むサイトカインは、サイトカインを産生するようＮＫ細胞を誘導することができる。ＩＦＮ－α及びＩＬ－２は、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性の強力な誘導因子である（Ｇ．Ｔｒｉｎｉｃｈｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６０：１１４７－１１６９，１９８４；Ｇ．Ｔｒｉｎｉｃｈｉｅｒｉ ａｎｄ Ｄ．Ｓａｎｔｏｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４７：１３１４－１３３３，１９７７）。ＩＬ－２が存在するとＮＫ細胞を刺激及び増殖する（Ｋ．Ｏｓｈｉｍｉ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ６３：２７９－２９０，１９９６）。ＩＬ－１２はＴ細胞及びＮＫ細胞からのサイトカイン産生を誘導し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害を増強することが示されている（Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７０：８２７－８４６，１９８９）。
ＮＫ細胞は、末梢血及び臍帯血（ＣＢ）を含む複数の供給源から増殖されている（Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ＩＬ－２１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ３０２６４，（２０１２）；Ｋｎｏｒｒ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｃａｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２，２７４－２８３，（２０１３）；Ｓｈａｈ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｙｉｅｌｄｓ ｌｏｇ－ｓｃａｌｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ｍｙｅｌｏｍａ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ７６７８１，（２０１３）；Ｗｏｌｌ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ａ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ １１３，６０９４－６１０１，（２００９））。フィーダー細胞として人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と組み合わせたサイトカインを使用したエクスビボでのＮＫ細胞増殖法が開発された（Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ３０２６４，（２０１２）；Ｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １１，３４１－３５５，（２００９）；Ｇｏｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ７６，４６７－４７５，（２０１０）；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３４，１８７－１９５，（２０１１））。
養子免疫療法では、患者の循環リンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球がインビトロで単離され、ＩＬ－２などのリンホカインによって活性化されるか、腫瘍壊死の遺伝子が形質導入され、再投与される。これを達成するために、本明細書に記載のアジュバントを組み込んだ抗原性ペプチド組成物と組み合わせて、免疫学的に有効な量の活性化リンパ球を動物又はヒトの患者に投与する。活性化されたリンパ球は、血液又は腫瘍サンプルから以前に単離され、インビトロで活性化（又は「増殖」）された患者自身の細胞が最も好ましいであろう。この形態の免疫療法では、黒色腫及び腎がんの退行のいくつかの例があるが、応答者の割合は、応答しなかったものと比較して少なかった。より最近では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と呼ばれるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を組み込んだ養子免疫細胞療法が、より高い応答率が観察された。同様に、腫瘍細胞の結合及び死滅を促進するために、自家及び同種異系の両方のナチュラルキラー細胞が単離され、増殖され、遺伝子改変されて、受容体又はリガンドを発現させる。
本発明の組成物は、当該技術分野で公知の方法で調製することができ、哺乳動物、特にヒトへの非経口投与に適したものであり、単独で治療有効量の組成物と、１つ又は複数の医薬的に許容される担体又は希釈剤を含む。
本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」という用語は、任意の適切な担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。これらには、組成物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする、抗酸化剤、緩衝液、溶質を含み得る全ての水性及び非水性の等張性滅菌注射液；懸濁剤及び増粘剤、分散媒体、抗真菌剤及び抗細菌剤、等張剤及び吸収剤などを含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。本発明の組成物はまた、他の補充の生理学的に活性な薬剤を含み得ることが理解されよう。
担体は、組成物の他の成分と適合性があり、対象に有害ではないという意味で、医薬的に「許容される」ものでなければならない。組成物には、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内投与を含む非経口投与に適したものが含まれる。組成物は、便宜的には単位投与形態で提供することができ、薬剤の分野で周知の任意の方法によって調製することができる。そのような方法は、細胞との会合のための担体を調製することを含む。一般に、組成物は、任意の有効成分を液体担体と均一かつ密接に会合させることによって調製される。
一実施形態では、組成物は非経口投与に適している。別の実施形態では、組成物は静脈内投与に適している。非経口投与に適した組成物は、組成物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする、抗酸化剤、緩衝液、殺菌剤、及び溶質を含み得る水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。
自己免疫疾患の処置
本開示の方法は、例えば、そのような疾患又は状態を処置するために、様々な自己免疫又は免疫関連の疾患又は状態に適用することができる。自己免疫疾患は、心臓、腎臓、肝臓、肺、生殖器、消化器系、又は皮膚などの臓器に影響を与える疾患を含む。自己免疫疾患には、内分泌腺、副腎腺、甲状腺、唾液腺、外分泌腺などの腺、および膵臓に影響を与える疾患が含まれる。自己免疫疾患もまた、多腺性である可能性がある。自己免疫疾患は、結合組織、筋肉、又は血液などの１つ又は複数の組織を標的にすることができる。自己免疫疾患は、神経系又は目、耳、又は血管系を標的にする可能性がある。自己免疫疾患は全身性である可能性もあり、複数の臓器、組織、及び／又はシステムに影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患又は状態は、炎症性疾患又は状態である。
自己免疫性又は免疫関連の疾患又は状態の非限定的な例としては、炎症、抗リン脂質症候群、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫性血管炎、セリアック病、自己免疫性甲状腺炎、輸血後免疫、母体－胎児不適合、輸血反応、ＩｇＡ欠損症などの免疫学的欠損症、一般的な可変免疫不全症、薬物誘発性狼瘡、真性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、若年発症糖尿病、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、免疫不全、アレルギー、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、慢性皮膚疾患、筋萎縮性側索硬化症、化学療法誘発性傷害、移植片対宿主疾患、骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、アトピー性湿疹、天疱瘡、ベーチェット病、慢性疲労症候群線維筋痛、化学療法誘発性傷害、重症筋無力症、糸球体腎炎、アレルギー性網膜炎、全身性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、チルブレンループスエリテマトーデスを含む皮膚ループスエリテマトーデス、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、自己免疫性血管炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性心臓炎、自己免疫性脳炎、自己免疫介在性血液疾患、ｌｃ－ＳＳｃ（限定的皮膚型強皮症）、ｄｃ－ＳＳｃ（びまん性皮膚型強皮症）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、グレイブ病（ＧＤ）、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、アンキロス性脊椎炎、移植拒絶反応、免疫老化、リウマチ性／自己免疫性疾患、混合結合組織疾患、脊椎関節症、乾癬、乾癬性関節炎、筋炎、強皮症、皮膚筋炎、自己免疫性血管炎、混合結合組織疾患、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、ヒトアジュバント病、骨関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、特発性炎症性ミオパチー、全身血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、免疫介在性腎疾患、中枢又は末梢神経系の脱髄性疾患、特発性脱髄性多発神経障害、ギラン－バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、感染性又は自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆道肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン感受性腸症、ホイップル病、自己免疫又は免疫介在性皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、肺の免疫疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、移植関連疾患、移植片拒絶又は移植片対宿主疾患、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、毒性表皮壊死症、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患に伴う応答、潰瘍性大腸炎、呼吸困難症候群、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅延型過敏症に伴う免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（ＡＮＣＡを含む）、再生不良性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、純赤血球形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎球減少症、白血球減少症、白血球遊出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患、多臓器損傷症候群、重力筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート－イートン筋無力症候群、レイノー症候群、スティーブンス－ジョンソン症候群、水疱性天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害又はＩｇＭ媒介性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性〔throbocytopenic〕紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アディソン病、自己免疫性多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、大血管炎（多発性筋痛リウマチ及び巨大細胞（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病及び結節性多動脈炎を含む）、アンキロス性脊椎炎、バーガー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆道肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、低温グロブリン血症、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などが挙げられる。
がんの処置法
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子、例えば、配列番号１、を含む治療有効量の医薬組成物を、対象に投与することを含む、それを必要とする対象における増殖性疾患又は状態を処置する方法が、本明細書に記載される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－２分子、例えば、配列番号１は、ＩＬ－２受容体と相互作用して、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋エフェクターナイーブ及びメモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞の増殖を刺激及び／又は増強する。付加的な場合では、Ｔｅｆｆ細胞の増殖は、腫瘍細胞又は病原体、例えば、ウイルスに感染した細胞を標的とするＴｅｆｆ集団に向かってＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比を歪める。
いくつかの実施形態では、増殖性の疾患又は状態はがんである。いくつかの場合では、がんは固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍には、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、固形腫瘍は転移性がんである。いくつかの場合では、固形腫瘍は再発又は難治性のがんである。いくつかの場合では、固形腫瘍は、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん、又はＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）欠損を有する転移性去勢抵抗性前立腺がんである。
いくつかの実施形態では、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、転移性がんの処置のために、対象に投与される。いくつかの例では、転移性がんは、転移性膀胱がん、転移性骨がん、転移性脳がん、転移性乳がん、転移性結腸直腸がん、転移性食道がん、転移性眼がん、転移性頭頸部がん、転移性腎臓がん、転移性肺がん、転移性黒色腫、転移性卵巣がん、転移性膵臓がん、又は転移性前立腺がんを含む。いくつかの場合では、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、転移性膀胱がん、転移性骨がん、転移性脳がん、転移性乳がん、転移性結腸直腸がん、転移性食道がん、転移性眼がん、転移性頭頸部がん、転移性腎臓がん、転移性肺がん、転移性黒色腫、転移性卵巣がん、転移性膵臓がん、又は転移性前立腺がんの処置のために、対象に投与される。いくつかの場合では、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、去勢抵抗性前立腺がん、転移性去勢抵抗性前立腺がん、又はＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）欠陥を有する転移性去勢抵抗性前立腺がんの処置のために、対象に投与される。
いくつかの例では、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、再発又は難治性のがんの処置のために対象に投与される。いくつかの例では、再発又は難治性のがんは、再発又は難治性の膀胱がん、再発又は難治性の骨がん、再発又は難治性の脳がん、再発又は難治性の乳がん、再発又は難治性の結腸直腸がん、再発又は難治性の食道がん、再発又は難治性眼がん、再発又は難治性の頭頸部がん、再発又は難治性の腎臓がん、再発又は難治性の肺がん、再発又は難治性の黒色腫、再発又は難治性の卵巣がん、再発又は難治性の膵臓がん、又は再発又は難治性の前立腺がんを含む。いくつかの場合では、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、再発又は難治性膀胱がん、再発性又は難治性骨がん、再発性又は難治性脳がん、再発性又は難治性乳がん、再発又は難治性結腸直腸がん、再発又は難治性食道がん、再発又は難治性眼がん、再発又は難治性頭頸部がん、再発又は難治性腎がん、再発又は難治性肺がん、再発又は難治性黒色腫、再発又は難治性卵巣がん、再発又は難治性の膵臓がん、又は再発又は難治性の前立腺がんの処置のために、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、がんは、処置未経験のがんである。このような場合、処置未経験のがんは、治療によって処置されていない、がんである。いくつかの場合では、処置未経験のがんは、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、又は前立腺がんなどの固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるのは、それを必要とする対象における処置未経験の固形腫瘍を処置する方法であり、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍である。いくつかの例では、血液悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫が含まれる。いくつかの場合では、血液悪性腫瘍はＴ細胞悪性腫瘍である。他の場合では、血液悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍である。例示的な血液悪性腫瘍には、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ウォルデンストロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子治療
８０以上の原発性免疫不全症が世界保健機関によって認識されている。これらの疾患は、免疫系に内在する欠陥により特徴付けられ、いくつかの場合では、体が感染に対する十分な、又は効果的な抗体を産生することができない。他の場合では、感染と戦うための細胞防御が、適切に機能することができない。典型的には、原発性免疫不全症は遺伝性障害である。アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ）－重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ファンコーニ貧血（ＦＡ）などの遺伝性免疫不全症の患者は遺伝子治療の恩恵を受けることができるが、これは、罹患した患者に機能的遺伝子を提供して、欠陥している遺伝子を補うものである。
二次的又は後天的な免疫不全は、遺伝性の遺伝子異常の結果ではなく、免疫系外の要因によって免疫系が損なわれている個体で発生する。例としては、外傷、ウイルス、化学療法、毒素、及び汚染などがある。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる二次免疫不全障害の例であり、Ｔリンパ球の枯渇により体が感染と戦うことができなくなる。二次免疫不全の患者もまた、遺伝子治療の恩恵を受けることができる。
組成物は、原発性免疫不全症（ＰＩＤＤＳ）に関連する１つ又は複数の遺伝子治療と組み合わせて使用することができる。これらには、例えば、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、ＡＰＳ－１（ＡＰＥＣＥＤ）、ＣＡＲＤ９、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、先天性好中球減少症候群、一般的可変免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ＣＴＬＡ４欠損症、ＤＯＣＫ８欠損症、免疫不全を伴うグリコシル化異常症、高免疫グロブリンＥ症候群（ＨＩＥＳ）、ＰＩ３キナーゼ病、ＰＬＡＩＤ、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ＳＴＡＴ３優性陰性疾患、ＷＨＩＭ症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、ディジョージ症候群、運動失調－毛細血管拡張症、慢性肉芽腫症、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、補体欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症が含まれる。
Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ－Ｘ１）は、共通のガンマ鎖遺伝子（γＣ）の変異によって引き起こされる細胞性及び体液性の免疫枯渇であり、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球の欠如と非機能性Ｂリンパ球の存在をもたらす。ＳＣＩＤ－Ｘ１は、骨髄移植（ＢＭＴ）や遺伝子治療などで免疫系が再構成されない限り、生後２年間で致死的状態となる。例えば、治療用タンパク質をコードする発現ベクターによる治療用遺伝子の投与は、ＩＬ－２、例えば、配列番号１及び／もしくは２をコードするベクター、又は本明細書に具体化される医薬組成物と組み合わせることができる。重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連する免疫不全を処置するための治療遺伝子及び／又は遺伝子産物の特定の例には、γＣ、ＪＡＫ３、ＩＬ７ＲＡ、ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＰＲＫＤＣ、ＬＩＧ４、ＮＨＥＪ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｇ、ＰＴＰＲＣ、ＺＡＰ７０、ＬＣＫ、ＡＫ２、ＡＤＡ、ＰＮＰ、ＷＨＮ、ＣＨＤ７、ＯＲＡＩ１、ＳＴＩＭ１、ＣＯＲＯ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＳ、ＲＦＸＡＰ、ＲＭＲＰ、ＤＫＣ１、ＴＥＲＴ、ＴＩＮＦ２、ＤＣＬＲＥ１Ｂ、及びＳＬＣ４６Ａ１；ＦａｎｃＡ、ＦａｎｃＢ、ＦａｎｃＣ、ＦａｎｃＤ１（ＢＲＣＡ２）、ＦａｎｃＤ２、ＦａｎｃＥ、ＦａｎｃＦ、ＦａｎｃＧ、ＦａｎｃＩ、ＦａｎｃＪ（ＢＲＩＰ１）、ＦａｎｃＬ、ＦａｎｃＭ、ＦａｎｃＮ（ＰＡＬＢ２）、ＦａｎｃＯ（ＲＡＤ５１Ｃ）、ＦａｎｃＰ（ＳＬＸ４）、ＦａｎｃＱ（ＥＲＣＣ４）、ＦａｎｃＲ（ＲＡＤ５１）、ＦａｎｃＳ（ＢＲＣＡ１）、ＦａｎｃＴ（ＵＢＥ２Ｔ）、ＦａｎｃＵ（ＸＲＣＣ２）、ＦａｎｃＶ（ＭＡＤ２Ｌ２）、及びＦａｎｃＷ（ＲＦＷＤ３）を含むＦＡＮＣファミリー遺伝子；可溶性ＣＤ４０；ＣＴＬＡ；Ｆａｓ Ｌ；ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２に対する抗体；ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６に対する抗体；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＴＣＲに対する抗体；ＩＬ４；ＩＬ１０；ＩＬ１２；ＩＬ１３；ＩＬ１Ｒａ、ｓＩＬ１ＲＩ、ｓＩＬ１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；ｓＴＮＦＲＩＩ；ＴＮＦに対する抗体；Ｐ５３、ＰＴＰＮ２２、及びＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２；グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；及び／又はＣ９ＯＲＦ７２が含まれる。
ほとんどの個体はＢＭＴ又は非自家遺伝子治療に対応ドナーを欠いているため、成熟Ｔ細胞が枯渇したハプロタイプ一致の親の骨髄がしばしば使用される；しかしながら、合併症として、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、適切な抗体が作成できず、長期の免疫グロブリン交換が必要となること、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生着の失敗によるＴ細胞の遅延的な喪失、慢性疣贅、及びリンパ球調節不全が含まれる。
ファンコーニ貧血（ＦＡ）は、骨髄不全を引き起こす遺伝性の血液障害である。それは、部分的に、不十分なＤＮＡ修復メカニズムによって特徴付けられる。少なくとも２０％のＦＡ患者は、急性骨髄性白血病などのがん、及び皮膚、肝臓、胃腸管、及び婦人科系のがんを発症する。皮膚腫瘍と消化管腫瘍は、普通は扁平上皮がんである。がんを発症する患者の平均年齢は、白血病で１５歳、肝腫瘍で１６歳、その他の腫瘍で２３歳である。
ＦＡ患者の細胞は、マイトマイシンＣやジエポキシブタンなどの鎖間ＤＮＡ架橋を生成する薬剤に対して特徴的な過敏症を示す。ＦＡ遺伝子は、ＤＮＡ架橋に対する細胞応答に関与する多成分経路を定義する。５つのＦＡ遺伝子（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、及びＦＡＮＣＧ）がクローン化され、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、及びＦＡＮＣＧタンパク質は、主に核局在化を伴う分子複合体を形成することが示されている。重症度の異なるＦＡと相関するＦＡＮＣＣ遺伝子の多くの変異が同定されている。
免疫及び血液障害におけるＢＭＴ及び非自家遺伝子治療への代替的な治療アプローチは、エクスビボでのＨＳＰＣ遺伝子治療であり、患者から血液又は骨髄由来のＨＳＰＣが濃縮され、ウイルスベクターで形質導入されて機能的な治療遺伝子を送達し（例えば、ＳＣＩＤ－Ｘ１のγＣ遺伝子又はＦＡのＦａｎｃＡ遺伝子）、患者に移植される。ＳＣＩＤ－Ｘ１の第１世代エクスビボでの遺伝子治療は、マウス白血病ウイルスベースのガンマレトロウイルス（ＲＶ）送達を使用し、処置を受けた患者で有意な長期臨床的改善を示した。しかしながら、５／２０人の患者が予期せずＴ細胞白血病を発症し、１人の患者が死亡した。これらの発見は、代替的なベクタープラットフォームとしての自己不活化（ＳＩＮ）ウイルスベクター及びＳＩＮ－レンチウイルスベクター（ＬＶ）の利用への強い関心を引き起こした。ＳＩＮ－ＲＶ及びＳＩＮ－ＬＶは、臨床現場でかなりの成功を収めて、現在、使用されているが、エクスビボでの遺伝子治療は、以下のような複数の課題に直面している：
１）ＨＳＰＣを治療に使用するための準備のために大規模なエクスビボでの操作が必要であり、移植後に多能性を失ったり、生着適性が低下したりすること、２）遺伝子改変ＨＳＰＣの生着を増強するために使用される様々な条件付けレジメンは、患者にかなりの遺伝毒性のリスクをもたらすこと、３）ＨＳＰＣの収集、培養、形質導入、検証、再注入のために高度な設備が必要となり、その結果、この処置形態は世界的に少数の施設を選択することに制限されること。
したがって、組成物及び使用方法は、本明細書に具体化される医薬組成物を対象に投与すること、及び／又はＩＬ－２、例えば配列番号１及び／又は２、をコードするベクターの投与を含む。特定の実施形態では、ＩＬ－２治療は、１つ又は複数の遺伝子治療、例えば、その特定のタンパク質の発現が疾患の原因である場合の治療薬又は野生型タンパク質の発現、と組み合わせて実行される。この方法は、ケモカイン、Ｇ－ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＡＭＤ３１００及びＳＣＦなどの動員因子の投与をさらに含む。Ｇ－ＣＳＦはサイトカインであり、ＨＳＰＣ動員におけるその機能には、顆粒球増殖の促進、プロテアーゼ依存性及び非依存性両方の接着分子の減衰、及びＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４軸の破壊が含まれ得る。当業者に公知の任意の市販形態のＧ－ＣＳＦを、本明細書に開示される方法及び製剤において使用することができ、例えば、Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）及びＰＥＧ化Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標）、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）である。
ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ）クラスの合成有機分子であるＡＭＤ３１００（ＭＯＺＯＢＩＬ（商標）、ＰＬＥＲＩＸＡＦＯＲ（商標）；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、パリ、フランス）は、ケモカイン受容体拮抗薬であり、ＣＸＣＲ４へのＳＤＦ－１結合を可逆的に阻害し、ＨＳＰＣ動員を促進する。ＡＭＤ３１００は、骨髄腫及びリンパ腫の患者におけるＨＳＰＣ動員のためにＧ－ＣＳＦと組み合わせて使用することが承認されている。
遺伝子治療は免疫療法にも利用できる。したがって、特定の実施形態では、免疫療法を必要とする対象を処置する方法は、対象に：（ｉ）配列番号１をコードする発現ベクター；及び／又は（ｉｉ）配列番号１をコードする発現ベクターを含む細胞を投与することを含む。免疫療法処置を必要とするそのような対象には、がん、免疫不全、免疫抑制、ウイルス感染又はそれらの組み合わせに罹患している対象が含まれる。特定の実施形態では、この方法は、ＩＬ－２、例えば、配列番号１、配列番号２又はそれらの組み合わせの投与を含むことができる。
特定の実施形態では、ＩＬ－２の発現は、他のサイトカイン、タンパク質などの発現と組み合わせることができる。例えば、Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＨＳＶ－ＴＫ／ＩＬ－２ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２，８３５－８４８ （２００５）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｊ．ｃｇｔ．７７００８５１．Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｓｏｂｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １ １９９９ （５） （９） ２３５９－２３６５．Ｐｈｉｌｉｐ Ａ．Ｄｕｒｏｓｔ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍａｒ ２０１８．３５２－３６５．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１７．０７２．Ｋｅｖｉｎ Ｓ．Ｇｏｕｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＩＬ－２ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍａｒｃｈ １５，２０１１，１８６ （６） ３７７９－３７８６；ＤＯＩ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１００１４２２．Ｍａｈｚａｄ Ａｋｂａｒｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｂ ｃｈａｉｎ ９－２３ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．７，２８９ｒａ８１ （２０１５）．ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａａ３０３２を参照されたい。
ＩＬ－２を発現するベクター、例えば、配列番号１、２又はそれらの組み合わせで形質転換することができる任意のタイプの細胞。例として、自家細胞、同種異系細胞、ハプロタイプ一致細胞、ハプロタイプ不一致細胞、ハプロ同一細胞、異種細胞、細胞株又はそれらの組み合わせが含まれる。細胞の種類としては、例えば、幹細胞、臍帯血細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、人工多能性幹細胞、自家幹細胞、骨髄細胞、造血細胞、造血幹細胞、体細胞、生殖系列細胞、分化細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞又はそれらの組み合わせが含まれる。
患者へのウイルスベクターの直接送達を含むインビボでの遺伝子治療を使用する処置は、遺伝毒性条件付けを必要とせず（又は遺伝毒性条件付けが少なくてもよく）、エクスビボでの細胞処理も必要としないものとすることができるため、単純で魅力的なアプローチとなっており、ワクチンの送達のために世界中ですでに行われているのと同様に、治療は注射によって投与できるため、開発途上国を含む世界中の多くの施設で採用されている。
フォーミー（Ｆｏａｍｙ）ウイルス（ＦＶ）ベクターは、非病原性の統合レトロウイルスであり、ＨＳＰＣ遺伝子治療に非常に効果的であり、ＳＩＮ－ＲＶ及びＬＶよりも安全である可能性がある。例えば、フォーミーベクタープロウイルスは、ＬＶベクターよりも遺伝子に組み込まれる頻度が低く、ＬＶ又はＲＶベクターよりも近くの遺伝子をトランス活性化する傾向が低くなっている。これらの特性は、イヌモデル及びマウス異種移植モデルで確立されたように、安全性に寄与するようである。ＶＳＶ－Ｇ偽型ＬＶベクターとは異なり、ＦＶベクターはヒト血清不活化に対して耐性があり、これはインビボでの送達中に特定の利点があり、複数の投与量が必要な場合は、同じＦＶベクターの複数回注入が可能になる。
他のベクターには、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。これらのベクターは、インビボでのヒトへの遺伝子送達に最適な安全性と有効性のプロファイルを持っていると考えられている。したがって、ＡＡＶベクターはインビボでの遺伝子治療に広く使用されており、前臨床モデルや臨床試験で安全かつ効果的であることが示されている。ＡＡＶベクターは、血友病Ｂ、嚢胞性線維症、アルファ１アンチトリプシン欠乏症、パーキンソン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびレーバー先天性黒内障の第ＨＩ相試験で成功を収めている（Ｓｅｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１４，１０７２－１０８２）。アリポジーン・チパルボベック〔Alipogene tiparvovec〕（ＧＬＹＢＥＲＡ（商標）、ｕｎｉＱｕｒｅ）は、リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）の処置のための遺伝子治療として、ヨーロッパでの販売承認を取得している。
細胞の単離方法
当該技術分野で公知の任意の数の方法を使用して、対象の処置の実行において使用することができるＴ細胞などの細胞又は任意の他の細胞タイプを単離することができる。したがって、キメラ抗原受容体、例えば、ＣＡＲを発現する他の様々な遺伝子操作細胞もまた提供される。細胞は一般に、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、又はリンパ器官に由来し、自然免疫又は獲得免疫の細胞などの免疫系の細胞、例えば、リンパ球を含む骨髄性又はリンパ性細胞、典型的にはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞である。他の例示的な細胞には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、多分化能〔multipotent〕及び多能性幹細胞などの幹細胞が含まれる。細胞は典型的には、対象から直接単離されたもの、及び／又は対象から単離され凍結されたものなどの一次細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型の１つ又は複数のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化、増殖、再循環、局在化、及び／又は持続能力の可能性、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化の程度によって定義されるものなどを含む。処置される対象に関して、細胞は同種異系及び／又は自己由来であり得る。方法の中には、既製の方法が含まれる。既製の技術などのいくつかの態様では、細胞は、多能性及び／又は多分化能、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞などである。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離し、それらを調製、処理、培養、及び／又は操作し、凍結保存の前又は後に、それらを同じ患者に再導入することを含む。
Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞及びそのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭＸセントラルメモリーＴ（ＴＣＭエフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ））、又は最終分化したエフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連不変Ｔ（ＭＡＩＴ）細胞、天然及びアダプティブ調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ（αβＴ）細胞、及びデルタ／ガンマＴ（γδＴ）細胞がある。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－、ＦＯＸＰ３＋及び／又はヘリオス＋／－である。他の実施形態では、Ｔ細胞は哺乳動物の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－、及び／又はＦＯＸＰ３＋である。
いくつかの実施形態では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、単球又は顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、及び／又は好塩基球である。
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子工学を介して導入された１つ又は複数の核酸を含み、それにより、そのような核酸の組換え又は遺伝子操作された産物を発現する。いくつかの実施形態では、核酸は異種、すなわち、別の生物又は細胞から得られたものなど、通常、細胞に存在しないか又は細胞から得られたものではないサンプルであり、例えば、操作される細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物には通常見られないものである。いくつかの実施形態では、自然界には見られない核酸など、核酸は天然には存在せず、複数の異なる細胞型からの様々なドメインをコードする核酸のキメラの組み合わせを含むものを含む。
いくつかの実施形態では、操作された細胞の調製は、１つ又は複数の培養及び／又は調製ステップを含む。ＣＡＲを導入するための細胞は、生物学的サンプル、例えば、対象から得られた、又は対象に由来するものなどのサンプルから単離することができる。いくつかの実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患又は状態を有するか、細胞療法を必要とするか、又は細胞療法が投与される対象である。いくつかの実施形態での対象は、細胞が単離、処理、及び／又は操作されている養子細胞療法などの特定の治療的介入が必要であるヒトである。
したがって、いくつかの実施形態における細胞は、一次細胞、例えば、初代ヒト細胞である。サンプルには、対象から直接採取した組織、体液、及びその他のサンプル、並びに分離、遠心分離、遺伝子工学（例えば、ウイルスベクターによる形質導入など）、洗浄、及び／又はインキュベーションなどの１つ又は複数の処理ステップから得られたサンプルが含まれる。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られたサンプルであるか、又は処理されたサンプルであり得る。生物学的サンプルには、それらから由来する処理されたサンプルを含めて、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗などの体液、組織及び臓器のサンプルが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、細胞から由来される又は単離されるサンプルは、血液又は血液由来のサンプルであるか、又はアフェレーシス又は白血球アフェレーシス産物であるか、又はそれらに由来する。例示的なサンプルには、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、又は他の器官、及び／又はそれらに由来する細胞が含まれる。サンプルには、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈において、自家及び同種異系の供給源からのサンプルが含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株、例えば、Ｔ細胞株に由来する。いくつかの実施形態における細胞は、異種源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、又はブタから得られる。
いくつかの実施形態では、細胞の単離は、１つ又は複数の調製及び／又は非親和性に基づく細胞分離ステップを含む。いくつかの例では、細胞は、洗浄、遠心分離、及び／又は１つ又は複数の試薬の存在下でインキュベートされ、例えば、不要な成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解又は除去する。いくつかの例では、細胞は、密度、付着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性及び／又は抵抗性など、１つ又は複数の特性に基づいて分離される。
いくつかの例では、対象の循環血液からの細胞は、例えば、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスによって得られる。いくつかの態様では、サンプルは、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び／又は血小板を含むリンパ球を含み、並びにいくつかの態様では、赤血球及び血小板以外の細胞を含む。
いくつかの実施形態では、対象から収集された血球は、例えば、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために、細胞を適切な緩衝液又は培地に入れるために洗浄される。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウム及び／又はマグネシウム及び／又は多くのもしくは全ての二価カチオンを欠如している。いくつかの態様では、洗浄ステップは、製造業者の取扱説明書に従って、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）によって達成される。いくつかの態様では、洗浄ステップは、製造業者の取扱説明書に従って、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって達成される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えばＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリーＰＢＳなど、洗浄後に様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、血液細胞サンプルの成分が除去され、細胞は、培養培地に直接再懸濁される。
いくつかの実施形態では、本方法は、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、及びパーコール又はフィコール勾配による遠心分離などの密度ベースの細胞分離方法を含む。
いくつかの実施形態では、単離方法は、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、又は核酸などの１つ又は複数の特定の分子の細胞内での発現又は存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態では、そのようなマーカーに基づいた分離のための任意の公知の方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、分離は、親和性又は免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの態様における単離は、１つ又は複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現又は発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離を含み、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーションによる分離を含み、その後、一般には、洗浄ステップによる分離及び抗体又は結合パートナーに結合した細胞を、抗体又は結合パートナーに結合していない細胞から分離することによる分離を含む。
そのような分離ステップは、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択、及び／又は抗体又は結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分が、さらなる使用のために保持される。いくつかの態様では、ネガティブ選択は、異種集団における細胞型を特異的に同定する抗体が利用できず、その結果、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離を行うことが最善である場合に特に有用であり得る。
分離は、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞を１００％濃縮又は除去する必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定のタイプの細胞をポジティブ選択すること又は濃縮することは、そのような細胞の数又はパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞が完全に無くなる必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞など、特定のタイプの細胞のネガティブ選択、除去、又は枯渇は、そのような細胞の数又はパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞全てを完全に除去する必要はない。
いくつかの例では、分離ステップの複数ラウンドが行われ、あるステップからポジティブ又はネガティブに選択された画分が、続けてポジティブ又はネガティブ選択などの別の分離ステップにかけられる。いくつかの例では、それぞれがネガティブ選択の標的となるマーカーに特異的である複数の抗体又は結合パートナーと細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を、単一分離ステップで枯渇させることができる。同様に、様々な細胞タイプで発現される複数の抗体又は結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞タイプを同時にポジティブに選択することができる。Ｔ細胞は、ポジティブ又はネガティブ選択技術によって単離される。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用してポジティブに選択できる。
いくつかの実施形態では、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団の濃縮、又はネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの実施形態では、ポジティブ又はネガティブ選択は、それぞれ、ポジティブ又はネガティブに選択された細胞上に発現されるか、又は比較的高いレベル（マーカーｈｌｇｈ）で発現される（マーカー「１」）１つ又は複数の表面マーカーに特異的に結合する１つ又は複数の抗体又は他の結合剤と共に細胞をインキュベートすることによって達成される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｂ細胞、単球、又は他の白血球などの非Ｔ細胞上に発現される、ＣＤ１４などのマーカーのネガティブ選択によってＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択ステップは、ＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団は、１つ又は複数のナイーブ、メモリー、及び／又はエフェクターＴ細胞亜集団で発現又は比較的高度に発現されるマーカーのポジティブ又はネガティブ選択によって、亜集団にさらに分類できる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ又はネガティブ選択などによって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、及び／又はセントラルメモリー幹細胞についてさらに濃縮するか又は枯渇させる。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、投与後の長期生存、増殖、及び／又は生着を改善するなど、効力を高めるために行われ、これは、いくつかの態様では、そのような亜集団において特に頑強である。Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９－７０１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣＭ濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることで、さらに効力が増強される。
いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１２７のポジティブ又は高い表面発現に基づく；いくつかの態様では、それは、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現又は高度に発現する細胞のネガティブ選択に基づいている。
いくつかの態様では、ＣＤ４発現に基づく選択ステップは、ＣＤ４＋細胞集団又は亜集団を生成するために使用され、ＣＤ４に基づく分離からのポジティブ及びネガティブ画分の両方が保持され、１つ又は複数のさらなるポジティブ又はネガティブ選択ステップが任意選択で続く後続の方法のステップにおいて使用される。
一例では、ＰＢＭＣのサンプル又は他の白血球サンプルは、ＣＤ４＋細胞の選択に供され、そこでは、ネガティブ及びポジティブの両方の画分が保持される。その後、ネガティブ画分は、例えば、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択、及びＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７などのセントラルメモリーＴ細胞に特徴的なマーカーに基づくポジティブ選択に供されるが、ここではポジティブ及びネガティブ選択は、いずれかの順序で行われる。
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を持つ細胞集団を特定することにより、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、及びエフェクター細胞に分類される。ＣＤ４＋リンパ球は標準的な方法により入手できる。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋である。
一例では、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体又は結合パートナーは、磁性ビーズ又は常磁性ビーズなどの固体支持体又はマトリックスに結合され、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための細胞の分離を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、細胞及び細胞集団は、免疫磁気（又は親和性磁気）分離技術を使用して分離又は単離される（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５８：Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．２：Ｃｅｌｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ ｖｉｖｏ，ｐ １７－２５ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ （Ｃ） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪにレビューされている）。
いくつかの態様では、分離される細胞のサンプル又は組成物は、常磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ又はＭＡＣＳビーズ）などの磁気応答性粒子又は微粒子などの、小さな磁化可能又は磁気応答性材料と共にインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば粒子は、一般に、分離することが望まれる、例えば、ネガティブ又はポジティブに選択することが望まれる、細胞、複数の細胞、又は細胞集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する、結合パートナー、例えば抗体に直接的又は間接的に付着している。
いくつかの実施形態では、磁性粒子又はビーズは、抗体又は他の結合パートナーなどの特定の結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法で使用される多くの周知の磁気応答性材料がある。適切な磁性粒子には、Ｍｏｌｄａｙ、米国特許第４，４５２，７７３号、及び欧州特許明細書ＥＰ ４５２３４２ Ｂに記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。Ｏｗｅｎ米国特許第４，７９５，６９８号、及びＬｉｂｅｒｔｉら、米国特許第５，２００，０８４号に記載されるようなコロイドサイズの粒子は、他の例である。
インキュベーションは、一般に、磁性粒子又はビーズに付着した抗体もしくは結合パートナー、又はそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体又は他の試薬などの分子が、存在する場合には、サンプル内の細胞上の細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。
いくつかの態様では、サンプルは磁場に置かれ、磁気応答性又は磁化可能な粒子に付着させられた細胞は、磁石に引き付けられ、標識されていない細胞から分離されるであろう。ポジティブ選択の場合、磁石に引き付けられた細胞が保持され；ネガティブ選択の場合、引き付けられない細胞（未標識細胞）が保持される。いくつかの態様では、ポジティブ及びネガティブ選択の組み合わせは、同じ選択ステップの間に実行され、ここでは、ポジティブ及びネガティブ画分が保持され、さらに処理されるか、又はさらなる分離ステップに供される。
特定の実施形態では、磁気応答性粒子は、一次抗体又は他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、又はストレプトアビジンでコーティングされている。特定の実施形態では、磁性粒子は、１つ又は複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着される。特定の実施形態では、ビーズではなく細胞が一次抗体又は結合パートナーで標識され、次に細胞型特異的二次抗体又は他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁性粒子が添加される。特定の実施形態では、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子は、ビオチン化された一次又は二次抗体と組み合わせて使用される。
いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子は、その後インキュベート、培養、及び／又は操作される細胞に付着したままである；いくつかの態様では、粒子は、患者に投与するため細胞に付着したままである。いくつかの実施形態では、磁化可能又は磁気応答性粒子が細胞から除去される。細胞から磁化可能な粒子を除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体の使用、磁化可能な粒子の使用、又は切断可能なリンカーに結合させた抗体などの使用が含まれる。いくつかの実施形態では、磁化可能な粒子は生分解性である。
いくつかの実施形態では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を介する。磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）システムは、磁化粒子が付着した細胞を高純度で選択することができる。特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の適用後に非標的種及び標的種が順次に溶出される様式で動作する。つまり、磁化粒子に付着した細胞はその場に保持され、付着していない種は溶出される。その後、この第１の溶出ステップが完了した後、磁場に捕捉されて溶出されなかった種は、溶出及び回収できるように何らかの方法で解放される。特定の実施形態では、非標的細胞は、標識され、異種の細胞集団から枯渇される。
特定の実施形態では、単離又は分離は、本方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、及び／又は製剤化ステップの１つ又は複数を行うシステム、デバイス、又は装置を使用して行われる。いくつかの態様では、システムは、例えば、エラー、ユーザーの操作、及び／又は汚染を最小限とするために、閉鎖又は無菌環境でこれらの各ステップを行うために使用される。一例では、システムは、国際特許出願、公開番号ＷＯ２００９／０７２００３、又はＵＳ ２０１１０００３３８０ Ａ１に記載されているシステムである。
いくつかの実施形態では、システム又は装置は、統合又は自己完結型システムにおいて、及び／又は自動化又はプログラム可能な方法で、単離、処理、操作、及び製剤化ステップの１つ又は複数、例えば全てを実行する。いくつかの態様では、システム又は装置は、システム又は装置と通信するコンピュータ及び／又はコンピュータプログラムを含み、これにより、ユーザーは、処理、単離、操作、及び製剤化のステップの様々な態様をプログラム、制御、結果の評価、及び／又は調整することができる。
いくつかの態様では、分離及び／又は他のステップは、例えば、閉鎖された無菌システムにおける臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して実行される。構成要素には、統合されたマイクロコンピューター、磁気分離ユニット、ペリスタポンプ、及び様々なピンチバルブが含まれ得る。統合されたコンピュータは、いくつかの態様では、機器の全ての構成要素を制御し、標準化された順序で繰り返し手順を実行するようにシステムに指示する。いくつかの態様における磁気分離ユニットは、可動永久磁石及び選択カラム用のホルダーを含む。ペリスタポンプは、チューブセット全体の流量を制御し、ピンチバルブと共に、システムを通過する緩衝液の制御された流れと細胞の継続的な懸濁を保証する。
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムは、いくつかの態様では、無菌の非発熱性溶液で供給される抗体結合磁化可能粒子を使用する。いくつかの実施形態では、磁性粒子で細胞を標識した後、細胞を洗浄して過剰な粒子を除去する。次に、細胞調製バッグがチューブセットに接続され、チューブセットは緩衝液を含むバッグと細胞収集バッグに接続される。チューブセットは、プレカラムと分離カラムを含む、事前に組み立てられた滅菌チューブからなり、単回使用用である。分離プログラムの開始後、システムは自動的に細胞サンプルを分離カラムにアプライする。標識細胞はカラム内に保持され、未標識細胞は一連の洗浄ステップにより除去される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、標識されておらず、カラムに保持されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、標識され、カラムに保持される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。
特定の実施形態では、分離及び／又は他のステップは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行う。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムは、いくつかの態様では、遠心分離による細胞の自動洗浄及び分画を可能にする細胞処理ユニティを備えている。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムには、オンボードカメラと供給細胞生成物の巨視的な層を識別することにより最適な細胞分画エンドポイントを決定する画像認識ソフトウェアを含めることもできる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球、及び血漿層に自動的に分離され得る。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムには、例えば、細胞の分化及び増殖、抗原のロード、長期の細胞培養などの細胞培養プロトコルを実行する統合細胞培養チャンバーを含めることもできる。入力ポートにより、培地の無菌的除去と補充が可能になり、統合された顕微鏡を使用して細胞を監視できる。例えば、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１－６６０，Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２，及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９－７０１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流動的な流れで運ばれる、フローサイトメトリーを介して収集及び濃縮（又は枯渇）される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）選別を介して収集され、濃縮（又は枯渇）される。特定の実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、ＦＡＣＳに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを使用することによって、収集及び濃縮（又は枯渇）される（例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １０，１５６７－１５７３；及びＧｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ．１（５）：３５５－３７６を参照されたい。両方の場合において、細胞を複数のマーカーで標識できるため、高純度のよく規定されたＴ細胞サブセットの単離が可能となる。
いくつかの実施形態では、抗体又は結合パートナーは、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための分離を容易にするため、１つ又は複数の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識された抗体への結合に基づくことができる。いくつかの例では、１つ又は複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体又は他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えば、フローサイトメトリー検出システムと組み合わせた調整スケール（ＦＡＣＳ）及び／又は微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを含む蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）などによる、流動的な流れの中で行われる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づくポジティブ及びネガティブな選択を可能にする。
いくつかの実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーション、及び／又は操作の前又は後のいずれかで、細胞を凍結、例えば、凍結保存するためのステップを含む。いくつかの実施形態では、凍結及びその後の解凍ステップでは、細胞集団中の顆粒球及び、ある程度まで、単球を除去する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、血漿及び血小板を除去するための洗浄ステップの後に、凍結溶液に懸濁される。いくつかの態様では、任意の様々な公知の凍結溶液及びパラメータを使用することができる。一例には、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ、又は他の適切な細胞凍結培地を使用することを包含する。その後、これを、ＤＭＳＯ及びＨＳＡの最終濃度をそれぞれ１０％及び４％となるように、培地で１：１に希釈する。その後、細胞を毎分１度の速度で－８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵する。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、培養〔cultivation〕、インキュベーション、培養〔culture〕、及び／又は遺伝子操作のステップを含む。例えば、いくつかの実施形態では、枯渇した細胞集団及び培養開始組成物をインキュベート及び／又は操作するための方法が提供される。
したがって、いくつかの実施形態では、細胞集団は、培養開始組成物中でインキュベートされる。インキュベーション及び／又は操作は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、又は細胞を培養又は養殖するための他の容器などの培養容器内で実施することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作の前に、又は遺伝子操作に関連して、インキュベート及び／又は培養される。インキュベーションステップには、培養〔culture〕、培養〔cultivation〕、刺激、活性化、及び／又は増殖を含めることができる。いくつかの実施形態では、組成物又は細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団内の細胞の増殖、拡張、活性化、及び／又は生存を誘導し、抗原曝露を模倣し、及び／又は組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように設計された条件が含まれる。
条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体などの刺激因子、及び細胞を活性化するように設計された任意のその他の薬剤のうちの１つ又は複数を含むことができる。
いくつかの実施形態では、刺激条件又は薬剤は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる、１つ又は複数の薬剤、例えば、リガンドを含む。いくつかの態様では、薬剤は、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３細胞内シグナル伝達カスケードをオンにするか又は開始する。そのような薬剤には、ＴＣＲに特異的なものなどの抗体、例えば抗ＣＤ３を含めることができる。いくつかの実施形態では、刺激条件は、１つ又は複数の薬剤、例えば、共刺激受容体を刺激することができるリガンド、例えば抗ＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、そのような薬剤及び／又はリガンドは、ビーズなどの固体支持体、及び／又は１つ又は複数のサイトカインに結合されてもよい。任意選択で、増殖法は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）添加するステップを、さらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７を含む。いくつかの態様では、ＩＬ－２、例えば、配列番号１、の濃度は少なくとも約１０ユニット／ｍＬである。
いくつかの態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，０４０，１７７号；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１－６６０，Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２，及び／又はＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９－７０１に記載されるような技術に従って行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの培養開始組成物フィーダー細胞に添加することによって（例えば、増殖させる開始集団の各々のＴリンパ球に対して、結果として生じる細胞の集団が、少なくとも約５、１０、２０、又は４０以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含むように）増殖され；及び培養物をインキュベートする（例えば、Ｔ細胞の数を増殖するために十分な時間）。いくつかの態様では、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防ぐために、約３０００から３６００ｒａｄの範囲のガンマ線で照射される。いくつかの態様では、フィーダー細胞は、Ｔ細胞の集団を添加する前に培養培地に添加される。
いくつかの実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の成長に適した温度、例えば、少なくとも摂氏約２５度、一般には、少なくとも摂氏約３０度、及び一般には、摂氏３７度又は約３７度を含む。任意選択で、インキュベーションは、フィーダー細胞として非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を添加することをさらに含んでもよい。ＬＣＬは、約６０００～１００００ｒａｄの範囲のガンマ線を照射できる。いくつかの態様では、ＬＣＬフィーダー細胞は、少なくとも約１０：１のＬＣＬフィーダー細胞と開始Ｔリンパ球との比など、任意の適切な量で提供される。
医薬組成物
ＩＬ－２、例えば、配列番号１は、薬学的に許容される担体を有する医薬組成物として製剤化されてもよい。化合物は、がんを処置するための有効な量で対象に投与される。「有効量」は、例えば、所望の生物学的効果を実現するために必要又は十分な量である。がんを処置するための有効な量は、例えば、（ｉ）がんのさらなる成長を防ぐ又は遅らせる、及び／又は（ｉｉ）既存のがん細胞を殺すために必要な量であり得る。本発明のいくつかの態様によれば、有効量は、本発明の化合物の単独又は別の薬剤との組み合わせの量であり、組み合わせ、同時投与、又は単独で投与されると、疾患に対する治療応答、疾患の予防又は処置をもたらす。生物学的効果は、がんの寛解及び／又は完全な排除である可能性がある。別の実施形態では、生物学的効果は、例えば、腎細胞がんなどの疾患の症状の不存在によって証明されるような、疾患の完全な撤廃である。
本明細書に記載の疾患の処置における本発明の化合物の有効量は、使用される特定の化合物、化合物の送達様式、及びそれが単独で使用されるか組み合わせて使用されるかに依存して異なり得る。特定の用途の有効量はまた、処置される疾患、投与される特定の化合物、対象のサイズ、又は疾患もしくは状態の重症度などの要因に依存しても異なり得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書で提供される教示と組み合わせて、効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者体重、有害な副作用の重症度及び好ましい投与様式などの様々な活性化合物及び重み因子から選択することによって、実質的な毒性を引き起こさないものの、特定の対象を処置するのに完全に効果的であるような、効果的で予防的又は治療的処置レジメンを計画することができる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．００１ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの範囲のＳＤＳ、非イオン性浸透圧調節物質、ｐＨ７～８のリン酸緩衝液又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のＳＤＳ、非イオン性浸透圧調節物質、及びｐＨ７～８のリン酸緩衝液からなる。特定の実施形態では、浸透圧調節物質は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む。
本明細書に記載の化合物の対象用量は、典型的には、約０．１μｇから１００００ｍｇ、又は約１μｇ／日から８０００ｍｇ、又は約１０μｇから１００μｇの範囲である。対象の体重に関して述べると、典型的な投与量は、１回の投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、及びその中で導出可能な任意の範囲である。本明細書に列記の数値から導出可能な範囲の非限定的な例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から約１００００ミリグラム／ｋｇ／体重の範囲などは、上記の数値に基づいて投与することができる。
特定の実施形態では、本明細書で具体化されるＩＬ－２分子、例えば、配列番号１の例示的な有効用量には、０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は９００μｇ／ｋｇ体重又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。
いくつかの場合では、ＩＬ－２は毎日、例えば、２４時間ごとに投与される。又は、ＩＬ－２は継続的に又は１日に数回、例えば、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間、１０時間ごと、１１時間ごと、又は１２時間ごとに投与される。
ＩＬ－２、例えば、配列番号１の例示的な有効日用量は、０．１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．１、０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９μｇ／ｋｇ体重を含む。
或いは、ＩＬ－２、例えば、配列番号１は、週に約１回、例えば、７日に約１回投与される。又は、ＩＬ－２は週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、又は週７回投与される。ＩＬ－２の例示的な有効な週用量には、０．０００１ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、又は４ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。例えば、ＩＬ－２、例えば、配列番号１の有効な週用量は、０．００１μｇ／ｋｇ体重から４００μｇ／ｋｇ体重の間である。或いは、ＩＬ－２、例えば、配列番号１は、固定用量で、又は体表面積に基づいて（すなわち、ｍ２あたり）投与される。
いくつかの場合では、対象は４週間のＩＬ－２、例えば、配列番号１の静脈内投与とそれに続く２週間の休息期間からなる、２つの６週間サイクルを受ける。最終的には、主治医又は獣医師が適切な量及び投与レジメンを決定する。
絶対量は、同時処置、投与回数、及び年齢、体調、サイズ、体重などの個々の患者のパラメータなど、様々な要因によって異なるであろう。これらは当業者に周知の要因であり、日々の実験のみで対処することができる。一般に、最大用量、すなわち、健全な医学判断による最高の安全用量を使用することが好ましい。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膀胱内、又は点滴注入によって投与される。阻害剤及びアルデスロイキンは、同時に又は連続で投与してもよい。
併用療法
任意選択で、本明細書に具体化されるＩＬ－２医薬組成物は、他の任意の標準的な治療法と組み合わせて投与される；そのような方法は当業者に公知であり、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。必要であれば、組成物は、免疫療法、治療用抗体、標的療法、手術、放射線療法、化学療法、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、免疫刺激物質、遺伝子療法、抗体及び／又は樹状細胞を含むがこれらに限定されない、任意の従来の抗新生物療法と組み合わせて投与される。
特定の実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のＳＤＳ、非イオン性浸透圧調節物質、ｐＨ７～８のリン酸緩衝液、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物の投与は、１つ又は複数の二次活性剤と共に投与される。例えば、がんの処置において、本明細書に具体化されるＩＬ－２分子を含む医薬組成物は、化学療法剤と共に投与される。化学療法薬には、アルキル化剤（例えば、白金系薬剤、テトラジン、アジリジン、ニトロソウレア、窒素マスタード）、抗代謝物（例えば、抗葉酸剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン）、抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド、タキサン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリン）及び免疫調節薬（例えば、サリドマイド及び類似体）が含まれる。
したがって、特定の実施形態では、本明細書で具体化されるＩＬ－２医薬組成物は、１つ又は複数の化学療法剤との併用療法として投与される。「化学療法剤」は、がんの処置に有用な化合物である。化学療法剤の例には、マイトマイシンＣ、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、スーテント（ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＣＨ ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ．）、及びゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（商標）シクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ及びウレドパなどのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン類及びメチルアメラミン類；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドジシシン、カルズシシン、及びビズシシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチンなどのニトロソウレア類；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１及びカリケアマイシンオメガ１（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４） ３３：１８３－１８６）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質クロモフォア類）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（商標） ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピュロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン〔strcptonigrin〕、ストレプトゾシン〔strcptozocin〕、ツブクレシジン、ウベニメックス〔ubenimcx〕、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール類；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド〔cyclophosphamidc〕；チオテパ〔thiotcpa〕；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォアフリー、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸又は誘導体が含まれる。
この「化学療法剤」の定義に含まれるものとしては：（ｉ）抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）など、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）（タモキシフェン）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（商標）（トレミフェン）を含む；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（商標）（エキセメスタン）、フォルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（商標）（レトロゾール）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（商標）（アナストロゾール）；（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）アロマターゼ阻害剤；（ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤；（ｖｉ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ－アルファ、Ｒａｌｆ及びＨ－Ｒａｓなどの、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの：（ｖｉｉｉ）ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（商標）（リボザイム））及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；（ｉｘ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（商標）ｒｍＲＨ；（ｘ）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗血管新生剤；並びに（ｘｉ）上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸又は誘導体である。
特定の実施形態では、本明細書に具体化されるＩＬ－２医薬組成物は、１つ又は複数の抗炎症剤との併用療法として投与される。抗炎症剤には、鎮痛、解熱、及び抗炎症効果を有するステロイド性及び非ステロイド性抗炎症薬が含まれる。ＮＳＡＩＤには、酵素シクロオキシゲナーゼの非選択的阻害剤が含まれる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、及びナプロキセンなどのプロピオン酸誘導体、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナクなどの酢酸誘導体、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム及びイソキシカムなどのエノール酸誘導体、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸などのフェナム酸誘導体、並びにセレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブなどのＣＯＸ－２阻害剤が含まれる。ＮＳＡＩＤは、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、急性痛風、月経困難症、転移性骨痛、頭痛及び片頭痛、術後疼痛、炎症や組織損傷による軽度から中等度の痛み、発熱、回腸、腎疝痛などの状態の症状緩和に適応できる。
特定の実施形態では、本明細書に具体化されるＩＬ－２医薬組成物は、１つ又は複数の免疫調節剤との併用療法として投与される。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマ；インターロイキン及び他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋ及びその他のサイトカイン類似体；又はＭＩＰ－１、ＭＩＰ－１ベータ、ＭＣＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、及びその他のケモカインが含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に具体化されるＩＬ－２医薬組成物は、１つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤との併用療法として投与される。
免疫チェックポイントとは、自己耐性を維持し、生理学的な免疫応答の持続時間と振幅を調節することに関与する免疫系の抑制経路を指す。特定のがん細胞は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に関して、免疫抵抗性の主要なメカニズムとして、免疫チェックポイント経路を利用することによって繁殖する。例えば、特定のがん細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の阻害に関与する１つ又は複数の免疫チェックポイントタンパク質を過剰発現する可能性がある。したがって、免疫チェックポイントモジュレーターを投与して、抑制性シグナルを克服してがん細胞に対する免疫攻撃を許可及び／又は増強することができる。免疫チェックポイントモジュレーターは、ネガティブな免疫応答レギュレーター（例えば、ＣＴＬＡ４）によるシグナル伝達を減少、阻害、もしくは無効にすることによってがん細胞に対する免疫細胞応答を促進するか、又はポジティブな免疫応答レギュレーター（例えば、ＣＤ２８）のシグナル伝達を刺激するかもしくは増強する可能性がある。したがって、本明細書に具体化されるＩＬ－２医薬組成物の投与は、例えば、腫瘍又はウイルス感染細胞に対する免疫応答を刺激し、免疫応答を維持するであろう。
免疫チェックポイントモジュレーターを標的とする免疫療法剤を投与して、がん細胞を標的とする免疫攻撃を促進することができる。免疫療法剤は、免疫チェックポイントモジュレーターを標的とする（例えば、特異的である）抗体剤であり得るか、又はそれらを含み得る。免疫療法剤の例には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、ＣＤ４０；及びＣＤ１３７の１つ又は複数を標的とする抗体剤が含まれる。抗体剤の特定の例には、モノクローナル抗体が含まれ得る。免疫チェックポイントモジュレーターを標的とする特定のモノクローナル抗体は、利用可能である。例えば、イピルミマブはＣＴＬＡ－４を標的し；トレメリムマブはＣＴＬＡ－４を標的し；ペムブロリズマブはＰＤ－１を標的とするなど。いくつかの実施形態では、そのような治療は、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、完全ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）モノクローナルＰＤ－１抗体）、ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗ＰＤ－１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（完全ヒトＩｇＧ４ ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ヒト化操作ＩｇＧ１モノクローナルＰＤ－Ｌ１抗体）及び／又はＭＥＤＩ４７３６（ヒト化操作ＩｇＧ１モノクローナルＰＤ－Ｌ１抗体）の１つ又は複数の投与を伴う。
医薬治療
本発明は、がん、自己免疫、細胞療法、遺伝子治療などの処置に有用なＩＬ－２、例えば、配列番号１を含む。治療用途の場合、本明細書に具体化されるＩＬ－２、例えば配列番号１は、全身投与されてもよく、例えば、生理食塩水などの医薬的に許容される緩衝液中に製剤化されてもよい。好ましい投与経路には、例えば、患者に継続的で持続的なレベルの薬物を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮内注射が含まれる。ヒト患者又は他の動物の処置は、生理学的に許容される担体中の、本明細書で同定された治療有効量の治療薬を使用して行われるであろう。適切な担体及びそれらの製剤化は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与される治療薬の量は、投与方法、患者の年齢と体重、及びがんの臨床症状によって異なる。一般に、量は、がんに関連する他の疾患の処置に使用される他の薬剤に使用される量の範囲内であるが、特定の例では、化合物の特異性が高められているため、より少ない量が必要とされるであろう。
医薬組成物の製剤化
組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内又は腹腔内）投与経路に適した投与形態で提供され得る。有利な投与方法は静脈内注入である。医薬治療剤は、従来の医薬慣行に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２０ｔｈ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８－１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。
特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．００１ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のＳＤＳ、非イオン性浸透圧調節物質、ｐＨ７～８のリン酸緩衝液又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のＳＤＳ、非イオン性浸透圧調節物質、及びｐＨ７～８のリン酸緩衝液からなる。特定の実施形態では、浸透圧調節物質は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む。
本発明による医薬組成物は、ＩＬ－２、例えば、配列番号１を、実質的に投与直後、又は投与後の任意の所定の時間又は期間で放出するように製剤化することができる。後者のタイプの組成物は、一般に制御放出製剤として公知であり、これには、（ｉ）長期間にわたって体内に実質的に一定の濃度の薬物を生成する製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間の後、長期間にわたって体内に実質的に一定の濃度の薬物を生成する製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿中レベルの変動（鋸歯状運動パターン）に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えながら、体内で比較的一定の有効レベルを維持することにより、所定の期間中に作用を維持する製剤；（ｉｖ）例えば、胸腺に隣接するか、又は胸腺と接触して、制御放出組成物を空間的に配置させることによって作用を局所化させる製剤；（ｖ）用量を、例えば、１週間又は２週間に１回、投与するような、便利な投薬を可能にする製剤；及び（ｖｉ）担体又は化学誘導体を使用して、治療薬を特定の細胞タイプ（例えば、新生物細胞）に送達することによって、がんをする製剤が含まれる。いくつかの応用では、制御放出製剤は、血漿中レベルを治療レベルに維持するために、日中に頻繁に投与する必要を無くす。
問題となる化合物の代謝速度を放出速度が上回る制御放出を得るため、いくつかある戦略のいずれかを追求することができる。一例では、制御放出は、例えば、様々なタイプの制御放出組成物及びコーティングを含む、様々な配合パラメータ及び成分の適切な選択により得られる。したがって、治療薬は、投与時に制御された方法で治療薬を放出する、医薬組成物に適切な賦形剤と共に製剤化される。例としては、単一又は複数単位の錠剤又はカプセル組成物、油溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが含まれる。
非経口組成物
医薬組成物は、従来の非毒性の医薬的に許容される担体及びアジュバントを含む投与形態、製剤又は適切な送達デバイスもしくはインプラントを介しての、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、小胞内など）によって、非経口的に投与され得る。そのような組成物の製剤化及び調製は、医薬製剤の当業者に周知である。製剤化は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに見出すことができる。
非経口使用のための組成物は、単位投与形態（例えば、単回投与アンプル）で提供されるか、又はいくつかの用量を含むバイアルで提供されてもよく、これには、適切な防腐剤が添加されてもよい（以下を参照）。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、注入デバイス、又は移植用の送達デバイスの形態であってもよいか、又はそれは、使用前に水又は他の適切なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提示され得る。がんを低減又は改善する活性剤とは別に、組成物には、適切な非経口的に許容される担体及び／又は賦形剤が含まれてもよい。活性治療剤、例えば配列番号１、２又はそれらの組み合わせは、制御放出のために、マイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、張性調整剤、及び／又は分散剤を含んでもよい。
上に示したように、本発明による医薬組成物は、無菌注射に適した形態であり得る。そのような組成物を調製するために、適切な治療薬は、非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解又は懸濁される。使用できる許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウム又は適切な緩衝液の添加により適切なｐＨに調整された水、１，３－ブタンジオール、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液及びデキストロース溶液がある。水性製剤はまた、１つ又は複数の防腐剤（例えば、メチル、エチル又はｎ－プロピルｐ－ヒドロキシベンゾエート）を含んでもよい。化合物の１つが水に溶けにくい又はわずかにしか溶けない場合、溶解増強剤又は可溶化剤を添加することができ、又は溶媒は、１０～６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油溶液、油懸濁液、又は乳濁液の形態であり得る。或いは、抗体は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、又は注入デバイスに組み込まれ得る。
マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用するための材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ－（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－Ｌ－グルタミン）〔poly(2-hydroxyethyl-L-glutam-nine)〕及びポリ（乳酸）などの生分解性／生体内分解性ポリマーである。制御放出非経口製剤を製剤化する際に使用できる生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、又は抗体である。インプラントにおける使用のための材料は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）又は生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又はポリ（オルトエステル）又はそれらの組み合わせ）であり得る。
経口使用のための固形投与形態
経口使用のための製剤には、非毒性の医薬的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含む錠剤が含まれる。そのような製剤は当業者に公知である。賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤（例えば、ショ糖、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム）、造粒剤及び崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、又はアルギン酸）；結合剤（例えば、ショ糖、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール）；及び潤滑剤、流動促進剤、及び付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、又はタルク）であり得る。他の医薬的に許容される賦形剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などであり得る。
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、又は公知の技術によってコーティングされていてもよく、任意選択で、胃腸管内での崩壊及び吸収を遅らせ、それによって長期間にわたって持続作用を提供する。コーティングは、所定のパターンで活性薬物を放出するように適合されていてもよく（例えば、制御放出製剤を達成するために）、又は胃の通過後まで活性薬物を放出しないように適合されていてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンに基づく）、又は腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシナート、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック、及び／又はエチルセルロースに基づく）であり得る。さらに、例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。
固体錠剤組成物は、組成物を望ましくない化学変化（例えば、キメラ抗体の放出前の化学分解）から保護するように適合されたコーティングを含んでもよい。コーティングは、上記のＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されるものと同様の方法で固体投与形態に塗布してもよい。
経口使用のための製剤はまた、チュアブル錠として、又は活性成分が不活性固体希釈剤（例えば、ジャガイモデンプン、乳糖、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリン）と混合された硬質ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水又は油媒体、例えばピーナッツ油、液体パラフィン、又はオリーブ油と混合されたソフトゼラチンカプセルとして、提示され得る。粉末及び顆粒は、錠剤及びカプセルの下で、例えば、ミキサー、流動床装置又は噴霧乾燥装置を使用する従来の方法で、上記の成分を使用して調製することができる。
徐放性経口投与形態
経口使用のための制御放出組成物は、例えば、活性物質の溶解及び／又は拡散を制御することによってキメラ抗体治療薬を放出するように構築されてもよい。溶解又は拡散制御放出は、化合物の錠剤、カプセル、ペレット、又は顆粒製剤の適切なコーティングによって、又は適切なマトリックスに化合物を組み込むことによって達成することができる。徐放性コーティングは、上記のコーティング物質の１つ又は複数、及び／又は、例えば、シェラック、蜜蝋、グリコワックス、ヒマシワックス、カルナウバワックス、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ－ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２－ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、及び／又はポリエチレングリコールを含んでもよい。制御放出マトリックス製剤において、マトリックス材料はまた、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバワックス及びステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、グリセリルトリステアレート、アクリル酸メチル－メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、及び／又はハロゲン化フルオロカーボンを含んでもよい。
１つ又は複数の治療用化合物を含む制御放出組成物はまた、浮揚性錠剤又はカプセル（すなわち、経口投与時に、一定期間胃内容物の上に浮かぶ錠剤又はカプセル）の形態であってもよい。化合物の浮揚性錠剤製剤は、化合物と賦形剤及びヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの２０～７５％ｗ／ｗの親水コロイドとの混合物を造粒することによって調製することができる。その後、得られた顆粒を圧縮して錠剤にすることができる。胃液と接触すると、錠剤はその表面の周りに実質的に水不透過性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは、密度を１未満に維持することに関与し、それによって錠剤が胃液中で浮力を維持できるようにする。
キット
本発明は、新生物の処置又は予防のためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、単位投与形態及び１つ又は複数の治療剤内に治療有効量のＩＬ－２、例えば、配列番号１を含む治療又は予防組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、治療的又は予防的細胞組成物を含む無菌容器を含む；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、合わせ紙、金属箔、又は薬剤を保持するために適した他の材料で作ることができる。
必要に応じてＩＬ－２、例えば配列番号１、及び１つ又は複数の治療薬が、ＩＬ－２、例えば、配列番号１、及び１つ又は複数の治療薬をそのような治療を必要とする対象へ投与するための説明書と共に提供される。説明書は、一般に、特定の疾患又は障害、例えば、自己免疫疾患の処置又は予防のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。他の実施形態では、説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；虚血又はその症状の処置又は予防のための投与スケジュール及び投与；注意；警告；適応症；反適応症；過剰摂取情報；副作用；動物薬理学；臨床試験；及び／又は参考資料。説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷するか、容器に貼付するラベルとして、又は容器内又は容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カード、又はフォルダーとして印刷されていてもよい。
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例はいかなる様式によっても本発明を限定することを意図していない。
［実施例１］本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキンのアミノ酸配列
本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキンのアミノ酸配列は、本方法で使用される発現プラスミドに存在するアルデスロイキン遺伝子のＤＮＡ配列決定によって推定された。得られたアミノ酸配列を図１に示す。
［実施例２］本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の比活性
本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の生物学的活性は、ＨＴ－２細胞株アッセイの増殖によって決定された。２０の独立したロットの比活性は、インターロイキン２（ヒト、ｒＤＮＡ由来）ＮＩＢＳＣコード：８６／５００のＷＨＯ国際標準で較正された１６．６～１９．５ＩＵ／ｍｇの範囲であった。この範囲の比活性は、ＥＰ １ ６８８ １４６Ｂ１に従って調製されたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の公表比活性に類似している。
［実施例３］動的光散乱によって測定された、凍結乾燥された市販の調製物から再構成した後に得られたＳＤＳ／プロロイキン凝集体及び本開示の方法を使用して得られたＳＤＳ／アルデスロイキン凝集体の比較サイズ
２．２ｍｇ／ｍＬのアルデスロイキンを含む液体調製物が、以下の最終組成を有する本発明の方法で得られた：０．４４ｍｇ／ｍｌ ＳＤＳ、５０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１．１９ｍｇ／ｍｌリン酸二ナトリウム、０．２６ｍｇ／ｍｌ二水和一ナトリウムリン酸塩、ｐＨ７．５。この調製物を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ及びＺｅｔａ Ｎａｎｏシリーズソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して動的光散乱によって分析し、アルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体のサイズ及び多分散度を決定した。１００μＬのサンプルを１ｍＬの純水で希釈し、測定の間の平衡時間３０秒で、２５℃で５回、３０秒間測定した。粒子サイズは、ｎｍ単位の流体力学的直径として表される。図２は、本開示の方法を使用して得られたＳＤＳ／アルデスロイキン凝集体、及び凍結乾燥された市販の調製物から再構成した後のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）の動的光散乱パターンを示す。本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体は、約８ｎｍにピークを有する４から１８ｎｍの間の拡張サイズ範囲を示す。ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）もまた、同様の分布曲線を示す。しかしながら、この曲線の下の面積は、本開示の方法によって調製されたアルデスロイキン／ＳＤＳ粒子の曲線の下の面積よりも明らかに小さい。両方の分析サンプルで使用されたタンパク質の質量は同じであったため、この結果は、再構成の際に、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）の一部が、使用された手法での研究に適さない大きな凝集体として残っている可能性があることを示唆している。
［実施例４］本開示の製造方法によって得られたアルデスロイキンのＳＤＳ／アルデスロイキン調製物の安定性
実施例３に記載の液体調製物を安定性について試験した。表１に、２～８℃での保存時間による比活性における活性変化を示す。比活性に加えて、各サンプルで以下の特性をアッセイした：異常の目視観察、ｐＨ、容量、ウエスタンブロット、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（還元及び非還元条件）、ローリー、エンドトキシン汚染（ＬＡＬ試験）及び無菌性。測定された全ての時間で、これらのアッセイは正常であった。
Figure 2022091653000001
さらに、図３は、動的光散乱によって測定されたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体のサイズ分布が、本開示のアルデスロイキン液体組成物において、２～８℃で６又は１２ヶ月の貯蔵後も十分に保存されていることを示す。
［実施例５］本開示の製造方法によって得られたＳＤＳ／アルデスロイキン凝集体と共にインキュベートされたヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）増殖
Ｔｒｅｇ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）制御性ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してヒトＰＭＢＣから回収された。ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルを使用して、アルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体のＴｒｅｇ増殖を誘導する能力を評価した。５００ＩＵのアルデスロイキン調製物をＴｒｅｇ増殖に使用した。７日間の増殖後、Ｔｒｅｇを計数した。本開示の方法又はＥＰ１ ６８８ １４６ Ｂ１に十分に開示された方法を使用して得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の両方の増殖は７６～１２５倍であった。
［実施例６］
本開示の製造方法を使用して得られたアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の治療活性
本開示の方法によって調製されたアルデスロイキンの凝集体及びＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）のアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体の治療効率を比較するために、記載されるように（７）、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を使用する肺転移モデルを使用した。８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０５Ｂ１６細胞を含む０．５ｍｌの細胞懸濁液を尾静脈に静脈内注射した。この後、マウスを各々１０匹のマウスからなる３つのグループに分けた。グループ１のマウスには、３日目から１０日目まで毎日、７．０ｍｇ／Ｋｇ用量のＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）を投与した。グループ２のマウスには、３日目から１０日目まで毎日、７．０ｍｇ／Ｋｇ用量の本開示の方法によって調製されたアルデスロイキンの微小凝集体を投与した。グループ３マウスには、３日目から１０日目まで毎日、ビヒクルを投与した。腫瘍接種後１６日目にマウスを安楽死させ、記載されるように（７）肺転移を計測した。表２は、本開示の方法によって調製された微小凝集体で観察された転移の中央値が４．３（範囲１～１２）であったのに対し、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）では５．５（範囲３～２２）であり、この差異は有意ではないことを示している。
Figure 2022091653000002
本開示の方法によって調製され、このアッセイで使用されるアルデスロイキンは、新しく産生された。対照的に、表３は、２～８℃で６又は１２ヶ月間保存した後、本開示の方法によって調製されたアルデスロイキンを用いて行われた同じアッセイを示している。
Figure 2022091653000003
配列
配列番号１
長さ：１３２
タンパク質
生物：人工配列、ヒトインターロイキン－２の成熟des－アラニル－１ セリン１２５バリアント
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
参考文献
米国特許文書
US 4,604,377 Aug. 5, 1986
他の特許文書
EP 1 688 146 B1 18.07.2007
WO 2 017 068 031 A1 Abr. 27, 2017
他の出版物
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他の実施形態
前述の記載から、様々な使用法及び条件に導入するために、本明細書に記載の発明に変更及び修正を施すことができることは明らかであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内にある。
本明細書における配列、特許及び刊行物への全ての引用は、各々の独立した特許及び刊行物が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (43)

  1. 約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物。
  2. ＩＬ－２が、配列番号１又はその変異体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 浸透圧調節物質が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する方法であって、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  5. アルデスロイキンが医薬組成物に含まれる、請求項４に記載の方法。
  6. アルデスロイキンが配列番号１又はその変異体を含む、請求項４に記載の方法。
  7. アルデスロイキンが、インビトロの生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する、請求項１に記載の方法。
  8. アルデスロイキンが、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間、液体組成物中で安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を含む、請求項１に記載の方法。
  9. アルデスロイキンが、ヒトがんの動物モデルで測定して、液体組成物中で少なくとも１年間、安定した治療活性を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 処置を必要とする対象における自己免疫疾患又は障害を処置する方法であって、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  11. アルデスロイキンが、インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する、請求項１０に記載の方法。
  12. アルデスロイキンが、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間、液体組成物中において安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を含む、請求項６に記載の方法。
  13. アルデスロイキンが、ヒトがんの動物モデルにおける測定で、液体組成物中において少なくとも１年間、安定した治療活性を有する、請求項６に記載の方法。
  14. それを必要とする対象における疾患又は障害に関連する免疫応答を調節する方法であって、制御性Ｔ細胞が対照と比較して増加して、インビボで制御性Ｔ細胞の増殖を誘導する、治療有効量のアルデスロイキンを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  15. アルデスロイキンが、インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する、請求項１０に記載の方法。
  16. アルデスロイキンが、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間、液体組成物中において安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を含む、請求項１０に記載の方法。
  17. アルデスロイキンが、ヒトがんの動物モデルで測定して、液体組成物中において少なくとも１年間、安定した治療活性を有する、請求項１０に記載の方法。
  18. 疾患又は障害が、自己免疫疾患、がん、炎症、ウイルス感染、細菌感染、神経変性障害、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
  19. 医薬用水性ビヒクル中にアルデスロイキンを含む組成物の調製に適したアルデスロイキンを製造する方法であって：
    アルデスロイキン遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた細菌細胞を培養すること；
    細菌細胞を破砕すること；
    アルデスロイキンを含む封入体を収集すること；
    封入体を界面活性剤による溶解の後、酸化及び第１のクロマトグラフィーに供すること；
    有機ニトリルで希釈し、第２のクロマトグラフィーに供すること；
    アルデスロイキンをダイアフィルトレーション及び滅菌に供すること
    を含む方法。
  20. 細菌細胞が大腸菌細菌細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１９に記載の方法。
  22. 酸化が酸化化合物を用いて行われる、請求項１９に記載の方法。
  23. 第１のクロマトグラフィーが、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、請求項１９に記載の方法。
  24. 第２のクロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である、請求項１９に記載の方法。
  25. ＨＰＬＣが、Ｃ４カラムＨＰＬＣクロマトグラフィーである、請求項２４に記載の方法。
  26. アルデスロイキンが、インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持する、請求項１に記載の方法。
  27. アルデスロイキンが、動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、約４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間、液体組成物中で安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を含む、請求項１９に記載の方法。
  28. アルデスロイキンが、ヒトがんの動物モデルで測定して、少なくとも１年間、液体組成物中で安定な治療活性を有する、請求項１９に記載の方法。
  29. アルデスロイキンが、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、非リンパ系細胞、細胞株、形質転換細胞又はそれらの組み合わせを含む、それらの膜においてＩＬ－２受容体を発現する細胞が関与する医学的処置のための薬物として使用される、請求項１９に記載の方法。
  30. アルデスロイキンを含む医薬組成物であって、アルデスロイキンが：ａ）インビトロ生物活性アッセイにより測定して、少なくとも１年間、医薬液体組成物中で安定を維持し、ｂ）動的光散乱により測定して、約８ｎｍにピークを持ち、４～１８ｎｍの範囲にある、少なくとも１年間、液体組成物中で安定なアルデスロイキン／ＳＤＳ凝集体分布を有し、ｃ）ヒトがんの動物モデルで測定して、少なくとも１年間、液体組成物中で安定な治療活性を有し、及びｄ）膜にＩＬ－２受容体を発現する細胞が関与する処置のための薬物として使用するために十分である、医薬組成物。
  31. それを必要とする対象におけるＴ細胞媒介性免疫応答を回復する方法であって、治療有効量の（ｉ）約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物、（ｂ）治療用タンパク質をコードする発現ベクター；（ｉｉ）１つ又は複数の動員因子を投与することを含み、それにより、それを必要とする対象におけるＴ細胞媒介性免疫応答を回復させる方法。
  32. ＩＬ－２が配列番号１又はその変異体を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 浸透圧調節物質が、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、又はｐＨ７～８のリン酸緩衝液を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 対象が免疫不全に罹患している、請求項３１に記載の方法。
  35. 対象が、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、ＡＰＳ－１（ＡＰＥＣＥＤ）、ＣＡＲＤ９、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、先天性好中球減少症候群、共通可変免疫不全症（ＣＶＩＤ）、ＣＴＬＡ４欠損症、ＤＯＣＫ８欠損症、免疫不全を伴うグリコシル化障害、高免疫グロブリンＥ症候群（ＨＩＥＳ）、ＰＩ３キナーゼ疾患、ＰＬＡＩＤ、重度の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ＳＴＡＴ３優性陰性疾患、ＷＨＩＭ症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、ディジョージ症候群、運動失調－毛細血管拡張症、慢性肉芽腫性疾患、乳児期一過性低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、補体欠損症、又は選択的ＩｇＡ欠損症に罹患している、請求項３４に記載の方法。
  36. 免疫不全症に罹患している対象を処置する方法であって、
    （ｉ）配列番号１をコードする発現ベクター；及び／又は、
    （ｉｉ）配列番号１をコードする発現ベクターを含む細胞；及び／又は、
    （ｉｉｉ）約０．００１ｍｇから３ｍｇ／ｍＬの範囲のＩＬ－２、約０．０００１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、非イオン性浸透圧調節物質、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物
    を対象に投与することを含む方法。
  37. 免疫療法を必要とする対象を処置する方法であって、
    （ｉ）配列番号１をコードする発現ベクター；及び／又は、
    （ｉｉ）配列番号１をコードする発現ベクターを含む細胞
    を対象に投与することを含み、
    それによって対象を処置する方法。
  38. 対象が、がん、免疫不全、免疫抑制、ウイルス感染、免疫障害、又はそれらの組み合わせに罹患している、請求項３７に記載の方法。
  39. 免疫障害、炎症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、又は自己免疫障害である、請求項３８に記載の方法。
  40. 免疫障害が、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、接触過敏症、喘息又はシェーグレン症候群である、請求項３９に記載の方法。
  41. ＩＬ－２を投与することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  42. 細胞が、自家細胞、同種異系細胞、ハプロタイプ一致細胞、ハプロタイプ不一致細胞、ハプロ同一細胞、異種細胞、細胞株又はそれらの組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
  43. 細胞が、幹細胞、臍帯血細胞、成体幹細胞、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、人工多能性幹細胞、自家幹細胞、骨髄細胞、造血細胞、造血幹細胞、体細胞、生殖系列細胞、分化細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞又はそれらの組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
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