KR20090087808A - 항암 활성을 갖는 화합물을 생성하는 미생물, 이 미생물로부터 생성된 항암 활성 화합물 및 이 화합물을 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

항암 활성을 갖는 화합물을 생성하는 미생물, 이 미생물로부터 생성된 항암 활성 화합물 및 이 화합물을 포함하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 화합물을 생성하는 미생물, 이 미생물로부터 생성된 항암 활성 화합물 및 이 화합물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로서, 해양시료를 배양하여 얻어지며 항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 스트렙토마이스세스 속 미생물, 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 미생물을 제공하며, 또한 항암 활성을 갖는 물질로 하기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 염과 항암 조성물로서 항암 활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면 항암 활성을 갖는 화합물, 구체적으로 인돌알칼로이드계 화합물을 생성할 수 있는 스트렙토마이세스 속 방선균주가 확립되고 이 확립된 균주로부터 항암 활성을 갖는 화합물, 구체적으로 인돌알칼로이드계 화합물을 안정적이고 대량으로 생산하여 의약 산업에 적용할 수 있는 항암제 및 항암 조성물의 제공이 가능하게 된다.
[화학식 1]
Figure 112008086782766-PAT00001
상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기임.

Description

항암 활성을 갖는 화합물을 생성하는 미생물, 이 미생물로부터 생성된 항암 활성 화합물 및 이 화합물을 포함하는 항암 조성물{Microorganism producing an anti-cancer compound, the anti-cancer compound made from the microorganism and an anti-cancer composition comprising the anti-cancer compound}
본 발명은 항암 활성을 갖는 화합물을 생성하는 미생물, 이 미생물로부터 생성된 항암 활성 화합물 및 이 화합물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 해양시료로부터 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물을 생성할 수 있는 방선균을 분리하여 균주를 확립하고, 확립된 균주를 통한 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물의 제조방법을 구체화하여 의약 산업에 적용할 수 있는 항암제 및 항암 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.
암은 현대사회에서 사망률 1위를 차지하는 주요 질병으로 현재까지 많은 연구에도 불구하고 획기적인 치료법이 없는 실정이다. 암의 치료에 있어 항암제와 같은 화학요법제를 이용한 치료는 어느 정도 효과를 거두고는 있으나 암의 다양한 발병기작과 항암제 내성 발현으로 인하여 많은 연구가 요구되고 있다. 현재 임상 에서 사용되고 있는 대표적인 항암제로 독소루비신(doxorubicin), 악티노마이신(actinomycin), 미토마이신(mitomycin)등을 들 수 있으며 이들은 방선균 특히, 스트렙토마이세스 (Streptomyces)에서 생산되는 세포독성물질들이다.
방선균은 항암물질 뿐만 아니라 항생제를 비롯한 생리활성물질의 주요원천으로 알려져있으며 현재에도 많은 연구자들이 방선균으로부터 생리활성물질 탐색을 실시하고 있다. 방선균에 생리 활성이 있는 여러 가지 신물질이 함유되어 있다는 것은 널리 알려진 사실로서, 이를 이용하여 의약품등 산업적으로 활발한 개발이 이루어지고 있다. 본 발명 역시 이러한 연구의 일환으로 신물질을 생성할 수 있는 특히 항암 활성을 갖는 신물질을 생성할 수 있는 방선균을 찾아 그 균주를 확립하여 그 균주를 이용하여 신물질을 개발하고 제조방법을 확립하여 산업적으로 이용가능한 항암 물질 및 항암 조성물과 관련하여 이루어진 것이다.
상술한 바와 같은 필요에 의해 본 발명은 항암 활성을 갖는 화합물을 생성할 수 있는 스트렙토마이세스 속 방선균, 이 스트렙토마이세스 속 방선균으로부터 제조되는 항암 활성 화합물 및 이 항암 활성 화합물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로 본 발명은 해양시료로부터 분리되어 인체 암세포주에 독성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물을 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 속 방선균, 이 스트렙토마이세스 속 방선균의 배양 여액으로부터 추출하여 얻어지는 인돌알칼로이드계 항암 활성 화합물 및 이 항암 활성 화합물을 활성 성분으로 포함하는 항암 조성물의 제공을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 해양시료를 배양하여 얻어지며 항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 스트렙토마이스세스 속 미생물을 제공한다.
본 발명에 따라 항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 스트렙토마이스세스 속 미생물은 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 미생물일 수 있다.
상술한 바와 같은 미생물에 의해 생성되는 항암 활성을 갖는 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물일 일 수 있다.
Figure 112008086782766-PAT00002
상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기임.
또한 본 발명은 항암활성을 갖는 물질로서 상기 화학식 1로 표시되며, 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 해양시료를 배양하여 수득되는 스트렙토마이스세스속 미생물, 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 미생물의 배양액으로부터 얻어질 수 있으며, 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 과정은
해양시료로부터 분리한 스트렙토마이세스 속 미생물을 해수 1L당 Glucose 5g, tryptone 1g, yeast extract 0.5g, beef extract 0.5g을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 변형된 배넷(Bennett) 배지에 배양하여 배양물을 얻는 단계;
상기 배양물을 원심분리하여 균사체와 배양여액으로 분리하는 단계;
상기 분리된 배양여액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하는 단계;
상기 추출한 조추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계;
상기 얻은 농축물을 크로마토그래피로 분획하는 단계;
상기 분획한 분획물을 감압 하에서 증발 건조시킨 후, 필터로 여과하여 불용성 물질이 제거된 농축물을 얻는 단계; 및
상기 불용성 물질이 제거된 농축물을 C18 역상 HPLC로 분리 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 기술적 과제를 달성하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 항암 활성을 갖는 화합물, 구체적으로 인돌알칼로이드계 화합물을 생성할 수 있는 스트렙토마이세스 속 방선균주가 확립되고 이 확립된 균주로부터 항암 활성을 갖는 화합물, 구체적으로 인돌알칼로이드계 화합물을 안정적이고 대량으로 생산하여 의약 산업에 적용할 수 있는 항암제 및 항암 조성물의 제공이 가능하게 된다.
또한 본 발명에 의하는 경우, 해양시료로부터 분리된 방선균으로부터 인체 암세포주에 독성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물을 얻어낼 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 스트렙토마이세스 속 방선균의 배양여액으로부터 추출하여 얻어지는 인돌알칼로이드계 화합물은 인체의 유방암과 폐암 등의 암세포에 대하여 강한 독성을 나타내어, 이를 포함하는 암세포 사멸유도제 및 항암용 의약조성물로 제공되는 것 도 가능하다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 방선균 유래 추출물의 제조는 스트렙토마이세스 속 방선균을 액체배지에서 배양하여 얻은 배양여액을 유기용매로 추출해서 추출물을 얻고, 상기 추출물을 감압 하에서 증발 건조하여 얻은 농출물을 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 이루어지며, 그 물질은 항암활성을 가지는 하기의 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112008086782766-PAT00003
(상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기이다.)
방선균으로부터 상기 화학식 1의 화합물을 분리하는 방법을 구체적으로 보면 방선균을 액체 배지에서 배양하고, 균사체로부터 분리된 배양액을 유기용매로 추출 한 후 용매를 감압 하에서 증발시키며, 농축물을 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명은 스트렙토마이세스 속 방선균으로부터 항암물질을 얻기 위하여, 상기와 같은 분리 추출방법을 이용하였고, 그렇게 함으로써, 상기와 같은 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물을 추출할 수 있었던 것이다.
본 발명에서 사용한 상기 스트렙토마이세스 속 방선균은 해양시료를 배양하여 얻어지는 스트렙토마이세스 속에 속하는 방선균이면 제한없이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명자에 의해 2007년 12월 12일자로 한국미생물보존센터에 미생물 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 미생물(미생물 명칭: Streptomyces sp. 04DH110)을 이용하는 것이 적합하다. 이 균주의 분리 및 분류에 대해서는 추후 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 방선균 유래 추출물의 제조를 더욱 구체적으로 보면
① 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 방선균을 액체배지에서 배양하는 단계;
② 배양물을 원심분리하여 균사체와 배양여액으로 분리하는 단계;
③ 배양여액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하는 단계;
④ 상기와 같이 추출하여 얻어진 조추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계;
⑤ 상기 농축물을 크로마토그래피로 분획하는 단계;
⑥ 각 분획을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계; 및
⑦ 상기 농축물을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계를 포함할 수 있다
상기와 같은 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물에 있어서, R1은 Cl, Br, F, I, COOH, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, (CH2)3CH3 또는 Isobutyl일 수 있고, R2는 H, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, (CH2)3CH3, Isobutyl 또는 CH2Ph일 수 있으며, R3는 H, OH, OCH3, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, (CH2)3CH3 또는 Isobutyl일 수 있고, R4는 H, OH, OCH3, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH(CH3)2, (CH2)3CH3 또는 Isobutyl일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 화학식 1에서 R1 = Cl 이고, R2, R3, R4 는 각각 수소 원자인 경우가 적합하며, 이 경우 상기 인돌알칼로이드계 화합물은 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole일 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 방선균 유래의 항암물질 추출방법의 순서를 나타내는 흐름도이고, 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole을 추출하는 방법을 상세하게 설명하면, 먼저 해양시료로부터 분리한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 방선균을 변형된 배넷(Bennett) 배지(해수 1L당 Glucose 5g, tryptone 1g, yeast extract 0.5g, beef extract 0.5g)에 배양하여 배양물을 얻는 단계(S110);를 거친다. 본 발명에서는 해양시료부터 분리된 방선균을 배양시키기 위해 상기와 같은 변형된 배넷 배지를 사용한 것이 특징이다.
그리고는, 상기 배양물을 원심분리하여 균사체와 배양여액으로 분리하는 단 계(S120); 상기 분리된 배양여액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하는 단계(S130); 상기 추출한 조추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계(S140); 상기 얻은 농축물을 크로마토그래피로 분획하는 단계(S150); 상기 분획한 분획물을 감압 하에서 증발 건조시킨 후, 필터로 여과하여 불용성 물질이 제거된 농축물을 얻는 단계(S160);를 거친다. 이러한 단계는 최종적으로 역상 HPLC로 분리 정제하기 전에, 농축물을 크로마토그래피로 분획한 후 불용성 물질이 제거된 농축물을 얻고자 한 것이다.
그 후에는, 상기 불용성 물질이 제거된 농축물을 C18 역상 HPLC [C18 reversed-phase HPLC, Column: YMC-ODS-A 입자직경 5㎛, 10×250㎜(내경×길이), 이동상 물/Methanol(4.5/5.5), 용출속도 1.5㎖/min, RI detector]로 분리 정제하는 단계(S170)를 거치었다. 이와 같이, 불용성 물질이 제거된 농축물을 C18 역상 HPLC로 분리 정제하면, 본 발명에 따라 항암활성을 가지는 하기의 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물이 추출되는 것이다.
또한 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항암 활성을 갖는 물질로서 상기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물이나 이것의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하며, 또한 항암 조성물로서 상기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물이나 이것의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 즉, 상기와 같은 인돌알칼로이드계 화합물을 포함하는 암세포 사멸 유도제이거나 항암용 의약조성물일 수 있다.
본 목적에 따라 항암 물질 및 항암 조성물의 활성 성분으로서 제공되는 상기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물 및 약학적으로 허용가능한 염의 제조는 특별한 제한없이 없으나 다만, 상술한 바와 같은 본 발명에 따라 해양시료 유래 스트렙토마이세스속 방선균, 바람직하게는 기탁번호 KFCC 11407P 로 기탁된 미생물으로부터 제조된 것일 수 있다.
이어서 본 발명에 따른 균주의 분리 및 분류에 관하여 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 균주는 2004년 동해안의 아야진에서 채취한 해양 퇴적토(sediment)에서 분리하였다. 채취한 퇴적토 약 1g을 멸균된 해수 9 ㎖가 채워진 vial에 넣고 5분 동안 sonification한 후, 60℃ dry oven에서 50분간 열처리하여 일반세균의 증식을 억제하였다.
열처리를 마친 시료를 10-1, 10-2, 10-3으로 순차적으로 희석하여 방선균 분리용 배지인 ISP-2, ISP-4, 변형된 벤넷 배지(modified Bennett's medium)에 0.1ml을 접종하여 골고루 도말하고, 30℃ 배양기에서 14일 동안 배양한 후, 형성된 방선균 집락을 2차 분리용 배지에 재차 streaking하여 분리한 균주를 집락형태를 관찰하여 순수 분리하여, -70℃에 보존하였다.
상기 균주의 형태학적 특징은 변형된 벤넷 배지 및 국제 스트렙토마이세스 프로젝트 배지에서 배양한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 상기 균주는 ISP-1, ISP-2, ISP-4, 변형된 벤넷 배지 등에서 전반적으로 생육이 양호하였으며, 가장 성 장이 종은 배지는 변형된 벤넷 배지였다. 성장 가능 온도 범위는 15~40℃였으며 최적 성장 온도는 25~30℃ 였다. 상기 균주의 벤넷 배지상에서의 배양 3일째의 형태학적 특징은 둥글고 규칙적이며 매트 타입의 균체를 형성하였으며, 기질균사(substrate mycelium)는 주로 연노랑이었으며, 그 위로 흰색 혹은 연보라색의 기중균사(aerial mycelium)를 형성하였고 배면색은 주로 회색 또는 연보라색이었다(도1 참조).
상기 균주는 액체 배양 시에 증류수를 사용하였을 때는 생육이 거의 안 되었으며, 인공해수에서도 성장이 좋았지만 해수를 사용하였을 때 생육이 가장 좋았다(도2 참조). 증류수를 사용하였을 때 잘 생육이 안 된다는 것은 상기 균주가 해양고유의 방선균이거나 해양에 적응된 방선균임을 뜻한다.
상기 균주에 대하여 주사전자 현미경을 사용하여 포자를 관찰한 결과, 포자사슬은 나선형이었으며, 포자표면은 매끄럽고, 특이적인 돌출물을 가지지 않았고, 포자는 원형으로 0.1~0.3 ㎛의 크기였으며, 기질균사는 분절된 형태를 나타내지 않았다(도3 참조).
또한 상기 균주의 동정 및 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였다.
먼저 DNA 추출을 위하여 변형된 벤넷 배지에 3일간 액체배양한 후, 배양액을 원심분리하여 cell을 분리하였으며, genomic DNA 추출과 16S rDNA 유전자의 증폭은 Rainey(Rainey et al., 1996)의 방법을 이용하였다.
상기 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열(1,485 bp)은 CLUSTAL W 소프트웨 어(Thompson, et al., 1994)를 이용하여 align되었으며, MEGA versioin 2.0(Kumar, et al., 2001)을 이용하여 1,000회 반복적으로 bootstrap을 수행하였다. DDBJ/EMBL/GenBank의 database에 등록된 16S rDNA 유전자 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 상동성(homology)을 검색하였다.
그 결과 상기 균주는 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae) NBRC 12773TT (AB184134) 및 스트렙토마이세스 마이크로스포러스(Streptomyces microsporus) NBRC 13678(AB184459)와 100% 상동성을 나타내었다. 이를 바탕으로 이미 분석된 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 균주들의 염기서열을 유전자 은행에서 취하여 MEGA 2.1 package 프로그램을 이용하여 neighbor-joining method(근린결합 방법)로 계통수(phylogenetic tree)를 그렸다(도 4 참조).
이상의 결과로 상기 균주의 형태학적, 배양학적 특성을 종합적으로 검토하고 16S rDNA 염기서열 분석 및 MEGA 프로그램을 이용하여 계통분류를 실시한 결과, 상기 균주를 스트렙트마이세스 에스피.(Streptomyces sp.) 04DH110로 명명하고, 부다페스트 조약에 의거한 미생물 국제 공인 기탁기관인 한국미생물 보존센터에 2007년 12월 12일에 기탁번호 KFCC11407P로 기탁되어 보관중이며, 기탁증을 본 명세서 첨부서류로 첨부한다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 스트렙토마이세스 속 방선균의 배양
2004년 동해에서 채취한 해양 유래의 시료들로부터 분리한 스트렙토마이세스 속 방선균(미생물 기탁번호 : KFCC 11407P, 미생물 명칭: Streptomyces sp. 04DH110)을 멸균된 해수와 glycerol 혼합용액에 현탁 시켜 튜브에 보관하였다. 튜브 안의 방선균을 백금이에 묻혀 배지에 접종하여 배양하였다. 이 종균(seed culture)을 대량배양을 위해 2L Fernbach flask에 10ml씩 가한 후 종균과 동일한 배지(800ml×20)에서 배양하였다. 배지는 변형된 Bennett's 으로써 성분은 (해수 1L당 Glucose 5g, tryptone 1g, yeast extract 0.5g, beef extract 0.5g)이다. 배양조건은 Shaking incubator에서 32℃로 분당 회전 속도 150으로 14일간 배양하였다.
실시예 2: 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole의 분리 정제
상기한 실시예 1에서 얻은 배양액을 고속원심분리기(ultracentrifuge 9000rpm 15분)을 사용하여 배양여액과 균사체로 분리하였다. 분리된 배양 여액은 동일한 양의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 2번 추출하였다. 이 추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 추출물 190㎎을 얻었다. 이 추출물을 역상 진공 플래쉬 크로마토그래피(reversed-phase vacuum flash chromatography)로 분획하였다. 용리 용매는 80%물 / 20%Methanol로 시작하여 Methanol을 20%씩 증가시켰으며, 마지막은 디클로로메탄으로 잔류물질을 세척하였다. 40%물 / 60%Methanol의 분획물을 감압하에서 증발 건조시킨 후 21mg의 농축물을 얻었고, 45%물 / 55%Methanol에 녹인 후 SPARTAN filter로 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 이 농축물을 C18 역상 HPLC [C18 reversed-phase HPLC, Column: YMC-ODS-A 입자직경 5㎛, 10×250㎜(내경×길이), 이동상 물/Methanol(4.5/5.5), 용출속도 1.5㎖/min, RI detector]로 분리하여 물질이 보유시간 53분에서 용출되었다. 최종적으로 분리된 물질의 양은 4㎎ 이었다.
실험예 1: 분리된 물질의 분석
상기와 같은 실시예에 따라 분리된 물질의 분자 구조는 핵자기 공명(NMR), 적외선 및 자외선 분광자료, 고해상도 질량 분석의 분광학적 방법으로 규명하였다. 핵자기 공명 스펙트럼에서 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 시그널과 탄소 핵자기공명(13C-NMR) 시그널에 대한 위치지정(assignment)은 COSY(COrrelation SpectroscopY), 구배 HSQC(Gradient Heteronuclear Single Quantum Coherence), 구배 HMBC(Gradient Heteronucleat Multiple Bond Coherence)의 이차원 핵자기공명 실험을 통하여 규명하였다. 이와 같이 하여 얻어진 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole의 화학식, 물리적 특성 및 분광학적 특성은 아래와 같다.
(1) 분자식: C11H7ClN2O
(2) 분자량: 218
(3) 성상: 노란색의 무정형 고체
(4) optical rotation
[α]25 D = 5.1°( c 0.055 MeOH)
(5) 적외선 흡수대(MeOH)
λ max 1627.67, 1456.96, 1431.89, 1244.83, 1193.72, 1126.23, 1056.8, 927.59, 744.39 ㎝-1
(6) 자외선 흡수대(MeOH)
λ max 215(ε 12300) 271(ε 4900) 287.5(ε 4800)
(7) 1H 및 13C NMR 화학이동(Chemical shift) 지정
하기의 표 1에 나타나 바와 같이 1H와 13C의 값들은 메탄올 d-4용매에서 각각 500㎒와 125㎒에서 측정한 NMR스펙트럼의 결과이다. 화학이동(Chemical shift) 값인 δ 또는 ppm은 내부 기준 물질(internal reference)인 TMS(tetramethylsilane)를 기준(δ=0ppm)으로 사용했을 때, 기준 물질에 대한 상대적인 값을 나타낸다.
Figure 112008086782766-PAT00004
상기의 표 1에 나타난 바와 같이, 5개의 방향족 수소 [δ 8.01 (d, H-4), δ 7.16 (t, H-5), δ 7.23 (t, H-6), δ 7.47 (d, H-7), δ 7.83 (s, H-2)]값과 이들이 결합된 탄소 [δ 121.37 (CH, C-4), δ 121.73 (CH, C-5), δ 123.89 (CH, C-6), δ 112.95 (CH, C-7), δ 125.42 (CH, C-2)]값의 각각에 결합된 탄소는 HSQC를 통해 알 수 있다. 방향족 수소 중 δ 8.01 (d, H-4)과 δ 7.47 (d, H-7)는 ortho-coupled doublet으로 나타났고, δ 7.16 (t, H-5), δ 7.23 (t, H-6)의 수소는 triplet으로 splitting되었다. 이는 4a,7a-disubstituted benzene ring의 존재를 나타낸다. 그리고 δ 7.83 (s, H-2)의 singlet의 수소의 존재로 δ 121.73 (C, C-3)부분이 치환된 인돌임을 알 수 있다. 그리고 수소 δ 8.19 (s H-11)와 이에 결합된 탄소 δ 150.1 (CH, C-11), 그리고 δ 121.6 (C, C-9), δ 145.3 (C, C-8)값은 Heteroaromatic ring으로 oxazole이 존재함을 확인 할 수 있다. 마지막으로 Long-range correlation을 알 수 있는 HMBC를 통해 δ 7.83 (s, H-2)와 δ 145.3 (C, C-8)의 연결을 확인할 수 있다. 그러므로 이 물질은 indole의 C-3위치와 oxazole의 C-8위치가 연결된 구조를 이루고 있음이 규명되었다.
실험예 2: 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole의 활성측정실험
(1) MTT방법
본 발명에 따른 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole의 암세포에 대한 저해 활성(ED50)은 대사과정이 온전한 암세포의 미토콘드리아 효소는 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphen-yl tetrazolium bromide)를 환원시켜 formazan을 형성시킬 수 있음을 근거로 formazan의 농도를 측정함으로써 생존한 세포 수를 간접적으로 측정한다.
본 실험에서는 암세포주(leukemia cell-line , K-562 : 백혈병세포주)에 대하여 활성을 측정하였다.
활성 측정시 시료는 메탄올에 각 농도별로 적정량씩 녹여 1.5㎖ 에펜돌프 튜브(Eppendorp tube)에 분주한 후 사용하였다. 세포 배양을 위해서 실험에 사용될 암세포는 10%FBS(Fetal Bovine Serum)와 페니실린(penicillin)이 들어 있는 RPMΙ 1640배양액을 사용하여 25㎠의 표면적을 갖는 T 플라스크에서 37℃, 5% CO2가 유지되는 배양기 내에서 배양하였다. 세포독성능 측정시에는 세포를 원심 분리하여 세척한 후 새로운 배양액에 2×104 cell/㎖로 부유시켜 사용하였다. MTT 측정법은 다음과 같이 실시하였다. 대수기에 도달한 암세포 배양액을 24웰(well) 플레이트에 1㎖ 접종하고 시료 (4-chloro-5-(3-indol-yl)oxazole)를 각각 10배씩 연속 희석, 0.1㎖씩 첨가하여 최종부피가 1.1 ㎖가 되게 한 후, 37℃, 5% CO2가 유지되는 배양기 내에서 4일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 증류수에 녹인 MTT용액(1㎎/1㎖)을 각각의 웰에 200㎕씩 가해주고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배양 상등액을 제거하고 살아있는 세포의 환원 효소에 의하여 형성된 포르마존(formazan)결정을 500㎕의 DMSO에 녹인 다음 540nm의 광학필터(optic filter)를 이용하여 마이크로플레이트 판독기 (microplate reader)로 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 세포에서는 진한 보라색으로 나타나고 암세포주가 모두 죽은 경우에는 거의 투명한 용액으로 결과가 나타나, 흡광도에 따라 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다.
실험 결과, 세포 내 환원효소에 의한 MTT formazan농도에 따른 생세포수 측정방법으로 측정하였을 때, 본 발명의 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole는 1.051㎍/㎖의 저해활성(ED50)을 나타내었다.
(2) SRB 방법
부유세포나 monolayer세포의 단백질 함량을 측정하여 세포 생존률을 측정한다. 배양세포를 trichloroacetic acid로 고정하고 1% acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) sulforhodamine B(SRB)로 염색한 후 결합 안된 SRB를 1% acetic acid로 충분히 세척하여 단백질과 결합한 SRB를 강알칼리인 10mM unbuffered Tris base(tris(hydroxy-methyl)-aminomethane)로 추출하여 흡광도를 microplate reader로 측정한다. 본 실험은 서로 다른 장기유래 인체 암세포주 MDA-MB-231(Breast), HCT-15(Colon), PC-3(Prostate), NCI-H23(Lung), ACHN(Renal), NUGC-3(Stomach)에 대하여 활성을 측정하였다.
세포성장저해효과의 측정실험은 NCI protocol에 따라서 시행하였다. 세포주를 loading하는 농도는 세포주의 성장속도에 따라서 다르게 한다. 각각의 세포주는 0day에 loading을 한 후에 시료를 처리하는 날에 Time Zero Plate(Tz plate)를 만들어 계산시에 영점으로 한다. 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole을 희석하여 100, 10, 1, 0.1, 0.01(ug/ml)이 되도록 처리한다. 48시간 후에 4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole을 처리한 plate를 50% TCA로 50㎕/well씩 넣어서 고정을 한다. 고정한 plate는 4℃에서 60분간 방치한 뒤 tap water로 4~5번 정도 세척을 한다. 세척한 plate는 건조한 후, 0.4% SRB(Sulforhodamine B) (0.1% acetic acid로 용해한 용액; 단백질의 염색 시약)을 100㎕/well을 가한다. 30분정도 방치한 후에 0.1% acetic acid로 세척을 하여 결합하지 않은 염색시약을 세척한다. 다시, plate를 건조한 후에 10mM Tris Base(pH 10.5)를 100㎕/well를 가하여 염색시약을 용해시키고, 540nm에서 흡광도를 측정한다.
실험결과는 하기의 표 2[4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole의 암세포주 성장억제 농도(GI50)]에 나타난 바와 같다.
Figure 112008086782766-PAT00005
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 명백한 것이다.
본 발명에 따라 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 방선균의 배양여액으로부터 추출하여 얻어지는 인돌알칼로이드계 화합물(4-chloro-5-(3-indolyl)oxazole)은 인체의 유방암과 폐암 등의 암세포에 대하여 강한 독성을 나타내어, 이를 포함하는 암세포 사멸유도제 및 항암용 의약조성물로 제공되는 것도 가능하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 방선균 유래 추출물의 제조방법의 순서를 나타내는 흐름도이다.
도 2는 벤넷 배지에 배양한 후 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 액체 배양시에 증류수, 인공해수, 해수에서 배양 상태를 나타낸 사진이다.
도 4는 균주의 포자 형태를 관찰한 주사전자현미경 스캐닝 모습을 나타낸 사진이다.
도 5는 균주에 대한 계통수 (phylogenetic tree)이다.
<110> korea ocean reserch and development institute <120> Microorganism producing an anti-cancer compound, the anti-cancer compound made from the microorganism and an anti-cancer composition comprising the anti-cancer compound <130> gnp1896 <150> KR10-2008-0012978 <151> 2008-02-13 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1485 <212> DNA <213> Streptomyces sp. 04DH110 <400> 1 caggacgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgatgaac ccacttcggt 60 gggggattag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat ctgccctgca ctctgggaca 120 agccctggaa acggggtcta ataccggata cgaccacttc aggcatctga tggtggtgga 180 aagctccggc ggtgcaggat gagcccgcgg cctatcagct agttggtgag gtaacggctc 240 accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca 300 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga 360 tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa 420 gaagcgaaag tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg 480 gtaatacgta gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc 540 ctgtcacgtc ggatgtgaaa gcccggggct taaccccggg tctgcattcg atacgggcag 600 gctagagttc ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca 660 ggaggaacac cggtggcgaa ggcggatctc tgggccgata ctgacgctga ggagcgaaag 720 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgt tgggaactag 780 gtgtgggcga cattccacgt cgtccgtgcc gcagctaacg cattaagttc cccgcctggg 840 gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag 900 catgtggctt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat acaccggaaa 960 cacccagaga tgggtgcccc cttgtggtcg gtgtacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc 1020 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc ccgtgttgcc 1080 agcaggccct tgtggtgctg gggactcacg ggagaccgcc ggggtcaact cggaggaagg 1140 tggggacgac gtcaagtcat catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg 1200 ccggtacaaa gagctgcgat accgcaaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc ggtctcagtt 1260 cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc 1320 attgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc 1380 ggtaacaccc gaagccggtg gcccaacccc ttgtgggagg gagctgtcga aggtgggact 1440 ggcgattggg acgaagtcgt aacaaggtag ccgtaccgga aggtg 1485

Claims (11)

  1. 해양시료를 배양하여 얻어지며 항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 스트렙토마이스세스 속 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속 미생물이 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 것을 특징으로 하는 스트렙토마이스세스 속 미생물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항암 활성을 갖는 물질이 하기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이스세스 속 미생물.
    [화학식 1]
    Figure 112008086782766-PAT00006
    상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기임.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
    [화학식 1]
    Figure 112008086782766-PAT00007
    상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기임.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 해양시료를 배양하여 수득되는 스트렙토마이스세스속 미생물의 배양액으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces) 미생물이 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 것을 특징으로 하는 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 스트렙토마이스세스속 미생물의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 과정이
    해양시료로부터 분리한 스트렙토마이세스 속 미생물을 해수 1L당 Glucose 5g, tryptone 1g, yeast extract 0.5g, beef extract 0.5g을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 변형된 배넷(Bennett) 배지에 배양하여 배양물을 얻는 단계;
    상기 배양물을 원심분리하여 균사체와 배양여액으로 분리하는 단계;
    상기 분리된 배양여액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하는 단계;
    상기 추출한 조추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계;
    상기 얻은 농축물을 크로마토그래피로 분획하는 단계;
    상기 분획한 분획물을 감압 하에서 증발 건조시킨 후, 필터로 여과하여 불용성 물질이 제거된 농축물을 얻는 단계; 및
    상기 불용성 물질이 제거된 농축물을 C18 역상 HPLC로 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 활성을 갖는 인돌알칼로이드계 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 인돌알칼로이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112008086782766-PAT00008
    상기 화학식 1에서, 상기 R1, R2, R3 및 R4는 각각 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 할로겐 원자, 수산기 또는 카르복실기임.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 해양시료를 배양하여 수득되는 스트렙토마이스세스 속 미생물의 배양액으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 속 미생물이 기탁번호 KFCC 11407P로 기탁된 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 스트렙토마이스세스속 미생물의 배양액으로부터 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는 과정이
    해양시료로부터 분리한 스트렙토마이세스 속 미생물을 해수 1L당 Glucose 5g, tryptone 1g, yeast extract 0.5g, beef extract 0.5g을 포함하여 이루어진 것 을 특징으로 하는 변형된 배넷(Bennett) 배지에 배양하여 배양물을 얻는 단계;
    상기 배양물을 원심분리하여 균사체와 배양여액으로 분리하는 단계;
    상기 분리된 배양여액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하는 단계;
    상기 추출한 조추출액을 감압 하에서 증발 건조하여 농축물을 얻는 단계;
    상기 얻은 농축물을 크로마토그래피로 분획하는 단계;
    상기 분획한 분획물을 감압 하에서 증발 건조시킨 후, 필터로 여과하여 불용성 물질이 제거된 농축물을 얻는 단계; 및
    상기 불용성 물질이 제거된 농축물을 C18 역상 HPLC로 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
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