KR20090060381A - 시험관내 미세기관 및 이에 관련된 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특이적 특징이 있는 분리된 세포 집단을 포함하는 미세기관 배양물을 기술한다. 본 발명의 미세기관 배양물의 주요 특징은 비교적 오랜 기간 동안 배양물에 유지되는 능력은 물론, 원료 기관에서 나타나는 것과 유사한 세포-세포 상호작용 및 세포-간질 상호작용 등을 용이하게 하는 기관 미세구조의 보존을 포함한다. 본 발명의 미세기관 배양물은 피검 수용체로의 유전자 산물의 전달 방법, 세포 증식제 및 세포 분화제 동정 방법 및 선조 세포와 줄기 세포의 동정 및 분리 방법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 미세기관 배양물은 세포 증식, 세포 분화 및 바이러스 감염성에 대한 억제제를 동정하는 방법에 사용할 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명의 미세기관 배양물은 이식에 사용할 수 있다.

미세기관 배양물, 체외이식편, 세포증식제, 세포분화제, 선조세포, 줄기세포, 이식

Description

시험관내 미세기관 및 이에 관련된 용도{IN VITRO MICRO-ORGANS, AND USES IN RELATED THERETO}

본 발명은 시험관내 미세기관 및 이에 관련된 용도에 관한 것이다.

진핵세포 배양물이 최초로 수득된 것은 1950년대 초였다. 그 이후로, 각종 형질전환 세포 및 원시 세포가 각종 배지와 규정 보충물, 예컨대 성장 인자 및 호르몬 등과 미규정 보충물, 예컨대 혈청 및 기타 다른 체내 추출물을 이용하여 배양되었다. 예를 들어, 동물의 피부에서 수득한 섬유아세포는 핵형적으로 이배체인 세포로서 다양한 세포 세대를 통해 관례적 방식으로 배양하거나 또는 확립된 세포주로서 관례적 방식으로 무한 배양할 수 있다. 하지만, 상피세포는 섬유아세포와 다른 형태적 성질과 증식성을 보유하여 배양하기가 더 어렵다. 더욱이, 상피세포와 섬유아세포를 동일 배양물에서 증식시키면, 일반적으로 상피세포는 섬유아세포에 비해 과증식한다.

2차원적 세포 증식은 높은 세포 증식율을 제공하여 배양물 상태로 세포를 준비, 관찰 및 연구하기에 편리한 방법이지만, 생체내 전체 조직의 특징적인 세포-세포 및 세포-간질 상호작용을 알 수는 없다.

이러한 기능적, 형태적 상호작용 연구를 위해 몇몇 연구자들은 콜라겐 겔(Douglas et al., (1980) In Vitro 16:306-312; Yang et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3401; Yang et al. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci. 77:2088-2092; Yang et al.,(1981) Cancer Res. 41:1021-1027); 셀룰로스 스폰지 단독형(Leighton et al.,(1951) J. Natl. Cancer Inst. 12:545-561) 또는 콜라겐 코팅형(Leighton et al.,(1968) Cancer Res. 28:286-296); 젤라틴 스폰지, 젤폼형(Sorour et al.,(1975) J.Neurosurg. 43:742-749)과 같은 3차원 기재를 이용하였다.

상피세포를 컴피턴트 클론화 방식으로 증식시키기 위하여 각종 배양 조건을 이용하였다. 예를 들어, 상피세포, 구체적으로 피부 상피세포(각질세포)를 치사량의 광조사된 섬유아세포의 영양세포층(Rheinhardt et al. (1975) Cell 6:331-343) 및 반합성 콜라겐 기질(미국 특허 제5,282,859호; 유럽 특허출원번호 0361957) 상에서 배양하였다. 몇몇 경우에는 이와 같은 세포의 증식에 사용된 배지에 뇌하수체 추출물과 혈청 등의 생물학적 추출물 및 상피세포 성장 인자, 인슐린 등의 성장 보충물 등을 첨가하여 사용하기도 하였다(Boisseau et al.(1992) J. Dermatol. Sci 3(2): 111-120; 미국 특허 제5,292,655호).

시험관내에서 피부를 증식시키기 위하여 수많은 시도가 수행되었다. 이와 같은 시도들은 일반적으로 상피에 있는 각질세포를 진피에 있는 섬유아세포 및 지방세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 분리 후, 각질세포는 일반적으로 층화된 상피를 형성시키는 방식으로 증식시킨다. 하지만, 이와 같은 방식으로 제조된 상 피에는 모낭과 땀샘이 없다. 더욱이 이 세포 배양물에는 상피와 진피 사이의 자연적인 관계가 보존되지 않는다. 또한, 비생육성 섬유아세포 상에서 각질세포를 증식시키는 방법(Rheinwald wt al.(1975) Cell 6:331-343) 또는 합성된 것이거나 진피와는 다른 근원에서 유래한, 콜라겐과 섬유아세포의 피부 기질 상에 각질세포를 제공하는 방법(Sugihara et al.(1991) Cell.Dev.Biol. 27:142-146; Parenteau et al. (1991) J. Cell Biochem. 45(3): 245-251) 등의 배양 방법들도 수행되었다. 그러나, 몇몇 경우에는 각질세포 분리가 수행되지 않고 전체 기관이 배양되었다. 기관을 시험관내 배양하는 시도는 혈청함유 배지에서 기관을 배양한 경우만 있었다(Li et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. 88(5):108-112).

진피의 시험관내 모델에 존재하는 대부분의 진피에는 모낭, 땀샘 및 피지샘이 없다(상피세포 배양물 검토를 위해 Coulomb et al.(1992) Pathol.Biol.Paris 40(2): 139-146). 예외적으로, 2x5㎟ 및 2.0mm 두께의 크기를 가진 피부 체외이식편이 혈청 함유 배지의 존재하에 수일 동안 생육성을 유지한 겔-지지성 피부 모델이 제시된바 있다(Li et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:8764-8768).

생물반응기 및 기타 다른 포유동물 세포 배양 방법은 세포 손상의 단점 외에도 세포를 본래 유기체에 존재하는 실제 조직의 공간적 3차원 형태와 유사한 조직으로 조합할 수 있는 조건을 마련하기 위한 능력 부족으로 인해 매우 제한적이었다. 이와 같은 이유로, 종래의 조직 배양 방법은 배양된 조직을 포유동물 세포 분화에 중요 요소로 사료되는 기능적으로 고도 세분화되거나 분화된 상태로 발현시키는 능력 및 연구중이며 약학적 당해 물질인 세분화된 생물학적 활성 분자의 분비 등에 한계가 있다. 미생물과 달리 포유동물과 같은 고등 유기체의 세포는 스스로 고차원의 다세포 조직을 형성한다. 이와 같은 자가조립의 정확한 기작은 알려져 있지 않지만, 지금까지 연구된 실례를 보면, 세포의 조직으로의 발달이 세포의 서로(동종 세포 또는 이종 세포)에 대한 배향 또는 다른 고착 기질에 대한 세포의 배향 및/또는 특정 물질(인자), 예컨대 호르몬, 자가분비인자 또는 주변분비인자 등의 존재 또는 부재에 따라 달라지는 것을 알 수 있었다. 이를 요약해보면, 충분히 낮은 전단응력, 충분한 3차원 공간 자유도 및 생체내 조직 구조의 훌륭한 모델링을 허용하기에 충분히 긴 중요 세포 상호작용(세포 상호간 또는 세포와 기질간) 기간을 동시에 달성할 수 있는 종래의 배양 방법은 없다.

따라서, 배양물의 세포가 그들 본래의 세포간 관계를 오랜 시간 동안 보존하는 배양물에서 기관 일부를 발생 및 유지시키는 시험관내 방법이 요구된다. 이와 같이 세포 분화, 세포 증식 및 세포 기능이 생체내 전체 기관에서 관찰되는 것과 유사한 조직 및 기관 모델의 이용가능성은 기관이 건강한 상태로 유지되는 기작과 이에 따라 비정상적 과정이 복원될 수 있는 방법을 이해하는데 유용하게 사용될 것이다.

본 발명은 전술한 요구를 해결하는 시험관내 미세기관 배양물(in-vitro micro-organ culture)을 제공한다. 대상 미세기관 배양물의 주요 특징으로는 비교적 오랜 시간, 예컨대 적어도 약 24시간, 바람직하게는 적어도 7일 이상 동안 배양물에서 유지되는 능력은 물론, 근원 기관에서 나타나는 것과 유사한 세포-세포 상호작용 및 세포-간질 상호작용 등을 용이하게 하는 기관 미세구조의 보존을 포함한다.

일반적으로, 미세기관 배양물의 세포 집단 중에서 적어도 하나의 세포는 증식성을 가진 것이다. 미세기관 배양물에 존재하는 세포 집단은 전체적으로 평형 상태, 즉 세포 집단 내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 대략 1이거나, 또는 미세기관 배양물 중의 세포가 소실되는 것보다 더 빠른 속도로 증식하여, 즉 예컨대 종양 조직에서 수득되는 세포 집단이나 체외이식편에서 증식하도록 유도된 선조 세포 집단에서와 같이 세포 집단내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1을 초과하는 것일 수 있다.

미세기관 배양물의 세포를 분리할 수 있는 바람직한 기관으로는 림프성 기관, 예컨대 흉선 및 비장; 소화관 기관, 예컨대 위, 간, 췌장, 담낭 및 담관; 폐; 생식 기관, 예컨대 전립선 및 자궁; 유방, 예컨대 유선; 피부; 요로기관, 예컨대 방광 및 신장; 각막; 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등이 있다. 미세기관 배양물의 분리된 세포 집단은 일 구체예에서는 중합체 장치, 예컨대 세포 또는 세포 산물, 예컨대 유전자 산물을 대상에게 전달하기 위한 장치에 캡슐화할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 미세기관 배양물 유래의 합성 배지에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 미세기관 배양물은 기관의 절편인 세포의 집단을 포함한다. 바람직하게는, 미세기관 체외이식편은 상피 및 결합조직 세포를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 기관 체외이식편은 췌장에서 수득한 것으로, 예를 들어 세포 집단의 미세구조는 체외이식편이 유래하는 본래 췌장의 미세구조와 거의 동일하며, 췌장의 상피세포, 예컨대 섬세포 및 췌장의 결합조직 세포를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 체외이식편은 피부에서 수득한 것으로서, 예를 들어 세포 집단의 미세구조는 생체내 피부의 미세구조와 거의 동일하며, 피부 상피세포, 예컨대 표피세포와 피부 결합조직 세포, 예컨대 피부 세포를 포함한다. 피부 체외이식편에서 수득되는 미세기관 배양물은 또한 표피 세포를 지지하는 바닥판, 피부 세포를 포함하는 세포외기질 및 적어도 하나의 함입, 예컨대 적어도 하나의 모낭 또는 샘을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 배양물은 바이러스, 예컨대 간염바이러스, 구체적으로 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 또는 인간 유두종 바이러스(HPV), 예컨대 HPV-6, HPV-8 또는 HPV-33으로 감염된 세포의 분리된 집단을 포함한다. 바이러스 감염시, 미세기관 배양물은 바이러스 감염성의 억제제를 동정하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은 본 발명의 방법에 따라 미세기관 체외이식편을 분리하는 단계를 포함하는데, 여기에서 체외이식편은 바이러스 감염 기관에서 분리 되는 것이거나 또는 시험관내에서 바이러스로 후속적으로 감염되어 바이러스 감염 세포의 집단을 생성하는 것이다. 이 체외이식편은 그 다음 후보 제제, 예컨대 항바이러스 활성을 시험하기 위한 제제와 접촉시키고, 이 후보 제제의 존재하에 나타나는 감염성 레벨(예컨대 바이러스 장입량, 신규 감염성 등)을 측정한 뒤 상기 후보 제제의 부재하에 바이러스에 의해 나타나는 감염성 레벨과 비교한다. 후보 제제의 존재하에 나타나는 바이러스 감염성 레벨의 감소는 바이러스 감염성의 억제제임을 시사하는 것이다.

또한, 본 발명은 미세기관 배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 포유동물 다른 공여자로부터, 적어도 약 24시간 동안 최소 배지에서 유지가능한 것으로서 분리된 세포 집단을 제공하는 크기를 보유한 미세기관 체외이식편을 분리하는 단계를 포함한다. 그 다음 이 미세기관 체외이식편을 배양물에 주입한다. 일반적으로, 상기 체외이식편은 이 체외이식편이 분리된 기관의 미세구조를 보유한 분리된 세포 집단을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 체외이식편의 적어도 하나의 세포는 증식성이 있는 것이다. 본 발명의 미세기관 배양물의 세포는 평형 상태, 즉 세포 집단 내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1이거나, 또는 미세기관 배양물 중의 세포가 소실되는 것보다 더 빠른 속도로 증식하여, 즉 종양 조직에서 수득한 세포 집단 등과 같이 세포 집단내 세포 소실에 대한 세포 증식의 비가 1을 초과하는 것일 수 있다.

미세기관 배양물의 세포를 분리할 수 있는 바람직한 기관으로는 림프성 기관, 예컨대 흉선 및 비장; 소화관 기관, 예컨대 위, 간, 췌장, 담낭 및 담관; 폐; 생식 기관, 예컨대 전립선 및 자궁; 유방; 피부; 요로기관, 예컨대 방광; 신장; 각막; 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등이 있다. 이러한 예들에서, 기관의 미세구조는 배양된 체외이식편에서 모두 유지되어야 한다. 이러한 미세기관 배양물은 조직 절편, 예컨대 β섬세포를 포함하는 췌장 조직 절편, 표피 및 진피 세포와 다른 피부 특이적 구조 특징, 예컨대 모낭을 포함하는 피부 조직 절편일 수 있다.

미세기관 체외이식편에 존재하는 세포는 또한 이 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 발현되거나 발현되지 않을 수 있는 재조합 단백질을 발현하도록 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 췌장에 의해 정상적으로 생산되고 본 유전자도입(transgenic) 방법에 의해 증대(예컨대 결핍증을 보충하기 위함)될 수 있는 유전자 산물로는 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A₂, 엘라스타제, 아밀라제 등이 있고, 간에서 일반적으로 생산되고 대체 유전자 요법에 의해 보충될 수 있는 유전자 산물로는 혈액 응고 인자, 예컨대 혈액 응고 인자 VIII 및 IX, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소 등이 있고, 흉선에 의해 일반적으로 생산되는 유전자 산물로는 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1이 있다.

본 발명의 미세기관 배양물은 다른 수용자에게 유전자 산물을 전달하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은 공여자로부터, 세포가 분리되는 기관이나 조직의 미세구조를 보유하고 적어도 약 24시간 이상 동안 최소 배지에서 유지가능한 분리된 세포 집단을 제공하는 표면적 대 부피를 보유한 분리된 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 그 다음, 이 세포 집단에는 미세기관 체외이식편에서 트랜스제닉 세포 집단, 예컨대 트랜스제닉 체외이식편을 생성시키기 위하여 목적 유전자 산물을 코딩하고 발현 유도하는 재조합 핵산을 도입시킨다. 그 후, 이 트랜스제닉 체외이식편을 수용자에게 투여할 수 있다. 공여자와 수용자는 동종이거나 이종일 수 있다.

본 발명의 미세기관 배양물은 또한 소정 기관의 세포, 예컨대 선조 세포의 증식을 유도하는 제제를 동정하는 방법에 사용할 수도 있다. 이 방법은 본 발명에 따라서 증식력이 있는 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세기관 체외이식편 배양물을 생산하는 단계를 포함한다. 이 체외이식편은 배양 후 후보 화합물, 예컨대 세포 증식능을 시험할 화합물과 접촉시킨 다음, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨을 측정한다. 그 다음 후보 화합물의 부재하에 측정한 세포 증식의 레벨을 후보 화합물의 존재하에 측정한 세포 증식의 레벨과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 나타나는 세포 증식 레벨의 증가는 세포증식제임을 시사한다. 세포 증식 억제제도 이와 같은 방식으로 동정할 수 있다. 구체적으로, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 측정된 레벨을 전술한 방법에 따라 측정한 경우, 후보 화합물의 부재하에 세포 증식의 레벨과 비교할 수 있다. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨의 감소는 세포증식 억제제임을 시사한다.

본 발명의 미세기관 배양물을 사용할 수 있는 다른 방법으로는, 소정 기관에 존재하는 1종 이상의 세포 분화를 유도 또는 억제하는 제제, 또는 특정의 분화 상태를 유지(탈분화 방지)하는 제제를 동정하는 방법이 있다. 이 방법은 당해 기관으로부터 미세기관 체외이식편을 제조하는 단계를 포함하며, 이때 체외이식편을 구성하는 세포 집단은 하기 기술되는 바와 같은 상기 기관의 미세구조, 약 1.5mm^-1 이상의 알레프를 보유하고, 분화하는 능력을 보유하거나 또는 분화 상태로서 탈분화하는 능력을 보유한 적어도 하나의 세포를 포함한다. 배양 상태가 된 즉시 세포 집단은 후보 화합물과 접촉시키고 이 화합물의 존재하에 세포 분화 레벨을 측정한다. 후보 화합물의 존재하에 측정된 세포 분화 레벨을 후보 화합물의 부재하에 측정된 세포 분화 레벨과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 나타나는 세포 분화 레벨의 증가는 세포분화제임을 시사하는 것이다. 세포 분화 억제제도 이와 같은 방식으로 동정할 수 있다. 구체적으로, 후보 화합물의 존재하에 측정된 세포 분화 레벨을 전술한 방법에 따라 측정한 경우, 후보 화합물의 부재하에 측정된 세포 분화 레벨과 비교할 수 있다. 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 레벨의 감소는 후보 화합물이 세포 분화 억제제임을 시사하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 기관으로부터 줄기 세포 또는 선조세포 집단을 동정 및 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 기관으로부터 세포 집단의 체외이식편을 배양물 상태로 분리하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 체외이식편은 (i) 체외이식편이 유래하는 기관의 미세구조를 배양물 상태에서 유지하는 능력, (ii) 적어도 약 1.55mm^-1 이상의 표면적 대 부피 지수(알레프), 및 (iii) 증식능이 있는 적어도 하나의 선조세포 또는 줄기세포를 특징으로 한다. 이 체외이식편을 선조 세포 또는 줄기 세포의 증식을 유도하는 제제, 예컨대 성장 인자 또는 다른 유사분열인자와 접촉시켜 체외이식편에 존재하는 분리된 세포 집단을 증폭시킨다. 그 다음, 체외이식편으로부터 증폭된 선조 세포를 분리할 수 있다. 이와 같은 체외이식편의 2차 집단은 이 집단의 증식 반응을 통해 확인할 수 있다. 다른 구체예로서, 선조세포/줄기세포는 외인성 제제를 첨가하지 않아도 배양물 중에서 자발적으로 증식할 것이다. 다른 구체예로서, 상기 외인성 제제에 대한 반응으로 증식하는 체외이식편 유래의 선조세포 또는 줄기세포의 분리는 예컨대 체외이식편에서 새로 발생하는 아체(bud)를 직접 기계식 분리하거나 체외이식편 전체 또는 일부를 용해시킨 뒤 증폭된 세포 집단을 분리하는 등의 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 미세기관 배양물을 사용할 수 있는 또 다른 방법으로는 수용자의 상처 치유를 촉진시키는 방법이 있다. 이 방법은 공여자로부터 적어도 약 1.5mm^-1 이상의 알레프를 보유하는 세포 집단을 분리한 뒤 이 세포 집단을 수용자의 상처에 적용하는 것을 포함한다. 공여자와 수용자는 동종이거나 이종일 수 있다. 일 구체예에서, 세포가 분리되는 조직은 피부이고 수용자의 상처는 궤양, 예컨대 당뇨병 관련 궤양인 것이다.

본 발명의 실시에는 별다른 기재가 없는 한 통상적인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자도입 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 방법들이 사용될 것이며, 이는 당업자라면 실시가능한 것이다. 이와 같은 방법들은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 그 예로서 다음과 같은 문헌을 참조할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II(D.N.Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed., 1984); Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells(R.I.Freshney, Alan R. Liss, Inc., N.Y.); Gene Trasfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); and Handbook of Experimental Imunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986).

본 발명의 다른 특징과 장점은 하기 상세한 설명과 특허청구범위로부터 분명하게 알 수 있을 것이다.

본 발명은 3차원 기관 체외이식편 배양 시스템에 관한 것이다. 이 배양 시스템은 생체내 전체 기관에서 발견되는 것과 거의 유사한 환경에서 시험관내 미세기관 체외이식편의 장기간 증식에 사용할 수 있다. 본 명세서에 기술한 배양 시스 템은 생체내 대응 기관과 유사한 구조를 유지하도록 증식 및 적당한 세포 성숙을 제공한다.

본 발명의 미세기관 배양물은 조직 또는 기관 절편을 유지할 수 있고, 그 절편의 기능을 장기간 동안 보존할 수 있는 시험관내 배양 시스템을 제공한다. 이와 같은 배양 시스템은 세포 분화, 세포 증식, 세포 기능 및 상기 세포 특징과 기능을 변화시키는 방법을 용이하고 정확하게 시험할 수 있는 시험관내 모델을 제공한다. 그 결과 얻어지는 배양물은 생체내 이식에서부터 시험관내에서의 세포독성 화합물 및 약학적 화합물의 선별, "생물반응기"에서 생물학적 활성 분자의 생산 및 조직으로부터 선조세포의 분리에 이르기까지 다양한 용도에 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 특정 구체예로는 (i) 화학치료 요법 동안 파괴될 골수를 대체하는데 사용하는 미세기관 골수배양 이식물; (ii) 경화증 환자에서 간 기능을 증대시키는데 사용하는 미세기관 간 이식물; (iii) 피검 미세기관 배양물에서 증식된 유전자 변형 세포(예컨대 인슐린을 코딩하는 재조합 유전자를 발현하는 췌장 미세기관); (iv) 구강 점막의 미세기관 배양물에 결합시킨 치과보철물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

또 다른 비제한적 구체예로서, 대상 미세기관 배양물은 다양한 화합물, 예컨대 세포독성 화합물, 성장/조절 인자, 약학적 제제 등을 선별하기 위하여 시험관내에서 사용할 수 있다. 이 목적을 위해 미세기관 배양물은 시험관내 유지시킨 뒤 시험할 화합물에 노출시킨다. 세포독성 화합물의 활성은 예컨대 체외이식편에 존재하는 세포의 손상 또는 사멸 능력을 통해 측정할 수 있다.

이 활성은 생생한 염색 기법을 통해 용이하게 평가할 수 있다. 성장/조절 인자는 체외이식편의 세포 함유물, 예컨대 총 세포수, 및 분화 세포 수를 분석하여 평가할 수 있다. 이 평가는 형별 특이적 세포 항원을 규정하는 항체를 이용한 면역세포화학 기법의 사용 등을 포함하는 표준 세포학적 및/또는 조직학적 기법으로 수행할 수 있다. 3차원 시스템에서 배양된 정상 세포에 미치는 각종 약물의 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 적혈구 형성을 증가시키는 약물은 골수 미세기관 배양물을 가지고 시험할 수 있다. 콜레스테롤 대사에 영향을 미치는 약물(예컨대 콜레스테롤 생산을 저하시킴으로써)은 간 미세기관 배양물을 가지고 시험할 수 있다. 이상 조직의 미세기관 배양물 역시 예를 들어 과증식 또는 신생증식 질환 연구의 용이성을 도모하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 증식이 일어난 미세기관 체외이식편은 예컨대 항종양제 효능을 시험하기 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있다.

본 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에 사용되고 있는 일부 용어들은 편리하게 알 수 있도록 이하에 모아서 설명하였다.

"체외이식편"이란 용어는 신체에서 분리하여 합성 배지에서 증식시킨 기관 유래의 세포 집합물을 의미한다. 간질 성분과 상피 성분을 모두 보유하는 기관 유래의 체외이식편이란 일반적으로 상기 기관 유래의 단일 체외이식편에 상기 두 성분을 모두 포함하는 체외이식편을 의미한다.

"조직"이란 용어는 특정 특이 기능을 함께 수행하는 유사하게 세분화된 세포 그룹 또는 층을 의미한다.

"기관"이란 용어는 미세구조를 형성하기 위하여 세포-세포 및/또는 세포-간질 상호작용의 일부 형태를 유지하는 2종 또는 그 이상의 인접 층으로 이루어진 조직을 의미한다. 따라서, 본 발명에 있어서 미세기관 배양물은 예컨대 포유동물 피부, 포유동물 췌장, 간, 신장, 십이지장, 식도, 방광, 각막, 전립선, 골수, 흉선 및 비장 등의 기관으로부터 제조하였다.

"간질"이란 용어는 기관의 지지 조직 또는 기질을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "미세기관 배양물"이란 용어는 세포가 분리된 기관 또는 조직의 미세구조를 보유한 분리된 세포 집단, 예컨대 체외이식편을 의미한다. 즉, 분리된 세포는 공간 상호작용, 예컨대 세포-세포, 세포-기질 및 세포-간질 상호작용 및 체외이식편이 유래하는 본래 유기체 및 실제 조직의 배향을 모방/유지하는 3차원 구조를 함께 형성한다. 따라서, 간질층과 상피층 사이와 같은 상기 상호작용이 체외이식된 조직에서 보존되어 중요한 세포 상호작용을 통해 예컨대 체외이식편의 생물학적 기능을 유지하는 자가분비인자, 주변분비인자 및 다른 세포외 자극을 구비하고 적당한 영양소와 폐기물 수송이 샘플을 통해 일어나는 조건하에서 장기 생존능을 얻을 수 있다.

대상 미세기관 배양물은 세포 또는 조직 체외이식편이 분리된 기관 또는 조직의 미세구조를 보유한다. 본 명세서에 사용된, "미세구조"란 용어는 세포 집단의 세포 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 그 이상의 세포가 생체내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접해있는 적어 도 1종 이상의 세포 물질 또는 비세포 물질과 시험관내에서 물리적 및/또는 기능적으로 접한 상태를 유지하며 적어도 약 1층, 보다 바람직하게는 적어도 약 5층, 가장 바람직하게는 적어도 약 10층 이상의 세포 배양물을 형성하는, 분리된 세포 집단 또는 조직 체외이식편을 의미한다. 바람직하게는, 체외이식편의 세포가 분리된 기관 또는 조직의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 것이 좋다.

본 명세서에 사용된 "분리된"이란 용어는 유기체 내의 자연 환경에서 분리된 체외이식편을 의미하는 것이다. 이 용어는 자연 환경으로부터의 전체적인 물리적 분리, 예컨대 공여 동물, 예컨대 인간이나 축소 돼지와 같은 포유동물로부터의 제거를 포함한다. 예를 들어, "분리된"이란 용어는 체외이식편이거나, 체외이식편의 일부로서 배양되거나 또는 체외이식편의 형태로 이식된 세포 집단을 의미한다. 세포 집단을 의미하는 것으로 사용했을 때, "분리된"이란 용어는 본 발명의 미세기관 배양물에서 세포의 증식으로부터 얻어지는 세포 집단을 포함한다.

"외세포층"이란 용어는 배아의 원시 배 3층 중 최외각을 의미하는 것으로서, 이로부터 표피 및 표피 조직, 예컨대 손톱, 머리 및 피부 샘, 신경계, 외부 감각 기관, 구강 및 항문의 점막 등이 유도된다.

"상피"란 용어는 내부 및 외부 체표면(피부, 점막 및 혈청)의 세포 외피 및 이로부터 유도된 샘 및 기타 다른 구조, 예컨대 각막세포, 식도세포, 표피세포 및 모낭 상피세포 등을 포함한다. 다른 상피조직의 예로는, 비강의 후각 영역 안에 존재하고 후각 수용체를 함유하는 의사층화된 상피인 후각 상피; 분비 세포로 구성된 상피를 의미하는 샘 상피; 편평화된 판상 세포로 구성된 상피를 의미하는 편평 상피를 포함한다. 상피란 용어는 또한 수축과 팽창으로 인해 현저한 기계적 변화를 겪는 중공의 기관 안에서 특징적으로 발견되는 전이성 상피, 예컨대 층화된 편평 상피와 원주형 상피 간의 전이를 나타내는 조직을 의미할 수도 있다. "상피화"란 용어는 박피 표면상에서 상피 조직의 성장에 의한 치유를 의미한다.

"피부"란 용어는 진피와 표피로 구성된 신체의 외측 보호용 외피를 의미하는 것으로, 땀샘 및 피지샘은 물론 모낭 구조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서를 통해 "피부성"이란 용어도 사용하였는데, 이는 이 용어가 사용된 문장에 적절하게 피부의 속성을 나타낸 것으로 이해되어야 한다.

"표피"란 용어는 배아의 외세포층에서 유래된, 피부의 최외각 비혈관계 층을 의미하는 것으로서, 두께가 0.07mm에서부터 1.4mm로 다양하다. 손바닥 및 발바닥 표면상에서, 표피는 내부로부터 외측으로 5개의 층, 즉 수직 배열된 원주 세포로 이루어진 기저층, 짧은 돌기 또는 가시를 가진 편평화된 다면체 세포로 이루어진 극세포 또는 가시모양 층, 편평화된 과립 세포로 이루어진 과립 층, 핵이 뚜렷하지 않거나 존재하지 않는 투명한 투과 세포의 여러 층으로 이루어진 투명 층, 및 편평화된 각화 비핵 세포로 이루어진 각질 층을 포함한다. 일반적으로 체표면의 표피에는 투명층은 보통 존재하지 않는다. "표피유사"는 표피와 유사한 세포 또는 조직이지만, 비피부 부위에서 발생하고 표피 인자의 함유로 형성되는 모든 종양을 의미하는데 사용할 수도 있다.

"진피"는 표피 아래에 깊이 존재하는 피부 층을 의미하는 것으로서, 혈관 결합 조직의 치밀한 바탕으로 이루어지고 신경과 감각 말단 기관을 포함한다. 모근, 피지샘 및 땀샘이 진피 내에 깊이 매립되어 있는 표피의 구조물이다.

"샘"이란 용어는 정규 대사적 요구에 관계없이 물질을 분비하는 전문적인 세포 집합체를 의미한다. 예를 들어, "피지샘"은 유상 물질과 피지를 분비하는 진피내의 완전분비 샘이다. "땀샘"이란 용어는 체표면 상의 관에 의해 열리는, 땀을 분비하고, 진피 또는 피하 조직내에 위치한 샘을 의미한다. 보통의 샘 또는 외분비땀샘은 체표면의 최외층 상에 분포하여 분비물의 증발로 냉각을 촉진하고; 아포크린 땀샘은 피부 상에 직접 비워지지 않고 모낭 상부로 비워지고 항문 주위와 겨드랑이내와 같은 특정 신체 영역에서만 발견되는 것이다.

"모" (또는 "털")란 용어는 사상 구조, 구체적으로 각질으로 이루어지고 진피내에 함입된 유두에서 발생하며 포유동물에 의해서만 생산되고 그 그룹의 동물에 특징적인 세분화된 표피 구조를 의미한다. 이 용어는 또한 이러한 모의 집합물의 의미하기도 한다. "모낭"이란 모를 에워싸는 표피의 관상 함입부의 하나로서, 이로부터 모가 자라난다. "모낭 상피세포"란 모낭내의 진피에 의해 둘러싸인 상피 세포, 예컨대 줄기세포, 외근 외장세포, 기질세포 및 내근 외장세포를 의미한다. 이와 같은 세포는 비악성의 정상 세포이거나 형질전환/무한증식성 세포일 수 있다.

"탈모증"은 일반적으로 대머리, 예컨대 정상적으로 존재하는 피부 영역에 모가 없는 것을 의미한다. 탈모증의 다양한 형태가 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 원형탈모증은 보통 수염이나 두피를 포함하는 매우 분명한 영역에서, 보통 가역성인 모발 상실을 의미하는 것이고, 약물성 탈모증이란 약물 섭취로 인한 모발 상실을 의미하며, 남성형 탈모증 또는 남성형 대머리는 유전적으로 결정되고 안드로겐 의존성이며 이마 뒤에서부터 시작하여 대칭적으로 진행하여 모발의 엉성한 주변 둘레만을 최종적으로 남기는 두피 모발의 상실을 의미한다.

본 명세서를 통해 사용된 "증식성 피부 질환"이란 용어는 피부 조직의 불필요한 증식 또는 이상 증식을 특징으로 하는 모든 피부 질환/병을 의미한다. 이러한 질환들은 일반적으로 표피 세포 증식 또는 불완전 세포 증식을 특징으로 하며, 그 예로는 X-관련 비늘증, 건선, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉 피부염, 표피박리각화과다증 및 지루피부염 등이 있다. 예를 들어, 표피형성이상은 표피의 불완전 발생 형태로서, 일 예로 일반 사마귀 바이러스와 동일한 바이러스 또는 이 바이러스와 근연성이 있는 바이러스에 의한 질환인 "사마귀표피형성이상" 등이 있다. 또 다른 예로는 외상 부위에서 또는 자발적으로 수포 및 물집이 형성된 표피의 느슨한 상태를 의미한다.

본 명세서에 사용된, "건선"이란 용어는 피부 조절 기작을 변화시키는 과증식 피부 질환을 의미한다. 구체적으로, 표피 증식, 피부의 염증 반응, 림포킨 및 염증성 인자와 같은 조절 분자의 발현의 1차 및 2차적 변화를 수반하는 병변이 형성되는 것이다. 건선 피부의 형태적 특징은 표피 세포의 증가된 회전율, 표피 비대, 이상 각질화, 진피층으로 염증세포의 침윤, 표피층으로 다형핵 백혈구 침윤과 이에 따른 바닥세포 순환의 증가 등이 있다. 또한, 각화과다 세포 및 이상각화 세포가 존재하기도 한다.

본 명세서에 사용된 "증식성" 및 "증식"이란 용어는 유사분열을 일으키는 세포를 의미한다.

"선조세포"란 용어는 증식하여 다수의 모세포를 생성하는 능력을 보유한 보다 많은 선조 세포를 발생시킬 수 있는 미분화 세포를 의미하는 것이고, 반면에 상기 모세포는 분화된 또는 분화가능한 딸 세포를 생성시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된 "선조세포"란 용어는 또한 당해 기술분야에서 때로 "줄기세포"라고도 불리는 세포를 포함하는 것이다. 바람직한 구체예에서, "선조세포"란 용어는 그 후손(자손)이 종종 여러 방면으로 분화에 의해, 예컨대 배아 세포 및 조직의 점진적 분화로 나타나는 것처럼 개개의 특성을 완전하게 획득하여 세분화하는 일반화된 모세포를 의미한다. 예를 들어, "조혈 선조세포"(또는 줄기세포)는 골수 및 다른 혈액관련 기관에서 발생하여, 예컨대 적혈구, 림프구, 기타 다른 혈액 세포와 같은 상기 분화된 자손을 발생시키는 선조 세포를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "형질전환된 세포"는 무제한 증식 상태로 자발적으로 전환된 세포, 즉 배양물에서 분열의 무한 횟수를 통해 증식하는 능력을 획득한 세포를 의미한다. 형질전환된 세포는 증식 조절의 상실 측면에서 신생, 역형성 및/또는 과다증식과 같은 용어로 특징지을 수 있다.

본 명세서에 사용된 "무한증식성 세포"란 용어는 세포가 배양물에서 분열의 무한 횟수를 통해 증식하는 능력을 보유할 수 있는 화학적 수단 및/또는 재조합체 수단을 통해 변형시킬 수 있는 세포를 의미한다.

"암종"이란 용어는 주위 조직에 침윤하여 전이를 발생시키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성 신규 증식물을 의미한다. 암종의 예로는, 드물게 전이하면서 국소 침입 및 파괴의 가능성을 보유한 피부의 상피 종양인 "기저세포 암종"; 편 평 상피에서 발생하고 입방형 세포를 보유하는 암종을 의미하는 "편평세포 암종"; 암성 조직과 육종성 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 "암육종"; 작은 상피 세포의 망이나 건에 의해 분리되거나 둘러싸인 원주형 또는 밴드형의 유리질 또는 점액 기질로 표시되는 암종으로서 유선, 타액선 및 호흡관의 점액선에서 발생하는 "샘낭암종"; 표피 세포와 동일한 방식으로 분화하는 경향이 있는, 즉 극세포를 형성하여 각질화를 일으키는 암 세포를 의미하는 "표피모양 암종"; 코 뒤쪽 공간의 상피 내막에서 발생하는 악성 종양을 의미하는 "코인두암종"; 다양한 배열의 관상 세포로 구성된 신장 실질의 암종에 속하는 "신장 세포 암종" 등이 있다. 또 다른 암성 상피 증식으로, 상피 유래의 양성 종양을 의미하며 원인인자로서 유두종바이러스가 있는 "유두종"; 및 신경 고랑의 폐쇄시에 외배엽 인자의 함입으로 형성된 뇌 또는 수막 종양을 의미하는 "표피종(epidermoidomas)"이 있다.

본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 동물"이란, 예컨대 1종 이상의 세포가 사람의 개입, 예컨대 당해 기술분야에 공지된 유전자도입 기법을 통해 도입된 이종 핵산을 함유하는 모든 동물, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물, 조류 또는 양서류이다. 핵산은 미량주사 또는 재조합 바이러스 감염과 같은 계획적인 유전자 조작을 통해 세포 전구체 중으로 도입시켜 세포에 직접 또는 간접적으로 도입시킨다. 유전자 조작이란 용어는 고전적인 이종교배 또는 시험관 수정을 포함하지 않고 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 이 분자는 염색체에 통합되거나 염색체외에서 복제하는 DNA일 수 있다. 이 용어는 또한 재조합체 유전자가, 예컨대 당해 기술분야에 기술된 바 있는 FLP 또는 CRE 재조합효소 의존적 작제물로서 침묵성인 트 랜스제닉 동물을 포함하는 것이다. 트랜스제닉 동물에는 또한 구성적 및 조건적 "녹아웃" 동물이 포함되기도 한다. 본 발명의 "인간을 제외한 동물"은 설치류, 인간을 제외한 영장류, 돼지, 양, 개, 소, 병아리, 양서류, 파충류 등의 척추동물을 포함한다. 인간을 제외한 동물은 축소 돼지 또는 래트와 마우스를 비롯한 설치류 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 가장 바람직한 것은 마우스이다. 본 명세서에 사용된 "키메라 동물"이란 용어는 재조합체 유전자가 발견되거나 재조합체가 동물의 전세포는 아니지만 일부 세포에서 발현되는 동물을 의미한다.

I. 미세기관 배양물의 확립

본 발명에 따른 본 발명의 미세기관 배양물의 주요 특징은 특정 조직의 생체내에서 발견되는 세포 미세환경을 보존하는 능력이다. 본 발명은 부분적으로 소정 환경에서 기관 체외이식편의 상이한 조직 층, 예컨대 중간엽층 및 상피층에 있는 세포의 성장이 활성화하여 배양물에서 증식 및 성숙할 수 있음을 발견한데 기초한 것이다. 또한, 체외이식편 자체에 제공된 세포-세포 및 세포-간질 상호작용은 세포 항상성, 예컨대 체외이식편 배양물에서 세포의 성숙, 분화 및 분리를 지지하기에 충분하여 연장된 시간 동안 조직의 미세구조 및 기능을 유지한다.

세포와 비세포 기질(간질) 사이의 물리적 접촉의 일 예는 상피세포와 그 기저층 간의 물리적 접촉이다. 세포와 다른 세포 간의 물리적 접촉의 일 예로는 예컨대 틈새이음부 및 치밀이음부와 같은 세포간 세포 이음부에 의해 유지되는 실제 물리적 접촉을 포함한다. 한 세포와 다른 세포 간의 기능적 접촉의 예로는 세포 간의 전기적 또는 화학적 교통을 포함한다. 예를 들어, 심근세포는 다른 심근세포 와 전기충격을 통해 교통한다. 또한, 많은 세포들은 화학적 통신, 예컨대 국소 확산 호르몬(예컨대 주변분비 신호 및 자가분비 신호 호르몬) 또는 혈관계에 의해 보다 먼 위치로 전달되는 호르몬(내분비 신호 호르몬) 등을 통해 다른 세포와 교통한다. 세포 사이의 주변분비 신호의 예로는 소화관의 각종 세포(장내분비 세포로도 알려져 있음), 예컨대 근처 유문 위(G) 세포에 의해 가스트린 방출을 억제하는 소마토스타틴을 분비하는 유문 D 세포에 의해 생성되는 신호가 있다.

본 발명의 미세구조는 최소 배지에서, 예컨대 외래원성 혈청이나 성장인자 없이 최소 배지에서 체외이식편의 유지에 매우 중요할 수 있는데, 그 이유는 체외이식편 내의 특이적인 세포 상호작용의 결과로 주변분비 인자 및 자가분비 인자에 의해 조직이 최소 배지에서 유지될 수 있기 때문이며, 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니다.

또한, "유지, 시험관내, 이들의 물리적 및/또는 기능적 접촉"이란 용어는 적어도 하나의 세포가 생체내에서는 물리적 및/또는 기능적 접촉 상태에 있지 않은 적어도 하나의 세포 또는 비세포성 물질과 물리적 및/또는 기능적 접촉 상태를 형성하는 분리된 세포 집단을 배제한 것은 아니다. 이러한 발생의 일 예는 분리된 세포 집단의 적어도 하나의 세포의 증식이다.

바람직한 구체예에서, 체외이식편을 구성하는 세포 집단은 한 세포의 다른 세포에 대한 자연 친화성을 보존하는, 예컨대 체외이식편에 존재하지만 다른 세포 층을 보존하는 방식으로 기관으로부터 분리되어 있다. 예를 들어, 피부 미세기관 배양물의 경우에 표피의 각질세포는 간질에 결합된 상태를 유지하고 모낭과 샘을 포함하는 정상 조직 구조를 보존하고 있다. 이러한 기본 구조는 모든 기관, 예컨대 상피 성분을 포함하는 모든 기관에 일반적인 것이다. 더욱이, 이러한 결합은 세포간 교통을 용이하게 해준다. 동물 세포 중에서는 다양한 유형의 교통이 일어난다. 이것은 상호작용이 한 조직 또는 세포(유도)와 다른 조직 또는 세포(반응) 사이의 상호작용을 통해 유도가 일어나는 분화 세포에서 특히 중요한 것인데, 그 결과 반응 세포는 분화 방향으로 변화를 겪게 된다. 또한, 유도 상호작용은 배아 세포와 성숙 세포에서도 일어나서 분화 유도뿐만 아니라 형태형성 패턴의 확립 및 유지 작용을 할 수 있다(Gurdon (1992) Cell 68:185-199).

또한, 본 발명에 따라 제조한 미세기관 배양물은 연장된 기간 동안 배양했을 때에도 정상적인 조직 구조를 보존한다. 여기에는, 생체내 정상적인 발생에 따라 시험관내 피부 미세기관에 모낭, 땀샘 및 피지선의 유지(실시예 VIII 및 도 10A 내지 도 10C) 또는 생체내에서 정상 발생된 췌장내 랑게르한스 섬의 유지가 포함된다(실시예 IV, V 및 VI 참조). 이 배양물들은 조절된 균일한 상태로 유지될 수 있고 생체내 조직과 매우 유사하기 때문에, 자연 현상과, 질병, 노화 또는 외상으로부터 발생하는 자연 현상의 혼란을 관찰, 측정 및 조절할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다. 또한, 배양물 상의 확인된 부위에서 각 세포를 연구할 수 있는 기술의 신속한 이용가능성은 기관의 각 성분들의 기능과 서로 간의 상호는 물론 전체 기관과의 상호작용을 관찰할 수 있도록 한다.

본 발명에 따라 제조된 미세기관 배양물의 예는 이하 실시예에 기술하고 있고, 한 세포의 다른 세포에 대한 자연 친화성을 보존할 수 있도록 복수의 층을 포 함할 수 있는 방식으로 그룹화된 세포 집단을 포함할 수 있다. 각 세포 또는 세포 그룹의 증식은 관찰한 뒤 자동방사능사진촬영 또는 면역형광법을 실시할 수 있다.

첨부되는 실시예는 단순히 보다 상세히 설명하기 위한 것으로서, 대상 배양물 시스템이 생리적 상태에 상당하는 시스템 내에서의 시험관내 상피 및 간질 인자의 복제를 제공함을 입증하는 것이다. 중요한 것은, 이 시스템에서 복제한 세포가 정상 표피 및 진피 성분을 형태적 및 조직학적으로 형성하기에 적당하게 이격된다는 점이다.

원 조직의 세포-세포, 세포-기질 및 세포-간질 구조를 보유하는 체외이식편을 분리하는 것 외에도 체외이식편의 크기는, 예컨대 미세기관 배양물을 연장된 기간, 예컨대 7 내지 21일 또는 그 이상 동안 유지시키고자 하는 경우에, 함유된 세포의 생존성에 중요하다. 따라서, 조직 체외이식편의 크기는 적당한 영양소와 가스, 예컨대 O₂는 3차원 미세기관의 모든 세포로 확산시키고 세포 폐기물은 상기 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관내 폐기물 국재화에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택한다. 따라서, 체외이식편의 크기는 특수 전달 구조 또는 합성 기질 없이 각 세포에 대해 접근용이성의 필요한 최소 레벨에 따라 결정한다. 본 명세서에 기술하였듯이, 이러한 접근용이성은 체외이식편의 두께 및 폭으로부터 계산한 지수인 알레프(Aleph)가 적어도 약 1.5mm^-1 보다 크면 유지될 수 있다는 것을 발견하였다.

본 명세서에 사용한 "알레프"는 화학식 1/x + 1/a≥1.5mm^{- 1}으로 나타내어지 는 표면적 대 부피비로서, 여기에서 x는 조직 두께(mm)이고 a는 조직의 폭(mm)이다. 바람직한 구체예에서, 체외이식편의 알레프는 1.5 내지 25mm^-1 범위, 보다 바람직하게는 1.5 내지 15mm^-1 범위, 보다 더 바람직하게는 1.5 내지 10mm^-1 범위인 것이 좋고, 특히 1.5 내지 6.67mm^-1 범위, 1.5 내지 3.33mm^-1 범위인 것이 좋다.

따라서, 본 발명은 조직 체외이식편의 표면적 대 부피 지수가 소정 범위 내에서 유지되는 것이다. 이러한 소정 범위의 표면적 대 부피 지수는 단층 세포와 유사한 방식으로 확산에 의한 영양소에 대한 세포 접근과 폐기물 처리 수단에 대한 세포 접근을 허용한다. 이러한 레벨의 접근용이성은 표면적 대 부피 지수(본 명세서에서 "알레프 또는 알레프 지수"라고 표시함)가 적어도 약 1.5mm^-1 이상인 경우 달성되어 유지될 수 있다. 3차원의 변화는 부피와 표면적의 방사분석 변화를 유발하기 때문에 표면적 대 부피 지수를 측정하는 데에는 무시하였다. 그러나, 알레프를 측정할 때에는 a와 x는 조직 절편의 가장 작은 두 치수로 제시되어야 한다.

알레프의 예는 표 I에 제시하였으며, 여기에서 예를 들어 두께가 0.1mm이고 폭이 1mm인 조직은 알레프 지수가 11인 것이다. 실시예 I에서, 알레프가 3.48이 되도록, 조직의 x는 0.3mm, a는 4mm로 하였다. 실시예 III에서는 x는 변화시키고 a는 4mm로 고정시켰다. 도 6에 예시하였듯이, 증식 활성은 체외이식편의 두께가 증가할 때 크게 감소한다. 따라서, 미세기관 배양물 내 증식성 세포의 수는 두께가 900㎛ 일 때 두께가 300㎛인 유사 근원 유래의 조직에서보다 약 10배 정도 적었 다. 두께가 900㎛인 조직의 알레프 지수는 1.36mm^{- 1}으로, 본 발명에서 제시한 최소값 보다 적은 값인 반면 두께가 300㎛인 조직의 알레프 지수는 3.58mm^{- 1}으로, 본 발명에서 제시한 범위에 속하는 것이었다.

표 1

a(폭)과 x(두께)(mm^-1)의 함수로서 표면적 대 부피비 지수인 여러 "알레프" 값

또한, 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 3차원 배양 시스템에 의해 제공되는 많은 인자들은 이 시스템의 성공에 기여할 수 있다:

(a) 예컨대 상기 알레프 계산을 이용하여 선택한 체외이식편 크기의 3차원 기질은 체외이식편의 모든 세포로 영양소를 적당히 확산시킬 수 있고 체외이식편의 모든 세포로부터 세포 폐기물을 적당히 확산시킬 수 있는 적당한 표면적 대 부피비를 제공한다.

(b) 기질의 3차원성으로 인하여, 각종 세포는, 융합성이 될 때까지 증식하여 접촉 억제를 나타내고 성장과 분열을 중단하는 단층 배양물 중의 세포와 달리 활성적 증식을 지속한다. 체외이식편의 세포 복제에 대한 성장 인자와 조절 인자의 기여도는 배양물에서, 예컨대 총 부피면에서 정지상태인 미세기관 배양물에 대해서도 세포 증식 자극과 분화 조절에 부분적인 책임이 있을 수 있다.

(c) 3차원 기질은 생체내 대응 조직에서 발견되는 것과 거의 유사한 세포 성분의 공간적 분포를 보유한다.

(d) 세포-세포 및 세포-기질 상호작용은 세포 성숙에 도움이 되는 국소적 미소환경을 확립시킬 수 있다. 분화된 세포 표현형의 유지에는 성장/분화 인자뿐만 아니라 적당한 세포 상호작용이 필요하다는 것이 확인되었다. 본 발명은 조직 미소환경을 효과적으로 모방하는 것이다.

하기 예시적 실시예들에 기술한 바와 같이, 동물(인간 포함) 유래의 미세기관 배양물, 예컨대 피부, 췌장, 간, 신장, 십이지장, 방광, 골수, 흉선 또는 비장 유래의 미세기관 배양물을 분리하여 최고 21일까지 배양물에서 증식시켰다. 하지만, 21일 이상의 연장된 기간 동안 배양물을 유지하는 것도 본 발명의 영역에 속하는 것이다.

II. 미세기관 배양물에 사용되는 체외이식편의 근원

대상 미세기관 배양물은 예를 들어, 피부 및 점막(예컨대, 구강 점막, 위장 점막, 비측관, 호흡관, 경부 및 각막); 췌장; 간; 담낭; 담즙관; 폐; 전립선; 자궁; 유선; 방광 조직; 및 흉선, 비장 및 골수 등의 혈액 관련 기관 등으로부터 분 리한 체외이식편을 사용하여 유도할 수 있다. 따라서, 이러한 기관의 시험관내 배양 동등물을 제조할 수 있다. 체외이식편을 형성하는 조직은 질병에 걸린 것이거나 정상(예컨대, 건강한 조직)인 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미세기관 체외이식편이 분리되는 기관은 과증식 질환, 예컨대 건선 또는 각질증; 바이러스 감염 세포, 예컨대 간염 바이러스 감염 세포, 또는 유두종 바이러스 감염 세포의 증식; 신생증식성 질환, 예컨대 기저 세포 암종, 편평세포 암종, 육종 또는 윌름즈 종양; 또는 섬유증 조직, 예컨대 경화증 간 또는 췌장염이 있는 췌장 유래의 섬유증 조직을 갖고 있는 것일 수 있다.

본 발명의 세포를 분리할 수 있는 동물의 예로는 인간 및 다른 영장류, 돼지, 예컨대 완전 동종 번식 또는 부분 동종 번식 돼지(예, 축소 돼지 및 트랜스제닉 돼지), 설치류 등이 있다.

III. 성장 배지

동물 유래의 세포를 배양하는데 사용할 수 있는 조직 배양 배지에는 다수가 있다. 이 중 몇몇은 복잡하고 일부는 단순하다. 미세기관 배양물은 복합 배지에서 증식할 수 있을 것으로 예상하지만, 본원에서는 둘베코 최소 필수 배지와 같은 단순 배지에서도 배양물을 유지시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 혈청이나 다른 생물학적 추출물, 예컨대 뇌하수체 추출물을 함유하는 배지에서 배양물을 증식시킬 수도 있으나, 본원에서는 혈청이나 다른 생물학적 추출물이 필요하지 않은 것을 확인하였다. 또한, 기관 배양물은 연장된 기간 동안 혈청 없이 유지될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 시험관내 배양물의 유지 동안의 배지에는 성장 인자를 첨가하지 않는다.

최소 배지에서의 성장과 관련된 요점은 중요하다. 현재, 포유동물 세포을 연장하여 성장시키기 위한 대부분의 배지 또는 시스템은 미정의 단백질을 포함하거나 상기 성장을 유지하는데 필요한 단백질을 제공하는 공급 세포를 사용한다.

본 명세서에 사용된, "최소 배지"란 용어는 세포가 생존하고 배양물에서 증식하는데 필요한 영양소만을 포함하는 화학적 성분이 분명한 배지를 의미한다. 일반적으로, 최소 배지에는 생물학적 추출물, 예컨대 성장인자, 혈청, 뇌하수체 추출물, 또는 배양물 중의 세포 집단의 생존과 증식을 지원하는데 필요하지 않은 기타 다른 물질이 없다. 예를 들어, 최소 배지는 일반적으로 적어도 하나의 아미노산, 적어도 하나의 비타민, 적어도 하나의 염, 적어도 하나의 항생제, 수소 이온 농도 측정에 사용되는 적어도 하나의 지시인자, 예컨대 페놀 레드, 글루코스, 및 세포의 생존과 증식에 필요한 기타 다른 미셀성 성분을 포함한다. 최소 배지는 무혈청성이다. 각종 최소 배지는 기브코(Gibco) BRL(미국 매릴랜드주 게터스버그 소재)로부터 최소 필수 배지로서 입수용이한 것이다.

그러나, 성장 인자와 조절 인자는 이 배지에 첨가할 필요는 없으나 이러한 인자들의 첨가 또는 다른 특수 세포의 접종은 배양물내 증식과 세포 성숙을 향상시키거나 변질시키거나 또는 변조시키는데 사용할 수 있다. 배양물에서의 세포의 증식과 활성에는 각종 성장 인자, 예컨대 인슐린, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 간 적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 및 간세포 성장 인자가 영향을 미칠 수 있다. 증식 및/또는 분화를 조절하는 다른 인자로는 프로스타글란딘, 인터루킨 및 자연 발생의 음성 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 및 형질전환 성장 인자 β군 성분이 있다.

미세기관 배양물은 24웰 또는 96웰 미량평판과 같은 적합한 모든 배양 용기에서 유지시킬 수 있으며 37℃, 5% CO₂ 하에서 유지될 수 있다. 배양은 호기성 향상을 위해 진탕시킬 수 있는데, 진탕 속도는 예컨대 12 rpm이다.

대상 미세기관 배양물(경우에 따라)이 위나 안에 제공되는 배양 용기와 관련하여, 바람직한 구체예에서는 이러한 용기가 일반적으로 임의의 재료 및/또는 형태일 수 있음을 유의해야 한다. 용기 형성에 사용할 수 있는 각종 재료들로는 나일론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(예, 폴리비닐클로라이드), 폴리카보네이트(PVC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 테플론), 터마녹스(TPX), 니트로셀룰로스, 면, 폴리글리콜산(PGA), 창자실봉합사, 셀룰로스, 젤라틴, 덱스트란 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 재료들은 모두 망(mesh)으로 제직될 수 있다. 미세기관 배양물이 생체내에서 스스로 이식되어야 하는 경우에는 폴리글리콜산, 창자실봉합사 또는 젤라틴 등의 생체분해성 기질을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 배양물이 장기간동안 유지되어야 하거나 동결보존되어야 하는 경우에는 비분해성 재료인, 나일론, 다크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 면 등이 바람직할 수 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 편리한 나일론 망은 평균 소공 크기 210㎛, 평균 나일론 섬유 직경 90㎛의 나일론 여과 망인 Nitex 이다(#3-210/36, Tetko, Inc. N.Y.). 또 다른 구체예들은 하기에 설명하였다.

예시적 구체예로서, 랑게르한스 섬을 함유하는 췌장 미세기관은 본 발명의 배양물로서 제조한다. 이 배양물을 그 다음 면역거부를 피하기 위하여 캡슐화 형태로 준비한다. 캡슐화의 일반적(예시적)인 3가지 방법을 사용할 수 있을 것이다. 첫째는 미세기관 체외이식편을 함유하는 틀에 관형 막을 감는다. 이 막을 중합체 이식편에 연결하고 그 다음 이 장치를 혈관에 연결시킨다. 글루코스와 인슐린은 막을 통해 앞뒤로 자유 확산하고 항체와 림프구의 통행은 차단하도록 막 투과성을 조절함으로써, 이 장치로 처리된 췌장절제술을 받은 동물에서 정상혈당이 유지될 수 있다(Sullivan et al.(1991) Science 252:718).

두 번째 방법으로서, 췌장 체외이식편을 함유하는 중공 섬유를 다당류 알기네이트에 고정(경우에 따라)시킨다. 이 장치가 당뇨병 동물의 복강내에 배치되면 혈당 농도가 저하되고 양호한 조직 화합성이 관찰될 수 있다(Lacey et al.(1991) Science 254: 1782; 실시예 VI 참조). 따라서, 섬유를 사전방적한 뒤 이어서 미세기관 체외이식편에 장입시킬 수 있다(Aebischer et al. 미국 특허 제4,892,538호; Aebischer et al. 미국 특허 제5,106,627호; Hoffman et al.(1990) Expt. Neurobiol. 110:39-44; Jaeger et al.(1990) Prog. Brain Res. 82:41-46; 및 Aebischer et al.(1991) J.Biomech Eng. 113:178-183).

셋째, 알기네이트나 폴리아크릴레이트로 구성된 미세캡슐에 미세기관 섬 체외이식편을 주입할 수 있다(예컨대, Lim et al.(1980) Science 210:908; O'Shea et al.(1984) Biochim. Biophys. Acta 840:133; Sugamori et al(1989) Trans Am.Soc. Artif.Intern. Organs 35:791; Levesque et al.(1992) Endocrinology 130:644; 및 Lim et al(1992) Transplantation 53:1180).

마지막으로, 본 발명의 미세기관 배양물이 유지되는 배양 배지를 수집하여 합성 배지원으로서 사용할 수 있음을 주지해야 한다. "합성 배지"란 용어는 배양된 세포/조직이 없는 상청액을 의미하는 것으로서, 일정 시간 후 그 배지는 세포에 의해 생산되고 배양물에 분비된 특정 주변분비 및/또는 자가분비 인자를 포함하여 변질될 정도로 배양 세포와 접촉시킨다. 이러한 산물의 예로는 인슐린, 각종 성장 인자 및 호르몬이 있다. 이러한 합성 배지는 다른 종류의 세포 및 조직 배양용 배양 배지로서 사용할 수 있다. 또는, 합성 배지는 성장 인자와 같은 신규 세포 산물원으로서 이용할 수도 있다. 이러한 산물은 합성 배지로부터 분획화한 뒤 정제하거나 실질적으로 정제할 수 있다.

IV. 미세기관 배양물의 생물학적 성질 측정

정상 조직에서 얻은 본 발명의 미세기관 배양물은 조직 전체가 성장됨이 없이 구성형 세포의 증식으로 항상성 상태를 유지하는 것으로 관찰되었다.

세포 증식을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 가장 일반적인 방법은 세포 복제의 특징적인 DNA 합성을 측정하는 것이다. DNA 합성을 측정하는 방법으로는 당해 기술분야에 수많은 방법이 공지되어 있으며, 이중 어느 한 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, DNA 합성은 방사능 표지(³H-티미딘) 또는 표지된 뉴클레오타이드 유사체(BrdU)를 사용하여 면역형광성을 검출함으로써 측정하였다.

미세기관 배양물은 성숙 세포의 증식은 물론 전구체 세포, 예컨대 몇몇 경우에는 배아 세포의 활성적 참여를 통해 제조하고 유지시킬 수 있다. 이 미세기관 배양물은 상기 전구체 세포를 보존, 동정, 분리하고 자연적 진화를 용이하게 하는 적합한 환경을 제공하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 기저층의 미성숙 세포는 피부 미세기관 배양물에서 성숙 각질세포가 되는 것으로 관찰되었고, 이와 마찬가지로 배아 췌장 세포는 미세기관 배양물에서 성숙 췌장 상피세포를 제공할 수 있었다. 전구체 세포의 성숙과 잇따른 이들의 성숙 세포로서의 기능화는 특정 산물, 예컨대 표피 세포에서의 특정 각질, 췌장 상피에서의 인슐린, Glut2 및 글루카곤, 및 간 미세기관 배양물에서의 알부민 및 VIII 인자 등의 분비를 측정하여 모니터할 수 있다.

본 발명에 따라 제조한 미세기관 배양물은 생체내에 존재하는 정상 조직 구조를 보존한다. 전술한 바와 같이, 그 예로는 생체내 정상적인 발현에 따르는, 시험관내 피부 미세기관 중의 모낭, 땀샘 및 피지선의 유지 및 췌장 미세기관에 존재하는 글루카곤 분비 세포의 유지를 포함한다. 이들 배양물은 조절되는 균일한 조건하에서 유지될 수 있고 생체내 기관의 미세구조와 매우 유사하기 때문에, 자연 현상과 질병, 노화 또는 외상에 의해 발생하는 자연 현상의 혼란을 관찰하고 측정하여 조절할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다. 또한, 배양물 상의 확인된 부위에서 각 세포를 연구할 수 있는 기술의 신속한 이용가능성은 기관의 각 성분들의 기능과 서로간의 상호은 물론 전체 기관과의 상호작용을 관찰할 수 있도록 한다.

또한, 대상 미세기관 배양물은 연장된 시간 동안 배양 유지할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 약 24시간 이상 배양 유지할 수 있고, 보다 바람직하게는 적어도 약 2일 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 5일 동안, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 7일 동안, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 2주 또는 그 이상 동안 배양 유지할 수 있다. 본 발명의 미세기관 배양물은 일반적으로 적어도 7일 이상 동안 배양 유지되는 것이다. 일 예로서, 인간, 마우스, 기니아 피그 및 래트 피부의 피부 미세기관 배양물은 적어도 약 21일 이상 동안 배양 유지되었다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "배양 유지가능한"이란 용어는 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 세포가 특정 기간 후 배양물에서 생존성을 유지하는 조직 체외이식편의 세포 집단을 의미한다.

바람직한 구체예에서, 미세기관 배양물 중에 존재하는 세포의 세포 상실, 예컨대 사멸이나 탈피에 의한 세포 상실에 대한 세포 증식의 비는 1과 동일한 것으로서, 즉 상실된 세포 수와 증식 세포 수가 동일하다. 본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 배양물에 존재하는 세포의 세포 상실에 대한 세포 증식의 비는 1 보다 큰 것으로서, 상실되는 세포 보다 더 빠른 속도로 세포가 증식한다. 후자의 경우에 미세기관 배양물은 증폭되는 세포 집단을 포함하는 것으로 사료된다.

V. 미세기관 배양물의 적용

본 발명의 미세기관 배양물을 이용할 수 있는 적용 예로는 다음과 같은 것이 있다:

(a) 정상적인 조직과 기관의 항상성에 관여하는 인자의 동정;

(b) 영양소 변화를 비롯한 환경 변화 및 잠재적 독성제의 존재에 대한 정상적인 기관의 조직과 세포의 항상성에 미치는 영향 연구;

(c) 발병이나 외상 초기 및 발병이나 외상 중에 야기되는 기관의 조직과 세포에서 나타나는 변화 경로에 대한 이해;

(d) 발병이나 외상과 관련된 변화 환경에서의 악영향을 반전시키는 수복 기작의 동정;

(e) 정상적인 조직의 항상성 동안 분화하는 세포의 발생 조절;

(f) 모낭과 같은 기관내 존재하는 세분화된 구조의 발생 조절;

(g) 개개인의 기관 일부를 보유하지만 만성 피부 궤양, 각종 형태의 당뇨병 또는 만성 간 손상을 앓고 있는 환자에서 발생하는 것과 같은 손상 조직의 대체 또는 재생에는 불충분한 기관 보충/이식;

(h) 약물 선발 및 세포독성 연구를 위한 조직/기관 동등물로서의 용도;

(i) 증식 질환의 진단 분석용으로서의 용도;

(j) 신규 성장 인자의 근원으로서의 용도;

(k) 줄기/선조세포의 근원으로서의 용도;

(l) 분자를 유도하는 근원으로서의 용도;

(m) 분자를 유도하는 선발용으로서의 용도;

보다 상세히 설명하면, 본 발명의 방법은 피부 동등물을 미세기관 배양물의 형태로 생성하는데 사용할 수 있다. 배경기술로서, 상처 치료 목적, 특히 화상 치료 목적으로 인간 피부를 모방하는 방식으로 상피 세포를 증식시키기 위한 다수의 시도들이 개시되어 있음은 잘 알고 있을 것이다. 피부는 2종의 조직으로 이루어져 있다. 이들은 (1) 신경, 혈관 및 지방 세포뿐만 아니라 고밀도 콜라겐 기질내에 드문드문 분산되어 있는 섬유아세포를 포함하는 간질 또는 표피와, (2) 치밀하게 충전된 활성 증식형 미성숙 상피 세포의 표피 기저층을 포함하는 표피이다. 기저층 세포가 복제하면, 어린 세포 중 일부는 기저층에 그대로 남아있는 반면 다른 세포는 층 밖으로 이동하여 크기가 증가하고 사실상 계면활성제 및 환원제에 대해 내성인 엔벨로프를 형성시킨다. 인간의 경우, 기저층에서 발생한 세포는 가장자리 또는 외층에 도달하는데 약 2주가 소요되고 그 이후 세포는 사멸하여 탈피된다. 피부는 각종 구조, 예컨대 모낭, 피지선 및 땀샘을 포함한다. 모낭은 표피의 함입이 치밀하게 채워져 있는 각질세포의 분화로부터 생성된다. 이러한 함입으로부터 형성된, 개방 말단형 소포는 분비된 각질을 수집하고 농축하여 털 필라멘트를 생성한다. 또는, 함입을 내면에 채워진 표피 세포는 유체(땀샘) 또는 피지(피지선)를 분비할 수 있다. 이러한 구조의 형성과 증식의 조절은 알려져 있지 않다. 건강한 피부의 일정한 재생은 신생 세포가 생산되고 노화 세포가 사멸하는 균형있는 공정에 의해 이루어진다. 노화 시 발생하고, 또한 이러한 균형을 붕괴시키는 질병과 외상을 통해 나타나는 이상 현상에 대응하기 위해서는 정확한 조절을 실시할 수 있는 방법에 대한 이해가 필요하다.

본 발명의 일 구체예에서, 미세기관 배양물의 미세구조는 생체내 피부의 미 세구조와 유사하거나 거의 동일하여, 예컨대 상피조직/결합조직 구조를 보유한다. 예를 들어, 피부 미세기관 배양물에서, 표피의 각질세포는 결합조직에 결합된 상태를 유지하며 모낭을 포함하는 정상 조직 구조가 보존된다. 피부 조직 절편에서 수득한 미세기관 배양물은 또한 표피 세포를 지지하는 바닥판, 진피 세포를 포함하는 세포외 기질 및 적어도 하나의 함입, 예컨대 적어도 하나의 모낭을 포함할 수 있다. 피부 상피 조직과 피부 결합 조직 사이의 결합은 세포간 교통을 용이하게 해준다. 더욱이, 전두께의 피부는 공기 계면을 허용하는 각종 방식으로 증식시킬 수 있다. 체외이식편의 각질세포가 공기에 노출되면 각질세포의 보다 신속한 분화 및 각질 층의 보다 광범위한 분비가 촉진되며, 이는 피부 투과 연구에 매우 중요할 수 있다.

마지막으로, 최근 연구들에서는 피부가 면역계의 중요한 활성 요소임이 시사되고 있음을 상기해야 한다(Cooper et al. (1987) The mechanobullous disease. In: Dermatology in General Medicine, 3d. Ed., McGraw Hill, NY(pp. 610-626)). 각종 면역 활성에 중요한 피부 중에 존재하는 주요 세포 종류 중 하나는 랑게르한스 세포이다. 이 세포는 새 피부 샘플에서 준비할 수 있고 3차원 피부 배양물에 첨가하여 면역학적으로 완전한 조직 시스템을 얻을 수 있다. 이 세포를 배양물 상태로 장시간 동안 증식시키는 것은 종래의 조직 배양 기법으로는 어렵다. 3차원 시스템에서 이 세포를 증식시킬 수 있는 능력은 주입, 세포독성 및 질환 기작을 비롯한 연구의 모든 양태에서 매우 중요할 것이다. 이러한 유형의 피부 배양 시스템은 직접 또는 간접적인 피부 병발을 보유하는 자가면역 질환(예, 전신홍반성낭창, 수포성 유사천포창 등)과 관련된 연구에 가장 큰 영향을 미칠 것이다. 따라서, 본 발명의 미세기관 배양물은 질환의 면역학적 측면이 최소화된 상태에서 증식성/분화성 질환을 연구하는데 사용할 수 있다. 또한, 일례로서 과다형성성 상피 세포의 증식을 억제할 수 있는 제제를 동정하기 위하여 건선 피부 체외이식편을 사용하여 약물 선발 분석법을 유도할 수 있다.

피부는 단순히 간질 조직에 의해 지지되고 있는 상피 조직을 보유한 미세기관 배양물로서 증식할 수 있는 조직의 일례이다. 상피 조직을 포함하는 다른 조직도 본 발명의 미세기관 배양물로서 증식시킬 수 있다. 상피 조직은 기관과 환경 사이의 계면이 존재하는 신체의 모든 부분에서 발견되는 것으로서, 상처가 없는 체내에서 지속적으로 순환하여 피부를 비롯한 체내의 모든 유리 표면에 대해 피복 조직을 형성한다. 일부 경우에, 예컨대 췌장의 상피세포에는 수많은 함입이 채워져 있고 기관이 기능할 수 있는 개방 공간으로 효소를 분비한다. 폐도 고도의 함입을 가진 기관 중 하나로서 폐에 존재하는 각 함입은 상피세포 안에 존재하여 공기를 환경으로부터 체내로 확산시킨다. 이러한 상피세포는 특징적인 성질이다. 위의 내면도 역시 장벽을 형성할 뿐만 아니라 음식물을 선택적으로 흡수하는 세분화된 구조를 함유하는 특수 상피 세포로 구성되어 있다. 모든 상피세포는 결합 조직에 의해 지지되고 있다. 중요한 세포-기질 상호작용을 포함하는 또 다른 기관은 골수이다.

즉, 본 발명의 다른 구체예에서, 미세기관 췌장 배양물의 미세구조는 생체내 근원 췌장의 구조와 유사하거나 거의 동일한 것으로서, 예컨대 상피조직/결합조직 구조를 하고 있다. 예를 들어, 췌장 미세기관 배양물은 췌장 상피 세포, 예컨대 섬 세포를 포함하며, 췌장 결합 조직과 결합 상태를 유지하고 있다. 따라서, 췌장 미세기관 배양물에서는 정상 조직 구조가 보존되고 정상 췌장 상피 세포 산물, 예컨대 인슐린 및 글루카곤이 생성된다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 골수 유래의 미세기관 배양물의 생성방법을 제공하며, 여기에서 배양물은 생체내 기관의 미세구조를 보존한다. 실시예 XV에 기술한 바와 같이, 골수 미세기관은 생리적 조건에 상당하는 시스템을 유도하기 위하여 배양물에서 분리하였다.

본 발명의 골수 배양물은 건강한 골수 세포를 파괴하거나 이 세포들의 기능적 활성을 억제하는 질환이나 증상을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 미세기관의 이식은 혈액 악성 질환 및 골수를 포함하는 다른 종양의 치료에 효과적일 수 있다. 이러한 양태의 본 발명은 골수가 환경적 요인(예컨대, 방사선, 독소 등)에 의해 악화된 환자를 치료하는데 효과적이다. 환자 자신의 골수에서 유래하는 체외이식편의 재이식이 일반적으로 바람직하지만, 이러한 체외이식편은 동종원성, 예컨대 동종의 다른 구성원 유래이거나 또는 이종원성, 예컨대 다른 유기체 유래일 수도 있다. 이종원성 이식편의 일 예는 인간에 이식하기 위한 축소 돼지 유래의 미세기관 배양물일 수 있다.

또한, 필요한 간질 유래의 성장/조절 인자가 제공된다면 인간 조혈 선조세포의 장기간의 증식도 가능하다. 이러한 상호작용은 본 발명의 미세기관에 의해 제공되어, 이들 체외이식편을 줄기세포 및 선조세포의 근원이 되게 해준다. 일반적 으로, 골수의 조혈 선조세포는 골수 미세기관의 간질 기질에서 형성된 천연 패킷(packet)에서 군락을 형성한다("시드(seed)"). 골수 간질 세포의 성장에 주요 속도 제한 요인은 골수 간질 세포 중에 포함된 섬유아세포의 비교적 낮은 유사분열 지수이다. 따라서, 이들 세포의 성장과 이들 세포에 세포외 기질 성분의 배치를 향상시키고자 하는 경우에는 체외이식편을 하이드로코르티손이나 다른 섬유아세포 성장 인자와 같은 제제와 접촉시키면 된다.

전이성 질환이나 혈액 악성 질환을 앓고 있는 특정 환자를 치료하고자 하는 목적으로 골수를 배양해야만 한다면 배양에 앞서 환자로부터 수득한 골수로부터 먼저 이상 증식성 세포를 물리적 또는 화학요법적 수단으로 "제거"해야 한다.

본 발명의 골수 미세기관 배양물 유래의 합성 배지는 신규 또는 공지 림포킨의 근원, 예컨대 인터루킨의 근원으로서 사용할 수 있다.

본 발명은 일 양태로서, 유기체에 이식하기 위한 대상 미세기관 배양물의 용도를 제공한다. 본 명세서에 사용된, "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"이란 용어는 상호교환적으로 사용할 수 있는 것으로서, 세포를 원하는 부위에 국재화시키는 방법이나 경로를 통해 본 발명의 세포 집단을 대상, 예를 들어 이종원성 또는 동종원성 대상 내에 배치하는 것을 의미한다. 세포 집단은 세포의 적어도 일부가 생존성을 유지하는 대상의 원하는 위치에 세포를 전달하는 임의의 적당한 경로를 통해 피검체에 투여할 수 있다. 대상에 투여 후 세포의 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 적어도 약 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 가장 바람직하게는 적어도 약 50% 또는 그 이상이 생존성을 유지해야 한다. 상기 대상에 투여 후 세포의 생존성 기간은 몇 시간 정도로 짧은 시간, 예컨대 24시간 정도에서부터 몇 일, 수주 내지 수개월 정도로 긴 시간일 수도 있다. 본 발명의 세포 집단을 투여하는 방법은 세포를 내장이나 벽쪽복막, 예컨대 그물막 주머니에 이식하는 방법, 세포를 수용자의 기관, 예컨대 췌장, 간, 비장, 피부 내 또는 위에 이식하는 방법 등이 있다. 본 발명의 미세기관은 또한 신장 피막 등의 아래에 이식하여 상기 대상에 투여할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "대상"이란 용어는 포유동물, 예컨대 영장류, 예컨대 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "이종 대상"은 다른 종의 세포가 도입되거나 도입되어야 하는 대상이다. "동종원성 대상"은 동종의 세포가 도입되거나 도입되어야 하는 대상이다. 공여자는 배양물에 위치하고(하거나) 수용자에게 이식되어야 하는 세포, 조직 또는 기관을 제공하는 대상이다. 수용자는 이종원성 또는 동종원성 대상일 수 있다. 공여자는 또한 자신에게 재도입시키기 위한, 즉 자가이식을 위한 세포, 조직 또는 기관을 제공할 수 있다.

숙주에 의해 면역원성 공격을 받기 쉬운, 예컨대 이종 이식이 사용된 경우, 구체적으로 돼지-인간 이식인 경우, 세포 집단의 이식을 용이하게 하기 위하여 미세기관을 재충전가능한 장치 또는 생물분해가능한 장치에 삽입하거나 캡슐화한 다음, 수용자에 이식할 수 있다. 이와 같은 세포에 의해 생산된 유전자 산물은 예를 들어 단백성 생물약제를 비롯한 화합물, 예컨대 약물의 조절 전달을 위해 고안한 중합체 장치를 통해 전달할 수 있다. 생물분해성 및 비분해성 중합체를 비롯한 각 종 생체화합성 중합체(하이드로겔 포함)를 사용하여 특정 표적 부위에서 본 발명의 세포 집단에 의한 유전자 산물을 지속 방출할 수 있는 이식편을 만들 수 있다. 이러한 이식편의 제조에 대해서는 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그 예로는 다음과 같은 문헌[Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. By David Williams(MIT Press: Cambridge, MA, 1990); 사벨(Sabel) 등, 미국 특허 제4,883,666호; 아에비셔(Aebischer) 등, 미국 특허 제4,892,538호; 아에비셔 등, 미국 특허 제5,106,627호; 림(Lim), 미국 특허 제4,391,909호; 및 세프톤(Sefton), 미국 특허 제4,353,888호]이 있다. 본 발명의 세포 집단은 약학적 허용성 담체 또는 희석제, 예컨대 멸균 식염수 및 완충 수용액 상태로 투여할 수 있다. 이러한 담체 및 희석제의 사용에 대해서는 당해 기술분야에 공지되어 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 미세기관 배양물은 상처 치유에 이용할 수 있다. 피부 병변부의 수복은 기저부에 있는 결합 조직 유래의 분자 신호에 대한 반응으로 원시상피세포 이동은 물론 상피세포의 복제를 포함하는 매우 복잡한 공정으로 알려져 있다. 피부 미세기관 배양물을 상처 치유의 모델로 본 명세서에 기술하였다. 조절성 배양 조건하에서 치유를 조절하는 인자를 신중하게 모니터할 수 있다. 또한, 미세기관 배양물을 천연의 혈액 공급원으로부터 분리한 경우에는 복잡성을 추가시키는 혈액계 인자 또는 세포의 고려없이 치유 공정을 분석할 수 있다. 정상 표피는 200 내지 300시간 마다 세포를 순환시키는 바 유사분열 활성이 낮다. 하지만, 표피에 상처가 나면 급격한 유사분열 활성이 일어나 세포가 상처의 정도와 증상에 따라 최고 10배 이하의 빠른 속도로 분열하게 된다(Pinkus H.(1951) J.Invest.Dermatol. 16:383-386).

실시예 II에서 입증되어 있는 바와 같이, 피부 미세기관 배양물은 수일 동안 최고 10배 이하의 증식 증가를 보인다. 이 실시예에서 상처의 가장자리는 미세기관 배양물에 필적하는 것이다. 이와 같은 증식 증가는 상처와 관련된 사건과 유사하므로, 상처 치유 공정을 연구할 수 있는 고유의 기회를 제공한다. 더욱이, 후속 실시예들을 통해 생체내 실험으로 입증된 바와 같이 본 발명의 표피 체외이식편은 만성 상처에 적용할 수 있고(실시예 IX) 털을 성장시킬 수 있는 생존성 이식편을 형성할 수 있다(실시예 XI).

또한, 본 발명의 표피 미세기관은 화상 환자의 치료에 사용할 수 있다. 화상 환자들에게 피부 대체요법의 필요성은 분명한 것으로서, 미국과 유럽에 있는 여러 연구센터들에서는 화상 상처와 만성 궤양을 영구적으로 피복 할 수 있는 인간 각질세포 타가이식체와 자가이식체의 배양물을 이용한바 있다(Eisinger et al., (1980) Surgery 88:287-293; Green et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5665-5668; Cuono et al.,(1987) Plast. Reconstr. Surg. 80:626-635). 이 방법들은 종종 성공을 거두지 못하였고 최근 연구에서는 이식된 표피 층 밑에 형성된 1 이상의 결합 조직 성분의 이상으로 인하여 치유 이식편의 수포성 및/또는 피부 무름성이 나타날 수 있다고 지적하였다(Woodley et al.,(1988) JAMA 6:2566-2571). 본 발명의 피부 배양물 시스템은 표피와 진피 모두의 피부 동등물을 제공하여 종래 사용된 각질세포 이식편의 배양물이 특징적으로 나타내는 문제점을 극복하는 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 미세기관 배양물 시스템은 유전자 요법에 사용하기 위하여 유전자 및 유전자 산물을 생체내에 도입시키는 매개체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법을 사용하여 환자에 결손된 유전자를 바이러스 또는 조직 특이적 프로모터의 조절하에서 배치할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 작제물을 사용하면 본 발명의 미세기관 배양물 시스템의 모든 세포 또는 특정 세포만을 형질전환 또는 트랜스펙션시킬 수 있다. 활성 유전자 산물을 발현하는 미세기관 배양물은 상기 산물이 결손형인 개체에게 이식할 수 있다.

이와 같이 본 발명의 미세기관 배양물을 유전자 요법에 사용하는 방법은 많은 장점이 있다. 첫째, 그 배양물이 진핵세포를 포함하므로 유전자 산물은 적절히 발현되어 배양물에서 활성 산물로 가공될 수 것이다. 둘째, 유전자 요법의 기술들은 트랜스펙션된 세포의 수가 임상적 가치, 관련성 및 유용성이 있을 정도로 실질적으로 증가될 수 있는 경우에만 유용한데, 본 발명의 배양물은 트랜스펙션 세포 수의 팽창 및 증폭을 허용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 트랜스제닉 미세기관 배양물은 유전자 도입의 용이성을 제공하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 발현 벡터를 함유하는 미세기관 배양물은 재조합 바이러스를 배양물과 접촉시킨 세포로, 예컨대 이식에 의해 전달하는데 사용할 수 있어서, 생체내 바이러스 전염을 모방할 수 있다. 따라서, 이 시스템은 현재 통용되는 DNA 트랜스펙션의 기법들 보다 효과적으로 유전자 형질도입을 수행할 수 있는 방법이다.

따라서, 본 발명의 미세기관 배양물의 세포는 유전자 산물을 발현하기 위해 변형시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된, "유전자 산물"이란 용어는 단백질, 펩타이드 및 기능성 RNA 분자를 의미한다. 일반적으로, 핵산 분자에 의해 코딩된 유전자 산물은 대상에게 공급할 목적 유전자 산물이다. 이러한 유전자 산물의 예로는 수용자의 기관에서 정상적으로 생산되는 단백질, 펩타이드, 당단백질 및 지단백질이 있다. 예를 들어, 췌장에 존재하는 결손성 기관에 대한 유전자 대체로 공급할 수 있는 유전자 산물로는 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티아제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A₂, 엘라스타제 및 아밀라제가 있고; 간에서 정상적으로 생산되는 유전자 산물에는 혈액응고인자, 예컨대 혈액응고인자 VIII 및 IX, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바노일라제 및 사이토크롬 p450 효소, 및 혈청 아데노신의 가공이나 저밀도 지단백질의 세포이물흡수를 위한 아데노신 데아미나제가 있으며; 흉선에서 생산되는 유전자 산물에는 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴 및 타이모신 α1이 있으며; 소화관 세포에서 생산되는 유전자 산물에는 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴 및 물질-P가 있다. 또는, 코딩된 유전자 산물은 세포에 의한 목적 유전자 산물의 발현을 유도하는 것이다(예컨대, 대상에게 공급할 유전자 산물의 전사를 유도하는 전사 인자를 코딩하는 유전자 물질). 또 다른 구체예에서, 재조합 유전자는 이종 단백질, 예컨대 발현되는 세포에 대해 천연물이 아닌 것을 제공할 수 있다. 예를 들어, 인간 수용체 내의 주입을 지원하기 위하여 비인간의 미세기관에 각종 인간 MHC 성분을 제공할 수도 있다. 또는, 트랜스제닉 유전자는 미세기관 체외이식편에서 정상적으로 발현되는 공여 MHC 유전자 산물의 발현이나 작용을 억제하는 것이기도 하다.

세포에 도입되는 핵산 분자는 그 핵산에 의해 코딩된 유전자 산물이 세포에서 발현되기에 적합한 형태이어야 한다. 따라서, 핵산 분자는 유전자(또는 그 일부) 전사에 필요한 암호 및 조절 서열을 포함해야 하고, 또한 유전자 산물이 단백질이나 펩타이드인 경우에는 핵산 분자의 해독에는 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 시그널은 물론 코딩된 단백질이나 펩타이드를 수송하는데 필요한 서열, 예컨대 단백질이나 펩타이드를 세포 표면으로 수송하거나 또는 분비를 위한 N-말단 시그널 서열을 포함해야 한다.

유전자 산물의 발현을 조절하는 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 프로모터 및 인헨서 서열)은 그 유전자 산물이 발현되어야 하는 세포 종류와 유전자 산물의 필요한 발현율에 따라 선택한다. 예를 들어, 프로모터에 결합된 유전자를 세포종류마다 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 프로모터를 사용할 수 있다. 예컨대, 근육모세포 유전자 발현에 특이적인 프로모터는 그 유전자 산물이 근육에서만 특이적으로 발현할 수 있도록 당해 유전자에 결합시킬 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 근육 특이성이 있는 조절 인자로는 디스트로핀 유전자 유래의 상류 영역(Klamut et al.,(1989) Mol.Cell Biol. 9:2396), 크레아틴 키나제 유전자(Buskin and Hauschka, (1989) Mol.Cell Biol. 9:2627), 및 트로포닌 유전자(Mar and Ordahl, (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 85:6404) 유래의 업스트림 영역을 포함한다. 각 질 유전자에 존재하는 음성 반응 인자는 전사 억제를 매개한다(Jho Sh et al.,(2001). J.Biol.Chem). 다른 세포 종류에 특이성이 있는 조절 인자는 당해 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, 간 특이적 발현에는 알부민 인헨서; 췌장섬 세포 특이적 발현에는 인슐린 조절 인자; 각종 신경 세포 특이적 조절 인자, 예컨대 신경 디스트로핀, 신경 에놀라제 및 A4 아밀로이드 프로모터). 또는, 각종의 여러 세포 종류에서 구성적 유전자 발현을 유도할 수 있는 조절 인자, 예컨대 바이러스 조절 인자를 사용할 수도 있다. 유전자 발현 유도에 일반적으로 사용되는 바이러스 프로모터의 예로는 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 사이토메가로바이러스 및 시미안 바이러스 40 유래의 프로모터와 레트로바이러스 LTR이 있다. 또는, 결합된 유전자의 유도성 발현을 허용하는 조절 인자를 사용할 수도 있다 유도성 조절 인자(예컨대 유도성 프로모터)의 사용으로, 세포내에서 유전자 산물의 생산을 조절할 수 있다. 진핵 세포에 사용할 수 있는 매우 유용한 유도성 조절 시스템의 예로는 호르몬 조절성 인자(예, Mader, S. and White, J.H.(1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5603-5607), 합성 리간드 조절성 인자(예, Spencer, D.M. et al., 1993) Science 262:1019-1024) 및 이온화 방사선 조절성 인자(예, Manome, Y. et al.(1993) Biochemistry 32:10607-0613; Datta, R. et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:1014-10153)가 있다. 또 다른 개발가능한 조직 특이성 또는 유도성 조절 시스템도 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 변형에 사용할 수 있는, 유전자 물질을 세포로 도입시키는 방법은 당해 기술분야에 다수가 공지되어 있다. 일 구체예에서, 핵산은 나출형 핵 산 분자 형태일 수 있다. 이때, 변형될 세포에 도입할 핵산 분자는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 필수 조절인자으로만 구성한다. 또한, 유전자 산물을 코딩하는 핵산(필수 조절 인자를 포함하는)은 플라스미드 벡터에 포함되기도 한다. 플라스미드 발현 벡터의 예로는 CDM8(Seed, B.(1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al.(1987) EMBO J. 6:187-195)이 있다. 또 다른 구체예에서, 세포로 도입할 핵산 분자는 바이러스 벡터에 포함되기도 한다. 이때, 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 바이러스 게놈(또는 부분 바이러스 게놈)에 삽입되어 있다. 유전자 산물의 발현을 유도하는 조절 인자는 핵산과 함께 바이러스 게놈에 삽입되어 포함되거나(즉, 바이러스 게놈에 삽입된 유전자에 결합) 또는 바이러스 게놈 자체가 공급하는 것일 수 있다.

나출형 핵산은 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주입 및 수용체 매개 흡수를 이용하여 세포에 도입시킬 수 있다.

나출형 핵산, 예컨대 DNA는 핵산과 인산칼슘을 함유하는 침전물을 형성시켜 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, HEPES 완충화된 식염수 용액을 염화칼슘과 핵산을 함유하는 용액과 혼합하여 침전물을 형성시키고, 이 침전물을 그 다음 세포와 배양시킨다. 특정 세포에 의해 흡수되는 핵산의 양을 증가시키기 위하여 글리세롤이나 디메틸설폭사이드 쇼크 단계를 첨가할 수도 있다. 세포를 안정적으로(또는 일시적으로) 트랜스펙션시키기 위하여 CaPO₄ 매개 트랜스펙션법을 사용할 수 있 으며, 이 방법은 세포의 시험관내 변형에만 적용할 수 있다. CaPO₄ 매개 트랜스펙션법의 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.1 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.32-16.40 이나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다.

나출형 핵산은 핵산과 DEAE-덱스트란의 혼합물을 형성시키고 이 혼합물을 세포와 배양함으로써 세포에 도입시킬 수 있다. 핵산 흡수량을 증가시키기 위하여 디메틸설폭사이드 또는 클로로퀸 쇼크 단계를 첨가할 수도 있다. DEAE-덱스트란 트랜스펙션법은 시험관내 세포 변형법에만 적용가능하며, DNA를 세포에 일시적으로 도입시키는데 사용할 수 있어서 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 작제하는데에는 바람직하지 않다. 따라서, 이 방법은 유전자 산물을 단기간 생산하는데 사용할 수 있고, 유전자 산물의 장기간 생산을 위해서는 최선의 방법이 아니다. DEAE-덱스트란 매개의 트랜스펙션의 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.2 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.41-16.46 이나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다.

나출형 핵산은 또한 세포와 핵산을 적당한 완충액에서 함께 항온배양하고 세 포를 고전압 전기 펄스로 처리함으로써 세포에 도입시킬 수 있다. 전기천공에 의해 핵산이 세포로 도입되는 효율은 인가된 전기장, 전기 펄스의 길이, 온도, DNA의 형태와 농도 및 매질의 이온 조성 등에 의해 영향받는다. 전기천공은 각종 세포 종류를 안정적으로(또는 일시적으로) 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. 세포에 전기천공시키는데 유용한 프로토콜은 다음과 같은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.3 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), Sections 16.54-16.55 나 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다.

나출형 핵산을 세포로 도입시킬 수 있는 다른 방법으로는 리포좀 매개 트랜스펙션법(리포펙션)이 있다. 이때, 핵산은 양이온 지질을 함유하는 리포좀 현탁액과 혼합한다. 이 DNA/리포좀 혼합물을 그 다음 세포와 항온배양한다. 리포좀 매개 트랜스펙션법은 시험관내 배양물 중의 세포를 안정적(또는 일시적)으로 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있다. 이 프로토콜은 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.4 및 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. 또한, 생체내 유전자 전달법을 리포좀을 이용하여 수행하기도 하였다. 예컨대 문헌[Nicolau et al.(1987) Meth. Enz. 149:157-176; Wang and Huang(1987) Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 84:7851-7855; Brigham et al.(1989) Am. J. Med. Sci. 298:278; 및 Gould-Fogerite et al.(1989) Gene 84:429-438]을 참조할 수 있다.

나출형 핵산은 또한 이 핵산을 세포에 직접 주사하여 세포에 도입시킬 수 있다. 세포의 시험관내 배양물인 경우, DNA를 미세주사로 도입시킬 수 있다. 각 세포를 각각 미세주사하므로 이 시도는 다수의 세포를 변형시킬 때에는 매우 노동집약적인 방법이다. 그러나, 트랜스제닉 동물의 제조에는 미세주사가 최선의 방법이다(이하에 상세히 설명됨). 이와 같은 경우에, DNA는 동물로 발달할 수 있는 수정된 난모세포에 안정적으로 도입된다. 그 결과 얻어지는 동물은 난모세포에 도입된 DNA를 운반하는 세포를 함유하게 된다. 또한, 직접 주사법은 나출형 DNA를 생체내 세포에 직접 도입시키는 데에도 사용되었다(예컨대, Acsadi et al.(1991) Nature 332: 815-818; Wolff et al.(1990) Science 247:1465-1468). 생체내에서 세포에 DNA를 주사하기 위하여 전달 장치(예컨대, "유전자 총")를 사용할 수 있다. 이러한 장치는 시중에서 입수용이하다(예, 바이오래드 제품).

나출형 핵산은 수용체 매개의 세포이물흡수에 의해 흡수되는 세포-표면 수용체의 리간드에 결합되는 양이온, 예컨대 폴리리신과 복합체를 형성시킬 수 있다(예컨대, Wu, G. and Wu, C.H.(1988), J.Biol.Chem. 263:14621; Wilson et al.(1992) J.Biol.Chem. 267:963-967 및 미국 특허 제5,166,320호). 수용체에 대한 핵산-리간드 복합체의 결합은 수용체 매개의 세포이물흡수에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 한다. 세포내 리포좀에 의한 상기 복합체의 분해를 피하기 위하여, 천연적으로 엔도좀을 붕괴시켜 세포질에 물질을 방출시키는 아데노바이러스 캡시드에 결합된 DNA-리간드 복합체를 사용할 수 있다(예컨대, Curiel et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 88:8850; Cristiano et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:2122-2126). 수용체 매개의 DNA 흡수는 시험관내 또는 생체내에서 DNA를 세포에 도입시키는데 사용할 수 있으며, 부가적으로 당해의 표적 세포에서만 선택적으로 발현되는 수용체에 결합하는 리간드를 사용함으로써 DNA가 특정 세포 종류만을 표적으로 선택할 수 있다는 특징도 있다.

일반적으로, 나출형 DNA를 배양물 중의 세포에 도입시키는 경우(예컨대 전술한 트랜스펙션 기법 중 하나를 사용하여)에, 세포의 소량(10⁵개 중에서 약 1개)만이 일반적으로 트랜스펙션된 DNA를 자신의 게놈내로 통합시킨다(즉, DNA는 세포에서 에피좀으로 유지된다). 따라서, 이종 DNA를 흡수한 세포를 확인하기 위해서는 당해의 핵산과 함께 선택성 마커를 코딩하는 핵산을 세포에 트랜스펙션시키는 것이 유리하다. 바람직한 선택가능한 마커로는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 등의 약물에 대해 내성을 부여하는 것이 있다. 선택가능한 마커는 당해 유전자와 같은 플라스미드를 통해 도입하거나 별도의 플라스미드를 통해 도입시킬 수 있다.

유전자 산물을 코딩하는 핵산을 세포로 도입시키는 방법 중 바람직한 것은 유전자 산물을 코딩하는 핵산, 예컨대 cDNA를 함유하는 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스 벡터를 이용한 세포의 감염은 다량의 세포가 핵산을 수용할 수 있어서, 핵산이 수용된 세포를 선발할 필요가 없다는 장점이 있다. 또한, 바이러스 벡터 내에서 코딩된 분자, 예컨대 바이러스 벡터에 함유된 cDNA는 바이러스 벡터 핵산을 흡수한 세포에서 효과적으로 발현되는 바, 바이러스 벡터 시스템은 시험 관내 또는 생체내에서 사용할 수 있다.

결손형 레트로바이러스가 유전자 요법 목적의 유전자 전달에 유용하다는 것은 충분히 규명되어 있다(Miller, A.D.(1990) Blood 76:271). 재조합 레트로바이러스는 당해 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 레트로바이러스 게놈에 삽입시켜 제작할 수 있다. 또한, 레트로바이러스에 복제 결손성을 부여하기 위하여 레트로바이러스 게놈의 일부를 제거할 수도 있다. 이러한 복제 결손형 레트로바이러스는 표준 기법에 따라 헬퍼 바이러스의 사용으로 표적 세포를 감염시키는데 사용할 수 있는 비리온으로 팩키징한다. 재조합 바이러스 제작과 이 바이러스를 이용한 생체내 또는 시험관내 세포 감염 방법에 대해서는 문헌, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Section 9.10-9.14 및 다른 표준 실험서에서 찾아볼 수 있다. 적합한 레트로바이러스의 예로는 당해 기술분야에 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM이 있다. 적합한 팩키징 바이러스 세포주의 예로는 ψCrip, ψ2 및 ψAm이 있다. 레트로바이러스는 시험관내 및/또는 생체내에서 상피세포, 내피세포, 림프구, 근육모세포, 간세포, 골수세포 등의 다양한 여러 종류의 세포에 각종 유전자를 도입시키는데 사용되어왔다(예컨대, Eglitis et al.(1985) Science 230:1395-1398; Danosand Mulligan(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8039-8043; Feri et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al.(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89: 7640-7644; Kay et al.(1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al.(1993) J.Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 제4,868,116호; 미국 특허 4,980,286호; PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출원 WO 92/07573). 레트로바이러스 벡터는 핵산을 세포에 안정적으로 도입시키기 위하여 레트로바이러스 게놈( 및 여기에 삽입된 이종 핵산)이 숙주 게놈에 통합되도록 표적 세포의 분열을 필요로 한다. 따라서, 표적 세포의 복제를 자극할 필요가 있을 수 있다.

아데노바이러스의 게놈은 당해 유전자 산물을 코딩하여 발현하지만, 정상적인 용균 바이러스 생활환으로 복제하는 능력 면에서는 불활성화되도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Berkner et al.(1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al.(1991) Science 252:431-434; 및 Rosenfeld et al.(1992) Cell 68:143-155]을 참조할 수 있다. 아데노바이러스 균주 Ad 타입 5 dl324 또는 다른 아데노바이러스 균주(예, Ad2, Ad3, Ad7 등) 유래의 적합한 아데노바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 유전자 전달 매개체로서의 효과를 높이기 위하여 분열 세포를 필요로 하지 않아서 다양한 세포 종류, 예컨대 기도 상피(Rosenfeld et al. (1992) 상기 인용문헌), 내피세포(Lemarchand et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:6482-6486), 간세포(Herz and Gerard (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2812-2816) 및 근육 세포(Quantin et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:2581-2584)를 감염시키는데 사용할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 도입된 아데노바이러스 DNA( 및 이종 DNA 함유물)는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 에피좀 상태를 유지하여, 도입된 DNA가 숙주 게놈에 통합되기 시작하는 상황에서 삽입성 돌연변이유발의 결과로서 발생할 수 있는 잠재적 문제점(예컨대, 레트로바이러스 DNA)을 피할 수 있다.

또한, 이종 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 운반 용량은 다른 유전자 전달 벡터에 비하여 상당히 크다(최고 8 킬로베이스)(Berkner et al. 상기 인용문헌; Haj-Ahmand and Graham(1986) J.Virol. 57:267). 현재 사용되고 있는 대부분의 복제 결손형 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자 전부 또는 일부가 결실되고 아데노바이러스 유전자 물질 중 80% 정도는 보유하는 것이다.

아데노 관련 바이러스(AAV)는 효율적인 복제와 생산성 생활환을 위해 헬퍼 바이러스로서 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등과 같은 다른 바이러스를 필요로 하는 자연발생의 결손형 바이러스이다(Muzyczka et al. Curr. Topics In Micro. And Immunol. (1992) 158:97-129). 또한, 자신의 DNA를 비분열성 세포에 통합시킬 수 있는 몇 안되는 바이러스 중 하나로서, 높은 안정된 통합율을 나타낸다(예컨대, Flotte et al.(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al.(1989) J.Virol. 63:3822-3828; 및 McLaughlin et al.(1989) J. Virol. 63:1963-1973). AAV 300 염기쌍 정도만을 함유하는 벡터는 팩키징되어 통합될 수 있다. 이종 DNA를 위한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. 문헌[Tratschin et al.(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260]에 기술된 바와 같은 AAV 벡터는 DNA를 세포로 도입시키는데 사용할 수 있다. AAV 벡터를 이용하여 각종 핵산을 여러 세포 종류에 도입시킨바 있다(예컨대, Hermonat et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al.(1985) Mol. Cell Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al.(1988) Mol. Endocrinol.2:32-39; Tratscin et al.(1984) J.Virol. 51:611-619; 및 Flotte et al.(1993) J.Biol.Chem. 268:3781-3790).

특정 발현 벡터 시스템의 효율과 핵산을 세포에 도입시키는 방법은 당해 기술분야에 통상적으로 사용되는 표준 기법으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 세포에 도입된 DNA는 필터 하이브리드화 기법(예컨대, 서던 블롯팅)으로 검출할 수 있고, 도입된 DNA의 전사에 의해 생산된 RNA는 예컨대 노던 블로팅, RNase 차단 또는 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 등으로 검출할 수 있다. 유전자 산물은 적당한 분석법, 예컨대 생산된 단백질을 특이적 항체 등을 이용한 면역학적 검출, 또는 유전자 산물의 기능적 활성을 측정하는 기능적 분석법, 예컨대 효소적 분석법으로 측정할 수 있다. 세포에 의해 발현될 수 있도록 한 당해 유전자 산물이 용이하게 분석할 수 없는 것이라면, 발현 시스템을 먼저 사용되는 조절 인자와 벡터에 리포터 유전자를 결합시켜 최적화할 수 있다. 리포터 유전자는 쉽게 검출할 수 있는 유전자 산물을 코딩하는바 이 시스템의 효능을 평가하는데 사용할 수 있다. 당해 기술분야에 사용되는 표준 리포터 유전자로는 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제, 루시퍼라제, GFP/EGFP 및 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자가 있다.

세포 집단에 핵산을 도입시키는데 사용한 방법이 대부분의 세포를 변형시켜 서 그 세포에 의해 유전자 산물이 효율적으로 발현되도록 한다면(예컨대, 바이러스 발현 벡터를 사용하는 경우에 흔히 나타나듯이) 변형된 세포 집단은 그 집단에 존재하는 각 세포의 추가 분리 또는 2차 클로닝 없이 그대로 사용할 수 있다. 즉, 세포의 추가 분리가 필요하지 않을 정도로 상기 세포 집단에 의해 유전자 산물이 충분히 생성될 수 있다. 또는, 유전자 산물을 효율적으로 발현하는 세포를 분리하기 위하여, 변형된 단일 세포를 동일 변형을 가진 동종 세포 집단으로 증식시키는 바람직한 경우도 있다. 이와 같은 균일 세포 집단은 변형된 단일 세포를 한계희석클로닝법으로 분리한 뒤 배양물 중의 단세포를 표준 기법에 따라 클론성 세포 집단으로 팽창시킴으로써 제조할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 세포"란 용어는 삽입 또는 도입되는 세포에 대해 부분적 또는 전적으로 이종성, 예컨대 외래성인 핵산 서열이 삽입 또는 도입되어 있는 세포를 의미한다. 트랜스제닉 세포는 또한 이 세포의 내인성 유전자와 상동성인 핵산이 삽입되어 있는 세포일 수 있다. 이와 같은 경우에, 상동성 핵산은 이것이 삽입되는 세포의 게놈을 변형시킬 수 있는 방식으로 세포 게놈에 삽입하거나 삽입되도록 디자인한다. 예를 들어, 상동성 핵산은 천연 유전자의 추이와 상이한 삽입하거나 또는 특정 표현형을 녹아웃시키도록 상동성 핵산을 삽입시킨다. 세포에 삽입된 핵산은 선발한 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 1 또는 그 이상의 전사 조절 서열 및 기타 다른 핵산, 예컨대 인트론을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 미세기관 배양물은 악성 질환과 질병을 진단 및 치료하는데 도움을 주기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 기관의 생검(예컨대, 피부, 신장, 간 등)을 과증식 또는 신생증식 질환이 의심되는 환자로부터 채취할 수 있다. 생검 체외이식편을 본 발명의 방법에 따라 배양하면 체외이식편의 증식성 세포는 배양동안 클론적으로 팽창한다. 이에 따라 상기 질환을 조사할 수 있는 기회가 증가하여 진단의 정확성을 증가시킬 수 있다. 또한, 환자의 미세기관 배양물은 시험관내에서 세포독성 화합물 및/또는 약학적 화합물을 선발하는데 사용할 수 있고, 이에 따라 가장 효능이 높은 화합물, 즉 악성 세포 또는 질병 세포를 죽이지만 정상 세포에는 영향을 미치지 않는 화합물을 동정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 세포독성 화합물 성장/조절 인자, 약학적 제제 등의 각종 화합물을 선발하기 위한 목적에 본 발명의 미세기관 배양물을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 잠재적으로 독성 가능성이 있는 화합물에 대한 철저한 시험의 필요성은 보편적으로 인식하는 것으로서, 약물, 화장품, 식품 첨가제 및 살충제를 평가할 수 있는 민감하고 재현성있는 단기 시험관내 분석법의 개발 필요성은 자명한 것이다. 본 명세서에 설명된 미세기관 배양물은 조직 동등물을 분석 기질로서 사용가능케 하며 생체내 상태와 매우 유사한 시스템으로 정상 세포 상호작용의 장점을 제공한다.

이와 같은 목적을 위해, 배양물을 시험관내 유지시킨 후 시험 화합물에 노출시킨다. 세포독성 화합물의 활성은 체외이식편에 존재하는 세포의 표현형(예컨대 사멸)을 변조시키는 능력을 통해 측정할 수 있다. 이와 같은 측정에는 생생한 염색 기법, 마커 발현 등을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다 예를 들어, 성장/조절 인자의 효과는 배양물의 세포 함유물, 예컨대 총세포수 및 분화세포수를 분석하여 평가할 수 있다. 이 분석에는 형별 특이성 세포 항원을 규정하는 항체를 이용하는 면역세포화학 기법을 비롯한 표준 세포학적 및/또는 조직학적 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 시스템에서 배양한 정상 세포에 미치는 각종 약물의 효과를 평가할 수도 있다. 예를 들어, 건선 조직의 증식을 감소시키는 약물을 확인할 수 있다.

체외이식편에 있는 세포의 증식을 자극하는 제제의 검출을 위해 유도된 본 방법의 예시적 구체예로서, 본 방법은 대상으로부터 조직 체외이식편을 분리하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 체외이식편의 세포 집단은 이 체외이식편이 분리된 기관이나 조직의 미세구조를 보유하는 것으로서, 예컨대 체외이식편은 적어도 약 1.5mm^-1 이상의 알레프를 특징으로 하고 증식하는 능력을 보유한 적어도 하나의 세포를 포함하는 것이다. 이 체외이식편을 배양하여 후보 화합물과 접촉시킨다. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨을 측정하고, 후보 화합물의 부재하에 측정한 세포 증식의 레벨과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식 레벨의 통계적으로 유의적인 증가는 세포 증식제로서 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.

본 명세서에 사용된 "후보 화합물" 또는 "후보제"란 용어는 증식, 항증식, 분화, 항분화 또는 항바이러스 활성에 대해 시험하거나 시험할 제제를 의미하는 것이다. 이와 같은 제제는 예를 들어 작은 유기 분자, 생물학적 추출물 및 재조합 산물이나 조성물일 수 있다.

세포 증식을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 가장 일반적인 방법은 세포 복제시의 특징인 DNA 합성을 측정하는 것을 포함한다. DNA 합성을 측정하는 방법에는 당해 기술분야에 공지된 수많은 방법이 있고, 이 중 어느 한 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는, DNA 합성의 측정을 위해 방사능 표지 (³H-티미딘) 또는 표지된 뉴클레오타이드 유사체(BrdU)를 이용한 면역형광성 검출을 사용하였다.

또 다른 구체예에서는 세포 증식 억제제를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 전술한 바와 같은 조직 체외이식편을 제공하는 단계, 이 체외이식편을 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다. 후보 화합물의 존재하에 세포 증식의 레벨이 통계학상 유의적으로 감소한다는 것은 세포 증식 억제제임을 시사하는 것이다.

예시적 구체예에서는, 세포 증식의 증강제 및 억제제(본 명세서에서는 항증식제라고도 부름)를, 예컨대 목적 효과에 따라 털의 성장을 제어하는데 사용할 수 있다.

울(wool)과 털 같은 경질 각질 섬유의 성장은 표피집세포의 증식에 따라 달라진다. 집의 모낭 줄기 세포는 매우 활성적이어서 빠른 증식과 복잡한 분화를 통해 모섬유를 발생시킨다. 이러한 털 순환에는 뚜렷한 3단계가 있다: 성장기(증식), 퇴행기(퇴화) 및 휴지기(휴식). 모낭의 표피 줄기세포는 휴지기 후반 중에 표피 유두에 의해 활성화된다. 이를 "돌출 활성화"라 한다. 또한, 이와 같은 줄기세포는 털 및 모낭 구조는 물론 피지선 및 표피도 발생시키는 다능성 줄기세포로 사료된다. 세포증식제와 세포증식 억제제는 털 성장 순환의 동태를 변화시키는 수단으로서, 예컨대 모낭 세포, 구체적으로 모낭의 줄기세포의 증식을 정지시킨다.

모낭 세포 증식의 억제제는 절단, 면도 또는 털뽑기 등에 의한 통상적인 제거방식과는 다르게 인간의 털 성장을 감소시킬 수 있는 방법으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 확인된 모낭세포 억제제는 털의 급속 또는 치밀한 이상 성장을 특징으로 하는 털증, 예컨대 털과다증의 치료에 사용할 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 이러한 억제제는 이상 털증으로 표시되는 질환인 다모증을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 억제제의 사용은 탈모 기간을 연장시키는 방법을 제공할 수 있다.

모낭 세포 증식의 억제제는 또한 세포 주기의 S기로 진행되어야 효능을 발휘하는 세포독성제로부터 모낭 세포를 보호하는데 사용할 수 있다. 이러한 억제제로의 처리는 모낭 세포를 정지기로 유도하여 보호작용을 제공하는데, 예를 들어 세포가 S기로 진행되지 않도록 억제하여 모낭세포의 유사분열 파국 또는 예정세포사멸을 방지하는 것이다. 예를 들어, 모낭 세포증식의 억제제는 통상적으로 탈모를 초래하는 화학치료법이나 방사선요법을 받는 환자에게 사용할 수 있다. 억제제 처리는 이러한 치료 중에 세포 순환의 진행을 억제함으로써, 세포 사멸 프로그램의 활성화로 나타날 수 있는 사멸로부터 모낭세포를 보호할 수 있다. 치료가 종결된 후에는 모낭 세포 증식을 억제할 필요가 없으므로 억제제 처리도 없앨 수 있다.

하지만, 털 성장 조절에 근본적인 분자 기작을 규명하고자 개시하고 털에 영향을 미치는 잠재적 약물을 시험하기 위하여 털 성장의 시험관내 모델이 필요하다. 본 발명의 일 양태로서, 본 방법은 모낭의 미세구조를 보유하는, 예컨대 모낭의 상피층과 모낭의 기질 성분(표피 유두), 예컨대 줄기 세포, 외근집세포, 간질 세포 및 내근집세포 중 하나 이상 사이의 상호작용을 보유하는 모낭 미세기관 체외이식편을 제조하는데 사용한다. 후속되는 실시예에서 입증되듯이, 털 성장은 혈청의 부재하에서도, 예컨대 최소 배지에서도 상기 미세기관 배양물에서 관찰된다. 중요한 것은, 본 발명이 실질적으로 휴지기, 예컨대 휴식 상태에 있는 모낭을 제공하는 모낭 배양물을 제공한다는 점이다. 이하에서 입증되는 같이, 휴지기 모낭 체외이식편은 시험관내 배양물에서 증식성인 성장기 모낭으로 활성화될 수 있고, 특정 구체예에서는 동조적 방식으로 활성화될 수 있다. 일시 증식 초기의 모낭의 표피 줄기세포는 예를 들어 모낭 기관의 각종 조직에서 생산되는 주변분비 인자 및/또는 자가분비 인자들에 매개되는 것과 같은 성장기의 활성화를 이해할 수 있는 유일무이한 기회를 제공한다.

또한, 본 발명의 미세기관 배양물은 모낭의 활성화 또는 불활성화를 변조시키는 제제를 동정할 수 있는, 예컨대 털 성장을 촉진 또는 억제할 수 있는 제제를 동정하는 시스템을 공급한다. 일 구체예로서, 하기 실시예 XVIII에 기술된 바와 같은 휴지기(휴식 상태) 모낭 체외이식편을 각종 시험 제제와 접촉시킨 후, 모낭의 자극 레벨을 측정한다. 예를 들어, 모낭 줄기세포의 휴지기에서 성장기로의 전이는 모낭 세포의 유사분열 지수를 관찰하거나 또는 증식을 측정할 수 있는 다른 유사한 방법을 사용하여 모니터할 수 있다. 일 예로서, 도 17은 체외이식편에 존재하는 줄기세포 활성화의 상대적 레벨을 시험 화합물(이 도면에서는 FGF)의 존재 또 는 부재 하에 측정하기 위하여 티미딘 병입률을 사용할 수 있고 증식 증가가 털 성장 촉진 활성이 있는 시험 제제임을 시사한다는 것을 보여주는 것이다.

역 분석에서, 예를 들어, 첨부된 실시예에 기재된 활성화된 센카(Sencar) 체외이식편 또는 성장 인자 자극된 체외이식편(예를 들어, FGF 자극됨)와 같은 성장기 미세기관 체외이식편은 배양물로 제공된다. 예를 들어, 비처리된 모발성장 체외이식편에 상대적으로 모발 난포 줄기 세포의 성장을 억제하는 시험 제제가 추가로 모발 성장을 방해하는, 휴지기(telogenic) 제제용으로서 고려될 수 있다.

여전히 또 다른 양태에서, 대상 분석에 의해 동정된 세포 증식(예를 들어, 종양 형성 및 성장)의 억제제를 사용하여 신생 또는 과다증식 세포의 성장을 억제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태는 상피 종양 형성 및 성장의 억제에 관한 것이다[문헌참조: 1995년 2월 7일자로 출원된 미국 특허원 제08/385,185호]. 세포 증식의 조절이 변화되고 세포와 이들 주변 세포간의 상호작용으로 인해 침투 및 전이를 유발하는 장애의 결과로서 종양이 형성된다. 세포 분열로 부터 비롯되는 세포 수의 증가와 분화 또는 세포 사멸로 인한 세포 주기로 부터의 이탈간의 상호관계의 파괴가 세포 증식의 조절을 방해한다. 정상적인 조직에서, 항상성은, 각각의 줄기 세포가 분열함으로써 2개의 딸 세포중 하나만이 줄기 세포 구획부에 유지되고 또 다른 하나의 딸 세포는 분화 경로를 거치도록 보장됨에 의해 유지된다[문헌참조: Cairns, J.(1975)Nature 255:197-200]. 따라서, 세포 증식의 조절은 이들 과정에 영향을 주는 시그날에 의한 것이다. 이들 시그날은 양성 또는 음성일 수 있고 종양원성은 이들 조절 지점에 영향을 주는 유전학적 변화에 의해 획득된다.

실시예 IX에 기술되고 도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 피부 미세기관 배양물이 세포 증식 제제 및 세포 증식의 억제제를 동정하기 위해 사용되었다. 실시예 IX에 기재된 바와 같이, TGF-β가 시험되었고 세포 증식의 억제제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원인 액티빈 단백질은 또한 상피 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 상피 세포의 증식을 억제하는 데 관여하는 TGF-β 패밀리의 또 다른 구성인이 존재할 수 있음을 지적한다. 당해 데이타는 상피 항상성의 중요한 조절인자로서 및 생체내 상피 종양 형성 및 성장을 억제하는데 있어서 TGF-β 패밀리의 단백질에 대한 역할을 제안한다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포 분화 제제, 즉, 세포 분화를 유발하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 세포 집단이 세포가 분리되는 기관 또는 조직의 미세 구조를 갖고 표면적 대 부피 지수가 약 1.5mm^-1 이상인 세포 집단을 대상으로부터 분리시킴을 포함하고 분화 능력을 갖는 하나 이상의 세포를 포함한다. 이어서, 세포는 약 24 시간 이상동안 배양물에 부가하고 후보 화합물과 접촉시킨다. 이어서, 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 수준을 측정하고 후보 화합물의 부재하의 세포 분화 수준과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 통계학적으로 상당한 세포 분화 수준의 증가는 후보 화합물이 세포 분화 제제임을 암시한다. 본원에 기재된 바와 같은 분화는 세포가 고유적으로 소유한 형태 및 기능뿐만 아니라 또는 이들과는 상이한 획득된 형태 및/또는 기능을 갖는 세포를 언급한다. 전형적으로 이들 형태 및 기능은 성숙한 세포의 특징이다. 본 발명의 세포 집단의 분화는 특정 세포 생성물의 생성 및/또는 분비를 측정하여 모니터할 수 있다.

유사한 방식으로, 본 발명은 또한 세포 분화의 억제제를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기한 바와 같은 동일한 프로토콜에 따라, 후보 화합물의 존재하에 세포 분화의 수준을 측정하고 후보 화합물의 부재하의 세포 분화 수준과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 세포 분화 수준의 통계학적으로 상당한 감소는 세포 분화의 억제제임을 암시한다.

또 다른 양태에서, 대상 배양물은 바이러스 감염에 대한 시험관내 모델을 확립할 수 있게 한다. 예를 들어, 상피 또는 편평 조직은 분리될 수 있고 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1, 헤르페스 심플렉스 바이러스 2와 같은 헤르페스 바이러스; 바리셀라-조스터 바이러스 또는 사람 파필로마 바이러스, 예를 들어, 사람 파필로마 바이러스 1-58, 예를 들어, HPV-6 또는 HPV-8과 같은 사람 파필로마 바이러스에 감염될 수 있다. 유사하게, 간 모델은 간염에 대해, 예를 들어, 간염 바이러스, 예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스로 감염된 체외이식편으로서 제공될 수 있다. 바이러스로 감염된 조직 체외이식편을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 바이러스 감염 능력의 억제제를 동정할 수 있다. 상기한 바와 같이, 특정 미세기관 배양물이 제공되고 세포를 감염시켜 바이러스 감염된 세포 집단을 생성하는 바이러스와 임의로 접촉시킨다. 이어서 바이러스 감염된 세포는 후보 화합물과 접촉시키고 후보 화합물의 존재하에 바이러스 감염 능력의 수준을 측정한다. 후보 화합물의 존재하에 바이러스 감염 능력의 측정된 수준은 후보 화합물의 부재하의 바이러스 감염 능력의 수준과 비교한다. 후보 화합물의 존재하에 바이러스의 감염 능력 수준의 통계학적 상당한 감소는 바이러스 감염 능력의 억제제임을 암시한다.

바이러스 감염 능력을 측정하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 사용되는 바이러스 유형에 따라 다양하다. 예를 들어, 바이러스 감염 능력 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 하나의 방법은 미세기관 배양물의 감염된 세포 또는 시험될 특정 바이러스에 특이적인 유전자 생성물을 갖는 미세기관 배양 배지에서의 생성 수준을 측정하는 방법이다. 예를 들어, 미세기관 배양물내의 세포에 대한 B형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스의 감염 능력의 수준을 측정하기 위해, 간염 단백질의 생성 및 간염 DNA를 정량할 수 있다. 일반적으로, 미세기관 배양물 배지는 선택된 바이러스 단백질 및 SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ELISA상에서 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 분석된 면역반응성 단백질에 대한 항체와 항온처리할 수 있다. 예를 들어, B형 간염 바이러스 표면 항원의 생성을 측정하기 위해, B형 간염 바이러스와 이전에 항온처리된 미세기관 기원의 미세기관 배양 배지를 매일 일정 간격으로 샘플 채취하여 제조업자가 기재한 바와 같은 ELISA(Abbott) 방법에 의해 표면 항원에 대해 분석할 수 있다. 정량을 위한 당해 방법은 연속 희석된 표준 표면 항원(CalBiochem)을 사용하여 변형될 수 있다. 배양 배지내 B형 간염 바이러스 표면 항원의 축적에 있어서 통계학적으로 상당한 감소는 시험된 후보 화합물이 간염 바이러스 감염 능력에 대한 억제제임을 지적한다.

미세기관 배양 배지내 HBsAg의 수준을 측정하는 것뿐만 아니라, 미세기관 배양물 기원의 세포 추출물로부터 새롭게 합성된 B형 간염 바이러스 DNA를 DNA의 PCR 증폭에 이어서 프로브로서 HBV pre-S(HBsAg 코딩) 영역내 표지된 프라이머 쌍을 사용한 서던 블롯 분석에 의해 검출하고 정량할 수 있다[문헌참조: Sambrook, J. Et al.(1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed., vol. 2, pp. 10.14-10.15]. 점도 측정기에 의해 상대적으로 정량화될 수 있고 상응하는 밴드의 섬광 계수에 의해 확인될 수 있다. 새롭게 합성된 바이러스 DNA의 감소는 시험된 후보 화합물이 간염 바이러스 감염 능력의 억제제임을 지적한다.

또 다른 예에서, 레트로바이러스, 예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 gag, pol 및 env 단백질 생성물은 또한 상기된 기술 및 당해 기술 분야에 공지된 기타 표준 기술에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, HIV로 감염된 미세기관 배양물의 세포내 pol 단백질 발현은 세포 추출물을 항 pol 항체 또는 수거된 AIDS 환자 혈청 및 SDS/폴리아크릴아마이드 겔상에서 분석된 면역반응 단백질로 항온처리함에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 미세기관 배양물내에서 헤르페스 바이러스, 예를 들어, 엡스타인/바르 바이러스(EBV)의 감염 능력을 측정하기 위해, EBV DNA 및 EBV-유도된 핵 항원 생산은 본원에 기재된 방법을 사용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 미세기관 배양물을 또한 사용하여 대상내 상처 치유를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로, 수용자내 상처 치유를 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 공여자로부터 표면적 대 부피 지수가 약 1.5mm^-1 이상인 세포 집단을 분리시킴을 포함한다. 전형적으로, 세포 집단은 약 24시간이상 동안 배양물내 부가한다. 이어서, 세포 집단은 수용자의 상처에 적용될 수 있다. 한 양태에서, 상처 또는 병변은 느린 치유 또는 만성 상처, 예를 들어, 당뇨병과 연관된 상처, 예를 들어, 화상, 예를 들어, 궤양이다. 실시예 X 및 XI에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 피부 미세기관 배양물은 미소 체외이식편으로서 사용되어 만성 상처(실시예 X)에 적용될 수 있고 모발을 성장시킬 수 있는 생존 이식체(실시예 XI)를 형성할 수 있다.

여전히, 또 다른 양태에서, 대상 미세기관 체외이식편은 세포독성 또는 자극에 대한 시험 분석에 제공된다. 예시적인 양태에서, 대상 방법은 시각 및 표피 자극제에 관한 시험관내 시험 기술을 제공한다. 상기한 바와 매우 유사한 방법은 액체, 고체 과립 또는 겔형 물질(예를 들어, 화장제)를 본 발명의 미세기관 배양물에 국소 적용함에 이어서 배양물내 생성된 효과를 검출하는 단계를 포함한다.

현재, 많은 화학물질, 가정용 세정 제품, 화장품, 페인트 및 기타 물질의 잠재적인 안구 및 피부 자극은 동물 또는 인간 대상에 직접 적용하여 평가된다. 그러나, 산업 분야에서 대부분 평가되는 바와 같이, 당해 방법은 압도적으로 대중의 호응에 부적합하다. 본 발명의 방법은 동물의 희생 또는 영구적인 상해를 입힐 필요가 없는 또 다른 분석법을 제공하고 또한 목적하는 포맷으로 데이타를 제공한다. 예시적인 양태에서, 피부 미세기관 배양물은 본 발명에 따라 유도된다. 배양된 체외이식편은 화장품 제제와 같은 시험 제제와 접촉시키고 세포 생존력은 노출 후 몇몇 시점에서 평가한다. 바람직한 양태에서, MTT 분석(기능적인 미토콘드리아에 의한 테트라졸륨 감소를 기준으로 함)을 사용하여 생존력에 대해 점수를 매긴다.

본 원의 미세기관 배양물은 추가로 조직 및 세포의 정상적인 항상성에 관여하는 인자를 동정하고 영양물의 변화 및 잠재적으로 독성인 제제의 존재를 포함하는 세포의 환경에서 변화에 대해 조직 및 세포의 정상적인 항상성에 대한 효과를 연구하고 병리 또는 외상의 초기 및 진행 동안에 유발되는 조직 및 세포내 변화 경로를 연구하고 병리 또는 외상과 연관된 변화된 환경에서 역효과를 역전시키는 복구 기작을 동정하고 조직의 정상적인 항상성 동안에 분화하는 세포의 발육 조절 및 조직내 특정 구조(예를 들어, 모발 난포)의 발육 조절 및 개인 기관의 일부가 보존되지만 만성 피부 궤양을 갖거나 부적합한 혈액 공급에 의해 유도되는 치유 결핍을 갖거나 국소 피부가 당뇨병 I형 또는 II형으로서 공지된 증상에서와 같이 치유 불가능한 환자에서 발생하는 바와 같은 손상된 조직을 대체하거나 복원시키는데 불충분한 기관 보충에 관한 연구를 수행하는데 사용될 수 있다.

개괄적으로 기재된 본 발명은 지금부터, 본 발명의 특정 측면 및 양태를 단지 설명할 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하고자는 하는 것이 아닌 하기의 실시예를 참조로 용이하게 이해될 것이다.

성인 사람 피부, 마우스, 기니아 피그 및 래트 피부를 포함하는 동물 기원의 미세기관 배양물을 분리하고 21일 이하동안 배양하여 성장시킨다. 그러나, 21일을 초과하는 배양 기간을 유지하는 것은 본 발명의 범위내에 있다.

추가로, 광범위한 동물로부터 미세기관 배양물을 형성하는 것은 본 발명의 범위내에 있다. 다양한 동물은 단지 예시적인 것이고 하기에 제공된 샘플에 제한 되지 않는다.

첨부된 실시예에서 기재된 바와 같이, 미세기관 배양물은 피부로부터 또한 포유동물 췌장, 간, 신장, 십이지장, 식도 및 방광을 포함하는 기관으로부터 제조된다. 유사하게, 포유동물 각막, 신장, 유방 조직 및 다양한 내장 유래의 조직뿐만 아니라 장 및 결장과 같은 식도 기원의 상피의 미세기관 배양물은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 실질적으로, 체내의 식도/간질 구조를 포함하는 임의의 부위로부터 미세기관 배양물을 분리하고 유지시키는 것은 본 발명의 범위내에 있다.

상기에도 불구하고, 대상 미세기관 배양 기술은 특정 림프 조직, 예를 들어, 흉선 및 비장 체외이식편와 같은 식도/간질 구조를 갖지 않는 조직 기원의 장기 배양에서 조직 체외이식편을 보존하는데 사용되어 왔다.

실시예 I

표피의 미세기관 배양물의 제조

신선한 피부를 수술 후 수득하고 하부 지방 조직으로부터 세정하고 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 수단을 사용하여 0.4 x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 최종 조직 절편의 차원이 폭이 4mm이고 두께가 0.3mm이 되도록 멸균 조건하에서 300㎛ 분획으로 가로로 절단한다(도 1 참조). 이들 마이크로그랜스를 1일 내지 8일 기간동안 12rpm에서 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 5% CO₂하에, 무혈청하에 DMEM 400㎕중의 24웰 미량평판중에 놓는다. 20개의 미세 체외이식편을 웰당 성장시킨다.

실시예 II

마우스, 기니아 피그 및 사람 표피 미세기관 배양물의 증식 측정

미세기관 배양물을 실시예 I에 따라 제조하고 세포 증식은 하기와 같이 DNA 합성 양을 분석하여 측정한다. 마우스 피부 및 기니아 피그 피부를 2일동안 성장시키고 사람 피부를 4일동안 성장시킨 후, BrdU를 배지에 최종 농도가 3시간동안 100μM이 되도록 배지에 첨가함에 이어서 4% 포름알데하이드 중에서 세포를 고정화시킨다. 고정화 후, 배양물을 염소 항-BrdU 항체에 이어서 항 염소 FICT 표지된 IgG로 염색한다. 조직학적 제제는 하기의 고정화에서 4% 포름알데하이드중에 매립시키고 3㎛의 조각으로 절단하고 메틸렌 블루로 염색시킨다.

배양한 지 2일 내지 4일 후에 시험관내에서 DNA를 합성할 수 있는 세포 분획이 생체내에서 관찰되는 값과 비교하여 10배까지 증가하였고 이후에, DNA 합성 속도는 점진적으로 감소되었지만 배양물내에서 10일 이하 동안 높게 유지되었다(도 2, 3 및 4A 내지 4D 참조). 심지어 배양 6일째에, 세포는 안정한 상태의 증식 및 분화를 유지하여 조직 구조가 보존되었다[도 5A 내지 5C 참조].

실시예 III

미세기관 배양물내 다양한 크기의 세포 증식

기니아 피그 미세기관은 실시예 I에 따라 제조한다. 폭이 4mm인 전체 두께 피부 스트립을, 두께가 300, 450, 600, 700, 900, 1200 및 3000㎛인 조각을 포함하는 다양한 두께의 체외이식편으로 절단한다. 이들 조각은 각각 2일동안 무혈청 배지를 포함하는 웰에 각각 첨가한다. BrdU는 최종 농도 100μM에서 종결하기전에 4시간동안 첨가한다. 체외이식편을 이어서 4% 포름알데하이드중에서 고정화하고 BrdU에 대한 염소 항체로 염색시킴에 이어서 항 염소 IgG FITC 표지된 2차 항체 제제로 염색시킨다. 당해 실험의 결과는 도 6에서 설명한다. 세포/유니트 조직의 수의 함수로서 BrdU 병입양은 체외이식편의 두께가 증가함으로써 상당히 감소한다.

실시예 IV

췌장 미세기관 배양물의 제조 및 세포 증식의 측정

기니아 피그 췌장을 제거함에 이어서 두께가 300㎛이고 폭이 4mm이고 깊이가 2mm인 절편으로 적합한 조직 절단기를 사용하여 췌장 미세구조가 유지되는 방식으로 절단한다. 미세 체외이식편은 2 내지 18일의 여러 기간동안 배양물에서 성장시킨다. 7개의 미세기관을 12rpm의 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO₂하에 무혈청 DMEM 150㎕중에서 플레이트의 96웰 각각에 부가한다. BrdU를 최종 농도 100μM에서 종료하기 3시간 전에 첨가하고 이어서 체외이식편을 4% 포름알데하이드중에 고정화시키고 BrdU에 대한 염소 항체로 염색시킴에 이어서 항 염소 FITC 표지된 IgG로 염색시킨다. 도 7A 내지 7B는 췌장 유래된 미세기관내의 세포가 활성적으로 증 식하고 있음을 도시한다.

실시예 V

췌장 미세기관 배양물의 제조 및 배양 배지로의 인슐린 분비의 측정

성체의 피그 췌장 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. 췌장을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 길이로 절단하고 두께가 300㎛이고 폭이 4mm인 절편으로 조각낸다. 미세기관 배양물을 무혈청 배지에서 14일동안 성장시킨다. 2일 마다, 배지를 제거하고 신선한 배지를 첨가한다. 수거된 배지는 표준 방사선면역분석 방법을 사용하여 인슐린 함량에 대해 분석한다.

실시예 VI

피그 췌장 미세기관의 이종 대상으로의 이식

성체의 피그 췌장 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. 췌장을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 길이로 절단하고 두께가 300㎛이고 폭이 4mm인 절편으로 조각낸다. 이어서 미세기관 배양물을 무혈청 배지에서 0 내지 5일의 상이한 시점동안 성장시키고 배양한 후, 췌장 미세기관을 배양물로부터 제거하고 래트 숙주의 내장 및 산 분비 중배엽 둘 다로 이식한다. 미세기관은 1개월 이상 생체내 생존하고 널리 혈관화된다. 생체내 3일, 5일, 7일 및 14일 후, 광범위한 세포 증식을 검출할 수 있다. 더욱이, 양성 인슐린 염색이 이식 후, 4일, 7일 및 30일 후에 생체내에서 관찰된다.

실시예 VII

간, 신장, 십이지장, 식도 및 방광 미세기관 배양물의 제조 및 미세기관 배양물에서 세포 증식의 측정

여러 상피 조직 함유 기관으로부터의 기니아 피그 미세기관 배양물은 피부에 대한 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. 기관을 제거하고 가위로 2mm의 적당한 폭, 3mm의 길이로 절단하고 300㎛의 두께의 절편으로 조각낸다. 미소 배양물을 무혈청 배지에서 3일, 4일 및 6일동안 배양한다. 실험을 종료하기 12시간 전에, ³H-티미딘을 체외이식편의 배양물에 첨가한다. 종료시에, 조직을 고정화하고 여러 번 세정하고 섬광 계수기로 계수한다. 당해 실험의 결과는 도 9에 도시되어 있다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, 모든 조직은 활성적인 증식을 나타내고 ³H-티미딘의 흡수에 의해 결정되는 바와 같이 6일동안 계속된다.

실시예 VIII

미세기관 배양물에서 모발 난포의 증식

피부 미세기관 배양물은 실시예 I에 따라 제조하고 2일동안 배양한다. BrdU를 배양 종료 3시간 전에 첨가한다. 세포를 4% 포름알데하이드중에 고정화시키고 염소 항 BrdU 항체에 이어서 항 염소 FITC 표지된 IgG로 염색한다. 정상적인 주변 여건하에서 생체내에 존재하는 온전한 모발 난포는 정확하게 조절되는 배양 조건하 에서 유지할 수 있고 혈정 또는 임의의 기타 외인성 인자를 첨가할 필요가 없다. 이들 미세기관에서 모발 난포 세포는 대다수의 모발 난포 세포가 BrdU를 병입함에 의해 지적되는 바와 같이 본 발명의 방법의 조건하에서 몇일동안 왕성하게 증식하는 것으로 밝혀졌다[도 10A 내지 10C). 미세기관 기니아 피그 배양물의 시간 제로에서 및 2주 후에 모간의 크기 분포는 도 11에 도시되어 있다. 2일마다 배지를 교환하다. 모간 크기는 임의대로 소형, 중형 및 대형으로 분류한다. 배양 9일 후에, 명백하게 크기 분포가 전환되어 소형 모발의 %가 64%에서 28%로 감소된 반면 배양 초기에 존재하지 않았던 대형 줄기가 줄기 집단의 30%를 차지하였다.

실시예 IX

세포 증식에 대한 후보 화합물의 효과를 측정하기 위한 분석 준비

배양물은 실시예 I에 기재된 바와 유사한 성장 조건에서 합성 배지에서 제조하고 유지한다. 대조군 샘플은 면역조직화학에 의해 분석하여 미세기관 배양물이 생체내에서 발생하는 것과 유사하는 방식으로 유지됨을 결정한다.

피부 미소 배양물의 2중 샘플을 2.5ng/ml의 TGF-β로 처리한다. BrdU 표지된 세포/체외이식편의 수의 정량적인 분석은 실시예 II에 따라 수행한다. 90% 초과의 DNA 합성의 억제가 대조군과 비교하여 TGF-β의 존재하에 관찰된다(도 12).

실시예 X

만성 비치유 피부 궤양의 치유를 촉진시키는 방법

본 방법에 따라, 정상적인 비관여 피부 이식체의 적은 면적을 환자로부터 제거하고 두꺼운 폭이 4mm이고 두께가 0.3mm인 미소 체외이식편을 실시예 I에 기재된 바와 같이 제조한다. 그러나, 당해 제제는, 0.3mm의 조각으로 절단이 고의로 불완전하여 일편의 절편이 도 13에 지적된 바와 같이 함께 유지되고 있고 상단 상피 층은 간질층을 포함하고 있다는 점에서 실시예 I와는 상이하다. 이식체의 디자인은 영양물이 모든 세포에 도달할 수 있지만 조직 조각이 조작 가능한 포맷으로 유지될 수 있도록 지향된다. 환자의 상처를 세정하고 주변 피부 가장자리를 제거한다. 이어서 피부가 없는 영역은 미소 체외이식편으로 덮고 이는 비 절편된 가장 자리가 상향되고 반대 절편 조각이 상처내 유체내에 매달리도록 상처에 위치한다. 충분한 미소 체외이식편을 제조하여 모든 상처 영역을 실질적으로 덮는다. 이어서 처리된 영역을 적합한 드레싱으로 덮고 치유되도록 방치한다.

실시예 XI

생체내 모발 난포의 증식

피부의 1cm² 영역이 마우스로부터 제거되고 불완전하게 미세 절편되어 전체 피부 영역의 각질이 상기된 바와 같이 잔류하는 생체내 동물 실험을 수행한다. 미세기관을 봉합된 마우스내 본래 위치로 재이식하고 치유되도록 방치한다. 이식체는 생존 상태를 유지하고 동물 조직으로 병입되고 신규 모간이 배양한 지 1 내지 2주 후에 이식체로부터 성장한다(도 14 참조).

실시예 XII

사람 췌장 피부 미세기관 배양물

82세 노년 환자 기원의 분할 두께의 건선성 피부를 피부절단기를 사용한 해부후 수득한다. 이어서 피부를 0.5 x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 이것은 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치를 사용하여 300㎛의 절편으로 가로로 절단한다. 이들 미세기관 절편을 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO₂하에 무혈청 DMEM하에 미량평판에 부가한다. 몇몇 경우에, 성장 인자를 배양 배지에 첨가한다. 배지를 2일 마다 갈아준다. 사람 건선성 피부를 미세기관 배양물로서 광범위하게 증식시킨다.

실시예 XIII

간염 바이러스로 감염된 간 미세기관 배양물

사람, 래트, 마우스 및 기니아 피그 간을 절단하고 미세기관 배양물로서 실시예 VII에서 기재한 바와 같이 배양한다. 이들 미세기관 배양물중의 활성 증식을 본원에 기재된 바와 같은 BrdU 병입을 사용하여 검출한다. 이들 미세기관 배양물에서 간세포는 배양한 지 14일 이상 후에 우레아(Sigma Chemical, 우레아 검출 키트) 및 알부민 생산(ELISA)에 대한 분석에 의해 측정된 바와 같이 기능적인 것으로 결정되었다.

상기 제조된 사람 간 미세기관 배양물을 B형 간염 바이러스 및 C 형 간염 바이러스에 대해 양성인 환자 기원의 혈청과 항온처리한다. 24시간 후에, 배지를 제거하고 10%의 정상적인 태아 소 혈청(FCS)의 존재 및 부재하에 신선한 DMEM을 첨가한다. 2일 마다, 배양 배지를 신선한 배지로 교환하고 조건화된 배지를 바이러스 단백질 HB에 대한 항체를 사용하여 바이러스 입자에 대해 시험한다. 상당한 수의 바이러스 입자의 증가는 FCS의 존재하에 당해 미세기관 배양물에서 4일 후 검출된다.

실시예 XIV

흉선 및 비장 미세기관 배양물

흉선 및 비장 기원의 마우스 및 래트 미세기관 배양물은 필수적으로 피부에 대해 이전의 실시예에서와 같이 제조한다. 기관을 제거하고 가위로 폭이 2mm이고 길이가 3mm이 되도록 절단한다. 이어서, 이들 샘플을 적당한 조직 절단기를 사용하여 기관의 필수 미세구조를 보존하는 방식으로 대략적으로 300㎛의 두께를 갖는 체외이식편으로 조각낸다. 이어서 미세기관은 무혈청 배지에서 1, 3, 5 및 10일동안 배양한다. 이들 미세기관 배양물중에서의 활성 증식은 본원에 기재된 바와 같이 BrdU 병입을 사용하여 검출한다.

실시예 XV

골수 미세기관 배양물

골수 기원의 미세기관 배양물은 래트 및 마우스의 대퇴부로부터 온전하게 골수를 주의깊게 제거하여 제조한다. 당해 생체외이식편에서 골수의 직경은 단지 약 1 내지 2mm이기 때문에, 골수는 직접 조직 절단기를 사용하여 두께가 300㎛인 미세기관 체외이식편으로 조각낸다. 당해 방법은 골수의 미세구조가 보존되는 동시에 장기 배양에 따르는 표면/부피 지수를 유지하도록 보장한다. 이들 미세기관 배양물에서 골수 세포의 활성 증식은 본원에 기재한 바와 같이 BrdU 병입을 사용하여 검출한다.

실시예 XVI

유전자 생성물의 피부 미세기관 배양물로의 전달

본 발명의 미세기관 배양물에 고유적인 높은 표면적 대 부피은 다양한 유전자 전달 기술을 위해 용이하게 접근할 수 있는 방법을 허용한다. 본 실시예에서, 미세기관 배양물은 전기 천공 및 리포펙션을 사용하여 외래 유전자로 트랜스펙션시킨다. 미세기관 배양물은 동물에게 이식될 수 있고 약 30일 이상동안 생체내에서 생존하고 혈관화된다. 이것은 생체외 유전자 치료 프로토콜에서 조직의 MC 배양물을 사용하는 가능성을 입증한다. MC 배양물의 추가의 잇점은 체내의 한정된 위치로 이식될 수 있어 필요에 따라 후에 쉽게 제거될 수 있다. 이것은 세포가 이동할 수 있거나 정상 조직에서 상실되는 체내로의 세포 현탁액의 이식과는 대조적이다.

기니아 피그 피부를 절개하고 폭이 2mm이고 두께가 300㎛인 절편으로 조각낸다. 피부를, 페니실린 및 스트렙토마이신을 제조업자의 추천된 농도로 함유하는 무혈청 듈베코 최소 필수 배지에서 미세기관으로서 배양한다. 37℃에서 및 5% CO₂에서 1일 배양한 후, 피부 미세기관 배양물을, 항생제 없이 DMEM으로 세정하고 0.4cm 갭 1회용 전기 천공 큐벳에 빙상에서 배지 500㎕를 첨가한다.

지적된 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA 10㎍을 나타낸 바와 같이 첨가한다(각각의 플라스미드는 β-갈락토시다제(대조군) 또는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 구동시키는 사이토메갈로바이러스 프로모터를 갖는다). 루시퍼라제 플라스미드 골격은 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 프레임과 융합되는 pRC-CMV(Invitrogen)이다.

샘플을 도 15에 나타낸 바와 같이 220mV 및 다양한 전기용량(고 = 900μF, 중 = 500μF, 저 = 250μF)에서 전기천공한다. NIH3T3을 바이오-래드 전기천공 장치로 250μF에서 처리한다. 이어서 샘플을 추가로 10% 태아 소 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루탐산을 함유하는 DMEM으로 24웰 배양 플레이트에서 2일동안 항온처리한다. 배지를 제거하고 샘플을 세포 배양 용해 시약(Promega) 약 700 ㎕중에 현탁시킨다. 조직 단편을 균질화하고 이어서 20㎕를 루시퍼라제 분석 시약(Promega) 100㎕에 첨가하고 팩카드 탑카운트로 3회 발광을 검출한다. 양성 대조군으로서, 75cm 배양 플라스크 기원의 NIH3T3 세포를 트립신 처리하고 동일하게 미세기관 배양물도 처리한다. 도 15에 도시된 바와 같이, 중(500μF) 및 저(250μF) 전기용량 셋팅에서 상당한 루시퍼라제 활성이 검출된다. 비교를 위해, 유사한 양의 NIH3T3 불멸의 배양 세포를 250μF에서 동일한 플라스미드로 전기천공한다.

또 다른 실험에서, 미세기관 체외이식편의 트랜스펙션은 리포펙션에 의해 성취되고 이것은 전기천공보다 효율적인 것으로 관찰된다. 특히, 기니아 피그 피부, 신생 마우스 피부 및 래트 폐 기원의 미세기관 배양물은 루시퍼라제 리포터를 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 간략하게, 미세기관 배양물은 트랜스펙션 1일 전에 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 함유하는 DMEN중에서 5.5% CO₂의 37℃에서 성장시킨다. 체외이식편을 웰당 20개의 체외이식편 및 400㎕의 배지를 함유한 24웰 플레이트상에 분주한다. 트랜스펙션을 위해, 미세기관 배양물을 오프티멤으로 2회 세정하고 리포펙틴 10㎕(Gibco BRL) + DNA 2㎍ + 오프티멤을 각각의 웰에 최종 부피이 500㎕가 되도록 첨가한다. 오프티멤/리포펙틴/DNA 용액을 리포펙틴 제조업자의 지시에 따라 제조한다. 이어서 배양물을 5.5% CO₂에서 37℃에서 5 내지 6시간동안 제조한다. 오프티멤/리포펙틴/DNA 배지를 이어서 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민 및 10% FCS를 함유한 DMEN 400㎕로 대체하고 배양물을 5.5% CO₂에서 37℃에서 밤새 배양한다. 다음날 아침, 미세기관 배양물을 제거하고 1 X PBS로 2회 세척하고 수 작업 유리 분쇄기로 1 X 세포 배양 용해 완충액(Promega) 750㎕중에서 분쇄한다. 형질전화 유전자 기원의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 사용하여 검출하고 당해 결과는 도 18에 나타낸다.

실시예 XVII

유전자 생성물의 미소간 배양물로의 전달

8주된 암컷 루위스 래트 기원의 폐 및 흉선을 절개하고 실시예 XV에 기재된 바와 같이 미세기관 배양으로 가공처리한다. 미세기관 배양물을 배양 웰에 가하고 37℃에서 항온처리하면서 5 내지 6시간동안 플라스미드 DNA 복합체를 코딩하는 양이온 지질/루시퍼라제로 트랜스펙션시킨다. 양이온 지질/플라스미드 DNA 용액을 흡입하고 이어서 배양물을 2일동안 배지 + 10% 혈청에서 항온처리함에 이어서 루시퍼라제 리포터 유전자 발현(임의의 광 유니트로 표시함)에 대해 분석한다. 당해 실험의 결과는 도 16에 도시한다. 도 16에서 입증된 바와 같이, 폐는 당해 조건하에서 트랜스펙션된 루시퍼라제 유전자를 발현하지만 흉선에서는 그렇지 않다. 예상된 바와 같이, 음성 대조군 β-갈락토시다제 트랜스펙션된 폐 미세기관 배양물(10㎕의 양이온성 지질 농축물)은 광 발생(23 광 유니트)을 위한 기계 배경 근처에 있다.

실시예 VIII

시험관내 모간 성장

신생 마우스 피부를 수술 후 수득하고, 하부 지방 조직으로부터 세정하고 0.4 cm x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치를 사용하여 300㎛의 절편으로 가로로 절단한다. 미세기관을 혈청 부재하에 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO₂하에 DMEM중에 미량평판에 부가한다. 특정 미세기관 생체외이식편은 배양 배지에 첨가되는 성장 인자, 예를 들어, FGF와 접촉시킨다. 배지는 2일 마다 교환한다.

신생 "모발 부재" 피부는 MC 배양물에서 성장하는 경우, 모간을 생산하기 위해 유도될 수 있다. 1ng/ml의 EGF의 존재하에 3일동안 미세기관 배양물에서 성장한 30시간된 마우스 기원의 피부에 대한 마이크로그래프는 배양 초기에 성장되지 않는 생체외이식편에서 모간의 발육을 나타낸다.

또 다른 세트의 실험에서, 휴지기 난포의 활성화가 관찰된다. 센카 마우스는 모발 난포 활성화 연구를 위해 유용한 모델을 제공하는데 그 이유는 당해 난포가 매우 동일 크기로 분포되어 있고 주기 단계가 널리 특징화되어 있기 때문이다. 센카 마우스는 항원 활성화를 위한 생체내 모델을 제공한다. 휴지기 난포로부터 클럽의 제거는 새로운 모발 형성을 유도할 수 있고 이의 첫 징조는 널리 특징화되어 있다. 성체의 센카 마우스 기원의 피부는 수술 후 수득하고 하부 지방 조직으로부터 제거하고 0.4 x 5 cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기 또는 기타 적합한 절단 장치로 300㎕의 절편으로 가로로 절단한다. 미세기관을 1 내지 14일동안 일정한 진탕하에 37℃에서 5% CO₂에서 혈청 부재하에 DMEM중의 미세 플레이트에 부가한다. 클럽 제거 또는 성장 인자 처리에 의해 유도되는지 간에 휴지기 난포의 활성화는 난포 줄기 세포의 증식에 의해 확대된다. 도 17은 티미딘 병입에 의해 검출되는 바와 같이 휴지기 생체외이식편의 활성화를 도시한다.

실시예 IXX

이식을 위한 췌장섬의 제조

다양한 포유동물 공급원으로부터 대량으로 섬 세포를 제조하기 위한 다양한 기술이 개발되었는데 그 이유는 이들이 확립된 당뇨병 I형을 치료하기 위해 잠재적으로 이식가능한 β세포 매쓰를 차지하기 때문이다. 2개의 주요 결점이 지금까지 나타났다. 베타 세포를 제조하기 위한 재현 신뢰 가능한 방법을 수득하기가 어려운 것으로 입증되었다. 부분적으로, 제1 이유 및 부분적으로 β세포 대부분이 정상 췌장에서 섬 세포 하부에 있는 간질로부터의 지지체를 요구한다는 사실에 기인한다. 췌장 기관을 생체외에 유지하는데 있어서 일련의 시도가 지금까지 성공적이지 못하였다. 본원에 기재된 MC 배양물의 기술을 사용하여 시험관내 마우스, 래트, 기니아 피그 및 피그 췌장의 미세기관 배양물을 합성 배양 배지내에 확립하는데에 성공을 거두었다.

췌장 미세기관 배양물은 현재 1개월 이하의 기간동안 시험관내에서 성장시킨다. 배양물내에, 생체외이식편은 이의 조직 미세 구조를 유지하고 특정 세포 아집단은 BrdU 병입 및 표지에 의해 결정되는 바와 같이 활성적으로 증식한다. 추가로, 섬 세포는 시험관내 배양 1개월 후에도 인슐린을 배지로 분비한다.

피그 미세기관 췌장 배양물이 래트 숙주의 내장 및 산분비 중배엽 모두로 이식되는 이식 실험을 수행하였다. 생체외이식편은 몇일 내지 1개월 이하 생체내에서 다양한 기간동안 유지된다. 생체외이식편은 널리 혈관화되고 조직 숙주로 병입된다.

실시예 XX

사람 건선성 피부 미세기관 배양물의 제조

환자로부터 분할된 두께의 건선성 피부를 표피 절단기를 사용하여 해부 후 수득한다. 피부를 0.4cm x 5cm 플랩으로 절단하고 이어서 조직 절단기로 300㎛의 두께로 가로로 절단한다. 이들 미세기관 생체외이식편은 1일 내지 14일동안 37℃ 및 5% CO₂에서 미량평판에서 DMEM(무혈청)에서 배양한다. 다양한 시점에서 미세기관 생체외이식편의 조사는 생체외이식편의 세포가 생존상태로 유지되고 증식함을 지적한다.

상기 인용된 모든 참조문헌 및 공보는 본원에 참조로서 인용된다.

등가물

당업자의 기술자는 통상의 실험, 본원에 기재된 특정 분석 및 시약에 대한 수많은 등가물을 사용할 수 있음을 인지하거나 확신할 수 있다. 당해 등가물은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려되고 하기의 청구항에 의해 보호된다.

도 1은 알레프(Aleph)를 측정하는 치수를 나타낸 미세기관의 개략적 도면이다(여기에서 x는 조직의 두께이고 a는 조직의 폭이다).

도 2는 기니이 피그 미세기관 배양물에서의 세포 증식을 여러 시간 동안 항온배양한 후 BrdU 표지화하여 나타낸 막대그래프이다.

도 3은 인간 등 피부 미세기관 배양물에서의 세포증식을 1 내지 8일 동안 배양한 후 BrdU 표지화하여 측정한 막대그래프이다.

도 4A 내지 도 4D는 마우스 피부(50배율)(도 4A), 기니아 피그 피부(75배율)(도 4B), 인간 포피(50배율)(도 4C) 및 인간 포피(75배율)(도 4D)의 복제 세포 각각의 면역형광성을 나타내는 현미경사진이다.

도 5A 내지 도 5C는 배양 0일(도 5A), 3일(도 5B) 및 6일(도 5C)째의 조직 미세구조를 나타내는 인간 표피 미세기관 체외이식편(75배율)의 횡단면도이다.

도 6은 (a)는 4mm로 일정하게 유지시키고 기니아 피그 미세기관 배양물의 두께(x)는 변화시켜 BrdU 병입을 통해 측정한 표피 증식의 효과를 나타낸 막대그래프이다.

도 7A 및 도 7B는 췌장 유래의 미세기관 배양물에 존재하는 증식성 세포에 상응하는 면역형광성을 나타내는 현미경사진이다(75배율).

도 8은 성숙한 돼지 췌장의 미세기관 배양물에서 방출된 인슐린 양을 나타내는 막대그래프이다.

도 9는 배양 3일, 4일 및 6일째 결장, 간, 신장, 십이지장 및 식도의 미세기 관 배양물에 존재하는 증식성 세포의 ¹H-티미딘 병입율을 나타내는 막대그래프이다.

도 10A 내지 도 10C는 미세기관 배양물에서 모낭의 활성 증식을 면역형광성으로 측정하여 나타낸 현미경사진이다. 배율은 40x(도 10A), 40x(도 10B) 및 75x(도 10C)이다.

도 11은 미세배양 초기와 말기에 털줄기의 크기 분포를 나타내는 막대그래프이다.

도 12는 TGF-β 2.5ng/ml 첨가된 기니아 피그 피부 배양시에 미세기관 배양물의 유사분열원성 억제를 나타내는 막대그래프이다.

도 13은 생체내에서 용이하게 처리할 수 있는 구조를 유지하기 위한 조직 절편의 불완전 분획을 나타내는 만성 피부 궤양을 치료하기 위한 미세기관 체외이식편의 개략적 모식도이다.

도 14는 정상 피부 일부를 미세기관 배양물로 대체한 후 나타나는 마우스 표면의 사진으로서, 치유, 이식편에 새로운 털줄기의 생성 및 정상 마우스 피부에 이식편의 병입을 관찰할 수 있다(10배율).

도 15는 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 플라스미드를 이용한 배양물의 트랜스펙션 후 기니아 피그의 피부 미세기관 배양물에서 나타나는 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 도시한 그래프이다.

도 16은 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 플라스미드와 래트 폐 및 흉선 미세기관 배양물의 양이온 지질 매개의 트랜스펙션 후 상기 배양물에서 나타나 는 루시퍼라제 유전자 발현을 도시한 그래프이다.

도 17은 본 발명의 미세기관 배양물에서 FGF 처리시 휴지기 모낭의 활성화를 도시한 그래프이다.

도 18은 본 발명의 미세기관 체외이식편에 존재하는 트랜스제닉 루시퍼라제 유전자의 발현을 도시한 그래프이다.

Claims (62)

1. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편으로서, 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 수용체에게 전달하기 위해 사용되는 미세기관 체외이식편이며,

   상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조(microarchitecture)를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물은 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 수용체에게 투여되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래 하는 기관에서 정상적으로 생성되지 않는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 마커 단백질인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
5. 제 1 항에 있어서, 재조합 단백질이 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A₂, 엘라스타제, 아밀라제, 혈액 응고 인자, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소, 아데노신 데아미나제, 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 적혈구생성인자, 표피 성장 인자, 간적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 음성 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장인자 β군, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴, 물질-P, 및 전사 인자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
6. 제 1 항에 있어서, 24시간 이상 동안 배양물에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
7. 제 1 항에 있어서, 식 1/x + 1/a > 1.5 ㎜^-1(식 중, 'x'는 조직 두께이고, 'a'는 이 조직의 폭(mm)임)로 특징지어지는 표면적 대 부피 지수를 갖는, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 림프 기관, 췌장, 간, 담낭, 신장, 소화관 기관, 호흡관 기관, 생식 기관, 피부, 요로 기관, 혈액 관련 기관, 흉선, 및 비장으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편을 수득한 기관의 미세구조와 유사한 미세구조로 배열된 상피 조직 세포 및 결합 조직 세포를 포함하는, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 췌장이고, 상기 세포 집단이 랑게르한스섬을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 피부이고, 상기 체외이식편이 적어도 하나의 모낭 및 샘을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 기관이 병에 걸린 피부이고, 상기 체외이식편이 병에 걸린 피부 유래의 과증식 세포 또는 신생증식 세포의 집단을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편이 최소 배지에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 체외이식편이 보유하는 미세구조가, 상기 체외이식편을 분리한 기관의 2종 이상의 조직 사이에 나타나는 세포-세포 배향 및 세포-기질 배향 중 하나 이상을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
15. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 상기 재조합 유전자 산물을 코딩하는 재조합 유전자를 운반하는 재조합 바이러스로 감염된 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 재조합 간염 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노관련 바이러스, 재조합 유두종 바이러스, 재조합 헤르페스 바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 사이토메갈로바이러스 및 재조합 시미안 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
17. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공(electroporation), 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주사, 및 수용체 매개 흡수로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환법을 통해 이종 핵산 서열에 의해 형질전환된 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편.
18. 제 1 항에 따른 유전자 변형된 미세기관 체외이식편에 의해 조성되고 상기 재조합 유전자 산물을 함유하는 합성 배지.
19. 제 1 항에 따른 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 함유하는 약학적 제제로서, 탈모증, 건선, 암종, 유두종, 피부궤양 또는 이들의 조합을 치료하는 데에 효과적인 약학적 제제.
20. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 제조하는 방법으로서,

    상기 미세기관 체외이식편은 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 인간이 아닌 동물 수용체에게 전달하는 데에 사용되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것인 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이며,

    상기 방법은

    (a) 세포 집단을 포함하고, 상기 기관이 유래하는 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 상기 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 상기 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 가진 기관 일부를 동물로부터 분리하는 단계; 및

    (b) 상기 기관 일부의 세포 집단 중에서 적어도 일부 세포를 재조합 유전자로 유전자 변형시켜 적어도 1종의 재조합 유전자 산물이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 방법이며,

    상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물이 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
22. 제 20 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되지 않는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
23. 제 20 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 마커 단백질인 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
24. 제 20 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A₂, 엘라스타제, 아밀라제, 혈액 응고 인자, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소, 아데노신 데아미나제, 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 적혈구생성인자, 표피 성장 인자, 간적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 음성 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장인자 β군, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴, 물질-P, 및 전사 인자로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
25. 제 20 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 24시간 이상 동안 배양물에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
26. 제 20 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이, 식 1/x + 1/a > 1.5 ㎜^-1(식 중, 'x'는 조직 두께이고, 'a'는 이 조직의 폭(mm)임)로 특징지어지는 표면적 대 부피 지수를 갖는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
27. 제 20 항에 있어서, 상기 기관이 림프 기관, 췌장, 간, 담낭, 신장, 소화관 기관, 호흡관 기관, 생식 기관, 피부, 요로 기관, 혈액 관련 기관, 흉선, 및 비장으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
28. 제 20 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 상기 체외이식편을 수득한 기관의 미세구조와 유사한 미세구조로 배열된 상피 조직 세포 및 결합 조직 세포를 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
29. 제 20 항에 있어서, 상기 기관이 췌장이고, 상기 세포 집단이 랑게르한스섬을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
30. 제 20 항에 있어서, 상기 기관이 피부이고, 상기 체외이식편이 적어도 하나의 모낭 및 샘을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
31. 제 20 항에 있어서, 상기 기관이 병에 걸린 피부이고, 상기 체외이식편이 병에 걸린 피부 유래의 과증식 세포 또는 신생증식 세포의 집단을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
32. 제 20 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 최소 배지에서 유지가능한 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
33. 제 20 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 보유하는 미세구조가, 상기 체외이식편을 분리한 기관의 2종 이상의 조직 사이에 나타나는 세포-세포 배향 및 세포-기질 배향 중 하나 이상을 포함하는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
34. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 상기 재조합 유전자 산물을 코딩하는 재조합 유전자를 운반하는 재조합 바이러스로 감염된 것인, 유전 자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 재조합 간염 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노관련 바이러스, 재조합 유두종 바이러스, 재조합 헤르페스 바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 사이토메갈로바이러스 및 재조합 시미안 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
36. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공(electroporation), 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주사, 및 수용체 매개 흡수로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환법을 통해 이종 핵산 서열에 의해 형질전환된 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
37. 인간이 아닌 동물 수용체에게 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은

    (a) 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편으로서, 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 수용체에게 전달하기 위해 사용되는 미세기관 체외이식편이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 1종의 재조합 유전자 산물을 발현 하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것인 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 마련하는 단계; 및

    (b) 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 상기 인간이 아닌 동물 수용체에게 이식하는 단계를 포함하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 수용체 유래의 것인 방법.
39. 제 37 항에 있어서, 상기 미세기관 체외이식편이 다른 공여자 유래의 것인 방법.
40. 제 37 항에 있어서, 상기 미세기관 체외이식편이 인간 유래의 것인 방법.
41. 제 37 항에 있어서, 상기 미세기관 체외이식편이 인간이 아닌 동물 유래의 것인 방법.
42. 제 37 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되는 것인 방법.
43. 제 37 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관에서 정상적으로 생성되지 않는 것인 방법.
44. 제 37 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 마커 단백질인 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 인슐린, 아밀라제, 프로테아제, 리파아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 카르복시펩티다제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 트리아실글리세롤 리파아제, 포스포리파아제 A₂, 엘라스타제, 아밀라제, 혈액 응고 인자, UDP 글루쿠로닐 트란스퍼라제, 오르니틴 트란스카르바모일라제, 사이토크롬 p450 효소, 아데노신 데아미나제, 혈청 흉선 인자, 흉선액 인자, 타이모포이에틴, 타이모신 α1, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 적혈구생성인자, 표피 성장 인자, 간적혈구생성 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 음성 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장인자 β군, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 소마토스타틴, 물질-P, 및 전사 인자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
46. 제 37 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 24시간 이상 동안 배양물에서 유지가능한 것인 방법.
47. 제 37 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이, 식 1/x + 1/a > 1.5 ㎜^-1(식 중, 'x'는 조직 두께이고, 'a'는 이 조직의 폭(mm)임)로 특징지어지는 표면적 대 부피 지수를 갖는 것인 방법.
48. 제 37 항에 있어서, 상기 기관이 림프 기관, 췌장, 간, 담낭, 신장, 소화관 기관, 호흡관 기관, 생식 기관, 피부, 요로 기관, 혈액 관련 기관, 흉선 및 비장으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
49. 제 37 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 상기 체외이식편을 수득한 기관의 미세구조와 유사한 미세구조로 배열된 상피 조직 세포 및 결합 조직 세포를 포함하는 것이 특징인 방법.
50. 제 37 항에 있어서, 상기 기관이 췌장이고, 상기 세포 집단이 랑게르한스섬을 포함하는 것인 방법.
51. 제 37 항에 있어서, 상기 기관이 피부이고, 상기 체외이식편이 적어도 하나의 모낭 및 샘을 포함하는 것인 방법.
52. 제 37 항에 있어서, 상기 기관이 병에 걸린 피부이고, 상기 체외이식편이 병에 걸린 피부 유래의 과증식 세포 또는 신생증식 세포의 집단을 포함하는 것인 방법.
53. 제 37 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 최소 배지에서 유지가능한 것인 방법.
54. 제 37 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이 보유하는 미세구조가, 상기 체외이식편을 분리한 기관의 2종 이상의 조직 사이에 나타나는 세포-세포 배향 및 세포-기질 배향 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
55. 제 37 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 상기 재조합 유전자 산물을 코딩하는 재조합 유전자를 운반하는 재조합 바이러스로 감염된 것인 방법.
56. 제 55 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 재조합 간염 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노관련 바이러스, 재조합 유두종 바이러스, 재조합 헤르페스 바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 사이토메 갈로바이러스 및 재조합 시미안 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
57. 제 37 항에 있어서, 상기 세포 집단의 적어도 일부가, 인산칼슘 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공(electroporation), 리포좀 매개 트랜스펙션, 직접 주사 및 수용체 매개 흡수로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환법을 통해 이종 핵산 서열에 의해 형질전환된 것인 방법.
58. 제 37 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이전에 상기 유전자 변형된 미세기관 배양물을 캡슐화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
59. 제 37 항에 있어서, 상기 단계 (a)가,

    (i) 세포 집단을 포함하고, 상기 기관이 유래하는 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 상기 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 상기 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 상기 미세기관 체외이식편 중의 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 가진 기관 일부를 동물로부터 분리하고; (ii) 상기 기관 일부의 세포 집단 중에서 적어도 일부 세포를 재조합 유전자로 유전자 변형시켜 적어도 1종의 재조합 유전자 산물이 발현되도록 함으로써 수행되는 것인 방법.
60. 제 37 항에 있어서, 상기 단계 (a)가 상기 재조합 유전자 산물을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 동물의 기관으로부터 미세기관 체외이식편을 수득함으로써 수행되는 것인 방법.
61. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법으로서, 상기 미세기관 체외이식편은 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 인간이 아닌 동물 수용체에게 전달하는 데에 사용되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편이며,

    상기 방법은

    세포 집단을 포함하고, 기관이 유래하는 본래의 미세구조를 유지하면서 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 상기 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 기관 일부 중의 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 가진 기관 일부를 트랜스제닉 동물로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법이며,

    상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물은 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 인간이 아닌 동물 수용체에게 투여되는 것인, 유전자 변형된 미세기관 체외이식편의 제조방법.
62. 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자 변형된 미세기관 체외이식편을 캡슐화하는 중합체성 장치를 포함하는 의료용 장치로서, 상기 미세기관 체외이식편은 세포 집단을 포함하고, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 수용체에게 전달하는 데에 사용되는 것이며, 상기 미세기관 체외이식편의 세포 집단 중 적어도 일부 세포가 적어도 1종의 재조합 유전자 산물을 발현하는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편은 상기 미세기관 체외이식편이 유래하는 기관 본래의 미세구조를 유지하면서, 동시에 적당한 영양소와 가스는 미세기관 체외이식편의 세포 내로 확산시키고 세포 폐기물은 미세기관 체외이식편 밖으로 확산시켜, 미세기관 체외이식편 내 불충분한 영양소와 폐기물 축적에 따른 세포 독성 및 이에 수반되는 사멸을 최소화할 수 있도록 선택된 크기를 갖는 것이며, 상기 적어도 1종의 재조합 유전자 산물은 재조합 단백질 및 재조합 기능성 RNA 분자로 이루어진 군에서 선택되는 것이고, 상기 미세기관 체외이식편이 상기 수용체에게 투여되는 것인, 의료용 장치.

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