KR20090056095A - 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를포함하는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 이를 도포한스텐트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관협착에 사용하는 약물방출형 스텐트에 혈관 내피세포의 세포접착인자 발현유전자를 억제하는 물질을 이용하는 것으로서, 보다 자세하게는, 하기 화학식 1 내지 3으로 정의된 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 상기 조성물으로 도포한 스텐트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 이를 도포한 스텐트는 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 재접착하고 침투하는 것을 저하시켜 스텐트 시술 후 다양한 원인에 의해 발생하는 재협착(restenosis)을 방지하는데 유효하다.

혈관 재협착, 유전자 발현억제, 스텐트, 약물 방출형

Description

혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 이를 도포한 스텐트{Pharmaceutical composition comprising a gene expression inhibitor of intracellular adhesion molecule for the stent and a stent comprising the same}

본 발명은 하기 화학식 1 내지 3에 정의된 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 상기 조성물이 표면에 코팅된 스텐트에 관한 것이다.

관상동맥질환이 진전되면 관상동맥이 완전히 막히면서 심장 근육의 일부가 괴사하게 되어 심장의 박동력이 떨어지게 되고, 이로 인해 심장이 피를 제대로 신체로 공급하지 못해 여유의 피가 심실 및 허파에 고이게 되어 심한 호흡장애가 나타난다. 관상동맥 질환 치료의 시작은 가능한 한 빨리 좁아진 혈관을 확장시키거나 노폐물을 제거해 심장에 충분한 영양분과 산소를 공급하는 것이다.

그러나, 심각한 상태라면 관상동맥 우회술과 관상동맥 확장술로 불리는 중재 적 시술이 효과적이다. 관상동맥 우회술은 심장 부근의 동맥이나 다리 정맥을 잘라 관상동맥의 막힌 부위에 이식하는 방법으로 우회로를 만들어주는 외과적 수술법인데, 약물에 대한 의존도를 낮춘다는 장점은 있지만 5∼10년 후 다시 혈관이 막힐 수 있다는 단점이 있다. 중재적 시술에는 막힌 관상동맥에 풍선이 달린 카데터를 넣어 좁아진 부위를 확장시키는 풍선 확장술과 풍선으로 혈관을 부풀린 후 스텐트 (파이프 형태의 미세금속 그물망)를 삽입해 혈관벽을 고정하는 스텐트 삽입술이 있다. 이 경우 역시 여러 가지 이유로 혈관이 다시 좁아지는 재협착률이 높은 것이 문제다.

스텐트란 혈관, 위장관 및 담도 등 혈액이나 체액의 흐름이 순조로워야 되는 부위에 악성 혹은 양성질환이 발생하여 그 흐름에 장애가 발생하였을 때, 외과적 수술을 통하지 않고 x-선 투시하에서 좁아지거나 막힌 부위에 삽입하여 흐름을 정상화시키는데 사용되는 원통형의 의료용 재료이며, 스텐트의 재질은 스텐레스와 형상기억 합금인 나이티놀 등이 많이 사용되고 있다.

혈관질환에서 스텐트는 동맥경화증에 의해 동맥 내에 혈전이나 지질의 침착으로 동맥 내경이 좁아져 혈류의 흐름이 원활하지 못한 경우에 설치하는데, 주로 다리에 혈류를 공급하는 골반부의 장골동맥, 뇌에 혈류를 공급하는 경동맥 및 신장에 혈류를 공급하는 신동맥 등에 많이 이용되고 있다. 스텐트를 이용한 수술의 장점은 개복수술 방법보다 간편하며, 전신마취를 하지 않고 부분마취를 하여 시술에 부담을 줄일 수 있으며, 수술 성공률도 높아 세계적으로 널리 이용되고 있다. 스텐트를 이용한 혈관시술의 경우에는 상대적으로 고령, 심장질환 및 호흡기 질환 등의 원인으로 개복 수술이나 전신마취를 하는데 위험부담이 큰 경우에 더 많이 시술되고 있다.

스텐트의 종류는 내강을 확보하는 작용기전에 따라 풍선을 이용하는 풍선확장식 및 형상기억합금을 이용하는 자가 팽창식 스텐트가 있으며 스텐트를 설치하는 장기와 질병에 따라 선택적으로 사용된다.

스텐트의 개발로 풍선확장술의 급성합병증같은 위험요인은 감소하였으나 스텐트 시술 빈도가 급격히 증가함에 따라 재협착의 절대 빈도도 같이 증가하여 재협착 병변 자체가 중재 시술의 중요한 한 분야가 되었다.

혈관 재협착은 스텐트 수술 후 주로 6개월 내에 발생하며 평활근 세포가 과도하게 증식하여 혈관을 재협착 시키는 과정이다. 즉, 혈관 재협착은 한마디로 관동맥 내막이 풍선확장술로 손상을 받게 되어 일어나는 치유과정이 원하지 않게 과도하게 일어난 결과로 요약할 수 있다. 풍선확장술로 혈관 내막이 손상을 받고 중막이 확장하게 되면 정상적인 상처 치유 과정(wound-healing process)으로 염증반응이 야기되게 되며(inflammatory phase), 과립화된 조직(granulation tissue)이 증식되고(granulation phase), 혈관이 재형성(remodeling phase)된다. 염증 단계 (Inflammatory phase)에는 각종 사이토카인(cytokine) 및 염증세포와 혈소판이 주 된 작용을 하며, 과립화 단계(granulation phase)에는 평활근 세포의 이동과 증식이 주된 작용을 하며 재형성 단계(remodeling phase)에는 프로테오글라이칸 (proteoglycan) 및 콜라겐(collagen) 등의 증대로 혈관이 재형성되게 된다. 재협착 과정의 시작에는 풍선확장술로 혈관 내막이 손상을 받은 직후부터 발생하는 염증 병변 내로 분비된 각종 주유세포 유혹인자, 혈소판 및 사이토카인들이 주요원인이 되는 것으로 알려져 있다.

시술 후 재협착률은 풍선 확장술 시술 후 40∼50% 및 스텐트 삽입술 시술 후 25∼30% 정도가 재협착에 의하여 재수술을 받아야한다. 따라서 재협착률을 줄이는 것이 중재적 시술의 관건이라 할 수 있다.

최근 방사선 조사로 재협착을 감소시키기 위한 관상동맥 근접방사선치료(brachytherapy)가 시도되면서 재협착 병변의 치료에 많은 진전이 있다는 보고도 있으나 이러한 방법에는 기술적 및 경제적 문제점 등이 있으며 혈관 재협착 자체를 예방하는 데는 한계가 있다.

따라서, 최근에는 상기에서 언급한 스텐트 시술 후의 재협착의 빈도를 낮추는 문제에 관심이 모아지고 있는데 이런 문제를 개선하려는 일환으로 약물 방출형 스텐트에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 많은 연구자들이 스텐트에 혈관 재협착을 억제하는 활성물질을 고분자물질과 혼합하여 물질이 천천히 방출될 수 있도록 제작한 서방형 약물 방출형 스텐트 및 이러한 스텐트에 사용될 수 있는 혈관 재협착을 억제하는 활성물질을 연구하고 있다. 약물방출형 스텐트란 혈관재협착을 방 지하는 약물을 코팅한 것으로 최근의 혈관 스텐트 시술의 90% 이상이 약물방출형 스텐트로 시술되고 있다. 그런데 이러한 약물방출형 스텐트는 약물과 함께 사용하는 고분자물질이 오히려 혈전이나 염증을 유발하는 문제를 가지고 있다.

유럽심장학회에서의 지적에 따라 미국 식품의약국(FDA)은 2006년 12월 자문위원회를 열어 이 문제를 중점 논의했다. 주로 다뤄진 스텐트는 '텍서스'(보스턴 사이언티픽사 제품)와 '사이퍼'(코디스사 제품)인데, 이 두 제품은 한국내에서도 약물방출 스텐트 시장의 80%(각각 40%)를 점유하고 있다. 나머지 20%는 메드트로닉사 제품인 '엔데버'이다.

그러나, 이러한 약물방출형 스텐트는 혈전증 발생률에 있어 기존 금속 스텐트와 거의 동일할 뿐만아니라, 심장혈관에 삽입한 뒤의 심근경색 발생률과 사망률도 기존 제품과 같거나 그 보다 낮은 것으로 평가돠었는바, 결국 약물방출형 스텐트의 사용은 실보다 득이 많다는 것이 FDA 위원회의 결론이었으며, 실제로 풍선확장술의 40% 및 금속 스텐트 시술의 20%가 재수술을 받는 데 비해 약물방출 스텐트는 재수술받는 비율이 10% 정도이므로 풍선확장술과 일반 금속 스텐트 시술보다 유리한 것으로 나타났다.

따라서, 여전히 혈관재협착을 방지하기 위하여 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 특정 약물을 발굴하고 이를 스텐트에 도포하여 체내로 효율적으로 전달하여 생체부작용이 없는 전달체의 개발이 필요하다.

한편, 세포접착인자 중에 세포내 접착 분자-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1; CD54)은 Ig-수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 접착 수용체 (adhesion receptor)로서, 혈관내피세포와 일부 림프구 및 단핵구(monocyte)에서 저밀도로 발현되며 [Springer, Nature 346: 425-434, 1990, Rothlein et al., J. Immunol. 137: 1270-1274, 1986] IL-1, TNF-a 및 IFN-g와 같은 염증성 사이토카인 (cytokine)과 지질다당질(lipopolysaccharide, LPS)를 다양한 세포에 처리했을 때, 다양한 세포 유형에서 ICAM-1의 발현이 증가된다 [Hubbard and Rothlein, Free Radic. Biol. Med. 28: 1379-1386, 2000]. 백혈구 기능 연관 항체-1(Leukocyte function associated antigen-1, LFA-1; CD11a/CD18)은 ICAM-1의 리간드로서 유휴 상태의 백혈구(resting leukocyte)에서는 불활성이지만, T-세포 수용체 매개 시그날링(T-cell receptor-mediated signaling)이나 포볼에스테르(phorbolester)와 같은 다양한 자극인자에 의해 활성화된다 [Dustin and Springer, Nature 341: 619-624, 1989, Rothlein and Springer, J. Exp. Med. 163: 1132-1149, 1986].

한편, 백혈구가 염증부위에 침윤하기 위해서는 백혈구가 혈관내피세포표면을 roling하면서 혈관내피세포에 접착하는 과정을 통해야만 한다. 세포접착인자 ICAM-1 (CD54)은 혈관내피세포, 활성화된 백혈구 및 기관지 상피세포 등에 발현되고 있으며 염증성 사이토카인에 의해 그 발현량이 현저히 증가한다. ICAM-1의 리간드인 LFA-1 (CD11a/CD18)은 주로 백혈구에 발현되는 β2-인테그린에 속한 분자로, 다양한 염증성 자극에 의하여 백혈구로부터 활성화되어 ICAM-1과 결합한다. ICAM-1은 특히 염증반응이 일어난 혈관내피세포에 많이 발현되며 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 접착하고 침투하는 것을 증진시키는 작용을 한다. 또한 혈소판과 혈관내피세포의 접착에도 ICAM-1이 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다 [Thomas and DeGraba, Neurology 49: 15-19, 1997]. ICAM-1이 염증반응의 진전에 중요하게 관여하고 있다는 사실은 ICAM-1의 모노클로날 (monoclonal) 항체 및 여러 종류의 질환모델 동물실험을 통해서 밝혀지고 있다. ICAM-1이나, LFA-1에 직접적으로 대응하는 모노클로날 항체를 이용한 ICAM-1/LFA-1 결합 저해가 동맥경화, 천식, 사구체 신염 및 관절염 등의 자기면역질환에 유효한 것으로 밝혀졌으며, 면역응답반응에 있어서 T세포의 활성화에는 T세포 수용체를 통한 항원 특이적인 시그날 뿐만 아니라 ICAM-1/LFA-1등의 항원 비특이적인 시그날이 반드시 필요한 것으로 밝혀졌다 [Cornejo et al., Adv. pharmacol. 39: 99-141, 1997, Patel et al., Circulation 97: 75-8, 1998, Nishikawa et al., J. Exp. Med. 177: 667-77, 1993, Kobayashi et al., Cell Immunol. 164: 295-305, 1995, Nagase et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 81-86, 1995].

이러한 염증반응과 동맥경화 진전과정에서 세포접착인자가 중요한 역할을 하고 있으며, 단핵구와 내피세포 사이에서 이들의 발현을 차단하는 저해제의 개발이 다양하게 시도되고 있다. 이러한 결과로 미루어 ICAM-1이나 LFA-1의 저해제는 동맥경화와 염증과 같은 면역관련질환을 위한 잠재적인 치료제로서의 가치가 충분하다고 볼 수 있다 [Oppenheimer-marks and Lipsky, Clin . Immunol . Immunopathol . 79: 203-210, 1996].

현재 ICAM-1이나 LFA-1의 활성 저해제 개발은 그들의 중화항체가 대상이었으며 천연물로부터는 수 종의 저해제만이 보고되어 있는 실정이다. 애보트(Abbott)사에서 합성품으로서 ICAM-1 발현 저해물질을 보고하였으며 [Stewart et al., J. Med. Chem . 44: 988-1002, 2001] ICAM-1의 에피토프를 모체로 한 합성물질인 LFA-1의 길항체 (antagonist)가 노바티스사와 로슈사로부터 개발되었으나 [Welzenbach et al., J. Biol . Chem . 277: 10590-10598, 2002, Gadek et al., Science 295: 1086-1089, 2002], 아직 질환동물모델을 이용한 인 비보 (in vivo ) 활성에 대한 보고는 없다. 한편, 천연물로부터는 세코-리모니드 (seco-limonids)계 물질 (Trichilia rubra, IC₅₀; 10～25 nM) 큐큐비타신 (cucurbitacins, Conobea scoparioides, IC₅₀; 0.18～1.36 mM), 아드잔트로마이신 (adxanthromycins, Streptomyces sp. Na-148, IC₅₀; 1.5～6.5 mM) 등이 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 물질로 보고되었다 [Musza et al., Tetrahedron 50: 11369-11378, 1994, Musza et al., J. Net . Prod. 57: 1498-1502, 1994, Nakano et al., J. Antibiotics 53: 12-18. 2000].

인간 전골수성 백혈구 세포주 (Human promyelocytic leukemia cell line)인 HL-60 세포는 여러 분화유도인자에 의해 단핵구 또는 과립구로 분화될 수 있는 양기능성(bipotent) 세포로서 세포분화연구의 유용한 모델로 사용되고 있다 [Collins et al., Nature 270: 347-349, 1977, Collins, Blood 70: 1233-1244, 1987]. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)는 HL-60 세포의 monocyte/marcrophage-like 또는 granulocyte-like differentiation을 유도하고, 그 결과로 세포성장이 정지되고, ICAM-1과 LFA-1에 의한 세포간 접착성이 증가되어 세포간 응집이 일어난다 [Das et al., FEBS Lett. 472: 50-52, 2000].

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 시주카올 B 및 C, 및 시클로시주카올 A가 혈관협착에 사용하는 약물방출형 스텐트에 사용될 수 있는 세포접착인자 발현유전자를 억제하는 물질임을 확인하고, 스텐트에 상기 혈관 재협착을 억제하는 활성물질을 고분자물질과 혼합하여 물질이 천천히 방출될 수 있도록 제작하였으며, 상기 제작된 서방형 약물 방출형 스텐트가 세포접착을 저해하여 혈관 재협착률을 낮추는 것을 확인함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 약물방출형 스텐트에 사용할 수 있는 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물 및 이를 도포한 스텐트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물에 관한 것이다.

구체적인 양태로서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제는 ICAM/LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 하기의 화학식 1 내지 3으로 표시되는 시주카올 B(화학식 1), 사이클로시주카올 A(화학식 2) 및 시주카올 F(화학식 3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.

[화학식 1 내지 3]

상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 천연물인 홀아비꽃대(학명 : Chlorantus japonicus SIEB)에서 분리될 수 있다. 홀아비꽃대는 다년생 초목으로서 홀꽃대, 홀애비꽃대, 등룡화, 가세신, 은연초라는 속명을 가지고 있으며, 홀아비꽃대의 전초는 플라보노이드, 이소프락시딘, 세스퀴락톤, 페놀류, 아미노산균류를 함유하며, 산한, 거풍, 행어 및 해독에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 홀아비꽃대에서 상기 화학식 1의 화합물을 수득하기 위해서는 공지의 추출 방법을 적절히 사 용할 수 있으며, 이러한 방법의 일례로서 본 발명에 따른 시주카올 B의 수득방법이 대한민국 공개특허 제10-2005-006406호에 자세히 기술되어 있다. 이에 관한 구체적인 일 실시 양태로서, 본 발명자들은 상기의 방법을 응용하여 건조된 홀아비꽃대의 뿌리 (3.5 kg)에 메탄올 (20 L)을 가하여 3일간 실온에서 추출한 후 그 여과액을 감압 농축하여 조 추출물을 얻었고, 이 조 추출물을 노말 헥산, 클로로포름 및 물로 분획하여 세포접착 저해 활성이 높은 클로로포름층을 감압 농축하였다. 농축된 클로로포름층 (16.5 g)을 여러 용매조건의 각종 컬럼크로마토그래피를 행하여 활성 물질들을 분리하였는데, 클로로포름분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피시의 용출 용매(클로르포름: 메탄올100/0 - 0/100)를 사용하였고, 이 분획들을 세포접착 저해 활성을 측정하여 저해활성이 높은 분획들을 모아, 다시 역상 컬럼크로마토그래피(ODS gel)를 이용하여 다시 정제하였다. 용출 용매는 증류수/메탄올 (v/v)을 이용하여 메탄올의 농도가 60%, 80%, 100% 순으로 용출시켰으며 80% 메탄올/증류수 (v/v)정도에서 세포접착 저해활성이 있는 분획들을 모아 최종적으로 HPLC을 실시하여 순수화합물들을 얻었다. HPLC 컬럼은 YMC-Pack ODS-A (250 x 25 mm)를 사용하였으며 용출 용매는 45% MeOH와 55% 증류수인 혼합용매로 분당 7 ml로 용출시켰고, UV (210 nm)에서 검출하였다. 최종적으로 분리된 순수한 활성 물질 화학식 1 내지 3의 화합물은 57분, 61분 및 68분에 용출되었으며, 홀아비꽃대 3.5kg로부터 상기 화학식 1 내지 3 화합물들을 110mg, 93mg 및 78mg 얻을 수 있었다.

본 발명의 조성물은, 혈관 협착을 방지하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 즉, 협심증 또는 심근경색을 유발하는 관동맥 협착을 예방 및 치료하기 위한 목적으로 사용될 수 있으며, 관동맥 협착을 치료하기 위한 목적으로 시술된 경피적 관동맥 성형술 이후 빈번히 발생되는 재협착을 방지하기 위한 목적으로도 사용될 수 있다. 경피적 관동맥 성형술의 예로는 풍선혈관성형술, 스텐트 삽입, 관동맥 우회술 및 동맥-정맥 문합술 등이 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 사용 일례는 일반 약제와 동일하게 투여하거나 스텐트에 도포하는 것이다. 바람직하게는 서방형 약물방출형 스텐트에 사용된다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 하기하는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 용액에 분산시킬 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 용액은 멸균되거나 무균성이고, 물, 완충제, 등장제 또는 동물 또는 사람에게 적용할 경우, 알레르기 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기타 성분을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제, 항진균제 및 등장제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 상기 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 익히 고잊되어 있다. 활성 성분과 비혼화성인 통상적인 매질 또는 제제 이외에, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충성 활성 성분을 당해 조성물에 혼 입시킬 수도 있다.

상기 조성물은 액제, 유제, 현탁제 또는 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 사용량은 관상동맥 재협착 방지에의 통상적인 사용량으로, 일례로 1일 10μg/스텐트 내지 50μg/스텐트의 양을 사용할 수 있다. 그러나 상기 투여량은 이에 한정되지 않으며, 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물 등에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하다.

구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 상기 화학식 1의 화합물의 세포응집 저해활성을 측정하였으며, 그 결과 상기 화합물 1은 40 nM의 농도에서 PMA(25 nM)에 의해 유도된 세포 응집(cell aggregation) 을 완전히 저해하였다. 또한 PMA (25 nM) 자극에 의한 HL-60 세포에서의 ICAM-1 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 50 nM에서 ICAM-1 발현을 90% 이상 저해하였다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 재접착하고 침투하는 것을 저하시키는데 유효하여 약물방출형 스텐트 특히, 약물이 천천히 방출될 수 있도록 제작한 서방형 약물방출형 스텐트의 제조에 특히 유용하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 조성물을 도포한 이식가능한 스텐트에 관한 것이다.

본 발명에서 스텐트라 함은 상기에서 언급한 바와 같이 관내 적 용(endoluminal appilcation), 예를 들면 혈관 내에 적용하기 위한 일반적인 장치를 의미하는 것으로, 혈액의 흐름이 순조로워야 되는 부위에 질환이 발생하여 그 흐름에 장애가 발생하였을 때, 외과적으로 개복 수술을 하지 않고 x-선 투시 하에서 좁아지거나 막힌 혈관부위에 삽입하여 혈액의 흐름을 정상화시키는 원통형의 의료용 재료를 의미한다. 예를 들어 혈관 내 스텐트(vascular stent)는 Eric J Topol 저 "Textbook of Interventional Cardiology", Saunders Company, 1994에 기술되어 있다. 바람직하게는 서방형 약물방출형 스텐트이다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 스텐트를 제조하기 위하여, 상기 조성물을 스텐트에 코팅한다. 스텐트에 조성물을 코팅하는 방법으로는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 통상의 코팅방법을 적용할 수 있으고, 예를 들어 침염코팅(dip-coated)과 고분자와 함께 코팅(polymer coated) 하는 방법이 있으며, 침염코팅법은 가장 간단한 코팅 방법이며, 약학 조성물만이 코팅되기 때문에 약물만의 생물학적 효과를 관찰하기에 용이하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물이 천천히 방출될 수 있도록 상기 조성물을 약물방출형 스텐트에 고분자 물질과 혼합한 후 코팅하여 본 발명의 스텐트를 제조할 수 있다. 약물방출형 스텐트에 사용될 수 있는 고분자 물질은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, PLLA-폴리-글라이콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤, 폴리-(하리드록시부티레이트/하리드록시발레레이트)공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리테트라 플루오로에틸렌, 폴 리(2-하리드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(에테루레탄 우레아), 실리콘, 아크릴, 에폭사이드, 폴리에스테르, 우레탄, 파알렌, 폴리포스파진 고분자, 플루오로 고분자, 폴리아마이드 및 폴리올레핀 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명을 하기 실시예에 의하여 좀더 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 화합물의 세포접착 저해활성 검정

<1-1> 세포접착 활성 측정

세포접착활성을 측정하기 위하여 사용한 세포는 HL-60 세포(ATCC; CCL-240)로 10% FBS(v/v)와 60.0 mg/L 카나마이신 황산염(kanamycin sulfate), 2.0 g/L NaHCO₃가 포함된 RPMI-1640을 배양액으로 하여, 37℃, 5% 함유 CO₂의 조건으로 세포를 배양하였다. HL-60 세포는 PMA로 자극하면 ICAM-1/LFA-1 매개성 세포접착으로 응집을 일으킨다. 이러한 성질을 이용하여 96 well flatted-bottom plate에 HL-60 세포를 각각 1×10⁶ cells/ml (200 μl/웰)가 되게 분주한 다음, 저해활성을 보고자하는 시료를 30분간 전처리 한다. 농도 의존적인 저해활성을 측정하고자 할때는 시료를 단계별로 희석하여 세포에 처리하였고, 항-ICAM-1 모노클로날 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. 그리고 PMA를 각 웰에 최종 25 nM의 농도로 첨가하고, 48시간 배양한 후, 현미경(Nikon; ECLIPSE TS100)으로 세포의 형태를 관찰하고 필요 할 때는 사진기로 촬영(Nikon; COOLPIX 995)하였다.

<1-2> 항- ICAM -1 모노클로날 항체의 세포응집 활성 측정

HL-60세포의 응집이 ICAM-1과 LFA-1에 의한 것임을 증명하기 위하여 항-ICAM-1 모노클로날 항체의 세포응집저해활성을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 항-ICAM-1 모노클로날 항체는 PMA (25 nM)에 의하여 유도된 세포 응집을 100 ng/ml의 농도에서 완전히 저해하였다.

<1-3> 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F의 세포접착 저해활성측정

세포응집 저해제로 분리, 정제된 세포접착 저해 활성물질인 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F를 첨가하여 세포응집저해 활성을 측정하였고, 그 결과 PMA에 의하여 유도된 세포 응집을 50% 저해하는 농도는 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F가 각각 32 nM, 900nM 및 28nM였다. (도 2)

ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성물질은 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 접착하고 침투하는 것을 저해하여 동맥경화와 면역관련 염증질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

<1-4> 세포와 세포간 직접 세포접착 저해활성측정

세포와 세포간 직접 접착하는 정도를 알아보기 위하여 THP-1 세포와 CHO- ICAM-1세포를 사용하여 그 활성을 알아보았다. 먼저 THP-1세포에 형광발색제인 BCECF-AM을 넣어 표식시키고 세포의 LFA-1을 활성화시키기 위하여 PMA를 100nM 처리하고, 이들 세포를 섞어 37℃에서 1시간 혼합배양하고 접착되지 않은 세포를 세척한 후에 1% Triton X-100 용액을 넣어 여기 상태(excitation) 파장이 485nm 방사(emission) 파장이 538nm에서 형광측정기에서 형광정도를 측정하였다. 세포접착 저해활성물질의 활성은 세포가 접착되지 않아 형광정도가 낮아지는 것으로 판정하였다. 이때 세포접착 저해물질로 알려진(Plant Medica 2003, 69: 1147-1149) Manassantin A를 비교물질로 사용하였다(도 2).

<1-5> 세포독성평가

세포접착 저해활성과 세포독성의 구별을 위하여 동일 농도조건에서 반응시료의 세포독성 실험을 수행하였다. 96 well round-bottom plate에 HL-60 세포를 2.5×10⁴ cells/ml (200 μl/well)가 되게 분주한 다음, 반응시료를 세포 응집 어세이와 동일한 농도조건으로 첨가하여 48시간 배양한 후, MTT법을 이용하여 세포의 생존률(%)을 측정하였다. MTT를 각각의 웰에 최종농도 0.5 mg/ml로 처리한 후, 4시간 동안 배양한 다음, 500×g, 15분간 원심분리 한다. 배지를 aspiration한 후, 각각의 웰에 DMSO를 100 μl씩 첨가하여 포르마잔(formazan) 결정을 용해한 다음, ㅁ마이크로플레이트 리더(microplate reader, Molecular Devices; VERSAmax)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 의한 세포의 생존률은 아래의 식을 이용하여 계산하였고, 각각 농도별 실험군에서 대조군에 대하여 70 % 이하의 생존률을 나타낸 시료를 세포독성을 나타내는 시료로 판단하였다.

세포의 생존률(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100

정제된 활성물질인 시주카올(shizukaol) B는 10 mg/ml의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과로부터 시주카올 B의 세포응집저해활성이 세포독성에 의한 것이 아님이 증명되었다.

실시예 2 : 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F의 ICAM -1 발현 저해활성 검정

<2-1> ICAM -1의 발현양 측정

6-웰 플레이트에 HL-60 cell을 2×10⁶ cells/웰로 준비한 다음, 샘플을 농도별로 희석하여 각각의 웰에 처리하여 1시간 동안 전배양한 후, PMA를 최종농도 50 nM로 30분간 처리하고 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 48시간 반응시켰다. 각각의 웰에서 반응시킨 세포를 모아서 원심분리(500×g, 5 min) 한 후, PBS로 1회 세척한 후 세포침전물에 1 ml의 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 첨가하여, 상온에서 10분간 고정하였다. 고정된 세포를 원심분리 (500×g, 5min) 하여 상층액을 버린 후, PBS로 1회 세척한 후 1 ml의 블러킹 용액(blocking solution, 2 % FBS, 0.01 % sodium azide in PBS)을 첨가하여 상온에서 20분간 블러킹 하였다. 원심분리(500×g, 5 min) 하여 상층액을 버린 후, 200 ml의 1차 항체 (0.5 mg/ml anti-ICAM-1 mAb in blocking solution)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 30분마다 잘 섞어준 다음 세포를 모은 후, PBS로 3회 세척하였다. 200 ml의 2차 항체(FITC conjugated anti-IgG antibody; 1:50 dilution in blocking solution)를 첨가하여 상온에서 40분간 반응시킨 후, 세포를 모아 PBS로 2회 세척하였다. 500 ml의 PBS를 첨가하여 잘 섞은 후, FACS 튜브로 옮겨서 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석하였다.

<2-2> 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F의 ICAM -1 발현 저해활성

HL-60세포에 PMA (50 nM)를 처리함으로써 발현된 ICAM-1의 양을 유세포분석기로 분석한 결과, PMA 처리 후 뒤 PMA 무처리와 비교하여 ICAM-1의 발현이 약 40% 증가 하였으며 ICAM-1의 발현을 50% 저해하는 농도는 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F가 각각 82 nM, 700nM 및 62nM였다. (도 3)

< 실시예 3> 실험용 생쥐에 대한 경구투여 급성독성 시험

화학식 1의 시주카올 B를 임상적으로 활용하기 위하여 하기와 같은 방법으로 급성독성을 조사하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트(rat)를 군당 5 마리씩으로 나누어 본 발명의 화학식 1의 시주카올 B를 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 10 mg/kg의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과 본 발명의 시주카올 B를 투여한 동물에서는 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사 및 혈액생화학적 검사 및 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 실험한 상기 화합물은 랫트에서 10 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 mg/kg 이상인 물질로 판단되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자를 억제하는 물질인 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F를 포함하는 기관 또는 혈관협착방지용 조성물은 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 재접착하고 침투하는 것을 저하시키는데 유효하여 약물방출형 스텐트 특히, 약물이 천천히 방출될 수 있도록 제작한 서방형 약물방출형 스텐트의 제조에 특히 유용하며, 이러한 조성물을 도포한 스텐트는 상기 물질을 천천히 방출하여 종래의 약물방출형 스텐트에 비해 혈관재협착을 효과적으로 방지할 수 있어 매우 유용하다.

도 1은 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F의 화학구조이다.

도 2는 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F가 ICAM-1과 LFA-1의 접착에 의한 세포응집 저해활성을 나타낸 것이다.

도 3은 화합물 시주카올 B(1), 사이클로시주카올 A(2) 및 시주카올 F(3)의 ICAM-1 발현의 저해활성을 나타낸 것이다.

Claims (2)

1. 하기 화학식 1 내지 3에 정의된 시주카올 B, 사이클로시주카올 A 및 시주카올 F로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 혈관내피세포의 세포접착인자 발현 유전자 억제제를 포함하는 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물.

   [화학식 1 내지 3]

   
2. 제1항의 기관 또는 혈관 재협착 방지용 조성물이 표면에 도포된 스텐트.

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