KR101136029B1

KR101136029B1 - 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 이를 포함하는 스텐트

Info

Publication number: KR101136029B1
Application number: KR1020110014939A
Authority: KR
Inventors: 김경수; 조준호; 방성호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2012-04-18
Also published as: KR20110036024A; KR20090087795A

Abstract

본 발명은 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 상기 조성물이 코팅된 스텐트에 관한 것이다:
본 발명에 따른 약학 조성물은 혈관 평활근 세포증식 억제율과 비교하여 상당히 낮은 혈관 내피 세포 증식 억제 작용을 나타내므로 후기 스텐트 혈전증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 이를 포함하는 스텐트{PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND STENT FOR PREVENTING AND TREATING LATE STENT THROMBOSIS}

본 발명은 혈관 평활근 세포증식 억제율과 비교하여 낮은 혈관 내피 세포 증식 억제 작용을 나타내어 후기 스텐트 혈전증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있는 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 상기 조성물이 코팅된 스텐트에 관한 것이다.

협심증, 심근경색증, 심부전증, 부정맥, 판막질환 등 심혈관계 질환은 전 세계적으로 많은 환자가 고통받고 있으며, 우리나라도 고령화와 식생활의 서구화로 심혈관계 질환에 의한 사망률이 급격하게 증가하고 있어, 사망원인 2위를 차지할 정도다.

일반적으로 협심증 및 심근경색 환자의 경우 콜레스테롤 침적 등의 원인으로 관상동맥, 말초혈관 등의 인체 내 혈관에 협착이 발생하여 혈류의 흐름이 저하되고 이로 인해 심한 통증을 수반하거나 급작스런 사망을 유발하게 된다. 이러한 동맥경화증 및 허혈성 심질환자를 치료하기 위하여 경피적 관상동맥성형술이 치료방법으로 임상에서 시술되고 있다.

상기 경피적 관상동맥성형술은 좁아진 관상동맥을 수술에 의하지 않고 확장시키는 방법으로, 시술방법으로는 경피적 관상동맥 풍선 확장술, 경피적 관상동맥 스텐트 삽입술 등이 있다.

그중 경피적 관상동맥 풍선 확장술은 대퇴부나 팔의 동맥을 통하여 가이드용 도관을 삽입한 후 도관을 대동맥을 통하여 병변이 있는 관상동맥의 입구에 위치시키고, 가이드용 도관의 위치를 확인한 후 이 도관의 내부를 통하여 끝에 풍선이 부착되어 있는 도관을 관상동맥의 협착 부위에 위치시킨 후 풍선을 확장시킨다. 확장된 풍선은 플라크 등을 압착하여 좁아진 관상동맥을 확장시켜 관상동맥의 혈류개선을 가져와 협심증에 대한 증상 개선율이 높고, 심근경색 유발의 위험이 낮아 뛰어난 치료법으로 평가되고 있다.

그러나 이러한 풍선카테터를 이용한 관상동맥성형술 후, 환자의 약 20 ~ 50%가 약 6개월 이내에 혈관 재협착이 발생하고, 이러한 협착증은 당뇨병 환자, 병소 부위의 관동맥의 굵기가 작은 경우, 병소 부위가 긴 경우 더욱 빈번하고 심하게 오는 것으로 알려져 있다.

이러한 문제점을 개선하기 위해, 스테인레스 스틸재인 금속망 스텐트(stent)를 이용하는 경피적 관상동맥 스텐트 삽입술이 시술되고 있다. 스텐트 삽입술은 철망이 입혀진 풍선을 협착부위에 위치시킨 후 풍선을 확장하여 관상동맥의 내벽에 철망을 입히는 것이다. 이러한 스텐트 삽입술은 풍선 확장술에 비해 재협착율이 상당히 낮은 것으로 보고되고 있다. 그러나 스텐트의 혈관 손상에 따른 신생내막 증식(neointima hyperplasia)으로 야기되는 관동맥 재협착은 최근까지 큰 문제로 남아 있다.

이와 같이 관상동맥 성형술 시술의 경우 손상에 의해 유도되는 혈관내막 증식증의 과정으로 혈관내피의 손상, 혈관막내 혈전증(mural thrombosis), 혈관 평활근 세포와 섬유아세포의 이동과 단핵세포 및 임파구의 침윤, 신생내막(neointima)내의 세포의 증식, 세포외기질의 축적(reendothelialization), 세포사멸(apoptosis) 등에 의한 재협착(restenosis)이 발생한다. 시술 후 환자의 약 6.8%에서 혈전증이나 혈관 경련 등에 의한 재협착이 발생할 수 있으며, 혈관확장수술 후 3 내지 6개월에 더 심한 혈관의 재협착이 일어날 수 있고, 약 40%의 환자에게서 풍선확장술 부위에 재협착의 소견을 발견할 수 있다(Herrman J-PR et al., Drugs, vol. 46, 18-52, 1993). 또한 동맥과 정맥의 우회로 수술한 부위의 혈관과 관상동맥과 대퇴혈관의 동맥내막절제술(endarterectomy) 부위의 20%에서 혈관의 이차적인 변화로 인하여 혈관이 막힐 수 있다(VolteasN et al., Int . Angiol, 2: ; 13(2), 143-147, 1994).

따라서 혈관 재협착 방지를 위해 레이저 혈관성형술, 고속회전 죽종제거술, 절단풍선을 이용한 관상혈관성형술과 같은 새로운 관상동맥성형술 장비의 도입과 항혈소판제, 항혈전제, 혈관확장제, 세포증식억제제 등의 약제를 이용하여 관상동맥성형술 후 재협착을 예방하는 시도가 있어왔으나, 재협착을 효과적으로 감소시킬 수 있는 방법은 아직까지 확립되지 않았다.

최근 관상동맥성형술을 시행한 부위에 직접 약물을 투여하여 재협착을 방지하기 위해, 이중풍선카테터, 디스패치 또는 미세구 풍선 등이 개발되어 임상에 이용되고 있으며, 장기간 시술부위에 약물을 전달하기 위해 서방성 미세입자 또는 스텐트에 약물을 입혀 치료하는 시도들이 있다. 현재 사용되는 약물로 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 실로리무스(silorimus), 베라파밀(verapamil) 등이 있다.

그러나 전술한 약물은 신생내막의 증식뿐만 아니라 혈관 내피 세포의 증식까지 억제하여 시술 부위의 혈관 내피화(endothelialization)도 억제되는 단점이 있다. 따라서 시술 부위의 혈관 내피화에 따른 후기 혈전증(late thrombosis) 방지 효과를 얻을 수 없어 후기 혈전증으로 인한 급성 심근경색이 발생하는 문제점이 있다.

본 발명에 따른 화학식1로 표시되는 피라졸로피리미디논 화합물(대한민국 특허등록 제353014호)은 포스포디에스터라제-5의 활성을 저해하는 효과가 우수하여 발기부전 치료제(상품명 자이데나, 성분명 유데나필, 동아제약)로 사용되고 있다.

이러한 포스포디에스터라제-5의 저해제의 하나인 실데나필(sildenafil)은 폐동맥 평활근 세포의 증식을 억제하여 폐동맥 고혈압 치료제로 사용될 수 있음이 알려져 있다(Benedetta Tantini et al., Basic Res Cardiol 100:131-138, 2005, Wharton, Strange, Moller et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 172, 105-113, 2005)

이에 본 발명자들은 새로운 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료제를 재발하기 위해 예의 연구를 반복적으로 수행한 결과, 발기부전 치료제로 널리 알려진 화학식1로 표시되는 피라졸로피리미디논 화합물이 혈관 내피 세포에 대해서는 낮은 증식 억제작용을 가지고, 혈관 평활근 세포의 성장과 혈관 신생 내막 증식을 억제하여 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 발견하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 혈관 내피 세포에 대해서는 낮은 증식 억제작용을 가지고, 혈관 평활근 세포 증식과 혈관 신생내막의 형성을 억제하는 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물이 코팅된 스텐트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

하기 화학식 2로 표시되는 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다:

삭제

[화학식 2]

아울러 본 발명은 상기 약학 조성물이 코팅된 스텐트를 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 혈관 내피 세포에 대해서는 낮은 증식 억제작용을 가지므로 관상동맥 성형술 시술 부위의 혈관 내피화 억제를 감소시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물이 코팅된 스텐트를 이용하여 부위 특이적으로 고농도 약물을 투여함으로써 후기 스텐트 혈전증을 방지 및 치료할 수 있다.

도 1은 실험예 1의 대조군, 유데나필 투여군의 ELISA를 이용하여 590nm의 파장으로 흡광도를 측정한 결과를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 2는 실험예 2의 대조군, 유데나필 투여군의 ELISA를 이용하여 590nm의 파장으로 흡광도를 측정한 결과를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 3의 (a)는 실험예 3의 대조군 경동맥 단면, (b)는 유데나필 1uM 투여군 경동맥 단면, (c)는 유데나필 10uM 투여군 경동맥 단면, (d)는 유데나필 100uM 투여군 경동맥 단면의 광학 현미경 사진(100배)이다.
도 4는 실험예 3의 대조군, 유데나필 투여군의 신생내막의 면적 및 중막의 면적을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 실험예 3의 대조군, 유데나필 투여군의 신생내막의 면적/중막의 면적을 비교하여 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 포스포디에스터라제-5 저해제로 발기부전 치료 효과를 갖는 피라졸로피리미디논 화합물의 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료제로서의 새로운 용도에 관한 것이다.

본 발명의 유효성분인 피라졸로피리미디논 화합물은 하기 화학식1의 구조를 갖는다:

(상기 화학식 1에서,

R₁은 수소 또는 C₁~C₆의 알킬이고,

R₂는 수소 또는 C₂~C₆의 알킬이고,

R₃는 C₁~C₆의 알킬이며,

R₄는 C₁~C₁₀의 알킬기로 치환 또는 치환되지 않은 피리딘, 이속사졸, 티아졸, 피리미딘, 인단, 벤즈티아졸, 피라졸, 티아디아졸, 옥사졸, 피페리딘, 몰포린, 이미다졸, 피롤리딘, 티에닐, 트리아졸, 피롤 및 퓨릴 중에서 선택되는 헤테로사이클이다.)

더욱 바람직하게는, 상기 화학식1의 화합물은

R₁은 C₁~C₆의 알킬이고, R₂는 C₂~C₆의 알킬이고, R₃는 C₁~C₆의 알킬이며, R₄는 C₁~C₁₀의 알킬기로 치환 또는 치한되지 않은 피롤리딘인 것이다.

본 발명의 화학식1의 화합물 중 특히 바람직한 화합물은 구체적으로 하기 화학식2의 화합물이다:

본 발명에 의한 피라졸로피리미디논 화합물은 비대칭 탄소를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 라세믹 혼합물 및 개별적으로 분리된 이성질체를 모두 포함한다.

본 발명의 피라졸로피리미디논 화합물은 당업계에서 알려진 방법에 의해 제조될 수도 있고, 상업적으로 시판되는 제품을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 혈관 평활근 세포의 증식과 혈관 신생내막의 형성을 억제하여 혈관의 협착을 억제한다.

본 발명의 바람직한 실험예1에 따르면, 화학식2의 구조를 갖는 피라졸로피리미디논 화합물은 시험관내(in vitro) 실험에서 100uM 내지 1mM 수준에서 인간 대동맥 평활근 세포의 증식을 억제하였다.

본 발명의 바람직한 실험예2에 따르면, 화학식 2의 구조를 갖는 피라졸로피리미디논 화합물은 시험관내(in vitro) 실험에서 실험예1의 인간 대동맥 평활근 세포 증식 억제율과 비교하여 상당히 낮은 인간 제대정맥 내피 세포 증식 억제율을 나타내었다.

또한, 본 발명의 바람직한 실험예3에 따르면, 화학식2의 구조를 갖는 피라졸로피리미디논 화합물은 생체내(in vivo) 실험에서 경동맥 재협착을 효과적으로 억제하였다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 내에서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피하내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하여, 스텐트 내 도포하여 협착 주위에 직접 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 혈관 재협착을 억제하기 위한 약물의 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 혈관 재협착 방지제의 통상적인 투여량으로, 일례로 성인의 경우 1,000 ㎍/kg 내지 10,000 ㎍/kg, 바람직하게는 10 ㎍/스텐트 내지 1,000 ㎍/스텐트를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 사용 일례는 스텐트에 코팅하는 것이다. 따라서 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물이 코팅된 스텐트를 제공한다.

이러한 약학 조성물을 스텐트에 코팅하는 방법은 본 기술분야에서 알려진 모든 방법이 가능하며, 구체적으로 그 종류를 특별히 한정하지는 않는다. 대표적으로 딥 코팅, 스핀 코팅, 바 코팅, 스프레이 코팅 등이 가능하다.

이때 본 발명의 약학 조성물을 생분해성 고분자와 함께 스텐트에 부착하거나 생분해성 고분자를 사용하지 않고 스텐트에 바로 코팅할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 시험관내 ( in vitro ) 인간 대동맥 평활근 세포 증식억제 효과 확인

1-1. 세포 배양

세포 실험은 인간 대동맥 평활근 세포(Human artery vascular smooth muscle cells, HASMCs; ATCC, Rockville, MD)를 사용하였다. 세포는 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Karlsruhe, Germany), 1% 페니실린을 포함한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-low glucose, DMEM; Gibco, Karlsruhe, Germany)의 배양액을 사용하여 37℃에 5% CO₂를 포함한 세포배양기에서 배양하였다. 세포 배양에 사용된 배양액은 2일에 한번 씩 교체했다. 세포는 20에서 22계대까지 사용하였다.

1-2. 유데나필의 HASMCs 증식억제 효과

유데나필(상품명 자이데나, 동아제약)을 100% 에탄올에 1mM, 100uM, 10uM, 1uM의 농도로 용해하여 사용하였다. 배양된 HASMCs를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 트립신(0.25%)으로 처리하여 페트리디쉬에서 떼어낸 후, cell counter를 이용해 세포 수를 측정하고 1×10⁴개의 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 우태혈청을 첨가하지 않은(serum free) 배양액에서 24시간 배양한 후, 대조군은 아무런 물질을 첨가하지 않은 배양액에, 투여군은 1mM, 100uM, 10uM, 1uM의 유데나필을 배양액에 첨가하여 24시간 반응시켰다. 이후 PBS로 다시 씻고, MTT(50ul, Calbiodhem, Germany)를 넣고 3시간 배양한 후, 처리한 시약을 제거한 후 DMSO (150ul, sigma chemical company, Germany)를 5분간 처리하였다. 이후 ELISA를 이용하여 590nm의 파장으로 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 유데나필 10uM 이하에서는 혈관 평활근 세포의 증식 억제효과가 미미하였으나, 농도 증가에 따라 세포 증식 억제효과가 증가하였으며, 특히 1mM과 100uM 농도에서 세포 증식 억제 효과가 현저히 나타났다.

실험예 2: 시험관내 ( in vitro ) 인간 제대정맥 내피 세포 증식 효과 확인

2-1. 세포 배양

세포 실험은 인간 제대정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs; Bio4you, Seoul, Korea)를 사용하였다. 세포는 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Karlsruhe, Germany), 1% 페니실린을 포함한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-low glucose, DMEM; Gibco, Karlsruhe, Germany)의 배양액을 사용하여 37℃에 5% CO₂를 포함한 세포배양기에서 배양하였다. 세포 배양에 사용된 배양액은 2일에 한번 씩 교체했다. 세포는 3에서 5계대까지 사용하였다.

2-2. 유데나필의 HUVECs 증식억제 효과

유데나필(상품명 자이데나, 동아제약)을 100% 에탄올에 1mM, 100uM, 10uM, 1uM의 농도로 용해하여 사용하였다. 배양된 HUVECs를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 트립신(0.25%)으로 처리하여 페트리디쉬에서 떼어낸 후, cell counter를 이용해 세포 수를 측정하고 1×10⁴개의 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 우태혈청을 첨가하지 않은(serum free) 배양액에서 24시간 배양한 후, 대조군은 아무런 물질을 첨가하지 않은 배양액에, 투여군은 1mM, 100uM, 10uM, 1uM의 유데나필을 배양액에 첨가하여 24시간 반응시켰다. 이후 PBS로 다시 씻고, MTT(50ul, Calbiodhem, Germany)를 넣고 3시간 배양한 후, 처리한 시약을 제거한 후 DMSO (150ul, sigma chemical company, Germany)를 5분간 처리하였다. 이후 ELISA를 이용하여 590nm의 파장으로 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 유데나필 농도 증가에 따라 제대정맥 내피 세포 증식 억제효과가 증가하였으나, 유데나필의 혈관 평활근 세포 증식 억제율과 비교하여 상당히 낮은 억제율을 보여, 제대정맥 내피 세포에 대해서는 낮은 증식 억제 작용을 갖음을 보여주었다. 따라서 관상동맥성형술 시술부위의 혈관 내피화(endothelialization) 가능성이 증가되어 혈관 재협착 및 후기 혈전증의 문제점을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

실험예 3: 생체내 ( in vivo ) 경동맥 협착 억제효과 확인

3-1. 도포용 유데나필 - 플루로닉 겔의 제조

실험 하루 전날 F-127 플루로닉 겔(sigma chemical company, Germany)을 25%가 되도록 차가운 PBS로 녹인 뒤, 4℃에서 12시간 이상 방치하여 분말상태의 F-127 플루로닉 겔을 완전히 녹였다. 실험당일 분말상태의 유데나필을 100uM, 10uM, 1uM의 농도로 100% 에탄올에 용해시킨 후 25% F-127 플루로닉 겔 180ul에 ethanolic 유데나필(100uM/L, 10uM/L, 1uM/L의 udenafil) 20ul의 비율로 첨가하여, 200ul의 유데나필-플루로닉 겔이 되도록 제조하였다. 도포용 플루로닉 겔은 유데나필 포함 여부에 관계없이 무색 투명한 겔 상태였다.

3-2. 대상동물

체중 300~350g의 Sprague-Dawley계의 성숙한 수컷 백서를 사용하였다. 좌측 총 경동맥 풍선 손상(balloon injury)만 받은 대조군 3마리, 풍선 손상 후 유데나필을 각 농도 별로 투여 받은 치료군 13마리를 실험군으로 총 16마리를 대상으로 하였다.

3-3. 백서 경동맥 손상모델과 유데나필 국소요법

백서에 케타민(ketamine, 50 mg/kg)과 자일라진(xylazine, 6.7 mg/kg)을 복강에 투여하여 마취시킨 후, 좌측 경부를 절개하여 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥을 분리하였다. Microvascular clamp (Acland, S & T, Switzerland)를 총경동맥의 대동맥 기시부와 내경동맥 원위부에 착용시켜 혈류를 일시적으로 중단시킨 상태에서 외경동맥을 절개하였다. 총경동맥에 풍선도자를 삽입하고, 총경동맥의 직경보다 크게 풍선을 부풀려 3회 왕복시켜 내피세포를 제거한 후 생리적 식염수로 총경동맥 내부를 세척하였다. 이후 microvascular clamp를 제거하여 혈류를 재관류 시키고 절개부위를 봉합하였다. 대조군은 총경동맥에 손상만을 가한 후 혈류를 재관류시켰으며, 유데나필 100uM, 10uM, 1uM 치료군은 동일한 방법으로 내피세포를 제거하고 microvascular clamp을 제거하여 혈류를 재개시키고 절개부위를 봉합하였다. 경동맥의 외부에 분비물 및 혈액을 깨끗이 제거한 후, 도포하기 위해 미리 준비된 유데나필-플루로닉 겔과 유데나필을 포함하지 않는 플루로닉 겔을 대조군과 유데나필 치료군에 각 실험동물의 경동맥 외벽에 주사기를 이용하여 200ul씩 고르게 도포한 후 절개부위를 봉합하였다.

3-4. 백서 경동맥 병리조직 검사 및 분석

21일 후에 다시 마취시킨 후 경동맥을 적출하여 10% 포르말린액에 고정시켰다. 고정된 경동맥의 중앙부위 1cm를 취하여 파라핀에 포매한 후 4um로 연속적인 절편을 만들어 Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하고 광학 현미경으로 관찰하고 혈관 절편의 사진을 촬영하였다.

촬영한 사진을 스캐닝하여 컴퓨터에 옮긴 후 Image Analysis Software(Image-Pro Plus version 6.0)을 이용하여 quantitative morphometry 분석을 시행하였다. 분석에 사용한 인자들은 신생내막의 면적(neointima area), 중막의 면적(media area), 신생내막과 중막의 면적비(intima/media ratio)이다.

도 3의 (a)는 실험예 3의 대조군 경동맥 단면, (b)는 유데나필 1uM 투여군 경동맥 단면, (c)는 유데나필 10uM 투여군 경동맥 단면, (d)는 유데나필 100uM 투여군 경동맥 단면의 광학 현미경 사진(100배)이다.

도 3을 참조하면, 유데나필 10uM 이하에서는 경동맥 재협착 억제효과가 미미하였으나, 1mM과 100uM 농도에서 경동맥 재협착 방지 효과가 현저히 나타남을 확인할 수 있었다.

도 4는 실험예 3의 대조군, 유데나필 투여군의 신생내막의 면적 및 중막의 면적을 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 5는 실험예 3의 대조군, 유데나필 투여군의 신생내막의 면적/중막의 면적을 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 유데나필 10uM 이하에서는 신생내막 대 중막의 면적비가 대조군과 비교하여 감소하였으며, 1mM과 100uM 농도에서는 신생내막 대 중막의 면적비가 현저히 감소하여 신생내막 형성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 후기 스텐트 혈전증을 효과적으로 억제하여, 다양한 심혈관계 질환의 치료에 효율적인 방법으로 적용될 것이다.

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 피라졸로피리미디논 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하고, 스텐트 코팅제의 형태로 비경구 국소투여되는 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물:
[화학식 2]
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제1항에 따른 후기 스텐트 혈전증 예방 및 치료를 위한 약학 조성물이 코팅된 스텐트.