KR20090051208A - 폴리페놀 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사과와 같은 과일로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 추출하기 위한 방법 및 심혈관 질환, 대장암 및 소화 건강의 치료 또는 예방에 있어서의 상기 추출물의 사용에 관한 것이다.

폴리페놀, 과일

Description

폴리페놀 추출 방법 {POLYPHENOL EXTRACTION PROCESS}

본 발명은 사과와 같은 과일류로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물 (polyphenols)을 추출하는 방법 및 심혈관 질환, 대장암 및 소화 건강의 치료 또는 예방에 있어서 상기 추출물의 사용에 관한 것이다.

심혈관 질환 (CVD)과 암은 전세계적으로 가장 중요한 두가지 사망 원인이다.

유럽연합에 있어서, CVD는 질병과 사망의 주원인으로서 연간 1천6백9십억 유로의 비용을 발생시키고 있고[Leal et al . (2006) Eur. Heart J. 27(13):1610-9], 미국에 있어서는, 7천1백3십만 명의 미국인이 하나 이상의 유형의 CVD를 갖고 있는 것으로 미국 심장 협회는 추정하고 있다.

세계보건기구(WHO)에 의하면, 전세계적으로 매년 약 7백6십만 명(또는 13%)의 사람들이 암으로 사망한다. 특히, 폐, 위, 간, 대장 및 유방의 암이 이들 사망 원인의 절반을 넘고 있다.

역학적(Epidemiological) 증거가 시사하는 바에 따르면, 과일류와 야채류를 많이 섭취하면 이들 만성적인 질병들에 대한 상당한 예방 효과를 얻을 수 있는 것으로 보인다. 이러한 예방 효과의 상당 부분은 과일과 채소에서 통상적으로 발견되는 파이토케미컬(phytochemical)의 주된 일종인 폴리페놀계 화합물 (polyphenols)에 기인한다.

폴리페놀계 화합물은, 알레르기 항원, 바이러스 및 발암물질에 대한 생체의 반응을 조절하는 그들의 능력을 보여주는 강력한 실험상의 증거로 인해, 천연의 생체반응조절물질 (biological reponse modifier)로서 언급되어 왔다. 그것들은 항알레르기, 항염, 항균 및 항암 작용을 나타낸다. 게다가, 폴리페놀계 화합물은 산화 및 자유 라디칼 손상 (oxidative and free radical damage) 을 방지하는 강력한 항산화제로서 작용하며, 산화 스트레스 (oxidative stress)와 연관된 다양한 질병을 막는데 도움이 된다.

그러나, 대부분의 사람들은 폴리페놀계 화합물에 의해 제공되는 건강상의 잇점을 얻기에 충분한 양을 먹지 않는 것으로 평가되어 왔다. 예를 들어, 평균적인 현재의 미국인의 하루 에피카테킨(epicatechin) 섭취는 CVD 위험을 줄이기 위해 필요한 복용량(dose)보다 2 내지 4배 낮다[Gu et al . (2004) J.Nutr. 134(3):613-7; Prior and Gu (2005) Phytochemistry 66(18):2264-80]. 결과적으로, 음식물을 통한 섭취 증가가 중요한 건강 목표로서 대두되고 있다.

사과류는 심혈관 질환의 위험을 줄이는데 필요한 복용량(projected dose)의 거의 10%를 제공하므로써 폴리페놀계 화합물의 중요한 공급원이 될 수 있다[Gu et al. (2004) supra]. 그러나, 폴리페놀계 화합물의 농도와 분포는 각각의 품종에 따라 급격히 변화한다(표 1 참조). 실제로, 대부분의 개량된 후식용 사과 (modern dessert apples)는 1,000 mg/kg 보다 작은 폴리페놀 함량을 갖고 있다.

게다가, 사과의 처리과정이 폴리페놀계 함량에 영향을 끼치는 것으로 알려졌다. 예를 들어, 사과 쥬스를 추출할 때, 총 폴리페놀계 화합물의 95% 정도가 사과 찌꺼기에 남아 있게 된다. 더 중요한 것은, 프로시아니딘계 화합물 (procyanidins)은 쥬스에서 가장 낮은 수율 (32%)을 보인다는 것이다[Guyot and Marnet (2003) J. Agric. Food Chem. 51(21), 6240-6247].

본 발명의 목적은 사과와 같은 과일류로부터 폴리페놀계 화합물을 분리하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 1 태양에 따르면, 과일로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 추출하기 위한 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 상기 과일의 코팅을 제거하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 과일을 냉동건조 또는 냉동하는 단계;

(c) 선택적으로, 상기 (b)단계에서 얻은 냉동건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계;

(d) 상기 (b) 또는 (c)단계에서 얻은 재료에 1회 이상의 용매 추출 사이클(solvent extraction cycle)을 가하는 단계; 및

그 후에 선택적으로,

(e) 상기 (d)단계에서 얻은 액상 추출물로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 분리하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 사과로부터 폴리페놀-함유 분획(fraction)을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 상기 사과의 천연 왁스 코팅을 제거하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 사과를 냉동건조 또는 냉동하는 단계; 및

그 후에 선택적으로,

(c) 상기 (b)단계에서 얻은 냉동건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계.

본 발명의 추가 구현예에 있어서, 사과로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 분리하기 위한 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 상기 사과의 천연 왁스 코팅을 제거하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 사과를 냉동건조 또는 냉동하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 얻은 냉동건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 얻은 분말화된 재료에 1회 이상의 용매 추출 싸이클을 가하는 단계; 및

그 후에 선택적으로,

(e) 상기 (d)단계에서 얻은 액상 추출물을 원심 분리하는 단계.

일 구현예에 있어서, 상기 과일은 사과이다. 추가 구현예에 있어서, 상기 과일은 "붉은 과육 사과(red-cut through apple)"다. 인식될 수 있는 바와 같이, "붉은 과육(red-cut through)"이라는 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, "빨간 속살(red flesh)"을 갖는 사과를 가리킨다.

본 발명에 있어서, 폴리페놀(polyphenol)이라는 용어는 분자내에 하나 보다 많은 페놀기(phenol group)가 존재하는 것을 특징으로 하는 일군의 화합물을 일컫는다. 일 구현예에 있어서, 폴리페놀계 화합물은 그 하위군으로서 플라보노이드계화합물(flavonoids)을 포함한다.

5,000 여종의 자연적으로 발생하는 플라보노이드계 화합물이 다양한 식물로부터 규명되어 있다. 이들은 화학구조에 따라 분류되어, 다양한 하위-분류(sub-class)로 나눠질 수 있다. 일 구현예에 있어서, 플라보노이드계 화합물은 다음을 포함한다:

(a) 화학식 1에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 플라바논계 화합물 (flavanones) (예를 들어, 헤스페레틴(Hesperetin), 나린제닌(Naringenin), 에리오딕티올(Eriodictyol)):

(b) 화학식 2에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 이소플라바논계 화합물 (isoflavanones) (예를 들어, 제니스테인(Genistein), 다이드제인 (Daidzein), 글리시테인(Glycitein)):

(c) 화학식 3에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 플라본계 화합물 (flavones) (예를 들어, 루테올린(Luteolin), 아피제닌(Apigenin), 탄제리틴(Tangeritin)):

(d) 화학식 4에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 플라보놀계 화합물 (flavonols) (예를 들어, 퀘르세틴(Quercetin), 캠프페롤(Kaempferol), 마이리세틴(Myricetin), 이소람네틴(Isorhamnetin), 파키포돌(Pachypodol), 람나진 (Rhamnazin)):

(e) 화학식 5에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 플라반-3-올계 화합물 (flavan-3-ols) (예를 들어, 카테킨(Catechin), 갈로카테킨(Gallocatechin), 에피카테킨(Epicatechin), 에피갈로카테킨 (Epigallocatechin)):

(f) 화학식 6에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 플라반-3,4-다이올계 화합물 (flavan-3,4-diols):

(g) 화학식 7에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 디하이드로플라보놀계 화합물 (dihydroflavonols):

(h) 화학식 8에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 안토시아니딘계 화합물(anthocyanidins) (예를 들어, 시아니딘(Cyanidin), 델피니딘(Delphinidin), 말비니딘(Malvinidin), 펠라고니딘(Pelargonidin), 페오니딘(Peonidin), 페투니딘 (Petunidin)):

(i) 화학식 9에 나타나 있는 화학적 골격 구조에 기초하는 안토시아닌계 화합물(anthocyanins):

화학식 9에서 당(sugar)은 글루코스(glucose), 아라비노스(arabinose), 갈락토스(galactose) 또는 그와 유사한 것으로부터 선택될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 플라보노이드계 화합물은 프로안토시아니딘계 화합물(proanthocyanidins)을 포함한다. 프로안토시아니딘계 화합물은 플라반-3-올 기본단위(subunit)로 구성되는 바이오폴리머(biopolymers)이다. 폴리머는 주로 4 및 8 위치와 4 및 6 위치를 통하여 연결된다. 추가 구현예에 있어서, 프로안토시아니딘은 화학식 10에 나타나 있는 화학구조를 갖는 4,8 연결형 폴리머이다.

일 구현예에 있어서, 플라보노이드계 화합물에는 안토시아니딘계 화합물, 프로안토시아니딘계 화합물, 플라바놀계 화합물, 플라보놀계 화합물, 플라본계 화합물, 플라바논계 화합물 및 이소플라본계 화합물이 포함된다. 추가 구현예에 있어서, 플라보노이드계 화합물에는, 플라보놀계 화합물 및 프로안토시아니딘계 화합물이 포함된다.

일 구현예에 있어서, 플라반-3-올계 화합물은 화학식 5a에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

화학식 5a에서, R₁은 수소 또는 OH 기를 나타낸다.

일 구현예에 있어서, 플라반-3-올계 화합물은 화학식 5b에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

화학식 5b에서, R₁은 앞에서 정의된 바와 같다.

R₁이 수소인 화학식 5b의 화합물들은 에피카테킨으로 알려져 있고, R₁이 OH기인 화학식 5b의 화합물들은 에피갈로카테킨으로 알려져 있다.

일 구현예에 있어서, 플라반-3-올계 화합물은 화학식 5c에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

화학식 5c에서, R₁은 앞에서 정의된 바와 같다.

R₁이 수소인 화학식 5c의 화합물들은 카테킨으로 알려져 있고, R₁이 OH기인 화학식 5c의 화합물들은 갈로카테킨으로 알려져 있다.

일 구현예에 있어서, 안토시아니딘계 화합물은 시아니딘(cyanidin)을 포함하는데, 이것은 화학식 8a에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

일 구현예에 있어서, 플라보노이드계 화합물은 델피니딘(delphinidin)을 포함하는데, 이것은 화학식 8b에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

일 구현예에 있어서, 프로안토시아니딘계 화합물은 화학식 10a에 나타나 있는 화학구조를 갖는다:

화학식 10a에서, R₁은 앞에서 정의된 바와 같으며; n 은 2 내지 30이다.

일 구현예에 있어서, n > 10 (예를 들면, 11 내지 30)이다. 추가 구현예에 있어서, 화학식 10a의 화합물들은 1,000 이상의 분자량을 갖는다. 또 다른 추가 구현예에 있어서, 화학식 10a의 화합물들은 1,000 내지 9,000의 (또는, 3,000 내지 9,000의) 분자량을 갖는다.

프로안토시아니딘계 화합물은 하위군으로서, 프로시아니딘계 화합물과 프로델피니딘계 화합물을 포함하며, 산 가수분해를 통해 이것들은 각각 시아니딘과 델피니딘을 만들어낸다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 추출된 하나 이상의 폴리페놀계 화합물은 에피카테킨(epicatechin) (즉, R₁이 수소인 화학식 5b의 화합물)을 포함한다.

단계 (a)에서의 과일의 코팅 제거(예를 들어, 사과의 천연 왁스 코팅의 제거)는 유리하게도, 이어지는 단계 (d)의 용매 추출 싸이클에서 거품 발생을 줄여준다. 일 구현예에 있어서, 상기 제거 과정은 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol) 또는 아세톤(acetone)과 같은 적합한 용매를 사용하여 세척하는 단계를 포함한다. 이 때, 상기 천연 왁스는 증류에 의해 생기는 왁스/용매 추출 혼합물로부터 회수될 수 있으며, 유익하게도 화장품의 원료로 사용될 수 있다.

인식될 수 있는 바와 같이, 냉동-건조 또는 냉동 단계 (b)는 통상적으로 당 업자에게 공지된 절차를 포함한다. 예를 들어, 냉동-건조 단계에서는 -18℃에서 미리 냉동된 지름이 25mm 미만인 사과를 통째로 사용하여 이를 진공 하에서 건조시키므로써, 수분이 수증기의 형태로 확실히 제거되도록 한다. 이 단계는 유익하게도, 결과로서 생기는 폴리페놀계 화합물을 온전한 형태로 유지시키는 것은 물론 전체적인 생산물의 구조와 크기를 보존시킨다.

냉동된 샘플들에 의해 제공되는 잇점은 세포의 구조를 깨는 얼음 결정들을 생성시키므로써 더 쉽게 폴리페놀계 화합물이 방출되도록 한다는 것이다. 그 결과, 냉동과정은 추출 과정의 효율을 향상시킨다. 게다가, 오븐건조(oven drying), 자연건조(air drying) 또는 열건조 (thermal drying)와 같은 다른 건조 방법과 비교했을 때, 냉동-건조 과정은 카테킨과 에피카테킨 분자들의 가용성(availability)을 향상시킨다.

분말화 단계(c)는 당업자에 공지된 방법을 포함한다. 예를 들어, 소규모의 분말화는 종래의 푸드 프로세서(food processor)에서 수행될 수 있다. 대규모 분말화 기술도 유사한 방법으로 적절하게 채용될 수 있는데, 재-수화반응(re-hydration)을 막기 위해 일반적으로 습한 공기의 제거(예를 들어, 질소 블랭킷(nitrogen blanket)같은 불활성 분위기의 사용이나 퍼징(purging)에 의한)를 필요로 할 것이다. 분말화는 폴리페놀계 화합물의 분해를 일으키는 산화작용 (예를 들어, 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)에 의한)을 방지하며, 또한 작은 크 기의 입자들을 제공하므로써 이어지는 추출 단계에서의 효율을 증대시킨다. 추가 구현예에 있어서, 분말화는 액체 질소의 존재 하에 수행되는데, 이는 이어지는 단계 (d)의 추출 싸이클 동안 사용 재료가 분해되는 것(macerating)을 방지한다. 단계 (c)에서 얻어진 분말화된 사과는 일반적으로, 이어지는 용매 추출 싸이클에 유리한, 예를 들면, 1 내지 25mm 정도의 입자크기를 갖는다. 본 발명의 이러한 태양은 폴리페놀계 화합물의 분해를 일으킬 위험이 있는 효소 처리과정을 요구하지 않는다는 중요한 장점을 제공한다.

단계 (d)의 추출 싸이클은 통상적으로 연속 수평 향류 추출기(continuous horizontal counter current extractor)나, 회분식 추출기(batch extractor) (용매 추출과 다-용매 추출 및 하류에서의 용매 회수를 포함), 또는 향류 수직 탑형 추출기(counter current vertical column extractor) (하류 액체를 박막 증발기(wiped film evaporators)를 갖고 있는 액체 추출 원심분리기로 보냄), 또는 적합한 디자인의 반연속 회전 드럼 진공 필터 또는 원심 경사분리기(centrifugal decanter)에서 수행된다. 인식될 수 있는 바와 같이, 향류 추출기는 당업자에 잘 알려져 있으며, 연속식 또는 회분식 향류 추출기일 수 있다.

단계 (d)는 일반적으로 메탄올, 에탄올, 물, 아세톤 및 이들의 임의의 혼합물과 같은 하나 이상의 추출 용매를 포함한다. 이들 용매는 식물 효소(plant enzymes)를 변성시키는 데에 도움이 되며, 그 결과 잔류 효소 활성(residual enzyme activity)문제를 제거한다.

일 구현예에 있어서, 추출 용매는 물이다. 추가 구현예에 있어서, 상기 물은 증류되고, 탈이온화되고(deionised), 탈기되고(deaerate), 65℃ 내지 80℃ 사이의 온도 (예를 들어, 70℃ 내지 75℃사이, 또는 73℃ 내지 75℃사이)로 가열될 수 있다. 추출 용매로 물을 사용하는 것은 상당한 장점이 있는데, 예를 들어, 제거되지 않은 채로 결과물인 식품(foodstuff)에 곧바로 사용될 수 있고, 다른 용매들과는 달리 환경문제를 일으키지 않는다는 것이다. 탈기된 물의 사용은 일반적으로 최종 산물인 폴리페놀계 화합물의 분해(폴리페놀 수율을 50%까지 줄임)를 일으키는 산화 효소를 억제하는 잇점을 제공한다. 이 문제에 대한 이전의 접근 방법들은 산화효소를 억제하는 특별한 작용제 (예를 들어, 아스코르빈산(ascorbic acid)) 를 이용하고 있었다. 그러나 이러한 접근 방법은, 산화효소들이 억제될 뿐 제거되지는 않고, 게다가 상기 작용제는 하류에서의 사용 (예를 들어, 식품 등에 투입)에 앞서 제거될 것을 요구받을 수도 있었기 때문에 제한적인 성공일 뿐이었다. 70℃ 이상으로 가열된 물을 사용하는 것은 추출물을 저온살균함(pasteurising)(저온살균은 73℃ 보다 높은 온도에서 일어난다)과 동시에 단일 싸이클(single cycle)만으로도 폴리페놀계 화합물의 95%를 추출할 수 있다는 잇점을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 물은 1 bar보다 높은 압력 (예를 들어, 2 내지 5 bar, 또는, 4 bar)으로 용매 추출 단계에 사용된다. 고압으로 물을 공급하는 것은 추출 과정에 관련된 배압(back pressure)을 극복하는데 도움이 된다.

일 구현예에 있어서, 추출용 용매는 메탄올인데, 이것은 유리하게도 단일 싸이클에서 폴리페놀계 화합물의 95%를 추출할 수 있게 해준다.

다른 구현예에 있어서, 추출용 용매는 아세톤인데, 이것은 메탄올보다 더 환경친화적인 용매이다.

일 구현예에 있어서, 추출 싸이클 (d)는 복수의 분리된 단계, 바람직하게는 세 개의 단계를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 용매 추출 싸이클의 첫 번째 단계는 50 내지 100%의 메탄올과 0 내지 50%의 물, 바람직하게는, 60 내지 90%의 메탄올과 10 내지 40%의 물, 또는, 80%의 메탄올과 20%의 물을 포함하는 추출용 용매를 사용한다. 이 단계는 단계 (c)에서 얻어진 분말화된 사과로부터 잔류 카테킨과 에피카테킨 분자들을 추출하는데 기여한다.

일 구현예에 있어서, 분말화된 사과들은 상기 첫 번째 단계에 앞서 가수분해(hydrolysis)되는데, 이를 통하여 배당체 결합(glycoside bonds)이 깨진다. 가수분해 단계는 저 분자량 폴리페놀계 화합물에 대해서는 필요치 않은데, 이는 이들 물질이 오직 당이 결합되지 않은 형태의 폴리페놀계 화합물(non-sugar bonded polyphenols)로서 존재하기 때문이다.

일 구현예에 있어서, 용매 추출 싸이클의 두 번째 단계는 0 내지 75%의 에탄올과 25 내지 100%의 물, 바람직하게는, 40 내지 60%의 에탄올과 40 내지 60%의 물, 또는, 50% 에탄올과 50%의 물을 포함하는 추출용 용매를 사용한다. 이 단계는 사과 바이오매스(biomass)로부터 고 분자량 올리고머와 폴리머를 회수하는데 기여한다.

일 구현예에 있어서, 추출 싸이클의 상기 두 번째 단계 이전에 물 세척을 할 수 있다. 예를 들어, 추출 바이오매스는 통상적으로, 이어지는 추출 단계에 앞선 전 단계로서 재료를 불리기 위해 향류 추출기 내에서 물로 세척될 수 있다. 이 단계는 유리하게도 폴리머의 추출 가용성을 증가시킨다.

일 구현예에 있어서, 추출 싸이클의 세 번째 단계는 50 내지 100%의 아세톤과 0 내지 50%의 물, 바람직하게는, 60 내지 80%의 아세톤과 20 내지 40%의 물, 또는, 70%의 아세톤과 30%의 물을 포함하는 추출용 용매를 사용한다.

다른 구현예에 있어서, 추출 싸이클은 하나의 연속적인 단계로 이뤄질 수 있다. 이 경우에, 추출 싸이클은 추출용 용매들의 조합을 순차적으로 적용할 수 있도 록 배열될 수 있다. 그 결과, 추출 순서는 : 80%의 메탄올과 20%의 물, 50%의 메탄올과 50%의 물, 및 75%의 아세톤과 25%의 물이다. 소규모 바이오매스 원료 처리와 여러 번의 실험에 더 적합한 회분식 추출에 비해, 연속적인 배열은 유익하게도 대규모 바이오매스 원료 처리에 더 적합하다.

용매 추출 싸이클은 추출액(extraction liquid)과 용해성 사과 펄프(soluble apple pulp)를 생산한다. 일 구현예에 있어서, 용매 추출 싸이클은 반복되는데, 바람직하게는 3회 반복된다. 추가 구현예에 있어서, 용해성 사과 펄프는 추출 공정으로부터 회수되고, 예를 들어, 분무 건조, 열 건조, 냉동 건조와 같은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 건조되어, 적합한 열봉합 알루미늄 포일 백(heat sealed aluminium foil bags)이나 용기 안에, 탈수된 사과 섬유질로서 채워질 수 있다.

일 구현예에 있어서, 분리 단계 (e)는 당업자에 공지된 절차에 따라 원심분리 과정(centrifugation)을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 추출액은 3,000 내지 9,000G에서 15분 내지 30분 동안 원심분리된다. 그리하면, 추출액으로부터 잔류 고형 사과 펄프를 분리해 낼 수 있고 이어지는 여과 단계에 앞서 대량의 바이오매스 재료를 제거할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 원심분리에 의해 얻어진 상청액은 한외여과(ultra- filtration)된다. 이것은 다른 분자량을 가진 폴리페놀계 화합물을 선택적으로 여 과해 내는 잇점을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 예를 들어, 600 이하의 분자량을 가진 폴리페놀계 화합물과 같은 저 분자량 폴리페놀계 화합물이 분리된다. 이 구현예는 용매, 예를 들어, 에피카테킨 및 카테킨 (분자량=290)과 같은 폴리페놀 단량체, 폴리페놀 이량체 (분자량=580), 단당류(monosaccharides) 및 예를 들어, 과당(fructose) 및 자당(sucrose)(분자량=342)과 같은 이당류(disaccharides)를 포함하는 여과액 (filtrate)을 만들어낸다.

다른 구현예에 있어서는, 300 미만의 분자량을 갖는 분자들을 분리하여, 용매와, 예를 들어, 에피카테킨 및 카테킨 (분자량 290)과 같은 폴리페놀 단량체를 포함하는 여과액을 생산한다.

일 구현예에 있어서, 잔류 용매는, 예를 들면, 불활성 기체 (예를 들어, 질소) 존재 하에서의 단일 또는 다단 증발과정에 의해 제거되고, 응축과정에 의해 재사용을 위하여 회수된다. 추가 구현예에 있어서, 최종 분리 단계에 앞서 후처리를 위해, 단량체와 이량체가 물상 용액(water phase solution)에 확실하게 남아 있도록 하기 위해서, 용매를 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 세척한다.

그러므로, 상기 방법은, 수용액의 형태로, 두 개의 분리물을 산출한다. 일 구현예에 있어서, 첫 번째 분리물은 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하고, 두 번째 분리물은 예를 들어, 분자량 600 이상의 분자들과 같은 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함한다.

추가 구현예에 있어서, 분리물들은 둘다 30℃ 이하의 온도, 예를 들어, 20℃이하의 온도에서 진공 하에 건조되고, 선택적으로 냉동-건조된다.

일 구현예에 있어서, 사과로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 분리하기 위한 방법이 제공되는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 사과의 천연 왁스 코팅을 제거하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 얻은 사과를 냉동-건조 또는 냉동하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 얻은 냉동-건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 얻은 재료에 용매가 물인 1회 이상의 용매 추출 싸이클을 가하는 단계;

(e) 상기 (d)단계로부터 물을 증발시키는 단계;

(f) 상기 (e)단계에서 준비된 미정제 추출액 (crude extract)으로부터, 에탄올과의 용리(elution)를 이용하여 크로마토그래피 분리법(chromatographic separation)으로 폴리페놀계 화합물을 분리하는 단계;

(g) 에탄올을 증발시켜 폴리페놀계 화합물 분리물을 산출하는 단계;

본 발명의 두 번째 태양으로서, 앞에서 설명한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 폴리페놀 함유 추출물이 제공된다.

본 발명의 방법에 따라 붉은 과육 사과(red-cut through apples)로부터 폴리페놀계 화합물을 추출하면, 폴리페놀계 화합물을 고농도로 포함하는(예를 들어, 에피카테킨 함량이 18% 이상인) 진한 붉은 색의 추출액이 생긴다는 것이 밝혀졌다. 추출물 안의 폴리페놀계 화합물은 승인된 식품 색소(food colourant)(시아니딘(cyanidin); E163a)인 안토시아니딘류(anthocyanidins)로서 고정되어 있음이 확실하다. 이 식품 색소는 2.5 mg/kg-body-weight 의 수준으로 사용이 승인된 바 있는데, 본 발명의 방법은 1 mg/kg-body-weight의 농도로 시아니딘을 제공한다. 그러므로, 일 구현예에 있어서, 본 발명의 추출물을 함유하는 폴리페놀을 포함하는 천연 식품 색소가 제공된다. 식품 색소로서의 폴리페놀 추출물의 사용은, 식품의 안전한 착색 및 고농도의 유익한 폴리페놀계 화합물 제공이라는 두 가지 중요한 장점을 제공한다.

치료 방법 ( Methods of Treatment )

폴리페놀계 화합물은 수많은 건강상의 이익을 가져온다는 것이 증명되어왔다. 예를 들어, 역학적 연구에 따르면 플라보노이드(flavonoid)의 섭취가 많을수록 CVD의 위험이 줄어드는 것으로 나타나는데[Arts et al . (2001) Epidemiology 12(6): 668-675; Sesso et al. Am J Clin Nutr 77: 1400-8; Mink et al . (2007) Am J Clin Nutr 85(3):895-909], 이는 인체에서 내피기능(endothelial function)을 향상시키고 혈소판 응집을 방해하는 그것들의 능력에 기인하는 결과라 할 수 있다[Keen et al . (2005) Am J Clin Nutr 81 (1 Suppl):298S-303S; Vita J A (2005) Am J Clin Nutr 81( Suppl ):292S-7S; Heptinstall et al . (2006) J Cardiovasc Pharmacol 47 Suppl 2:S197-205].

그러므로, 본 발명의 추가 태양으로서, 심혈관 질환 또는 대장암의 예방이나 치료에 사용하기 위한, 앞에서 설명한 바와 같은 폴리페놀 추출물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 있어서, 심혈관 질환 또는 대장암의 예방이나 치료에 사용되는 의약품의 제조에 있어서의, 앞에서 설명한 바와 같은 폴리페놀 추출물의 사용이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 앞에서 설명한 바와 같은 폴리페놀 추출물의 투여단계(administration)를 포함하는, 심혈관 질환 또는 대장암의 치료 또는 예방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 심혈관 질환 또는 대장암의 치료나 예방에 사용하기 위한 폴리페놀 추출물을 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition)이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 심혈관 질환의 예방이나 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 심혈관 질환의 예방이나 치료에 사용하기 위한 의약품의 제조에 있어서의, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물의 사용이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물의 투여단계를 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는예방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 대장암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 대장암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약품의 제조에 있어, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물의 사용이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물의 투여를 포함하는, 대장암의 치료 또는 예방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 대장암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

인식될 수 있는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 “치료법(treatment)"과 “치료(treating)"는 질병(disease)이나 부조(disorder) 와 같은 용태(condition)와 싸우는 것을 목적으로 하는 환자의 관리와 보살핌을 의미한다. 이 용어는 증상과 합병증을 완화하거나 경감하기 위해, 질병, 부조 또는 용태의 진행을 늦추기 위해, 및/또는, 용태를 예방하는 것은 물론 질병, 부조, 또는 용태를 치료하거나 제거하기 위해, 예를 들면, 병의 증상 또는 합병증을 완화하기 위한 활성 화합물을 투여하는 것과 같은, 환자가 겪고 있는 주어진 용태에 대한 치료의 전 영역을 포함 하는 것으로 의도된다. 이 때, 예방(prevention)은 질병, 용태 또는 부조와 싸우기 위한 환자의 관리와 보살핌으로서 이해되고, 예를 들면, 증상이나 합병증의 발병을 예방하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다. 치료되어야 할 환자는 바람직하게는, 특히, 사람과 같은 포유동물이며, 또한 개, 고양이, 소, 양, 말 및 돼지와 같은 동물들도 포함될 수 있다.

인식될 수 있는 바와 같이, 여기에서 “폴리페놀 추출물(polyphenol extract)”이라 함은, 본 발명의 방법에 따라 사과로부터 추출된 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는 또한 미정제 추출물로부터 정제 (예를 들면, 크로마토그래피 분리법에 의한) 되어 분리된 폴리페놀계 화합물을 포함하는 것으로 의도된다.

복합 치료법 ( Combination Therapies )

많은 질병들이, 병용투여되거나 순차투여되는 하나 이상의 의약품을 사용하여 치료된다. 그러므로, 앞에서 언급된 질병의 치료법에 통상적으로 사용되는 다른 기존의 치료법과 병용되어, 또는 그에 대한 보조약으로서, 또는 그와 접목되어 상기 질병들 중 하나의 치료를 위한 치료적 방법으로서 본 발명의 사과, 사과 추출물 또는 분리 폴리페놀을 사용하는 것은, 본 발명의 범위 안에 있다. 일 구현예에 있어서, 하나 이상의 부가적인 치료제와 복합된, 앞에서 설명된 사과, 추출물 또는 분리 폴리페놀을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

유사하게, 앞에서 언급된 질병을 위한 의약품의 제조에 있어, 상기 질병 중 하나의 치료법에 일반적으로 사용되는 다른 활성 화합물들과 조합하여 본 발명의 사과, 추출물 또는 분리 폴리페놀을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.

복합 치료법은 당업자에 의해 필요하거나 편리하다고 판단되는 임의의 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 목적에 부합하는 한, 조합에 사용되는 화합물들의 순서, 양, 반복 또는 상대적인 양에 관한 제한은 특별히 고려되지 않는다.

조성물 ( Compositions )

일 구현예에 있어서, 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 폴리페놀 추출물은, 예를 들어, 단당류(monosaccharides), 이당류(disaccharides) 및 다당류와 같은 다른 프리바이오틱 물질(prebiotic agents)과 조합하여 사용될 수 있다. 그리하여, 본 발명의 다른 태양으로서, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 포함하는 폴리페놀 추출물과 하나 이상의 단당류, 이당류 또는 다당류를 포함하는 프리바이오틱 조성물이 제공된다. 적합한 당류는 화학식 11에 나타타 있는 화학구조를 갖는 프락토올리고당(oligofructose)이다:

화학식 11에서, n 은 일반적으로 2 내지 14, 적합하게는 2 내지 10, 또는 2 내지 8의 범위에 있다.

추가 구현예에서, 본 발명의 폴리페놀 추출물은 종래의 사과 추출물과 조합되어 사용될 수 있는데, 이것은 다양한 단당류, 이당류 및 다당류를 제공한다.

폴리페놀계 화합물이 다른 프리바이오틱 물질 또는 종래의 사과 추출물과 조합하여 사용되는 경우, 각 성분들은 임의의 편리한 경로에 의해 순차적으로 또는 병용으로 투여될 수 있다. 이러한 조합은 미세균총(micro flora)을 자극하는 잇점을 제공하는데, 이는 대장암의 위험을 더욱 줄이는 것은 물론, 위장 건강, 위장 기능, 칼슘 흡수 및 면역 반응을 향상시키는데 도움이 된다[Rios,L. et al ., supra].

일 태양에 있어서, 본 발명은 폴리페놀 추출물 및/또는 앞에서 언급된 조합을 포함하는 제형(dosage form)을 제공한다(이후 본 발명의 조성물이라 칭함).

본 발명의 조성물은, 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)나 부형제(excipient)와 조합되어 편리하게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 종래의 기술에 따라 임의의 다른 공지된 보조제(adjuvants)와 부형제는 물론, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제(diluents)와 함께 제형화될 수 있다. [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Edition, Gennaro, Ed. , Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1995 참조].

적합한 약제학적 담체에는, 불활성 고체 희석제나 증량제(filler), 살균 수용액 및 다양한 유기 용매 등이 포함된다. 고형 담체의 예로서는 젖당(lactose), 백토(terra alba), 자당(sucrose), 시클로덱스트린(cyclodextrin), 활석(talc), 젤라틴(gelatine), 한천(agar), 펙틴(pectin), 아라비아고무(acacia), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid) 및 셀룰로즈의 저급 알킬 에테르 (lower alkyl ethers of cellulose) 등이 있다. 액상 담체의 예로서는 시럽(syrup), 땅콩 기름(peanut oil), 올리브 기름(olive oil), 인지질(phospholipids), 지방산(fatty acids), 지방산 아민(fatty acid amines), 폴리 옥시에틸렌(polyoxyethylene) 및 물(water) 등이 있다.

유사하게, 담체 또는 희석제는, 단독으로 또는 왁스(wax)와 혼합되어 사용되는, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트(glyceryl distearate)와 같은, 이 분야에서 알려진 임의의 서방형(sustained release) 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물과 약제학적으로 허용 가능한 담체들을 조합하므로써 형성된 약학 조성물은, 알려진 투여 경로에 적합한 다양한 제형으로 손쉽게 투여된다. 제형화(formulation)는 약제학 기술 분야에서 알려진 방법에 의하여 단위 제형으로 편리하게 제시될 수 있다.

그리하여, 추가 태양에 있어서, 심혈관 질환의 치료법에 사용하기 위한, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용 가능한 염(salt) 또는 전구약물(prodrug)을 포함하는 폴리페놀 추출물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 제형이 제공된다.

그리하여, 추가 태양에 있어서, 대장암의 치료법에 사용하기 위한, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물을 포함하는 폴리페놀 추출물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 제형이 제공된다.

상기 제형은 경구(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 폐(pulmonary), 국소 (topical) (예를 들면, 구강(buccal)과 혀밑(sublingual)), 경피(transdermal), 소뇌연수조(intracisternal), 복막내(intraperitoneal), 질(vaginal) 및 비경구 (parenteral) (예를 들면, 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 경막내 (intrathecal), 정맥내(intravenous) 및 피내(intradermal)) 경로와 같은 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있는데, 이중에서 경구를 통한 투여 방법이 바람직하다. 인식될 수 있는 바와 같이, 바람직한 경로는 치료받는 환자의 일반적인 건강상태와 나이, 처치되는 상태의 특징 및 선택된 활성 성분 (active ingredient)에 따라 달라질 수 있다.

국소 사용의 경우, 본 발명의 화합물을 함유하는 스프레이(sprays), 크림(creams), 연고(ointments), 젤리(jellies), 겔(gels), 흡입제(inhalants), 피부 패취(dermal patches), 임플란트(implants), 현탁액(solutions of suspensions) 등이 고려될 수 있다. 이러한 적용 방식의 목적상, 국소적인 적용에는 구강세척과 양치(gargles)가 포함될 것이다.

구강 투여를 위한 조성물에는, 경질 또는 연질 캡슐(capsules), 정제(tablets), 트로키제(troches), 당의정(dragees), 환약(pills), 마름모꼴 알약(lozenges), 가루약(powders), 과립(granules)과 같은 고형 제형; 및 용액(solutions), 유화액(emulsions), 수성 또는 유성 현탁액(suspensions), 시럽 (syrups) 및 엘릭서(elixirs)와 같은 액상 제형이 포함되는데, 이들 각각은 본 발명의 조성물의 소정의 양을 포함할 수 있고, 또한 적합한 부형제를 포함할 수도 있다. 경구용으로 의도된 조성물은 임의의 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그러한 조성물은, 약제학적으로 아취있고 입에 맞는 조제품(preparation)을 제공하기 위해, 감미료 (sweetening agents), 향미료(flavouring agents), 착색제(colouring agents) 및 보존제(preserving agents)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다.

수성 현탁액은, 수계 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 형태로, 본 발명의 조성물을 함유할 수 있다. 그러한 부형제로는, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellu- lose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (hydroxypropylmethylcellulose),알긴산 나트륨(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 트라가칸스검(gum tragacanth) 및 아라비아 고무(gum acacia)와 같은 현탁제(suspending agents)가 있다. 분산 또는 습윤제는, 레시틴(lecithin)과 같은 자연 발생 인지질; 또는, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트(polyoxyethylene stearate)와 같은, 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합물; 또는, 예를 들어,헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같은, 긴사슬 지방족 알콜(long chain aliphatic alcohols)과 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)의 축합물; 또는, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트 (polyoxyethylene sorbitol monooleate)와 같은, 지 방산과 헥시톨(hexitol)로부터 유도된 부분 에스테르(partial esters)와 에틸렌 옥사이드의 축합물; 또는, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyethylene sorbitan monooleate)와 같은, 지방산과 헥시톨 무수물(hexitol anhydrides)로부터 유도된 부분 에스테르(partial esters)와 에틸렌 옥사이드의 축합물; 일 수 있다. 수계 현탁액은 또한 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 자당이나 사카린(saccharin) 과 같은, 하나 이상의 감미제를 함유할 수 있다.

유성 현탁액은, 본 발명의 조성물을, 예를 들어 땅콩 기름(arachis oil), 올리브유(olive oil), 참기름(sesame oil) 또는 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 식물성 기름에, 또는 유동 파라핀(liquid paraffin)과 같은 광물성 기름에 현탁시키므로써 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은, 예를 들어, 밀납(beeswax), 고형 파라핀(hard paraffin) 또는 세틸 알콜(cetyl alcohol)과 같은 증점제(thickening agent)를 함유할 수 있다. 앞에서 기재된 바와 같은 감미제와 향미제는 입맛에 맞는 경구용 조제품을 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 아스코르빈산(ascorbic acid)과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말과 과립은, 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제(preservative)와 혼합된 형태로 본 발명의 조성물을 제공한다. 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제의 예는 앞에서 이미 언급한 바와 같다. 그것들은 또한, 구연산염(citrate) 및 인산염(phosphate) 완충 제와 같은 완충제, 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 또는 중탄산암모늄 (ammonium bicarbonate)과 같은 중탄산염(bicarbonates)과 같은 탄산염으로부터 형성된 발포제(effervescent agents), 및 구연산(citric acid)과 같은 솔릭 액시드(solic acid) 또는 액시드 시트레이트 솔트(acid citrate salt)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 감미제, 향미제 및 착색제와 같은 추가적인 부형제 또한 첨가될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 수중유 형의 유화물(oil-in-water emulsions)의 형태일 수 있다. 기름 상(oily phase)은 올리브유나 땅콩기름과 같은 식물성 기름, 유동 파라핀과 같은 광물성 기름, 또는 그들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는, 예를 들어 아라비아검 또는 트라가칸드검과 같은 천연 검(gum), 예를 들어 콩, 레시틴과 같은 자연 발생 인지질, 예를 들어 소르비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate)와 같은, 지방산과 헥시톨 무수물(hexitol anhydrides) 로부터 유도된 에스테르나 부분 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxy ethylene sorbitan monooleate)와 같은, 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물 등일 수 있다. 이 유화액은 또한 감미제와 향미제를 함유할 수 있다.

시럽과 엘릭서(elixirs)는, 예를 들어 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 소르비톨(sorbitol) 또는 자당(sucrose)과 같은 감미제를 이용하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형은 진통제(demulcent), 보존제 및 향미제와 착색제를 또한 함유할 수 있다. 상기 약학 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 앞에서 설명한 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하는 공지의 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 조제품은, 예를 들어 1,3-부탄디올에 녹인 용액과 같이, 무독성의 비경구용으로 사용될 수 있는 희석제나 용매를 사용한 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비이클(vehicles)과 용매로서는, 물, 링거액 (Ringer's solution) 및 등장 식염 용액(isotonic sodium chloride solution)이 있다. 또한, 멸균 고정유(fixed oil)는 용매나 현탁용 매질로서 편리하게 사용된다. 이러한 목적을 위해, 임의의 무자극성 고정유(bland fixed oil)가, 합성 모노 또는 디글리세라이드(mono- or diglycerides)를 이용하여 사용될 수 있다. 또한, 올레산(oleic acid)과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

추가 구현예에서, 폴리페놀 추출물은 건조될 수 있는데, 예를 들어, 30℃보다 낮은 온도(예를 들어, 20℃보다 낮은 온도)에서 진공 하에 분무-건조되거나 건조될 수 있고, 선택적으로는 냉동-건조될 수 있으며, 그에 따라, 고형 제형으로 제형화될 수 있다.

정제(Tablets)는 정제의 제조에 적합한, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합된 형태로 활성 성분을 함유할 수 있다. 이들 부형제는, 예를 들어, 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 젖당(lactose), 인산칼슘(calcium phosphate) 또는 인산나트륨( sodium phosphate)과 같은 불활성 희석제 ; 예를 들어, 옥수수 전분이나 알긴산과 같은 과립화 및 붕해제(granulating and disintegrating agents); 예를 들어, 전분(starch), 젤라틴(gelatine) 또는 아라비아검(acacia)과 같은 결합제; 및 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid) 또는 활석(talc)과 같은 윤활제; 일 수 있다.

정제(tablet)는 코팅되지 않을 수도 있고, 또는, 위장 관에서의 분해와 흡수를 지연시키고 그에 따라 더 오랜 기간동안 지속적인 작용을 제공하도록 하기 위하여 공지된 기법에 의해 코팅될 수도 있다.

경구 사용을 위한 제형은 또한, 활성 성분이, 예를 들어, 탄산칼슘(calcium carbonate), 인산칼슘(calcium phosphate) 또는 백토(kaolin)와 같은 불활성 고체 희석제와 혼합되어 들어있는 경질 젤라틴 캡슐로서 제공되거나, 또는, 활성 성분이 물이나, 예를 들어, 땅콩유(peanut oil), 유동 파라핀(liquid paraffin) 또는 올리브유(olive oil)와 같은 기름 매질과 혼합되어 들어있는 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수도 있다.

비경구 투약을 위한 제형은, 사용에 앞서 멸균 주사용 용액 또는 분산액에 녹이게 되는 멸균된 분말은 물론, 멸균 주사용 수계 및 비수계 용액, 분산액, 현탁 액 또는 유화액을 포함한다. 이러한 수용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하며, 액상 희석제는 먼저 충분한 염류나 당류로 등장(isotonic)되어야 한다. 이러한 수용액은 특히, 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 적당하다. 사용되는 멸균 수계 매질은 당업자에게 공지된 표준적인 기술에 의해 모두 쉽게 입수될 수 있다. 데포 주사용 제형 (Depot injectable formulations)도 고려될 수 있는 바, 이 또한 본 발명의 범위 안에 속한다.

상기 화합물들의 직장 투여를 위한 조성물은 또한 좌약의 형태일 수 있다. 이들 조성물은, 본 발명의 조성물을 적합한 비자극성 부형제와 혼합하므로써 제조될 수 있는데, 이 때, 부형제는 실온에서는 고형이지만 직장온도에서는 액상인 것이어서, 직장 안에서 녹아 본 발명의 조성물을 방출하게 된다. 이러한 재료의 예에는 카카오 버터(cocoa butter) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols)이 포함된다.

본 발명의 화합물 또는 그것들의 조성물은, 일반적으로, 의도한 결과를 얻는데 효과적인 양으로, 예를 들어 치료되어야 할 특정 질병을 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 상기 화합물(들)은 치료 효과를 얻기 위해서 치료학적으로 투여될 수 있다. 치료 효과(therapeutic benefit)란 치료되어야 하는 기저 질환의 근절이나 개선, 및/또는, 기저 질환과 결부된 하나 이상의 시스템의 근절이나 개선을 의미한다. 치료 효과는 또한, 개선이 이뤄졌는가에 상관없이, 질병 의 진행을 멈추거나 늦추는 것을 포함한다.

정확한 투여량(dosage)은 투여 횟수와 방식, 환자의 성별, 나이, 몸무게 그리고 일반적인 건강상태, 치료되는 용태의 특징과 심각성(severity) 및 치료되어야 하는 임의의 부수적인 질환, 그리고 당업자에게 자명한 기타 인자들에 의해 달라질 수 있다. 효과적인 투여량(dosage)의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.

상기 폴리페놀 추출물이 같은 질병 상태에 유효한 제 2의 치료제와 조합되어 사용되는 경우, 각각의 화합물의 일회 투여량(dose)은, 화합물이 단독으로 사용될 때와는 달라질 수 있다. 적절한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있다.

본 발명의 다른 태양으로서, 예를 들어, 과일 쥬스, 스포츠 음료, 요구르트 음료, 우유 음료, 차 및 그와 유사한 것 등과 같은 음료수, 또는, 예를 들어, 후르츠 바(fruit bar), 너트 바(nut bar) 및 시리얼 바(cereal bar) 등의 푸드 스낵 바(food snack bar), 씨리얼, 후식, 초코렛바(예를 들어 밀크와 다크) 및 이와 유사한 것과 같은 고형 식품과 같은 식이 조성물(dietary composition)이 제공되는데, 이 때 상기 식이 조성물은 앞에서 설명한 폴리페놀 추출물 및/또는 앞에서 언급된 조합들을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 식이 조성물은, 비타민, 무기질 및 프락토올리고당과 사과 섬유와 같은 프리바이오틱(prebiotics) 등과 같은 다른 영양물질과 프로바이오틱(probiotics)을 더 포함할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 식이 조성물은 앞에서 설명한 바와 같은 액상 제형으로 제형화된다. 추가 구현예에서, 액상 제형은 증점제, 삼투압 조절제 및 완충제를 더 포함할 수 있다.

적합한 삼투압 조절제의 예에는 당류와 소금(sodium chloride)이 포함되는데, 이것들은, 예를 들어 등장 용액 같은 특정 농도의(particular strength) 용액을 제공하는데 사용될 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 구연산염(citrates)과 인산염(phosphates)이 포함된다.

추가 구현예에 있어서, 식품(foodstuff)은 앞에서 설명한 바와 같은 폴리페놀 추출물을 포함한다. 추가 구현예에 있어서, 상기 폴리페놀 추출물은 예를 들어, 건조 과일, 견과류 및 씨리얼 등과 같은 재료 중 하나 이상과 혼합될 수 있다.

그리하여, 추가 태양에서 있어서, 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는, 앞서 정의된 식이 조성물이 제공된다.

추가 태양에 있어서, 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 의약품의 제조에 사용되는, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는, 앞서 정의된 식이 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양으로서, 하나 이상의 저 분자량 폴리페놀계 화합물을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는, 앞서 정의된 식이 조성물의 투여단계를 포함하는 심혈관 질환의 치료 또는 예방법이 제공된다.

그에 따라 추가 태양으로서, 대장암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는, 앞서 정의된 식이 조성물이 제공된다.

추가 태양에 있어서, 대장암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 의약품의 제조에 사용되는, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는, 앞서 정의된 식이 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 있어서, 하나 이상의 고 분자량 폴리페놀계 화합물을 함유하는 폴리페놀 추출물을 포함하는 앞에서 설명한 바와 같은 식이 조성물의 투여를 포함하는, 대장암의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 방법의 도식적인 배열을 보여준다

도 2 내지 13은 에피카테킨 추출에 있어 용매 추출 온도의 효과의 분석 결과를 보여준다.

도 14 내지 15는 메탄올 추출 분석의 결과를 보여준다.

도 16은 메탄올 추출 분석의 결과를 보여준다.

도 17 내지 18은 에피카테킨 추출물의 심혈관 연구의 결과를 보여준다.

일반 절차 ( General Procedures )

약 6g의 냉동-건조된 사과를 비이커에 넣고 저울에 달아 질량을 기록하였다. 여기에 15ml의 탈이온 탈기 증류수를 첨가하여 걸쭉한 반죽(thick paste)으로 만들어, 이것을 탈기된 탈이온수가 일부 채워져 있는 추출셀(extraction cell)로 옮겼다. 추출셀의 남은 공간을 물로 채우고 밀봉한 후 추출 시스템의 오븐 내에 놓아 두었다(도 1 참조). 약 4 bar의 정압에 도달할 때까지 펌프로 물을 투입하였다. 그다음, 오븐을 원하는 온도로 맞추고, 샘플 수집 단계(sample collection phase)의 개시에 앞서 30분 동안 평형되도록 놓아두었다.

30분 동안 일정한 속도로 물이 흐르도록 한 후에, 샘플은 2시간 동안에 걸쳐 샘플을 수집한 후, 그 견본을 뽑아 HPLC로 분석하였다. 그 다음, 용액내의 (-)-에피카테킨의 농도를 계산하였고, 이 값을 이용하여 온도 범위에 따른 추출률을 평가 하였다.

고성능 액체 크로마토그래피법 ( HPLC method )

컬럼(Column) : Waters RP18 (C18 정지상 4.6 x 150mm, 3.5㎛ 입자크기)

그래드 컬럼(Grad column) : Waters RP18 (4.6 x 50mm, 3.5㎛ 입자크기)

오븐 온도 :30℃

이성분계 이동상 : 성분 A. 2% 아세트산 함유 물

성분 B. 0.1% 아세트산 함유 메탄올

구배 용리 프로파일( Gradient elution profile )

구배 종류	% A	% B	경과 시간 ( min )
시작	85	15	0
선형	55	45	25
선형	15	85	26
유지	15	85	35
선형	85	15	37
유지	85	15	40
실행 시간 후	85	15	5

실시예 1 : 에피카테킨 추출에 대한 용매 추출 온도의 영향

표 2 에 나타난 바와 같이 6개의 다른 온도에서 추출분석을 수행하였다.

추출 조건

테스트 식별부호	온도 (℃)	물의 유속 ( ml / min )
A	20(상온)	100 ml 정지 부피
B	50	1.0
C	75	1.0
D	100	1.0
E	125	1.0
F	150	1.0

(A) 20℃ 에서의 추출

10.001g 의 사과 분말을 100ml 물이 담긴 비이커에 넣고 잘 섞은 후 밀봉필름으로 덮은 다음, 2시간 동안 방치하였다. 추출된 용액 1ml를 0.45㎛ 시린지 필터에 통과시켜 에피카테킨 내부표준용액(internal standard solution) (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 크로마토그래피 분석 결과를 도 2에 나타냈다. 분석 결과 상기 용액은, 사과 분말 kg당 에피카테킨 825.28mg의 농도에 도달하였다.

(B) 50℃ 에서의 추출

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라, 6.137g의 사과 분말이 추출되었다. 추출된 용액 각각 1ml를 0.45㎛ 시린지 필터에 통과시켜 에피카테킨 내부표준용액(internal standard solution) (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과는 표 3에 나타냈다.

50℃ 추출의 결과

추출부피 (ml)	추출부피 중의 (-)-에피카테킨 (mg)	추출된 총 (-)-에피카테킨 (mg)	에피카테킨 누적 백분율 (%)
10	0.247	0.247	2.0
15	0.062	0.308	2.5
25	0.577	0.885	7.2
35	4.597	5.482	44.5
45	1.498	6.980	56.6
55	2.554	9.534	77.4
65	1.607	11.141	90.4
75	0.689	11.830	96.0
85	0.287	12.117	98.3
95	0.147	12.264	99.5
105	0.058	12.322	100.0
110	0.000	12.322	100.0

50℃ 추출의 누적 결과는 도 3 에 나타냈고, 크로마토그래피의 결과는 도 4 에 나타냈다.

분석 결과, 사과 분말 그램당 2.01mg의 에피카테킨 (2007.85 mg/kg과 같음)을 얻었다:

샘플(g) mg /g mg / kg

50℃ 6.137 2.01 2007.85

(C) 75℃ 에서의 추출

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라, 6.595g의 사과 분말이 추출되었다. 추출된 용액 각각 1ml를 0.45μm 시린지 필터에 통과시켜, 에피카테킨 내부표준용액 (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과를 표 4 에 나타냈다.

75℃ 추출의 결과

추출 부피 ( ml )	추출부피 중의 (-)- 에피카테킨 (mg)	추출된 총 (-)- 에피카테킨 (mg)	에피카테킨 누적 백분율 (%)
10	3.097	3.097	16.8
20	4.926	8.023	43.6
30	2.981	11.004	59.8
40	2.045	13.049	70.9
51	1.553	14.602	79.4
60	1.025	15.627	84.9
70	0.841	16.468	89.5
80	0.683	17.151	93.2
93	0.663	17.814	96.8
100	0.233	18.047	98.1
110	0.222	18.270	99.3
120	0.131	18.400	100.0

75℃ 추출의 누적 결과는 도 5에 나타냈고, 크로마토그래피 분석 결과는 도 6에 나타냈다.

분석 결과, 사과 분말 그램당 2.79mg의 에피카테킨 (2790.02 mg/kg과 같음)이 얻어졌다:

샘플 (g) mg /g mg / kg

75℃ 6.595 2.79 2790.02

(D) 100℃ 에서의 추출

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라, 6.0962g의 사과 분말이 추출되었다. 추출된 용액 각각 1ml를 0.45㎛ 주입기 필터에 통과시켜 에피카테킨 내부표준용액 (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과를 표 5 에 나타냈다.

100℃ 추출의 결과

추출 부피 ( ml )	추출부피 중의 (-)- 에피카테킨 ( mg )	추출된 총 (-)- 에피카테킨 ( mg )	에피카테킨 누적 백분율 (%)
11	1.126	1.126	6.9
21	4.089	5.215	31.9
31	3.819	9.034	55.3
41	2.806	11.840	72.5
52	1.884	13.724	84.0
61	1.087	14.811	90.6
71	0.670	15.481	94.7
81	0.429	15.910	97.4
91	0.214	16.123	98.7
102	0.162	16.285	99.7
111	0.057	16.342	100.0
121	0.000	16.342	100.0
161	0.000	16.342	100.0

100℃ 추출의 누적 결과는 도 7에 나타냈고, 크로마토그래피 분석 결과는 도 8에 나타냈다.

분석 결과, 사과 분말 그램당 2.68mg의 에피카테킨 (2680.71 mg/kg과 같음)이 얻어졌다:

샘플 무게 (g) mg /g mg / kg

100℃ 6.0962 2.68 2680.71

(E) 125℃ 에서의 추출

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라, 6.2038g의 사과 분말이 추출되었다. 추출된 용액 각각 1ml를 0.45μm 시린지 필터에 통과시켜, 에피카테킨 내부표준용액 (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과는 표 6 에 나타냈다.

125℃ 추출의 결과

추출 부피 ( ml )	추출부피 중의 (-)- 에피카테킨 ( mg )	추출된 총 (-)- 에피카테킨 ( mg )	에피카테킨 누적 백분율 (%)
15	4.003	4.003	31.2
25	4.505	8.508	66.2
35	1.910	10.418	81.1
45	1.130	11.549	89.9
55	0.513	12.061	93.9
65	0.305	12.367	96.3
75	0.173	12.540	97.6
85	0.099	12.639	98.4
95	0.087	12.725	99.1
106	0.056	12.781	99.5
115	0.032	12.813	99.8
125	0.030	12.843	100.0
165	0.000	12.843	100.0

크로마토그래피 분석 결과는 도 9에 나타냈다.

분석 결과, 사과 분말 그램당 2.07mg의 에피카테킨 (2070.21 mg/kg과 같음)이 얻어졌다:

샘플 무게 (g) mg /g mg / kg

125℃ 6.2038 2.07 2070.21

(F) 150℃ 에서의 추출

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라, 6.6651g의 사과 분말이 추출되었다. 추출된 용액 각각 1ml를 0.45㎛ 시린지 필터에 통과시켜, 에피카테킨 내부표준용액 (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과는 표 7에 나타냈다.

150℃ 추출의 결과

추출 부피 ( ml )	추출부피 중의 (-)- 에피카테킨 ( mg )	추출된 총 (-)- 에피카테킨 ( mg )	에피카테킨 누적 백분율 (%)
16	1.061	1.061	42.9
29	0.901	1.962	79.4
39	0.245	2.208	89.3
49	0.120	2.327	94.1
59	0.101	2.429	98.2
69	0.044	2.473	100.0
79	0.000	2.473	100.0
93	0.000	2.473	100.0
103	0.000	2.473	100.0
116	0.000	2.473	100.0
126	0.000	2.473	100.0
136	0.000	2.473	100.0

150℃ 추출의 누적 결과는 도 10에 나타냈고, 크로마토그래피의 결과는 도 11에 나타냈다.

분석 결과, 사과 분말 그램당 0.37mg의 에피카테킨 (371.00 mg/kg과 같음)이 얻어졌다:

샘플(g) mg /g mg / kg

150℃ 6.6651 0.37 371.00

(G) 결과 요약

추출(A)~(F) 각각으로부터 얻어진 데이터는 위에 기재되어 있고, 또한 도 12 에 나타냈는데, 이것은 주어진 온도에서의 겉보기 추출 속도의 비교를 보여준다. 도 13은 에피카테킨 추출에 대한 추출 온도 각각에 따른 효율을 보여준다(최고 효율은 83%인 것으로 나타났다). 도 13으로부터, 75℃ 이상에서 추출된 에피카테킨의 총 농도가 감소하는 것을 볼 수 있다. 감소된 효율은 더 높은 온도에서 에피카테킨이 카테킨으로 이성화(isomerisation 또는 에피화(epimerisation))한데서 기인하는 것으로 추정된다.

실시예 2 : 추출물에서 카테킨의 검출

더 높은 온도에서 에피카테킨이 카테킨으로 이성화하는 가능성을 실험하기 위해, 0.688mg/ml의 에피카테킨 시험용액을 만들어 다음과 같이 처리하였다: 950㎕의 에피카테킨을 오토 샘플러 바이알에 넣은 후 질소를 불어 넣은 다음 밀봉하였다. 바이알은 정해진 시간동안, 주어진 온도의 오븐 안에 놓아 두었다. 그다음, 바이알을 냉각시키고, 밀봉을 제거한 후 분석에 앞서 50㎕ 내부표준용액을 첨가하였다. 실험은 15분과 30분 동안 50, 75, 100 및 125℃에서 수행되었다. 실험은, 바이알이 발생될 압력을 견딜 수 없기 때문에, 150℃에서는 수행되지 않았다.

에피카테킨과 카테킨의 농도가 각각의 테스트 용액에 대해 측정되었으며 표 8 에 나타냈다.

(-)- 에피카테킨 이성화 결과

	에피카테킨		카테킨		기타*
	mg/ml	잔류 %	mg/ml	초기 %	기타	초기 %
시작	0.688	100.00	0.000	0.00	0.000	0.00
50℃ 15min	0.643	93.53	0.007	1.07	0.037	5.40
50℃ 30min	0.601	87.40	0.012	1.81	0.074	10.79
75℃ 15min	0.550	79.92	0.065	9.49	0.073	10.59
75℃ 30min	0.441	64.07	0.112	16.28	0.135	19.65
100℃ 15min	0.254	36.97	0.321	46.68	0.113	16.36
100℃ 30min	0.164	23.88	0.344	50.05	0.179	26.07
125℃ 15min	0.156	22.71	0.340	49.36	0.192	27.94
125℃ 30min	0.139	20.27	0.300	43.60	0.249	36.13

*는 100 - (에피카테킨 + 카테킨) 로 부터 계산됨.

100℃ 이상의 온도에서의 (-)-에페카테킨의 빠른 이성화는, 이들 온도가 추가 연구에 대해 부적합한 온도임을 나타냈고, 상승된 온도에서 샘플이 머무는 총 시간은 가능한 한 짧게 유지되어야 한다는 것을 나타냈다.

실시예 3: 메탄올 추출 분석

앞서 기술된 “일반 절차”에 따라 추출된 사과 분말 약 1g에 대해 메탄올을 이용한 삼중추출을 수행하였다. 사과 샘플을 정량하여 60ml짜리 원심분리 튜브에 넣고 메탄올 25ml를 첨가했다. 이 샘플들을 흔들어 55℃로 설정된 오븐에 20분동안 놓아 둔 다음 추출하였고, 샘플들의 접촉을 최대화하기 위해 매 5분마다 반복하여 흔들어 주었다. 한번 추출된 샘플은 오븐에서 제거하였고 30분 동안 식혔다. 각각의 용액의 1ml를 0.45㎛ 시린지 필터에 통과시켜, 에피카테킨 내부표준용액 (Sigma사 제품) 50㎕가 첨가된 2ml 오토 샘플러 바이알(auto sampler vial)에 넣었다. 그 결과는 표 9에 나타냈다.

메탄올 추출의 결과

샘플	mg / ml	부피	부피 중의 mg
Meth 1	0.32	25	8.01
Meth 2	0.35	25	8.73
Meth 3	0.38	25	9.58
		평균	8.77
	샘플 (g)	mg /g	mg / kg
Meth 1	2.0034	4.00	4000.29
Meth 2	2.0443	4.27	4269.64
Meth 3	2.2301	4.30	4295.73
		평균	4188.55

크로마토그래피 분석 결과는 도 14 에 나타냈다.

280 +/- 10nm의 데이터 수집 파장 (data collection wavelength)에서 검출되지 않은 다른 물질의 공용리(co-elution)가 있는지를 판단하기 위해, 도 14 에서 얻어진 (-)-에피카테킨 피크 스펙트럼을 조사하였다. 이 피크를 확대하여 도 15에 나타냈다. 두 스펙트럼이, 정량화를 위해 사용된 (-)-에피카테킨 표준액에 의해 생성된 것과 일치하는 것으로 확인되었다. 이로부터, 주 피크와 숄더(shoulder)가 매우 비슷한 물질들로 구성된 것임을 알 수 있는데, 이는 숄더가 에피카테킨의 (+) 이성질체(isomer)일 수 있다는 증거이다. 스펙트럼에 다른 트레이스(trace)가 없다는 것은 크로마토그램의 이 지점에서 다른 물질이 공용리되지 않았다는 것을 나타낸다.

실시예 4 : 크로마토그래피에 의한 폴리페놀계 화합물의 분리

C18-E SPE 재료와 두 개의 상업적으로 입수 가능한 이온 교환 수지 (Amberlite XAD-16 및 Purolite MNlOO)를 사용하여, 소규모의 테스트가 수행되었다.

10ml의 물에 9.18mg의 에피카테킨을 함유하는 테스트 용액(0.918mg/ml)을, 세 개의 흡착체를 각각 1g 씩 함유하는 컬럼에 투입하였다. 에피카테킨의 존재를 위해 물 후처리(water post treatment)를 평가하였고, XAD 16이 0.261mg/ml 포함한다는 것이 발견되었는데, 이것은 컬럼에 적용된 전체 중에서 71.6%만이 남아있다는 것을 의미한다. MNlOO과 C18은 처리된 물에 에피카테킨이 존재하지 않는 것으로 나타났다. 그 후, 테스트 흡착체 각각을 에탄올로 용리시켰고, 용매를 분석하여 회수된 에피카테킨의 양을 측정하였다.

XAD 16 세척은 5.22mg의 에피카테킨을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 결국, 흡착체에 투입된 총량의 85.3%인 총 7.83mg을 얻게 되었다. 남은 1.35mg (16.5%)은 회수되지 않았다.

MN 100 세척은 4.37mg의 에피카테킨을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 결국, 흡착체에 투입된 총량의 47.6%인 총 4.37mg을 얻게 되었다. 남은 4.81mg (52.4 %) 은 회수되지 않았다.

C 18 세척은 9.03mg 에피카테킨을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 결국, 흡착체에 투입된 총량의 98.4%인 총 9.03mg을 얻게 되었다. 남은 0.15mg (1.6 %)은 회수되지 않았다.

이로부터, Amberlite XAD 16 또는 C18-E가 사용될 수 있다는 것을 알 수 있는데, 다만, XAD 16이 사용된다면, 같은 샘플 로딩 특성(sample loading characteristics)을 얻기 위해서는 훨씬 더 큰 충전 부피(bed volume)를 필요로 할 것이다. 위의 데이터에 근거하여, 제품 회수와 샘플 로딩을 최대화하기 위해서, C18-E가 표 10에서 보여지듯이 수용액으로부터 폴리페놀계 화합물을 분리하는데 가장 좋은 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.

C18 로 행한 크로마토그래피 분리의 결과

C18 시험 데이타	부피 ( ml )	농도 ( mg / ml )	투입총량 ( mg )	회수 %
공급	10.0	0.918	9.18
회수	3.0	3.01	9.03	98.4

C18로 행한 추출의 누적 결과는 도 16에서 볼 수 있다.

실시예 5 : 에탄올 추출 분석

7개 부분의 사과분말 (약 50g)을 50℃ 온도에서 에탄올을 사용하여 4:1 비율로 추출하였다. 그 결과 수집된 에탄올을, 사용 가능한 임의의 고형 재료를 수집하기 위해서 증발시키기 전에, 유리 섬유 필터를 통해 여과하였다. 전체적으로, 에탄올 1,505g을 사용하여 377.3g의 사과분말을, 즉 4:1의 비율로, 추출하였다.

증발 과정동안 고형 재료가 용액으로부터 떨어지는 것을 볼 수 있는데, 이 물질은 용액을 원심 분리하므로써 회수되었다. 수집된 물질, 즉, 14.6g의 백색의 끈끈한 고체는 분석되었고, 폴리페놀계 화합물의 미소량을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 이 물질 안에 갇힌 에탄올 흔적의 결과일 것이다.

에탄올의 잔류물은 60℃ 에서 진공 하에 회수되었고, 끈적한 붉은 반 고형 물질 28.9g이 회수되었다. 이 물질은 예상되었듯이, 분말의 고체는 아니었다. 이 마지막 증류물이, 폴리페놀계 화합물과 함께 에탄올, 물, 지방, 및 단백질의 잔류물을 포함할 가능성이 있다. 폴리페놀계 화합물로부터 이들 원하지 않는 물질을 제거하기 위해, 이 고체는 물에 용해되어 폴리페놀 분획(rich fraction)을 회수하기 위해 C18-E SPE 관을 통과시킬 수 있다.

마지막 증류물이 물에 용해될 때, 용해되지 않는 물질 층이 보였는데, 이를 여과하고 건조하였더니, 이 물질은 폴리페놀계 화합물을 미량 수준 함유하는 고체임이 밝혀졌다. 물 추출물이 C18-E를 거쳐 통과될 때, 물을 분석해본 결과, 에피카테킨을 갖고 있지 않은 것으로 밝혀졌다. C18-E는 에탄올의 충전 부피의 4배로 용리되었다. 에탄올을 증발시킨 결과 1.976g의 붉은 분말을 얻었는데, 이것은 분석결과 18.3%의 에피카테킨을 포함하는 것으로 밝혀졌다.

분말을 얻기 위한 과정 동안 추출물을 여러 차례 조작하였기 때문에, 상기 과정을 반복함에 있어 다른 분획을 수집하지 않았으며, 가능한 한 직접적으로 제품 수집에 이르도록 진행시켰다.

그에 따라 다음의 과정이 실시되었다:

1). 338g의 냉동 건조된 사과 분말을 2.5L 유리병에 넣고 60℃ 에서 15분 동안 1,045g의 에탄올( 3:1의 비율)로 추출되었다.

2). 그 결과 얻은 혼합물을 진공 하에서 열여과하고, 에탄올은 회수하였다. 여전히 얼마의 에탄올을 함유하는 사과 분말을 다시 추출 병에 넣고, 밀봉하였다.

3). 수집된 추출물은 50% 가량 증발되었고, 불용성 물질은 제거되었다.

4). 남은 부피는 하룻밤 보관(overnight storage)동안 처음 수준의 15% 정도까지 더 줄어들었다.

5).회수된 에탄올을 다시 사과 분말에 투입하고, 실온에서 하룻밤동안 3:1의 비율로 재추출하였다.

6). 하룻밤동안 스며들도록 한후, 단계 2에서 단계 4가 반복되었다.

7). 두 개의 농축된 에탄올 추출물을 섞고 증발시켜서, 끈끈하고 붉은 반고체를 생성시켰다.

8). 폴리페놀계 화합물을 용해하기 위해, 400ml의 따뜻하고 (50℃) 탈기된 물을 상기 끈적한 고체에 첨가하였다.

9). 수용액을 냉각하고 여과하여 비용해성 물질(지방류)을 제거하였다.

10). 4개의 C18-E, 2Og 기가 튜브(giga tubes)를, 사용에 앞서 제조자의 지시에 따라 준비하였다. C 18 베드(bed)를 먼저 에탄올로 적신 후, 베드 부피의 4 배인 240ml 의 물로 교환시키므로써 사용가능 상태로 만들었다.

11). 상기 수용액을 C18 튜브로 처리하여, 용액으로부터 폴리페놀 고함유 분획을 제거한 다음, 상기 베드를 물로 세척하여, 비결합물질(non bound material)을 제거하였다.

12). 흡착제 베드는 240ml 에탄올로 용리되고, 수집되었다.

13). 에탄올은 증발되어 건조되었고 고체 “분말”이 수집되었다.

14). 2 내지 5mg 사이의 샘플을 분석하여 그것의 에피카테킨 함량을 구했다.

최초 338g의 사과 분말을 처리하여, 에피카테킨 함량이 12.1%인 붉은 분말 총 6.757g이 얻어졌다. 회수된 고체는 최초 사과 분말 질량의 2%에 해당된다. 건조 사과 분말에 상당하는 mg/kg으로 환산하면, 회수된 고체의 양은 2,427.1mg/kg이 된다.

1g의 사과분말과 10ml 메탄올을 사용한 비교 추출에서는 4,663mg/kg의 값을 얻었다. 상기 낮은 회수값이 에탄올에 대한 에피카테킨의 낮은 용해성에서 기인하는지를 테스트하기 위해, 10,20 및 30:1 w/w 을 사용하여 일련의 테스트가 수행되었다. 이 결과는 표 11 에서 볼 수 있다.

메탄올과 에탄올 추출의 비교

샘플	mg / ml	mls	총 mg	샘플	mg /g	mg / kg
메탄올	0.52	10	5.20	1.115	4.66	4663.7
에탄올 10ml	0.345	10	3.45	1.206	2.86	2862.4
에탄올 20ml	0.244	20	4.87	1.029	4.74	4736.3
에탄올 30ml	0.210	30	6.31	1.241	5.09	5085.5

표 11의 데이터는 에피카테킨이 메탄올보다 에탄올에서 낮은 용해도를 가짐을 암시하지만, 용해도의 비에 필적하도록 추출비를 증가시키므로써 높은 수율이 얻어질 수 있다.

실시예 6: 에피카테킨 추출물을 이용한 심혈관 연구

혈관의 상태 및 심혈관의 기능을 향상하기 위한 수단으로서의, 본 발명의 방법으로부터 얻어지는 에피카테킨 추출물의 효과를 테스트하기 위해, 10명의 건강한 지원자들이 모집되었다. 5명의 지원자에게는 위약 과일 음료(placebo fruit drink)가 주어졌고, 5명의 지원자에게는 동일한 테스트 음료이긴 하지만, 체중 kg 당 1 mg((-)-에피카테킨 단위를 기준으로)이 첨가된 테스트 음료가 제공되었다. 혈관의 상태는, 무혈 디지털 광혈류측정기(non-invasive digital photoplethysmography)에 의해 얻어진 굴절율(reflective index)과, 디지털 볼륨 펄스(digital volume pulse)에 대한 연속적이고, 연구자-비의존적이며, 자동적인 분석을 위한 알고리즘에 의해 연속적으로 정량화되었다. 이 데이터는 상대적인 경화도 (Stiffness Index SI) (m/s)로 제공되었고, 혈관의 나이와 상호 관련지어졌다. 맥파(pulse wave)는 핑거 펄프(finger pulp)를 통한 적색광과 적외선광의 투과에 의해 측정되었다. 1차 도함수의 극소점이 측정되었고, 그에 상응하는 맥파의 전환점(=변곡점)도 계산되었다. 굴절율은 전환점(=변곡점) 후의 세 번째 내지 일곱 번째 데이터의 평균으로부터 계산되었다.

도 17 과 18 은 2.5시간 동안의 시험 결과를 보여준다. 이들 도면은, 본 발명의 추출물을 포함하는 테스트 음료를 마신 실시군 (n = 10)의 동맥 경화도 (arterial stiffness index) (SI; 도 17)와 혈관의 나이(Vascular Age)(도 18)가, 대조군에 비교했을 때 통계적으로 개선된 (즉, 줄어든) 것을 보여준다.

본 발명은, 사과와 같은 과일류로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물 (polyphenols)을 추출하는 데 사용될 수 있으며, 또한, 그 추출물은 심혈관 질환, 대장암 및 소화 건강의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

Claims (17)

1. (a) 과일의 코팅을 제거하는 단계;

   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 과일을 냉동-건조 또는 냉동하는 단계;

   (c) 선택적으로, 상기 (b)단계에서 얻어진 냉동-건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계;

   (d) 상기 (b)단계 또는 (c)단계에서 얻어진 재료에 1회 이상의 용매 추출 싸이클을 가하는 단계;

   그 후에 선택적으로,

   (e) 상기 (d)단계에서 얻어진 액상 추출물로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 분리하는 단계를 포함하는,

   과일로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 추출하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 과일이 사과인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 과일이 “붉은 과육 사과 (red-cut through apple)" 인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리페놀계 화합물이 에피카테킨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)단계가 에탄올, 메탄올 또는 아세톤과 같은 적합한 용매를 사용하는 세척 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c)단계가 액체 질소의 존재하에 종래의 푸드 프로세서(food processor)에서 분말화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (d)단계의 추출 용매가 물인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 물이 탈기된 물인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 물이 65℃ 내지 80 ℃ (또는, 70 ℃ 내지 75℃, 또는, 73℃ 내지 75℃)의 온도로 가열되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물이 1 bar 이상의 압력 (또는, 2 내지 5bar, 또는, 4bar)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
11. (a) 사과의 천연 왁스 코팅을 제거하는 단계;

    (b) 상기의 (a)단계에서 얻어진 사과를 냉동-건조 또는 냉동하는 단계;

    (c) 상기의 (b)단계에서 얻어진 냉동-건조 또는 냉동된 재료를 분말화하는 단계;

    (d) 상기의 (c)단계에서 얻어진 재료에 1회 이상의 용매 추출 싸이클을 가하는 단계로서, 상기 용매가 물인 단계;

    (e) 상기의 (d)단계로부터 상기 물을 증발시키는 단계;

    (f) 에탄올에 의한 용리에 의한 크로마토그래피 분리법으로, 상기 (e)단계로부터 제조된 미정제 추출물로부터 폴리페놀계 화합물 분리물을 분리하는 단계; 및

    (g) 에탄올을 증발시켜 상기 폴리페놀계 화합물을 분리물을 산출하는 단계;

    를 포함하는, 사과로부터 하나 이상의 폴리페놀계 화합물을 분리하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 얻어진 폴리페놀 함유 추출물.
13. 제 12 항에 따른 폴리페놀 함유 추출물을 포함하는 식품 색소(food colourant).
14. 심혈관 질환 또는 대장암의 예방이나 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 폴리페놀 추출물.
15. 심혈관 질환 또는 대장암의 예방이나 치료에 사용되는 의약품의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 폴리페놀 추출물의 사용.
16. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 폴리페놀 추출물의 투여를 포함하는, 심혈관 질환 또는 대장암의 치료 또는 예방법.
17. 심혈관 질환 또는 대장암의 치료나 예방에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 폴리페놀 추출물을 포함하는 약학 조성물.

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