KR20090018298A

KR20090018298A - 담체로 작용하는 흡착성 수지의 제공에 의한 트리사이클로화합물의 생산 및 추출 방법

Info

Publication number: KR20090018298A
Application number: KR1020070082642A
Authority: KR
Inventors: 김재종; 임시규; 이미옥; 임상면; 이보미; 김동환; 유정현; 이금순
Original assignee: (주) 제노텍
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2009-02-20
Also published as: KR100891313B1; JP2011505791A; EP2185714A4; EP2185714A1; JP5532337B2; WO2009025439A1; US20110183385A1

Abstract

본 발명은 트리사이클로 화합물(tricyclic compounds), 특히 FK506 및/또는 FK520의 발효 및 정제 방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 FK506 및/또는 FK520 생산 균주의 배양 단계에 소수성 흡착 수지를 담체로 제공하여 FK506 및/또는 FK520의 생산 수율을 향상시키고 첨가한 수지를 회수하여 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래의 방법과 비교하여 생산수율의 증진 효과가 있을 뿐만 아니라 단순한 정제과정이 특징이다.

트리사이클로 화합물(tricyclic compounds), FK506, FK520, 발효, 정제 방법

Description

담체로 작용하는 흡착성 수지의 제공에 의한 트리사이클로 화합물의 생산 및 추출 방법{Method of extraction and yield-up of tricyclo compounds by adding a solid adsorbent resin as their carrier in fermentation medium}

본 발명은 트리사이클로 화합물(tricyclo compounds), 특히 FK506 및/또는 FK520의 발효 및 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 미국특허 등록번호 4,894,366에 기술된 트리사이클로 화합물(tricyclo compounds) 특히, FK506(Tacrolimus) 및 FK520(ascomycin)의 생산 증대 및 정제방법에 관한 것이다.

트리사이클로 화합물(Tricyclo compounds)은 주로 미생물, 특히 방선균 속이 생산하는 항진균 활성 및 면역억제 활성을 보이는 미생물 이차 대사 산물인 생리활성 물질이다. 트리사이클로 화합물은 화학식 1과 같은 일반적인 구조를 가질 수 있다.

(단, 상기 화학식 1에서 R1은 하이드록시기 또는 보호된 하이드록시기

R2는 수소, 하이드록시기 또는 보호된 하이드록시기

R3는 메틸, 에틸, 프로필 또는 알릴기

n= 1 또는 2

실선 및 점선으로 이중 표시된 부위는 단일결합 혹은 이중결합을 나타냄)

중요한 트리사이클로 화합물로서 FK506, FK520이며 그와 유사한 구조로 라파마이신(rapamycin) 등이 알려져 있다. 특히, FK506은 1987년에 Kino 등이 사이클로스포린 A(cyclosporin A)보다 더욱 뛰어난 면역억제활성능력을 보이는 물질로 보고 되었다(Hantanaka, H., M. Iwai, T. Kino. T. Goto and M. Okuhara. 1988. J. Antibiot. 41: 1586-1591. Kino, T., H. Hantanaka, M. Hashimoto, M. Nishiyama, T. Goto, M. Okuhara, M. Kohsaka, H. Aoki and H. Iminaka. 1987. J. Antibiot. 40: 1249-1255). FK506은 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) 9993, 스트렙토마이세스속 ATCC55098, 스트렙토마이세스속 ATCC53770, 스트렙토마이세스 카나이마이세티쿠스(Streptomyces kanaymyceticus) KCC S-043 등의 균주에서 생산되는 것으로 보고되었으며(Muramatsu, H., S. I. Mokhtar, M. Katsuoka and M. Ezaki. 2005. Actinomyetelolgoica. 19:33-39, 미국 특허 제4,894,366호), FK506과 구조적으로 유사체인 FK520 또한 면역억제활성과 항진균활성(antifungal activities)을 가지며, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아속 아스코마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus) ATCC14891, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아속 야쿠시마엔시스(Streptomyces hygroscopicus subsp. yakusimaensis) 7238과 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) 993 등이 생산하는 것으로 보고되었다.

최근에는 이들 두 물질의 생합성 유전자가 스트렙토마이세스속 ATCC53770 와 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아속 아스코마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus) ATCC14891 생산균주로 부터 클로닝되었으며(Motamedi,H., and A. Shafiee. 1998. Eur. J. Biochem 256:528-534, Wu, K. L. Chung, W.P. Revill, L. Katz, C. D. Reeves, 2000. Gene 251:81-90), 배열과 구성 이 비슷함을 보고하였다. FK506은 Prograf^TM 로 판매되고 있으며, FK506과 유사한 트리사이클로 화합물인 라파마이신, FK520 그리고 이들의 유도체가 FK506 결합 단백질(FK506 binding proteins; FKBPs)에 결합하는 활성(Hamilton, G. S. and J. P. Steiner 1998. J. Med. Chem. 41:51119-5143. Gold, B. G.. 1999. Drug Metab. Rev. 31:649-663. Scheriver, S. L. and G. R. Carbtree. 1995. Harvey Lect. 91:99-114)에 기반하여 장기이식 거부증에 대한 개선, 알러지, 신경세포손상/기능장애를 예방하거나 치료하기 위한 신경 친화성 약제로 개발되고 있다(미국 특허공개 2005239813, 미국특허공개 2005070468, 미국특허공개 2001050419, 미국특허공개 2002086015). 스트렙토마이세스 클라버리제러스(Streptomyces clavurigerus) KCTC 10561BP 균주를 이용하여 FK506의 생산력에 미치는 배지 혹은 배양방법을 개선한 방법(대한민국 특허 제485877호), 스트렙토마이세스속 MA6858 균주에서 FK506의 생산에 미치는 영양인자를 조사한바 있다(Yoon, Y. J. and C. Y. Choi. 1997. J. Fermen. Bioengin. 83:599-603). 일반적인 트리사이클로 화합물의 정제는 배양액(cultured broth)으로부터 규조토와 드럼 필터(drum filter)를 사용하여 균사체(mycelial cake)를 회수하여, 그로부터 대상 물질을 메탄올 등의 유기용매로 회수하며, 회수된 액과 여과된 배양액을 혼합하여 합성수지가 충진된 컬럼에 적용하여 정제(미국 특허: 4,894366, 대한민국 특허 제485877호, 일본특허공개 제1999-0014호)하므로 그 처리 과정이 매우 복잡하다.

FK506은 자가 면역질환, 장기이식, 신생아 적아구증 등의 의학용 치료제로 유용하게 사용된다. 이러한 치료제의 개발에는 고순도의 제품 생산이 필요하다. 고순도의 제품을 위해 생산력의 증대된 균주, 발효공정과 효율적인 정제공정 확립이 필요하다. 본 발명에서는 FK506, FK520을 비롯한 트리사이클로 화합물 생산량 증대와 정제공정을 단순화할 수 있는 발효방법 및 정제공정을 확립하려는 것이다.

본 발명은 방선균의 발효 배지에 소수성인 트리사이클로 화합물을 흡착할 수 있는 소수성 흡착 합성수지를 담체로 첨가하여 발효를 수행함으로써 가역 반응을 방지함으로써 트리사이클로 화합물 특히, FK506 및 FK520 (화학식 2)의 생산량을 증가시키는 발효 방법을 제공하는 것이며, 또한 트리사이클로 화합물을 발효 배지에 첨가된 수지로부터 추출하여 손쉽게 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 소수성 트리사이클로 화합물의 생산 및 정제과정에 소수성 흡착 합성수지를 가함으로써 생산 수율을 현저히 높였고, 정제 과정을 단순화시키는 효과를 거둘 수 있다.

본 발명자들은 방선균의 발효 배지에 트리사이클로 화합물의 담체로 제공될 수 있는 소수성 흡착 합성수지를 첨가, 발효를 수행하여 가역 반응을 방지함으로써 트리사이클로 화합물 특히, FK506 및 FK520 (화학식 2)의 생산량 증가를 가져오는 발효 방법을 제공하는 것이며, 또한 트리사이클로 화합물을 발효 배지에 첨가된 수지로부터 추출하여 정제 공정에 적용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 화학식에서 R=C₃H₅인 경우FK506이고_,R=C₂H₅인 경우 FK520이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 실시예에 사용된 균주는 FK506 및 FK520을 동시에 생산하는 균주인 스트렙토마이세스속 GT1005이다. 그러나 본 발명은 상기 균주에 국한되는 것은 아니며, 트리사이클로 화합물, 특히 FK506 생산 균주 및/또는 FK520의 생산 균주에 적용 가능하다.

트리사이클로 화합물은 소수성이므로 이 화합물의 담체(carrier)가 될 수 있는 소수성 흡착 합성수지를 발효 배지에 첨가함으로 소수성인 균사체에 트리사이클로 화합물이 흡착하여 이로 인한 생산저해 현상을 극복하여 생산 증대를 이룰 수 있다.

담체로 사용되는 소수성 흡착 수지는 스티렌/다이비닐벤젠 중합체(styrene/divinylvenzene copolymers) 또는 지방족 에스터(aliphatic ester)를 주요 성분으로 하는 합성수지가 사용될 수 있으며, Diaion HP-20, Amerlite XAD-2 Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-7, Amberlite XAD-7HP, Amberlite XAD-8, Amberlite XAD-16, Amberlite XAD-16 HP, Amberlite XAD-1180, Amberlite XAD-2000, Amberlite XAD-2010(비극성 다방향성 수지) 등으로 구성된 그룹 중 1종을 선택하는 것이 바람직하다.

첨가되는 합성수지의 양은 1-15%(V/V)까지 다양하게 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 3-5%(V/V)이며, 5%(V/V)의 첨가가 가장 바람직하다. 합성수지를 배양배지에 직접 첨가하여 발효를 수행할 경우 3배 이상의 생산수율의 증대를 기대할 수 있다.

배양 배지에 합성수지를 첨가하는 시기는 배양 시작일부터 배양종료일까지 첨가가 가능하며, 바람직하게는 배양 시작 후 3일 내(0-72시간)에 첨가하는 것이다. 이는 트리사이클로 화합물의 생산특성과 밀접한 관계가 있다. 즉 수지 무첨가 시험구에서 FK506은 배양 2일째부터 생산이 증가되어 5-6일째에 최고생산량을 보인 다. 그러므로 생산량의 증대를 위해서는 합성수지를 배양 초기부터 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

트리사이클로 화합물, 특히 FK506 및 FK520은 합성수지가 첨가된 이후 4-7일간 배양된 발효액으로부터 회수한다. 생산된 대부분의 트리사이클로 화합물은 담체로 공여된 소수성 흡착성 합성수지에 흡착되어 있으므로(90-98%) 균체 및 배양액으로부터 합성수지를 분리한 후 합성수지로부터 화합물을 회수하는 것이 더욱 바람직하다.

합성수지는 원심분리법 혹은 여과법으로 회수한다. 더욱 바람직하게는 합성수지 크기(평균 250㎛)보다 작은 체눈 크기(평균 250㎛)를 가진 섬유조직, 혹은 금속으로 구성된 망사를 사용하는 것이며, 더욱 바람직하게는 금속망사(체눈 크기, 60-250㎛)를 사용한다.

합성수지로부터 트리사이클로 화합물을 용출하기 위한 용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토나이트릴, 부탄올, 아이소프로판올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산 중 1종을 선택한다. 바람직하게는 물과 혼합 가능한 용매인 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토나이트릴이며, 가장 바람직하게는 아세톤, 및 아세톤수용액(40-100%) 이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분 야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명확하다 하겠다.

실시예 1. 트리사이클로 화합물 생산을 위한 발효

트리사이클로 화합물 생산을 위하여 스트렙토마이세스속 GT1005 균주의 균사체 저장액을 종배양배지(1% 수용성 전분, 1% 글리세롤, 2% 콩가루, 0.2% CaCO₃, 0.05% GE-304)에 접종하여 27-30℃에서 24시간 배양 후 본 배양 배지{7% 수용성 전분, 0.5% 콩가루, 1.7% 효모 추출물, 0.1% (NH₄)₂SO₄, 0.5% 콘스팁리쿼(corn steep liquor), 0.1% CaCO₃, 0.05% GE-304}에 1-5% 접종하여 27-30℃에서 6일 동안 배양하였다. 삼각플라스크 배양은 종배양과 본배양 모두 30㎖ 배지가 든 500㎖ 플라스크를 사용하였으며, 230rpm으로 진탕 배양하였다. 5ℓ 배양은 본배양 배지를 3ℓ를 사용하여 1.5vvm의 통기와 600rpm-900rpm으로 하였으며, 담체로 첨가된 소수성 흡착성 고형수지는 diaion HP-20, Amberlite XAD4, Amberlite XAD7H, Amberlite XAD16 중 선택하여 첨가하였으며, 실시예에 따라 첨가시기와 양을 달리하였다.

실시예 2. 트리사이클로 화합물의 확인 및 정량

트리사이클로 화합물 중 FK506 과 FK520을 확인하고 정량하였다. FK506과 FK520은 표준물질로 A.G. Sientific 사에서 구입하여 사용하였다. 표준물질과 발효 산물에 존재하는 FK506과 FK520은 LC-ESI-MS/MS로 분자량을 확인하였으며(FK506,M/Z 822; FK520 M/Z 810), 필요한 경우 시료와 표준물질의 동시주입에 의 해 동일한 머무름 시간(FK506, 34분: FK520 33분)을 확인하여 검증하였다(도 1, 2). 정량을 위한 HPLC 조건은 표 1과 같으며, 최종 시료는 50% 아세톤 수용액에 녹인 시료를 사용하였으며 정량 표준곡선의 유효량(0.1-1mg)을 벗어나지 않는 범위 내의 양으로 실시하였다.

조건 항목	조건 내용
칼럼	Hypersil GOLD C18 analytical column(Thermo)
칼럼온도	55℃
흡수파장	210㎚
이동상	50% 아세토나이트릴(Acetonitrile)
유속	1㎖/min
시료주입량	20㎕

실시예 3. 담체로 공여된 고체 수지별 생산량 증가 효과

생산된 트리사이클로 화합물(FK506, FK520)은 대부분 균사체에 존재한다(도 1). 이는 트리사이클로 화합물의 화학적 물성이 소수성인 것과 관계가 있을 것으로 추정된다. 생합성된 소수성 트리사이클로 화합물은 소수성을 나타내는 방선균의 균사체에 흡착되어 축적될 것이다. 축적된 과량의 트리사이클로 화합물은 궁극적으로 세포의 성장 감소 혹은 피드백 억제(feedback inhibition)를 통해 트리사이클로 화합물의 생산을 중단 혹은 감소시킬 것으로 판단되었다. 만일, 균사체와 성질이 유사한 소수성 고체 물질을 발효 배지에 첨가한다면, 균사체를 대신하여 트리사이클로 화합물의 담체가 될 수 있을 것이다. 즉, 본 발명자들은 소수성 고체 합성수지를 발효 배지에 첨가하여 발효를 수행할 경우, 생산되는 트리사이클로 화합물이 균사체를 대신하여 소수성 고체 합성수지에 흡착될 것으로 예측하였다.

발효 배지에 첨가하는 흡착수지로는 HP-20(이륭화학), Amberlite XAD-4(Rohm & Hass), Amberlite XAD-7H(Rohm & Hass), Amberlite XAD-16(Rohm & Hass)을 사용하여 본 배양 배지 내에 5%(v/v) 비율로 첨가하여 30㎖ 배지에 500㎖ 삼각플라스크를 사용하여 상기 실시예 1의 방법으로 6일 동안 배양한 후 트리사이클로 화합물 특히, FK506 과 FK520의 함량을 실시예 2의 방법으로 조사하였다.

표 2는 담체로 공여된 수지 종류에 따른 화합물의 생산량을 나타낸 것이다.

시험구	FK506 생산량 (㎎/ℓ)(%)	FK520 생산량 (㎎/ℓ) (%)
무첨가 대조구	101.5 (100)	1.7 (100)
HP-20	292 (287)	6.6 (388)
XAD-4	262.75 (258)	6.5 (382)
XAD-7H	299.25 (294)	5.7 (335)
XAD-16	281.75 (278)	5.2 (305)

그 결과, 표 2와 도 3에서 확인할 수 있듯이 배양액에 수지가 첨가되었을 경우 대조구의 트리사이클로 화합물인 FK506 및 FK520의 생산량에 비해 수지가 첨가된 처리구에서 생산량이 2.5배 이상 증가함을 볼 수 있었다. FK506과 FK520 모두 비슷한 비율로 생산량이 증가하는 것은 FK506과 FK520의 물성 특성과 구조적 특성 그리고 추정되는 생합성 과정의 조절이 유사하여 두 물질이 유사한 비율로 증가하는 것으로 판단된다.

실시예 4. 발효 배양시기별 고체 합성수지의 첨가에 따른 생산량 증대 효과

고체 합성수지의 첨가에 적절한 시간을 결정하기 위해 발효배지에 발효 시작에서 종료 1일 전까지 5일 동안 1일 간격으로, 실시예 3에서 선택된 HP-20수지를 5%(v/v) 비율로 배양 배지에 첨가하고 발효한 후 실시예 1과 같이 6일간 배양하고 실시예 2와 같이 트리사이클로 화합물(FK506, FK520)의 함량을 조사하였다.

표 3은 수지의 첨가일자에 따른 화합물의 생산량을 나타낸다.

수지(HP-20) 첨가일 (일)	FK506 생산량 (㎎/ℓ)	FK520 생산량 (㎎/ℓ)
무첨가 대조구	102	2.3
0일째	356	7
1일째	356.5	8.7
2일째	337	8
3일째	186.5	5.5
4일째	117	3.3
5일째	81	1.6

그 결과, 표 3과 도 4에서 알 수 있듯이, 배양 초기부터 첨가한 시험구에서 가장 높은 생산증가를 보였다. 즉, 발효 당일에서 2일(48시간) 사이에 첨가한 시험구에서 3배 정도의 증가가 이루어지며, 3일 이후에는 증가폭이 감소하기 시작하여 발효 만료 1일전 즉, 배양 후 5일에 첨가한 시험구에서는 생산량의 증가가 거의 없다. 이는 합성수지 무첨가 시험구에서의 FK506의 생산곡선에 역 비례하는 것이다(도 5). 즉, 생산이 시작되는 초기 단계인 3일 이전에 수지를 첨가하여야 생산량의 증대 효과가 있으며, 생산이 완료된 시점의 첨가는 증대의 효과가 없었다. 그러므로 발효 초기에 합성수지의 첨가가 무엇보다도 중요하였다. 후기의 실시예 5, 6의 수지 첨가 실험구는 발효와 동시에 합성수지를 첨가하기 위해, 수지가 첨가된 발효배지를 조제, 살균하여 종균을 접종한 후 발효를 개시하였다.

실시예 5. 담체로 공여된 고체 수지량에 따른 화합물 생산량 증가 효과

실시예 3에서 사용한 합성수지 중 1종인 HP20 수지를 선택하여, 실시예 4에서 확인한 바에 따라 발효 배지에 3%, 5%, 7%, 10%(v/v)비율로 첨가한 다음 상기 실시예 1의 방법으로 6일 배양하였고, 상기 실시예 2의 방법으로 트리사이클로 화합물을 추출하고 HPLC로 함량을 분석하였다.

표 4는 수지의 첨가량에 따른 생산량을 나타낸다.

수지(HP-20) 첨가비율(%)	FK506 생산량 (㎎/ℓ)	FK520 생산량 (㎎/ℓ)
0	98	1.05
3	377	7
5	365.25	6.1
7	373.5	4
10	207.5	4.8

그 결과, 표 4와 도 6에서 확인할 수 있듯이 HP20 농도 3%, 5% 첨가된 처리구에서 FK506 및 FK520의 생산량이 가장 높고 합성수지 첨가 비율이 높을수록 생산량이 소량 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 과량의 수지의 첨가는 균의 생육에 유해한 영향을 주기 때문으로 판단되었다.

실시예 6. 트리사이클로 화합물의 합성수지에 의한 생산량 증대의 원인

합성수지에 의한 화합물 생산량 증대의 이유를 구체적으로 해명하기 위해, 균사체의 통과는 어렵고 배지는 통과가 쉬운 포집망(Miracloth, Calbiochemt)으로 합성수지를 분리하여 발효 배지에 포함시켜 실시예 1과 같이 발효를 수행하였다. 그 결과 합성수지를 분리하여 첨가한 시험구에서는 수지에 의한 생산량 증대 효과가 없었다(표 5).

시험구	FK506 생산량 (㎎/ℓ)(%)
무첨가 대조구	113.0 (100)
수지(HP-20) 첨가구	313.8 (278)
수지(HP-20) 분리 첨가구	112.6 (100)

이러한 결과는 트리사이클로 화합물의 합성수지로의 흡착에 중요한 요소는 균체와 합성수지의 접촉이 중요한 요소임을 의미하며, 합성수지에 의한 생산량의 증가의 기작은 균사체에 흡착된 트리사이클로 화합물이 소수성 합성수지로 이양됨으로 균사체에 흡착되어 있는 트리사이클로 화합물이 감소하고 이로 인해 트리사이클로 화합물의 균체에 대한 독성 감소 혹은 피드백 저해가 해소되어 생산의 증가를 가져 오는 것으로 판단할 수 있다.

합성수지에 의한 트리사이클로 화합물의 생산량 증대의 원인을 더욱 면밀히 추정하기 위해 배양액에 존재하는 FK506 및 FK52O의 분포를 확인하였다. 배양에 첨가한 HP20 수지, 균체, 배양여액을 각각 분리하여 트리사이클로 화합물의 함량을 조사하였다. 그 결과 대부분의 화합물(95-99%)이 HP-20 수지에 흡착하여 존재하였으며, 균체와 배양액에는 매우 소량(1-5%) 존재하였다(표 6).

분 획	FK506 생산량 (㎎/ℓ)	FK520 생산량 (㎎/ℓ)	% (FK506+FK520)
상등액	0	0	0
균체	7.2	0	1.4
HP-20	494.5	11.8	98.6

또한, 과량(1㎎/㎖)의 FK506에 대해서 시험한 방선균주는 내성을 나타내었으며, 생육의 저해가 일어나지 않았다(도 7). 이는 트리사이클로 화합물이 항진균활성을 가지며, 항세균활성을 가지지는 않는다는 보고와 일치하는 것이다. 합성수지가 FK506 및 FK520의 합성수지에 의한 증가는 자체 독성의 제거에 의한 과량 생산이 이루어지는 것이 아님을 보여주는 것이었다. 과량의 트리사이클로 화합물의 존재에서도 균의 생육에 영향을 미치지 않는 점, 또 수지의 첨가에 의해 생육속도 혹은 세포의 중량이 증가하지 않는 점으로 미루어 보아 트리사이클로 화합물 혹은 다른 이차 산물의 독성감소를 통한 균의 생육 증가에 의해 생산력이 증대되는 것이 아닌 것으로 추정된다. 그러므로 트리사이클로 화합물 혹은 다른 이차 대사 산물에 의한 트리사이클로 화합물의 생산 조절에 관여하는 피드백 저해(feedback inhibition)를 해소함으로 생산력의 향상을 가져 오는 것으로 판단된다. 결과적으로 합성수지를 첨가하여 발효 배양하는 것을 특징으로 하는 본 발명은 균사체에 흡착하는 트리사이클로 화합물, 특히 FK506 및 FK520을 첨가된 합성수지로 이양함으로써 피드백 저해를 제거하여 생산량의 증대를 이루게 되는 것이다. 이러한 본 발명은 균사체에 흡착할 수 있는 트리사이클로 화합물의 양이 제한되어 고생산 균주 개발의 저해요인으로 작용할 수 있는 점을 개선 시켜 고생산 균주로 개량하는 한 방법으로 응용될 수 있다.

실시예 7. 고체 수지의 회수 및 고체 수지로부터 FK506 의 추출 및 재사용

실시예 6의 결과로부터 확인된 대부분의 트리사이클로 화합물이 흡착된 합성수지만을 분리하여, FK506 및 FK520을 추출하여 후 정제공정에 적용하고자 하였다. 합성수지(HP20)의 크기는 평균 250㎛ 이상이므로 발효가 완료된 배양액(5ℓ)으로부터 합성수지를 회수하기 위해 체눈의 크기 250㎛ 이하의 동망을 사용하였다. 회수된 합성수지는 증류수로 세척하고 이를 적절한 크기의 컬럼에 충진하였다. 충진된 합성수지로부터 트리사이클로 화합물의 회수는 다양한 유기용매로 추출할 수 있으나, 특별히 물과의 혼합이 자유로운 아세톤, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴이 바람직했다(표 7). 아세톤으로 추출할 경우 50%이상의 아세톤 수용액으로 회수가 가능했으며, 70-75% 아세톤 수용액이 불순물 함유가 낮고, 회수율이 좋았다(도 8). 75%의 아세톤으로 추출시 수지부피의 3배의 40% 아세톤 수용액으로 수지를 세척한 후 3배 부피의 75% 아세톤 수용액으로 추출하였다. 이때의 회수율은 94% 이상이었다(표 8). 따라서 HP20 수지가 첨가된 발효액은 합성수지를 배양액과 분리수거하여 추출용매를 사용함으로써 추출용매의 사용량을 줄일 수 있었고 대부분의 트리사이클로 화합물을 추출할 수 있어 매우 효율적이었다.

표 7은 수지로부터 용매 추출에 의한 화합물 회수 정도를 나타낸 것이다.

수지종류	FK506 생산량(㎎/ℓ)	FK520 생산량(㎎/ℓ)
아세톤	477.5	11
아세토나이트릴	448	10
메탄올	237.5	6.3

표 8은 수지로부터 아세톤 수용액 추출에 의한 화합물의 회수 정도를 나타낸 것이다.

단계		부피	FK506 양(㎎)	수율(%)
시료	수지(HP20)	200㎖	1491.0	100.0
추출용매	40% 아세톤	600㎖	31.8	2.1
	75% 아세톤	200㎖	10.3	0.6
		200㎖	1193	80.0
		200㎖	201.4	13.5
		200㎖	0.8	0.1
		200㎖	0.0	0.0

표 9는 재생 수지의 흡착능력을 나타낸 것이다.

	FK506 생산량 (㎎/ℓ)	대조구에 대한 비(%)	신생수지에 대한 비(%)
무첨가 대조구	94.5 ± 10.0	100.0	31.8
신생수지	297.0 ± 28	314.3	100.0
한번 사용한 수지	264.7 ± 1.25	280.2	89.1
두 번 사용한 수지	269.0 ± 19.8	284.7	90.6

또한 회수한 합성수지(HP20)를 50% 이소프로필알콜 + 50% 1N NaOH 수용액, 4% NaOCl수용액 과 증류수로 순서대로 각각 4배 부피비로 세척하여 재생하여 반복 사용할 경우도 신생수지의 90% 정도의 효과를 나타내었다(도 9, 표 9).

도 1은 3원환 화합물 FK506 및 FK520의 HPLC 분석 결과이다.

대조구는 무첨가 시험구이며, 전체는 배양액 전체를, 상등액은 균체가 제거된 용액을, 균체는 원심분리하여 회수한 균체만을 대상으로 측정하였으며, HP-20 첨가 배양구는 HP-20 합성수지 5% (V/V)가 첨가된 발효 배양액 전체를 측정하였다.

도 2는 FK506 및 FK520의 LC-Mass 분석 결과이다.

FK506 [M+NH³ ⁺], ~822; FK520 [M-NH³ ⁺], ~810

도 3은 합성 수지별 FK506 및 FK520의 생산량을 나타낸 그래프이다.

배양 배지에 여러 종류의 합성수지를 각각 5%(V/V) 첨가하였다. 수지를 첨가한 후 살균하여 6일간 발효시켜 FK506 및 FK520의 생산량을 측정하였다. 대조구(control)는 합성수지 무첨가구이다.

도 4는 수지 첨가 일자별 FK506 및 FK520의 생산량을 나타낸 그래프이다.

수지(HP-20)를 사용하여 실험하였다. 수지는 배양 중에 별도 살균하여 최종 5% (V/V)가 되도록 표시된 배양일자에 첨가하였다. 6일간 발효하여 생산량을 측정하였다. 대조구(control)는 수지 무첨가구이다.

도 5는 배양 일자별 및 수지첨가 일자별 FK506 및 FK520의 생산량을 비교한 그래프이다.

-■- , 수지 무첨가 배양 일자별 FK506 생산량; 발효 배양 동안 표시된 일자에 소량 회수하여 생산량을 측정하였다.

-●- , 수지 첨가 배양 일자별 FK506 생산량; 도 4에 기록된 생산량 수치를 그대로 사용하였다.

도 6은 수지 첨가량에 따른 FK506 및 FK520의 생산량을 나타낸 그래프이다.

수지 첨가량은 부피비이다. 대조구(control)는 수지 무첨가 시험구이다.

도 7은 FK506에 대한 방선균의 감수성 시험 결과이다.

시험 방선균은 1. 스트렙토마이세스 베네주엘라(Streptomyces venezuelae); 2, 스트렙토마이세스속 GT1005; 3, 스트렙토마이세스속 ATCC55098 이며, 도면에 표시된 농도의 FK506을 사용하여 감수성을 시험하였다.

도 8은 용매별 FK506 및 FK520의 추출량을 나타낸 그래프이다.

수지(HP-20)를 첨가한 발효 배양 시험구에서 수지만 추출한 후 2배 부피 비의 용매를 가하여 추출하여 정량하였다.

도 9는 수지 재생에 따른 FK506의 생산량을 비교한 그래프이다.

수지(HP-20)의 첨가량은 5%(V/V)이다. 수지 무첨가구(control)를 대조구로, 신생 수지(New), 한 번 사용한 수지(Re-1), 두 번 사용한 수지(Re-2)를 실시예 7에 기록한 방법과 같이 재생하여 사용하였다.

Claims

트리사이클로 화합물 생산균주 발효 및 정제시 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소수성 흡착 수지를 가하여 생산 수율 및 정제 효율을 향상시키는 트리사이클로 화합물 생산 방법:

(a) 트리사이클로 화합물 생산균주에 소수성 흡착 수지를 가하여 배양하는 단계;

(b) 상기 소수성 흡착 수지를 회수하는 단계;

(c) 상기 소수성 흡착 수지로부터 트리사이클로 화합물을 회수하는 단계.
제1항 있어서, 상기 트리사이클로 화합물은 FK506 및 FK520 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지는 스티렌/다이비닐벤젠 중합체(styrene/divinylvenzene copolymers) 또는 알리파틱 에스터 중합체(aliphatic ester copolymer)를 주요 성분으로 하는 수지인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지는 Diaion HP-20, Amerlite XAD-2 Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-7, Amberlite XAD-7HP, Amberlite XAD-8, Amberlite XAD-16, Amberlite XAD-16 HP, Amberlite XAD-1180, Amberlite XAD-2000 및 Amberlite XAD-2010에서 선택되는 1종 이상의 수지인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지는 3~7%(v/v)인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지는 배양 개시 후 3일 내에 첨가하는 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 트리사이클로 화합물의 회수에 사용되는 용출액은 아세톤, 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄으로 구성된 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 용출액은 50-100%(v/v)의 아세톤 수용액인 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지는 재생하여 사용하는 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.
제9항에 있어서, 상기 소수성 흡착 수지를 50% 이소프로필알콜과 50% 1N NaOH 수용액의 혼합 용매, 4% NaOCl 수용액 및 증류수로 순서대로 세척하는 것을 특징으로 하는 트리사이클로 화합물 생산 방법.