KR20090017862A - 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 포도비리대박테리오파지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 박테리오파지(Bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간을 포함한 동물성 질환의 주된 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 포도비리대(Podoviridae) 박테리오파지, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물, 항생제 및 소독제에 관한 것이다.

황색포도상구균, 항생제, 포도비리대, 박테리오파지

Description

황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 포도비리대 박테리오파지{Podoviridae Bacteriophage Having Killing Activity Specific to Staphylococcus aureus}

본 발명은 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 신규한 포도비리대 박테리오파지에 관한 것이다.

박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 일군의 효소를 발현시킨다. 이들 효소는 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도(mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스

의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)

을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다. 그러나, 1950년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제 사용의 보급화로 인해 일부 동유럽 국가에 한정되어서만 박테리오파지에 대한 연구가 계속되었으며 그 밖의 지역에서는 다소 시들하였다. 그러나, 2000년 이후에 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균의 출현빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성 때문에 박테리오파지에 대한 연구가 선진국들을 중심으로 많은 관심을 받으며 다시 활발하게 진행되고 있다.

비록 항생제(또는 항균제)가 세균 감염에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 1980년대 이후 과도한 항생제의 사용으로 더욱 많은 항생제 내성 균주가 발생하고 있으며, 1986년 최후의 항생제로 불리는 반코마이신(Vancomycin)에 내성을 지닌 황색포도상구균 및 다재 내성을 가진 균주가 다수 발견됨으로써 의학계에 큰 충격을 주었다. 반코마이신에 내성을 보이는 반코마이신 내성 장구균(Vancomycin Resistant Enterococci; VRE)은 1986년 프랑스에서 처음 보고 되었고 1988년 미국에서 분리된 이래, 치료가 곤란한 병원감염(nosocomial infections)의 원인균으로서 그 분리 빈도가 해마다 증가하고 있으며 최근에는 유럽, 미국 이외에도 싱가포르, 일본, 오스트레일리아, 한국 등 전 세계적으로 증가하는 추세이다. 국내에서는 1992년에 VRE가 처음 분리되었다. 황색포도상구균의 경우, 1990년대 초에 반코마이신 내성 황색포도상구균(Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus; VRSA)이 세계 최초 발견되었으며, 국내에서는 1996년 6월 마침내 VRSA가 발견되었다.

따라서 기존 항생제에 내성을 갖는 세균에 의한 질환까지도 치료할 수 있어 국민 건강과 의약 기술을 선도할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급한 상황이다. 다시 말해, 내성세균의 출현에 대한 심각성뿐만 아니라 최근 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 항생제 오남용에 의한 문제 및 항생제 잔류 문제에 대한 새로운 해결책으로 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발 등 대안 마련이 매우 절실한 형편이다. 물론 이러한 대안 마련의 해결책은 기존 항생제와는 근본적으로 다른 방법에 의한 새로운 개념의 항생 물질의 개발을 통해서 일 것이다.

한편, 본 발명자들은 이전의 연구를 통하여 황색포도상구균에 대하여 항균활성(antimicrobial activity)을 갖는 미오비리대 박테리오파지를 선별하여 2006년 6월 14일자로 농업생명공학연구원(기탁번호 KACC 97001P)과 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11153BP)에 기탁한 바 있으며, 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2006-55461호). 그러나, 본 발명자들의 경험에 의하면, 박테리오파지는 그 종류에 따라 항균 활성을 나타내는 황색포도상구균의 종류나 범위가 다를 뿐만 아니라 서로 작용하는 기작도 다르다. 이 에 따라 가능한 다양한 박테리오파지의 확보가 요망된다. 이렇게 추가적 박테리오파지의 확보는 더 많은 황색포도상구균에 대처할 수 있는 방안을 제공해 주며 또한 이들 박테리오파지를 혼용할 시는 한 종류의 박테리오파지의 단독 사용에 비하여 추가적 항균 효과의 증가가 기대될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 병원체로부터 황색포도상구균을 일차적으로 분리하고 이 분리된 황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 또한 자연에서 분리하였다. 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 이를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 유전체(genome)의 유전자 서열을 제공하고, 더 나아가 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 분리된 박테리오파지를 이용하여 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간을 포함한 동물의 감염성 질환의 주된 원인균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용으로서 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 특이적 사멸능을 갖는 포도비리대 과(Podoviridae family) φ29-유사 바이러스 속(φ29-like virus genus)의 박테리오파지를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지는 서열번호 1의 염기 서열로 표시되는 유전체를 가진다.

황색포도상구균은 피부감염, 식중독 등을 일으키는 주요 원인균이고, 국내에서 조사된 항생제 메티실린에 대한 내성률이 평균 73%로 세계 최고 수준인 매우 위해한 병원균이다. 이는 항생제를 써도 죽지 않는 황색포도상구균이 73%가 된다는 뜻으로 내성이 매우 강한 병원균이라고 할 수 있다.

본 발명자들은 이러한 황색포도상구균을 선택적으로 사멸시키기 위해 예의 노력한 결과, 병원체로부터 황색포도상구균을 분리하고, 이 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규한 포도비리대 박테리오파지를 선별하였고 이를 SAP-2로 명명하였다. 이렇게 선별된 박테리오파지를 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11154BP)에 기탁하였다.

본 발명은 선별된 SAP-2 박테리오파지의 유전체의 핵산 분자 서열을 제공한다 (서열번호 1).

본 명세서에서 사용된 "핵산 분자"라는 용어는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

또한, 본 발명은 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용으로서 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키므로, 황색포도상구균에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료에 효과를 나타낸다.

황색포도상구균은 가축에서 전염성 유방염을 유발하는 주요 병원균 중 1위를 차지한다. 미국 내 전체 젖소우군의 90%에 황색포도상구균이 존재하고, 전체 젖소의 10%는 이 병원균에 감염되어 있을 것으로 추정되고 있다. 또한, 황색포도상구균은 인체에서는 급성 피부염의 원인균이기도 한데, 이 급성 피부염은 갑자기 패혈증으로 발전하여 환자의 목숨을 앗아가기도 한다. 또 황색포도상구균은 화농성 질환, 땀 냄새, 식중독의 원인균이기도 하다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 황색포도상구균에 의해 유발되는 다양한 질환, 예컨대 유방염, 급성 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 대한 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 박테리오파지를 젖소유방염에 감염된 부위에 매일 분무해 주면 유의적 수준으로 유방염 발생이 감소하며, 이를 통해 유방염 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 예방; (ⅱ) 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅲ) 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투 여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1 × 10³ 내지 1 × 10¹⁰ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 10⁶ 내지 1 × 10⁹ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

황색포도상구균은 고초균(Bacillus subtilis), 대장균 및 녹농 균(Pseudomonas aeruginosa) 등과 함께 화장품에서 자주 발견되는 유해균이기도 하다. 화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또, 식품에 비하여 사용기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.

화장품에 가장 널리 사용되고 있는 파라벤류와 같은 합성방부제는 최근 그 위험성이 부각되고 있고, 특히 유방암 환자의 유방암 부위에 방부제가 축적되었다는 사실이 최근 알려지면서 아무런 경각심 없이 사용되고 있는 합성 방부제 함유 화장품이 예상 외로 위험할 수도 있다고 인식되고 있다. 또, 미국 피부과학회는 합성 방부제를 피부 알레르기 유발 원인물질 2위에 올려놓은 바도 있다. 이와 함께 최근에는 어린이용 제품에 인공 합성 방부제를 사용함으로써 어린 시절부터 방부제 함유제품에 노출되게 되어 그 사용기간과 사용량이 훨씬 증가할 수 있기 때문에 더욱 위험할 수 있다는 우려가 있어 새로운 천연유래의 방부제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 SAP-2 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 황색포도상구균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 갖고 있다. 이는 유용한 균은 죽이지 않고 병원균인 황색포도상구균만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 부작용이 없는 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지를 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다. 따라서, 병원성 세균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

병원감염에서 분리되는 균의 분포는 시대에 따라 변화하고 있다. 미국의 NNIS (National Nosocomial Infection Surveillance System)에서 이러한 경향을 잘 볼 수 있는데, 1980년대 후반부터는 그람양성균, 특히 황색포도상구균의 분리가 증가하고 있으며, 이러한 경향은 국내에서도 볼 수 있다. 1985년 국내 조사에 의하면 대장균, 녹농균, 코아굴레이스 음성 포도상구균(coagulase negative Staphylococcus), 황색포도상구균의 순으로 나타났으나, 점차 황색포도상구균의 분 리가 증가하고 있으며, 1996년 대한병원감염관리학회의 조사에 따르면 황색포도상구균이 전체의 17.2%를 차지하였고, 다음으로 녹농균이 13.8%, 그 다음으로 대장균이 12.3%의 순이었다. 그리고 분리된 전체 황색포도상구균의 78.8%는 기존 항생제에 대한 내성을 가졌다.

이러한 점을 고려한다면, 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 SAP-2 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 병원성 세균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키는 능력을 갖는 포도비리대 박테리오파지를 제공한다. 본 발명의 박테리오파지는 황색포도상구균이 주원인이 되는 감염성 질환의 예방 및 치료제, 항생제, 화장품용 항균제 또는 천연 유래의 방부제, 및 다양한 소독제 등으로 광범위하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 병원체로부터 황색포도상구균의 분리 및 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

1-1: 황색포도상구균의 분리

박테리오파지는 자연계에 널리 존재하는데, 특히 세균이 존재하는 곳에 공생하는 경우가 많다. 본 발명자들은 황색포도상구균에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 기본적으로 황색포도상구균이 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집한 후 실제로 황색포도상구균이 존재하는 지를 황색포도상구균 선택배지인 Baird-Parker 아가(agar) 배지를 이용하여 조사하였다.

이를 상세히 설명하면, 대상 세균인 황색포도상구균을 병원체로부터 분리하고자 선택한 질환은 젖소 유방염으로 하였다. 유방염은 황색포도상구균에 의해 발병되는 대표적 질환 중에 하나이다. 유방염에 감염된 젖소의 우유로부터 채취된 시료로부터 황색포도상구균의 선택배지인 Baird-Parker 아가 배지를 이용하여 황색포도상구균을 획득하였고, 그람염색법(Gram staining method), 카탈라아제 조사(catalase test)와 bioMerieux 사의 Vitek을 이용한 생화학적 조사를 통해 선별된 균이 황색포도상구균임을 최종적으로 확인하였다. 그 결과는 하기 표 1과 같다.

Vitek ID	200000-0 (A1-18) 카탈라아제 + 코아귤라아제(Coagulase) +
타입	그램 양성 동정(identification) 카드(GPI)
상태	최종
경과 시간	5 시간
생물	황색포도상구균
PB + BAC - OPT + HCS + 6NC + 10B + 40B - ESC - ARG - URE - TZR + NOV - DEX + LAC + MAN + RAF - SAL - SOR - SUC + TRE + ARA - PYR + PUL - INU - MEL - MLZ - CEL - RIB - XYL - CAT + BH/CO +

1-2: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 분리

다음 단계로서, 분리된 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 분리하기 위해 박테리오파지가 있을 것으로 예상되는 시료를 황색포도상구균과 함께 배양한 후 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻은 다음 이를 여과한 다음, 배양된 황색포도상구균을 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 함께 다시 배양하여 황색포도상구균의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석(plaque assay)을 통해 판별하였다.

이를 상세히 설명하면, 황색포도상구균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 우사 내의 토양, 지푸라기, 흙 및 하수 등에서 검체를 채집하여 앞에서 얻은 황색포도상구균과 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다. 이 때 사용한 방법의 모식도가 도 1에 개시되어 있고 박테리오파지 검출에 이용한 용균반 분석 결과가 도 2에 제시되어 있다. 얻어진 박테리오파지의 형태를 관찰하기 위해 염화세슘(CsCl) 밀도 구배법(밀도: 1.15 g/㎖, 1.45 g/㎖, 1.50 g/㎖ 및 1.70 g/㎖)을 이용한 원심분리(38,000 rpm, 22시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제한 다음, 이를 구리 격자(cupper grid)에 묻히고, 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)를 이용한 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후, 전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다. 그 결과 분리된 박테리오파지가 형태학적 분류상 포도비리대 과(Podoviridae family) φ29-유사 바이러스 속(φ29-like virus genus)에 속하는 것을 확인할 수 있었으며 크기는 약 36.4 nm이었고 이 박테리오파지를 SAP-2로 명명하였다 (도 3).

실시예 2: 황색포도상구균에 특이적인 분리된 박테리오파지의 유전적 특성 분석

얻어진 SAP-2 박테리오파지의 유전자 서열분석을 실시하였다. 이를 위해 SAP-2 박테리오파지의 유전체를 통상의 방법으로 추출한 다음 유전적 특성을 분석하였다. 구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ) 200 ㎖와 600 nm에서 흡광도가 1인 황색포도상구균 부유액 50 ㎖ 및 1×10⁸ pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 황색포도상구균이 용균되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 다음 이 여과한 배양액에 남아 있을 황색포도상구군의 DNA와 RNA를 제거하기 위해 이 여과한 배양액 10 ㎖에 DNase와 RNase 각각을 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 그 후 DNase와 RNase의 활성을 제거하기 위해 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 ㎕를 첨가한 후 10분간 정치시켰다. 그 다음 단계로 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/㎖) 100 ㎕와 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 18,000 rpm에서 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층 중에서 위층을 취하고 여기에 2부피비의 차가운 100% 알코올을 가하여 순수한 유전체만을 추출하였다. 추출한 박테리오파지의 유전체가 DNA인지, RNA 인지를 확인하기 위해, DNaseⅠ (10 U/㎕) 및 RNase A (10 ㎍/㎕)를 각각 첨가해 준 다음 37℃에서 1시간동안 처리하였고, 이와 더불어 DNA일 경우에 단일가닥 DNA인지, 이중가닥 DNA인지 구분하기 위해 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제(45 U/㎕)를 첨가해 준 다음 상온에서 15분간 처리 하였다. 이렇게 처리한 시료들을 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 각 효소에 의한 절단 양상을 조사하였다. 그 결과, 얻어진 유전체는 DNaseⅠ에만 민감하였다(도 4). DNase I에 민감한 것은 유전체가 DNA임을 의미하고, 녹두 뉴클레아제에 민감하지 않은 것은 유전체가 DNA 이중가닥 형태임을 의미한다. 이 결과로부터 얻어진 박테리오파지의 유전체가 DNA형이면서 이중가닥임을 확인할 수 있었다.

위와 같이 분리된 박테리오파지의 유전체는 게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 이 gDNA의 유전자 서열을 분석하기 위해 먼저 다양한 제한효소(restriction enzyme)로 처리하여 제한효소 처리에 따른 절단 양상을 일차적으로 파악하였다 (도 5). 그 결과, 제한효소 Nde I으로 처리하는 경우가 gDNA의 라이브러리(library) 구축에 가장 적합하다고 판단되어 Nde I으로 처리하여 준비된 유전자 단편(fragment)을 이용한 gDNA 라이브러리를 통상의 방법에 따라 구축하였다. gDNA 라이브러리 구축에 사용된 방법이 도 6에 모식적으로 제시되어 있다. 이와 더불어 SAP-2 박테리오파지의 gDNA 자체의 염기 서열을 직접 분석하여 전체 박테리오파지 유전체의 염기 서열을 확보하였다.

이를 상세히 설명하면, 먼저 통상의 방법대로 SAP-2 박테리오파지의 gDNA를 Nde I으로 처리하여 유전자 단편을 얻었고, 또한 pGEM T-easy 벡터(vector)(Promega사)도 Nde I으로 처리하여 벡터 단편을 준비하였다. 이 때 사용한 pGEM T-easy 벡터는 TA-클로닝용 벡터이므로 그대로 사용하지 않고 벡터 말단의 T-돌출 (T-overhang)을 통상의 방법으로 제거한 후 평활말단 결합(blunt-ended ligation)을 통하여 환형으로 만들어 준 다음 사용하였다. 이렇게 준비된 유전자 단편들과 벡터 단편을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 통상의 방법대로 서로 결합시켰다. 이렇게 하여 준비된 SAP-2 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 전기천공법(electroporation)이라는 전기적 형질전환 방법(electro-transformation)을 통해 대장균의 한 종인 Top10F' 종 (Invitrogen사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 형질전환된 형질전환체를 엑스-갈(X-Gal; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 및 이소프로필 베타-디-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 첨가된 암피실린(ampicillin) 함유 아가 평판배지 상에서 통상의 청백 콜로니 선별법(Blue-White colony selection)을 통해 선별하였다. 선별된 단일 콜로니(colony)를 암피실린이 포함된 배양배지에 접종한 후 하룻밤동안 진탕배양 하였고, 이 배양 세포로부터 플라스미드(plasmid) 정제 키트(iNtRON사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이 추출된 플라스미드는 0.8% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 통하여 그 크기를 확인함으로써 재조합된 플라스미드를 선별하였다.

이렇게 선별된 플라스미드는 3개였으며 이에 해당하는 클론(clone)도 당연히 그 플라스미드 수만큼 3개를 얻을 수 있었다. 이 클론들을 다시 배양하여 배양 세포로부터 다시 플라스미드를 상기 방법과 같이 추출하였고, 추출된 플라스미드를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 이와 병행하여 SAP-2 박테리오파지의 gDNA을 이용한 직접 염기 서열 분석도 실시하였다. 이때 사용한 프라이머(primer)의 서열은 다음의 표 2와 같다.

프라이머	염기서열
T7 promoter	TAATACGACTCACTATAGGGCGA
SP6 promoter	GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT
1	CGTAATGCTTCAAAATGTTC
2	GAGCAATGTTAGTTGATTACTCATT
3	CCATTTAAAAAATAATCATCACGTT
4	TGCAATTCATATATTAGATGATAA
5	TATGCTTTATATGGAGGTTGATAAC
6	AATTAGTGTACCGTCACCTAAAGA
7	TGCAACACCATCGTGATGTA
8	GTTGTTGAACATCGCAACAG
9	CAAAATCTGATAAAAACGTCAT
10	GACGTGATGAGGATTATTAT
11	ATAAATTCTCTTTCTTTTTCCTCAAATTCAAATCTCGCTAATGT
12	CATACGTGGATAATTACGTTTCAACATTAATTCCTCATTT
13	ATCAAATTCATTTAAAATTTTCTTTCT
14	AATGTCACCTATGTTTAATGCAGA
15	AGTTCATCATTTAAGAATTGAACAACAGAACT
16	TTTGTTGCTCTAATGATGTAATACGTTGTTCTAATATAACAG
17	TCACTTGCAATAATACCACTTTCTAAT
18	GTCAAGTATCATTTTAATACAATTT
19	TCATTATACATTACGTGACGCTTA
20	AGCTTCTCTTTCTTTTTTCCATCTA
21	GAACTTCATTGTATTTAGCGCTGTTG
22	TGAATCTTCATATGGTCGACCTGCAG
23	ATTTAATAGTTTTGCACAAGTACCAA
24	CAAACTAACCCATCTGATAAACAAAC
25	AACCTAATGGCTATTGGTTCCAACCA
26	GGTAACAGTTCAGTTAATTCACAT
27	GGTGCCATAATTTATTATTCCTCC
28	TTAATCGTACCTAATTTAATATCAC
29	AACGTAAATCGTTATTACTTGCAATG
30	CGTTACAACACCCGGAGAATATTA
31	CCAAATGTCCAAGATTTTGAATAA
32	TTTAAAATGTACAGGTACGTATAC
33	TTGAATTTAACGAATATAATTTGGC
34	ATATTATCATGATTGCACATAACTG
35	GTAAAAGGTTATGGACGTTTTAAT
36	AATTTTTATGACTATATAAAATCATT
37	ACAAAAAACATTTAACAACACGTAT
38	AAATAAAATACAAAACATAATCAAT

상기 두 가지 방법을 통하여 확보된 SAP-2 박테리오파지의 전체 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다. 최종적인 SAP-2 박테리오파지 유전체의 총 구성 염기 수는 17938개였다.

실시예 3: 얻어진 황색포도상구균에 특이적인 SAP-2 박테리오파지를 이용한 황색포도상구균의 감염 예방에 대한 적용예

9 ㎖의 영양배지(Nutrient broth: 소고기 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ) 하나에는 약 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준의 SAP-2 박테리오파지액(실시예 1) 100 ㎕를 넣어주고 대조실험의 배지에는 박테리오파지액을 넣어주지 않은 시료를 각각 준비하였다.

여기에 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 황색포도상구균액을 넣어준 다음 황색포도상구균의 배양 상태를 관찰해 보았다. 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 박테리오파지액을 첨가해 주지 않은 배지에서는 60분 후 600 nm에서의 흡광도가 0.8 정도가 될 정도로 황색포도상구균이 매우 잘 성장하는 반면에 박테리오파지액을 첨가해 준 영양배지에서는 10분경과 후 600 nm에서의 흡광도가 0.1 정도 수준으로, 60분 후에는 0.05 수준으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 실시예 1에서 분리한 SAP-2 박테리오파지가 황색포도상구균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸시킬 수 있는 능력이 있어 황색포도상구균의 감염을 막는데 매우 효과적임을 알 수 있었다.

황색포도상구균 사멸 능력(OD₆₀₀ 흡광도 값)

구분	배양 0시간	배양후 10분	배양후 60분
대조군(무처리)	0.5	0.6	0.8
실험군 (실시예 1에서 얻은 박테리오파지액)	0.5	0.1	0.05

실시예 4: 얻어진 황색포도상구균에 특이적인 SAP -2 박테리오파지를 이용한, 황색포도상구균의 감염에 의해 유발되는 질환의 치료에의 적용예

황색포도상구균이 주요 원인균인 젖소유방염에 감염된 젖소 10두를 대상으로 실시예 1에서 얻은 SAP-2 박테리오파지가 유방염 치료에 효과적인지에 대해서 조사해 보았다. 젖소를 5두씩 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 매일 10⁸ pfu/㎖의 SAP 박테리오파지액 10 ㎖을 감염부위에 분무해 주었고 다른 하나의 5두로 구성된 대조 그룹에는 박테리오파지가 없는 박테리오파지액의 준비에 사용했던 조성 그대로인 인산완충식염수를 매일 같은 양인 10 ㎖씩 감염부위에 분무해 주었다. 이와 같은 처치를 10일간 해준 다음 젖소 유방염에 감염된 젖소로부터 얻어진 우유에 포함된 황색포도상구균의 수를 조사해 본 결과, 박테리오파지액을 분무해 준 경우에만 유의적 수준의 유방염 치료 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 실시예 1에서 얻어진 SAP-2 박테리오파지가 황색포도상구균을 원인으로 하는 감염질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

황색포도상구균 감염 질환 치료 능력(황색포도상구균 수)

구분	처치전	처치후
대조군(인산완충식염수)	1.5× 104 cfu/㎖	1.7× 104 cfu/㎖
실험군(실시예1에서 얻은 박테리오파지액)	1.7× 104 cfu/㎖	1.2× 102 cfu/㎖

실시예 5: 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지의 활성 비교

본 발명자들은 본 발명에 의해 개시한 것을 포함하여 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 두 가지 박테리오파지(기탁번호 KACC 97001P와 기탁번호 KCTC 11154BP)의 용균 활성을 비교해 보았다. 대상 황색포도상구균은 항생제내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; 서울시 노원구 공릉 2동 126 서울여자대학교 제 1 과학관 429호)에 보유되어 있는 것으로 하였다. 그 결과는 다음과 같다.

No .	CCARM No .	Species	A	B
1	0027	Staphylococcus aureus	◎	◎
2	3501	Staphylococcus aureus	◎	◎
3	3502	Staphylococcus aureus	×	◎
4	3089	Staphylococcus aureus	◎	×
5	3090	Staphylococcus aureus	◎	◎
6	3091	Staphylococcus aureus	◎	×
7	3095	Staphylococcus aureus	◎	×
8	3108	Staphylococcus aureus	◎	×
9	3207	Staphylococcus aureus	◎	×
10	3209	Staphylococcus aureus	◎	×
11	3210	Staphylococcus aureus	◎	×
12	3222	Staphylococcus aureus	◎	×
13	3223	Staphylococcus aureus	◎	×
14	3224	Staphylococcus aureus	◎	×
15	3229	Staphylococcus aureus	×	×
16	3230	Staphylococcus aureus	×	◎
17	3267	Staphylococcus aureus	×	×
18	3268	Staphylococcus aureus	×	×
19	3270	Staphylococcus aureus	◎	×
20	3271	Staphylococcus aureus	◎	◎
21	3467	Staphylococcus aureus	×	×
22	3468	Staphylococcus aureus	◎	◎
23	3469	Staphylococcus aureus	×	×
24	3476	Staphylococcus aureus	×	×
25	3504	Staphylococcus aureus	◎	×
26	3521	Staphylococcus aureus	×	×
27	3531	Staphylococcus aureus	×	×
28	3533	Staphylococcus aureus	×	×
29	3535	Staphylococcus aureus	◎	◎
30	3538	Staphylococcus aureus	×	×
31	3543	Staphylococcus aureus	×	×
32	3547	Staphylococcus aureus	◎	×
33	3548	Staphylococcus aureus	×	×
34	3549	Staphylococcus aureus	◎	◎
35	3554	Staphylococcus aureus	◎	×
36	3557	Staphylococcus aureus	×	◎
37	3596	Staphylococcus aureus	◎	×
38	3599	Staphylococcus aureus	×	◎

상기 표에서, CCARM No.는 항생제내성균주은행에서의 목록번호이며, “◎”는 용균 활성이 확인된 경우이고 “×”는 용균 활성이 확인되지 않은 경우에 해당함. “A"는 기탁번호 KACC 97001P에 해당하는 박테리오파지의 결과이고 ”B"는 기탁번호 KCTC 11154BP에 해당하는 박테리오파지의 결과임.

이 결과에서 알 수 있듯이 두 박테리오파지가 용균 활성을 보이는 대상 황색포도상구균의 종류에는 차이가 있다. 또한 비록 같은 용균 활성을 보일 경우에도 활성의 정도에는 서로 차이가 있었다. 따라서 두 박테리오파지는 상호 보완적 성격을 가지며 동시에 이용할 경우에는 그 항균 효과가 배가될 가능성이 높다. 이는 대부분의 경우 박테리오파지의 용균 기작이 조금씩 다르기 때문이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리법을 모식적으로 나타낸 그림이고;

도 2는 용균반 분석에 의해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출한 평판접시 사진이고;

도 3은 용균반 분석에 의해 황색포도상구균에 특이적인 박테리오파지를 검출한 다음 이를 전자현미경으로 촬영한 사진이고;

도 4는 추출한 박테리오파지의 유전체의 특성을 조사한 결과로서, 레인 g는 아무 처리도 하지 않은 유전체 그대로, 레인 D는 DNaseⅠ으로 처리한 유전체, 레인 R은 RNase A로 처리한 유전체, 레인 MB는 녹두 뉴클레아제로 처리한 유전체, 레인 M은 분자마커에 해당하고;

도 5는 박테리오파지 유전체의 제한 효소에 의한 절단 양상을 보여주는 결과로서, 레인 M1은 분자마커, 레인 1은 SalⅠ에 의한 절단 양상, 레인 2는 NdeⅠ에 의한 절단 양상, 레인 3은 MboⅠ에 의한 절단 양상, 레인 4는 DraⅠ에 의한 절단 양상, 레인 5는 BamH I에 의한 절단 양상, 레인 6은 Acc I에 의한 절단 양상, 레인 7은 SAP-2 gDNA, 레인 M2는 분자마커이고;

도 6은 박테리오파지의 유전체 라이브러리의 구축을 위하여 사용한 방법을 순서대로 보여주는 모식도이다.

<110> INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> Podoviridae bacteriophage having Killing Activity specific to staphylococcus aureus <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17938 <212> DNA <213> Podoviridae bacteriophage <400> 1 taaatataat cggaaaaagt ttttgtaaat ttacacctcc ccaccgttta aaataaacga 60 ttatacaaat caaaacttat aaattaactt atcatttcta aactaaactt ataaaaaatg 120 ttcacctact ttcccaactt atctaaccta ttacatattc attaattaca aaatatatac 180 atctattgac ttttatccaa aattatgatt tgaaattaaa atctagtttc ttctattaaa 240 tagtagtttt aaattattta aactttttta cgatatttta ttgacaaaac atttaaacat 300 ttgctatact aagtatgtaa tcaaaacaag gaggtaacaa aaatgattaa tgttgataat 360 gcaccatcag aaaaaggtca agcatatact gaaatgttgc aattattcaa taaactgatt 420 caatggaatc cagcatatac gtttgataac gcaattaact tagtatctgc ttgtcaacaa 480 ctattattaa actataacag ttctgttgtt caattcttaa atgatgaact caacaacgaa 540 actaagccag aatctatttt agcttatatt gctggtgacg atgcaatcga acagtggaat 600 atgcacaaag gtttttatga aacgtataat gtttacgtat tttagaaagg aatgatataa 660 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ccttgtttta acgtctttaa tccagtaatt ttttcacttg tcttaacgtc 9120 ctctaaatct tttgtattaa tagaatcttt aggtaacatt tgaacctttt gaaagttttg 9180 tgtaatccat ggataggcac tcattttatc cataaagtta ataaagtcac catattccat 9240 aacgtataag ttgactggtg atgtgatatt gtcatatatt gtacctttag acgtatctaa 9300 gtttggctct tttttagtac caaatttctt tgataaatca gcacttgact ggaataacac 9360 taaattttcc aaaaactgtt gcatttggtt atacacatag tttttatttg atacttttaa 9420 cacatcatca ttgttacgta acattggtaa catatagtta tacgtgcgtt ttgataagtg 9480 ttgacgttca atattaacgt ttgagagttg ttctaataca ttaccttgtg tatacgtcat 9540 aatagtatca atcacaaaat atattttaac cacaacatca ttcacatatt cgatttgatt 9600 cacaaacgca taataacgtc tgtcctcaaa atctgataaa aacgtcatgt agttaatccc 9660 ttgtgcgtca tgccactgca tatcaacatt gatttccatt ctatcacgta taaaattata 9720 cggttgtttg gaatagtcta atgatttaaa atgacgtcca tttaaaaaat aatcatcacg 9780 ttcttgatta ctattaaaat gaatcgtatt ttgataatca gtaaacggtg tgttatagaa 9840 aaatttaaaa tttgttaatt ttctcatttt tacctccata aaaaatagtc gtataaatta 9900 tttatacgac 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Claims (7)

1. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 특이적 사멸능을 갖는, 포도비리대 과(Podoviridae family)의 박테리오파지(Bacteriophage).
2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11154BP의 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
3. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 1의 염기 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
4. 제1항 내지 제3항 중 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는, 황색포도상구균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 황색포도상구균 유발성 질환은 유방염, 급성 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염 및 장염으 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제.
7. 제1항 내지 제3항 중 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제.

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