KR20090015976A - 지방 흡인 후의 지방흡인물로부터 조혈모세포의 분리 및 정제 - Google Patents

지방 흡인 후의 지방흡인물로부터 조혈모세포의 분리 및 정제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방 조직으로부터 조혈모세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 조혈모세포를 포함하는 현저하게 많은 개수의 CD34+, ALDHbr 및/또는 ABCG2-발현 세포를 제공함으로써, 신장(expansion) 없이 또는 최소 신장으로 당해 세포들을 사용할 수 있다.
조혈모세포, ABCG2-발현 세포, 지방흡인, 지방 조직, SVF, CD34

Description

지방 흡인 후의 지방흡인물로부터 조혈모세포의 분리 및 정제{Isolation and purification of hematopoietic stem cells from post-liposuction lipoaspirates}
조혈모세포(hematopoietin stem cell)(HSC)는 혈액 및 면역 세포를 생성하고 유기체가 살아있는 동안 유기체에 지속적인 혈액 재생을 궁극적으로 책임지는 줄기세포(stem cell)이다. HSC는 수세기 동안 연구의 초점이 되왔으며 현재 많은 치료적 적용, 예를 들어 백혈병, 림프종, 유전성 혈액 장애 및 광범위한 화학치료 요법 후 HSC 회복 등에 일반적으로 사용되고 있다.
HSC는 성인 기관의 조직 내 존재하는 다능성(multipotential) 줄기세포의 가장 특화된 예이다. 트렌틴과 그의 동료가 수행한 생식 연구에서[참조: Trentin, 1965, Cardiovasc. Res. Cent. Bull 4:38-4; Till & McCulloch, 1961, Rad. Res. 14:213-222], 치사량으로 방사선 조사된 마우스가 순환하는 혈액 세포를 공급하지 못해 사망하였다. 그러나, 동계의 도우너(donor) 동물로부터의 골수 세포 이식은 숙주 동물을 구했다. 도우너 세포는 모든 순환하는 혈액 세포의 재증식을 책임진다. 더욱 최근에, 골수를 이식받은 사람에서 조혈의 개조에 책임을 지는 세포가 CD34 항원(CD34+)을 발현하는 하위 구조의 세포 내 존재하는 것으로 보고되었다[참 조: Berenson et al., 1991, Blood 77:1717-1722]. 즉, CD34+ 세포는 조혈모세포를 포함한다. 세포 표면 면역페노타입에 영향을 받지 않는 조혈모 세포가 풍부한 군집(population)을 동정하고 분리하는 다른 방법이 연구되었다. 알데하이드 탈수소효소(ALDH) 활성에 기초하여 원시 사람 조혈 전구체(progenitor)가 분리되었다[참조: Storms et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:9118-9123; Hess et al., 2004, Blood 104:1648-1655)]. 더욱이, 사람에서 이식(engraftment)은 ALDH 활성(ALDHbr)과 낮은 측방 산란(low side scatter)(SSClo)을 갖는 주입된 세포의 개수와 매우 밀접하게 관련이 있다[참조: Fallon et al., 2003, Br. J. Haematol. 122:99-108].
많은 신뢰도 높은 연구에서 한정된 개수의 미분화된 조혈모세포의 제공으로 숙주 동물에서 8개 이상의 상이한 혈액 세포 계통(lineage)을 재생시킬 수 있음을 보여주었다. 이러한 대규모의 연구는 골수 이식의 기초를 제공하여 암과 선천성 대사 이상의 치료적 양식으로 널리 수용되었다. 따라서, 조혈모세포는 정상 사람의 골수 내 전생에 걸쳐 존재하는 것으로, 신생아 기간에 국한되지 않는다.
현재 골수 이식의 목적에 사용되는 조혈모세포(HSC)의 세가지 주요 공급원은 다음과 같다: 성인 골수, 성인 말초 혈액 및 출산 후 제대혈의 단핵구. 이식의 목적으로 분리되는 세포는 일반적으로 성인의 골수 또는 말초 혈액으로부터 분리된다. 그러나, 불행하게도 CD34+ 세포는 성인 골수 중 극히 드물어(~1-2%), 성인에게 이식하기에 충분한 양의 HSC를 생성시키기 위해 상당한 양의 골수가 얻어지는 것이 필요하다. 골수를 얻는 과정은 골수 회수를 위해 장기간 입원해야 하므로 골수 도우너에게는 지리하고 불쾌한 과정이다. 말초 혈액으로부터 CD34+ 또는 ALDHbr 세포의 분리는 일반적으로 다중의 혈구성분채집술 세션을 필요로 하며, 이는 도우너에게 불쾌감은 덜하지만 말초 혈액으로 HSC를 결집(mobilization)하기 위해 사이토카인으로 도우너를 예방접종할 필요가 있다. 결집에도 불구하고, CD34+ 또는 ALDHbr 세포, 및 결과적으로 HSC의 수는 여전히 일반적으로 상당히 낮다.
제대혈(UCB)은 골수나 결집된 말초 혈액에 비해 CD34+ 세포가 다소 풍부하지만[참조: Wang et al., 1997, Blood 89:3919-3924], 태줄 중 이용할 수 있는 혈액의 양이 소량이기 때문에 회수될 수 있는 이식가능한 HSC의 절대적 수가 제한되고, 이로 인해 UCB의 유용성은 본래 기대했던 것보다 떨어진다. 이론적으로, 제대혈 샘플을 수회 풀링(pooling)함으로써 충분한 개수의 HSC를 제공할 수 있으나, 임상적 실시에서는 풀링이 여의치 않게 된다. 따라서, 제대혈-유도된 CD34+ 세포는, 분리된 HSC의 개수가 너무 적어 완전히 자란 성인에 성공적으로 이식할 수 없어 성인에서 활용도가 제한된다. 신장(expansion) 프로토콜이 세포 개수를 시도하고 증가시키기 위해 연구되었다. 그러나, 일반적으로 HSC 신장은 항상 바람직스러운 것은 아닌 후속의 분화를 수반한다.
조혈 전구체가 골수 미시환경에만 국한되지 않을 수 있다는 부상하는 증거가 있다. 칼거리 대학의 연구자들은 일반적으로 신경 세포 계통 경로로 분화하는 신 경 줄기세포를 조사하였다. 신경 세포가 치사량으로 방사선 조사된 숙주에 이식되었을 때, 연구자는 새로 생성된 미엘로이드 및 림프구 세포 내 도우너 세포 마커의 존재를 확인하였다[참조: Bjornson, 1999, Science 283:534-537]. 베일러 의과 대학의 연구자는 뮤린 골격 근육으로부터 분리된 위성세포를 사용하여 유사한 연구를 실시하였다[참조: Jackson et al., 1999, PNAS 96:14482-14486]. 이러한 근육-유도된 세포를 치사량으로 방사선 조사된 숙주에 이식했을 때, 연구자는 모든 혈액 세포 계통에서 근육 유전자 마커(marker)의 존재를 확인하였다. 나아가, 이 연구는 신경 및 근육 조직이 조혈 분화할 수 있는 줄기세포를 함유함을 보여준다. 이는 골수 외 부위가 사람 질환 치료에 적용가능성이 있는 조혈 전구체의 재생 공급원을 제공할 수 있음을 시사한다[참조: Quesenberry et al., 1999, J. Neurotrauma 16:661-666: Scheffier et al., 1999, Trends Neurosci 22:348- 357; Svendsen & Smith, 1999, Trends Neurosci 22:357-364].
더 최근에, 지방(adipose)-유도된 스트로마 혈관 분획(SVF) 세포가 치사량으로 방사선 조사된 마우스에서 주요 조혈 계통을 성공적으로 재구성하는 것으로 보고되었다[참조: Cousin et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 301:1016-1022 and U.S. Patent Publication No. 2004/0067218]. 지방 조직으로부터 분리된 간엽 스트로마 줄기세포가 또한 결집된 말초 혈액으로부터 분리된 CD34+ 세포와 공주입되어CD34+ 세포의 성공적인 이식을 돕는 것으로 밝혀졌다[참조: Kim et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329(1) :25-31].
미국 특허 공개 번호 제2001/0033834호는 분리된 지방-유도된 스트로마 세포가 분화되어 하나 이상의 조혈 전구체 세포의 특성을 발현함을 기술한다. 또한, 지방-유도된 스트로마 세포가 완전하게 기능성인 다분화능 줄기세포로 탈분화되고, 다음으로 조혈 세포 계통으로 분화될 수 있음을 기술한다.
상기 요약된 업적에도 불구하고, 치료적 및 기타 적용에 사용하기 위한 조혈모세포의 풍분한 공급원에 대한 필요는 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 필요를 제공하고 충족시킨다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 지방 조직을 얻는 단계; 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(SVF)을 제조하는 단계; 및 SVF에서 비-부착 세포를 분리시키는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 조혈모세포를 분리시키는 방법을 제공하며, 여기서 비-부착 세포는 조혈모 세포를 포함한다. 바람직하게 지방 조직은 사람의 것이다. 한 양태에서, 지방 조직은 지방흡인물(lipoaspirates)로부터 수득된다.
한 양태에서, 조혈모세포는 ALDHbrSSClo 세포, CD34+ 세포, CD34+SSClo 세포, CD34+CD45+ 세포, CD34+CD38-CD41- 세포, CD34+CD45- 세포, CD34+CD38-CD41-SSClo 세포, 및 ABCG2-발현 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 양태에서, 조혈모세포는 과립구 대식세포 콜로니형성단위(CFU-GM), 적혈구의 파열 형성 단위(BFU-E) 및 과립구 적혈구 대식세포 거대핵세포 콜로니형성단위(CFU-GEMM)로 이루어진 그룹으 로부터 선택된다.
다른 양태에서, 조혈모세포를 분리하는 방법은 비-부착 세포로부터 CD34hi 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 본 방법은 비-부착 세포로부터 ALDHbr 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 한 양태에서, ALDHbr 세포는 ALDHbrSSClo이다.
본 발명은 또한, 지방 조직을 수득하는 단계; 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(SVF)을 제조하는 단계; 부착 세포로부터 SVF 중 비-부착 세포를 분리하는 단계; 및 비-부착 세포로부터 CD34+ 세포를 분리하여, 이로써 CD34+ 세포를 분리하는 단계를 포함하는, CD34+ 세포를 분리하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 지방 조직은 사람으로부터 유래된 것이다. 본 방법에 따라 분리된 CD34+ 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 여기서 CD34+ 세포는 약 1ml의 지방 조직 중 적어도 약 1 x 105의 CD34+ 세포의 비로 분리된다.
한 양태에서, 지방 조직은 지방흡인물로부터 수득된다. 한 양태에서, SVF는 적어도 약 40%의 CD34+ 세포를 포함한다. 한 양태에서, CD34+ 세포는 약 100ml의 지방 조직 중 적어도 약 1 x 107의 분리된 CD34+ 세포의 비로 분리된다.
다른 양태에서, CD34+ 세포는 CD34+SSClo 세포, CD34+CD45+ 세포, CD34hiCD38- CD41- 세포, CD34+CD38-CD41-SSClo 세포, CD34loCD45- 세포, CD34loCD45+ 세포, CD34+ALDHbr 세포 및 CD34+ALDHbrSSClo 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, CD34+ 세포를 분리하는 방법은 CD34hi 세포 또는 CD34lo 세포를 분리하는 단계를 추가 포함한다.
대상체에 조혈모세포를 제공하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 당해 방법은 도우너 대상체로부터 지방 조직을 수득하는 단계; 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(SVF)을 제조하는 단계; SVF 중 비-부착성 세포를 분리하는 단계; 비-부착 세포로부터 조혈모세포를 분리하는 단계; 및 비-부착 세포로부터 치료적으로 유효량의 세포를 투여하는 단계; 및 치료적 유효량의 조혈모세포를 치료가 필요한 수용 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 도우너 대상체와 수용 대상체는 사람이다. 한 양태에서, 도우너 대상체와 수용 대상체는 동일인이다. 다른 양태에서, 도우너 대상체와 수용 대상체는 동일인이 아니다.
조혈모세포를 제공하는 본 방법의 한 양태에서, 조혈모세포는 CD34+이고, 약 100ml의 지방 조직 중 적어도 약 1 x 107의 분리된 CD34+ 세포의 비로 분리된다.
당해 방법의 한 양태에서, 수득하는 단계는 지방흡인을 포함한다. 다른 양태에서, 분리하는 단계는 ALDHbrSSClo 세포 또는 CD34+CD38-CD41-SSClo 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
적어도 약 40%의 비-부착 스트로마 혈관 분획(SVF) CD34+를 포함하는 분리된 세포 조성물을 본원에서 제공한다. 한 양태에서, 분리된 세포는 적어도 약 20%의 CD34+CD45- 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 스트로마 혈관 분획은 사람의 지방 조직으로부터 수득된다. 한 양태에서, CD34+ 세포는 CD34+CD38-CD41-ALDHbr 세포를 포함한다. 다른 양태에서, CD34+ 세포는 CD34+CD38-CD41-SSClo 세포를 포함한다. 다른 양태에서, CD34+ 세포는 과립구 대식세포 콜로니형성단위(CFU-GM), 적혈구의 파열 형성 단위(BFU-E) 및 과립구 적혈구 대식세포 거대핵세포 콜로니형성단위(CFU-GEMM)를 포함한다. 다른 양태에서, 세포는 유적공학적으로 변형된다.
또한, 본원은 적어도 약 10%의 비-부착 스트로마 혈관 분획(SVF) ALDHbr 세포를 포함하는 분리된 세포 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 조성물은 적어도 약 15% 비-부착 SVF ALDHbr 세포를 포함한다. 한 양태에서, ALDHbr 세포는 ALDHbrSSClo 세포이다. 바람직하게, SVF는 사람 지방 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본원에서 제공된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 예시의 목적으로 본 발명의 특정 양태의 도면이 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 세밀한 양태의 배열 및 수단으로 한정되지 않는 다.
도 1은 지방 조직 비-부착 스트로마 혈관 분획(SVF)로부터 분리된 CD34+ 세포의 다양한 하위군집에 대한 유세포분석기 광 산란 데이타 도면들이다. 중앙 패널 중 4개의 박스 내 하위군집 내에 기재된 수는 당해 하위군집에 존재하는 총 세포의 백분율을 나타낸다. 2개의 좌측 및 2개의 우측 패널에서 게이트된(gated) 군집은 흑색 점으로, 비게이트된 군집은 회색 농도로 나타내었다. SSC-H= 측방 산란; FSC-H= 전방 산란.
도 2는 지방 조직 비-부착 SVF로부터 분리된 2개의 주요 군집의 CD34+ 세포(낮은 측방 산란 및 높은 측방 산란)에서 CD38 및 CD41 발현에 관한 유세포분석 데이타 도면들이다. 우측의 2개의 플롯은 낮은 측방 산란의 CD34+ 세포이다.
도 3은 지방 조직 비-부착 SVF로부터 분리된 2개의 주요 군집의 CD34+ 세포에서 CD31, CD105 및 CD90 발현에 관한 유세포분석 데이타 도면들이다. 우측의 3개의 플롯은 낮은 측방 산란의 CD34+ 세포이다.
도 4는 Methocult
Figure 112008086711814-PCT00001
(제조원: 스템 셀 테크놀로지스) 배양 14일 째 BFU-E 콜로니 사진이다. 이 콜로니는 20,000 비-부착 SVF 세포의 배양 후 관찰되었다(100X 배율).
도 5는 20,000 비-부착 SVF 세포의 배양 후 14일 째의 2개의 BFU-E 콜로니 사진이다(100X 배율).
도 6은 20,000 비-부착 SVF 세포의 배양 후 14일 째의 CFU-GM 콜로니 사진이다(100X 배율).
도 7은 20,000 비-부착 SVF 세포의 배양 후 14일 째의 CFU-GEMM 콜로니 사진이다(100X 배율).
도 8은 도 8A 및 8B를 포함하며, 비-부착 SVF 세포에서 ABCG2 발현을 보여주는 2개의 도면들이다. 도 8A는 비-부착 SVF 세포의 광 산란 특성의 플롯이다. 비-부착 SVF 세포에서 ABCG2-발현 세포는 구분된 영역(원 표시)에서 일반적으로 발견된다. 도 8B는 비-부착 SVF 세포에 대한 ABCG2 발현 그래프이다. 이 데이타는 비-부착 SVF 세포의 약 16%가 ABCG2를 발현함을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 지방 조직의 스트로마 혈관 분획(SVF) 중 비-부착 세포에, HSC 동정을 위한 중요한 마커인 CD34+ 세포, ALDHbr 세포, ALDHbrSSClo 세포 및 ABCG2-발현 세포가 풍부하다는 발견에 일부 근거한다. 더욱이, 이러한 세포는 다능성 조혈 전구체와 계통-구속(lineage-committed) 조혈 전구체를 포함하는 것으로 보인다. 본 발명은 따라서 지방 조직으로부터 조혈모세포를 분리하는 방법을 제공한다.
정의
다른 언급이 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 사용된 명칭 및 세포 배양 중 실험 공정, 분자 유전학, 유기 화학, 핵산 화학 및 하이브리드화는 당업계에 익히 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다.
표준 기술이 핵산 및 펩티드 합성에 사용된다. 당해 기술 및 공정은, 일반적으로 본원을 통해 제공되는 당업계에 통상적인 방법 및 다양한 일반적 참조문헌에 따라 수행된다[참조예: Sambrook 및 Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 및 Ausubel et al., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY].
본원에 사용된 명사는 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 나타낸다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "약"은 당업자에 의해 이해되며 당해 용어가 사용되는 내용을 기준으로 어느 정도 변할 수 있다.
본원에서, "in vitro" 및 "ex vivo"는 생물체의 체 외 조건을 나타내기 위해 호환적으로 사용된다. 따라서, in vitro 배양 및 ex vivo 배양은 모두 생물체의 바깥에서 배양함을 나타낸다.
"지방(adipose)"은 임의의 지방 조직을 나타낸다. 지방 조직은 갈색, 황색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 지방 조직은 지방세포(adipocyte) 및 스트로마(stroma)를 포함한다. 지방 조직은 동물의 체내 전체에서 발견된다. 예를 들어, 포유류에서 지방 조직은 복강, 골수, 피하 공간, 지방 비후(예: 견갑골 또는 슬개하 지방 비후) 및 주변 다수 기관 내 존재한다. 지방 조직은 지방(fat) 조직을 갖는 임의의 기관으로부터 유래할 수 있다. 사람의 편리하고 풍부한 지방 조직 공급원은 지방흡인술로부터 유래한 것이다. 그러나, 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직 분리 방법은 본 발명에서 중요한 것이 아니다.
용어 "지방 조직-유도된 세포"는 지방 조직으로부터 기원된 세포를 나타낸다. 지방 조직으로부터 수득된 세포는 원시 세포 배양, 패시지된 배양(passaged culture) 또는 불멸화된 세포주일 수 있다. 지방 조직으로부터 분리된 초기 세포 군집은 이에 제한되는 것은 아니지만 스트로마 혈관 분획(SVF) 세포를 포함하는 이종 세포 군집이다.
본원에 사용된, 용어 "지방 유도된 스트로마 세포", "지방 조직-유도된 스트로마 세포", "지방 조직-유도된 성인 스트로마(ADAS) 세포" 또는 "지방-유도된 줄기세포"(ASC)는 호환적으로 사용되며 지방 조직으로부터 유래된 스트로마 세포를 나타내며, 이는 다양한 세포 유형, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 아디포사이트, 오스테오사이트, 콘드로사이트, 근육 및 신경/아교 세포 계통에 줄기세포-유사 전구체로서 제공될 수 있다. ASC는 지방 조직으로부터 유도된 하위구조 군집으로, 이는 당업자에게 공지된 표준 배양 공정을 사용하여 지방 조직의 기타 성분으로부터 분리될 수 있다. 추가로, ASC는 당업자에게 공지된 세포 표면 마커에 기초하여 세포 혼합물로부터 분리될 수 있다.
본원에서, 용어 "지방-유도된 조혈모세포"는, 지방 조직의 스트로마 혈관 분 획에 존재하는 비-부착 세포를 나타내며, 이는 CD34+, ALDHbr, SSClo, ABCG2 발현 및 다능성 조혈 전구체 능력으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 하나 이상의 HSC 특징을 포함한다.
본원에서, "비-부착 세포"는 SVF 세포에 대한 표준 조직 배양 조건에서 조직 배양 플라스크에 부착되지 않는 세포를 나타낸다. 당업자는 SVF 세포에 대한 표준 조직 배양 조건에 친숙할 것이다.
본원에서 "ALDHbr"는 형광 생성물을 생성하는 ALDH 기질 세포에 투여 후, 고수준의 ALDH를 발현하는 밝은 세포내 형광 세포를 나타낸다. ALDHbr 세포를 검출하는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 추가로, ALDH-발현 세포의 동정에 사용된 ALDEFLUOR
Figure 112008086711814-PCT00002
키트(제조원: 스템셀 테크놀러지, 밴쿠버, BC, 캐나다)가 상업적으로 이용가능하다[참조: 미국 특허 제 5,876,956호].
용어 "전구 세포", "전구체 세포" 및 "줄기세포"는 당업계에서 호환적으로 사용되며, 본원에서는, 목적하는 세포 유형으로 분화될, 잠재적으로 스스로 재생하거나 전구체 세포를 생산하여 비제한적 개수의 유사 분열할 수 있는 다분화 또는 계통-비구속 전구체 세포 중 어느 하나를 나타낸다. 다분화 줄기세포와는 대조적으로 계통-구속 전구체 세포는 일반적으로 페노타입이 서로 다른 수많은 세포 유형을 발생시킬 수 없는 것으로 간주된다.
본원에서, 용어 "다능" 또는 "다기능성"은 하나 이상의 세포 유형으로 분화되는 줄기세포의 능력을 나타낸다.
본원에서 "생적합성"은 포유류에 이식되었을 때 포유류에서 역 반응을 일으키지 않는 임의의 물질을 나타낸다. 생적합성 물질이 개체에 도입되었을 때 개인에게 독하거나 해롭지 않으며 포유류 중에서 당해 물질은 면역학적 거부 반응을 유도하지 않는다.
본원에서 "자가조직"은 생물학적 물질이 후에 재도입될 동일한 개체로부터 유도된 물질임을 나타낸다.
본원에서, "동종의(allogenic)"는 생물학적 물질이 도입될 개체와 동일한 종의 유전적으로-상이한 개체로부터 유도된 물질을 나타낸다.
본원에서, "동계의(syngeneic)"는 물질이 도입될 개체와 유전적으로 동일한 개체(예: 일란성 쌍둥이)로부터 유도된 생물학적 물질을 나타낸다.
본원에서, 질환, 결함, 장애 또는 상태를 "경감"하는 것은 질환, 결함, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서, "치료"는 환자가 경험하는, 질환, 결함, 장애 또는 부작용 등의 증상의 빈도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서, "치료학적으로 유효량"은 조성물이 투여되는 개인에게 유리한 효과를 제공하기에 충분한 본 발명의 조성물의 양을 의미한다. 예를 들어, 개인에게 세포를 투여하는 것과 관련하여, "치료학적으로 유효량"은 세포가 투여되는 대상체에 유리한 효과를 제공하기에 충분한 세포의 양이다.
"치료적" 처치는 하나 이상의 증상을 치료하거나 경감시키기 위해 하나 이상의 병리 증상을 나타내는 환자에게 투여하는 처치이다.
본원에서, 용어 "성장 배지"는 세포의 증식을 촉진하는 배양 배지를 나타낸다. 성장 배지는 일반적으로 동물 혈청을 포함한다. 특정 예에서, 성장 배지는 동물 혈청을 포함하지 않는다.
본원에서, "분화 배지"는 줄기세포, HSC, CD34+ 세포, 지방-유도된 성인 줄기세포 또는 기타 그러한 전구체 세포와 같이 첨가제 함유 또는 첨가제 비함유 성장 배지를 나타내며, 이는 배지 내에서 배양시 완전히 분화되지 않으며 분화된 세포의 특성의 일부 또는 전부를 가진 세포로 발전한다.
본원에서, "성장 인자"는 세포의 증식, 분열 및/또는 성숙을 자극하는 성분이다. 본 발명에서 유용한 성장 인자의 비제한적 예는 에리쓰로포이에틴(EPO), 대식세포 콜로니 자극 인자, 트롬보포이에틴(TPO), 성장 호르몬(GH), 인터류킨 1-
Figure 112008086711814-PCT00003
및 1-β, 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 9(IL-9), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 11(IL-11), 인터류킨 13(IL-13), c-키트 리간드/줄기세포 인자(SCF), 인슐린, IGF-2와 같은 인슐린-유사 성장 인자, 상피 성장 인자(EGF) 및 FGF-1, FLT-3/FLK-2 리간드와 같은 섬유아세포 성장 인자(FGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를 포함한다. 성장 인자는 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준의 농도에서 일반적으로 사용된다.
본원에서, 세포의 "면역페노타입"은 세포의 표면 단백질 프로파일의 관점에서 세포의 페노타입을 나타낸다.
"분리된 세포"는 조직 또는 포유류 내에서 자연스럽게 수반되는 다른 성분 및/또는 다른 세포로부터 분리된 세포를 나타낸다.
본원에서, "실질적으로 정제된 세포"는 이의 천연 발생 상태에서 정상적으로 수반되는 다른 세포 타입으로부터 정제된 세포이다.
본원에서 "신장성(expandibility)"은 세포의 증식 능력 또는 개수 증가 능력, 세포의 군집의 경우에 군집 배가 능력을 나타낸다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건의 성장 배지에 위치되었을 때 배양에 의해 신장되어 더 큰 군집의 세포에 이른다.
본원에서 "증식"은 유사한 형태, 특히 세포의 재생산 또는 증가를 나타낸다. 즉, 증식은 더 많은 개수의 세포의 생산을 나타내며, 단지 세포 수를 세거나 세포 내 혼입된 3H-티미딘을 세는 등의 방법에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식은 배가(doubling) 시간으로 공지되어 있으며, 세포의 개수가 2배되는 데 걸리는 시간으로 일반적으로 측정된다.
본원에서, "세포 배양"은 생명체로부터 취한 세포를 조절된 조건하에서 성장시키는 과정을 나타낸다.
"일차 세포 배양"은 유기체로부터 직접 취한 세포, 조직 또는 기관을 처음 하위배양(subculture) 전 배양하는 것을 나타낸다.
본원에서, "하위배양"은 하나의 성장 용기에서 다른 성장 용기로 세포를 이동시키는 것을 말한다.
본원에서 "패시지(passage)"는 하위 배양의 라운드를 나타낸다. 따라서, 세포가 하위배양되었을 때, 이들은 패시지되었다고 말한다. 특정 군집의 세포 또는 세포주는 때때로 패시지된 시간 수로 나타내거나 특징지어진다. 예를 들어, 10회 패시지된 배양된 세포 군집은 P10 배양으로 표현될 수 있다. 일차 배양, 즉, 처음 배양은 조직으로부터 세포의 분리를 수반하며 P0이다. 일차 배양 후, 세포는 이차 배양(P1 또는 패시지 1)로 기술된다. 이차 하위배양 후, 세포는 삼차 배양(P2 또는 패시지 2) 등이 된다. 당업자는 패시지 기간 동안에 복수 군집의 배가가 있을 수 있음을 이해할 것이다; 따라서 배양 군집의 배가 수는 패시지 수보다 크다. 패시지 사이의 기간 동안 세포의 신장(즉, 군집 배가의 수)은 여러 인자, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 시딩(seeding) 밀도, 기질, 배지 및 패시지 사이 시간에 따라 달라진다.
본원에서, 용어 "비-면역원성"은 in vitro 림프구 혼합 배양 반응(MLR) 또는 in vivo에서 T 세포의 증식을 유도하지 않는 세포의 특성을 나타낸다.
본원에서, "조직 공학"은 조직 대체 또는 재건의 용도를 위해 ex vivo에서 조직을 생성시키는 과정을 나타낸다. 조직 공학은 세포, 유전자 또는 기타 생물학적 빌딩 블럭을 바이오공학 물질 및 기술과 함께 혼입시킴으로써 조직 및 기관을 회복 또는 대체하는 접근법을 포함하는 "재생 의약"의 한 예이다.
본원에서, "내인성"은 기관, 세포 또는 시스템 내 존재하거나 생성되는 임의의 물질을 말한다.
"외인성"은 기관, 세포 또는 시스템 내로 도입되거나 기관, 세포 또는 시스 템 외부에서 생산된 임의의 물질을 말한다.
본원에서 용어 "페노타입 특징"은 하나 이상의 다음 특징을 나타내기 위한 것이다: 형태학적 외관, 특정 단백질 발현, 염색 패턴, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 원형질 염색 패턴, 특정 세포 관련 효소 활성 및 물질로 염색되는 능력.
"인코딩"은 생물학적 과정에서 정해진 서열의 뉴클레오티드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정해진 아미노산 서열 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 기타 중합체 및 거대분자의 합성에 템플릿으로 제공되는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은, 폴리뉴클레오티드에서 특정 서열의 뉴클레오티드의, 고유 특성을 나타낸다. 따라서, 세포 또는 기타 생물학적 시스템 내에서 유전자가 당해 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역으로 단백질을 생산한다면, 당해 유전자는 단백질을 인코딩한다.
코딩 스트랜드, 즉, mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 리스트로 제공되는 뉴클레오티드 서열과, 유전자 또는 cDNA의 전사에 템플릿으로 사용되는 비-코딩 스트랜드 모두가, 단백질 또는, 당해 유전자 또는 cDNA의 기타 생성물을 인코딩하는 것으로 언급될 수 있다.
특정 언급이 없다면, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 상호 변질 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"분리된 핵산"은 본래 발생한 상태의 서열로부터 분리된 핵산 단편 또는 조각을 나타내며, 즉, 정상적으로 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편이며, 여기서 서열은 자연적으로 발생하는 게놈 내에서 당해 단편에 인접하는 서열이다. 당해 용어는, 핵산, 즉, RNA 또는 DNA 또는 단백질을 자연스럽게 포함하는 세포 내 존재하는 기타 성분으로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용된다. 따라서, 당해 용어는 예를 들어, 벡터; 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵 또는 진핵 세포의 게놈 DNA 내 혼입되거나 다른 서열에 독립적인 별개 분자(즉, PCR 또는 제한 효소 소화에 의해 제조된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 발명의 내용에서, 핵산 염기에 대해 일반적인 다음 약자가 사용된다. "A"는 아데노신; "C"는 시토신; "G"는 구아노신; "T"는 티미딘; 및 "U"는 우리딘을 나타낸다.
본원에 사용된 표현 "전사 조절 하에서" 또는 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 프로모터가 폴리뉴클레오티드의 RNA 폴리메라제 개시 및 발현을 조절하도록 폴리뉴클레오티드에 대해 정확한 위치 및 방향에 있음을 나타낸다.
본원에서, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 특정 예에서, 당해 서열은 코어(core) 프로모터 서열일 수 있으며, 다른 예에서 당해 서열은 인핸서 서열 및 유전자 생성물의 발현에 필요한 기타 조절 요소를 또한 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성" 프로모터는 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건에서 유전자 생성물이 세포 내 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도" 프로모터는 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도자가 세포 내 존재할 때만 세포 내에서 유전자 생성물이 제조되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이적" 프로모터는 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 세포 내에서 당해 유전자 생성물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하는 물질의 조합으로 분리된 핵산을 세포 내부에 전달하는 데 사용될 수 있다. 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양쪽성 화합물과 조합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율적으로 복사하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 당해 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 이동을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리라이신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 이해된다. 바 이러스 벡터의 예는 이에 제한되는 되는 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다.
"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하며, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 in vitro 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업자에게 공지된 모든 것, 예를 들어 코스미드, 플라스미드(즉, 네이키드 또는 리포좀 내 함유된) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스를 포함한다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"는 자연적으로는 함께 조합되지 않는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 증폭되거나 조합된 재조합 폴리뉴클레오티드가 적합한 벡터 내 포함될 수 있으며, 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 물론 비-코딩 기능(예: 프로모터, 복제원, 리보좀-결합 부위 등)을 제공할 수 있다.
본원에서, "혈액 장애"는, 부족하거나 의학적으로 유의하게 감소된 개수의, 하나 이상 유형의 성숙, 기능성 혈액 세포, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 단핵구, 대식세포, 중산구, 호염구, 호산구, T-세포, B-세포, NK-세포, 적혈구, 거대핵세포 및 수지상 세포를 갖는 만성 또는 급성의 임의의 상태를 나타낸다. 당해 상태는 만성이거나 급성일 수 있다. 그러한 상태를 일으키는 원인은 공지되었을 수 있으며, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 화학적으로-유도되거나 유전적으로-유도된 것이거나, 또는 원인이 비공지되거나 불확실(즉, 특발성)한 것 일 수 있다. 혈액 장애는 하나 이상 유형의 성숙 혈액 세포의 불충분한 개수를 수반하거나 그러한 불충분한 개수가 특징인 과증식성 장애 및 저증식성 장애를 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 조성물의 생리학적 성분과 양립할 수 있으며, 수용자에게 해롭지 않은 임의의 담체, 희석제 또는 부형제를 나타낸다.
발명의 설명
본 발명에서, 많은 양의 CD34+ 세포, ALDHbr 세포 및 ABCG2-발현 세포가 지방 조직으로부터 수득됨이 밝혀졌다. 추가로, 수득된 세포가 HSC의 다양한 하위군집을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 하위군집의 비제한적 예로는 ALDHbrSSClo 세포, CD34+SSClo 세포, CD34+ALDHbr 세포, CD34+CD38-CD41- 세포, CD34+CD38- CD41-ALDHbr 세포, CD34+CD38-CD41-SSClo 세포, CD34+CD45- 세포 및 CD34+CD45+ 세포 및 CD34+ALDHbrSSClo 세포를 포함한다. 추가로, 수득된 CD34+ 세포는 다양한 다능성 조혈 전구체 및 계통-구속 조혈 전구체를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 지방 조직으로부터 HSC를 포함하는, CD34+ 세포, ALDHbr세포 또는 ABCG2-발현 세포의 군집을 고수율로 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 방법에 의해 분리된 HSC를 포함하는 CD34+ 세포, ALDHbr세포 또는 ABCG2-발현 세포의 조성물을 추가 로 제공하며, 당해 조성물은 일차 배양으로 HSC가 매우 풍부한 군집을 수득한다. 본 발명은 추가로 HSC가 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 유리하게, 따라서 본 발명의 방법 및 조성물은 치료적 처치에 사용되기 전에, HSC를 포함하는 분리된 CD34+ 세포, ALDHbr세포 또는 ABCG2-발현 세포를 신장할 필요성을 감소시키거나 배제시킨다.
지방 조직은 다능성 조혈모세포의 공급원으로서, 골수 또는 제대혈의 유리한 대체물을 제공한다. 지방 조직은 다수의 개인으로부터 용이하게 이용할 수 있으며 또한 풍부하다. 실제로, 비만은 미국에서 만연하는 비율의 병적 상태로, 여기서 성인의 50% 이상이 신장 및 체중을 기준으로 한 권장 신체 체중 기준(BMI)를 초과한다. 지방 조직은 외래 환자를 대상으로 지방 흡인(liposuction)하여 채집될 수 있다. 지방 흡인은 대다수의 환자에서 허용될 수 있으며 미용 효과를 갖는 최소의 비-침투적 과정이다. 더욱이, 지방 세포(adipocyte)가 재공급될 수 있는 세포 군집임이 잘 보고된다. 실제로, 동일 부위에서 시간 경과에 따라 개인의 지방 세포가 재현되는 것을 일반적으로 관찰할 수 있다. 따라서, 지방 조직 제거의 초기 미용 효과를 기대하지 않는 사람도 지방 흡인 과정에 순응적이다.
통상의 공급원, 예를 들어 골수, 말초 혈액 및 제대혈과는 현저하게 대조적으로, 지방 조직은 CD34+ 세포, ALDHbr세포 또는 ABCG2-발현 세포의 풍부한 공급원인 것으로 밝혀졌다. 특히, 사람 지방조직으로부터 수득된 SVF 세포는, HSC를 포함하는 적어도 약 5%이고 가능하게 적어도 약 10%인 CD34+ 세포를 포함하는 것으로 본원 에서 밝혀졌다. 추가로, 비-부착 SVF 세포의 적어도 약 40% 내지 약 60%가 CD34+ 세포임이 밝혀졌다. 비-부착 SVF 세포의 적어도 약 10% 내지 약 20%가 ALDHbr세포인 것으로 밝혀졌다. 또한, 비-부착 SVF 세포의 적어도 약 10% 내지 약 20%가 ABCG2-발현 세포인 것으로 밝혀졌다. 위와 같은 고비율은 HSC를 포함하는 현저하게 높은 수율의 CD34+ 세포, ALDHbr세포 또는 ABCG2-발현 세포가 생성되게 하며, 이는 지방 조직의 적당한 양으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 한 양태에서, 예를 들어 적어도 약 1×107의 CD34+ 세포가 지방 흡인 과정에서 약 100ml의 지방 조직으로부터 분리될 수 있다. 대조적으로, 골수 또는 제대혈 100ml로 약 1-2×106 CD34+ 세포만이 일반적으로 수득된다.
일반적인 미용 목적의 지방 흡인 과정은 약 3 내지 약 4L의 지방흡인물을 발생시킨다. 본 발명의 방법을 사용하여, 지방 조직의 이러한 양은 연장된 배양이나 신장없이도 적어도 약 3-4×108의 CD34+ 세포를 잠재적으로 수득할 수 있다. 전형적인 HSC 이식 과정에서, 체중 1Kg 당 약 2×106의 CD34+ 세포가 신속한 이식을 달성하기 위해 수용자 내 주입되는 것이 필요하다. 따라서, 100kg의 사람의 경우 약 2×108의 CD34+ 세포가 필요하다. 따라서, 1회 지방 흡인 흡입물로부터 수득량은 평균-사이즈 성인을 치료하고 이식하는 데 잠재적으로 충분한 양이다. 결과적으로, 지방 조직은 현재까지 확인된 HSC의 공급원 중 가장 임상적으로 적당하고 풍부 한 공급원이 될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다수 유용한 적용 분야에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 치료적 적용에 충분한 개수의 HSC를 얻기 위해 신장이나 다수의 패시지를 할 필요없이, HSC를 포함하는 다량의 CD34+ 세포의 제조, HSC를 포함하는 다량의 ALDHbr세포의 제조 또는 HSC를 포함하는 다량의 ABCG2-발현 세포를 신속하게 제조하는 데 유용하다. 지방-유도된 조혈모세포의 조성물은 개인에서 혈액 장애를 경감시키거나 치료하기 위한 치료적 방법에 사용될 수 있다. 당해 조성물 및 방법은 또한, 연구 목적, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, HSC의 신장이나 분화에 영향을 미치는 화합물의 동정에 사용될 수 있다.
I. 지방 조직으로부터 HSC의 분리
본 발명에 유용한 지방 조직은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 임의의 포유류로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 방법에서 지방 조직의 공급원으로 유용한 포유류는 이에 제한되는 것은 아니지만, 소, 양, 염소, 개, 말, 고양이, 사람 제외 영장류 및 사람을 포함한다. 바람직하게, 지방 조직은 영장류로부터 분리되며, 더욱 바람직하게는 사람으로부터 분리된다. 바람직하게, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 지방 조직의 바람직한 공급원은 망(omental) 지방이다. 사람에서, 지방은 일반적으로 지방흡인에 의해 분리된다. 본 발명의 세포가 사람 대상체에 이식되는 경우, 지방 조직은 자가 조직 이식으로 제공되기 위해 동일한 대상체로부터 분리되거나, 동계 이식으로 제공되기 위해 유전적으로 동일한 형제(예: 일란성 쌍둥이)로부터 분리되는 것이 바람직하다. 또는, 투여된 HSC는 동종계일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 지방-유도된 HSC는 SVF의 비-부착 세포인 CD34+ 세포를 분리함으로써 분리된다. 다른 양태에서, HSC는 SVF의 비-부착 세포 ALDHbr을 분리함으로써 지방조직으로부터 분리된다. 한 양태에서, 지방-유도된 HSC를 포함하는 ALDHbrSSClo 비-부착 SVF 세포를 분리한다. 다른 양태에서, 지방-유도된 HSC는 ABCG2-발현, SVF의 비-부착 세포를 분리함으로써 분리된다.
지방 조직으로부터 SVF를 제조하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 방법은 본원에 내용 전체가 혼입되는 미국 특허 제6,153,432호에 기술되어 있다. 일반적으로, 지방 조직을 0.01 내지 0.5% 농도, 바람직하게 0.04 내지 0.3%, 가장 바람직하게 약 0.2%의 콜라게나제, 0.01 내지 0.5%, 바람직하게 0.04%, 가장 바람직하게 약 0.2%의 농도의 트립신; 및/또는 0.5ng/ml 내지 10ng/ml 농도의 디스파제; 및/또는 유효 농도의 히알루로니다제 또는 DNase; 및 약 0.01 내지 2.0mM, 바람직하게 약 0.1 내지 약 1.0mM, 가장 바람직하게 0.53mM의 농도의 에틸렌디아민테트라-아세트산(EDTA)으로 25 내지 50℃, 바람직하게 33 내지 40℃, 가장 바람직하게 37℃에서, 10 분 내지 3시간, 바람직하게 30분 내지 1시간, 가장 바람직하게 45분 동안 처리한다. 선택적으로, 세포를 20 미크론 내지 800 미크론, 더욱 바람직하게 40 내지 400 미크론, 가장 바람직하게 70 미크론의 나일론 또는 치즈클로쓰(cheesecloth) 메쉬 필터를 통과시킨다. 다음으로, 세포를 배지에서 직접 차등적 원심분리하거나 피콜(Ficoll) 또는 퍼콜(Percoll) 또는 기타 입자 경사상에 위치시킨다. 세포를 100 내지 3000Xg의 속도로, 더욱 바람직하게 200 내지 1500Xg, 가장 바람직하게 500Xg의 속도로 1분 내지 1시간, 더욱 바람직하게 2 내지 15분, 가장 바람직하게 5분 동안, 4℃ 내지 50℃, 바람직하게 20℃ 내지 40℃, 가장 바람직하게 약 25℃에서 원심분리한다. 이러한 세포 팰릿(pellet)은 SVF이다. 당해 SVF 세포 펠릿을 평편배양하여 비-부착 세포를 수득한다.
SVF의 비-부착 세포는 시간의 기간 동안 배양 기구에서 스트로마 세포 배지 중 SVF 세포를 일차로 배양함으로써 분리된다. "시간의 기간"은 in vitro에서 세포를 배양하고 부착 세포를 부착시키기에 적합한 임의의 시간일 수 있다. 한 양태에서, 시간의 기간은 약 12 시간이다. 바람직한 양태에서, 시간의 기간은 24시간이다. 배양 기구는 in vitro에서 세포를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 임의의 배양 기구일 수 있다. 바람직한 배양 기구는 배양 플라스크이며, 더욱 바람직하게는 T-225 배양 플라스크이다. 배양 밀도는 cm2 당 약 10,000 세포 내지 약 100,000 세포의 범위일 수 있다. 한 양태에서, 세포를 cm2 당 약 50,000 세포 및 당해 세포수 사이의 모든 정수로 배양 플라스크에서 평편배양시킨다. 그러나, 본 발명은 당해 배양 밀도에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 통상의 실험을 통해 적합한 배양 밀도를 정할 수 있다.
HSC를 포함하는 비-부착 세포는 배양 중 임의의 시간에 배양 기구로부터 채집될 수 있다. 비-부착 세포를 채집하는 비-제한적인 방법은 배양 기구로부터 액상 배지를 철수시키는 방법을 포함한다. 당해 배지는 SVF 세포의 배양 중 임의의 시간에 대체될 수 있다; 비-부착 SVF 세포를 포함하는 제거된 배지(및 따라서 HSC)는 일차 패시지 트립신화까지 날마다 채집될 수 있다. 바람직하게 스트로마 세포 배지는 3 내지 4일마다 교체된다.
바람직하다면, 부착 분획 중 존재하는 지방 조직-유도된 스트로마 세포(ASC)는 또한 배양 기구로부터 채집될 수 있다. 당해 ASC는 즉시 사용되거나 저온 보존(cryopreserve)되어 후에 사용되기 위해 저장될 수 있다. 지방 조직-유도된 스트로마 세포는 트립신화, EDTA 처리 또는, 배양 기구로부터 부착 세포를 채집하는 데 사용되는 임의의 기타 공정에 의해 채집될 수 있다. 지방 조직-유도된 스트로마 세포는 HSC 수용 대상체에 투여되어, 예를 들어 HSC의 이식을 돕는 조혈 보조 세포를 공급할 수 있다.
HSC는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 특화될 수 있다. HSC의 면역페노타입은 독특한 HSC 동정화제로서 제공되기 위해 연구될 수 있다. 즉, 관심 세포 상 독특한 세포 표면 마커가, 지방 조직으로부터 유도된 혼합된 군집 세포로부터 세포의 특이적 하위-군집을 분리하는 데 사용될 수 있다. HSC의 페노타입 마커는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 문헌에 다수 기재되어 있다. 추가의 페노타입 마커가 계속 기술되거나 과도한 실험없이도 동정될 수 있다. HSC에 특이적인 특정 페노타입 마커는 CD34, CD45, CD38lo/-, CD41 및 ABCG2를 포함한다. HSC의 기타 특성은 높은 알데하이드 탈수소효소(ALDHbr) 활성과 낮은 측방 산란(SSClo)이다. HSC의 기타 마커 및 다양한 조혈 구속된 계통은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD32, CD51, CD52, CD53, CD56, CD57, CD60, CD61, CD62L, CD65, CD72, CD73, CD81, CD82, CD83, CD90, CD99, CD1OO, CD117, TCR, P-셀렉틴, HLA-DR 등을 포함한다. 당업자는 공지된 색체계, 형광, 면역화학, 중합효소 연쇄 반응, 화학적 또는 라디오화학적 방법에 의해 계통 특이적 마커 또는 효소적 활성의 부존재 또는 존재를 용이하게 확인할 수 있음을 인정할 것이다.
바람직하게, 지방-유도된 HSC는 CD34의 세포 표면 발현, 높은 ALDH 활성(ALDHbr), 광 산란 특성(예: SSClo) 및/또는 ABCG2 발현이 특징이다. SVF로부터 분리된 비-부착 세포가 적어도 약 10% CD34+ 세포, 바람직하게 적어도 약 20%의 CD34+ 세포 및 더욱 바람직하게 적어도 약 40% CD34+ 세포를 포함한다. SVF로부터 분리된 비-부착 세포는 적어도 약 10% ALDHbr세포, 바람직하게 적어도 약 15% ALDHbr세포 및 더욱 바람직하게 적어도 약 20% ALDHbr세포를 포함한다. SVF로부터 분리된 비-부착 세포는 적어도 약 10% ABCG2-발현 세포, 바람직하게 적어도 약 15% ABCG2-발현 세포 및 더욱 바람직하게 적어도 약 20% ABCG2-발현 세포를 포함한다.
추가로, 당업자는 세포 표면 마커에 특이적인 항체가 물리적 지지체(즉, 스 트렙타비딘 비드)에 접합(conjugating)되어, 특이적 세포 표면 마커를 갖는 HSC를 결합 및 분리하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. HSC에 특이적으로 결합하는 항체의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만 항-CD34+ 항체를 포함한다. 결합 후, 결합된 HSC는, 예를 들어, 자석 막대, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 Dynabeads
Figure 112008086711814-PCT00004
(제조원: Dynal Biotech, 위스콘주, 브라운 디어)를 사용한 자석 분리에 의해 잔여 세포로부터 분리될 수 있다. Dynabeads
Figure 112008086711814-PCT00005
의 사용에 추가하여, MACS 분리 시약(제조원: Miltenyi Biotec, 캘리포니아주, 오번)이 혼합된 세포 군집으로부터 HSC를 제거하는 데 사용될 수 있다. 또는, 면역페노타입, 광 산란 특성 및/또는 HSC를 검출하기 위한 HSC-특이적 효소 생성물의 존재로 유세포분석기 세포 분류기(flow cytometry-based cell sorter)를 사용하여 분류할 수 있다. 분리 단계 또는 세포 분류의 결과로, HSC가 풍부한, CD34+ 세포, ALDHbr세포 및/또는 ABCG2-발현 세포 군집이 수득된다. 한 양태에서, HSC 군집은 정제된 세포 군집이다. 분리된 HSC는 추가 신장없이 치료적 적용을 위해 즉시 사용되거나 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 저온저장되거나 본원에 기술된 방법 또는 통상의 방법을 사용하여 in vitro에서 배양, 신장 및 임의 분화될 수 있다.
HSC는 또한 다능성의 계통-구속된 조혈 전구체를 측정하기 위해 콜로니 형성 검사를 실시함이 특징이다. 콜로니 형성 검사를 실시하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게, SVF로부터 분리된 비-부착 세포 중 HSC는 과립구 대식세포 콜로니형성단위(CFU-GM), 적혈구의 파열 형성 단위(BFU-E) 및 과립구 적혈구 대식세포 거대핵세포 콜로니형성단위(CFU-GEMM)를 포함한다.
ASC를 배양하기에 유용한 배지는 본원에서 "스트로마 세포 배지"라 칭한다. HSC를 배양하기에 유용한 배지를 본원에서 "조혈모세포 배지"라 칭한다. 세포 배양 중 섬유아세포(fibroblast)를 지지할 수 있는 임의의 배지가, 스트로마 세포 배지, 조혈모세포 배지 또는 ASC 및 HSC의 공배양 배지로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 스트로마 세포 배지 또는 조혈모세포 배지는 기본 배지, 혈청 및 항생제/항진균제를 포함한다. 스트로마 세포 배지의 비제한적 예로는 DMEM/F 12 햄, 10% 소태아 혈청(FBS), 100U/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신(펜-스트렙) 및 0.25㎍/ml 암프토테리신 B를 포함하는 배지이다. 조혈모세포 배지의 비제한적 예는 DMEM, 10% 소태아 혈청(FBS), 4mM의 L-글루타민, 50mg/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신 및 100ng/ml의 각각의 Flt-3 리간드, 줄기세포 인자 및 거대핵세포 성장 및 발전 인자(MGDF)를 포함하는 배지이다. 조혈모세포 배지의 다른 예는 2% FBS를 함유하는 이스코브(Iscove) 배지이다. 이 배지는 예를 들어 CFU 검사를 위해 세포를 희석하는 데 유용하다. 그러나, ASC 및 HSC는 항생제 및/또는 항진균제를 포함하지 않는, 하나 이상의 성장 인자, 사이토킨 또는 호르몬으로 보충된 기본 배지에서 배양될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 HSC의 분리 및 증식에 유용한 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 당해 배지는 또한 ASC의 분리 및 증식에 유용하다. 본 발명의 방법에서 유용한 기본 배지의 비제한적 예는 최소 필수 배지 이글, ADC-1, LPM (알부민 비함유 소혈청), F1O(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(피튼-잭 슨 개질제 함유 및 비함유), 기본 배지 이글(얼(Earle)의 염 베이스 추가된 BME), 둘베코의 개질된 이글 배지(혈청 비함유 DMEM), 야만(Yamane), IMEM-20, 글라스고 (glasgow) 개질 이글 배지(GMEM), 리보비츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 M199 (얼의 세일 베이스 함유 M199E), 배지 M199 (한크의 염 베이스 함유 M199H), 최소 필수 배지 이글(얼의 염 베이스 함유 MEM-E), 최소 필수 배지 이글(한크의 염 베이스 함유 MEM-H), 및 최소 필수 배지 이글(비필수아미노산 함유 MEM-NAA), 다수의 기타 중, 예를 들어, 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, 윌리암의 G, 뉴만 & 타이텔, 히구치, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 배지는 DMEM이다. 이러한 및 기타 유용한 배지가 기타 제조사 중에서 깁코사(미국, 뉴저지주, 그랜스 아일랜드) 및 바이오라지컬 인더스트리즈(이스라엘, 벳 하멕)로부터 구입될 수 있다. 다수의 이러한 배지가 문헌[참조: Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, 저자: William B. Jakoby 및 Ira H. Pastan, 출판사: Academic Press, Inc. Sigma-Aldrich, StemCell Technologies, StemGenix, Mabio 및 Quality Biological Inc., among others]에 방법이 요약되어 있으며, 조혈모세포의 증식을 위한 독점적 배지를 제공한다.
본 발명에서 유용한 혈청은 이에 제한되는 것은 아니지만, 소 또는 기타 종의 태아혈청을 적어도 1% 내지 약 30%, 바람직하게 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게 약 10%의 농도로 포함한다. 닭 또는 기타 종의 태아 추출물이 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게 약 10%의 농도 로 존재할 수 있다. 사람에 대한 특정 치료적 양태에서, 비-사람 혈청의 사용은 혈청 중 우연의 감염성 오염물의 가능한 전달로 인한 안정성 위험으로 인해 바람직하지 않을 수 있다. 숙련된 의료 수행자는 치료적 적용을 위한 HSC의 의학적으로 적합한 취급에 친숙하다.
"성장 인자, 사이토킨, 호르몬"은 다음 특정 인자를 나타내고자 하며, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 에리쓰로포이에틴(EPO), 대식세포 콜로니 자극 인자, 트롬보포이에틴(TPO), 성장 호르몬(GH), 인터류킨 1-
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및 1-β, 인터류킨 3(IL-3), 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 9(IL-9), 인터류킨 10(IL-10), 인터류킨 11(IL-11), 인터류킨 13(IL-13), c-키트 리간드/줄기세포 인자(SCF), 인슐린, IGF-2와 같은 인슐린-유사 성장 인자, 백혈병 억제 인자(LIF), 대식세포 억제 단백질 1
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(MIP 1
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), 표피 성장 인자(EGF) 및 FGF-1, FLT-3/FLK-2 리간드와 같은 섬유아세포 성장인자(FGF), 거대핵세포 성장 및 발전 인자(MGDF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를, 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml의 농도로 포함한다. HSC의 신장에 유용한 인자는 이에 제한되는 것은 아니지만 IL-3, SCF, FLT-3/FLK-2 리간드, IL-6 및 GM-CSF을 포함한다. HSC가 치료적 적용을 위해 사람에게 투여되는 경우, 배지 중 임의의 성장 인자, 사이토킨 및/또는 호르몬은 바람직하게 사람이다.
또한, 배양 배지 중 추가의 성분이 첨가될 수 있음이 인정된다. 그러한 성분은, 항생제, 항진균제, 알부민, 아미노산 및 기타 세포의 배양을 위해 당업자에 게 공지된 성분일 수 있다. 추가적으로, 성분은 분화 과정을 개선시키기 위해 첨가될 수 있다. 배지 내 첨가될 수 있는 항생제는 이에 제한되는 것은 아니지만 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한다. 배양 배지 중 페니실린의 농도는 ml 당 약 10 내지 약 200 유닛이다. 배양 배지 중 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200㎍/ml이다. 그러나, 본 발명은 스트로마 세포 및/또는 HSC의 배양을 위해 특정 하나의 배지에 제한되지 않는다. 오히려, 조직 배양에서 지방 조직 SVF 세포 및 HSC를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다.
본원에서 분리된 바와 같은 지방-유도된 HSC는 통상적 방법에 따라 저온 보관될 수 있다. 바람직하게, 약 백만 내지 천만개의 세포가 액상 N2의 증기상에서 10% DMSO를 함유하는 스트로마 세포 배지 중 저온 보관된다. 냉동된 세포를 37℃의 수조에서 회전시켜 해동하고 신선한 성장 배지 중 재현탁하고 전술한 바와 같이 신장시킬 수 있다.
II. HSC의 사용
본 발명의 방법에 의해 수득된 지방-유도된 HSC는 HSC를 사용하는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 사용될 수 있다. 추가적으로 HSC는 아직 밝혀지지 않은 방법 및 조성물로 사용될 수 있다. HSC를 사용하는 한 방법은 HSC가 필요한 수용 대상체에게 이를 투여하는 것이다.
수용 대상체는 임의의 포유류, 예를 들어, 말, 염소, 소, 개, 양, 고양이, 사람 외 영장류 및 사람일 수 있다. 바람직하게, 수용 대상체는 사람이다. 이식을 위한 HSC를 수득하는 데 사용된 지방 조직의 공급원은 치료의 수용 대상체의 것(자가 조직 이식)과 동일하거나 도우너 대상체의 것일 수 있다. 도우너 대상체는 수용 대상체와 유전적으로 동일하거나(동계 이식), 동일한 종의 유전적으로 동일하지 않은 대상체일 수 있다(동종계 이식).
기술된 세포의 주입으로 치료될 수 있는 장애는 이에 제한되는 것은 아니지만, 정상적인 혈액 세포 생산 및 성숙의 기능 이상이 원인인 질환(즉, 재생불량성 빈혈 및 저증식성 줄기세포 장애)을 포함한다. HSC의 투여로 결함있는 내인성 혈액 세포 생산 및 성숙을 보충하거나 대체하고자 한다. 그러한 장애는 일반적으로 조혈 기관의 종양 및 악성 질환(예: 백혈병 및 림프종); 비-조혈 기원의 넓은 스펙트럼의 악성 고형 종양; 자가면역 이상; 또는 유전적 장애일 수 있다. 그러한 장애는 이에 제한되는 것은 아니지만 정상 혈액 세포 생산 및 성숙의 기능 부전 또는 기능 이상이 원인인 질환, 과증식성 줄기세포 장애, 예를 들어 재생 불량성 빈혈, 범혈구감소증, 무과립구증, 혈소판감소증, 적혈구계 무형성증, 약물, 방사선 조사 또는 감염으로 인한 블랙팬-다이아몬드(Blackfan-Diamond) 증후군, 특발성; 급성 림프구성(림프성) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 악성 골수경화증, 다발성 골수종, 진성 적혈구 증가증, 원인불명의 골수화생(agnogenic myelometaplasia), 왈덴스트롬 거대글로불린혈증, 홉킨스 림프종, 비-홉킨스 림프종을 포함한 조혈 악성 종양; 악성 흑색종, 위암, 난소암, 유방암, 소세포 폐암, 망막모세포종, 고환암, 교모세포종, 횡문근육종, 신경모세포종, 유잉육종, 림프종을 포함한 악성 고형 종양 환자에서 면역억제; 류마티스 관절염, I형 당뇨병, 만성 간염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스를 포함한 자가면역 질환; 빈혈, 가족성 무형증, 판코니 증후군, 디하이드로엽산 환원효소 결핍증, 포름아미노 전이효소 결핍증, 레쉬-니한 증후군, 선천성 적혈구이형성 증후군 I-IV, 차치맨-다이아몬드 증후군(Chwachmann-Diamond syndrome), 선천성 구상적혈구증, 선천성 타원적혈구증, 선천성 스토마토시토시스, 선천성 Rh 부재 질환, 발작성 야간 혈색뇨증, G6PD (글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제) 변이 1, 2, 3, 피루베이트 키나제 결핍증, 선천성 에리쓰로포이에틴 과민성, 결핍증, 겸상구 질환 및 형질, 탈라세미아 알파, 베타, 감마, 메트-헤모글로빈혈증, 면역의 선천성 장애, 중증의 결합된 면역결핍 질환(SCID), 베어 림프구 증후군, 면역 결핍증과 결합된 ionophore-반응, 선천성 면역 장애, 캡핑 비정상과 결합된 면역결핍, 뉴클레오사이드 포스포릴라제 결핍증, 과립구 액틴 결핍증, 유아성 무과립세포증, 가우셔 질환, 아데노신 데아미나제 결핍증, 코스트맨 증후군, 망상형성이상증, 선천성 백혈구 기능이상 증후군을 포함한 자가면역 질환; 및 골다공증, 골수경화증, 후천성 용혈성 빈혈, 후천성 면역결핍증, 원발성 또는 속발성 면역결핍증을 일으키는 감염성 질환, 박테리아성 감염(예: 브루셀라증, 리스테리아증, 결핵, 나병), 원충성 감염(예: 말라리아, 리슈마니아증), 진균성 감염, 림프구 세포 셋트 중 이상비율 관련 장애, 및 노화로 인한 손상된 면역 기능, 파고사이트 장애, 코스트맨 무과립구증, 만성 육아종성 장애, 체디아크-히가시(Chediak-Higachi) 증후군, 호중구 액틴 결핍증, 호중구 막 GP-180 결핍증, 대사 저장 질환, 뮤코다당체침착증, 뮤코지방증, 면 역 메카니즘이 관여된 기타 장애, 비스콕-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 알파 1-안티트립신 결핍증 등을 포함한다.
세포는 수용 대상체에 매우 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 방법은 비경구, 복강내, 정맥내, 경피내, 경막외, 척수내, 스테마내(intrastemal), 관절내, 활막내, 지주막하, 동맥내, 심장내, 근육내, 비강내, 피하, 안구내, 관절낭내, 국소, 경피 팻치, 직장, 좌약을 통한 질 또는 요도 투여, 피하, 비강 스프레이, 수술적 임플란트, 내부 수술적 페인트, 주입 펌프 또는 카데터를 통해서이다. 한 양태에서, 약제 및 담체는 직접 조직 주입 또는 볼러스(bolus), 이식, 마이크로입자, 마이크로구, 나노입자 또는 나노구와 같이 서방 (slow release) 제형으로 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 방법은 정맥내 주입니다. 골수 이식의 방법이 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 문헌, 예를 들어, 미국특허 제4,678,470호 및 미국특허 제5,571,083호는 신체 내 임의의 해부학적 위치에 세포를 이식하는 방법에 대해 교시한다.
본 발명의 세포를 사람 내 이식하기 위해, 전술한 바와 같이 세포를 분리된다. 분리된 HSC는 이식을 위해 의학적으로 필요한 임의의 방법으로 후속 처리될 수 있다. 선택적으로, T-세포와 같은 세포가 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 HSC로부터 제거된다. 이러한 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 계수유속 원심 유출기, 대두 응집/E-로셋트 형성, 밀도 경사 원심분리 및 면역학적 감소(depletion)를 포함한다. 암 치료의 일부로서 자가조직 이식을 위한 종양 세포의 제거 방법이 당업자에게 또한 공지되어 있다.
바람직하게, 이식되는 세포는 이식 대상체 유래 세포(자가조직 이식)이다. 세포가 당해 환자 유래가 아닌 경우(동종계 이식), 도우너 세포와 환자 사이의 혈액형 또는 하플로타입 적합성이 일반적으로 측정된다. 당업계에서 숙련된 의사는 동종 이식에서 적합성 문제에 친숙하다.
100 Kg 환자 당 약 105 및 약 1013 사이의 CD34+ 세포, ALDHbr세포 및/또는 ABCG2-발현 세포가 사람에게 투여된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1.5×106 내지 약 1.5×1012 세포가 투여된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×108 내지 약 5×1011 세포가 투여된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×109 내지 약 2×1011 세포가 투여된다. 다른 양태에서, 환자 100kg 당 약 5×108 내지 약 1×1010 세포가 투여된다. 세포는 다양한 방법, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 주입 및 정맥 내 투여에 의해 사람에게 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 세포의 단독 투여가 제공된다. 특정 양태에서, 수회 투여가 제공된다. 특정 양태에서, 수회 투여는 3 내지 7일의 연속적 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 3 내지 7일 투여는 3 내지 7일 연속적 기간 동안 제공된다. 다른 양태에서, 5회 투여는 5일의 연속적 기간 동안 제공된다.
특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 105 내지 약 1013 세포가 1회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1.5×108 내지 약 1.5×1012 세포가 1회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×108 내지 약 5×1011 세포가 1회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×109 내지 약 1×1010 세포가 1회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×1010 세포가 1회 투여로 제공된다.
특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 105 내지 약 1013 세포가 수회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1.5×108 내지 약 1.5×1012 세포가 수회 투여로 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 1×108 내지 약 5×1011 세포가 3 내지 7일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 4×109 세포의 수회 투여가 3 내지 7일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 환자 100kg 당 약 2×1011 세포의 수회 투여가 3 내지 7일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 약 3.5×109 세포의 5회 투여가 5일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 약 4×109 세포의 5회 투여가 5일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 약 1.3×1011 세포의 5회 투여가 5일의 연속된 기간 동안 제공된다. 특정 양태에서, 약 2×1011 세포의 5회 투여가 5일의 연속된 기간 동안 제공된다.
다른 양태에서, HSC를 투여 전에 성장 인자, 사이토킨 또는 호르몬으로 처리하여 특정 분화된 상태로 구속을 유도한다. 지방-유도된 HSC는 in vitro에서 본원에서 언급한 분화 인자 및 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 세포를 처리함으로써 분화될 수 있다.
부분적으로 또는 말기 분화된 세포는, 특정 말기 분화된 상태의 HSC의 계통 구속을 지시하는, 표면 및 세포 내 단백질, 유전자 및/또는 기타 마커의 동정이 특징이다. 당해 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, (a) 유속세포측정법의 사용을 포함하여, 이차 형광 태그를 사용하여 연결된 단백질 특이적 모노클론 항체를 사용하는 면역-형광법에 의해 세포 표면 단백질의 검출; (b) 유속세포측정법의 사용을 포함하여, 이차 형광 태그를 사용하여 단백질 특이적 모노클론 항체를 사용한 면역형광법에 의한 세포내 단백질 검출; (c) 중합효소 연쇄 반응, 인 시튜 하이브리드화 및/또는 노던 블럿(northern blot) 분석에 의한 세포 유전자 검출을 포함한다.
다른 양태에서, 지방-유도된 스트로마 세포(ASC)가 또한 수용 대상체에 투여되어 HSC의 이식을 돕는 조혈 보조 세포를 제공한다. ASC는 HSC와 함께 투여되거나 HSC 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. ASC는 HSC에 대해 제공된 유사한 투여 지침서를 사용하여 투여될 수 있다.
III. 유전자 변형
다른 양태에서, 본 발명의 지방-유도된 HSC는 유전적으로 변형되어 외인성 유전자 또는 코딩 서열이 발현되거나 내인성 유전자의 발현이 억제 또는 변경된다. 이러한 유전자 변형으로 HSC가 대상체에 투여될 때 치료적 이점을 가질 수 있다. 또는, 유전자 변형은 예를 들어 당해 유전적으로 변형된 지방-유도된 HSC를 대상체에 이식 후 당해 변형된 세포를 추적하거나 동정하는 수단을 제공할 수 있다. 세포를 추적한다는 것은 이식된 유전자 변형 세포의 이동, 동화 및 생존을 추적함을 포함할 수 있다. 유전자 변형은 또한 적어도 제2 유전자를 포함할 수 있다. 제2 유전자는 예를 들어 선택적인 항체-저항성 유전자 또는 다른 선택적 마커를 코딩할 수 있다.
세포를 추적하기에 유용한 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만 녹색 형광 단백질(GFP), 임의의 다른 형광 단백질(예: 개선된 녹색, 시안, 황색, 청색 및 적색 형광 단백질; 제조원: 클론테크, 캘리포니아, 팔로 알토) 또는 기타 태그 단백질(예: LacZ, FLAG-태그, Myc, His6, 등)을 포함한다.
본 발명의 세포의 이동, 분화 및 융합의 추적은 벡터 또는 바이러스로부터 발현된 검출가능한 분자를 사용하는 것으로 한정되지 않는다. 세포의 이동, 융합 및 분화는 이식된 HSC의 국소화를 허용하는 일련의 프로브를 사용하여 측정될 수 있다. 이식된 세포의 추적은 추가로 본원에서 기술된 세포-특이적 마커에 대한 항체 또는 핵산 프로브에 의해 달성될 수 있다.
유전자 변형된 HSC의 치료적 용도는 이에 제한되는 것은 아니지만, 환자에서 결핍되거나 기능이상의 돌연변이된 단백질의 발현을 제공하는 것을 포함한다. 예를 들어, HSC는 겸상적혈구증 치료를 위해 유전자 변형되어 헤모글로빈 S 대신 또 는 이에 추가하여 헤모글로빈 A를 제공한다. ex vivo에서 유전자 변형된 HSC를 사용한 유전자 치료의 기타 비제한적 후보는, 탈라세미아 및 X-연결된 중증 결합된 면역결핍이다. 목적하는 분리된 핵산을 발현하는 세포가, 분리된 핵산의 생성물을 다른 세포, 조직, 또는 전체 포유류에게 제공하는 데 사용할 수 있으며, 여기서 고수준의 당해 유전자 생성물이 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료하거나 경감하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 목적하는 서열을 코딩하는 분리된 핵산을 발현하는 HSC을 포함하며, 여기서 목적하는 단백질의 증가된 발현, 단백질 수준 및/또는 활성 증가가 조혈계 관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료하거나 경감하는 데 유용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 분리된 핵산이 도입되고, 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 발현될 때, 당해 단백질이 세포 내에서 이전에는 존재 또는 발현되지 않았으나 트랜스유전자가 도입되기 전보다 상이한 수준 또는 상이한 환경에서 발현되는 것이 이점이 있는 HSC를 포함한다. 이러한 이점은, 목적하는 핵산의 발현이 실험실 또는 당해 세포가 존재하는 포유류에서 in vitro 연구될 수 있는 시스템이 제공된다는 사실을 포함할 수 있으며, 당해 시스템에서 도입된 핵산을 포함하는 세포는 연구, 진단 및 치료 툴로서 사용될 수 있으며, 포유류 모델은 선택된 질환 상태에서 새로운 진단 및 치료 툴의 개발에 유용한 것을 생성시킨다.
따라서, 본 발명은 세포 내 외인성 DNA 발현을 위해 외인성 DNA를 HSC내로 도입하기 위한 발현 벡터 및 방법을 포함한다. 당업자는 발현 벡터를 생성시키고 이로써 세포를 형질전환시키는 기술에 친숙하다[참조예: Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)].
발현 벡터는 세포에 발현 카셋트를 전달하기에 적합한 유전자 벡터이다. 원하는 목적 분야에 따라서, 임의의 당해 벡터가 사용되어 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다(예: 플라스미드, 네이키드 DNA, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스, 레트로바이러스 등). 목적하는 발현 카셋트를 벡터 내 구현시키는 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 이 중 다수가 당업자에게 공지된 것으로, 예를 들어, 직접 클로닝, 상동 재조합 등이 있다. 목적하는 벡터는 벡터를 세포에 도입시키는 데 사용된 방법을 주로 결정하며, 일반적으로 이는 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 기술은 원형질체융합법, 칼슘-포스페이트 침전, 유전자 건(gun), 전기영동, 포토포레이션(photoporation), DEAE 덱스트란 또는 지질 담체 매개된 형질전환, 및 바이러스 벡터로 감염을 포함한다.
발현 벡터는 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터에 작동적으로 연결되어 발현되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카셋트를 포함한다. 발현되는 뉴클레오티드 서열은 단백질을 코딩할 수 있거나 생물학적으로 활성 RNA, 예를 들어 안티센스 RNA, siRNA 또는 리보자임을 코딩할 수 있다. 따라서, 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 독성에 저항성, 호르몬(예: 펩티드 성장 호르몬, 호르몬 방출 인자 및 인터페론, 인터류킨 및 림포카인과 같은 사이토킨), 세포 표면-결합된 세 포 내 신호화 잔기(예: 세포-부착 분자 및 호르몬 수용체) 및 주어진 계통 분화를 촉진하는 인자 또는 기타 임의의 코딩 서열을 부여하는 유전자를 코딩할 수 있다.
적합한 프로모터의 예는 원핵 프로모터 및 바이러스 프로모터(예: 레트로바이러스 ITR, LTR, 헤르페스바이러스 프로모터 IEp(예: ICP4-IEp 및 ICPO-IEEp), 시토메갈로바이러스(CMV) IEp와 같은 즉시 초기 바이러스 프로모터(IEp) 및 라우스육종 바이러스(RSV) 프로모터와 같은 기타 바이러스 프로모터 및 뮤린 류케미아 바이러스(MLV) 프로모터)를 포함한다. 기타 적합한 프로모터는 진핵 프로모터로, 예를 들어 인핸서(예: 토끼 β-글로빈 조절 요소), 구조적으로 활성 프로모터(예: β-액틴 프로모터 등), 신호 특이적 프로모터(예: RU486에 반응하는 프로모터와 같은 유도성 프로모터 등) 및 조직-특이적 프로모터이다. 이미 정해진 세포 내용물에서 유전자 발현 유도에 적합한 프로모터를 선택하는 것은 당업자에게 익숙한 것이다. 발현 카셋트는 하나 이상의 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 필요한 경우 기타 요소(예: 폴리아데닐화 서열, 막-삽입 신호 또는 분비 리더를 코딩하는 서열, 리보솜 엔트리 서열, 전사 조절 요소(예: 인핸서, 사일렌서 등) 등)를 포함할 수 있다.
실험적 실시예
본 발명은 다음 실험적 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기술된다. 당해 실시예는 예시의 목적을 위해 제공되는 것으로 다른 언급이 없다면 발명을 이에 제한시키고자 함이 아니다. 따라서, 본 발명은 다음 실시예로 한정되는 것으로 해석해서는 안되고 본원에서 기술된 교시의 결과임이 분명해지는 임의의 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 지방흡인물 지방 조직으로부터 조혈모세포의 분리
미용상 이유로 사람 대상체에 대해 실시한 지방 흡인 지방흡인물로부터 지방 조직을 수득하였다. 50ml의 지방 흡인물을 50ml PBS(인산 완충된 식염수)와 혼합하고 지방 아래 수성 층을 흡인함으로써 세척하였다. 세척액이 담황색이 될때까지 세포 현탁액을 PBS로 2회 이상 세척하였다. 수성 세척액을 풀링(pooling)하고 "흡인물 세척후 팰릿"(APWP)으로 보관하였다. 50ml PBS와 1% 소 혈청 알부민(BSA)에 용해된 50ml의 95mg 콜라게나제를 세척된 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 T-185 플라스크로 이동시켰다. 플라스크를 Belly Dancer
Figure 112008086711814-PCT00009
세이커 (제조원: 스토발 라이프 사이언스, Greensboro, NC) 상에서 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.
용해된 지방을 약 550 × g (1600 rpm)에서 6분 동안 원심분리하였다. 최상단 지방 층, 약 10 내지 20ml를 따라부었다. 세포 팰릿을 잔여 상청액 중 재현탁시키고 100 마이크로미터의 세포 여과기에 부어 잔사를 제거하였다. 통과한 여액을 약 550 × g (1600 rpm)에서 6분 동안 원심분리하여 세포를 팰릿화하였다. 상청액을 제거하였다.
세포 펠릿을 적혈구 세포 파괴 완충액(제조원: eBioscience)에 현탁시켰다. 현탁된 세포를 3분 동안 얼음 위에 위치시키고, 다음으로, 약 550 × g (1600 rpm)에서 6분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다(후속의 작업은 적혈구 세포 파괴 단계가 SVF로부터 HSC를 분리하는 데 있어 필요하거나 바람직하지 않음을 보 여준다).
세포 펠릿을 PBS에 현탁시켜 세포를 세척하고, 당해 세포를 전술한 바와 같이 팰릿화하였다. 다음으로, 팰릿을 5ml의 배양 배지(10% 소태아 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 항생제 및 ml 당 0.25 ㎍의 암프토테리신 B이 보충된 DMEM/F12 햄) 중 현탁시켰다. 이 세포가 "비-분류된(unfractionated) SVF"이다.
비-분류된 SVF 세포를 계수하고 트립판 블루 배제를 사용하여 생존력을 측정하였다. 다음으로 세포를 T-185 플라스크에서 cm2 당 대략 50,000개의 세포가 살아있는 상태에서 평편배양하였다.
플라스크를 5% CO2에서 37℃의 인큐베이터 내에서 배양하였다. 24시간 후, 비-부착 세포를 포함하는 배양 배지를 제거하고 신선한 배양 배지로 교체하였다. 비-부착 세포 분획을 "비-부착 SVF"로서 보관하였다.
비-부착 SVF 세포의 표면 면역타입은 유세포분석에 의해 특화되었다. HSC의 전통적인 마커인 CD34 및 CD45의 발현이 일차로 조사되었다. 도 1의 중앙 패널에서 도시된 바와 같이, 당해 지방 조직 샘플로부터의 비-부착 SVF 세포의 약 40.88%가 HSC의 익히 공지된 마커인 CD34+를 발현하는 것으로 관찰되었다(다른 도우너 유래 지방 조직으로의 실험에서는 비-부착 SVF 세포의 약 50% 내지 약 60%가 CD34+를 발현하는 것으로 관찰되었다). 이러한 데이타는 사람 지방 조직 약 100ml로부터 적어도 약 1×107 CD34+ 세포의 수득율이 가능함을 보여준다.
다수의 CD34+ 하위군집이 비-부착 SVF 군집에서 관찰되었다. 대표적 도우너에서 관찰된 2개의 구별되는 측방 산란 군집은, 낮은 CD34lo 및 높은 CD34hi이었다. CD34hi 세포는 비-부착 SVF 세포의 약 27.2%(23% + 4.29%)를 포함하였고, CD34lo는 약 13.59%(8.88%+4.71%)를 포함하였다. CD34hiCD45-의 군집은 당해 세포의 약 23%를 포함하였다. CD34loCD45-의 군집은 비-부착 SVF 세포의 약 8.88%를 포함하였다. CD34+CD45+의 군집은 비-부착 SVF 세포의 약 9%(4.29%+4.71%)를 포함하였다.
또한, 백-게이팅(back-gating)을 실시하여 다양한 CD34+ 하위군집의 전방 및 측방 산란을 조사하였다. 이러한 분석으로 몇몇의 구별되는 측방 산란 그룹이 존재함을 확인하였다(도 1의 좌측 2개의 패널 및 우측 2개의 패널 참조). CD34hi 군집(최상단 좌측 및 최상단 우측 패널)이 CD34lo 군집(좌측 아래 및 우측 아래 패널)에 비해 낮은 측방 산란(SSClo)을 갖는 것으로 관찰되었다. 낮은 측방 산란은 조혈모세포 군집과 일반적으로 관련이 있다.
CD38 및 CD41은 CD34+ 세포의 하위군집을 동정하는 데 사용되는 세포 표면 마커로 개선된 HSC 이식을 예측하는 데 적당하게 사용된다. CD41 발현은 조혈의 개시를 나타내며 또한 혼합된 CD34+ 세포의 군집 중에서 상피성 전구체(CD34+CD41+ 세포)와 HSC(CD34+CD38-CD41- 세포)를 구별하는 데 사용된다. 도 2에 도시된 바와 같이(좌측 2개의 패널), 비-부착 SVF 군집의 약 13%를 포함하는 높은 측방 산란 CD34+ 군집이 유의한 개수의 CD41+ 세포를 함유하였다. 특히, 낮은 측방 산란 CD34+ 군집(비-부착 SVF 군집의 ~16%)은 HSC의 전형적 면역페노타입과 일치하게 CD38 및 CD41 모두의 발현이 부족하였다.
광 산란 획득 점 플롯에서 CD34+ 세포의 2개의 주요 군집을 동정한 후, 상피(CD31) 또는 스트로마 마커(CD105 및 CD90)가 CD34와 함께 발현되는 지 여부를 알아보기 위해 당해 세포를 각각 게이팅(gating)하였다. CD90이 또한 조혈 세포에서 발현될 수 있으나 엔도긴(endogin)(CD105)이 독점적인 스트로마 계통 마커이다. 도 3에 도시한 바와 같이, 다양한 수준의 공-발현 및 계통 음성 군집이 낮은 측방 산란을 가진 CD34+ 세포 및 높은 측방 산란을 가진 CD34+ 세포에서 관찰되었다. CD31 및 CD105는 CD34+ HSC 상에서 발현되는 않는 것으로 예상된다. CD34+ CD31+ 세포 및 CD34+ CD105+ 세포가 상피 및 스트로마 세포 계통일 것이다.
따라서, 비-부착 SVF 세포는 이종의 혼합물 내, CD34+SSClo 군집, CD34+SSClo 군집, CD34hiSSClo 군집, CD34hiCD38-CD41-SSClo 군집; CD34loCD45- 군집; 및 CD34loCD45+ 군집을 포함한, 다수 편성(permutation)의 상이한 페노타입의 마커 발현을 포함한 다. 또한, HSC와 또한 관련된 마커인 c-kit(CD117)의 발현이 비-부착 SVF 세포의 약 2-3%에서 관찰되었다.
또 다른 HSC 마커인 ABCG2의 발현이 비-부착 SVF 세포의 약 16%에서 관찰되었다(도 8B). 유리하게도, 밝은 ABCG2 형광을 갖는 비-부착 SVF 세포가 구별되는(discrete) 광 산란 프로파일을 갖는다. 도 8A에서, 전체 세포의 약 25%를 차지하는 원 표시된 세포는 밝은 ABCG2 형광을 갖는 세포를 포함한다. 이러한 특징으로 인해 단지 광 산란 데이터에만 기초하고 항체의 사용이나 임의의 기타 화학적 조작없이 당해 세포를 풍부하게 하는 것의 가능성을 보여준다. 따라서, 비-부착 SVF는 골수-유도된 HSC에 견줄만한 면역페노타입 및 분화 가능성을 보여주는 세포를 포함한다.
콜로니 형성 단위 검사는 특정 계통 전구체의 빈도를 정량하기 위해 제한 희석법을 사용한다. "흡인물 세척 후 팰릿(pellet)"(APWP), "비분류된 SVF" 및 "비-부착 SVF"로 라벨링된 세포의 별개 군집을 Methocult
Figure 112008086711814-PCT00010
배지(제조원: 스템셀 테크놀러지스, 캐나다, 밴쿠버)에서 평편배양하여 조혈 콜로니 형성 전구체의 존재를 검사하였다. 다양한 세포 분획물을 2개의 세포 농도, 즉 ml 당 25,000개 세포 및 ml 당 50,000 세포수로 평편배양하였다. 1.1ml 분취량의 Methocult 배지 세포 현탁액을 중복된 35mm 배양 디쉬에 첨가하였다. 배양 14일 후, 플레이트 당 CFU의 수를 계수하고 분석하여 BFU-E, CFU-GM 및 CFU-GEMM 콜로니의 빈도를 관찰하였다. 당해 실험 결과를 표 1에 나타낸다.
검사된 세개의 세포 군집 각각에서 BFU-E, CFU-GM 및 CFU-GEMM를 포함한 모 든 세 유형의 콜로니가 관찰되었으나, 가장 높은 빈도수로 관찰된 것은 "비-부착 SVF" 군집이었다. 도 4 내지 7은 비-부착 SVF 세포에서 관찰된 대표적 콜로니를 보여준다. 도 4 및 5는 40× 확대에서 관찰된 BFU-E 콜로니를 보여준다. 도 6은 CFU-GM 콜로니를, 도 7는 CFU-GEMM 콜로니를 보여준다.
APWP SVF 비-부착 SVF
BFU-E 1:25,000 1:2,000 1:600
CFU-GM 관찰되지 않음 1:7,000 1:5,000
CFU-GEMM 관찰되지 않음 1:50,000 1:25,000
참조: APWP= 흡인물 세척 후 펠릿; BFU-E= 적혈구의 파열 형성 단위; GM=과립구, 대식세포; GEMM= 과립구, 적혈구, 대식세포, 거대핵세포
또한 조혈 하위군집의 동정에 알데하이드 탈수소효소(ALDH)의 발현이 사용되었다. 지방흡인 흡인물의 스트로마 혈관 분획의 비-부착 군집 내 잠재적 조혈 하위군집을 동정하기 위해 ALDH 활성 및 PCR 검사 분석을 실시하였다. 예비 데이타는 ALDHbrSSClo 군집이 비-부착 SVF 세포 군집의 약 17%를 포함함을 보여준다.
실시예 2: 지방-유도된 HSC를 사용한 골수 재증식 검사
실시예 1에서 수득된 사람 지방 조직-유도된 조혈모세포를 대상으로 골수 재증식 검사에 근거한 조혈 분화에 대해 시험하였다. 면역결핍 SCID 또는 누드/베이지 마우스에 11 Gy의
Figure 112008086711814-PCT00011
-선의 분할량을 치사적 방사선 조사하고 산성화된 물 및 오토클레이브 음식으로의 식사를 유지하였다. 뮤린 기원(107 골수-유도된 세포)시 이식 조혈 세포 당 약 107 세포의 양, 또는 사람 기원(106 지방-유도된 HSC 또는 106 SVF 세포)시 이식 당 약 106 세포의 양으로 조혈 세포를 분리하고, 마우스에 16시간 도입한 후 꼬리 정맥이나 후안와 정맥 또는 복강을 통해 주입하여 치사적 조사를 행하였다. 또는, 치명적 방사선 조사량 미만으로 조사된 숙주 동물에게 이식하기 전에 사람 세포를 뮤린 조혈 세포와 약 1:10의 비율로 혼합하여 경쟁적 재증식을 검사하였다. 동물은 메톡시플루란 마취 하에서 수혈되었다.
이식 후 6주 내지 12주 후, 혈액을 수용 동물로부터 채집하고, 사람 조혈 세포 마커, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, Thy 1 (T 세포 마커), B220 (B 세포 마커), Mac 1 (대식세포 마커), 및 HLA (H-2K, 사람 마커)에 특이적인 단일 항체의 유세포분석을 실시하였다. 사람 대 뮤린 기원의 총 말초 조혈 세포 백분율을 측정하였다. 유사한 연구에서, 수용 마우스로부터 골수 및 비장을 채집하고 특정 조혈 계통의 in vitro 클론원성 검사를 시행하였다. 당해 연구에서는 메틸세룰로스 콜로니계 검사를 활용하였다. 세포를 특정 계통 구속에 대해 유사한 면역형광법을 사용하여 분석하였다.
실시예 3: 지방-유도된 HSC를 사용한 골수 재증식 검사
개인 도우너 유래 사람 지방 조직은 지방 흡인에 의해 분리되고, 지방-유도된 HSC는 전술한 방법에 의해 in vitro에서 분리된다. 당해 세포를 약 5일 이하의 기간 동안 일차 배양하고 다음으로 37℃에서 10% 소태아혈청, 5% 계란 추출물, 줄기세포 인자, fit-3 리간드 및 항생제를 함유하는 이스코브 배지에서 초기 평편배양하였다.
세포는 고용량의 화학 요법 후의 조혈 장애와 같은 조혈 장애 환자에게 즉시 사용되거나 도우너 또는 조직 적합성있는 수용자에게 급하게 의학적으로 필요한 경우의 장래 사용을 위해 저온저장된다. 지방-유도된 HSC는 골수 기능 및 면역 적격성을 심각하게 훼손하는 임의의 사건, 예를 들어 화학요법 또는 방사선요법 후 자가 이식 또는 동종 이식으로 수용자에게 주입된다. 지방-유도된 HSC는 형광 라벨로 표지되어 의사가 이식 후 이의 말로를 추적하게 한다. 증가된 골수 회복의 증거가, 유세포분석법에 기초한 말초 혈액 스트림에서 새롭게 합성되는 조혈 세포(림프구 세포, 미엘로이드 세포, 적혈구 세포 및 혈소판)의 검출에 근거하여 모니터링된다.
본원에서 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 참조에 의해 이들 전체가 본원에 혼입된다.
본 발명은 특정 양태로 기술되어 있으나, 본 발명의 진정한 정신과 범위를 벗어나지 않는 본 발명의 기타 양태 및 변화가 당업자에 의해 도출될 수 있음은 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 그러한 양태 및 균등 변화물을 포함시키고자 한다.

Claims (38)

  1. 지방 조직을 수득하는 단계,
    수득된 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(stromal vascular fraction)(SVF)을 제조하는 단계, 및
    SVF 중 비-부착 세포를 분리하는 단계를 포함하며, 당해 비-부착 세포는 조혈모세포를 포함하고 있는, 지방 조직으로부터 조혈모세포를 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 지방 조직을 수득하는 단계가 지방흡인을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 지방 조직의 사람 유래인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조혈모세포가, ALDHbrSSClo 세포, CD34+ 세포, CD34+SSClo 세포, CD34+CD45+ 세포, CD34+CD38-CD41- 세포, CD34+CD45- 세포, CD34+CD38-CD41-SSClo 세포 및 ABCG-발현 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 비-부착 세포로부터 CD34hi 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 비-부착 세포로부터 ALDHbr 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, ALDHbr 세포가 ALDHbrSSClo인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 조혈모세포가, 과립구 대식세포 콜로니-형성 단위(CFU-GM), 적혈구의 파열-형성 단위(BFU-E) 및 과립구 적혈구 대식세포 거대핵세포 콜로니-형성 단위(CFU-GEMM)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 지방 조직을 수득하는 단계,
    수득된 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(SVF)을 제조하는 단계, SVF 중 부착 세포로부터 비-부착 세포를 분리시키는 단계, 및
    비-부착 세포로부터 CD34+ 세포를 분리하여 이로써 CD34+ 세포를 분리시키는 단계를 포함하는, CD34+ 세포의 분리 방법.
  10. 제9항에 있어서, SVF가 적어도 약 40%의 CD34+ 세포를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, CD34+ 세포가 지방 조직 약 100ml 중 적어도 약 1×107 개 의 분리된 CD34+ 세포의 비율로 분리되는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 지방 조직을 수득하는 단계가 지방흡인을 포함하는, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 지방 조직이 사람 유래인, 방법.
  14. 제9항에 있어서, CD34+ 세포가, CD34+SSClo 세포, CD34+CD45+ 세포, CD34hiCD38-CD41- 세포, CD34+CD38-CD41-SSClo 세포, CD34loCD45- 세포, CD34loCD45+ 세포, CD34+ALDHbr 세포 및 CD34+ALDHbrSSClo 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제9항에 있어서, CD34hi 세포 또는 CD34lo 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제9항에 따른 방법에 따라 분리된 CD34+ 세포를 포함하는 조성물로, 여기서 CD34+ 세포가 지방 조직 약 1ml 중 적어도 약 1×105 개의 분리된 CD34+ 세포의 비율로 분리된 것인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 지방 조직이 사람 유래인, 조성물.
  18. 도우너(donor) 대상체로부터 지방 조직을 수득하는 단계,
    수득된 지방 조직으로부터 스트로마 혈관 분획(SVF)을 제조하는 단계,
    SVF 중 비-부착 세포를 분리시키는 단계,
    비-부착 세포로부터 조혈모세포를 분리시키는 단계, 및
    치료적 유효량의 조혈모세포를 이를 필요로 하는 수용(recipient) 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조혈모세포를 대상체에 제공하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 도우너 대상체 및 수용 대상체가 사람인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 도우너 대상체 및 수용 대상체가 동일인인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 도우너 대상체 및 수용 대상체가 동일인이 아닌, 방법.
  22. 제18항에 있어서, 조혈모세포가, CD34+ 이고 지방 조직 약 100ml 중 적어도 약 1×107 개의 분리된 CD34+ 세포의 비율로 분리된, 방법.
  23. 제20항에 있어서, 지방 조직을 수득하는 단계가 지방흡인을 포함하는, 방법.
  24. 제18항에 있어서, 분리 단계가, ALDHbrSSClo 세포 또는 CD34+CD38-CD41-SSClo 세포를 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 적어도 약 40%의 비-부착된 스트로마 혈관 분획(SVF) CD34+ 세포를 포함하는, 분리된 세포의 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 분리된 세포가, 적어도 약 20%의 CD34+CD45- 세포를 포함하는, 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 스트로마 혈관 분획이 사람의 지방 조직으로부터 수득된 것인, 조성물.
  28. 제25항에 있어서, CD34+ 세포가 CD34+CD38-CD41-ALDHbr 세포를 포함하는, 조성물.
  29. 제25항에 있어서, CD34+ 세포가 CD34+CD38-CD41-SSClo 세포를 포함하는, 조성물.
  30. 제25항에 있어서, CD34+ 세포가, 과립구 대식세포 콜로니-형성 단위(CFU-GM), 적혈구의 파열-형성 단위(BFU-E) 및 과립구 적혈구 대식세포 거대핵세포 콜로니-형성 단위(CFU-GEMM)를 포함하는, 조성물.
  31. 제25항에 있어서, 상기 세포가 유전적으로 변형된, 조성물.
  32. 적어도 약 10%의 비-부착된 스트로마 혈관 분획(SVF) ALDHbr 세포를 포함하는, 분리된 세포의 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 적어도 약 15%의 비-부착된 SVF ALDHbr 세포를 포함하는 조성물.
  34. 제32항에 있어서, ALDHbr 세포가 ALDHbrSSClo 세포인 조성물.
  35. 제32항에 있어서, SVF가 사람의 지방 조직으로부터 수득된 것인, 조성물.
  36. 제16항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 제25항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 제32항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
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