KR20090009212A

KR20090009212A - 자궁내막 증식에 대한 바이오마커

Info

Publication number: KR20090009212A
Application number: KR1020087026231A
Authority: KR
Inventors: 마리아 보바디야; 살라-디느 쉬부; 앙드레 코르디에
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2009-01-22
Also published as: WO2007128429A1; JP2009535023A; EP2016417A1; AU2007247497A1; CA2648165A1; BRPI0710912A2; CN101427139A; MX2008013789A; GB0608483D0

Abstract

본 발명은 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 조성물 또는 키트 및 어레이에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대상에서의 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애의 진단 방법에 관한 것이다.

자궁내막 증식, 바이오마커, 에스트로겐, 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM)

Description

자궁내막 증식에 대한 바이오마커 {BIOMARKERS FOR ENDOMETRIAL PROLIFERATION}

본 발명은 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 조성물 또는 키트 및 어레이에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대상에서의 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인와 관련된 장애의 진단 방법에 관한 것이다.

자궁내막은 자궁의 안쪽을 이루는 공동(空洞)의 점막이다. 난소 호르몬의 영향 하에, 자궁내막에서의 필수적인 해부학적 및 기능적 변화가 일어난다.

따라서, 생리적 조건 하에, 자궁내막은 호르몬 제어 하에 두꺼워지고, 임신이 발생하지 않으면, 월경기간 동안 탈락되고, 여성의 생식 수명 전반에 걸쳐 각각의 월경 주기에 재생된다. 월경 주기의 제5일까지, 자궁내막은 기질 및 샘의 증식을 나타내고, 샘은 연장된다. 샘의 안쪽을 이루는 세포는 명확한 제한적인 막과 함께 입방형이고 기질 세포는 얇고 방추형이며, 이는 초기 증식기를 가리킨다. 1주일 후, 제12일에는, 샘이 매우 크고, 이제 팽창되며, 이는 후기 증식기를 가리킨다. 이러한 단계에서, 혈관이 또한 두드러지고 모세혈관이 팽창된다. 이러한 증 식성 변화는 이러한 시기에 난소에서 분비되는 에스트로겐, 특히 17-β-에스트라디올의 영향으로 인한 것이다. 배란 후, 황체가 다량의 프로게스테론을 생산하고, 이는 샘에서의 분비성 변화 및 기질 세포의 팽윤을 유도한다. 풍부한 혈액 공급이 존재하고, 모세혈관이 굴모양이 된다. 28일 주기의 마지막 무렵에, 기질은 더욱 더 혈관성 및 부종성이 되고, 작은 출혈 및 혈전이 나타나며, 호르몬 지지의 철회로 인해 자궁내막이 결국 파괴된다. 자궁내막의 표면층이, 혈액 및 백혈구와 함께, 탈락 및 배출되고, 이는 월경을 가리킨다. 하루나 이틀 내에, 벗겨진(raw) 표면이 샘의 기저 부분으로부터의 상피 증식에 의해 아문다.

그러나, 장애가 있는 자궁내막 증식이 자궁내막증, 샘근육증, 자궁내막 과다형성 및 부인과 암이 포함되는 여러 부인과 질환과 관련될 수 있다.

자궁내막 증식에서 수반되는 생리학적 및 병리생리학적 메커니즘에 관해 지금까지 거의 알려져 있지 않다. 또한, 자궁내막 증식과 관련된 질환의 효율적인 치료법 및/또는 예방이 현재까지 확립되지 않았다.

이러한 생리학적 및 병리생리학적 메커니즘 및 이에 수반되는 유전자 및 단백질의 기능의 통찰은 자궁내막 증식의 진단 및 예후에 대한 도구를 제공할 것이고, 따라서 자궁내막 증식과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 도구를 제공할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 대상의 자궁내막 증식 단계를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 목표는 샘플 내의 에스트로겐 및/또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM) 에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 방법을 제공함으로써 본 발명에 따라 달성된다.

놀랍게도, 여러 유전자가 에스트로겐 및 SERM에 의해 조정되는 것으로 확인되었고, 이때 상기 유전자의 상기 조정은 자궁내막 증식을 유도하는 에스트로겐 및/또는 SERM의 상이한 잠재력과 상관된다.

에스트로겐은 정상적인 성(性) 발달 및 여성 생식 기관 예컨대 자궁내막의 기능수행에 필수적인 스테로이드 호르몬이다. 에스트로겐에는 뼈 및 심장에 대한 중요한 비-생식성 효과가 또한 있다. 에스트로겐은 천연 및 합성 물질의 군을 포함한다. 천연 에스트로겐에는 에스트라디올 (즉, 17β-에스트라디올), 에스트론 및 에스트리올이 포함된다. 특히 17β- 에스트라디올의 영향 하에, 자궁내막의 증식이 일어난다. 17β-에스트라디올은 자기 자신의 수용체, 뿐만 아니라 프로게스테론 수용체의 합성을 유도한다. 따라서, 자궁내막이 주기의 초기 절반, 즉 증식기에 증식되어, 특정 두께의 자궁내막이 초래되고, 이는 최대 8 내지 10 ㎜에 도달한다. 천연 에스트로겐 이외에, 에스트로겐은 예를 들어 에티닐 에스트라디올, 접합된 에스트로겐 또는 디에틸스틸베스트롤과 같은 접합체의 형태로 치료적으로 종종 제공된다.

에스트로겐에 응답성인 신체 내의 조직은 "에스트로겐-민감성" 또는 "에스트로겐-응답성" 조직으로 칭해지고, 비뇨생식기 관, 심혈관계 및 골격계의 세포를 포함한다. 에스트로겐-민감성 조직을 이루는 세포는 에스트로겐 수용체 (ER)를 함유한다. ER은 알파 유형 또는 베타 유형일 수 있다. 에스트로겐이 세포에 진입하여 이같은 세포의 세포질 내의 ER에 결합하고, 에스트로겐-ER 복합체가 형성된다. 수용체에 결합하는 에스트로겐과 같은 분자는 "리간드"로 명명된다.

일단 에스트로겐 리간드가 ER에 결합하면, 에스트로겐-ER 복합체가 세포의 핵으로 이동하고, "에스트로겐 응답 요소"로 칭해지는, 세포 게놈 내의 DNA의 특정 서열에 결합한다. 이같은 에스트로겐 응답 요소는 세포 핵 내의 특정 유전자의 프로모터 내에 위치한다.

에스트로겐-ER 복합체가 에스트로겐-응답성 요소에 결합하는 것은 특정 유전자의 전사의 활성화 또는 억제를 야기한다. 특정 유전자 전사의 활성화 또는 억제는 리간드-수용체 복합체의 형성으로부터 초래될 수 있는 분자성 및/또는 세포성 응답의 한 유형이다. 이같은 응답이 발생했을 때, 수용체는 "활성화"된 것으로 언급된다.

따라서, 에스트로겐-ER 복합체는 이러한 유전자들의 발현을 조절하는 전사 인자로서 작용한다. 리간드가 수용체에 결합하고, 분자성 및/또는 세포성 응답 (예를 들어, 유전자의 전사 조절)이 발생했을 때, 이같은 리간드는 "작동제"로 지칭되고, 생성된 응답은 "작동(agonism)"으로 칭해진다.

에스트로겐 및 ER이 세포 조직의 정상적인 발달 및 기능수행에서 작용하는 역할에 더하여, 에스트로겐 및 ER은 특정 인간 질환 상태, 예컨대 증강된 자궁내막 증식, 자궁내막증, 부인과 암 예컨대 유방암 등에서 중요한 역할을 한다.

ER에 결합하고, 에스트로겐에 의해 야기되는 분자성 및/또는 세포성 응답을 방지하는 물질에게 "선택적 에스트로겐 수용체 조정인자" 또는 SERM라는 일반명이 주어진다. SERM은 "항-에스트로겐"으로 또한 칭해질 수 있다. SERM은 상이한 응답을 일으키는 ER 리간드를 포함한다. 예를 들어, 한 특정 SERM은 길항제일 수 있다. 또다른 특정 SERM은 부분적인 작동제일 수 있다. 또다른 특정 SERM은 ER에 결합하여, 에스트로겐에 의해 생성되는 응답보다 크기가 약간 작은 분자성 및/또는 세포성 응답을 생성한다. 이같은 SERM은 부분적 작동제에 의해 생성되는 응답보다 더 큰 크기의 분자성 및/또는 세포성 응답을 초래할 수 있지만, 작동제로 지칭되지 않는데, 이는 분자성 및/또는 세포성 응답이 작동제-유사 에스트로겐에 의해 생성되는 것보다 적기 때문이다.

화학적으로, SERM은 3가지 군으로 분류될 수 있다. 첫번째 군은 트리페닐에틸렌 유도체를 포함하고, 항암제인 타목시펜이 이들 중 하나이다. 트리페닐에틸렌 유도체인 또다른 물질은 토레미펜, 드롤록시펜, (3-히드록시타목시펜), 아이독시펜, TAT-59 (4-히드록시타목시펜의 인산화 유도체) 및 GW5638 (타목시펜의 카르복실산 유도체)이다. SERM의 두번째 군은 기타 비-스테로이드계 화합물을 포함한다. 이러한 군은 EM-800, EM652 (벤조피란), 랄록시펜, LY353381 (SERM3) 및 LY357489를 포함한다. SERM의 세번째 군은 에스트로겐에 의해 생성되는 응답을 억제하는 능력이 더 양호한 스테로이드계 화합물을 포함한다. ICE-182,780 (ICE)이 이러한 세번째 군의 구성원이다. 각각의 군을 이루는 하위-센서의 목록은 완전하지 않고, 기타 물질들이 존재할 수 있다.

본 발명에 따라, 자궁내막 증식을 유도하는 에스트로겐 및 SERM의 상이한 잠재력과 상호관련된 특정 유전자의 발현 및/또는 활성 수준이 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정된다는 것이 발견되었다. 따라서, 상기 특정 유전자의 발현 및/또는 활성 수준의 측정은 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 에스트로겐은 에스트라디올이고, SERM은 타목시펜 및/또는 랄록시펜이다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 유전자는 포유류 유전자, 바람직하게는 인간 유전자이다.

본 발명의 방법은 인간, 수의학 및/또는 진단 의학에서의 용도에 대해 구현된다.

바람직하게는, 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자는 전방 경사 2 호모로그(homolog) (제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)) (유전자 번호 10551); 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 2 (버시칸(versican)) (유전자 번호 13003); 콜라겐, 유형 I 알파 1 (유전자 번호 1277); 콜라겐, 유형 I, 알파 2 (유전자 번호 1278); 콜라겐, 유형 III, 알파 1, (엘러스-단로스(Ehlers-Danlos) 증후군 유형 IV 보통염색체 우성) (유전자 번호 1281); 콜라겐, 유형 IV, 알파 1 (유전자 번호 1282); 콜라겐, 유형 VI, 알파 3 (유전자 번호 1293); 크레아틴 키나제, 뇌 (유전자 번호 24264); 다이네인, 세포질형, 경질 폴리펩티드 1 (유전자 번호 8655); 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (유전자 번호 2597); 열 충격 27kDa 단백질 1 (유전자 번호 3315); 마우스 팔다리싹 및 심장 유전자의 유사 오르토로그(ortholog) (유전자 번호 81606); 라이실 산화효소-유사 1 (유전자 번호 4016); 흑색종 항원, 패밀리 D, 1 (유전자 번호 9500); RGS16의 막 상호작용 단백질 (유전자 번호 51573); 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서(enhancer) (유전자 번호 5118); 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730); 분비형 프리즐드(frizzled)-관련 단백질 4 (유전자 번호 6424); 세린 (또는 시스테인) 단백질분해효소 억제제, 클레이드(clade) H (열 충격 단백질 47), 구성원 1, (콜라겐 결합 단백질 1) (유전자 번호 871); 트로포마이오신 1 (알파) (유전자 번호 7168) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 (유전자 번호 3488) 및/또는 이의 조합물로 구성된 유전자 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 하나 이상의 유전자는 콜라겐, 유형 I, 알파 1 (유전자 번호 1277); 콜라겐, 유형 I, 알파 2 (유전자 번호 1278); 콜라겐, 유형 III, 알파 1, (엘러스-단로스 증후군 유형 IV 보통염색체 우성) (유전자 번호 1281); 크레아틴 키나제, 뇌 (유전자 번호 24264) 및/또는 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730)이다.

가장 바람직하게는, 하나 이상의 유전자는 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730)이다.

상기 언급된 유전자들의 접속 번호는 공개적인 유전자 데이터베이스인 NCBI 엔트레즈 진(Entrez Gene) 데이터베이스 (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene)에서의 참조에 의해 지시된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 및/또는 활성의 수준은 상기 유전자의 전사물 수준을 측정함으로써 결정된다.

놀랍게도, 전사물의 전사물 수준 (실시예 1 참조)이 자궁내막 증식을 유도하는 에스트로겐 및 SERM의 상이한 에스트로겐성 효능과 관련된다는 것이 발견되었다.

바람직하게는, 유의성의 결정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 유의성의 결정은 충분한 개수, 예를 들어 적어도 500개, 바람직하게는 500개 내지 700개의 프로브(probe) 셋트 (유전자)의 유전자 발현 분석에 의해 수행될 수 있다. 전사물이 수득되는 조직은 바람직하게는 뇌하수체 및 자궁 조직이다.

유전자 전사의 수준을 측정하는 방법은 mRNA의 수준을 측정하는 것을 포함한다. RNA는 당업자에게 주지된 방법에 의해, 예를 들어 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volume 1, Chapter 7, pp 7.4-7.12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 3rd Edition (2001)]에 기술된 바와 같이 샘플로부터 단리될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 전사물 수준의 결정은 혼성화 반응을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 혼성화 반응은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 전사 생성물인 mRNA에 혼성화되는 것을 수반한다. 바람직하게는, 신장 및/또는 증폭 반응이 결정에 추가로 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 증폭은 역전사효소 PCR 및/또는 실시간 PCR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기술을 포함한다.

바람직하게는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따라 상기 유전자의 상보적인 전사물에 특이적으로 혼성화하는데 충분한 길이이다. 본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 핵산을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 적어도 16개 내지 20개의 길이이지만, 일부 경우에는 뉴클레오티드 적어도 20개 내지 25개의 더 긴 길이가 바람직할 것이다. 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 혼성화된 프로브/표적 폴리뉴클레오티드 복합체의 검출을 허용하는 하나 이상의 표지 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 표지 모이어티는 분광학적, 생화학적, 광화학적, 생물전자공학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 포함할 수 있다. 표지 모이어티의 예로는 방사성 동위원소, 예를 들어 ³²P, ³³P, ³⁵S, 화학발광 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자, 분광학적 마커 예컨대 형광 마커 및 염료, 결합된(linked) 효소, 질량 분광법 태그(tag) 및 자기 표지가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 유전자 발현 수준은 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 단백질 생성물의 수준을 측정함으로써 결정된다. 바람직하게는, 단백질 생성물은 전방 경사 2 호모로그 (NP_006399), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 2 (버시칸) (NP_004376), 알파 1 유형 I 콜라겐 프리프로프로틴(preproprotein) (NP_000079), 알파 2 유형 I 콜라겐 (NP_000080), 알파 1 유형 III 콜라겐 (NP_000081), 알파 3 유형 IV 콜라겐 이소형(isoform) 1, 전구체 (NP_000082), 알파 4 유형 IV 콜라겐 전구체 (NP_000083), 알파 1 유형 IV 콜라겐 프리프로프로틴 (NP_001836), 알파 3 유형 IV 콜라겐 이소형 1 전구체 (NP_004360), 뇌 크레아틴 키나제 (NP_001814), 세포질형 다이네인 경질 폴리펩티드 (NP_003737), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NP_002037), 글리실-tRNA 합성효소 (NP_002038), 성장 저지-특이적 1 (NP_002039), 열 충격 27kDa 단백질 1 (NP_001531), 가상 단백질 DKFZp 566J091 (NP_112177), 라이실 산화효소-유사 1 (NP_005567), 흑색종 항원 패밀리 D, 1 이소형 b (NP_008917), RGS16의 막 상호작용 단백질 (NP_057725), 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 (NP_002584), 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (NP_000945), 분비형 프리즐드-관련 단백질 4, (NP_003005), 세린 (또는 시스테인) 단백질분해효소 억제제, 클레이드 H1, 구성원 1 전구체 (NP_001226), 트로포마이오신 1 (알파) (NP_000357) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 (NP_000590)로 구성된 상응하는 접속 번호의 단백질 생성물 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 단백질 생성물은 알파 1 유형 I 콜라겐 프리프로프로틴 (NP_000079), 알파 2 유형 I 콜라겐 (NP_000080), 알파 1 유형 III 콜라겐 (NP_000081), 뇌 크레아틴 키나제 (NP_001814) 및/또는 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (NP_000945)이다.

가장 바람직하게는, 단백질 생성물은 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (NP_000945)이다.

모든 상기 언급된 단백질들은 단백질 서열에 대한 공개적으로 입수가능한 데이터베이스인 NCBI 엔트레즈 프로틴(Entrez Protein) 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entry/query.fcqi?db=protein)로부터 선택된다.

바람직하게는, 단백질 생성물 수준은 예를 들어 면역분석법 또는 질량 분광법과 같은 단백질 결정에 적절한 효소 결합 방법, 면역학적 방법 및/또는 물리적 방법에 의해 결정된다.

하나 이상의 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어 촉매 도메인의 발현을 검출가능하게 표지된 또는 추후에 표지될 수 있는 프로브에 의해 검출할 수 있다. 일반적으로, 프로브는 발현된 단백질을 인식할 수 있는 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "항체"에는 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체, 인간화 또는 키메라 항체, 및 항체 단편이 단백질 또는 이의 단편에 결합하는데 충분한 단편인, 생물학적으로 기능성인 항체 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

개시된 유전자들 중 하나에 의해 코딩되는 단백질 또는 이러한 단백질의 단편에 대한 항체의 생산을 위해, 다양한 숙주 동물을 폴리펩티드 또는 이의 단편의 주사에 의해 면역화시킬 수 있다. 이같은 숙주 동물에는 토끼, 마우스 및 래트 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 다양한 애쥬번트(adjuvant)가 숙주 종에 따라 면역학적 응답을 증가시키기 위해 사용될 수 있고, 여기에는 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 젤 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성제 예컨대 라이소레시틴, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 애쥬번트 예컨대 BCG (칼메트-게랑(Calmette-Guerin) 간균) 및 코리네박테리움 파르붐(Corinebacterium parvum)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리클로날 항체는 항원, 예컨대 표적 생성물, 또는 이의 항원성 기능성 유도체로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자들의 비균질성 집단이다. 폴리클로날 항체의 생산을 위해, 상기 기술된 것들과 같은 숙주 동물을 또한 상기 기술된 바와 같은 애쥬번트가 보충된, 코딩된 단백질 또는 이의 일부분의 주사에 의해 면역화시킬 수 있다.

특정 항원에 대한 항체들의 균질한 집단인 모노클로날 항체 (mAB)는 배양 중인 연속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 수득될 수 있다. 여기에는 [Kohler and Milstein (Nature, Vol. 256, pp. 495-497 (1975)]; 및 미국 특허 번호 4,376,110의 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 ([Kosbor et al., Immunology Today, Vol. 4, p. 72 (1983)]; [Cole at al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 2026-2030 (1983)]), 및 EBV-하이브리도마 기술 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96 (1985)])이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이의 임의의 서브클래스를 포함하여 임의의 면역글로불린 클래스의 항체일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양할 수 있다. 생체내에서의 mAb의 높은 역가의 생산으로 인해 이는 현재 선호되는 생산 방법이다. 또한, 적합한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱(splicing)시킴으로써 "키메라 항체"의 생산에 대해 개발된 기술 ([Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, pp. 6851-6855 (1984)]; [Neuberger et al., Nature, Vol. 312, pp. 604-608 (1984)]; [Takeda et al., Nature, Vol. 314, pp. 452-454 (1985)])을 사용할 수 있다. 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예컨대 뮤린(murine) mAb로부터 유래된 가변 또는 초가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역이 있는 것들이다. 별법적으로, 단일쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기술 (미국 특허 번호 4,946,778; [Bird, Science, Vol. 242, pp. 423-426 (1988)]; [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, pp. 5879-5883 (1988)]; 및 [Ward et al., Nature, Vol. 334, pp. 544-546 (1989)])을 개조하여, 차별적으로 발현된 유전자-단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 단일쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 다리를 통해 연결시켜 단일쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다. 가장 바람직하게는, "인간화 항체"의 생산에 유용한 기술을 개조하여, 단백질, 이의 단편 또는 유도체에 대한 항체를 생산할 수 있다. 이같은 기술은 미국 특허 번호 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5.585,089; 5,530,101; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661,016 및 5,770,429에 개시되어 있다. 특정 에피토프를 인식하는 항체 단편이 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이같은 단편에는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F(ab')₂ 단편, 및 F(ab')₂ 단편의 디술피드 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 별법적으로, Fab 발현 라이브러리를 구축하여 ([Huse et al., Science, Vol. 246, pp. 1275-1281 (1989)]), 원하는 특이성이 있는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다.

그후, 생물학적 샘플 내의 발현된 단백질 (단편)의 수준을 상기 기술된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 이용하는 면역분석법 방법에 의해 결정할 수 있다. 이같은 면역분석법 방법에는 웨스턴(Western) 블롯팅, 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 면역조직화학, 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 효소 결합 이뮤노-스팟(immuno-spot) 분석법 (ELISPOT), 도트 블롯팅, 경쟁적 및 비-경쟁적 단백질 결합 분석법, 및 과학 및 특허 문헌에서 통상적으로 사용되고 이에 광범위하게 기술된 기타 방법, 및 상업적으로 사용되는 다수의 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

샌드위치 ELISA가 검출 용이성을 위해 특히 바람직하고, 이의 다수의 변형이 존재하며, 이들 모두 본 발명에 의해 포함되도록 의도된다. 예를 들어, 전형적인 전방 분석법에서, 표지되지 않은 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편이 고체 기판 상에 고정되고, 결합된 분자와 테스트될 샘플이 접촉되고, 항체-항원 2원 복합체가 형성되는데 충분한 기간의 시간 동안 인큐베이션된다. 이러한 시점에, 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 분자로 표지된 2차 항체, 항체 유도체, 또는 항체 단편이 첨가되고, 항체-항원-표지된 항체의 3원 복합체가 형성되는데 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 임의의 미반응 물질을 세정하여 제거하고, 신호의 관찰에 의해 항원의 존재를 결정하거나, 또는 기지량의 항원을 함유하는 대조군 샘플과 비교함으로써 항원의 존재를 정량할 수 있다. 전방 분석법의 변형은 결합된 항체에 샘플 및 항체가 동시에 첨가되는 동시 분석법, 또는 표지된 항체 및 테스트될 샘플이 먼저 조합되고, 인큐베이션되어, 표지되지 않은 표면-결합 항체에 첨가되는 역행 분석법이 포함된다. 이러한 기술들은 당업자에게 주지되어 있고, 주요하지 않은 변형의 가능성이 명백할 것이다. 본원에서 사용된 "샌드위치 분석법"은 기본적인 2-부위 기술의 모든 변형을 포함하도록 의도된다.

이러한 유형의 분석법에서 항체, 항체 단편 또는 유도체를 표지하기 위한 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단- 또는 방사성핵종-함유 분자이다. 효소 면역분석법 (EIA)의 경우, 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해, 효소가 2차 항체에 접합된다. 그러나, 용이하게 인식될 바와 같이, 당업자에게 주지된 광범위한 상이한 결찰 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소에는 양고추냉이 과산화효소, 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제가 특히 포함된다. 특정 효소와 함께 사용되는 기질은 상응하는 효소에 의한 가수분해 시 검출가능한 색 변화가 나타나도록 일반적으로 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트가 알칼리성 포스파타제 접합체와 사용하기에 적절하다; 과산화효소 접합체에 대해서는, 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘이 통상적으로 사용된다. 상기 언급된 발색성 기질 대신에, 형광 생성물을 산출하는 형광발생성 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 적합한 기질을 함유하는 용액을 3차 복합체에 첨가한다. 기질이 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여, 정성적인 시각적 신호를 제공하고, 일반적으로 분광광도법으로 이를 추가로 정량하여 단백질 또는 이의 단편의 양의 평가를 제공할 수 있다. 별법적으로, 형광 화합물 예컨대 플루오레세인 및 로다민을 항체의 결합 역량을 변화시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링시킬 수 있다. 특정 파장의 빛의 조명에 의해 활성화되는 경우, 형광색소로 표지된 항체가 빛 에너지를 흡수하여, 분자 내의 여기 상태를 유도한 후, 특징적인 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 방출은 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색으로 나타난다. 면역형광 및 EIA 기술은 모두 당업계에 잘 확립되어 있고, 본 방법에 대해 특히 선호된다. 그러나, 기타 리포터 분자, 예컨대 방사성 동위원소, 화학발광 분자 또는 생물발광 분자가 또한 사용될 수 있다. 필요한 용도에 적절하도록 절차를 바꾸는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 적용되는 샘플은 체액 또는 조직 샘플이다. 바람직하게는, 체액은 혈액, 혈장, 소변 및/또는 혈청이다.

본 발명의 추가적인 양상은 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 및/또는 활성의 수준을 결정하기 위한 시약을 포함하는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 조성물 또는 키트이다. 바람직하게는, 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현 및/또는 활성은 상기 정의된 바와 같은 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물 또는 키트는 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 전사물 수준을 결정하기 위한 시약을 포함한다. 바람직하게는, 전사물 수준을 결정하기 위한 상기 시약은 혼성화 프로브를 포함하고, 임의로, 신장 및/또는 증폭용 프라이머를 포함한다. 바람직하게는, 혼성화 프로브 및 프라이머는 상기 언급된 유전자들의 전사물에 결합할 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 생성물의 수준을 결정하기 위한 시약을 포함하는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 조성물 또는 키트이다.

바람직하게는, 조성물 또는 키트는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 생성물의 수준을 결정하기 위해 효소적, 결합, 생리학적 및/또는 면역학적 결정을 위한 시약을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 조성물 또는 키트는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물 또는 키트는 상기에서 상세하게 기술된 바와 같은 모노클로날 항체를 포함한다.

또다른 바람직한 실시양태에서, 생물학적 샘플을 수집하기 위한 장치를 추가로 포함하는 조성물 또는 키트가 제공된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 조성물 또는 키트는 대상의 생물학적 샘플을 수집하기 위한 장치를 추가로 포함하고, 이에 더하여, 키트의 사용 및 결정된 유전자 발현 및/또는 활성 수준 및/또는 단백질 생성물 수준의 해석을 위한 지침서를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 샘플 내의 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준 및/또는 이의 전사물 수준을 결정하기 위한 캐리어(carrier) 및 프로브를 포함하는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 어레이에 관한 것이다.

어레이는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 정렬된(ordered) 어레이에 대한 표지된 mRNA의 혼성화를 수반하는, 다수의 유전자로부터 수득된 mRNA 전사물의 수준을 검출하는데 특히 유용한 방법이다. 전형적으로, 이러한 혼성화 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된다. 고체 지지체의 예로는 막, 필터, 슬라이드, 종이, 나일론, 웨이퍼, 섬유, 자기성 또는 비-자기성 비드, 젤, 배관, 중합체, 폴리비닐 클로라이드 접시 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 직접적으로 또는 간접적으로, 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합될 수 있는 임의의 고체 표면이 사용될 수 있다. 발현 모니터링을 위한 이같은 프로브 어레이는 예를 들어 Affymetrix사의 편람에 기술되어 있는 바와 같은, 당업자에게 주지된 기술에 따라 제조 및 사용될 수 있다. 이같은 방법은 다수의 유전자의 전사 수준이 동시에 측정되어 유전자 발현 프로파일 또는 패턴이 생성되도록 한다.

또한, 어레이는 상기 정의된 바와 같은 유전자에서의 하나 이상의 다형성의 존재를 결정하기 위한 선호되는 방법이다. 바람직하게는 이같은 어레이는 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 유전자의 하나 이상의 다형성의 존재를 결정하기 위한 하나 이상의 프로브가 고정된 캐리어를 포함한다. 바람직하게는, 어레이 캐리어, 예를 들어 평면형 캐리어 또는 마이크로채널 장치에는 테스트될 다형성이 위치하는 서열을 함유하는 핵산 분자, 예를 들어 RNA 분자 또는 DNA 분자, 증폭 생성물, 프라이머 신장 생성물 등에 결합할 수 있도록 디자인된, 캐리어의 상이한 영역들에 위치한 다수의 상이한 프로브들이 고정되어 있다. 따라서, 캐리어 상에 고정된 프로브에 대한 핵산 샘플 분자의 부위-특이적 결합 이벤트의 검출에 의해 분석될 다형성의 확인이 달성될 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상은 샘플 내의 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준을 결정하는 것을 포함하고, 이때 건강한 대상에 대한 기준값으로부터 실질적으로 벗어나는 발현 및/또는 활성 수준은 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인을 가리키는, 대상에서의 자궁내막 증식 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애 및/또는 컨디션의 진단 방법에 관한 것이다.

용어 "장애"는 포유동물, 바람직하게는 인간의 병리학적 상태로 정의되고, 용어 "컨디션"은 포유동물, 바람직하게는 인간의 비-병리학적 상태로 정의된다. 본 발명의 문맥에서, 자궁내막 증식과 관련된 컨디션은, 예를 들어, 임신 또는 배란이고, 자궁내막 증식과 관련된 장애는, 예를 들어, 자궁내막증 또는 자궁내막염이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 장애의 진단 방법은 자궁내막 증식의 기능장애와 관련된다.

본 발명은 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인이 있는 대상에서 차별적으로 발현되는 유전자를 최초로 개시한다. 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 유래된 유전자 발현 프로파일을 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인에 침범되지 않은 대상 또는 대상 집단으로부터 수득된 샘플로부터 유래된 유전자 발현 프로파일과 비교할 수 있다. 대상이 자궁내막 증식의 기능장애에 침범되었는지 또는 침범될 위험이 있는지 여부가 따라서 결정될 수 있다.

바람직하게는 대상은 포유동물이고, 더욱 바람직하게는 인간이다.

바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 유전자의 전사물 수준 및/또는 단백질 생성물의 수준을 측정함으로써 유전자 발현 및/또는 활성의 수준이 결정된다.

상기 언급된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은, 체액에서 측정가능하다면, 자궁내막 증식에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다.

바람직하게는, 자궁내막 증식 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애 또는 컨디션은 자궁내막 위축, 발육부진 자궁내막, 무월경, 자궁내막염, 증강된 자궁내막 증식, 자궁내막증, 무질서한 월경 주기, 임신, 배란, 불임증, 자궁내막 과다형성, 자궁내막 폴립 및/또는 부인과 종양으로 구성된 군으로부터 선택된다.

자궁내막 위축은 자궁내막이 적절한 발달에 저항하는 장애이다. 자궁내막 위축에 대한 전형적인 원인은 생물 내에서 에스트로겐의 강한 결핍을 야기하는 제스타젠으로의 장기 치료이다.

자궁내막은 자궁 발달 실패의 결과로 발육부진될 수 있다.

또한, 월경 이상 예컨대 무월경이 자궁내막 증식의 기능장애와 관련된다. 무월경은 광범위한 상황 하에서의 월경의 부재로 정의된다. 생리학적 조건 하에, 무월경은 일생의 4회의 독특한 시기에 발생한다: 초경의 초기 단계, 임신 동안, 수유 동안, 및 폐경 후. 병리학적 조건 하에, 무월경은, 예를 들어, 자궁내막 위축 또는 발육부진 자궁내막의 원인으로서 발생한다. 그후, 월경 주기와 관련된 컨디션 예컨대 임신 및 배란이 자궁내막 증식과 관련된다.

자궁내막 증식의 기능장애와 관련된 추가적인 장애는 불임증, 예를 들어 하기에 추가로 설명되는 자궁내막증 또는 자궁내막염의 결과로서의 불임증이다.

본 발명에 따른 자궁내막 증식의 기능장애와 관련된 또다른 중요한 질환은 자궁내막증이다.

자궁내막증은 여성에서 두번째로 흔한 질환이고, 자궁 바깥쪽에서의 자궁내막 세포의 발생으로 정의된다. 자궁내막증은 생식 연령의 여성 5명 중 약 1명을 침범하고, 출산력 문제가 있는 여성 2명 중 1명을 침범한다.

정상적인 상황 하에, 자궁내막은 자궁 내에서만 발견된다. 자궁내막증에서는, 조직학적 외관이 자궁내막을 닮은 조직이 자궁의 바깥쪽에서, 예를 들어 자궁의 외면 상에서, 소장 상에서, 또는 심지어 췌장 또는 폐 내에서 발견된다. 이러한 자궁내막증 병소가 자궁의 바깥쪽에 위치함에도 불구하고, 이들 또한 월경 기간 동안 출혈되고, 따라서 여성 주기의 호르몬에 영향을 받는다. 자궁내막증 병소가 자궁내막처럼 주기 동안 부피 변화를 겪기 때문에, 이러한 변화는 위치에 따라 통증을 야기할 수 있다. 또한, 신체가 자궁내막증 세포 및 염증성 응답에 반응하고, 이것이 다시 통증을 야기한다. 또한, 염증이 난소 및 난관의 영역에서 유착에 이르게 되고, 그 결과, 침범된 여성의 소위 기계적 불임증을 초래한다. 그러나, 명백하게, 자궁내막증에서, 유착의 부재 하에서도 침범된 여성의 출산력을 감소시킬 수 있는 메신져가 또한 방출된다 (예를 들어 사이토카인, 프로스타글란딘).

병리학적 성질의 관점에서, 자궁내막증 세포는 정상 세포와 종양 세포 사이에 있는 것으로 분류될 수 있다: 한편으로는, 이들은 신생물성 거동을 나타내지 않지만, 또다른 한편으로는, 전이성 종양 세포처럼, 이들은 생물 내의 기관 경계를 가로질러 이동할 수 있고 다른 기관 내로 성장할 수 있고, 즉 이들은 침습성 거동을 나타낸다. 이러한 이유로, 자궁내막증 세포는 문헌에서 "양성 종양 세포"로 정의되지만, 현재까지 원형-종양유전자(proto-oncogene)에서의 종양-특이적 돌연변이가 이러한 유형의 세포에서 발견되지 않았다.

자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인과 관련된 또다른 장애는 자궁내막염이다. 이러한 장애는 자궁내막의 급성 염증으로 정의되고, 이는 분만 또는 유산 후의 감염에 응답하여 또는 피임 장치의 삽입에 응답하여 또는 임균성 감염의 일부로서 발달될 수 있다.

본 발명에 따른 추가적인 관련된 장애는 증강된 자궁내막 증식, 특히 샘 상피의 증강된 자궁내막 증식으로 정의되는 자궁내막 과다형성이다. 이 장애는 등급 I 내지 III (비정형 과다형성)으로 세분된다. 첫째로, 등급 III은 자궁내막 암종의 전암성 컨디션이다. 자궁내막 과다형성은 제스타젠의 부재 하의 에스트로겐 ("반대가 없는 에스트로겐")의 지연성 영향 하에, 대개 갱년기 및 폐경기 후에 발달된다.

또한, 자궁내막 폴립이 모든 여성의 10％에서 주로 갱년기에 발생한다. 대부분의 폴립은 자궁내막의 기저부에서 국한된 과다형성으로 성장한다. 자궁내막 폴립이 있는 환자에서, 근종의 발생률이 정상 집단보다 크다. 이는 자궁에서의 일반적인 증식성 활성의 징후이다. 사례들의 1％ 미만에서만 자궁내막 폴립에서 발견된 암종이 있다. 자궁내막 폴립에서, 자궁으로부터의 불규칙한 또는 진행중인 출혈이 발생할 수 있다.

또한, 자궁내막암, 유방암, 난소암, 외음부암 및/또는 질암으로 구성된 군으로부터 선택된 여러 부인과 종양이 자궁내막 증식의 기능장애와 관련된다.

자궁내막암은 가장 흔한 부인과 암 중 하나이다. 이는 일반적으로 폐경후 여성 (75％)에서, 가장 빈번하게는 55세와 65세 사이의 연령에서 발견되고, 대부분 (60％)은 이러한 기간의 후반부에 발생한다. 대다수의 종양 (60％)은 순수한 샘암종이다. 이들은 샘의 분화 정도에 따라 3가지 군으로 분류될 수 있다. 일반적으로, 이러한 암은 자궁강으로부터 천천히 확산되는데, 아마도 자궁내막에 림프관이 없기 때문일 것이다. 진행된 사례에서는 원격 전이가 발생한다. 폐 침착이 가장 통상적이다. 이러한 암의 실제 원인은 미지이다. 이러한 종양과 에스트로겐 사이의 의심할 여지가 없는 관련에 논의가 집중되었다. 발생 증가가 폐경후 호르몬 대체 요법으로 에스트로겐이 단독으로 제공된 여성 및 난소의 에스트로겐 분비 종양이 발달된 환자에서 보고되었다. 호르몬 대체 요법에서 에스트로겐에 프로게스테론을 첨가하는 것이 자궁내막암의 발생 증가를 폐지하는 것으로 보인다는 사실에 의해 자궁내막암의 병인에서의 에스트로겐의 중심적인 위치가 강화된다.

본 발명의 추가적인 양상은 자궁내막 증식에 대한 효과를 시험할 후보 작용제의 존재 하의 세포의 샘플 내의 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준을 상기 후보 작용제의 부재 하의 상기 발현 및/또는 활성 수준과 비교하여 결정하는 것을 포함하는, 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애의 조정인자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 이같은 방법은 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성을 간섭할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 생체내 또는 세포-기반 및/또는 무세포 분석법을 포함한다.

또한 본 발명은 자궁내막 증식과 관련된 장애 및/또는 컨디션에 대해 활성인 약물의 개발을 위한 표적으로서의 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질 생성물의 용도에 관한 것이다. 약물 표적화는 신체의 특정 조직으로의 화합물의 전달을 목표로 하는 전략이다. 소정의 표적의 약물가능성은 화합물, 예컨대 소형 분자 약물 또는 항체가 얼마나 잘 표적에 접근할 수 있는지에 의해, 또는 화합물이 실제로 표적을 달성할 수 있는 효율에 의해 정의된다. 다수의 파라메터가 소정의 표적의 약물가능성에 영향을 미친다; 여기에는 세포 위치, 저항성의 발달, 운송 메커니즘 예컨대 외수송(外輸送) 펌프, 부작용, 독성 및 기타가 포함된다. 치료적 개입을 위한 표적으로서, 수용체, 단백질, 효소, DNA, RNA 및 리보솜성 표적이 고려된다. 본 발명에 따르면, 에스트로겐 및/또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM)에 의해 조정되는 유전자, 상기 유전자의 전사물, 뿐만 아니라 이의 단백질 생성물이 표적으로 특히 유용하다. 상기 유전자, 전사물 및/또는 단백질 생성물을 약물가능 표적으로서의 마커로 사용함으로써, 자궁내막 증식과 관련된 장애 및/또는 컨디션에 대한 새롭고 더욱 양호한 치료법을 개발하는 것이 가능하다.

본 발명에 따르면, 바람직하게는 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용가능한 캐리어, 부형제 및/또는 첨가제와 조합된 활성성분을 함유한다. 이같은 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합되어 투여될 수 있고, 이는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 무균성 생체적합성 제약학적 캐리어 내에서 투여될 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께 환자에게 투여될 수 있고, 이때 하나 이상의 유전자의 수준 및/또는 하나 이상의 단백질 생성물의 수준은 건강한 대상에 대한 기준으로부터 실질적으로 벗어나고, 이는 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인을 가리킨다.

제약 조성물은 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 제약 조성물은 경구, 설하, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 뇌실내, 안구내, 수막강내, 뇌내, 두개내, 호흡기, 기관내(氣管內), 코인두, 경피, 피내, 피하, 복강내, 비강내, 장, 국소, 또는 직장 경유 수단, 주입 또는 이식이 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여 경로는 경구이다.

투여될 때, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용가능한 제제에서 투여된다. 본원에서 사용된 용어 "제약상 허용가능한 캐리어"는 인간을 포함하는 포유동물 내로의 투여에 적절한 하나 이상의 혼화성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 "캐리어"는 적용이 용이하도록 활성 성분이 이와 조합되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미한다.

용어 "제약상 허용가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 이같은 제제는 제약상 허용가능한 농도의 염, 완충제, 방부제, 혼화성 캐리어, 보조 면역 강화제 예컨대 애쥬번트 및 사이토카인, 및 임의로 기타 치료제, 예컨대 화학요법제를 일상적으로 함유할 수 있다.

의약에서 사용되는 경우, 염은 제약상 허용가능하여야 하지만, 제약상 허용가능하지 않은 염이 이의 제약상 허용가능한 염을 제조하는데 편리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 범주로부터 배제되지 않는다.

제약 조성물은 염 내의 아세트산; 염 내의 시트르산; 염 내의 붕산; 및 염 내의 인산이 포함되는 적절한 완충제를 함유할 수 있다.

또한 제약 조성물은 적절한 방부제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드; 클로로부탄올; 파라벤 및 티오메로살을 임의로 함유할 수 있다.

제약 조성물은 단위 투약형으로 편리하게 제시될 수 있고, 약학 분야에 주지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성 작용제를 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 캐리어와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 화합물을 액체 캐리어, 미세하게 분할된 고체 캐리어, 또는 양쪽 모두와 균일하게 및 밀접하게 회합시킨 후, 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다.

경구 투여에 적절한 조성물은 분리된 단위, 예컨대 캡슐, 정제, 로젠지로 제시될 수 있고, 이들 각각은 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 기타 조성물에는 수성 액체 또는 비-수성 액체 내의 현탁액 예컨대 시럽, 엘릭서르 또는 에멀션이 포함된다.

편리하게는, 비경구 투여에 적절한 조성물은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 무균성 수성 또는 비-수성 제제를 포함하고, 이는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성이다. 이러한 제제는 적절한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제형할 수 있다. 무균성의 주사용 제제 또한 비-독성의 비경구용으로 허용가능한 희석제 또는 용매 내의 무균성의 주사용 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-부탄 디올 내의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매에는 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균성의 고정유가 용매 또는 현탁 매질로 편리하게 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하여 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산 예컨대 올레산이 주사제의 제조에서 사용될 수 있다.

경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 투여에 적절한 캐리어 제형을 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 확인할 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상은 자궁내막 증식과 관련된 장애 및/또는 컨디션의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 조정인자의 용도를 포함한다.

바람직하게는, 제약 조성물의 조정인자는 에스트로겐 및/또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM), 이의 길항제 및/또는 작동제 예컨대 항체 또는 항체 단편, siRNA (소형 간섭 RNA), miRNA (마이크로RNA), 안티센스 분자 및/또는 리보자임이다.

단백질 또는 호르몬, 예를 들어 에스트로겐 또는 SERM의 작동제는 각각의 단백질 또는 호르몬의 활성을 증가시키는 효소, 조효소, 막 수용체 등과 같은 물질이다.

한 양상에서, 본 발명의 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물에 대해 특이적인 항체가 직접적으로 조정인자, 예를 들어 길항제 또는 작동제로서, 또는 간접적으로 제약 작용제를 단백질을 발현하는 세포 또는 조직에 데려오기 위한 표적화 또는 전달 메커니즘으로서 사용될 수 있다. 항체는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이같은 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 단일쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 중화 항체 (즉, 이량체 형성을 억제하는 것)이 치료 용도에 특히 바람직하다.

항체의 생산을 위해, 염소, 토끼, 래트, 마우스, 인간 및 기타 숙주를 포함하여 다양한 숙주가 면역원성 성질이 있는 단백질 또는 이의 임의의 단편 또는 올리고펩티드의 주사에 의해 면역화될 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 애쥬번트가 면역학적 응답을 증가시키도록 사용될 수 있다. 단백질 생성물에 대한 항체를 유도하도록 사용된 펩티드, 단편 또는 올리고펩티드의 아미노산 서열이 5개 이상의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 아미노산으로 구성된다.

단백질 생성물에 대한 모노클로날 항체는 배양중인 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 여기에는 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다 ([Koehler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497]; [Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42]; [Cote, R. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030]; [Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120]).

또한, '키메라 항체'의 생산을 위해 개발된 기술인, 적합한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 수득하기 위한 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자에 대한 스플라이싱을 사용할 수 있다 ([Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855]; [Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608]; [Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454]). 별법적으로, 단일쇄 항체의 생산을 위해 기술된 기술을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 개조하여, 본 발명의 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물에 대해 특이적인 단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 관련된 특이성이 있지만 이디오타입(idiotype) 조성이 다른 항체가 사슬 셔플링(shuffling)에 의해 무작위 조합형 면역글로불린 라이브러리로부터 생성될 수 있다 ([Burton, D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-11123]). 림프구 집단에서의 생체내 생산을 유도함으로써 또는 문헌 ([Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837]; [Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293-299])에 개시된 바와 같이 고도로 특이적인 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 스크리닝함으로써 항체가 또한 생산될 수 있다.

단백질 생성물에 대한 특이적 결합 부위를 함유하는 항체 단편이 또한 생성될 수 있다. 예를 들어, 이같은 단편에는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F(ab')₂ 단편, 및 F(ab')₂ 단편의 디술피드 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 별법적으로, Fab 발현 라이브러리를 구축하여, 원하는 특이성이 있는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다 ([Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:1275-1281]).

다양한 면역분석법을 원하는 특이성이 있는 항체를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 특이성이 확립되어 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁적 분석 및 면역방사측정 분석법을 위한 수많은 프로토콜이 당업계에 주지되어 있다. 이같은 면역분석법은 단백질과 이의 특이적 항체 간의 복합체 형성을 측정하는 것을 전형적으로 수반한다. 2개의 비-간섭 단백질 에피토프들에 대해 반응성인 모노클로날 항체들을 사용하는 2-부위 모노클로날-기반 면역분석법이 선호되지만, 경쟁적 결합 분석법 또한 사용될 수 있다 ([Maddox, 상기 문헌]).

본 발명의 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편 또는 핵산 조정인자 분자 예컨대 안티센스 분자, 앱타머(aptamer), siRNA 분자, miRNA 분자 또는 리보자임이 치료 목적으로 사용될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명의 단백질 생성물에 결합하여 활성을 조정할 수 있는 앱타머, 즉 핵산 분자가 조합형 핵산 라이브러리의 사용을 수반하는 스크리닝 및 선별 절차에 의해 생성될 수 있다.

추가적인 양상에서, mRNA의 전사를 차단하는 것이 바람직할 상황에서 안티센스 분자가 사용될 수 있다. 특히 상기 정의된 바와 같은 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열로 세포가 형질전환될 수 있다. 따라서, 안티센스 분자를 사용하여 단백질 생성물 활성을 조정하거나 유전자 기능의 조절을 달성할 수 있다. 이같은 기술은 현재 당업계에 주지되어 있고, 단백질 생성물을 코딩하는 서열의 코딩 또는 제어 영역을 따라 있는 다양한 위치로부터 센스 또는 안티센스 올리고머 또는 더 큰 단편이 디자인될 수 있다. 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 우두 바이러스로부터 또는 다양한 박테리아 플라스미드로부터 유래된 발현 벡터가 뉴클레오티드 서열을 표적화된 기관, 조직 또는 세포 집단에 전달하는데 사용될 수 있다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 재조합 벡터를 구축할 수 있고, 이는 본 발명의 단백질 또는 상동성 단백질 생성물을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 분자를 발현할 것이다. 이러한 기술은 [Sambrook et al. (상기 문헌)] 및 [Ausubel et al. (상기 문헌)] 양쪽 모두에 기술되어 있다. 본 발명의 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현하는 발현 벡터로 세포 또는 조직을 형질전환시킴으로써 본 발명의 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물을 코딩하는 유전자를 끌 수 있다. 이같은 구축물을 사용하여 번역될 수 없는 센스 또는 안티센스 서열을 세포 내로 도입할 수 있다. DNA 내로 삽입되지 않는 경우에도, 이같은 벡터는 내인성 핵산분해효소에 의해 무력화될 때까지 계속 RNA 분자를 전사할 수 있다. 일시적인 발현이 비-복제성 벡터로 1개월 또는 그 이상 동안 지속될 수 있고, 적합한 복제 요소가 벡터 시스템의 일부분인 경우에는 더욱 길어질 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 상기 정의된 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물을 코딩하는 유전자의 제어 영역, 즉, 프로모터, 인핸서 및 인트론(intron)에 대한 안티센스 분자, 예를 들어 DNA, RNA 또는 핵산 유사체 예컨대 PNA를 디자인함으로써 유전자 발현의 변형이 수득될 수 있다. 전사 개시 부위로부터 유래된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 시작 부위로부터 -10 내지 +10 사이가 선호된다. 유사하게, "삼중 나선" 염기-쌍형성 방법을 사용하여 억제가 달성될 수 있다. 삼중 나선 쌍형성은 중합효소, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위해 충분히 개방되는 이중 나선의 능력을 억제하는 것을 야기하기 때문에 유용하다. 삼중 DNA를 사용하는 최근의 치료적 진보가 문헌에 기술되어 있다 ([Gee, J. E. et al. (1994) In; Huber, B. E. 및 B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.]). 전사물이 리보솜에 결합하는 것을 방지함으로써 mRNA의 번역을 차단하도록 안티센스 분자가 또한 디자인될 수 있다.

효소성 RNA 분자인 리보자임을 또한 사용하여 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있다. 리보자임의 작용 메커니즘은 상보적인 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열-특이적 혼성화에 이은 엔도뉴클레오라이틱(endonucleolytic) 절단을 수반한다. 사용될 수 있는 예로는 본 발명의 단백질 생성물 및 상동성 단백질 생성물을 코딩하는 서열의 엔도뉴클레오라이틱 절단을 특이적으로 및 효율적으로 촉매할 수 있는 조작된 망치머리형 모티프(motif) 리보자임 분자가 포함된다. 임의의 잠재적인 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위가 GUA, GUU, 및 GUC의 서열을 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 표적 분자를 스캐닝함으로써 먼저 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 표적 부위의 영역에 상응하는 리보뉴클레오티드 15개 내지 20개의 짧은 RNA 서열이 올리고뉴클레오티드가 작동불가능하게 할 수 있는 2차 구조적 특색에 대해 평가될 수 있다. 리보핵산분해효소 보호 분석법을 사용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 접근성을 테스트함으로써 후보 표적의 적절성이 또한 평가될 수 있다.

핵산 조정인자 분자, 예를 들어 안티센스 분자 및 리보자임은 핵산 분자의 합성에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 기술 예컨대 고체 상 포스포르아미디트 화학 합성이 포함된다. 별법적으로, RNA 분자가 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이같은 DNA 서열은 적절한 RNA 중합효소 프로모터 예컨대 T7 또는 SP6과 함께 다양한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 별법적으로, 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도성으로 합성하는 이러한 cDNA 구축물이 세포주, 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있다. RNA 분자는 세포내 안정성 및 반감기가 증가되도록 변형될 수 있다. 가능한 변형에는 분자의 5' 및/또는 3' 말단에서의 플랭킹(flanking) 서열의 부가 또는 핵염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티의 변형, 예를 들어 분자의 골격 내의 포스포디에스테라제 연결 대신 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 개념은 PNA의 생산에서 고유하고, 내인성 엔도뉴클레아제에 의해 쉽게 인식되지 않는 비-전통적인 염기 예컨대 이노신, 퀘오신 및 위부토신, 뿐만 아니라 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 유사하게 변형된 형태의 아데닌, 사이티딘, 구아닌, 티민 및 유리딘의 포함에 의해 모든 이러한 분자에서 확장될 수 있다.

벡터를 세포 또는 조직 내로 도입하기 위한 다수의 방법이 이용가능하고, 생체내, 시험관내 및 생체외에서의 사용에 대해 동등하게 적절하다. 생체외 치료를 위해, 벡터를 환자로부터 취해진 줄기 세포 내로 도입하고, 동일한 환자 내로 다시 자가 이식하기 위해 클론 증식시킬 수 있다. 형질감염 및 리포솜 주사에 의한 전달이 당업계에 주지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 기술된 치료 방법들 중 임의의 것을 포유동물 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 가장 바람직하게는 인간이 예를 들어 포함되는 임의의 적절한 대상에게 적용할 수 있다.

유전자 발현 분석

재료 및 방법

동물

에스트로겐 및 SERM의 인간 임상 시험에서의 결과를 예보하는 유용한 모델로 입증된 난소가 적출된 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 에스트로겐 결핍 모델로 사용하였다. 연구는 실험적 또는 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 법, 규정 또는 행정 조항에 관련된 동물 의료(Animal Health) 규제, 협의회 지침(Council Directive) No. 86/609/EEC에 따라 수행되었다. 처치를 시작하기 전에 적어도 14일 동안 동물들을 처치 설비에 순응시켰다. 동물들에게 물을 자유롭게 제공하였고, 투약하고 나서 적어도 1시간 후에 약 180 g의 OWM 펠렛화 식이 (Dietex France, SDS, Saint Gratien, France)를 매일 제공하였으며, 단 처치 마지막 날에는 동물들을 금식시켰다. 또한, 각각의 동물에게 2개의 과일 또는 채소를 매일 제공하였다. 약 48개월령의 성적으로 성숙한 암컷 사이노몰구스 원숭이 (R.C. Hartelust BV (Tilburg, the Netherlands)로부터 수득한 마카카 파시쿨라리스)에게 약물을 처치하기 10주 전에 수술 (난소적출술 또는 거짓수술)을 적용하였다.

수술 절차

처치 제1일 10주 전에 CIT (Evreux, France)의 표준 수술 프로토콜에 의해 난소적출술을 수행하였다. 자일라진 (Rompun®: 0.4 ㎖/동물, Bayer Pharma Division Sante Animale, Puteaux, France) 및 케타민 히드로클로라이드 (Imalgene®: 0.6 ㎖/㎏, Merial, Lyon, France)의 조합된 근육내 주사로 마취시킨 후 난소를 제거하였다. 거짓 수술 동물에게는 난소의 제거를 제외하고 동일한 수술 절차를 적용하였다.

에스트라디올 분석법

에스트라디올 혈청 수준을 수술 약 2주 후에 각각의 동물에서 결정하여, 난소적출술의 효과를 확인하였다. 금식되지 않은 동물의 정맥혈 샘플 (약 1.5 ㎖)을 항응고제 없이 튜브 내에 수집하고, 방사선면역분석법 (Sorin, Ecole Nationale Veterinaire de Lyon, France)을 사용하여 분석하였다. 또한, 약물 처치를 시작하고 나서 약 2주 및 4주 후에 에스트라디올 분석법을 수행하여, 임의의 동물에서 자궁외(ectopic) 난소 조직 성장이 발달되었는지를 결정하였다; 임의의 이같은 동물 을 연구 및 이어지는 분석에서 제거하였다.

처치 프로토콜

난소적출 동물 및 거짓수술 동물을 4개의 군으로 나누었다. 거짓수술 동물 및 난소적출 동물 중 1개의 군에는 비히클만을 제공하였고, 난소적출 원숭이의 나머지 군에는 에스트라디올 (Sigma No. E8875), 또는 타목시펜 (Tamofene®, Aventis Pharma), 또는 랄록시펜 (Evista®, Lilly France SA)을 제공하였다. 테스트 아이템을 비히클 내의 현탁액으로 제조하여, 경구 강제급식(gavage)에 의해 매일 투여하였다. 처치 마지막 날, 근육내 케타민 히드로클로라이드 및 정맥내 소듐 펜토탈에 의해 유도된 깊은 마취에 이은 실혈에 의해 동물들을 희생시켰다.

뇌하수체 및 자궁 유전자 발현

조직 제조

약물 치료법 말기에 뇌하수체 및 자궁에서 유전자 발현을 결정하였다. 분석될 조직 (뇌하수체 및 자궁)을 절제하고, 액체 질소에서 순간 동결시키고, RNA 추출을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다

DNA 마이크로어레이 분석

전체 RNA를 산 구아니디늄 이소티오시아테이트-페놀-클로로포름 추출 (Trizol; Invitrogen Life Technologies, San Diego, CA, USA)에 의해 수득하고, 친화성 수지 컬럼 (RNeasy; Quiagen, Hilden, Germany) 상에서 제조업자의 지침서에 따라 정제하였다. DNA 마이크로어레이 실험을 진칩(GeneChip) 시스템 (Affymetrix, Inc. 2002)의 제조업자가 권고한 바와 같이 수행하였다. 이전의 마 이크로어레이 연구에서 종-교차 DNA 칩 분석의 타당성이 입증되었고, 따라서 1차로 주석이 달린 인간 유전자를 질의하는 22,283개의 프로브 셋트를 함유하는 인간 유전자 발현 프로브 어레이 HGU133A (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 1개의 진칩을 조직 당, 동물 당 사용하였다. 생성된 영상 파일 (.dat 파일)을 마이크로어레이 어낼리시스 스위트(Microarray Analysis Suite) 5 (MAS5) 소프트웨어 (Affymetrix, Inc.)를 사용하여 프로세싱하였다. 신호 강도 (시그널(Signal)) 및 절대적인 발현 수준 치수 (앱솔루트 콜(Absolute Call))에 관한 데이터를 함유하는 탭-한정(tab-delimited) 파일을 수득하였다.

차별적으로 발현되는 것으로 발견된 전사물들이 어피메트릭스(Affymetrix) 프로브 셋트 번호 209173_at, 221731_x_at, 202310_s_at, 202403_s_at, 201852_x_at, 215076_s_at, 211161_s_at, 211980_at, 201438_at, 200884_at, 200703_at, 217398_x_at, 213453_x_at, 212581_x_at, 201841_s_at, 221011_s_at, 203570_at, 209014_at, 202593_s_at, 202465_at, 211663_x_at, 204051_s_at, 207714_s_at, 206116_s_at 및/또는 211959_at의 참조에 의해 지시된다.

에스트로겐성 효능의 정량

에스트로겐 점수 축

약물 처치의 에스트로겐성 효능을 나타내는 기준축을 정의하기 위해, 극단을 나타내도록 2가지 조건을 선택하였다 - 난소적출 동물 (OVX 군; 에스트로겐 결핍) 및 에스트라디올-처치 OVX (OVX-EE) 군 (최대 에스트로겐). 이러한 2가지 군을 사용하여, 이들의 상대적인 에스트로겐성 효능 점수를 각각 0％ 및 100％로 설정함으 로써 축을 정량적으로 축척화하였다. 그후, 거짓 수술 동물 및 타목시펜 또는 랄록시펜으로 처치된 동물로부터의 유전자 발현을 이러한 축 상에 위치시켜, 이들의 에스트로겐성 효능의 순위를 매겼다.

이러한 분석에 사용된 유전자 (프로브 셋트)의 선별은 에스트로겐에 의한 조절에 대한 조작적 정의(operational definition)를 충족시키는 수학적 및 통계학적 기준을 기초로 선택되었다; 또한, 유전자들이 생물학적 기능의 선험적 지식을 기초로 군으로 분류되었다. 프로브 셋트 A (n = 544)는 하기의 필터링 기준을 유전자 발현 데이터에 적용함으로써 정의되었다; (1) 소정의 프로브에 대한 평균 신호 강도가 테스트 조건들 중 하나 이상에서 50을 초과하였어야 하고, (2) OVX 조건을 거짓과 비교했을 때 발현 수준에서 1.5배 이상의 변화 (증가 또는 감소)가 있었어야 하며, (3) 변경된 발현 패턴이 에스트라디올 처치 (OVX-EE)로 역전되었어야 한다. 프로브 셋트 B (n = 74)는 유전자 기능의 선험적 지식을 사용하는 것 및 유전자들을 카테고리 (신호 전달, 수송, 세포외 매트릭스, 및 성장 인자)로 분류하는 것을 기초로 셋트 A의 부분집합으로 확인되었다. 프로브 셋트 C (n = 225)는 데이터를 필터링하기 위해 엄격하고, 편향되지 않은 수학적 및 통계학적 파라메터를 사용하여 정의되었고, (1) 신호 강도 중앙값이 OVX 및 OVX-EE 조건 중 하나 또는 양쪽 모두에서 50을 초과하였고, (2) 이러한 조건들 간에 발현에서 1.5배 이상의 변화를 나타냈으며, (3) P 0.05 (log10 변환 강도 값 상에서 통계적 유의성에 대해 t-테스트를 사용함)를 나타낸 프로브들만을 포함하였다.

OVX 및 OVX-EE 동물의 log10 변환 유전자 발현 (GEP) 데이터의 공분산 행렬 에 마이크로어레이 유전자 발현 데이터를 기술하기 위해 기존에 사용되어 온 통계적 차원 축소 방법인 주성분 분석 (PCA)을 적용하였다. PCA 알고리즘은 소위 "로딩(loading)" 및 "점수"를 계산한다. 로딩은 좌표계의 축 (주성분 (PC: Principal Component))을 정의하는 변수들 (유전자들)의 선형 조합의 가중치이다. 점수는 동일한 좌표계에서의 개별적인 동물들의 GEP 데이터를 기초로 하는 개별적인 동물들의 좌표를 나타낸다.

그후 모든 기타 로그 변환 GEP 데이터를 이러한 PCA 모델의 입력값으로 사용하여, 이들의 점수를 계산하였다. 1개의 PC만 계산되었고, 이러한 PC 상에서의 모든 샘플의 점수가 후속 계산에서 사용되었다. OVX 샘플의 점수의 중앙값을 모든 점수로부터 차감하였다. 그후, 모든 점수를 OVX-EE 동물의 점수의 중앙값으로 나눔으로써 축척화하고, 100을 곱하였다. 이러한 섹션에서 기술된 계산은 다변량 분석을 위한 SIMCA 소프트웨어 (제10판, Umetrics., Umea, Sweden) 및 엑셀 2002 (Microsoft Corp., Redman WA, USA)를 사용하여 이루어졌다.

이러한 발현 프로파일링 연구로 자궁내막 증식의 조절인자로서의 에스트로겐 및/또는 또는 SERM에 의해 조정되는, 분석된 전사물의 상응하는 유전자의 특정 영향이 확인되었다. 따라서, 이러한 유전자에 의해 코딩되는 단백질들이 자궁내막 증식의 바이오마커로 사용될 수 있다.

하기 표 1에 포함된 후보물의 선별은 과학적 기준, 및 유전자의 양호한 발현 수준 (평균 대조군에 대해 적어도 180) 및 에스트로겐 에티닐 에스트라디올에 의한 적어도 평균 2배의 조절을 기초로 하였다. 표 1의 값은 표 2에 지시된 측정된 개 별적인 유전자 발현 수준의 유전자의 평균 발현 수준을 반영하는 임의의 단위, 즉 존재하는 전사물의 계산된 평균 개수를 나타낸다. 표 1의 회색 단의 헤드라인에 제공된 배수 증가는 에티닐 에스트라 디올 및 SERM 타목시펜 및 랄록시펜의 영향으로 인해 조정되는 분석된 전사물의 각각의 유전자의 유전자 발현에서의 변화를 가리킨다.

Claims

샘플 내의 에스트로겐 및/또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM)에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성의 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 이때 상기 하나 이상의 유전자는 전방 경사 2 호모로그(homolog) (제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)) (유전자 번호 10551); 카드헤린 11, 유형 2; 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 2 (버시칸(versican)) (유전자 번호 13003); 콜라겐, 유형 I 알파 1 (유전자 번호 1277); 콜라겐, 유형 I, 알파 2 (유전자 번호 1278); 콜라겐, 유형 III, 알파 1, (엘러스-단로스(Ehlers-Danlos) 증후군 유형 IV 보통염색체 우성) (유전자 번호 1281); 콜라겐, 유형 IV, 알파 1 (유전자 번호 1282); 콜라겐, 유형 VI, 알파 3 (유전자 번호 1293); 크레아틴 키나제, 뇌 (유전자 번호 24264); 다이네인, 세포질형, 경질 폴리펩티드 1 (유전자 번호 8655); 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (유전자 번호 2597); 열 충격 27kDa 단백질 1 (유전자 번호 3315); 마우스 팔다리싹 및 심장 유전자의 유사 오르토로그(ortholog) (유전자 번호 81606); 라이실 산화효소-유사 1 (유전자 번호 4016); 흑색종 항원, 패밀리 D, 1 (유전자 번호 9500); RGS16의 막 상호작용 단백질 (유전자 번호 51573); 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서(enhancer) (유전자 번호 5118); 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730); 분비형 프리즐드(frizzled)-관련 단백질 4 (유전자 번호 6424); 세린 (또는 시스테인) 단백질분해효소 억제제, 클레이드(clade) H (열 충격 단백질 47), 구성원 1, (콜라겐 결 합 단백질 1) (유전자 번호 871); 트로포마이오신 1 (알파) (유전자 번호 7168) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 (유전자 번호 3488) 및/또는 이의 조합물로 구성된 유전자 군으로부터 선택되는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 유전자가 콜라겐, 유형 I, 알파 1 (유전자 번호 1277); 콜라겐, 유형 I, 알파 2 (유전자 번호 1278); 콜라겐, 유형 III, 알파 1, (엘러스-단로스 증후군 유형 IV 보통염색체 우성) (유전자 번호 1281); 크레아틴 키나제, 뇌 (유전자 번호 24264) 및/또는 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730)인 방법.
제2항에 있어서, 유전자가 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (뇌) (유전자 번호 5730)인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 및/또는 활성의 수준이 전사물 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결정이 혼성화 반응을 포함하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 결정이 증폭 및/또는 신장 반응을 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 증폭이 역전사효소 PCR 및/또는 실시간 PCR로 구성된 군으로부터 선택된 1가지 이상의 기술을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현의 수준이 전방 경사 2 호모로그 (NP_006399), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 2 (버시칸) (NP_004376), 알파 1 유형 I 콜라겐 프리프로프로틴(preproprotein) (NP_000079), 알파 2 유형 I 콜라겐 (NP_000080), 알파 1 유형 III 콜라겐 (NP_000081), 알파 3 유형 IV 콜라겐 이소형(isoform) 1, 전구체 (NP_000082), 알파 4 유형 IV 콜라겐 전구체 (NP_000083), 알파 1 유형 IV 콜라겐 프리프로프로틴 (NP_001836), 알파 3 유형 IV 콜라겐 이소형 1 전구체 (NP_004360), 뇌 크레아틴 키나제 (NP_001814), 세포질형 다이네인 경질 폴리펩티드 (NP_003737), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (NP_002037), 글리실-tRNA 합성효소 (NP_002038), 성장 저지-특이적 1 (NP_002039), 열 충격 27kDa 단백질 1 (NP_001531), 가상 단백질 DKFZp 566J091 (NP_112177), 라이실 산화효소-유사 1 (NP_005567), 흑색종 항원 패밀리 D, 1 이소형 b (NP_008917), RGS16의 막 상호작용 단백질 (NP_057725), 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 (NP_002584), 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (NP_000945), 분비형 프리즐드-관련 단백질 4, (NP_003005), 세린 (또는 시스테인) 단백질분해효소 억제제, 클레이드 H1, 구성원 1 전구체 (NP_001226), 트로포마이오신 1 (알파) (NP_000357) 및/또는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5 (NP_000590)로 구성된 단백질 생성물 군으로부터 선택된 단백질 생성물의 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
제8항에 있어서, 단백질 생성물이 알파 1 유형 I 콜라겐 프리프로프로틴 (NP_000079), 알파 2 유형 I 콜라겐 (NP_000080), 알파 1 유형 III 콜라겐 (NP_000081), 뇌 크레아틴 키나제 (NP_001814) 및/또는 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDA (NP_000945)인 방법.
제9항에 있어서, 단백질 생성물이 프로스타글란딘 D2 합성효소 21kDa (NP_000945)인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물 수준이 효소에 의한 방법, 결합 방법, 물리적 방법 및/또는 면역학적 방법에 의해 결정되는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 체액 또는 조직 샘플인 방법.
제12항에 있어서, 체액이 혈액, 혈장, 소변 및/또는 혈청인 방법.
샘플 내의 에스트로겐 및/또는 SERM에 의해 조정되는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준 및/또는 이의 전사물 수준을 결정하기 위한 캐리어(carrier) 및 프로브(probe)를 포함하고, 이때 상기 하나 이상의 유전자는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 유전자들로 구성된 군으로부터 선택되는, 샘플 내의 자궁내막 증식을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하기 위한 어레이.
샘플 내의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준을 결정하는 것을 포함하고, 이때 건강한 대상에 대한 기준값으로부터 실질적으로 벗어나는 발현 및/또는 활성 수준은 자궁내막 증식의 기능장애 또는 이에 대한 소인을 가리키는 것인, 대상에서의 자궁내막 증식 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애 및/또는 컨디션의 진단 방법.
제15항에 있어서, 대상이 포유동물인 방법.
제16항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 및/또는 활성 수준이 하나 이상의 유전자의 전사물 수준 및/또는 단백질 생성물의 수준을 측정함으 로써 결정되는 방법.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 장애 및/또는 컨디션이 자궁내막 위축, 발육부진 자궁내막, 무월경, 자궁내막염, 증강된 자궁내막 증식, 자궁내막증, 무질서한 월경 주기, 임신, 불임증, 자궁내막 과다형성, 자궁내막 폴립 및/또는 부인과 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제19항에 있어서, 부인과 종양이 자궁내막암, 유방암, 난소암, 외음부암 및/또는 질암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
자궁내막 증식에 대한 효과를 시험할 후보 작용제의 존재 하의 세포의 샘플 내의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성 수준을 상기 후보 작용제의 부재 하의 상기 발현 및/또는 활성 수준과 비교하여 결정하는 것을 포함하는, 자궁내막 증식 또는 이에 대한 소인과 관련된 장애 및/또는 컨디션의 조정인자를 스크리닝하는 방법.
자궁내막 증식의 표적 및/또는 조정인자로서의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자 및/또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 단백질 생성물의 용도.
제22항에 있어서, 자궁내막 증식과 관련된 장애 및/또는 컨디션에 대해 활성인 작용제의 제조를 위한 용도.
자궁내막 증식과 관련된 장애 및/또는 컨디션의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 유전자의 조정인자의 용도.