CN101427139A - 子宫内膜增殖的生物标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的方法。本发明还涉及用于定性和/或定量测定子宫内膜增殖的组合物或试剂盒和阵列。此外，本发明涉及用于诊断受试者中与子宫内膜增殖的功能异常相关的紊乱或其倾向的方法。

Description

子宫内膜增殖的生物标记
发明领域
本发明涉及用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的方法。本发明还涉及用于定性和/或定量测定子宫内膜增殖的组合物或试剂盒和阵列。另外，本发明涉及用于诊断受试者中与子宫内膜增殖功能异常相关的紊乱或此倾向的方法。
发明背景
子宫内膜是子宫腔的粘膜。在卵巢激素的影响下，子宫内膜中发生了必要的解剖学和功能上的改变。
因此，在生理条件下，子宫内膜在激素控制下变厚，并且贯穿于女性的生育周期，如果未发生怀孕会在月经期间脱落并在每个月经周期再生。直到月经周期的第五天，子宫内膜基质和腺体显示出增殖，后者延伸。沿着腺体排列的细胞是立方形的，具有明确的界膜，而基质细胞是细长的纺锤形的，表明早期增殖阶段。一周后，在第12天，腺体是非常大的并且此时是扩张的，表明晚期增殖阶段。在此阶段，血管也已突出并且毛细血管扩张。这些增殖改变是由于雌激素尤其是此时卵巢所分泌的17-β-雌二醇的影响。排卵之后，黄体产生大量的孕酮，其引起腺体中分泌的改变以及基质细胞的膨胀。有充足的血供应且毛细血管变成窦状的。直到28天周期结束，基质变得更加血管化和肿胀的，出现小量出血和血栓，而子宫内膜最终因激素支持的消失而脱落。子宫内膜的浅层与血和白血球一起脱落并排出，意味着月经。在一天或两天内有裂伤的表面通过来自腺体基部的上皮细胞增殖而得以愈合。
然而，失调的子宫内膜增殖可与几种妇科疾病包括子宫内膜异位(endometriosis)、子宫内膜异位(adenomyosis)、子宫内膜增生和妇科癌症相关。
到目前为止，对有关子宫内膜增殖的生理学和病理生理学机制所知甚少。而且，直到目前还未建立起对子宫内膜增殖相关疾病的有效治疗和/或预防。
对这些生理学和病理生理学机制以及对其中所涉及的基因和蛋白质功能的了解可为子宫内膜增殖的诊断和预后提供工具，并因而为子宫内膜增殖相关疾病的治疗和/或预防提供工具。
发明概述
本发明提供了用于鉴定受试者中子宫内膜增殖的阶段的方法。该目标是根据本发明通过提供定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的方法来完成的，所述方法包括测定所述样品中受雌激素和/或选择性雌激素受体调节剂(SERMs)调节的至少一种基因的表达水平和/或活性。
令人惊奇地，鉴定出受雌激素和SERMs调节的几种基因，其中所述基因的所述调节与雌激素和/或SERMs诱导子宫内膜增殖的不同潜力相关。
优选实施方案详述
雌激素是对于正常的性发育和雌性生殖器官例如子宫内膜发挥功能所必需的类固醇激素。雌激素对于骨骼和心脏也具有重要的非生殖性影响。雌激素包含一组天然和合成物质。天然雌激素包括雌二醇(即17-β-雌二醇)、雌酮和雌三醇。特别是在17-β-雌二醇的影响下，子宫内膜发生增殖。17-β-雌二醇诱导其自身受体以及孕酮受体的合成。因此，子宫内膜在周期的前半部分(即在增殖阶段)增殖，导致子宫内膜的一定厚度，其达到最大8到10mm。除了天然的雌激素，治疗上有时将雌激素以缀合物的形式给予，例如乙炔雌二醇，举例来说，缀合的雌激素或己烯雌酚。
响应雌激素的体内组织称为“雌激素敏感性”或“雌激素易感性”组织，并包括泌尿生殖道、心血管系统和骨骼系统的细胞。包含雌激素敏感性组织的细胞含有雌激素受体(ER)。ER可以为α型或β型。雌激素进入细胞并结合至此类细胞的细胞质中的ER上，从而形成了雌激素-ER复合体。将结合至受体的分子例如雌激素称为“配体”。
一旦雌激素配体结合至ER，雌激素-ER复合体迁移至细胞核并结合至被称为“雌激素反应元件”的细胞基因组内DNA的特定序列。此类雌激素反应元件位于细胞核内特定基因的启动子中。
雌激素-ER复合体与雌激素反应元件的结合引起特定基因转录的激活或抑制。特定基因转录的激活或抑制是由配体-受体复合体的形成引起的一种类型的分子和/或细胞反应。当此类反应发生时，受体据说已被激活。
因此，雌激素-ER复合体作为转录因子调节这些基因的表达。当配体结合至受体且分子和/或细胞反应(例如，基因的转录调节)发生时，将此类配体称为“激动剂”，将产生的反应称作“激动作用”。
除了雌激素和ER在细胞组织的正常发育和功能发挥中所起的作用外，雌激素和ER在某些人类疾病状态例如增强的子宫内膜增殖、子宫内膜异位、妇科癌症例如乳腺癌等等中也发挥重要作用。
对由雌激素引起的结合至ER并阻止分子和/或细胞反应的物质给予了通用名称“选择性雌激素受体调节剂”或SERMs。SERMs也可被称作“抗雌激素”。SERMs包含产生不同反应的ER配体。例如，一种特定的SERM可为拮抗剂。另一种特定的SERM可为部分激动剂。甚至另一特定的SERM可结合至ER并产生分子和/或细胞反应，该反应在强度上仅稍低于雌激素所产生的反应。此SERM将导致比部分激动剂所产生的反应更强的分子和/或细胞反应，但并不被称为激动剂，因为该分子和/或细胞反应小于由激动剂样雌激素所产生的反应。
化学上，可将SERMs分为三类。第一类包含三苯乙烯衍生物，他莫昔芬——一种抗癌药是其中之一。作为三苯乙烯衍生物的其它物质有托瑞米芬、着洛西芬、(3-羟泰米芬)、艾多昔芬、TAT-59(4-羟泰米芬的磷酸化衍生物)和GW5638(他莫昔芬的羧酸衍生物)。SERMs的第二组包含其它非类固醇类化合物。此类包含EM-800、EM652(苯并吡喃)、雷洛昔芬、LY353381(SERM3)和LY357489。SERMs的第三类包含具有较好抑制雌激素产生的反应的能力的类固醇类化合物。ICE-182780(ICE)是此第三类的成员。包含每种类别的次感受器列表是不完全的，可能存在其它的感受器。
根据本发明，已发现某些基因的表达水平和/或活性受雌激素和/或SERMs调节，与所述雌激素和SERMs诱导子宫内膜增殖的不同潜能相关。因此，测量所述某些基因的表达和/或活性的水平为定性和/或定量测定样品种子宫内膜增殖提供了方法。
优选地，雌激素是雌二醇，且SERMs是他莫昔芬和/或雷洛昔芬。
在优选的实施方案中，本发明的方法，受雌激素和/或SERMs调节的基因是哺乳动物基因，优选地人类基因。
预期将本发明的方法应用于人、兽医和/或诊断药物。
优选地，受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因选自如下基因：前梯度2同源物(光滑爪蟾(Xenopus laevis))(基因ID10551)；硫酸软骨素蛋白聚糖2(多功能蛋白聚糖)(基因ID 13003)；胶原，I型，α1(基因ID 1277)；胶原，I型，α2(基因ID 1278)；胶原，III型，α1(IV型爱-唐综合征(Ehlers-Danlos syndrome)，常染色体显性)(基因ID 1281)；胶原，IV型，α1(基因ID 1282)；胶原，VI型，α3(基因ID 1293)；肌酸激酶，脑(基因ID 24264)；动力蛋白，细胞质，轻多肽1(基因ID 8655)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(基因ID 2597)；热激27kDa蛋白1(基因ID 3315)；小鼠肢芽和心脏基因的可能的直向同源物(基因ID81606)；赖氨酰氧化酶样1(基因ID 4016)；黑素瘤抗原，D家族，1(基因ID9500)；RGS16的膜相互作用蛋白(基因ID 51573)；前胶原C内肽酶增强子(基因ID 5118)；前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID 5730)；分泌型卷曲相关蛋白4(基因ID 6424)；丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝H(热激蛋白47)，成员1(胶原结合蛋白1)(基因ID 871)；原肌球蛋白1(α)(基因ID 7168)和/或胰岛素样生长因子结合蛋白5(基因ID 3488)和/或其组合。
更优选地，至少一种基因是胶原，I型，α1(基因ID 1277)；胶原，I型，α2(基因ID 1278)；胶原，III型，α1(IV型爱-唐综合征，常染色体显性)(基因ID 1281)；肌酸激酶，脑(基因ID 24264)和/或前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID 5730)。
最优选地，至少一种基因是前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID5730)。
上述基因的检索号是通过参考公共基因数据库NCBI Entrez Gene数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene)进行标示的。
在本发明优选的实施方案中，受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的基因表达水平和/或活性是通过测量所述基因的转录水平来测定的。
令人惊奇地，发现转录物的转录水平(见实施例1)是与雌激素和SERMs诱导子宫内膜增殖的不同雌激素潜能相关的。
优选地，显著性的测定可如实施例1中所述地来进行。显著性的测定可通过充分数量例如至少500、优选地500至700个探针组(基因)的基因表达分析来进行。用于获得转录物的组织优选地是垂体和子宫组织。
测定基因转录水平的方法包括测定mRNA的水平。可通过本领域技术人员所公知的方法从样品中分离RNA，例如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第一卷，第7章，pp7.4to 7.12，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，第3版(2001)中所述。
在本发明优选的实施方案中，利用杂交反应进行转录水平的测定。通常，杂交反应包括将至少一种寡核苷酸或多核苷酸与转录产物mRNA相杂交。优选地，测定进一步包括延长和/或扩增反应。
在本发明优选的实施方案中，扩增包括选自反转录酶PCR和/或实时PCR的至少一种技术。
根据本发明，寡核苷酸或多核苷酸优选地具有能与上述基因的互补转录物特异杂交的足够长度。如此处所述，术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”指的是单链核酸。通常，寡核苷酸或多核苷酸在长度上将是至少16至20个核苷酸，尽管在一些情况下至少20至25个核苷酸的较长探针将是期望的。可用一种或多种标记部分标记寡核苷酸或多核苷酸从而允许对杂交的探针/靶多核苷酸复合体的检测。标记部分可包括通过光谱学、生物化学、光化学、生物电子学、免疫化学、电学、光学或化学方法进行检测的组分。标记部分的例子包括但不限于，放射性同位素，例如32P、33P、35S，化学发光化合物、标记的结合蛋白质、重金属原子、光谱学标记物例如荧光标记物和染料、连接的酶、质谱法标签和磁性标签。
根据本发明的另一优选实施方案，通过测量受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的蛋白质产物的水平来测定基因表达水平。优选地，蛋白质产物选自如下具有相应检索号的蛋白质产物：前梯度2同源物(NP_006399)、硫酸软骨素蛋白聚糖(多功能蛋白聚糖)(NP_004376)、α1I型胶原前蛋白原(NP_000079)、α2I型胶原(NP_000080)、α1III型胶原(NP_000081)、α3IV型胶原同工型1前体(NP_000082)、α4IV型胶原前体(NP_000083)、α1IV型胶原前蛋白原(NP_001836)、α3IV型胶原同工型1前体(NP_004360)、脑肌酸激酶(NP_001814)、细胞质动力蛋白轻多肽(NP_003737)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(NP_002037)、甘氨酰-tRNA合成酶(NP_002038)、生长阻滞特异1(NP_002039)、热激蛋白27kDa蛋白1(NP_001531)、假设的蛋白质DKFZp566J091(NP_112177)、赖氨酰氧化酶样1(NP_005567)、黑素瘤抗原家族D，1同工型b(NP_008917)、RGS16的膜相互作用蛋白(NP_057725)、前胶原C内肽酶增强子(NP_002584)、前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)、分泌型卷曲相关蛋白4(NP_003005)、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝H1，成员1前体(NP_001226)、原肌球蛋白(α)(NP_000357)和/或胰岛素样生长因子结合蛋白5(NP_000590)。
更优选地，蛋白质产物是α 1 I型胶原前蛋白原(NP_000079)、α 2 I型胶原(NP_000080)、α 1 III型胶原(NP_000081)、脑肌酸激酶(NP_001814)、和/或前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)。
最优选地，蛋白质产物是前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)。
所有上述蛋白质选自有关蛋白序列的公共可用数据库NCBI Entrez蛋白质数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entry/query.fcgi？db＝protein)。
优选地，蛋白质产物是通过酶结合、免疫学和/或物理学方法测定的，其可适用于蛋白质测定例如免疫测定或质谱法。
可通过探针对至少一种蛋白质或其片段例如催化结构域的表达进行检测，所述探针经可检测标记或随后可经标记。通常，探针可为能够识别所表达蛋白质的抗体、抗体衍生物或抗体片段。如此处所用的，术语“抗体”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体和生物学功能抗体片段，其为足以用于抗体片段结合蛋白质或其片段的那些片段。
为生产针对由一种公开的基因编码的蛋白质或针对该蛋白质片段的抗体，可通过利用所述多肽或其部分注射来免疫多种宿主动物。所述动物可包括但不限于兔子、小鼠和大鼠等等。多种佐剂可用于增强免疫反应，依赖于宿主种类，包括但不限于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普流罗尼多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在可用的人佐剂例如BCG(bacille Calnett-Guerlin)和Corinebacterium parvum。多克隆抗体是抗体分子的异质性群体，所述抗体分子来自于经抗原例如目标产物或其抗原功能性衍生物所免疫的动物的血清。为生产多克隆抗体，可通过利用所编码的蛋白质或其部分注射来免疫例如上述的那些宿主动物，该注射补充有同样如上所述的佐剂。
单克隆抗体(mABs)为针对特定抗原的抗体的同质性群体，可通过提供用于通过培养的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来完成。这些技术包括但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(Nature，Vol.256，pp.495-497(1975)和美国申请号4,376,110)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，Immunology Today，Vol.4，p.72(1983)；Cole等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.80，pp.2026-2030(1983))、以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96(1985))。此类抗体可为任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。本发明的产生mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。在体内高效价mAbs的生产使其成为目前优选的生产方法。此外，可使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，pp.6851-6855(1984)；Neuberger et al.，Nature，Vol.312，pp.604-608(1984)；Takeda等人，Nature，Vol.314，pp.452-454(1985))，该技术通过将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起来实现。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物种类的分子，例如具有来自鼠mAb的可变或高变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子。备选地，所述用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science，Vol.242，pp.423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.85，pp.5879-5883(1988)；和Ward等人，Nature，Vol.334，pp.544-546(1989))可适用于生产差异表达的基因单链抗体。单链抗体可通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段从而获得单链多肽来形成。最优选地，用于生产“人源化抗体”的技术可适用于生产针对蛋白质、其片段或衍生物的抗体。此类技术在美国专利号5,932,448、5,693,762、5,693,761、5.585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429中公开。识别特定表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，此类片段包括但不限于，可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段、和可通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生的Fab片段。备选地，可构建Fab表达文库(Huse等人，Science，Vol.246，pp.1275-1281(1989))来促使对具有目的特异性的单克隆Fab片段的快速和容易的鉴定。
然后可利用上述抗体、抗体衍生物或抗体片段通过免疫测定方法来测定生物样品中表达的蛋白质(片段)的水平。此类免疫测定方法包括但不限于，蛋白质印迹、荧光激活细胞分选术(FACS)、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点测定(ELISPOT)、斑点印迹、竞争性和非竞争性蛋白质结合测定、和其它通常使用及在科学和专利文献中广泛描述的方法，以及许多商业上使用的方法。
为检测简便，特别优选的是存在多种变型的夹层ELISA，有意将所有变型均包括于本发明中。例如，在典型的向前测定中，将未标记的抗体、抗体衍生物或抗体片段固定于固体基质上并将待测样品与结合的分子相接触，并温育一段足以允许形成抗体-抗原二元复合体的时间。此时，然后将标记有能够诱导可检测信号的分子的第二抗体、抗体衍生物或抗体片段加入并温育，允许足以形成抗体-抗原-标记抗体的三元复合体的时间。洗涤除去任何未反应物质，并通过观察信号来测定抗原的存在或可通过与含有已知量抗原的对照样品相比较来定量抗原。向前测定的变型包括同时测定，其中将样品和抗体同时添加至结合的抗体中，或者反向测定，其中首先组合标记的抗体和待测样品、温育并添加至未标记的表面结合的抗体中。这些技术对本领域技术人员而言是公知的，且较小变型的可能性将是显而易见的。如此处所述，“夹层测定”意在包括基础的双位点技术的所有变型。
在此类测定中用于标记抗体、抗体片段或衍生物的最普遍使用的报告分子是含有酶、荧光团或放射性核素的分子。在酶免疫测定(EIA)的情况中，通常通过戊二醛或高碘酸将酶连接至第二抗体。然而，如可容易地认识到，存在多种不同的连接技术，他们对于本领域技术人员而言是公知的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。通常选择用于特定酶的底物来在相应酶水解下产生可检测的颜色变化。例如，对硝基苯磷酸适合于与碱性磷酸酶缀合物使用；对于过氧化物酶缀合物，1，2-苯二胺或甲苯胺是常用的。还可能使用产生荧光产物的荧光底物，而不是上面所指出的显色底物。然后将含有合适底物的溶液加入三元复合体中。底物与连接至第二抗体上的酶反应，发出定性可见的信号，该信号进一步可定量，通常用分光光度计测量，从而给出对蛋白或其片段的量的评估。备选地，荧光化合物例如荧光素和罗丹明可化学偶联至抗体，而不改变其结合能力。当受到具有特定波长的光照激发时，荧光染料标记的抗体吸收光能，诱导分子的应激状态，随后是具有特征性的较长波长的光发射。发射显示为特征性的颜色，利用光学显微镜可在视觉上检测。免疫荧光和EIA技术都是本领域很完善建立的并且对于本方法是特别优选的。然而，也可使用其它报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。如何改变步骤来适于所需应用对本领域技术人员而言是显而易见的。
优选地，根据本发明用于本方法的样品是体液或组织样品。优选地，体液是血液、血浆、尿液和/或血清。
本发明的另一方面涉及用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的组合物或试剂盒，其包含用于测定受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的基因表达水平和/或活性的试剂。优选地，受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的基因表达和/或活性选自如上所述的基因。
在本发明优选的实施方案中，组合物或试剂盒包含用于测定受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的转录水平的试剂。优选地，用于测定转录水平的所述试剂包含杂交探针和任选地用于延长和/或扩增的引物。优选地，杂交探针和引物能够结合至上述基因的转录物上。
本发明另一优选的实施方案包含用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的组合物或试剂盒，其包含用于测定如上所述的至少一种基因编码的蛋白质产物的水平。
优选地，组合物或试剂盒包含用于酶、结合、生理学和/或免疫学测定以便测定如上定义的至少一种基因编码的蛋白质产物水平的组合物或试剂盒。更优选地，组合物或试剂盒包含能够结合由上述至少一种基因编码的至少一种蛋白质产物的至少一种抗体、抗体衍生物或抗体片段。优选地，所述组合物或试剂盒包含如上所详细描述的单克隆抗体。
在另一优选的实施方案中，提供了组合物或试剂盒，其进一步包含用于收集生物样品的装置。更优选地，本发明的组合物或试剂盒进一步包含用于收集受试者的生物样品的装置，另外还可包含试剂盒的使用说明书以及对所测定的基因表达水平和/或活性及蛋白质产物水平的解释。
本发明的另一方面涉及用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的阵列，其包含载体和用于测定所述样品中受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的表达水平和/或活性和/或转录水平的探针。
阵列是检测从多种基因所获得的mRNA转录物水平的特别有用的方法，其涉及标记的mRNA与寡核苷酸或多核苷酸的有序阵列的杂交。通常将该杂交方法中所用的寡核苷酸或多核苷酸结合至固相支持体上。固相支持体的例子包括但不限于膜、滤器、载玻片、纸、尼龙、晶片、纤维、磁性或非磁性层、凝胶、管、聚合物、聚氯乙烯盘，等等。寡核苷酸或多核苷酸可直接或非直接、共价或非共价结合的任何固体表面均可使用。用于表达监测的此类探针阵列可利用本领域技术人员公知的技术来制备，例如如Affymetrix公司的手册中所述的。此类方法允许同时检测多种基因的转录水平，从而产生基因表达图谱或模式。
另外，阵列是测定如上所述的基因中至少一种多态性的存在的优选方法。此类阵列优选地包含具有固定其上的至少一种探针的载体，所述探针用于测定受雌激素和/或SERMs调节的基因的至少一种多态性的存在。优选地，阵列载体，例如平面载体或微通道装置，具有固定其上的多种不同探针，所述探针定位于载体的不同区域，这些区域经设计以便它们可结合核酸分子例如RNA分子或DNA分子、扩增产物、引物延长产物等等，所述核酸分子含有这样的序列，其中待测多态性位于所述序列中。因而，通过检测核酸样品分子对固定于载体上的探针的位点特异性结合事件来鉴定所分析的多态性可得以完成。
本发明的另一方面涉及用于诊断受试者中与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况或其倾向的方法，其包括测定所述样品中如上所述至少一种基因的表达水平和/或活性，其中实质上偏离于健康受试者的参考值的表达水平和/或活性表明子宫内膜增殖的功能异常或其倾向。
术语“紊乱”定义为哺乳动物、优选人的病理状态，术语“状况”定义为哺乳动物、优选人的非病理状态。在本发明的上下文中，与子宫内膜增殖相关的状况是例如怀孕或排卵，然而与子宫内膜增殖相关的紊乱是例如子宫内膜异位或子宫内膜炎。优选地，用于诊断根据本发明的紊乱的方法与子宫内膜增殖的功能异常相关。
本发明首次公开了具有子宫内膜增殖功能异常或其倾向的受试者中差异表达的基因。可将来自从受试者获得的生物样品的基因表达图谱与来自从未受子宫内膜增殖功能异常或其倾向影响的受试者或受试者群体获得的样品的基因表达图谱进行比较。从而可确定受试者是否受到子宫内膜增殖功能异常的影响或处于受影响的危险中。
优选地，受试者是哺乳动物，更优选地是人。
在优选的实施方案中，通过检测至少一种基因的转录水平和/或蛋白质产物的水平来测定基因表达水平和/或活性。
如果在体液中可检测的话，上述基因所编码的蛋白质可用作子宫内膜增殖的生物标记。
优选地，与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况或其倾向选自子宫内膜萎缩、发育不良的子宫内膜闭经、子宫内膜炎、增强的子宫内膜增殖、子宫内膜异位、紊乱的月经周期、怀孕、排卵、不孕、子宫内膜增生、子宫内膜息肉和/或妇科肿瘤。
子宫内膜萎缩是其中子宫内膜阻止正常发育的一种紊乱。子宫内膜萎缩的一般原因是长期使用孕激素治疗，引起了生物体中雌激素的强烈耗竭。
由于子宫发育的障碍，子宫内膜会发育不全。
此外，月经异常例如闭经与子宫内膜增殖功能异常相关。将闭经定义为在很多种情况下的无月经。在生理条件下，闭经发生在生命的四个不同阶段：初潮的早期、怀孕期间、哺乳期间和绝经之后。在病理状况下，由于例如子宫内膜萎缩或发育不全的子宫内膜的原因而发生了闭经。然后，与月经周期相关的状况例如怀孕和排卵是与子宫内膜增殖相关的。
与子宫内膜增殖功能异常相关的另一紊乱是不育，例如由于子宫内膜异位或子宫内膜炎引起，下面对其做进一步解释。
根据本发明与子宫内膜增殖功能异常相关的另一重要疾病是子宫内膜异位。
子宫内膜异位是女性中的第二常见疾病，将其定义为在子宫外出现了子宫内膜细胞。子宫内膜异位影响大约1/5的育龄妇女，以及多达1/2的有生育力问题的妇女。
在正常情况下，子宫内膜仅发现于子宫。在子宫内膜异位中，子宫外部发现具有类似子宫内膜的组织学外观的组织，例如在子宫外部、在肠上或甚至在胰腺或肺中。尽管这些子宫内膜异位病灶位于子宫外部，它们在月经期间也会出血，因此它们受女性周期的激素影响。因为子宫内膜异位病灶，如子宫内膜，在周期过程中经历体积变化，所以这些变化可取决于位置而引起疼痛。而且，身体对子宫内膜异位细胞和炎症反应起反应，其再次引起疼痛。此外，炎症导致卵巢和输卵管区域的粘连，并因此导致受影响妇女的所谓机械性不育。显然，然而，在子宫内膜异位中，也释放信使(例如细胞因子、前列腺素类)，其甚至在不存在粘连的情况下可降低受影响妇女的生育力。
根据其病理生物学特性，可将子宫内膜异位细胞分类为处于正常细胞和肿瘤细胞之间：一方面它们未显示出肿瘤行为，然而另一方面，像转移性肿瘤细胞一样，它们能够移动穿过生物中的器官边界并能生长到其它器官中，即它们显示出侵袭行为。因此，文献中将子宫内膜异位细胞定义为“良性肿瘤细胞”，尽管直到现在在此类型细胞中还未发现原癌基因中的肿瘤特异性突变。
与子宫内膜增殖功能异常相关的另一紊乱或其倾向是子宫内膜炎。将该紊乱定义为子宫内膜的急性炎症，其可在分娩或流产后响应于感染或响应于避孕器具的插入而发生或者作为淋病感染的一部分。
根据本发明的另一相关紊乱是子宫内膜增生，将其定义为增强的子宫内膜，尤其是腺上皮的增殖。将该紊乱细分为I至III级(非典型增生)。首先，III级是子宫内膜癌的前癌状况。子宫内膜增生是在缺乏孕激素(“非对抗性雌激素”)情况下雌激素的延长影响下发生的，主要是在更年期和绝经后期。
此外，子宫内膜息肉主要发生在所有女性的10％中的更年期。大多息肉伴随着子宫内膜基底的局限性增生而生长。在患有子宫内膜息肉的病人中，肌瘤的发生高于正常群体。这表明了子宫中普遍的增殖活性。仅在低于1％的病例中有发现于子宫内膜息肉中的癌。在子宫内膜息肉中，可发现来自子宫的不规则或进行性出血。
此外，几种妇科肿瘤与子宫内膜增殖功能异常相关，其选自子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、外阴癌和/或阴道癌。
子宫内膜癌是最常见的妇科癌症之一。其通常发现于绝经后的妇女中(75％)，55至65的年龄之间最频繁，且大多数(60％)在该范围的后半部分。肿瘤的大多数(60％)是纯腺癌。根据其腺体分化程度可将其分为三组。通常，此癌从子宫腔扩散缓慢，可能是因为子宫内膜缺乏淋巴系统。在晚期病例中出现远端转移瘤。肺部沉积是最普遍的。此癌的实际原因是未知的。争论已集中围绕于该肿瘤和雌激素之间的确定关联。已经报道了单独给予雌激素作为绝经后激素替代疗法的女性中以及那些发生了卵巢的雌激素分泌型肿瘤的病人中增加的发病率。雌激素在子宫内膜癌的病原学中的中心位置得到了下述事实的加强，在激素替代疗法中向雌激素中添加孕激素显示出消除了子宫内膜癌的增加的发病率。
本发明的另一方面涉及用于筛选与子宫内膜增殖功能异常相关的紊乱或其倾向的调节剂的方法，其包括在候选试剂的存在下测定细胞样品中如上所述至少一种基因的表达水平和/或活性，将检测所述候选试剂对子宫内膜增殖的影响，与不存在所述候选试剂时的所述表达水平和/或活性相比较。此类方法包括体内或基于细胞和/或无细胞测定，用来鉴定能够干扰上述受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的表达和/或活性的化合物。
本发明还涉及如上所述至少一种基因和/或蛋白质产物作为药物开发靶标的用途，所述药物对与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况是有活性的。药物寻靶是针对化合物向身体特定组织的递送的策略。特定靶标的药物能力是通过化合物例如小分子药物或抗体能够达到靶标的程度、或通过化合物能够实际达到靶标的效率来定义的。多种参数影响特定靶标的药物能力，这些参数包括细胞定位、抗药性的发展、转运机制例如输出泵、副作用、毒性及其它。将受体、蛋白质、酶、DNA、RNA和核糖体靶标考虑作为治疗干预的靶标。依据本发明，受雌激素和/或选择性雌激素受体调节剂(SERMs)调节的基因、所述基因的转录物及其蛋白质产物作为靶标是特别有用的。通过利用所述基因、转录物和/或蛋白质产物作为用作药物靶标的标记，可能发现对子宫内膜增殖相关紊乱和/或状况新的和更好的疗法。
根据本发明，药物组合物优选含有与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或添加剂相组合的活性成分。该组合物可单独或与至少一种其它试剂例如稳定性化合物组合施用，其可在任何无菌、生物相容的药物载体中施用，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。该组合物可单独或与其它试剂、药物或激素组合施用于病人，其中至少一种基因的水平和/或至少一种蛋白质产物的水平实质上偏离健康受试者的参考值的，这表明子宫内膜增殖的功能异常或其倾向。
药物组合物可通过任意数量的途径来施用。药物组合物可通过任意数量的途径来施用，包括但不限于口服的、舌下的、静脉内的、肌内的、关节内的、动脉内的、髓内的、鞘内的、心室内的、眼内的、鞘内的、大脑内的、颅内的、呼吸的、气管内的、鼻咽的、经皮的、真皮内的、皮下的、腹膜内的、鼻内的、经肠的、局部的、或经直肠的方式，灌注或植入。优选地，所述施用途径是口服的。
当施用时，将本发明的药物组合物以药学上可接受的制剂形式施用。如此处所用的术语“药学上可接受的载体”指一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包胶物质，其适用于对哺乳动物包括人类施用。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其相结合来方便应用。
术语“药学上可接受的”意味着非毒性材料，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性。此类制剂可常规地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、补充的免疫增效剂例如佐剂和细胞因子以及任选地其它治疗剂例如化疗剂。
当用于药物中时，盐应当是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐，并不排除于本发明的范围之外。
药物组合物可含有合适的缓冲剂，包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
药物组合物还可任选地含有合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯类和硫柳汞。
药物组合物可方便地存在于单位剂量形式中，并可通过任意一种药学领域中众所周知的方法来制备。所有方法均包括使活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，通过使活性化合物与液体载体、细分固体载体、或两者均一并紧密地相结合，然后如果需要的话，使产品成型来制备组合物。
适合口服施用的组合物可呈现为离散单位，例如胶囊剂、片剂、锭剂，每种含有预定量的活性化合物。其它组合物包括水性液体或非水性液体形式的混悬液，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。
适合肠胃外给药的组合物方便地包含多肽或编码所述多肽的核酸的无菌水性或非水性制剂，其优选地与接受者的血液等渗。该制剂可根据已知方法利用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可为在非毒性的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂有水、林格液、和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌的非挥发性油用作溶剂或悬浮介质。因此，可使用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于注射物的制备中。
适合于口服、皮下、静脉内、肌内等施用的载体制剂可在Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到。
本发明的另一方面包含如上所述的至少一种基因的调节剂的用途，用于制造预防和/或治疗与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况的药物。
优选地，药物组合物的调节剂是雌激素和/或选择性雌激素受体调节剂(SERM)、其拮抗剂和/或激动剂，例如抗体或抗体片段、siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微RNA)、反义分子和/或核酶。
蛋白质或激素的激动剂，例如雌激素或SERM，是例如酶、辅酶、膜受体等的分子，其增强了各个蛋白质或激素的活性。
在一个方面，特异于本发明的蛋白质产物和同源性蛋白质产物的抗体可直接用作调节剂，例如拮抗剂或激动剂，或间接作为用于将药剂带向表达该蛋白质的细胞或组织的靶向或递送机理。抗体可利用本领域公知的方法来产生。此类抗体可包括但不限于多克隆的、单克隆的、嵌合的单链、Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。中和抗体(即那些抑制二聚体形成的抗体)是对于治疗用途特别优选的。
为生产抗体，多种宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人等等可通过利用具有免疫原特性的蛋白质或其片段或寡肽注射进行免疫。取决于宿主种类，可使用多种佐剂来增强免疫反应。优选用于诱导针对蛋白质产物的抗体的肽、片段或寡肽具有由至少5个氨基酸且更优选地至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。
针对蛋白质产物的单克隆抗体可利用通过培养的连续细胞系提供生产抗体分子的任何技术来制备。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和EBV杂交瘤技术(K
Figure A200780014476D0022081317QIETU
hler，G.等人(1975)Nature 256：495-497；Kozbor，D.等人(1985)J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote，R.J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-2030；Cole，S.P.等人(1984)Mol.Cell Biol.62：109-120)。
另外，可使用开发的用于生产“嵌合抗体”的技术，其将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因来获得具有合适的抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison，S.L.等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855；Neuberger，M.S.等人(1984)Nature 312：604-608；Takeda，S.等人(1985)Nature314：452-454)。备选地，利用本领域已知的方法，可改造所述用于生产单链抗体的技术，来生产特异于本发明的蛋白质产物和同源性蛋白质产物的单链抗体。具有相关特异性但具有不同个体基因型组成的抗体，可通过来自随机组合免疫球蛋白文库的链改组来产生(Burton，D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：11120-11123)。还可通过诱导淋巴细胞群体在体内产生或通过筛选重组免疫球蛋白文库或如文献中所公开的系列高度特异的结合试剂来生产抗体(Orlandi，R.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86：3833-3837；Winter，G.等人(1991)Nature 349：293-299)。
还可产生含有蛋白质产物的特异结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab′)2片段，和Fab片段，所述Fab片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫键来产生。备选地，可构建Fab表达文库来促使具有目的特异性的单克隆Fab片段的快速和容易的鉴定(Huse，W.D.等人(1989)Science 254：1275-1281)。
可使用多种免疫测定进行筛选来鉴定具有目的特异性的抗体。利用具有确定特异性的多克隆或单克隆抗体的用于竞争性结合和免疫放射测定的多种方案是本领域中公知的。此类免疫测定通常包括测量蛋白质和其特异性抗体之间的复合体形成。利用与两个非干扰性蛋白质表位相反应的单克隆抗体的基于双位点单克隆的免疫测定是优选的，但也可使用竞争性结合测定(Maddox，同上)。
在本发明的另一实施方案中，可将多核苷酸或其片段或核酸调节剂分子例如反义分子、适体、siRNA分子、miRNA分子或核酶用于治疗目的。在一方面，适体，即能够结合至本发明的蛋白质产物并调节其活性的核酸分子，可通过包括使用组合核酸文库的筛选和选择步骤来产生。
在另一方面，可将反义分子用于其中期望阻断mRNA转录的情况中。特别地，可利用与编码如上所述蛋白质产物和同源性蛋白质产物的多核苷酸互补的序列来转化细胞。因此，可将反义分子用于调节蛋白质产物活性或实现基因功能的调节。此技术是目前本领域公知的，并且可从沿着编码蛋白质产物的序列的编码区或调控区的多个位置来设计有义或反义寡聚体或更大的片段。可使用来自逆转录病毒、腺病毒、疱疹或痘苗病毒或来自多种细菌质粒的表达载体将核苷酸序列递送至靶器官、组织或细胞群体。可使用本领域技术人员所公知的方法构建重组载体，其将表达与编码本发明蛋白质和同源性蛋白质产物的基因的多核苷酸互补的反义分子。这些技术在Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)中有所描述。编码本发明蛋白质产物和同源性蛋白质产物的基因可通过用表达载体转化细胞或组织而关闭，所述表达载体表达高水平的编码本发明蛋白质产物和同源性蛋白质产物或其片段的多核苷酸。此类构建体可用于将不可翻译的有义或反义序列引入细胞中。甚至在不整合进DNA的情况下，此类载体仍可持续转录RNA分子直至它们被内源性核酸酶破坏。利用非复制型载体，瞬时表达可持续一个月或更长，如果合适的复制元件是载体系统的一部分，瞬时表达则会更长。
如上所述，基因表达的修饰可通过设计针对编码上述蛋白质产物和同源性蛋白质产物的基因的调控区(即启动子、增强子和内含子)的反义分子例如DNA、RNA或核酸类似物例如PNA来获得。来自转录起始位点，例如在起始位点的-10至+10位之间的寡核苷酸是优选的。类似地，利用“三螺旋”碱基配对方法学可实现抑制。三螺旋配对是有用的，因为引起双螺旋为结合聚合酶、转录因子或调节分子而充分打开的能力受到抑制。利用三螺旋DNA的新近治疗进展已在文献中有所描述(Gee，J.E.等人(1994)In；Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，N.Y.)。也可设计反义分子通过阻止转录物结合至核糖体而阻断mRNA的翻译。
核酶——酶促RNA分子，也可用来催化RNA的特异切割。核酶作用的机制涉及核酶分子对互补的靶RNA的序列特异性杂交，随后是内核分离。可使用的实例包括工程化的锤头基序核酶分子，其可特异且有效地催化编码本发明的蛋白质产物和同源性蛋白质产物的序列的内核分离。任何可能的RNA靶标内部的特异性核酶切割位点最初是通过扫描靶分子的核酶切割位点来鉴定的，所述核酶切割位点包括下列序列：GUA、GUU和GUC。一旦得以鉴定，可对对应于含有切割位点的靶基因区域的15至20个核糖核苷酸的短RNA序列评估其二级结构特征，该特征可使得寡核苷酸不可操作。候选靶标的适用性还可利用核糖核酸酶保护试验，通过测试与互补寡核苷酸的杂交的可及性来评估。
核酸调节剂分子，例如，反义分子和核酶可通过本领域已知的用于合成核酸分子的任何方法来制备。这些包括用于化学合成寡核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成。备选地，RNA分子可通过DNA序列的体外和体内转录来产生。可将此类DNA序列掺入多种具有合适的RNA聚合酶启动子的载体中，例如T7或SP6。备选地，可将组成型或可诱导地合成反义RNA的这些cDNA构建体引入细胞系、细胞或组织中。可修饰RNA分子来增强细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’端增加侧翼序列或在核碱基、糖和/或磷酸部分中的修饰，例如在分子的主链内部使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键。此概念是PNAs的生产中固有的，并可通过包含非传统碱基例如肌苷、queosine、和wybutosine以及乙酰基、甲基、硫代、和腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的类似修饰形式在所有这些分子中得以扩展，上述修饰形式不容易被内源性核酸内切酶所识别。
将载体引入细胞或组织的许多方法是可用和同样适用于体内、体外和先体外后体内(ex vivo)。对于先体外后体内治疗，可将载体引入从病人取出的干细胞并进行克隆繁殖用于自体移植回同一病人中。通过转染和通过脂质体注射的递送可利用本领域中公知的方法来完成。可将上述的任何治疗方法用于任何合适的受试者，包括，例如哺乳动物例如狗、猫、奶牛、马、兔、猴和最优选地，人。
实施例
基因表达分析
材料和方法
动物
将卵巢切除的(OVX)短尾猴(Macaca fascicularis)用作雌激素缺乏的模型，这种短尾猴已被证实是预测雌激素和SERMs的人类临床试验结果的有用模型。该研究是按照动物健康规则(Animal Health regulation)，委员会管理号(Council Directive No.)86/609/EEC关于与用于实验或其它科学目的的动物保护相关的法律、规程或管理规定来进行的。在开始治疗前使动物适应治疗设施至少14天。除了治疗的最后一天动物被禁食外，每天在给药之后的至少1小时动物随意接受水和大约180g的OWM颗粒食物(Dietex France，SDS，Saint Gratien，France)。另外，每个动物每天接受两种水果或蔬菜。在药物治疗之前的10周，对大约48月龄的性成熟雌性短尾猴(获得自R.C.Hartelust BV，Tilburg，荷兰的食蟹猴)实施外科手术(卵巢切除或假手术)。
外科手术步骤
治疗首日之前的10周在CIT(Evreux，France)通过标准的外科手术方案进行卵巢切除。利用甲苯噻嗪(
Figure A200780014476D00261
0.4mL/动物，Bayer PharmaDivision Santé Animale，Puteaux，France)和盐酸氯胺酮(0.6mL/kg，Mérial，Lyon，France)的组合肌内注射进行麻醉之后除去卵巢。除了去除卵巢之外，对假手术的动物进行相同的外科手术步骤。
雌二醇测定
在外科手术之后的大约2周测定每只动物中的雌二醇血清水平来确认卵巢切除的效果。在无抗凝血剂的管中收集未禁食动物的静脉血样品(大约1.5mL)并利用放射性免疫测定进行分析(Sorin，Ecole NationaleVétérinaire de Lyon，France)。此外，在开始药物治疗后的大约2至4周进行雌二醇测定来确定动物是否发生了异位卵巢组织生长；从该研究和后续分析中除去任何此类动物。
治疗方案
将卵巢切除的和假手术的动物分成4组。使假手术的和一组卵巢切除的动物仅接受载体，而使剩余组的卵巢切除的猴接受雌二醇(Sigma No.E8875)或他莫昔芬(
Figure A200780014476D00263
Aventis Pharma)或雷洛昔芬(
Figure A200780014476D00264
Lilly France SA)。将测试项目制备为载体中的混悬液并通过口服强饲法每天施用。在治疗的最后一天，通过由肌内盐酸氯胺酮和静脉内硫喷妥钠引起的深度麻醉来处死动物，随后放血。
垂体和子宫基因表达
组织制备
在药物治疗结束时测定垂体和子宫中的基因表达。切除所要分析的组织(垂体和子宫)，在液氮中迅速冷冻，并储存于-80℃直至进行RNA提取。
DNA微阵列分析
通过酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取(Trizol；Invitrogen LifeTechnologies，San Diego，CA，USA)来获得总RNA，并根据厂商说明书在亲和树脂柱(RNeasy；Quiagen，Hilden，Germany)上纯化。DNA微阵列实验按照基因芯片系统厂商(Affymetrix，Inc.2002)的建议来进行。先前的微阵列研究已经证实了交叉种类DNA芯片分析的有效性，因此使用了含有22283个探针组的人类基因表达探针阵列HGU133A(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，USA)，所述探针组主要涉及经注释的人类基因。利用Microarray Analysis Suite 5(MAS5)软件(Affymetrix，Inc.)对所获得的图像文件(.dat文件)进行加工。获得了含有关于信号强度(Signal)和明确的表达水平检测(Absolute Call)数据的Tab-定界的文件。
发现待差异表达的转录物通过参考Affymetrix探针组编号209173_at、221731_x_at、202310_s_at、202403_s_at、201852_x_at、215076_s_at、211161_s_at、211980_at、201438_at、200884_at、200703_at、217398_x_at、213453_x_at、212581_x_at、201841_s_at、221011_s_at、203570_at、209014_at、202593_s_at、202465_at、211663_x_at、204051_s_at、207714_s_at、206116_s_at和/或211959_at指出。
雌激素效能的定量
雌激素得分轴(Score Axis)
为定义代表药物治疗的雌激素效能的参考轴，选择了两种情况来代表极端——卵巢切除的动物(OVX组、雌激素缺失)和雌二醇治疗的OVX(OVX-EE)组(最高的雌激素)。使用这两组通过设置它们的相对雌激素效能分值分别为0％和100％来定量标记此轴的刻度。然后将来自假手术动物和来自经他莫昔芬或雷洛昔芬处理的动物的基因表达定位于此轴上来排列它们的雌激素效能。
用于此分析的基因的选择(探针组)是在数学和统计学标准的基础上来选择的，从而满足雌激素调节的操作定义，另外基于生物功能的现有知识对基因进行分组。探针组A(n＝544)是通过使用下列针对基因表达数据的过滤标准来定义的：(1)在至少一种测试条件下给定探针的平均信号强度必需高于50；(2)当OVX情况与假手术相比较时必须具有1.5倍或更高的变化(上升或下降)；且(3)改变的表达模式必须已经被雌二醇治疗逆转(OVX-EE)。在利用基因功能的现有知识和将基因分类(信号转导、运输、细胞外基质、和生长因子)的基础上，将探针组B(n＝74)鉴定为组A的亚组。利用严格无偏的数学和统计学参数过滤数据来确定探针组C(n＝225)，其仅包括那些探针：(1)在OVX和OVX-EE条件中的一种或两种下具有高于50的中间信号强度，(2)在这些条件之间的表达显示出1.5倍或更高的改变，且(3)显示出P.05(利用t检验针对log10转换的强度值进行统计学显著性分析)。
将OVX和OVX-EE动物的log10转换的基因表达(GEP)数据的协方差矩阵进行主要成分分析(PCA)，其是一种先前使用的用来描述微阵列基因表达数据的统计学维度缩减方法。PCA算法计算所谓的“负荷量”和“分值”。负荷量是变量(基因)的线性组合中的权重，其定义了坐标系的轴(Principal Components，PCs)。分值代表了在相同坐标系中单个动物基于其GEP数据的坐标。
然后将所有其它对数转换的GEP数据用作此PCA模型的输入并计算它们的分值。仅计算出一个PC值，并将针对此PC的所有样品的分值用于后续计算。从所有分值中扣除OVX样品分值的中位数。然后通过用OVX-EE动物分值的中位数除以所有分值并乘以100来衡量所有分值。此部分所述的计算是利用用于多变量分析的SIMCA软件(版本10，Umetrics.，Umea，Sweden)和Excel2002(Microsoft Corp.，Redman WA，USA)来完成的。
该表达图谱研究证实了所分析的转录物的相应基因的特定影响，所述基因受到作为子宫内膜增殖调节剂的雌激素和/或SERMs的调节。因此，这些基因编码的蛋白质可用作子宫内膜增殖的生物标记。
下面表1中包括的候选物的选择是基于科学标准、并基于基因表达的高水平(对于平均控制至少180)和通过雌激素乙炔雌二醇的至少平均2倍的调节。表1中的值表示任意单位，其反映了表2中所示的所测单个基因表达水平的基因平均表达水平，即存在的转录物的计算出的平均数量。表1灰色栏的标题中给出的倍数增加表明了所分析转录物的各个基因的基因表达变化，所述转录物由于乙炔雌二醇以及SERMs、他莫昔芬和雷洛昔芬的影响而受到调节。
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Claims (24)

1、用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的方法，其包括测定所述样品中受雌激素和/或选择性雌激素受体调节剂(SERMs)调节的至少一种基因的表达水平和/或活性，其中所述至少一种基因选自如下基因组成的组：前梯度2同源物(光滑爪蟾(Xenopus laevis))(基因ID 10551)；钙粘蛋白11，2型；硫酸软骨素蛋白聚糖2(多功能蛋白聚糖)(基因ID13003)；胶原，I型，α1(基因ID 1277)；胶原，I型，α2(基因ID 1278)；胶原，III型，α1(IV型爱-唐综合征，常染色体显性)(基因ID 1281)；胶原，IV型，α1(基因ID 1282)；胶原，VI型，α3(基因ID 1293)；肌酸激酶，脑(基因ID 24264)；动力蛋白，细胞质的，轻多肽1(基因ID 8655)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(基因ID 2597)；热激27kDa蛋白1(基因ID 3315)；小鼠肢芽和心脏基因的可能的直向同源物(基因ID 81606)；赖氨酰氧化酶样1(基因ID 4016)；黑素瘤抗原，D家族，1(基因ID 9500)；RGS16的膜相互作用蛋白(基因ID 51573)；前胶原C内肽酶增强子(基因ID5118)；前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID 5730)；分泌型卷曲相关蛋白4(基因ID 6424)；丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝H(热激蛋白47)，成员1(胶原结合蛋白1)(基因ID 871)；原肌球蛋白1(α)(基因ID 7168)和/或胰岛素样生长因子结合蛋白5(基因ID3488)和其组合。
2、权利要求1的方法，其中所述基因是胶原，I型，α1(基因ID 1277)；胶原，I型，α2(基因ID 1278)；胶原，III型，α1(IV型爱-唐综合征，常染色体显性)(基因ID 1281)；肌酸激酶，脑(基因ID 24264)和/或前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID 5730)。
3、权利要求2的方法，其中所述基因是前列腺素D2合酶21kDa(脑)(基因ID 5730)。
4、权利要求1至3的方法，其中通过测量转录物水平来测定基因表达水平和/或活性。
5、权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述测定包括杂交反应。
6、权利要求4至5中任意一项的方法，其中所述测定进一步包括扩增和/或延长反应。
7、权利要求6的方法，其中扩增包括选自反转录酶PCR和/或实时PCR的至少一种技术。
8、权利要求1至3中任意一项的方法，其中基因表达水平是通过检测选自下述的蛋白产物的水平来测定的：前梯度2同源物(NP_006399)、硫酸软骨素蛋白聚糖(多功能蛋白聚糖)(NP_004376)、α1I型胶原前蛋白原(NP_000079)、α2I型胶原(NP_000080)、α1III型胶原(NP_000081)、α3IV型胶原同工型1前体(NP_000082)、α4IV型胶原前体(NP_000083)、α1IV型胶原前蛋白原(NP_001836)α3IV型胶原同工型1前体(NP_004360)、脑肌酸激酶(NP_001814)、细胞质动力蛋白轻多肽(NP_003737)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(NP_002037)、甘氨酰-tRNA合成酶(NP_002038)、生长阻滞特异1(NP_002039)、热激蛋白27kDa蛋白1(NP_001531)、假设的蛋白质DKFZp566J091(NP_112177)、赖氨酰氧化酶样1(NP_005567)、黑素瘤抗原家族D，1同工型b(NP_008917)、RGS16的膜相互作用蛋白(NP_057725)、前胶原C内肽酶增强子(NP_002584)、前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)、分泌型卷曲相关蛋白4(NP_003005)、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝H1，成员1前体(NP_001226)、原肌球蛋白1(α)(NP_000357)和/或胰岛素样生长因子结合蛋白5(NP_000590)。
9、权利要求8的方法，其中蛋白质产物是α1I型胶原前蛋白原(NP_000079)、α2I型胶原(NP_000080)、α1III型胶原(NP_000081)、脑肌酸激酶(NP_001814)和/或前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)。
10、权利要求9的方法，其中蛋白质产物是前列腺素D2合酶21kDa(NP_000945)。
11、权利要求8至10任一项的方法，其中通过酶的、结合、物理和/或免疫学方法来测定蛋白质产物水平。
12、权利要求1至11中任意一项的方法，其中样品是体液或组织样品。
13、权利要求12的方法，其中体液是血液、血浆、尿液和/或血清。
14、用于定性和/或定量测定样品中子宫内膜增殖的阵列，其包含载体和用于测定所述样品中受雌激素和/或SERMs调节的至少一种基因的表达水平和/或活性和/或转录水平的探针，其中至少一种基因选自如权利要求1至3中任意一项所述的基因。
15、用于诊断受试者中与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况或其倾向的方法，其包括测定所述样品中如权利要求1至4中任意一项所述的至少一种基因的表达水平和/或活性，其中实质上偏离于健康受试者的参考值的表达水平和/或活性表明子宫内膜增殖的功能异常或其倾向。
16、权利要求15的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
17、权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人。
18、权利要求15至17中任意一项的方法，其中通过测量至少一种基因的转录水平和/或蛋白质产物水平来测定基因表达水平和/或活性。
19、权利要求15至18中任意一项的方法，其中所述紊乱和/或状况选自子宫内膜萎缩、发育不良的子宫内膜、闭经、子宫内膜炎、增强的子宫内膜增殖、子宫内膜异位、紊乱的月经周期、怀孕、不孕、子宫内膜增生、子宫内膜息肉、和/或妇科肿瘤。
20、权利要求19的方法，其中妇科肿瘤选自子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、外阴癌和/或阴道癌。
21、筛选与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况或其倾向的调节剂的方法，其包括在候选试剂存在下测定细胞样品中如权利要求1至3中任意一项所述的至少一种基因的表达水平和/或活性，将检测所述候选试剂对子宫内膜增殖的影响，与不存在所述候选试剂时的所述表达水平和/或活性相比较。
22、权利要求1至3中任意一项所述的至少一种基因和/或如权利要求8至10中任意一项所述的至少一种蛋白质产物作为子宫内膜增殖的靶标和/或调节剂的用途。
23、权利要求22的用途，用于生产对与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况有活性的活性剂。
24、权利要求1至3中任意一项中所述的至少一种基因的调节剂的用途，用于生产预防和/或治疗与子宫内膜增殖相关的紊乱和/或状况的药物。
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