KR20080110195A - 중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독세균 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ의검출법 및 검출키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)과 효소결합면역반응(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법 및 검출키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 리스테리오라이신(listeriolysin)을 코딩하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머로 중합효소연쇄반응을 시키고, 위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)를 넣어 혼성화시킨 후, 위 혼성화된 PCR 반응의 산물에 효소결합면역반응(ELISA)을 적용시켜서 위 식중독 세균을 검출하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

이때, 중합효소연쇄반응에 사용하는 PCR 프라이머의 염기서열은 서열목록 1과 2인 것을 특징으로 한다. 또한 이때, 탐침자(capture probe)의 염기서열은 서열목록 3인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 검출검사에 소요되는 시간은 총 5시간 미만이며 휴대가 가능하고 검사절차가 간편하며 검사결과를 육안으로 관찰할 수 있기 때문에 현장 검사용으로도 유용하다 하겠다.

중합효소연쇄반응(PCR), 효소결합면역반응(ELISA), Listeria monocytogenes

Description

중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ의 검출법 및 검출키트{The detection method of Listeria monocytogenes using PCR and ELISA ，＆ the detection kit}

본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)과 효소결합면역반응(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법 및 검출키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 리스테리오라이신(listeriolysin)을 코딩하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머로 중합효소연쇄반응을 시키고, 위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)를 넣어 혼성화시킨 후, 위 혼성화된 PCR 반응의 산물에 효소결합면역반응(ELISA)을 적용시켜서 위 식중독 세균을 검출하는 방법 및 키트에 관한 것이다.

Listeria monocytogenes는 임산부, 신생아 또는 면역 기능이 저하된 환자에 게 뇌염(encephalitis), 수막염(meningitides), 사산(stillbirths) 및 중추신경계(central nervous system)의 감염을 일으키는 식중독 세균으로서(Altimira et al, 1999; Vasquez-Boland et al, 2001), 미국 식품의약청(FDA)에 따르면 연간 약 1,600명이 Listeria monocytogenes에 감염되어 리스테리아증(listeriosis)을 보이고 이 중에서 약 415명이 사망하는 것으로 추정되고 있다(FDA/CFSAN, 2003). Listeria monocytogenes의 감염경로는 매우 다양한데, 주로 저온살균(pasteurization)된 우유나 가공되지 않은 우유(raw milk), 치즈, 아이스크림, 소시지, 익히지 않은 채소, 생선, 육류, 가금류(poultry) 또는 훈제 생선 등과 같은 식품들을 통해 감염되는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 다양한 식품들이 Listeria monocytogenes에 의한 오염에 노출돼 있지만, Listeria monocytogenes의 검출법으로서 전통적으로 사용되는 배지를 이용한 방법은(FDA/CFSAN, 2003) 농화배양, 선택배양, 확정시험에 총 48시간 이상이 소요되기 때문에 문제가 있다. 더구나 Listeria monocytogenes는 음식물의 냉장 보관 온도인 3℃에서도 번식할 수 있기 때문에 식품의 제조 및 유통 단계 모두에서 오염 여부를 매우 신속히 파악할 수 있어야 Listeria monocytogenes에 의한 감염을 조기에 차단할 수 있다는 점을 감안하여야 한다.

배양법을 이용하지 않은 방법으로, 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 이용한 분자생물학적인 방법이 개발된 바 있다(Cocolin et al., 2002 Rodriguez-Lazaro et al., 2004 Rodriguez-Lazaro et al., 2005 Guilbaud et al., 2005). 이는 주로 리스테리아증(listeriosis)의 병원성 인자(virulence factor)인 listeriolysin O(Barbour et al, 2001 Olier et al, 2002)를 부호화하고 있는 유전자(hly)를 타겟으로 한다. 하지만 PCR을 이용한 검출법은 신속하다는 장점이 있지만 양성반응인지 여부를 알기 위해서 전기영동법으로 PCR 산물을 확인하여야 한다. 1시간 정도 소요되는 전기영동법을 이용하여 PCR 산물의 생성여부를 관찰하기 위해서는 여러 가지 추가 장비들이 필요한데 관련된 모든 장비를 휴대용으로 제작하기는 힘들 것으로 사료되며, 이는 특히 브롬화에티듐(ethidium bromide)과 같은 발암성 독성물질을 사용하기 때문에 음식물 보관처, 판매처 또는 급식소와 같은 현장에서 직접 검출하기 위한 방법으로는 적절치 않을 것으로 생각된다. 또한 PCR 산물이 확인되었더라도 비특이적(non specific)인 반응에 의한 위양성(false positive)인지의 여부는 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization)과 같은 12시간 이상의 긴 시간이 소요되는 과정이 필요하다.

물론 PCR법은 최근 실시간-PCR(real time-PCR, RT-PCR)법의 개발로 전기영동을 하지 않고 PCR 산물을 정확히 실시간으로 확인할 수 있는 방법이 있기는 하다. 그럼에도 기기의 가격이 고가이며 고도로 숙련된 인력이 필요하기 때문에 현장에서 식품의 안전관리용으로 사용하기에는 실용성이 떨어진다.

저렴한 가격에 휴대가 가능하며 고도로 숙련된 인력이 필요하지 않고 간편한 검사키트 형식으로 사용될 수 있는 방법으로 항원-항체반응을 이용한 방법을 생각할 수 있는데, 이는 검체에 최소 10⁵개 이상의 Listeria monocytogenes가 있어야만 검출이 되는 정도의 낮은 민감도(sensitivity)를 보이기 때문에(Brigmon et al., 1992 Tamanai-Shacoori et al., 1994) 음식물을 대상으로 식중독 세균 Listeria monocytogenes를 검출하기 위한 목적으로는 역시 실용성이 낮다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것이다.

앞서 기술한 바와 같이 Listeria monocytogenes는 다양한 식품류를 통해 전염되는 병원성 세균으로 음식물의 냉장 온도에서도 번식 가능하기 때문에 각종 식품류의 제조, 보관, 유통 과정에서 매우 신속하게 오염여부를 파악할 수 있어야 하는바, 본 발명의 발명자들은, (1) Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 listeriolysin을 부호화(coding)하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR primer를 설계하고, (2) 설계된 primer를 이용한 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 capture probe를 설계하였으며, (3) 이를 효소결합면역반응(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)에 적용시켜 식품류의 제조, 보관, 유통, 판매 현장에서 식중독 세균 Listeria monocytogenes를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법 및 키트를 개발하였다.

본 발명에 따른 검출검사에 소요되는 시간은 총 5시간 미만이며 휴대가 가능하고 검사절차가 간편하며 검사결과를 육안으로 관찰할 수 있기 때문에 현장 검사용으로 유용할 것으로 사료된다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 것으로서, 중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용하여 식중독 세균 Listeria monocytogenes을 검출하는 것을 특징으로 하며, 더 구체적으로는, Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 리스테리오라이신(listeriolysin)을 코딩하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머로 중합효소연쇄반응을 시키고, 위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)를 넣어 혼성화시킨 후, 위 혼성화된 PCR 반응의 산물에 효소결합면역반응(ELISA)을 적용시키는 것을 특징으로 한다.

또한 이때, 중합효소연쇄반응에 사용하는 PCR 프라이머의 염기서열은 후술하는 서열목록 1과 2인 것을 특징으로 한다.

또한 이때, 효소결합면역반응에 사용하는 중합효소연쇄반응에 탐침자(capture probe)의 염기서열은 서열목록 3인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 서열목록 1, 2의 PCR 프라이머와 서열목록 3의 탐침자(capture probe)를 포함하는 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출키트인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.

1. 균주 및 배양

본 연구에서 사용된 Listeria monocytogenes strain은 모두 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 얻어진 것이며(표 1), 대조군으로는 Listeria ivanovii, Listeria innocua , Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli가 사용되었다. 모든 Listeria 균주는 DifcoTM Brain Heart Infusion Agar에서 계대배양하였으며 E. coli와 Pseudomonas는 DifcoTM Nutrient Agar에서 계대배양하였다. 세부적인 배양법은 ATCC의 지침을 따랐다.

2. PCR 프라이머 및 탐침자(capture probe)의 설계

NCBI GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 수록된 listeriolysin 유전자(hly)의 염기서열들(GenBank accession numbers U25252, U25449, U25446, M24199, AF253320)을 Clustal W(Thompson et al., 1994)를 사용하여 서열정렬(alignment)한 후 얻어진 대표서열(consensus)에 대하여 Array Designer(Premier Biosoft International, Calif. USA)를 이용하여 PCR 프라이머 서열을 탐색하고 설계하였다. Capture probe의 서열은 PCR 프라이머 서열의 사이에 위치하도록 탐색하였다. Primer와 probe 서열의 탐색조건은 소프트웨어 제조사가 정한 기본값을 사용하였으며, 세부적인 탐색 절차 역시 제조사의 지침을 따랐다. 설계된 프라이머 서열로부터 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)와 capture probe를 제조하였으며(Bioneer, Korea), capture probe의 5' 말단에는 바이오틴(biotin)을 부착시켰다.

NCBI GenBank에 수록된 hly 염기서열로부터 설계된 PCR 프라이머와 capture probe의 서열은 표 2와 같으며, 이는 기재된 순서대로 서열목록 1 내지 3으로 본 명세서에 첨부한다.

3. 게놈 DNA(Genomic DNA)의 추출 및 중합효소연쇄반응(PCR)

배양된 균주에서의 게놈 DNA(genomic DNA) 추출은 Sambrook과 Russell(2001)의 방법을 따랐다. 추출된 게놈 DNA의 hly 유전자는 PCR을 통해 증폭하였으며, 증폭과정에서 digoxigenin(DIG)-11-dUTP가 병합되어 PCR 산물이 DIG로 표지되도록 하였다. PCR 반응은 1㎕(240 ng)의 template DNA, 5㎕의 10X PCR reaction buffer(100 mM Tris-HCl, 500mM KCl, pH 8.3), 3㎕의 MgCl₂ 용액(final concentration, 1.5 mM), 5㎕의 PCR DIG labeling mix(2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP, 1.9 mM dTTP, 0.1 mM DIG-dUTP), 1㎕(20 pmole)씩의 PCR primer, 1㎕의 BSA(20mg/㎖, Bovine Serum Albumin, Roche, Germany), 0.5㎕(2.5U)의 Taq DNA polymerase(Roche, Germany)에 32.5㎕의 증류수를 넣어 총 50㎕로 실행하였다. 94℃에서 5분간 초기 변성기 후에, 94℃에서 1분간 변성-53.2℃에서 1분간 결 합(annealing)-72℃에서 2분간 신장(extension)하는 과정을 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 10분간 신장하였다. PCR thermocycler는 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems, Calif. USA)을 사용하였다.

4. Listeria monocytogenes의 검출

(1) Capture probe와 PCR 산물의 혼성화 및 고정화

PCR 산물 10㎕에 변성용액(denaturation solution, Roche, Germany) 20㎕를 섞어 상온에서 10분간 방치하고, 여기에 capture probe 100 pmole이 포함된 혼성화용액(hybridization solution, Roche, Germany) 220㎕를 더하여 streptavidin으로 표면처리된 multi-well plate(Roche, Germany)에 넣은 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다.

(2) 효소결합면역반응(ELISA)을 이용한 발색반응

Multi-well plate(MTP)의 표면에 고정된 capture probe에 혼성화된 PCR product에 anti-DIG-POD(peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody)가 항원-항체반응으로 결합되도록 하였다. 반응액을 제거하고 washing buffer(Roche, Germany)로 표면을 세척한 후, 반응 당 2.5 mU의 anti-DIG-POD(Roche, Germany)를 가하여 37℃에서 30분간 방치하였다. 그리고 다시 washing buffer(Roche, Germany)로 표면을 세척한 후, 50 mg의 ABTS(2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)] diammonium salt가 50 ml의 ABTS buffer(Roche, Germany)에 용해되어있는 용액 200㎕를 가하고 발색반응을 관찰하였다. 전반적인 방법에 대한 모식도를 Fig 1에 나타내었다.

5. 결과 및 고찰

(1) NCBI GenBank에 수록된 hly 염기서열로부터 설계된 PCR 프라이머와 capture probe의 서열은 위 표 2에서와 같다. 예상되는 PCR 산물의 길이는 약 130 bp이며 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 여러 종류의 Listeria monocytogenes 균주와 음성대조군(negative control)들을 대상으로 PCR을 수행한 결과, Listeria monocytogenes 균주들에 대해서 예상되는 길이의 PCR 산물을 얻을 수 있었다(그림 2). 음성대조군들로부터는 어떠한 크기의 PCR 산물도 관찰되지 않았다.

(2) 본 발명에서는 Listeria monocytogenes의 hly 유전자에 특이적인 PCR 반응에서 얻어진 PCR 산물을 특별한 기구나 방법을 사용하지 않고 육안으로 확인할 수 있는 방법을 개발하기 위해서 효소결합면역흡수법(ELISA)을 응용하였다.

Listeria monocytogenes ATCC 19115와 Listeria monocytogenes ATCC 19117이 사용되었으며 음성대조군으로는 E. coli가 사용되었다. DIG로 표지된 PCR 산물은 정제과정 없이 바로 변성용 약을 이용하여 변성시킨 후, 5' 말단에 biotin이 부착된 capture probe와 혼성화되었다. PCR 산물과 혼성화된 capture probe는 5' 말단에 위치한 biotin에 의해서 MTP의 표면에 코팅된 streptavidin과 결합하게 되는데 이를 효소결합면역흡수법(ELISA)을 이용하여 관찰하였다. ABTS 용액을 가한 후, 약 5분이 경과하고 나서 육안으로 관찰 가능한 정도의 발색반응이 확인되었다(그림 3). PCR과 마찬가지로 음성대조군에서는 어떠한 발색반응도 관찰되지 않았다.

(3) 본 연구에서 개발된 방법은 단순히 PCR product의 신속한 검출에 그치지 않고 PCR product에 특이적으로 결합할 수 있는 capture probe를 사용하기 때문에 PCR product에 대한 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization) 시험을 추가로 실시하지 않더라도 capture probe가 결합할 수 있는 PCR 산물만을 특이적으로 검출한다는 점에서 TaqMan probe등을 사용하는 real-time PCR에 견줄 만한 반응 특이성을 확보할 수 있는 장점이 있다. 하지만 real-time PCR은 고가의 장비 등이 필 요하고 고도로 숙련된 인력이 필요하다는 점을 고려하면, 본 연구에서 개발된 방법은 휴대가 가능하고 다양한 현장에서 식중독 세균 Listeria monocytogenes를 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 검출키트로 상용화될 수 있을 것으로 사료된다.

이상과 같이, 본 발명에서는 Listeria monocytogenes가 갖는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR primer를 설계하고 설계된 primer를 이용한 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 capture probe를 설계하여 이를 효소결합면역반응(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)에 적용시켰는바, 본 발명에 따른 검출검사에 소요되는 시간은 총 5시간 미만이며 휴대가 가능하고 검사절차가 간편하며 검사결과를 육안으로 관찰할 수 있기 때문에 현장 검사용으로도 유용하다 하겠다.

<110> Han Chi Moon ; Industry-University Cooperation Foundation Hankuk University of Foreign studies <120> The detection method of Listeria monocytogenes using PCR and ELISA, & the detection kit <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 tccgcctgca agtcctaag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggcggcacat ttgtcactg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture probe <400> 3 caagtcctaa gacgccaatc g 21

Claims (4)

1. Listeria monocytogenes의 병원성 인자(virulence factor)인 리스테리오라이신(listeriolysin)을 코딩하는 hly 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머로 중합효소연쇄반응을 시키고,

   위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)를 넣어 혼성화시킨 후,

   위 혼성화된 PCR 반응의 산물에 효소결합면역반응(ELISA)을 적용시키는 것을 특징으로 하는,

   중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법.
2. 제1항에 있어서,

   중합효소연쇄반응에 사용하는 PCR 프라이머의 염기서열은 서열목록 1과 2인 것을 특징으로 하는,

   중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   위 PCR 반응의 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침자(capture probe)의 염기서열은 서열목록 3인 것을 특징으로 하는,

   중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법.
4. 서열목록 1, 2의 PCR 프라이머와 서열목록 3의 탐침자(capture probe)를 포함하는 것을 특징으로 하는,

   중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출키트.