KR20080107415A - 변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법 - Google Patents

변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080107415A
KR20080107415A KR1020087022540A KR20087022540A KR20080107415A KR 20080107415 A KR20080107415 A KR 20080107415A KR 1020087022540 A KR1020087022540 A KR 1020087022540A KR 20087022540 A KR20087022540 A KR 20087022540A KR 20080107415 A KR20080107415 A KR 20080107415A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fad2
sequence
gene
soybean
fatb
Prior art date
Application number
KR1020087022540A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101259217B1 (ko
Inventor
토니 보엘커
조앤 제이. 필라티
닐 에이. 브린지
팀 울마소브
Original Assignee
몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 filed Critical 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Publication of KR20080107415A publication Critical patent/KR20080107415A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101259217B1 publication Critical patent/KR101259217B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C10L1/026—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only for compression ignition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 식물 유전학 분야이고, 재조합 핵산 분자들, 구조물들, 및 지방산 합성 경로에서 다수의 유전자들의 동조적 조작과 관련된 다른 제제들을 제공한다. 특히, 본 발명의 제제는 지방산 합성 경로에서 특정 유전자들의 향상된 발현 및 상기 경로에서 특정의 다른 유전자들의 억제된 발현이 동시에 일어나는 것과 관련된다. 또한, 그러한 제제들이 통합된 식물들, 및 특히, 변화된 종자 오일 조성을 나타내는, 그러한 구조물들이 통합된 식물들이 제공된다.

Description

변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법{NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND METHODS FOR PRODUCING ALTERED SEED OIL COMPOSITIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 발명의 명칭을 "수식된 유전자 사일런싱"으로 하여 2006년 2월 13일자로 출원된 미국 가출원번호 60/772,614; 발명의 명칭을 "대두 종자 및 오일 조성물 및 이의 제조 방법"으로 하여 2006년 3월 10일자로 출원된 미국 가출원번호 60/781,519 및 발명의 명칭을 "변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법"으로 하여 2006년 3월 16일자로 출원된 미국 출원번호 11/376,328에 대하여 35 U.S.C. §119(e)에 따라 우선권을 주장한다.
서열목록 첨부
2003년 9월 25일자로 보고되고, 미국 출원번호 10/669,888로 출원된 서열목록의 사본 및 (MS-DOS로 측정된) 크기가 60,690바이트인 파일명 "Omni2 AS FILED.txt"를 포함하는 디스켓에 리스트된 컴퓨터 가독성 형태의 서열목록이 참고문헌으로 본원에 통합된다. 2006년 3월 15일자로 보고된 서열목록의 사본 및 (MS-DOS로 측정된) 크기가 61,434바이트인 파일명 "OmniChild.txt"를 포함하는 디스켓에 리스트된 컴퓨터 가독성 형태의 서열목록이 참고문헌으로 본원에 통합된다.
본 발명은 지방산 합성 경로에서 다수의 유전자들의 동조적 조작과 연관된 재조합 핵산 분자들, 구조물들 및 다른 제제들(agents)과 관련된다. 특히, 본 발명의 상기 제제들은 지방산 합성에서 어떠한 유전자들의 동시적 발현 증가 및 상기 지방산 합성에서 다른 어떠한 유전자들의 동시적 발현 감소와 관련된다. 또한, 본 발명은 그러한 제제들이 통합된 식물들, 특히 변화된 종자 오일 조성물을 발현하는 그러한 구조물들이 통합된 식물들과 관련된다.
식물 오일은 다양하게 사용된다. 신규한 식물성 오일 조성물(vegetable oil compositions)과 생합성 기원 또는 천연 식물 기원으로부터 오일 조성물을 얻기 위한 개선된 접근법이 요구된다. 의도하는 오일 용도에 따라, 여러 다른 지방산 조성물들이 요구된다. 식물, 특히 종자에서 다량의 오일을 합성하는 식물 종들은 식용 및 산업용 모두에 중요한 오일 공급원이다. 종자 오일은 글리세롤의 세 개의 히드록시기가 지방산들로 에스테르화된 트리아실글리세롤로 거의 대부분 구성된다.
대두 오일(soybean oils)은 전형적으로 약 16~20%의 포화 지방산을 포함한다: 13~16%의 팔미테이트 및 3~4%의 스테아레이트. 일반적으로 Guns내지ne 등, The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London (1994) 참고. 대두 오일은 특정 시 장(markets)에 대한 유익성을 제공하기 위하여 여러 가지 육종법에 의하여 변성되어 왔다. 그러나, 샐러드 오일, 쿠킹 오일 및 프라잉 오일의 소비자와 같은 대부분의 대두 오일 사용자들, 및 바이오디젤 및 바이오 윤활유(biolube) 시장과 같은 산업용 시장에 폭넓게 유익한 대두 오일은 공급되지 못하고 있다. 이전의 대두 오일들은 고가이거나, 또는 산화 안정성, 프라이된 식품의 우수한 풍미 또는 우수한 포화 지방 함량과 같은 중요한 식품 품질, 또는 적절한 산화질소(nitric oxide) 방출 또는 내냉성(cold 내지lerance) 또는 냉간유동성(cold flow)과 같은 중요한 바이오디젤 특성이 결여되었다.
고등식물은 일반적 대사 경로-색소체(plastid)에 존재하는 지방산 합성효소(FAS) 경로-를 통하여 지방산을 합성한다. β-케토아실-ACP 합성효소는 식물 세포의 FAS에서 중요한 속도 결정 효소이며, 몇 종류가 존재한다. β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ은 팔미토일-ACP(C16:0)에 사슬 연장을 촉매하는 반면, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ는 스테아로일-ACP(C18:0)에 사슬 연장을 촉매한다. β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ는 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ의 변형체이고, 또한 18:0-ACP에 사슬 연장을 촉매할 수 있다. 대두에서, FAS의 주된 산물은 16:0-ACP와 18:0-ACP이다. 18:1-ACP를 형성하기 위한 18:0-ACP의 탈포화(desaturation)는 색소체에 위치한 가용성 Δ-9 탈포화효소(또한, "스테아로일-ACP 탈포화효소"로 언급됨)에 의하여 촉매된다. Voelker 등, 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 335~61 (2001) 참고.
색소체성 FAS 및 Δ-9 탈포화효소의 산물인 16:0-ACP, 18:0-ACP 및 18:1-ACP는 특이적 티오에스테라아제(FAT)에 의하여 가수분해된다. 식물 티오에스테라아제는 서열 상동성(homology)과 기질 편향성에 따라 두 유전자 패밀리로 분류될 수 있다. 첫 번째 패밀리인 FATA는 주로 18:1-ACP에 대해 활성을 갖는 긴 사슬 아실-ACP 티오에스테라아제를 포함한다. 두 번째 패밀리 효소인 FATB는 일반적으로 16:0-ACP(팔미토일-ACP), 18:0-ACP(스테아로일-ACP) 및 18:1-ACP(올레오일-ACP)를 이용한다. 이러한 티오에스테라아제들은 식물에서의 신생 지방산 생합성 동안 사슬 길이를 결정하는데 중요한 역할을 하며, 이러한 효소들은 지방산 아실 조성, 특히 종자 저장 오일에 존재하는 여러 지방산 아실그룹의 상대적 비율에 대해 여러 가지 변형을 제공하는데 유용하다.
FATA와 FATB 반응의 산물인 유리 지방산은 색소체를 떠나, 그들 각각의 아실-CoA 에스테르들로 전환된다. 아실-CoA들은 소포체(ER)에 존재하는 지방-생합성 경로(Kennedy Pathway)의 기질이다. 이 경로는 종자 오일을 구성하는 트리아실글리세롤의 생합성 및 막 지질 형성에 관여한다. ER에는 18:1을 다중불포화 지방산으로 더 탈포화시킬 수 있는 추가적인 막결합 탈포화효소가 존재한다. Δ-12 탈포화효소(FAD2)는 이중결합을 18:1내로 도입하여 리놀레산(18:2)의 형성을 촉매한다. Δ-15 탈포화효소(FAD3)는 이중결합을 18:2내로 도입하여 리놀렌산(18:3)의 형성을 촉매한다.
현재에는 많은 복잡한 생화학적 경로들이 일반적으로 단일 유전자의 억제 또는 과발현에 의하여 유전학적으로 조작되고 있다. 식물 유전자 조작의 잠재력에 대한 추가적 개발은 경로에서 여러 유전자의 동조적 조작을 요구할 것이다. 한 식물에서 형질전환유전자들(transgenes)을 결합하기 위하여, 성교배, 재형질전환(retransformation), 동시형질전환(cotransformation) 및 연결된 형질전환유전자들의 사용을 포함하는 다양한 접근법들이 사용되어 왔다. 연결된 부분적 유전자 서열들을 갖는 키메릭 형질전환유전자는 많은 식물성 내생적 유전자를 동조적으로 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 다수의 코딩 유전자들을 식물 세포에 동시에 도입하기 위하여 바이러스성 폴리단백질상에 만들어진 구조물이 사용될 수 있다. 리뷰를 위하여, Halpin 등, Plant Mol. Biol. 47:295~310 (2001) 참고.
따라서, 원하는 식물 표현형은 하나 이상의 유전자들의 발현 및 다른 유전자 또는 유전자들의 발현의 동시 감소가 필요할 수 있다. 따라서, 단일 형질전환유전자 구조물을 사용하여, 식물에서 하나 이상의 유전자들의 과발현과 다른 유전자 또는 유전자들의 발현 억제 또는 하향-조절의 동시 발생을 위한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은, 세포 또는 생물체 내로 도입되었을 때, 적어도 하나 이상의 내생적 FAD2, FAD3 또는 FATB RNA들의 발현의 억제, 적어도 부분적인 감소, 감소, 실질적인 감소 또는 효과적인 제거와 동시에, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ, Δ-9 탈포화효소 또는 CP4 EPSPS를 코딩하는 유전자로부터 전사된 하나 이상의 RNA들 또는 단백질들을 동시발현, 동시적으로 발현 또는 동조적으로 생산할 수 있는 재조합 핵산 분자 또는 분자들을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자 또는 분자들로 형질전환된 식물 세포들 및 식물들 및 상기 형질전환된 식물들로부터 생산된 종자, 오일 및 다른 생산물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 숙주 세포에서 발현될 때, FAD2, FAD3 또는 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 바람직하게는 두개의 유전자들의 내생적 발현을 억제할 수 있는 제1세트의 DNA 서열들; 숙주 세포에서 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 내생적 발현을 증가시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 제공한다.
또한, 본 발명은, FAD2 유전자의 비-코딩 지역과 적어도 90%의 상동성을 나타내는 제1의 RNA 서열을 발현하는 제1의 비-코딩 서열, 상기 제1의 RNA 서열과 함께 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 제1의 안티센스 RNA 서열을 발현하는 제1의 안티센스 서열, FATB 유전자의 비-코딩 지역과 적어도 90%의 동일성(identity)을 나타내는 제2의 RNA 서열을 발현하는 제2의 비-코딩 서열 및 상기 제2의 RNA 서열과 함께 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 제2의 안티센스 RNA 서열을 발현하는 제2의 안티센스 서열을 포함하며, 숙주 세포에서 발현될 때, dsRNA 구조물을 형성시킬 수 있고, 그리고 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 바람직하게는 두개의 유전자들의 내생적 발현을 억제시킬 수 있는 제1세트의 DNA 서열 등; 및 숙주 세포에서 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 내생적 발현을 증가시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 이러한 재조합 핵산 분자들로 식물을 형질전환시키는 방법들을 제공한다. 상기 방법들은 (A) 숙주 세포에서 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 바람직하게는 두개의 유전자들의 내생적 발현을 억제시킬 수 있는 제1세트의 DNA 서열들 및 숙주 세포에서 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 내생적 발현을 증가시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 포함하는 재조합 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 (B) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 핵산 분자를 결한 식물로부터의 종자와 비교하여 증가된 올레산 함량, 감소된 포화 지방산 함량 및 감소된 다중불포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 형질전환 식물을 성장시키는 단계를 포함하는, 증가된 올레산 함량, 감소된 포화 지방산 함량 및 감소된 다중불포화 지방산 함량을 갖는 종자를 가지는 형질전환 식물을 생산하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 식물 세포들을 상기 재조합 핵산 분자들로 형질전환시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (A) 숙주 세포에서 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 바람직하게는 두개의 유전자들의 내생적 발현을 억제시킬 수 있는 제1세트의 DNA 서열들 및 숙주 세포에서 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 내생적 발현을 증가시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 포함하는 재조합 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 (B) 상기 제1세트의 DNA 서열들과 제2세트의 DNA 서열들의 전사가 개시되는 조건하에서 상기 식물세포를 성장시키므로써, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 핵산 분자를 결한 식물 세포와 비교하여 오일 조성을 변화시키는 단계를 포함하는 식물 세포의 오일 조성을 변화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 숙주 세포에서 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의, 바람직하게는 두개의 유전자들의 내생적 발현을 억제시킬 수 있는 제1세트의 DNA 서열들 및 숙주 세포에서 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 내생적 발현을 증가시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 형질전환 식물을 제공한다. 나아가, 본 발명은 55~80중량%의 올레산, 10~40중량%의 리놀레산, 6중량% 미만의 리놀렌산 및 2~8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 종자를 가지는 형질전환 대두 식물, 및 상기 식물로부터 유래된 공급원료(feedstock), 식물의 부분들 및 종자를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 약 65~80중량%의 올레산, 약 3~8중량%의 포화 지방산 및 약 12~32중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 종자를 가지는 형질전환 대두 식물을 제공한다. 또한, 공급원료, 식물의 부분들 및 그러한 식물로부터 유래된 종자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 약 65~80중량%의 올레산, 약 2~3.5중량%의 포화 지방산 및 약 16.5~33중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 종자를 가지는 형질전환 대두 식물을 제공한다. 또한, 그러한 식물로부터 유래된 공급원료, 식물의 부분들 및 종자를 포함한다.
본 발명은 55~80중량%의 올레산, 10~40중량%의 리놀레산, 6중량% 미만의 리놀렌산 및 2~8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 대두 종자를 제공하고, 또한 65~80중량%의 올레산, 10~30중량%의 리놀레산, 6중량% 미만의 리놀렌산 및 2~8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 대두 종자를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 약 65~80중량%의 올레산, 약 3~8중량%의 포화 지방산 및 약 12~32중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 대두 종자를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 약 65~80중량%의 올레산, 약 2~3.5중량%의 포화 지방산 및 약 16.5~33중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 대두 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 69~73중량%의 올레산, 21~24중량%의 리놀레산, 0.5~3중량%의 리놀렌산 및 2~3중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 콩식품(soyfood)을 제공한다.
본 발명에 의하여 제공되는 조 대두 오일(crude soybean oil)은 55~80중량%의 올레산, 10~40중량%의 리놀레산, 6중량% 미만의 리놀렌산 및 2~8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는다. 본 발명에 의하여 제공되는 다른 조 대두 오일은 65~80중량%의 올레산, 10~30중량%의 리놀레산, 6중량% 미만의 리놀렌산 및 2~8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명에 의하여 제공되는 조 대두 오일은 약 65~80중량%의 올레산, 약 3~8중량%의 포화 지방산 및 약 12~32중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명에 의하여 제공되는 조 대두 오일은 약 65~80중량%의 올레산, 약 2~3.5중량%의 포화 지방산 및 약 16.5~33중량%의 다중불포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는다.
또한, 본 발명은 약 42~약 85중량%의 올레산 및 약 1.5~약 8중량%의 포화 지방산을 포함하는 오일 조성을 갖는 대두 종자를 제공한다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 대두 종자는 약 42~약 85중량%의 올레산, 약 1.5~약 8중량%의 포화 지방산, 35중량% 미만의 리놀렌산을 포함하고, 상기 올레산과 리놀렌산의 합은 총 오일 조성의 약 65~약 90중량%인 오일 조성을 갖고, 상기 종자는 숙주 세포에 약 50~약 400개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 FAD2-1 인트론 단편, FATB 3' UTR과 FATB 5' UTR, 이종성 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 이종성 Δ-9 탈포화효소를 갖는 DNA 서열을 갖는 재조합 핵산 분자를 가진다.
본 발명의 대두 종자는 약 50~약 80중량%의 올레산, 약 1.5~약 8중량%의 포화 지방산, 약 2~약 45중량%의 리놀레산, 약 4~약 14중량%의 리놀렌산을 포함하고, 상기 올레산과 리놀렌산의 합은 총 오일 조성의 약 65~약 90중량%인 오일 조성을 갖고, 상기 종자는 약 50~약 400개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 FAD2-1 인트론 단편, FATB CTP 코딩 지역 및 42개의 연속된 뉴클레오티드의 FATB 5' UTR을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 대두 종자는 FAD2 및 FATB의 내생적 발현을 억제하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하고, 상기 종자는 46~75중량%의 올레산, 1.5~8.5중량%의 포화 지방산, 2.5~38중량%의 리놀레산 및 4.5~17.5중량%의 리놀렌산을 포함하는 오일 조성을 가진다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 식물 세포의 내생적 FAD2 유전자로부터 유래되고, FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는 재조합 FAD2 서열을 식물 세포에서 발현하고; 그리고 ⅱ) 내생적 FAD2 유전자를 상기 재조합 FAD2 서열로 억제하여, FAD2 유전자 억제의 양이 전장 FAD2 인트론 또는 전장 FAD2 UTR로 이루어지는 재조합 FAD2 서열을 갖는 dsRNAi 구조물을 발현하므로써 얻어지는 유전자 발현의 양보다 적게 하므로써, 전장 FAD2 인트론 또는 전장 FAD2 UTR로 이루어지는 재조합 FAD2 서열을 갖는 dsRNAi 구조물을 발현하므로써 얻어지는 FAD2 유전자 억제의 양에 비하여 FAD2 유전자 억제의 양을 감소시키는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 내생적 FAD2 유전자의 부분으로부터 유래되고, FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는 재조합 FAD2 서열로 식물 세포를 형질전환시키고; 그리고 상기 재조합 FAD2 서열의 전사가 개시되는 조건하에서 상기 식물 세포를 성장시키므로써, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 FAD2 서열을 결한 식물 세포와 비교하여 오일 조성을 변화시키는, 상기 식물 세포의 오일 조성을 변화시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, ⅰ) 제1의 재조합 FAD2 서열로 형질전환된 식물로부터의 FAD2 유전자 억제의 양이, 유사한 유전적 기반과 제1의 재조합 FAD2 서열보다 많은 내생적 FAD2 서열로 이루어지는 제2의 재조합 FAD2 서열을 포함하는 식물 세포에서의 FAD2 유전자 억제의 양과 비교하여, 적어도 부분적으로 감소될 때까지 제1의 재조합 FAD2 서열의 길이를 단축시키고; ⅱ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 재조합 FATB 서열을 갖지 않는 식물 세포에서의 FATB의 억제와 비교하여, 식물 세포에서 FATB 유전자 발현을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 재조합 FATB 서열을 발현시키고; ⅲ) 상기 제1의 재조합 FAD2 서열 및 재조합 FATB 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 갖는 식물을 성장시키고; 그리고 ⅳ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 제1의 재조합 FAD2 서열 및 재조합 FATB 서열을 결한 식물로부터의 종자와 비교하여, 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 재배하므로써, 식물 종자에서 올레산 함량을 증가시키고, 포화 지방산 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 FAD2 및 FATB의 내생적 발현을 억제하고, 전장 FAD2 인트론 서열보다 적은 서열로 이루어지는 재조합 FAD2 및 재조합 FATB의 핵산 서열을 갖는 재조합 DNA 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키고; 그리고 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 DNA 서열을 결한 식물로부터의 종자와 비교하여 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 형질전환 식물을 성장시키므로써, 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 가지는 형질전환 식물을 생산하는 방법을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 지방산 합성 경로에서 내생적 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 적어도 40 뉴클레오티드 길이의 유전 인자(genetic element)를 분리하고; 상기 유전인자보다 짧은 하나 이상의 단편을 생성하고; 형질전환 식물을 생산하기 위하여, 온대성 오일종자 작물(temperate oilseed crop)의 식물 세포 내로 상기 짧은 하나 이상의 단편 각각을 도입하고; 그리고 종자 오일 지방산 조성에서 원하는 변화를 일으키는, 결정된 길이 및 서열의 짧은 단편을 포함하는 형질전환 식물을 선별하므로써, 온대 오일종자 작물의 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 매우 감소된 포화 지방산 함량과 약간 증가된 올레산 함량을 갖는 오일 조성을 나타내고, 식물 세포에서 FAD2의 내생적 발현을 억제하고, FAD2 인트론 단편으로 이루어지는 재조합 FAD2 서열을 갖는 DNA 서열을 가지는 대두 종자를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예는 약 60 내지 320개의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 FAD2-1A 인트론 단편의 서열을 포함하는 핵산 분자이다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 대두 FAD2-1 인트론을 포함하는, 내생적 대두 FAD2-1의 발현을 억제하는 제1의 재조합 DNA 서열, 및 KASI, Δ-9 탈포화효소, KASIV 및 이들의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 증가된 유전자 수준을 발현하는 제2의 재조합 DNA 서열을 갖는 대두 종자를 포함한다.
또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자의 대두 식물 세포를 포함한다. 또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 3중량% 미만의 리놀렌산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자의 대두 식물 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 약 60~320개의 연속된 뉴클레오티드의 FAD2-1A 인트론의 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은 약 20~약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2-1 인트론의 단편 및 약 40~450개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자 단편을 포함하는 재조합 DNA 구조물을 포함한다. 다른 구체예는, 약 20~약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 FAD2-1의 단편, 대두 FATB 3' UTR, 및 FATB 5' UTR 또는 CTP 코딩 지역을 포함하고, 대두 FAD2 -1 및 FATB의 내생적 발현을 억제하는 제 1의 재조합 DNA 서열, 및 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 Δ-9 탈포화효소로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 제2의 재조합 DNA 서열을 갖는 재조합 핵산 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 1.5~약 8중량%의 포화 지방산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일; 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일; 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 3중량% 미만의 리놀렌산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일; 및 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량, 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량 및 총 지방산의 약 1.5중량% 미만의 리놀렌산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일을 포함한다.
또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자로부터 유래된 대두 가루(meal)를 포함한다. 또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 3중량% 미만의 리놀렌산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자로부터 유래된 대두 가루를 포함한다
또한, 본 발명은 ⅰ) 식물 세포의 내생적 FAD2 유전자로부터 유래되고, FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는 이종성 FAD2 서열을 식물 세포에서 발현하고; 그리고 ⅱ) 내생적 FAD2 유전자를 상기 이종성 FAD2 서열로 억제하여, FAD2 유전자 억제의 양이 전장 FAD2 인트론 또는 전장 FAD2 UTR로 이루어지는 이종성 FAD2 서열을 발현하므로써 얻어지는 유전자 발현의 양보다 적게 하므로써, 전장 FAD2 인트론 또는 전장 FAD2 UTR로 이루어지는 이종성 FAD2 서열을 포함하는 dsRNAi 구조물을 발현하므로써 얻어지는 FAD2 유전자 억제의 양에 비하여 FAD2 유전자 억제의 양을 감소시키는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 내생적 FAD2 유전자의 부분으로부터 유래되고, FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는 이종성 FAD2 서열로 식물 세포를 형질전환시키고; 그리고 상기 이종성 FAD2 서열의 전사가 개시되는 조건하에서 상기 식물 세포를 성장시키므로써, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 이종성 FAD2 서열을 결한 식물 세포와 비교하여 오일 조성을 변화시키는, 식물 세포의 오일 조성을 변화시키는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은, ⅰ) 제1의 이종성 FAD2 서열로 형질전환된 식물로부터의 FAD2 유전자 억제의 양이, 유사한 유전적 기반과 상기 제1의 이종성 FAD2 서열보다 많은 내생적 FAD2 서열로 이루어지는 제2의 이종성 FAD2 서열을 포함하는 식물 세포에서의 FAD2 유전자 억제의 양과 비교하여, 적어도 부분적으로 감소될 때까지 제1의 이종성 FAD2 서열의 길이를 단축시키고; ⅱ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 이종성 FATB 서열을 갖지 않는 식물 세포에서의 FATB의 억제와 비교하여, 식물 세포에서 FATB 유전자 발현을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 이종성 FATB 서열을 발현시키고; ⅲ) 상기 제1의 이종성 FAD2 서열 및 이종성 FATB 서열을 갖는 게놈을 포함하는 식물을 성장시키고; 그리고 ⅳ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 제1의 이종성 FAD2 서열 및 이종성 FATB 서열을 결한 식물로부터의 종자와 비교하여, 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 재배하는 것을 포함하는, 식물 종자에서 올레산 함량을 증가시키고, 포화 지방산 함량을 감소시키는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 지방산 합성 경로에서 내생적 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 적어도 40 뉴클레오티드 길이의 유전 인자를 분리하고; 온대성 오일종자 작물의 식물 세포 내로 상기 유전 인자를 도입하고; 형질전환 식물을 생산하고; 그리고 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 상기 유전 인자를 포함하는 형질전환 식물 종자를 선별하는 것을 포함하는, 온대 오일종자 작물의 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 방법을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자의 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 약 20~약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2-1 인트론의 단편 및 약 40~약 450개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 포함하는 이종성 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 약 20~약 420개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2-1 인트론의 단편, 약 40~약 450개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편 및 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 Δ-9 탈포화효소의 하나 또는 모두의 발현을 증가시키는 핵산 서열을 포함하는 이종성 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 적어도 두 멤버의 FAD3 유전자 패밀리로부터의 핵산 서열을 포함하는 이종성 핵산 분자를 대두 세포에 도입하고; ⅱ) 식물 세포에서 내생적 FAD3 유전자 발현을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 FAD3 유전자로부터의 핵산 서열을 발현하고; ⅲ) 적어도 두 멤버의 FAD3 유전자 패밀리로부터의 핵산 서열을 갖는 게놈을 포함하는 식물 세포를 성장시키고; 그리고 ⅳ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 적어도 두 멤버의 FAD3 유전자 패밀리를 결한 식물 세포와 비교하여 감소된 리놀렌산 함량을 갖는 식물 세포를 재배하므로써, 대두 종자의 리놀렌산 함량을 감소시키는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 총 지방산의 약 42~약 85중량%의 올레산 함량, 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량 및 총 지방산의 약 1.5중량% 미만의 리놀렌산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1 내지 도 4는 예시적인 핵산 분자 배열을 각각 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d 및 도 6a 내지 도 6c는 제1세트의 DNA 서열의 모식도를 각각 나타낸다.
도 7 내지 도 20은 본 발명의 핵산 분자를 각각 나타낸다.
도 21은 구조물 pMON68537을 나타낸다.
도 22는 구조물 pMON68539를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
핵산 서열의 설명
서열번호:1은 FAD2-1A 인트론 1의 핵산 서열이다.
서열번호:2는 FAD2-1B 인트론 1의 핵산 서열이다.
서열번호:3은 FAD2-1B 프로모터의 핵산 서열이다.
서열번호:4는 FAD2-1A 게놈 클론의 핵산 서열이다.
서열번호:5 및 서열번호:6은 각각 FAD2-1A 3' UTR 및 5' UTR의 핵산 서열이다.
서열번호:7 내지 서열번호:13은 각각 FAD3-1A 인트론 1, 2, 3A, 4, 5, 3B 및 3C의 핵산 서열이다.
서열번호:14는 FAD3-1C 인트론 4의 핵산 서열이다.
서열번호:15는 부분적인 FAD3-1A 게놈 클론의 핵산 서열이다.
서열번호:16 및 서열번호:17은 각각 FAD3-1A 3' UTR 및 5' UTR의 핵산 서열이다.
서열번호:18은 부분적인 FAD3-1B 게놈 클론의 핵산 서열이다.
서열번호:19 내지 서열번호:25는 각각 FAD3-1B 인트론 1, 2, 3A, 3B, 3C, 4 및 5의 핵산 서열이다.
서열번호:26 및 서열번호:27은 각각 FAD3-1B 3' UTR 및 5' UTR의 핵산 서열이다.
서열번호:28은 FATB-1 게놈 클론의 핵산 서열이다.
서열번호:29 내지 서열번호:35는 각각 FATB-1 인트론 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ 및 Ⅶ의 핵산 서열이다.
서열번호:36 내지 서열번호:37은 각각 FATB-1 3' UTR 및 5' UTR의 핵산 서열이다.
서열번호:38은 쿠페아 풀케리마(Cuphea pulcherrima) KAS Ⅰ 유전자의 핵산 서열이다.
서열번호:39는 쿠페아 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자의 핵산 서열이다.
서열번호:40 및 서열번호:41은 각각 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis) 및 시몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis) Δ-9 탈포화효소 유전자의 핵산 서열이다.
서열번호:42는 FATB-2 cDNA의 핵산 서열이다.
서열번호:43은 FATB-2 게놈 클론의 핵산 서열이다.
서열번호:44 내지 서열번호:47은 각각 FATB-2 인트론 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ의 핵산 서열이다.
서열번호:48 내지 서열번호:60은 PCR 프라이머의 핵산 서열이다.
서열번호:61 및 서열번호:62는 각각 대두 FAD3-1C 3' UTR 및 5' UTR의 핵산 서열이다.
정 의
"ACP"는 아실 캐리어 단백질 부분을 나타낸다. "변화된 종자 오일 조성물"은 유사한 유전적 기반을 갖지만, 형질전환되지 않은 식물로부터의 종자 오일에 비하여, 변화된 또는 변경된 지방산의 수준을 갖는 본 발명의 유전자변형 식물 또는 형질전환 식물로부터의 종자 오일 조성물을 나타낸다.
"안티센스 억제"는 안티센스 RNA 분자의 도입에 의하여 유도된 유전자-특이적 사일런싱을 나타낸다.
"mRNA 또는 단백질과 같은 하나 이상의 제제의 동시발현"은 하나의 제제가 중첩되는 시간 영역에서 및 동일한 세포 또는 조직에서 다른 제제와 동시에 발현하는 것을 나타낸다. "하나 이상의 제제의 동조적 발현(coordinated expression)"은 그러한 제제들로부터의 전사체 및 단백질들의 생산이 공유된 프로모터 또는 동일한 프로모터를 사용하여 수행되는 것을 나타낸다.
핵산 서열의 "상보체"는 상기 핵산 서열의 전체 길이의 서열의 상보체를 나타낸다.
"동시억제"는 내생적 유전자의 전사체와 동일한 가닥성(strandedness)의 mRNA를 전사할 수 있는 상동성 센스 구조물의 발현에 의하여 특정 내생적 유전자 또는 유전자 패밀리의 발현 수준, 일반적으로 RNA 수준의 감소를 나타낸다. Napoli 등, Plant Cell 2:279~289 (1990); van der Krol 등, Plant Cell 2:291~299 (1990).
"조 대두 오일"은 대두 종자로부터 추출되어, 탈검화될 수는 있지만, 정제, 가공 또는 블렌드되지 않은 대두 오일을 나타낸다.
"CTP"는 "엽록체성 전이 펩티드 코딩 서열"에 의하여 코딩되는 엽록체성 전이 펩티드를 나타낸다.
본원에서 단백질과 핵산을 언급할 때, "유래된"은 공지의 단백질 또는 핵산으로부터 직접적으로(예를 들어, 공지된 단백질 또는 핵산의 서열을 찾고, 상기 공지된 단백질 또는 핵산의 서열과 적어도 부분적으로 유사한 서열을 갖는 단백질 또는 핵산을 제조) 또는 간접적으로(예를 들어, 공지된 단백질 또는 핵산에 관련된 생물체로부터 단백질 또는 핵산을 얻음) 단백질 또는 핵산을 얻는 것을 나타낸다. 공지된 단백질 또는 핵산으로부터 단백질 또는 핵산을 "유래시키는" 다른 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
이중-가닥 RNA("dsRNA"), 이중-가닥 RNA 간섭("dsRNAi") 및 RNA 간섭("RNAi")은 모두 적어도 부분적인 이중-가닥 RNA 분자를 전사할 수 있는 구조물의 도입에 의하여 유도되는 유전자-특이적 사일런싱을 나타낸다. "dsRNA 분자" 및 "RNAi 분자"는, 상보적인 핵산 서열들을 갖는 단편들을 포함하여, 서로 혼성화되어 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있는 RNA 분자의 지역을 나타낸다. 그러한 이중-가닥 RNA 분자는, 세포 또는 생물체에 도입되었을 때, 세포 또는 생물체의 세포에 존재하는 mRNA 종의 수준을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있다. 추가적으로, dsRNA는, 전체로서 참고문헌으로 본원에 통합된 국제출원번호 PCT/US2005/004681에 설명된 바와 같은 비정상적 재조합 및 위치-특이적 재조합을 통한 적절한 DNA 단편들의 생체 내 어셈블리 후에 만들어질 수 있다.
"엑손"은 발현된 단백질의 부분 또는 전체를 코딩하는 핵산 분자의 단편, 일반적으로 DNA의 단편을 의미하는 일반적인 의미의 용어를 나타낸다.
"지방산"은 유리 지방산과 지방산 아실기를 나타낸다.
"유전자"는 유전자 산물의 발현과 관련되는 5' 프로모터 지역, 어떠한 인트론 및 엑손 지역, 및 유전자 산물의 발현과 관련되는 3' 또는 5' 비번역 부위를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.
"유전자 사일런싱"은 유전자 발현의 억제 또는 유전자 발현의 하향-조절을 나타낸다.
"유전자 패밀리"는 유사한 작용 공헌도를 갖는 단백질을 코딩하는 생물체 내의 두 개 이상의 유전자이고, "유전자 패밀리 멤버"는 식물의 유전물질 내에서 발견되는 유전자 패밀리의 어떠한 유전자이며, 예를 들어, "FAD2 유전자 패밀리 멤버"는 식물의 유전물질 내에서 발견되는 어떠한 FAD2 유전자이다. 유전자 패밀리의 두 멤버의 예는 FAD2-1 및 FAD2-2이다. 유전자 패밀리는 핵산 서열의 유서성에 따라 추가적으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 유전자 FAD2는 그 유전자좌에서의 대립유전자를 포함한다. 바람직하게는, 유전자 패밀리 멤버는 유전자의 코딩 서열 부분에서 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 서열 동일성을 나타낸다.
"이종성"은 함께 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다.
핵산 분자가 간접적일지라도 인공적으로 세포 또는 생물체 내로 삽입되는 경우, "도입된"이라고 한다. 도입된 핵산 분자의 예는, 한정되지는 않지만, 형질전환, 형질도입 및 주입 및 투사를 통하여 세포 내로 도입된 핵산 및 한정되지는 않지만, 접합, 엔도사이토시스(endocy내지sis) 및 파고사이토시스(phagocy내지sis)를 포함하는 방법을 통하여 생물체 내로 도입된 핵산을 포함한다.
"인트론"은 발현된 단백질의 부분 또는 전체를 코딩하지 않으며, 내생적 조건에서, RNA 분자내로 전사되지만 RNA가 단백질로 번역되기 전에 내생적 RNA로부터 스플라이싱되어 제거되는 핵산 분자의 단편, 일반적으로 DNA의 단편을 의미하는 일반적 의미의 용어를 나타낸다. "인트론 dsRNA 분자" 및 "인트론 RNAi 분자"는 세포 또는 생물체에 도입되었을 때, 세포 또는 생물체의 세포 내에 존재하는 mRNA 종의 수준을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는, 인트론 서열을 포함하는 mRNA의 수준을 감소시키기 위하여, 세포 또는 생물체 내에 존재하는 유전자의 인트론과 충분한 동일성을 나타내는 이중-가닥 RNA 분자를 나타낸다.
"저 포화" 오일 조성은 3.6~8%의 포화 지방산을 포함한다.
"중(mid)-올레산 대두 종자"는 종자의 오일 조성이 50~85%의 올레산을 갖는 종자이다.
"저 리놀렌산" 오일 조성은 총 지방산의 약 3중량% 미만의 리놀렌산을 포함한다.
용어, "비-코딩"은 발현된 단백질의 일부분 또는 전체를 코딩하지 않는 핵산 분자의 서열을 나타낸다. 비-코딩 서열은, 한정되지는 않지만, 인트론, 프로모터 지역, 3' 비번역 부위(3' UTR) 및 5' 비번역 부위(5' UTR)를 포함한다.
용어, "오일 조성"은 지방산의 수준을 나타낸다.
하나 이상의 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터는 폴리시스트론 배열로 배치된 다중 코딩 또는 비-코딩 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 서열의 발현을 수행할 수 있다.
"물리적으로 연결된" 핵산 서열들은 단일 핵산 분자 상에서 발견되는 핵산 서열들이다.
"식물"은 전체 식물, 식물 조직(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자 및 식물 세포 및 이들의 자손을 포함한다.
용어, "식물 세포"는, 한정되지는 않지만, 종자 현탁 배양물(seed suspension cultures), 배아, 분열조직 부위, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 싹(shoots), 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자(microspores)를 포함한다.
"식물 프로모터"는, 한정되지는 않지만, 식물 바이러스성 프로모터, 식물로부터 유래한 프로모터 및 mRNA의 발현을 촉진하기 위하여 식물에서 작동할 수 있는 합성 프로모터를 포함한다.
"폴리시스트론 유전자" 또는 "폴리시스트론 mRNA"는 억제 또는 발현을 위하여 표적화된 하나 이상의 유전자의 핵산 서열에 상응하는 전사된 핵산 서열을 포함하는 어떤 유전자 또는 mRNA이다. 이러한 폴리시스트론 유전자들 또는 mRNA들은 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 전이 펩티드 코딩 서열, 엑손 또는 이들의 조합에 상응하는 서열들을 포함할 수 있고, 재조합 폴리시스트론 유전자 또는 mRNA는, 한정되지는 않지만, 예를 들어 하나의 유전자로부터의 하나 이상의 UTR들 및 다른 유전자로부터의 하나 이상의 인트론에 상응하는 서열들을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
"종자-특이적 프로모터"는 종자에서 우세하게 또는 특이적으로 활성을 갖는 프로모터를 나타낸다. "우세한 활성"은 식물의 다른 조직, 기관 또는 세포기관에서 보다 종자에서 실질적으로 더 큰 프로모터 활성을 나타낸다. "종자-특이적"은, 제한되지는 않지만, 종자의 호분층(aleurone layer), 배젖(endosperm) 및/또는 배아에서의 활성을 포함한다.
"센스 인트론 억제"는 센스 인트론 또는 이들의 단편의 도입에 의하여 유도되는 유전자 사일런싱을 나타낸다. 센스 인트론 억제는, 예를 들어, Fillatti의 PCT WO 01/14538 A2에서 설명된다.
mRNA 또는 단백질과 같은 하나 이상의 제제의 "동시 발현"은 하나의 제제와 동시에 다른 제제의 발현을 나타낸다. 그러한 발현은 단지 부분적으로만 중첩될 수 있으며, 또한, 다른 조직 또는 다른 수준으로 발생할 수도 있다.
"총 오일 수준"은 지방산의 종류에 관계 없이, 지방산의 총 누적량을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 총 오일 수준은 기본적인 글리세롤은 포함하지 않는다.
"형질전환유전자"는 생물체 내로 도입되는 유전자의 발현과 관련되는 핵산 서열을 나타낸다. 형질전환유전자는, 한정되지는 않지만, 내생 유전자 또는 생물에서 자연적으로 발생하지 않는 유전자를 포함한다. "형질전환유전자 식물"은 어떠한 성적인(sexual) 또는 무성적인(asexual) 방법에 의하여 식물로부터 형질전환유전자의 전달을 촉진시키는 방식으로 형질전환유전자를 안정하게 통합하는 어떤 식물이다.
"제로 포화(zero saturate)" 오일 조성은 3.6% 미만의 포화 지방산을 포함한다.
본 발명에서 단백질 및 핵산을 언급할 때, 대문자, 예를 들어, "FAD2"의 사용은 효소, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 나타내고, 이탤릭체, 예를 들어, "FAD2"의 사용은, 한정되지는 않지만, 유전자, cDNA 및 mRNA를 포함하는 핵산을 나타내기 위하여 사용된다. 세포 또는 생물체는 특정 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자 패밀리를 가질 수 있고, 유전자 용어 다음에 사용되는 대문자(A, B, C)는 패밀리 멤버를 구분하는데 사용될 수 있으며, 즉, FAD2-1A는 FAD2-1B와는 다른 유전자 패밀리 멤버이다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 어떤 범위의 설명은, 다른 설명이 없다면, 한계값들을 포함한다.
A. 제제들(Agents)
본 발명의 제제들은, 하나의 핵산 분자가 다른 핵산 분자와 혼성화하는 능력과 같은 구조적인 기여 또는 항체에 의하여 결합되는 (또는 그런 결합을 위하여 다른 분자와 경쟁하는) 단백질의 능력에 관하여, 바람직하게는 "생물학적으로 활성"일 것이다. 또는, 그러한 기여는 촉매적일 수 있으며, 따라서 화학 반응 또는 응답을 매개하는 제제의 능력과 관련된다. 상기 제제들은 바람직하게는 "실질적으로 정제된" 것이다. 본 발명에서 사용되는 용어로서, "실질적으로 정제된"은 자연적인 환경 조건에서 정상적으로 연관되는 다른 모든 분자로부터 실질적으로 분리된 분자를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 실질적으로 정제된 분자는 제조물(preparation)에 우세하게 존재하는 종이다. 실질적으로 정제된 분자는 천연 혼합물 내에 존재하는 (용매를 제외한) 다른 분자들로부터 60% 이상, 75% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 분리될 수 있다. 용어, "실질적으로 정제된"은 그들의 자연적인 환경 조건에서 존재하는 분자들을 포함하려는 의도는 아니다.
또한, 본 발명의 제제들은 재조합체일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어로서, "재조합체"는 (예를 들어, 한정되지는 않지만, DNA 또는 펩티드를 포함하는) 어떠한 제제, 또는 핵산 분자의 인위적 조작으로부터의 간접적인 결과물을 의미한다. 또한, 본 발명의 제제들은 상기 제제의 검출을 촉진시키기 위한 시약, 예를 들어, 형광 표지, 화학 표지 및/또는 수식된 염기로 표지될 수 있다.
본 발명의 제제들은 적어도 부분적으로 이중-가닥인 적어도 하나의 RNA 분자를 형성할 수 있는 센스- 및 안티센스-방향성으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 제제는 FAD2, FATB 또는 FAD2 및 FATB의 단편인 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중-가닥 RNA 분자이다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 제제는 숙주 세포에서 핵산 서열의 센스- 및 안티센스-방향성을 생산하기 위하여 전사될 수 있는 DNA 분자이다. 다른 구체예에 있어서, 핵산 분자는 센스 방향성 및 안티센스 방향성인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있거나, 또는 다른 구체예에 있어서, 핵산 분자는 센스 방향성 또는 안티센스 방향성인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터, 다른 프로모터들, 단일 프로모터 또는 하나 이상의 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 서열들은 단일 DNA 분자 또는 하나 이상의 DNA 분자 상에 존재할 수 있다.
본 발명의 제제들은 그들의 전장에 대하여 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에, 또는 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에 상보적인 핵산 서열에 적어도 50%, 60% 또는 70% 동일한 DNA 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, DNA 서열은 그들의 전장에 대하여, 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역, 또는 식물 코딩 또는 비-코딩 지역에 상보적인 핵산 서열에 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 적어도 99% 동일 또는 적어도 100% 동일하다.
종래 기술에서 잘 이해되는 바와 같이, "동일성"은 서열을 비교하여 결정되는 것으로서, 두 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두 개 이상의 핵산 분자 서열 간의 상관관계이다. 또한, 종래 기술에서, "동일성"은 그러한 서열들 사이의 매치에 의하여 결정되는 것과 같은 폴리펩티드 또는 핵산 분자 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은, 한정되지는 않지만, Computational Molecular Biology, Lesk, ed., Oxford University Press, New York 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, ed., Academic Press, New York 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartⅠ, Griffin와 Griffin, eds., Humana Press, New Jersey 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, Academic Press 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov와 Devereux, eds., S내지ck내지n Press, New York 1991; 및 Carillo와 Lipman, SIAM J. Applied Math, 48:1073, 1988에서 설명된 것들을 포함하는 공지된 방법들에 의하여 쉽게 계산될 수 있다.
동일성을 결정하기 위한 방법들은 검사된 서열 간에 가장 크게 매치되는 것으로 디자인된다. 또한, 상동성을 결정하는 방법들은 일반적으로 이용가능한 프로그램으로 코드화될 수 있다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은, 한정되지는 않지만, GCG; 핵산 서열 문의를 위하여 디자인된 세 가지(BLASTN, BLASTX 및 TBLASTX) 및 단백질 서열 문의를 위하여 디자인된 두 가지(BLASTP 및 TBLASTN)의 다섯 가지의 BLAST 프로그램을 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처, 예를 들어, BLAST Manual, Altschul 등, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403~410 (1990)로부터 일반적으로 이용할 수 있다. 또한, 잘 알려진 스미스 워터만 알고리즘(Smith Waterman algorithm)이 동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터들은 전형적으로 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman과 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443~453 (1970); Comparison matrix: Hentikoff와 Hentikoff로부터의 BLOSSUM62, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915~10919 (1992); Gap Penalty: 12; Gap Length Penalty: 4. 이러한 파라미터들과 함께 사용될 수 있는 프로그램은 Wisconsin주 Madison 소재의 Genetics Computer Group("GCG")으로부터의 "갭(gap)" 프로그램으로서 일반적으로 이용가능하다. 엔드 갭(end gap)에 대한 페널티(penalty)가 없는 상기 파라미터들은 펩티드 비교를 위한 디폴트 파라미터들(default parameters)이다.
핵산 분자 서열 비교를 위한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman과 Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443~453 (1970); 비교 매트릭스: 매치 - +10; 미스매치 = 0; 갭 패널티: 50; 갭 길이 패널티: 3. 본 발명에서 사용되는 것으로서, "%동일성"은 핵산 분자 서열 비교를 위한 디폴트 파라미터로서 상기 파라미터들 및 GCG의 10.2버전의 "갭" 프로그램을 사용하여 결정된다.
본 발명의 핵산 서열의 서브세트는 핵산 분자 단편을 포함한다. "핵산 분자 단편"은 큰 핵산 분자의 일부분을 나타내고, 그것은 큰 핵산 분자의 주요 부분(들) 또는, 실제적으로 대부분으로 이루어질 수 있다. 핵산 분자 단편은 약 15~약 400개의 연속된 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는, 약 15~약 45개의 연속된 뉴클레오티드, 약 20~약 45개의 연속된 뉴클레오티드, 약 15~약 30개의 연속된 뉴클레오티드, 약 21~약 30개의 연속된 뉴클레오티드, 약 21~약 25개의 연속된 뉴클레오티드, 약 21~약 24개의 연속된 뉴클레오티드, 약 19~약 25개의 연속된 뉴클레오티드 또는 약 21개의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 작은 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산 분자 단편은 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역의 주요 부분(들) 또는, 실제적으로 대부분으로 이루어질 수 있거나, 또는 더 작은 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 단편은 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역과 100%의 동일성을 보여준다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 단편은 더 큰 핵산 서열의 일부분을 포함한다. 다른 측면에서, 핵산 분자 단편은 본 발명의 핵산 분자의 적어도 15, 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열을 가진다. 바람직한 구체예에 있어서, 핵산 분자는 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역의 적어도 15, 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 핵산 서열을 가진다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 핵산 분자는 완전한 코딩 지역 또는 비-코딩 지역의 연속된 뉴클레오티드들의 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%를 갖는 핵산 서열을 가진다. 바람직한 구체예에 있어서, 전체 코딩 지역 또는 비-코딩 지역은 전체 유전자, 단일 엑손, 단일 인트론, 신호 서열 또는 비번역 부위(UTR)로부터 선택된 유전자 인자(element)일 수 있다. 전체 유전자 인자의 전체 서열을 갖지 않은 유전자 인자는 유전자 인자의 단편일 수 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 측면에서, 유전자 인자는 적어도 40개의 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자의 단편은 전체 유전자 인자의 일부분이고, 그러한 단편은 전체 유전자 인자의 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%의 연속된 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산 분자 단편은 전체 유전자 인자 길이의 약 5% 내지 약 80% 사이, 약 10% 내지 약 70% 사이, 약 10% 내지 약 60% 사이, 약 10% 내지 약 50% 사이, 약 25% 내지 약 60% 사이, 약 25% 내지 약 50% 사이, 약 40% 내지 약 60% 사이, 약 40% 내지 약 80% 사이, 약 50% 내지 약 90% 사이이다.
바람직한 구체예에 있어서, FAD2-1 인트론의 단편은 약 20 내지 약 420개 사이, 약 30 내지 약 420개 사이, 약 40 내지 약 320개 사이, 약 50 내지 약 200개 사이, 약 50 내지 약 400개 사이, 약 50 내지 약 420개 사이, 약 60 내지 약 320개 사이, 약 70 내지 약 220개 사이, 약 100 내지 약 200개 사이, 약 100 내지 약 320개 사이, 약 150 내지 약 200개 사이, 약 150 내지 약 220개 사이, 약 150 내지 약 400개 사이, 약 200 내지 약 300개 사이 또는 약 300 내지 약 400개 사이의 연속된 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, FAD2-1 인트론의 단편은 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 220개, 약 250개, 약 300개, 약 320개 또는 약 350개의 연속된 뉴클레오티드 길이이다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, FAD2-1 인트론 단편은 서열번호:1의 길이와 비교하여, 약 20개, 약 40개, 약 60개, 약 80개, 약 100개, 약 120개, 약 140개, 약 160개, 약 180개, 약 200개, 약 220개, 약 240개, 약 260개, 약 280개, 약 290개, 약 300개, 약 320개, 약 340개, 약 360개, 약 380개, 약 400개의 연속된 뉴클레오티드로 길이가 감소된다. 이러한 모든 FAD2-1 인트론 단편들에서, 절단(truncation) 또는 결실(deletion)은 5' 말단에서 시작되거나, 3' 말단에서 시작되거나, 또는 FAD2-1 인트론의 내부에서 일어날 수 있다. 이러한 모든 FAD2-1 단편들에서, FAD2-1 인트론의 서열은 서열번호:1일 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에 있어서, FATB 유전자의 단편은 FATB 유전자의 약 80 내지 약 450개, 약 100 내지 약 500개, 약 70 내지 약 500개, 약 200 내지 약 400개, 약 150 내지 약 300개, 약 250 내지 약 350개, 약 200 내지 약 350개의 연속된 뉴클레오티드이다. 하나의 바람직한 구체예에 있어서, FATB 단편은 FATB 내의 총 뉴클레오티드의 5' 말단 쪽 절반으로부터 유래된다. 이러한 FATB 단편들에서, 절단 또는 결실은 5' 말단에서 시작되거나, 3' 말단에서 시작되거나, 또는 FATB의 내부에서 일어날 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에 있어서, FATB 단편은 FATB의 5' 말단에서 시작하여 FATB의 총 뉴클레오티드의 절반으로부터 유래되거나, 5' 말단에 근접한 FATB의 총 뉴클레오티드의 1/3로부터 유래된다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, FATB 단편은 전이 펩티드 코딩 서열, 바람직하게는 엽록체 전이 펩티드 코딩 서열을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, FATB 단편은, 바람직하게는 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 전이 펩티드 코딩 서열의 단편을 포함한다. 또 다른 특히 바람직한 구체예에 있어서, FATB 단편은 FATB 5' UTR의 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 35개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 약 45개, 약 50개, 약 55개 또는 약 60개의 연속된 뉴클레오티드를 더 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 단편은 FATB 5' UTR에 접속된 FATB 3' UTR과 같은 두 개 이상의 불연속성 단편들 또는 분리된 유전자 인자들의 조합을 포함한다. 본 발명의 제제들은 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 제한되지는 않지만, 본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호:19, 20, 21, 22, 23, 25, 32, 33, 34, 35, 44, 45, 46 또는 47의 인트론 서열, 이들의 단편 또는 이들의 상보체를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 핵산 분자는, 세포 또는 생물체로 도입되었을 때, 하나의 RNA 또는 단백질의 생산을 억제하는 동시에, 다른 RNA 또는 단백질을 동시적으로 발현, 동시발현 또는 동조적으로 발현할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산 분자는, 세포 또는 생물체에 도입되었을 때, 내생적 FAD2, FAD3 및/또는 FATB RNA의 발현을 적어도 부분적으로 감소, 감소, 실질적으로 감소 또는 효과적으로 제거하는 동시에, 적어도 하나의 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ, Δ-9 탈포화효소 및/또는 CP4 EPSPS RNA 또는 단백질을 동시발현, 동시적으로 발현 또는 동조적으로 발현할 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
적어도 하나 이상의 내생적 유전자의 발현을 억제, 적어도 부분적으로 감소, 감소, 실질적으로 감소 또는 효과적으로 제거하므로써, 식물 세포에서 이용 가능한 FAD2 및/또는 FAD3의 양이 감소, 즉, 단백질의 정상-상태(steady-state)의 수준이 감소되고, 리놀레이트(C18:2) 및 리놀레네이트(C18:3)와 같은 다중불포화 지방산들의 감소된 비율이 제공될 수 있다. 트리아실글리세롤내로 통합시키기 위하여 이용가능한 지방산들의 풀(pool)의 변경은 식물 세포에서 오일의 조성에 마찬가지로 영향을 줄 수 있다. 그러므로, FAD2 및/또는 FAD3의 발현의 감소는 올레이트(C18:1)와 같은 단일-불포화 지방산의 증가된 비율로 귀결될 수 있다. FATB의 양이 식물 세포에서 감소될 때, 팔미테이트 및 스테아레이트와 같은 포화 지방산들의 감소된 양이 제공될 수 있다. 따라서, FATB의 발현의 감소는 올레이트(C18:1)와 같은 불포화 지방산들의 증가된 비율로 귀결될 수 있다. FAD2, FAD3 및 FATB 발현의 동시 억제에 의하여, 올레이트(C18:1)와 같은 탄소수 18개의 단일-불포화 지방산들이 전체적으로 증가되도록 FAS 경로가 진행된다. 미국 특허번호 제5,955,650호 참고.
식물 세포에서 이용가능한 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ(KAS Ⅰ) 및/또는 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ(KAS Ⅳ)의 양을 증가시키므로써, 16:0-ACP의 감소된 비율이 제공될 수 있고, 이로써 18:0-ACP의 증가된 비율이 유도된다. 하나 이상의 FAD2, FAD3 및 FATB의 동시 억제와 조합된 18:0-ACP의 더 큰 양에 의하여, 올레이트(C18:1)가 전체적으로 증가된 오일 조성이 유도된다. 식물 세포에서 이용가능한 Δ-9 탈포화효소의 양을 증가시킴으로써, 불포화 지방산의 증가된 비율이 제공될 수 있고, 이로써 스테아레이트 및 총 포화 지방산의 전체적인 저하로 귀결된다.
증가된 효소 발현 및 감소된 효소 발현의 이러한 조합은, 증가된 올레이트 수준, 감소된 리놀레이트, 리놀레네이트, 스테아레이트 및/또는 팔미테이트 수준 및 감소된 포화 지방산의 전체 수준을 갖는, 지방산을 포함하는 오일 조성물을 생산하기 위하여 조작될 수 있다. 식물에서 유전자 발현의 향상은 상기 유전자의 코딩 서열의 부가적인 사본들을 식물 세포로 도입시키거나, 또는 바람직하게는 상기 유전자의 코딩 서열의 부가적인 사본들을 상기 식물의 게놈에 통합시키므로써 나타날 수 있다. 또한, 과-발현은 유전자들의 발현을 조절하는 조절 메카니즘의 활성을 증가, 즉, 유전자 발현을 상향-조절시키므로써 나타날 수 있다.
식물 세포 내에서의 CP4 EPSPS의 생산은 식물 세포에 글리포세이트(glyphosate)에 대한 저항성 또는 내성을 제공하므로써, 글리포세이트-내성 선별을 통한 성공적인 형질전환체의 확인을 위한 편리한 방법을 제공한다.
또한, 유전자 사일런싱(silencing)으로 알려진 식물 내에서의 유전자 발현의 억제는 전사 수준 및 전사 후 수준 모두에서 발생한다. 숙주 세포 내에서 내생적 서열의 발현을 억제시키기 위한 방법으로서, 제한되지는 않지만, 안티센스 억제, 동시-억제, 리보자임, 센스 및 안티센스의 조합(이중-가닥 RNAi), 프로모터 사일런싱 및 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)과 같은 DNA 결합 단백질들을 포함하는 여러 방법이 있다(예를 들어, WO 98/53083, WO 01/14538 및 미국 특허번호 제5,759,829호(Shewmaker) 참고). 어러한 메카니즘 중 어떤 것은 DNA 또는 RNA 수준에서의 핵산 상동성(homology)과 관련된다. 이러한 상동성은 동일한 종들 내에서 또는 다른 종들 중의 DNA 또는 단백질 서열들의 유사성을 나타낸다. 만약 숙주 세포로 도입된 DNA 서열이 내생적 유전자와 충분히 상동성을 갖는다면 유전자 사일런싱이 일어나고, 이로써 도입된 DNA 서열의 전사는 내생적 유전자의 전사 또는 전사 후 유전자 사일런싱을 유도하게 될 것이다. 정상 상태의 발현 수준의 억제를 위한 충분한 상동성은, 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에 대하여, 또는 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에 상보적인 핵산 서열에 대하여, DNA 서열의 전체 길이가 적어도 50%, 약 60% 또는 약 70% 동일할 수 있다. DNA 서열은 그것의 전체 길이가 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에 대하여, 또는 식물 코딩 지역 또는 비-코딩 지역에 상보적인 핵산 서열에 대하여 적어도 80% 동일성; 적어도 85% 동일성; 적어도 90% 동일성; 적어도 95% 동일성; 적어도 97% 동일성; 적어도 98% 동일성; 적어도 99% 동일성; 또는 100% 동일성인 것이 더욱 바람직하다. 식물에서, 이중-가닥 RNA 분자들은 서열-특이적 사일런싱을 유도할 수 있다. 유전자 사일런싱은 식물에서 이중-가닥 RNA("dsRNAi")로, 캐노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 및 동물에서 RNA 간섭 또는 RNAi로, 곰팡이에서 진압(quelling)으로 종종 언급된다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 제1세트의 DNA 서열들을 포함하고, 상기 제1세트의 DNA 서열 각각은 식물 유전자의 하나 이상의 코딩 또는 비-코딩 서열과 충분한 상동성을 나타내어, 그것이 발현될 때, 그것은 상기 코딩 또는 비-코딩 서열이 유래된 상기 유전자 또는 표적 코딩 또는 비-코딩 서열에 상동성을 갖는 어떤 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거, 실질적으로 감소 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는, (a) 제1세트의 DNA 서열들 및 (b) 제2세트의 DNA 서열들을 포함하고, 상기 제1세트의 DNA 서열 각각은 식물 유전자의 하나 이상의 코딩 또는 비-코딩 서열과 충분한 상동성을 나타내어, 그것이 발현될 때, 그것은 상기 코딩 또는 비-코딩 서열이 유래된 상기 유전자 또는 표적 비-코딩 서열에 상동성을 갖는 어떤 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거, 실질적으로 감소 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있고, 그리고 상기 제2세트의 DNA 서열 각각은 식물 유전자에 충분한 상동성을 나타내어, 그것이 발현될 때, 그것은 상기 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 적어도 부분적으로 향상, 증가, 향상 또는 실질적으로 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, DNA 서열들의 "세트"는 단백질을 코딩하거나, 코딩하지 않는 하나 이상의 서열일 수 있다. 예를 들어, 제1세트의 DNA 서열들은 단지 프로모터, 비-코딩 지역 및 터미네이터로 구성될 수 있다. 제2세트의 DNA 서열들은 제1세트의 DNA 서열들 앞 또는 뒤에 존재할 수 있거나, 또는 존재하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 단백질 또는 mRNA와 같은 제제의 수준 또는 양의 "감소"는 상기 수준 또는 양이 상기 제제를 감소시킬 수 있는 DNA 서열을 결한 세포 또는 생물체에 비하여 감소된 것을 의미한다. 예를 들어, "적어도 부분적인 감소"는 적어도 25%의 감소를 나타내고, "실질적인 감소"는 적어도 75%의 감소를 나타내고, 그리고 "효과적인 제거"는 95% 이상의 감소를 나타내며, 제제의 수준 또는 양에 있어서 감소를 나타내는 상기 모든 용어들은 제제를 감소시킬 수 있는 DNA 서열을 결한 세포 또는 생물체의 경우와 비교하여 나타내는 용어들이다.
본 발명에서 사용되는 것으로서, 단백질 또는 mRNA와 같은 제제의 "향상된" 또는 "증가된" 수준 또는 양은, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 단백질 또는 mRNA를 코딩하는 도입된 핵산 분자를 결한 세포, 조직 또는 식물에 존재하는 제제의 수준 또는 양보다 많은 수준 또는 양을 의미한다. 예를 들어, "적어도 부분적으로 향상된" 수준은 적어도 25%의 증가를 나타내고, "실질적으로 향상된" 수준은 적어도 100%의 증가를 나타내며, 제제의 수준 또는 양에 있어서 증가를 나타내는 상기 모든 용어들은 유사한 유전적 기반을 갖지만, 해당 단백질 또는 mRNA를 코딩하는 도입된 핵산 분자를 결한 세포, 조직 또는 식물에 존재하는 제제의 수준 또는 양과 대비하여 나타내는 용어들이다. 바람직한 구체예에 있어서, 발현의 증가는, 단백질이 해당 시스템에 대해 이종성인 어떠한 발현일 수 있다. 예를 들어, CP4 EPSPS의 어떠한 발현은, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 도입 이전에는 식물에서 발현되지 않았다면, 이는 발현의 증가일 수 있다.
제제의 수준이 비교될 때, 그러한 비교는 유사한 유전적 기반을 갖는 생물체 사이에서 수행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 유사한 유전적 기반은, 비교되는 생물체가 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상 및 더욱 바람직하게는 90% 이상의 핵 유전물질의 서열 상동성을 공유하는 기반이다. 다른 바람직한 측면에 있어서, 유사한 유전적 기반은, 비교되는 생물체가 식물들이고, 이 식물들은 식물 형질전환 기술을 사용하여 도입된 어떠한 유전물질을 제외하고는 동질의 유전자형인 그러한 기반이다. 제제의 수준 또는 양의 측정은, 제한되지는 않지만, mRNA 전사체 수준, 단백질 또는 펩티드 수준 및/또는 표현형, 특히 오일 함량의 비교를 포함하는 어떤 적절한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, mRNA 전사체는 가공 및 비-가공된 mRNA 전사체를 포함하고, 단백질 또는 펩티드는 어떤 번역 후 수식이 수행 또는 미수행된 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
제1세트의 DNA 서열들은 코딩 서열들, 인트론 서열들, 3' UTR 서열들, 5' UTR 서열들, 프로모터 서열들, 다른 비-코딩 서열들 또는 이들의 어떤 조합일 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB를 구성하는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩된 단백질과 전사체 중 어느 하나 또는 모두를 선택적으로 감소시킬 수 있는 하나 이상의 서열을 코딩한다. 바람직한 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 개별적인 안티센스 서열들이 하나의 전사체에 연결될 수 있거나, 또는 연결되지 않은 개별적 전사체들일 수 있는 안티센스 RNA를 발현할 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은 단일 dsRNA 분자를 발현할 수 있는 물리적으로 연결된 서열들이다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 개별적인 센스 서열들이 하나의 전사체에 연결될 수 있거나, 또는 연결되지 않은 개별적인 전사체들일 수 있는 센스 동시억제 RNA를 발현할 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들의 예는 발명의 상세한 설명의 파트 B와 실시예에서 설명된다.
제2세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ(KAS Ⅰ), β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ(KAS Ⅳ), Δ-9 탈포화효소 및 CP4 EPSPS로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 단백질 또는 전사체의 어느 하나 또는 모두를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 서열을 코딩한다. 제2세트의 DNA 서열들은 물리적으로 연결된 서열들일 수 있다. 제2세트의 DNA 서열들의 예는 하기의 발명의 상세한 설명의 파트 C 및 D에 설명되어 있다.
그러므로, 본 발명은 지방산들 및 이러한 지방산들을 포함하는 오일, 왁스 및 지방과 같은 화합물들의 조성을 변화시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포 식물에서 특정 지방산들의 생산을 위한 방법을 제공한다. 그러한 방법들은 숙주 식물 세포의 FAS 경로의 변형을 위하여 본 발명에서 설명된 발현 카세트의 사용을 적용한다.
B. 제1세트의 DNA 서열들
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산 분자는, 세포 또는 생물체 내로 도입될 때, 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체들 또는 단백질들의 수준을 효과적으로 제거, 실질적으로 감소 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 하나 이상의 서열을 발현하는 제1세트의 DNA 서열들을 포함한다. 본 발명의 바람직한 측면은, 표적으로서 내생 유전자, 식물 유전자 및 비-바이러스성 유전자를 포함한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자는 FAD2, FAD3 또는 FATB 유전자이다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는, 식물 세포 또는 식물 내로 도입되어 발현될 때, 코딩 또는 비-코딩 서열(들)이 유래된 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체 또는 단백질의 수준을 효과적으로 제거, 실질적으로 감소 또는 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는, 식물 유전자로부터의 하나 이상의 코딩 또는 비-코딩 서열들과 충분한 상동성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 제1세트의 DNA 서열들은, 억제되어질 유전자로부터 유래된 코딩 지역 또는 비-코딩 지역과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 RNA 서열들 또는 RNA 단편들을 전사한다. 이러한 백분율 동일성은 다른 핵산 단편과 비교되는 것일 수 있다.
바람직하게는, 비-코딩 서열은 3' UTR, 5' UTR, 단백질을 코딩하는 서열의 부분 또는 식물 유전자로부터의 인트론이다. 보다 바람직하게는, 상기 비-코딩 서열은 프로모터 서열, 3' UTR, 5' UTR 또는 식물 유전자로부터의 인트론이다. 상기 인트론은 엑손들 사이에 위치되거나, 또는 식물 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR 내에 위치될 수 있다. 상기 코딩 서열은 단백질 코딩 프레임의 부분인 것이 바람직하다.
제1세트의 DNA 서열들의 서열(들)은, 식물 세포 또는 식물 내로 도입되었을 때, 원하는 효과를 달성하기 위한 dsRNA, 센스 억제 RNA, 또는 안티센스 RNA 또는 어떤 다른 억제 전사체를 생산하기 위하여 설계될 수 있다. 이러한 DNA 서열(들)은 핵산 분자 단편들일 수 있다.
식물 인트론은, 내생적이든지, 도입된 것이든지, 유전자로부터의 어떤 식물 인트론일 수 있다. 생물체들로부터의 이러한 인트론들의 핵산 서열들은, 제한되지는 않지만, 인터넷 사이트 ebi.ac.uk/swisprot/; expasy.ch/; embl-heidelberg.de/; 및 ncbi.nlm.nih.gov.에서 발견될 수 있는 EMBL 및 Genebank와 같은 데이터 베이스들을 포함하는 여러 기원들로부터 얻거나 또는 유래될 수 있다. 또한, 이러한 인트론들의 핵산 서열들은, 제한되지는 않지만, 인터넷 사이트 genes.mit.edu/GENSCAN.html에서 발견될 수 있는 GENSCAN 프로그램과 같은 기원들로부터 유래될 수 있다.
또한, 추가적인 인트론들은, 제한되지는 않지만, 공지의 엑손 또는 인트론 서열들의 프로브로 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 게놈 서열을 그것과 대응되는 cDNA 서열을 비교하거나, 또는 예를 들어, 선충과 같은 다른 생물체로부터의 게놈 서열과 대응(alignment)시키므로써, 대두 cDNA와 같은 인트론을 클로닝하는 것을 포함하는 방법들에 의하여 얻어질 수 있다. 추가적으로, 인트론들의 다른 핵산 서열들은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 상기 설명된 방법들은, 제한되지는 않지만, 프로모터 서열들, 3' UTR 서열들 및 5' UTR 서열들을 포함하는 다른 비-코딩 서열들을 유도 및 얻기 위하여 사용될 수 있다.
"FAD2", "Δ12 탈포화효소" 또는 "Ω-6 탈포화효소" 유전자는 카르복실 말단으로부터 12번째 위치의 지방산 아실 부분 내에 이중 결합을 삽입하는 것을 촉매할 수 있는 효소(FAD2)를 코딩한다. 용어 "FAD2-1"은 종자 조직에서 특이적 방식으로 자연적으로 발현되는 FAD2 유전자를 나타내는데 사용되고, 용어 "FAD2-2"는 (a) FAD2-1 유전자와는 다른 유전자이고, (b) 종자를 포함하는 다수의 조직들에서 자연적으로 발현되는 FAD2 유전자를 나타내기 위하여 사용된다. 대표적인 FAD2 서열들은, 제한되지는 않지만, 2002년 6월 21일자로 출원된 미국 특허출원번호 제10/176,149호에 개시된 서열들 및 서열번호: 1 내지 서열번호:6에 나타난 것들을 포함한다.
"FAD3, "Δ15 탈포화효소" 또는 "Ω-3 탈포화효소" 유전자는 카르복실 말단으로부터 15번째 위치의 지방산 아실 부분 내에 이중 결합을 삽입하는 것을 촉매할 수 있는 효소(FAD3)를 코딩한다. 용어 "FAD3-1, FAD3-A, FAD3-B 및 FAD3-C"는 종자를 포함하는 다수의 조직들에서 자연적으로 발현되는 FAD3 유전자 패밀리 멤버들을 나타내기 위하여 사용된다. 대표적인 FAD3 서열들은, 제한되지는 않지만, 2002년 6월 21일자로 출원된 미국 특허출원번호 제10/176,149호에 개시된 서열들 및 서열번호:7 내지 서열번호:27에 나타난 것들을 포함한다.
"FATB" 또는 "팔미토일-ACP 티오에스테라아제" 유전자는, 그것의 바람직한 반응으로서, 팔미토일-ACP의 판토텐 보결분자단(panthothene prosthetic group) 내의 탄소-황 티오에스테르 결합의 가수분해성 절단을 촉매할 수 있는 효소(FATB)를 코딩한다. 또한, 다른 지방산-ACP 티오에스테르들의 가수분해가 이 효소에 의하여 촉매될 수 있다. 대표적인 FATB-1 서열은, 제한되지는 않지만, 2002년 6월 21일자로 출원된 미국 가출원번호 제60/390,185호; 미국 특허번호 제5,955,329호; 제5,723,761호; 제5,955,650호; 및 제6,331,664호에 개시된 서열들; 및 서열번호:28~37에 나타난 것들을 포함한다. 대표적인 FATB-2 서열들은, 제한되지는 않지만, 서열번호:42~47에 나타난 것들을 포함한다.
C. 제2세트의 DNA 서열들
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 핵산 분자는, 세포 또는 생물체 내로 도입될 때, 하나 이상의 유전자에 의하여 코딩되는 mRNA 전사체들 또는 단백질들의 수준을 부분적으로 향상, 증가, 향상 또는 실질적으로 향상시킬 수 있는 제2세트의 DNA 서열들을 포함한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자는 내생적 유전자이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 유전자는 이종성 유전자일 수 있다. 하나의 바람직한 측면에 있어서, 이종성 또는 내생 유전자들은 동일한 핵산 분자 상에 있을 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자는 식물 유전자이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 유전자는 완전한 유전자에 의하여 촉매되는 반응을 촉매할 수 있는 절단된(truncated) 유전자이다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유전자는 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ 유전자, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 유전자, Δ-9 탈포화효소 유전자, CP4 EPSPS 유전자 또는 이들 유전자들의 조합물이다.
본 발명의 유전자는, 내생적이든지, 도입된 것이든지, 어떠한 유전자일 수 있다. 이러한 유전자들의 핵산 서열들은, 제한되지는 않지만, 인터넷 사이트 ebi.ac.uk/swisprot/; expasy.ch/; embl-heidelberg.de/; 및 ncbi.nlm.nih.gov.에서 발견될 수 있는 EMBL 및 Genebank와 같은 데이터 베이스들을 포함하는 여러 기원들로부터 유래될 수 있다. 또한, 이러한 유전자들의 핵산 서열들은, 제한되지는 않지만, 인터넷 사이트 genes.mit.edu/GENSCAN.html에서 발견될 수 있는 GENSCAN 프로그램과 같은 기원들로부터 유래될 수 있다.
또한, 추가적인 유전자들은, 제한되지는 않지만, 공지의 유전자 서열들의 프로브로 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 예를 들어, 선충과 같은 다른 생물체로부터의 유전자 또는 프로브와 대응(alignment)시키므로써 유전자를 클로닝하는 것을 포함하는 방법들에 의하여 얻어질 수 있다. 추가적으로, 유전자들의 다른 핵산 서열들은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 추가적인 유전자들은, 제한되지는 않지만, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하여 증폭되어, 본 발명의 구체예에서 사용될 수 있다. 나아가, 유전자들의 다른 핵산 서열들은 당업자에 명백할 것이다.
자동화된 핵산 합성기들이 이러한 목적을 위하여, 그리고 세포 또는 생물체 내에서 발견되는 서열을 갖는 핵산 분자를 제조하기 위하여 적용될 수 있다. 이러한 합성을 목적으로, 어떤 원하는 핵산 분자 또는 제1유전자의 단편을 PCR로 증폭하고, 이를 얻기 위하여, PCR에 사용될 수 있는 한 쌍의 프라이머를 특정하기 위한 목적으로 핵산 분자가 사용될 수 있다.
"KAS Ⅰ" 또는 "β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ" 유전자는 지방산 아실 부분을 팔미토일-ACP(C16:0)까지 연장시키는 것을 촉매할 수 있는 효소(KAS I)를 코딩한다. 대표적인 KAS Ⅰ 서열은, 제한되지는 않지만, 미국 특허번호 제5,475,099호와 PCT 공개공보 WO 94/10189에 개시된 서열들 및 서열번호:38에 나타난 것들을 포함한다.
"KAS Ⅳ" 또는 "β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ" 유전자는 중간 사슬 아실-ACP의 축합을 촉매하고, 18:0-ACP의 생산을 향상시킬 수 있는 효소(KAS Ⅳ)를 코딩한다. 대표적인 KAS Ⅳ 서열은,제한되지는 않지만, PCT 공개공보 WO 98/46776에 개시된 서열들 및 서열번호:39에 나타낸 것들을 포함한다.
"Δ-9 탈포화효소" 또는 "스테아로일-ACP 탈포화효소" 또는 "Ω-9 탈포화효소" 유전자는 카르복실 말단으로부터 9번째 위치의 지방산 아실 부분 내로 이중 결합의 도입을 촉매할 수 있는 효소를 코딩한다. 본 발명의 바람직한 Δ-9 탈포화효소는 식물 또는 시아노박테리아 Δ-9 탈포화효소이고, 보다 바람직하게는 카르타머스 팅크토리우스(Cartharmus tinc내지rius), 리시너스 코뮤니스(Ricinus communis), 시몬시아 키넨시스(Simmonsia chinensis) 및 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)로 이루어지는 군으로부터 선택된 생물체에서 발견되는 Δ-9 탈포화효소이다. 대표적인 Δ-9 탈포화효소 서열은, 제한되지는 않지만, 미국 특허번호 제5,723,595호에 개시된 서열들 및 서열번호:40~41에 나타난 것들을 포함한다.
"CP4 EPSPS" 또는 "CP4 5-엔올피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소" 유전자는 이들로부터 생성된 식물 세포 및 식물에 실질적인 정도의 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 효소(CP4 EPSPS)를 코딩한다. CP4 EPSPS 서열은, 미국 특허번호 제5,633,435호에 설명된 바와 같은, 아그로박테리움 투메파시엔스 종(Agrobacterium tumefaciens sp.) CP4 또는 이들의 변종 또는 합성 형태로부터 유래된 CP4 EPSPS일 수 있다. 대표적인 CP4 EPSPS 서열은, 제한되지는 않지만, 미국 특허번호 제5,627,061호 및 제5,633,435호에 개시된 것들을 포함한다.
D. 재조합 벡터들 및 구조물들
본 발명의 하나 이상의 핵산 구조물들은 식물 형질전환 또는 형질감염에 사용될 수 있다. 전사체들 또는 단백질들과 같은 생산물들의 수준은 식물과 같은 생물체의 전반에 걸쳐 증가되거나 감소될 수 있고, 또는 생물체의 하나 이상의 특정 기관 또는 조직에 국한되어 위치될 수 있다. 예를 들어, 생산물들의 수준은, 제한되지는 않지만, 뿌리, 덩이줄기, 줄기, 잎, 잎자루(stalk), 과실, 베리(berry), 너트(nut), 바크(bark), 포드(pod), 종자 및 꽃을 포함하는 식물의 하나 이상의 조직 및 기관에서 증가되거나, 또는 감소될 수 있다. 바람직한 기관은 종자이다. 예를 들어, 외생적 유전물질은 식물 세포 내로 전달될 수 있고, 상기 식물 세포는 임성 식물(fertile plant) 또는 중성 식물(sterile plant)의 전체 또는 식물의 부분으로 재생될 수 있다.
"외생적 유전 물질"은 자연적으로 발생하든, 자연적으로 발생하지 않든, 어떤 생물체 내로 삽입될 수 있는 어떤 기원으로부터의 어떤 유전 물질이다. 이러한 외생적 유전 물질은, 제한되지는 않지만, 본 발명의 핵산 분자들 및 구조물들을 포함한다. 외생적 유전 물질은 이러한 목적을 위하여 설계된 DNA 벡터 또는 구조물을 사용하여 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 유사하게, 바이러스는 숙주 세포 내로 외생적 유전 물질을 전달할 수 있다. 외생적 유전 물질은 내생적 유전자와 동일한 DNA 서열을 갖지만, 내생적 유전자의 발현을 억제할 목적의 DNA 벡터 또는 구조물의 사용에 의하여 숙주 세포로 재도입된다. 일반적으로, 이러한 벡터의 설계는 당 분야에 공지된 기술이다(예를 들어, Plant Molecular Biology: A Labora내지ry Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997) 참고). 바람직한 구체예에 있어서, 외생적 유전 물질은 재조합 DNA이다.
구조물 또는 벡터는 선택된 핵산 분자를 발현하기 위하여 식물 세포에서 기능하는 프로모터 또는 식물 프로모터를 포함할 수 있다. 식물 세포들에서 활성인 많은 프로모터는 문헌에 설명되어 있으며, CaMV 35S 및 FMV 프로모터들이 식물에서 사용되기에 바람직하다. 바람직한 프로모터들의 다른 예들은 콩 아르셀린(bean arcelin) 및 7S α를 포함한다. 추가적인 바람직한 프로모터들은 CaMV 35S 및 FMV 35S 프로모터의 향상된 또는 중복된 버전(version)이다. Odell 등, Nature 313: 810~812 (1985); 미국 특허번호 제5,378,619호 참고. 사용될 수 있는 추가적인 프로모터들은, 예를 들어, 미국특허 제5,378,619호; 제5,391,725호; 제5,428,147호; 제5,447,858호; 제5,608,144호; 제5,608,144호; 제5,614,399호; 제5,633,441호; 제5,633,435호; 및 제4,633,436호에 설명되어 있다. 추가적으로, 조직 특이적 인핸서가 사용될 수 있다.
또한, 특히 바람직한 프로모터들은 종자 또는 과실에서 본 발명의 핵산 분자를 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 나아가, 바람직한 구체예에 있어서, 사용되는 프로모터는 종자 특이적 프로모터이다. 이러한 프로모터들의 예는 나핀(napin)(Krid 등, Seed Sci. Res. 1:209~219 (1991)), 파세올린(phaseolin), 스테아로일-ACP 탈포화효소, 7Sα, 7sα'(Chen 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560~8564 (1986)), USP, 아르셀린(arcelin) 및 올레오신(oleosin)과 같은 유전자들로부터의 5' 조절 지역들을 포함한다. 종자에서 발현하기 위한 바람직한 프로모터들은 7Sα, 7Sα', 나핀 및 FAD2 -1A 프로모터들이다.
또한, 구조물들 또는 벡터들은, 제한되지는 않지만, 3' 전사 종결자들(3' transcriptional termina내지rs), 3' 폴리아데닐레이션 신호들(3' polyadenylation signals), 다른 비번역 핵산 서열들, 전이 또는 표적 서열들, 선택 가능한 또는 검색 가능한 마커들, 프로모터들, 인핸서들 및 오퍼레이터들(operators)을 포함하는 다른 유전 인자들을 포함할 수 있다. 또한, 구조물들 또는 벡터들은, 삽입될 때 내생적 프로모터를 사용할 수 있는 프로모터 없는 유전자를 포함할 수 있다.
식물 형질전환 또는 형질감염에 사용될 수 있는 핵산 분자들은 본 발명의 어떤 핵산 분자들일 수 있다. 본 발명은 설명된 구체예들에 한정되는 것을 의도하지는 않는다. 예시적인 핵산 분자들은 발명의 상세한 설명의 파트 A에서 설명되어 있고, 제한되지는 않지만, 추가적인 예시 핵산 분자들은 아래에 설명되어 있고, 도 1~4 및 실시예들에 예시되어 있다.
도면을 참고하면, 본 발명의 핵산 분자의 구체예들은 도 1~4에 나타내었다. 상기 설명된 바와 같이, 핵산 분자는 하나 이상의 T-DNA 지역상에 위치하는, (a) 제1세트의 DNA 서열들 및 (b) 제2세트의 DNA 서열들을 포함하며, 이들의 각각은 우측 경계(right border) 및 좌측 경계(left border)에 의하여 접한다. T-DNA 지역 내에서의 전사의 방향은 화살표로 나타내었다. 설명된 핵산 분자들은 모노시스트론 또는 폴리시스트론 구조로 배열된 그들의 DNA 서열들을 가질 수 있다. 바람직한 구조는 제1세트의 DNA 서열들과 제2세트의 DNA 서열들이 단일 T-DNA 지역상에 위치된 구조를 포함한다.
예시된 각각의 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는, 하나, 둘 또는 전부의 단백질들 및 전사체들을 선택적으로 감소시킬 수 있는 하나 이상의 서열을 포함한다. 제1세트의 DBA서열들의 바람직한 각각의 서열은, 발현될 때, 제한되지는 않지만, 다른 유전자 패밀리 멤버들을 포함하는 다른 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 상기 서열들은 코딩 서열들, 인트론 서열들, 3' UTR 서열들, 5' UTR 서열들, 다른 비-코딩 서열들 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들은 dsRNA 구조물, 센스 동시억제 구조물 또는 안티센스 구조물을 포함하는 어떠한 적절한 형태로 발현될 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들은 상기 서열들을 발현할 수 있고, 식물에서 작용하는 어떤 프로모터일 수 있는 적어도 하나의 프로모터 또는 어떤 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 제한되지는 않지만, 바람직한 프로모터들은 나핀 프로모터, 7Sα 프로모터, 7Sα' 프로모터, 아르셀린 프로모터 또는 FAD2-1A 프로모터를 포함한다.
제2세트의 DNA 서열들은 코딩 서열들을 포함하고, 이들의 각각은 KAS Ⅰ, KAS Ⅳ, Δ-9 탈포화효소 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 단백질 및 전사체의 어느 하나 또는 모두를 증가시킬 수 있는 서열을 코딩하는 DNA 서열이다. 각각의 코딩 서열은 식물에서 작동하는 어떤 프로모터일 수 있는 프로모터 또는 어떤 식물 프로모터와 결합된다. 제2세트의 DNA 서열들에서 사용되기 위한 바람직한 프로모터들은 FMV 프로모터 및/또는 종자-특이적 프로모터들이다. 특히 바람직한 종자-특이적 프로모터들은, 제한되지는 않지만, 나핀 프로모터, 7Sα 프로모터, 7Sα' 프로모터, 아르셀린 프로모터, Δ-9 탈포화효소 또는 FAD2-1A 프로모터를 포함한다.
도 1 및 도 2에 나타낸 구체예들에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되거나, 또는 그것으로부터 전사되는 단백질 및 전사체 중 하나 또는 모두의 발현을 억제할 수 있는 dsRNA 분자를 형성할 수 있다. 도 1에 나타낸 제1세트의 DNA 서열들은 3개의 비-코딩 서열들을 포함하고, 이들의 각각은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 비-코딩 지역과 동일성을 나타내는 RNA 서열(도시되지 않음)을 발현한다. 상기 각각의 비-코딩 서열은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 비-코딩 지역과 적어도 90% 동일성을 나타내는 RNA 서열을 발현한다. 또한, 제1세트의 DNA 서열들은 3개의 안티센스 서열들을 포함하고, 이들의 각각은 (비-코딩 서열들에 의하여 발현되는 것으로서) 그것의 각각의 상응하는 RNA 서열을 갖는 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 안티센스 RNA 서열(도시되지 않음)을 발현한다.
상기 비-코딩 서열들은 스페이서 서열(spacer sequence), 바람직하게는 dsRNA 분자의 형성을 촉진할 수 있는 스페이서 서열에 의하여 안티센스 서열들로부터 분리될 수 있다. 이러한 스페이서 서열들의 예는 Wesley 등, Plant J., 27(6):581~90 (2001) 및 Hamilton 등, Plant J., 15:737~746 (1988)에 나타난 것들을 포함한다. 바람직한 하나의 측면에 있어서, 상기 스페이서 서열은 상기 Wesley 등에 설명된 것과 같은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 본 발명에서 특히 바람직한 스페이서 서열은 식물 인트론들 또는 이들의 부분이다. 특히 바람직한 식물 인트론은 스플라이싱이 가능한 인트론이다. 스플라이싱이 가능한 인트론들은, 제한되지는 않지만, PDK 인트론, FAD3-1A 또는 FAD3-1B 인트론 #5, FAD3 인트론 #1, FAD3 인트론 #3A, FAD3 인트론 #3B, FAD3 인트론 #3C, FAD3 인트론 #4, FAD3 인트론 #5, FAD2 인트론 #1 및 FAD2-2 인트론으로 이루어지는 군으로부터 선택된 인트론을 포함한다. 바람직한 스플라싱 가능한 인트론들은, 제한되지는 않지만, FAD3 인트론 #1, FAD3 인트론 #3A, FAD3 인트론 #3B, FAD3 인트론 #3C 및 FAD3 인트론 #5로 이루어지는 군으로부터 선택된 인트론을 포함한다. 다른 바람직한 스플라이싱 가능한 인트론들은, 제한되지는 않지만, 약 0.75kb 내지 약 1.1kb 길이이고, RNA 헤어핀 구조를 촉진할 수 있는 스플라이싱 가능한 인트론을 포함한다. 제한되지는 않지만, 특히 바람직한 스플라이싱 가능한 인트론의 하나의 예는 FAD3 인트론 #5이다.
센스-방향 비-코딩 분자들은 DNA의 스페이서 단편에 의하여 상응하는 안티센스-방향 분자들로부터 선택적으로 분리될 수 있다. 상기 스페이서 단편은 유전자 단편 또는 인공 DNA일 수 있다. 상기 스페이서 단편은 헤어핀 dsRNA를 형성하는 것을 촉진하기 위하여 짧아지거나, 헤어핀 구조 없는 dsRNA를 촉진하기 위하여 길어질 수 있다. 상기 스페이서는 미국 특허출원 제2005/0176670호 A1에 설명된 것과 같은 센스 또는 안티센스 분자 중의 하나의 길이를 연장함으로써 제공될 수 있다. 또는, 우측 경계-우측 경계("RB-RB") 서열은 미국 특허출원 제2005/0183170호에서 설명된 바와 같은 식물 게놈 내로 삽입된 후 만들어질 수 있다.
도 1에 나타난 바와 같이, 핵산 분자는 두 개의 T-DNA 지역들을 포함하고, 이들의 각각은 우측 경계 및 좌측 경계에 의해 접할 수 있다. 제1의 T-DNA 지역은 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1의 DNA 서열들을 포함하고, 상기 제1의 T-DNA 지역은 제1의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제1의 프로모터 및 제2의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2의 프로모터를 포함하는 제2세트의 DNA 서열들의 제1의 부분을 더 포함한다. 제2의 T-DNA 지역은 제3의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제3의 프로모터를 포함하는 제2세트의 DNA 서열들의 제2의 부분을 포함한다. 도 2에 설명된 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 핵산 분자는 우측 경계 및 좌측 경계에 의해 접한 단일 T-DNA 지역을 포함한다. 제1세트 및 제2세트의 DNA 서열들은 단일 T-DNA 지역상에 모두 위치한다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같은 dsRNA 발현의 구체예에 있어서, 서열의 순서는 예시되고 설명된 것으로부터 변경될 수 있으나, 바람직하게는 비-코딩 서열들 및 안티센스 서열들은, 발현될 때, 제1의 비-코딩 서열은 제1의 안티센스 서열과 혼성화될 수 있고, 제2의 비-코딩 서열은 제2의 안티센스 서열과 혼성화될 수 있고, 그리고 제3의 비-코딩 서열은 제3의 안티센스 서열과 혼성화될 수 있어서 단일 dsRNA 분자가 형성될 수 있도록 스페이서 서열 주위에 배치된다. 바람직하게는, 프로모터에 대하여 비-코딩 서열들은 센스 방향이고, 안티센스 서열들은 안티센스 방향이다. 또한, 비-코딩 서열들, 안티센스 서열들 및 코딩 서열들의 수 및 T-DNA 지역(들)상에서 이들의 여러 상대적 위치들은 본 발명의 목적을 달성하기에 적당한 어떠한 방식으로도 변경될 수 있다.
도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, 예시된 핵산 분자는 제1세트 및 제2세트의 DNA 서열들이 위치하는, 우측 경계 및 좌측 경계에서 접하는 T-DNA 지역을 포함한 제1세트의 DNA 서열들은 프로모터 및 전사 종결 신호에 작동가능하게 연결된다. 제2세트의 DNA 서열들은 제1의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제1의 프로모터, 제2의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2의 프로모터 및 제3의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제3의 프로모터를 포함한다. 전사 종결 신호는 식물에서 기능하는 어떤 전사 종결 신호 또는 어떤 식물 전사 종결 신호일 수 있다. 제한되지는 않지만, 바람직한 전사 종결 신호들은 완두콩(pea) 루비스코 E9 3' 서열, 브라시카(Brassica) 나핀 3' 서열, tml 3' 서열 및 nos 3' 서열을 포함한다.
도 3에 도시된 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되거나, 그것으로부터 유래된 하나 이상의 단백질 또는 전사체의 발현을 억제할 수 있는 센스 동시억제 구조물을 형성할 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들은 3개의 비-코딩 서열들을 포함하고, 이들의 각각은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 비-코딩 지역(들)에 충분한 동일성을 나타낸는 RNA 서열(도시되지는 않음)을 발현한다. 각각의 비-코딩 서열들은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 비-코딩 지역(들)에 적어도 90%의 동일성을 나타내는 RNA 서열을 발현한다. 제1세트의 DNA 서열들 내의 비-코딩 서열들의 순서는 본 발명에서 예시되고 설명된 것으로부터 변경될 수 있으나, 상기 비-코딩 서열들은 프로모터에 대하여 센스 방향으로 배열된다.
도 4의 구체예에 있어서, 제1세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, FAD2, FAD3 및 FATB로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되거나, 그것으로부터 유래된 하나 이상의 단백질들 또는 전사체들의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 구조물을 형성할 수 있다. 제1세트의 DNA 서열들은 3개의 안티센스 서열들을 포함하고, 이들의 각각은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 비-코딩 지역(들)과 동일성을 나타내는 안티센스 RNA 서열(도시되지는 않음)을 발현한다. 각각의 안티센스 서열들은 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 비-코딩 지역(들)과 적어도 90%의 동일성을 나타내는 안티센스 RNA 서열을 발현한다. 제1세트의 DNA 서열들 내의 안티센스 서열들의 순서는 본 발명에서 예시되고 설명된 것으로부터 변경될 수 있으나, 상기 안티센스 서열들은 프로모터에 대하여 안티센스 방향으로 배열된다.
상기 설명된 핵산 분자들은 본 발명의 목적, 특징 및 이점을 달성하기 위한 바람직한 구체예들이다. 본 발명은 상기 예시된 구체예들로 제한되는 것으로 이해되지 않아야 한다. 핵산 분자 내의 제1세트 및 제2세트의 DNA 서열들의 서열 배치는 설명된 것들에 한정되지 않으며, 본 발명에서 설명되고, 도면에서 예시된 바와 같이 본 발명의 목적, 특징 및 이점을 달성하기 위하여 적절한 어떠한 방식으로도 변경될 수 있다.
E. 형절전환 생물들 및 이들을 생산하는 방법
본 발명의 어떤 핵산 분자들 및 구조물들은 영구적으로 또는 일시적으로 식물 또는 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자들 및 구조물들은 발명의 상세한 설명의 파트 A 내지 D 및 실시예들에서 설명된다. 본 발명의 다른 구체예는 적절한 식물 또는 식물 세포를 선별하고, 상기 식물 또는 식물 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키고, 그리고 형질전환된 숙주 세포를 얻는 단계들을 일반적으로 포함하는, 형질전환 식물들을 생산하는 방법을 제시한다.
바람직한 구체예에 있어서, 식물 또는 세포는 식용 및 산업적 용도를 위한 식물성 오일들의 생산에 관련된 식물이거나, 그 식물로부터 유래된 것이다. 온대성 오일종자 작물들이 특히 바람직하다. 바람직한 식물들로는, 제한되지는 않지만, 평지씨(rapeseed) (캐놀라 및 고 에루크산 변종), 옥수수(maize), 대두(soybean), 크램비(crambe), 겨자(mustard), 피마자(castor bean), 땅콩(peanut), 참깨(sesame), 목화(cotton), 아마씨(linseed), 홍화(safflower), 팜유(oil palm), 플락스(flax), 해바라기(sunflower) 및 코코넛(coconut)을 포함한다. 본 발명은 단자엽성 또는 쌍자엽성 종 등에 적용할 수 있고, 신규 및/또는 개량된 형질전환 및 조절 기술들에 쉽게 적용할 수 있을 것이다.
DNA를 식물 세포 내로 도입하는 방법 및 기술은 당업자에 공지되어 있으며, 실질적으로 핵산 분자들이 세포 내로 도입될 수 있는 어떤 방법이라도 본 발명에 사용되기에 적합하다. 제한되지는 않지만, 적절한 방법들의 예는, 화학적 방법들; 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation), 유전자 총(gene gun), 미세투사 충격(microprojectile bombardment) 및 진공흡입(vacuum infiltration)과 같은 물리적 방법들; 바이러스성 벡터들; 및 수용체-매개 메카니즘을 포함한다. 또한, 세포 형질전환의 다른 방법들이 사용될 수 있으며, 제한되지는 않지만, 꽃가루 내로 직접적인 DNA 전달에 의하여, 식물의 생식기관 내로 DNA의 직접적인 주입에 의하여, 또는 미성숙 배아 세포 내로 DNA의 직접적 주입 후, 탈수된 배아의 재수화에 의하여 식물 내로 DNA를 도입하는 방법을 포함한다.
아그로박테리움-매개 전달은 식물 세포 내로 유전자들을 도입하기 위해 광범위하게 적용되는 시스템이다. 예를 들어, Fraley 등, Bio/Technology 3:629~635 (1985); Rogers 등, Methods Enzymol. 153:253~277 (1987) 참고. 전달되는 DNA의 지역은 경계 서열들에 의하여 규정될 수 있고, 개재(intervening) DNA가 식물 게놈 내로 일반적으로 삽입된다. Spielmann 등, Mol. Gen. Genet. 205:34 (1986) 참고. 현재의 아그로박테리움 형질전환 벡터들은 아그로박테리움뿐만 아니라 대장균에서 복제될 수 있으므로 편리한 조작이 가능하다. Klee 등, Plant DNA Infectious Agents, Hohn과 Schell (eds.), Springer-Verlag, New York, pp. 179~203 (1985).
단일 식물 원형질 형질전환체로부터 또는 여러 형질전환된 이식편(explant)으로부터의 식물의 재생, 발달 및 재배는 당업자에 공지되어 있다. 일반적으로 Maliga 등, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Weissbach와 Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988) 참고. 본 발명의 식물들은 육종 프로그램의 일부분이거나 또는 이로부터 생산될 수 있으며, 또한 아포믹시스(apomixis)를 사용하여 재생될 수 있다. 아포믹시스 식물의 생산 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 제5,811,636호 참고.
바람직한 구체예에 있어서, 발현될 때, FAD2, FAD3 및/또는 FATB 단백질 또는 FAD2, FAD3 및/또는 FATB 전사체의 수준을 선택적으로 감소시킬 수 있는 핵산 서열들을 포함하는 본 발명의 식물은, 발현될 때, 다른 효소를 과발현할 수 있는 핵산 서열들을 포함하는 본 발명의 다른 식물과 교배된다. 바람직하게는, 상기 다른 효소는 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ, Δ-9 탈포화효소 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명의 식물은 형질전환성 또는 비-형질전환성인 다른 식물과 교배될 수 있다. 본 발명의 식물은, 변경된 지방산 수준을 포함하는 오일 조성을 갖는 다른 식물, 예를 들어, 제한되지는 않지만, 더 낮은 수준의 리놀렌산을 갖는 오일 조성을 가지는 변종 식물과 교배될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 식물은 3중량% 미만의 리놀렌산을 갖는 변종과 교배될 수 있으며, 또는 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 식물은 20중량% 이상의 스테아르산을 갖는 다른 식물과 교배될 수 있다. 변경된 수준의 지방산을 갖는 그러한 식물들은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Hawkins와 Kridl (1998) Plant Journal 13(6):743~752 및 미국 특허번호 제6,365,802호에 설명되어 있다.
F. 본 발명의 생산물들
본 발명의 식물들은 전체 또는 부분으로서 사용될 수 있다. 바람직한 식물 부분들은 생식 부분 또는 저장 부분들을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 "식물 부분들"은, 제한되지는 않지만, 종자, 배유(endosperm), 밑씨(ovule), 꽃가루(pollen), 뿌리, 덩이줄기, 줄기, 잎, 잎자루, 과실, 베리, 너트, 바크, 포드, 종자 및 꽃을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 식물 부분은 종자이다.
본 발명의 어떤 식물들 또는 이들의 어떤 부분들은 먹이, 음식, 단백질 또는 오일 제제를 생산하기 위하여 가공될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 식물은 본 발명의 지방산 조성을 갖는 오일을 가질 수 있다. 이러한 목적을 위한 특히 바람직한 식물 부분은 종자이다. 바람직한 구체예에 있어서, 먹이, 음식, 단백질 또는 오일 제제는 가축, 물고기 또는 인간, 또는 이들의 모두를 위한 것으로 설계될 수 있다. 먹이, 음식, 단백질 및 오일 제제를 생산하는 방법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 제4,957,748호, 제5,100,679호, 제5,219,596호, 제5,936,069호, 제6,005,076호, 제6,146,669호 및 제6,156,227호 참고. 바람직한 구체예에 있어서, 단백질 제제는 고 단백질 제제이다. 이러한 고 단백질 제제는 바람직하게는 5%w/v 이상, 보다 바람직하게는 10%w/v 이상, 및 가장 바람직하게는 15%w/v 이상의 단백질 함량을 갖는다.
바람직한 오일 제제에 있어서, 오일 제제는 5%w/v 이상, 보다 바람직하게는 10%w/v 이상, 및 가장 바람직하게는 15%w/v 이상의 본 발명의 식물 또는 이들의 부분으로부터 유래된 오일 함량을 갖는 고 오일 제제이다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 오일 제제는 액체이고, 1, 5, 10 또는 50리터 이상의 부피이다. 본 발명은 본 발명의 식물로부터 생산되거나, 또는 본 발명의 방법에 의하여 생산된 오일을 제공한다. 이러한 오일은 향상된 산화적 안정성을 갖는다. 또한, 이러한 오일은 어떤 결과 생산물의 소량 성분 또는 주요 성분일 수 있다.
더구나, 이러한 오일은 다른 오일과 블렌드될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 식물로부터 생산되거나, 또는 본 발명의 방법으로부터 생산된 오일은 어떤 생산물의 오일 성분의 부피 또는 중량기준으로 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 90% 이상을 구성한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 오일 제제는 블렌드될 수 있으며, 부피기준으로 10%, 25%, 35%, 50% 또는 75% 이상을 구성할 수 있다. 본 발명의 식물로부터 생산된 오일은 하나 이상의 유기 용매 또는 석유 증류액과 혼합될 수 있다.
본 발명의 식물의 종자들은 컨테이너에 보관될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 컨테이너는 그러한 종자들을 유지할 수 있는 어떤 물체이다. 바람직하게는, 컨테이너는 약 500개 이상, 1,000개, 5,000개 또는 25,000개 종자를 포함하며, 적어도 약 10% 이상, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 종자는 본 발명의 식물로부터 유래된다. 또한, 본 발명은 약 10,000개 이상, 보다 바람직하게는 약 20,000개 및 보다 더 바람직하게는 약 40,000개의 종자들이 담긴 컨테이너를 제공하고, 상기 종자들의 약 10% 이상, 보다 바람직하게는 약 25%, 보다 더 바람직하게는 50% 및 가장 바람직하게는 약 75% 또는 90%의 종자가 본 발명의 식물로부터 유래된 종자이다. 또한, 본 발명은 약 10kg 이상, 보다 바람직하게는 약 25kg, 및 보다 더 바람직하게는 약 50kg의 종자들이 담긴 컨테이너를 제공하고, 상기 종자들의 약 10% 이상, 보다 바람직하게는 약 25%, 보다 더 바람직하게는 약 50% 및 가장 바람직하게는 약 75% 또는 90%의 종자가 본 발명의 식물로부터 유래된 종자이다.
G. 오일 조성
다양한 오일 적용을 위하여, 포화 지방산 수준은 바람직하게는 8중량% 미만이고, 보다 바람직하게는 약 2~3중량%이다. 포화 지방산들은, 다양한 적용에서 바람직하지 않은 고 융점을 갖는다. 가축 먹이나 연료로 사용될 때, 포화 지방산들은 저온에서 클라우딩(clouding)을 야기시키고, 연료에 유동점(pour points) 및 저온 필터 막힘점(cold filter plugging points)과 같은 열등한 냉각유동 특성(cold flow properties)을 부여한다. 저 포화 지방산 수준을 포함하는 오일 생산물들은, 보다 건강에 도움이 되고 그리고/또는 FDA 가이드라인에 따라 "포화 지방 프리"로 표시될 수 있으므로, 소비자들 및 식품산업에 바람직한 것으로 될 수 있다. 추가적으로, 저 포화 오일들은 샐러드 오일과 같은 식품 용도를 위하여 오일을 윈터라이징(winterize)할 필요성을 감소 또는 제거시킨다. 바이오디젤 및 윤활제로의 적용에 있어서, 저 포화 지방산 수준을 갖는 오일들은 향상된 냉간유동 특성을 부여하고, 저온에서 클라우딩을 형성하지 않는다.
특정 오일의 물리적 특성을 통제하는 인자들은 복잡하다. 팔미트산, 스테아르산 및 다른 포화 지방산들은, 불포화 지방산들이 액체로 존재하는 것과 반대로 실온에서 전형적으로 고체이다. 포화 지방산들은 아실 사슬에 이중 결합을 갖지 않으므로, 이들은 증가된 온도에서 산화에 안정하게 남아있다. 포화 지방산들은 마아가린 및 초콜릿 제제에 중요한 성분이지만, 다양한 식품에 적용시키기 위하여, 포화 지방산들의 감소된 수준이 요구된다.
올레산은 하나의 이중 결합을 갖지만, 여전히 고온에서 비교적 안정하고, 고 수준의 올레산을 갖는 오일은 요리 및 가열이 요구되는 다른 공정에 적합하다. 최근에, 고 올레산 오일의 소비 증가가 추천되는데, 이는 올레산이 고밀도 지단백("HDL")의 수준에 영향을 주지 않으면서, 저밀도 지단백("LDL")의 혈액 수준을 낮추는 것으로 나타났기 때문이다. 그러나, 올레산 수준의 어떤 제한이 요구되는데, 이는 올레산이 고온에서 분해되어, 나쁜 풍미를 내는 물질들을 생성하고, 리놀렌산의 산화에 의하여 생성되는 우수한 풍미를 감소시키기 때문이다. Neff 등, JAOCS, 11:1303~1313 (2000); Warner 등, J. Agric. Food Chem. 49:899~905 (2001) 참고. 바람직한 오일들은 튀김용 오일 및 튀김 식품과 같은 식품 적용에서 나쁜 풍미를 제한하기 위하여, 65~85중량% 미만의 올레산을 갖는다. 다른 바람직한 오일들은 산화적 안정성을 개선시키기 위하여, 55중량% 이상의 올레산 수준을 갖는다.
리놀레산은 식품에서 주된 다중불포화 지방산이고, 인간에 필수적 영양성분이다. 그것은 튀김 식품 맛을 우수하게 하는, 2,4-데카디에날과 같은 튀김 음식 풍미 물질들의 주된 전구체이므로, 다양한 식품 용도를 위하여 요구되는 성분이다. 그러나, 리놀레산은 가열되었을 때 제한된 안정성을 갖는다. 바람직한 식품 오일들은, 원하는 튀김 식품 풍미 물질의 형성을 향상시키기 위하여 10중량% 이상의 리놀레산을 갖고, 또한 나쁜 풍미의 형성을 감소시키기 위하여 25중량% 이하의 리놀레산을 갖는다. 또한, 리놀레산은, 비록 과다 섭취가 인간 세포들이 산화적 손상으로부터 그들 스스로를 방어하는 능력을 감소시켜서, 심혈관 질환의 위험을 증가시킬 수 있을지라도, 콜레스테롤-저감 특성을 가진다. Toborek 등, Am J. Clin. J. 75: 119~125 (2002) 참고. 일반적으로 Flavor Chemistry of Lipid Foods, editors D.B. Min & T.H. Smouse, Am Oil Chem. Soc, Champaign, IL (1989) 참고.
올레산보다 저 융점을 갖는 리놀레산은 바이오디젤 및 바이오윤활제 용도에서 원하는 냉간유동 특성을 향상시키는데 더 공헌한다. 최상의 적용을 위한 바람직한 오일들은 30중량% 이하의 리놀레산 수준을 갖는데, 이는 리놀레산의 산화는 튀김용 오일, 식품, 먹이, 연료 및 윤활제 제품의 유용한 저장기간 또는 유통기한을 제한하기 때문이다. 일반적으로, Physical Properties of Fats, Oils, and Emulsifiers, ed. N. Widlak, AOCS Press (1999); Erhan & Asadauskas, Lubricant Basestocks from Vegetable Oils, Industrial Crops and Products, 11:277~282 (2000) 참고. 추가적으로, 소 먹이에 있어서 고 리놀레산 수준은 젖소의 우유에서 원하지 않는 고 수준의 리놀레산 수준을 야기할 수 있으므로, 산화적 안정성과 풍미가 나빠진다. Timmons 등, J. Dairy Sci. 84:2440~2449 (2001) 참고. 광범위하게 사용되는 오일 조성물은 10~25중량%의 리놀레산 수준을 갖는다.
또한, 리놀렌산은 인간 다이어트의 중요한 성분이다. 이것은 그로부터 유래된 ω-3 패밀리의 긴-사슬 지방산 및 프로스타글란딘을 합성하기 위하여 사용된다. 그러나, 그것의 이중 결합들은 산화에 매우 민감하여, 고 수준의 리놀렌산을 갖는 오일들은 공기, 특히 고온에 노출되면 빠르게 나빠진다. 오일이 가열될 때 나쁜 풍미의 형성 및 산패를 지연하기 위하여 그들이 식품에 사용될 수 있기 전에, 이러한 오일들의 부분적인 수소화가 종종 필요하지만, 수소화는 심혈관 질환에 영향을 미칠 수 있는 건강에 해로운 트랜스 지방산을 생성할 수 있다. 개선된 산화적 안정성을 달성하고, 오일을 수소화시키는 필요성의 감소를 위하여, 바람직한 오일은 본 발명의 오일 내의 총 지방산의 중량으로 8% 미만, 6% 미만, 4% 미만, 약 3% 미만 및 보다 바람직하게는 약 0.5~2%의 리놀렌산 수준을 갖는다.
또한, 본 발명의 대두로부터의 오일은 블렌드된 오일 제품을 제조하기 위하여 블렌딩 원료(source)로 사용될 수 있다. 블렌딩 원료에 대하여, 본 발명의 대두로부터의 오일은 다른 오일의 지방산 조성, 풍미 및 산화적 안정성과 같은 특성을 개선시키기 위하여 다른 식물성 오일과 혼합될 수 있다. 사용될 수 있는 본 발명의 대두로부터의 오일의 양은 결과의 최종 블렌드 오일 제품에서 얻고자 하는 원하는 특성들에 따라 달라질 것이다. 제한되지는 않지만, 블렌드된 오일 제품들의 예는 마아가린, 쑈트닝, 튀김용 오일, 샐러드 오일 등을 포함한다. 본 발명의 대두로부터의 오일은 블렌드 오일, 합성 오일 또는 바람직한 구체예에 있어서, 적절한 오일 조성을 갖는 오일 종자로부터 생성된 오일일 수 있다. 오일 종자로부터 직접 생산된 오일은 비-블렌드 오일이다. 다른 측면에 있어서, 오일은 성숙한 오일 종자로부터 직접 얻는다. 이러한 측면에 있어서, 성숙한 종자는 사료용으로 판매되는 것과 같은, 상업적 농업 분야에서 수확된 종자로 정의된다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 오일은 대두 오일이다. 상기 오일은 조 대두 오일과 같은 조생의 오일일 수 있고, 예를 들어, 상기 오일은 정제, 표백, 탈취 및/또는 윈터라이징될 수 있는 가공된 오일일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, "정제"는 불순물을 제거하기 위하여 천연 또는 가공된 지방 또는 오일을 처리하는 공정을 나타내고, 지방 또는 오일을 가성 소다로 처리한 후, 원심분리, 물 세척 및 진공하에서 가열하여 수행될 수 있다. "표백"은 지방 또는 오일 내의 색을 내는 물질의 수준을 제거 또는 감소시키기 위하여 지방 또는 오일을 처리하는 공정을 나타낸다. 탈색은 지방 또는 오일을 활성탄 또는 백토(규조토)로 처리하므로써 수행될 수 있다. "탈취"는 최종 생산물에 나쁜 풍미 또는 냄새를 나게하는 성분을 지방 또는 오일로부터 제거하는 공정을 나타내며, 고 진공 및 고온의 스팀 세척의 사용으로 수행될 수 있다. "윈터라이징(winterizing)"은 오일로부터 포화 글리세리드를 제거하는 공정을 나타내고, 칠링(chilling) 및 오일로부터 지방의 고형 부분을 제거하므로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 오일은 저 포화 오일 조성 또는 제로 포화 오일 조성을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 증가된 올레산 수준, 감소된 포화 지방산 수준 및 감소된 다중불포화 지방산 수준을 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 증가된 올레산 수준 및 감소된 포화 지방산 수준을 갖는다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 오일은 대두 오일이다. 본 발명에서 사용된 지방산 함량 또는 지방산 수준의 백분율은 중량%를 의미한다.
제1의 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 바람직하게는 55 내지 80%의 올레산, 약 12 내지 43%의 다중불포화 지방산 및 2 내지 8%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 더욱 바람직하게는 55 내지 80%의 올레산, 약 14 내지 42%의 다중불포화 지방산 및 3 내지 6%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 그리고, 보다 더 바람직하게는 55 내지 80%의 올레산, 약 16.5 내지 43%의 다중불포화 지방산 및 2 내지 3.6%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖는다.
제2의 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 바람직하게는 65 내지 80%의 올레산, 약 12 내지 33%의 다중불포화 지방산 및 2 내지 8%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 더욱 바람직하게는 65 내지 80%의 올레산, 약 14 내지 32%의 다중불포화 지방산 및 3 내지 6%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 그리고, 보다 더 바람직하게는 65 내지 80%의 올레산, 약 16.5 내지 33%의 다중불포화 지방산 및 2 내지 3.6%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖는다.
제3의 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 바람직하게는 약 42 내지 약 85%의 올레산 및 약 8 내지 약 1.5%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 보다 바람직하게는 총 오일 조성의 중량으로 약 65% 내지 약 95%에 상당하는 올레산 및 리놀렌산의 합계량을 갖는 오일 조성을 갖는다. 본 발명의 보다 더 바람직한 오일 조성은 총 오일 조성의 중량으로 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 85%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%에 상당하는 올레산 및 리놀렌산의 합계량을 갖는다.
제4의 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 중량으로 약 42 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 약 6% 내지 약 15%의 리놀렌산의 오일 조성을 갖고; 보다 바람직하게는 중량으로 약 42 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 35% 미만의 리놀렌산의 오일 조성을 갖고; 그리고, 보다 더 바람직하게는 중량으로 약 42 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 약 9%의 리놀렌산의 오일 조성을 갖는다.
제5의 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 중량으로 약 50% 내지 약 85%의 올레산 및 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖고; 보다 바람직하게는 중량으로 약 50% 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 약 4% 내지 약 14%의 리놀렌산의 오일 조성을 갖고; 보다 더 바람직하게는 중량으로 약 50% 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 35% 미만의 리놀렌산의 오일 조성을 갖고; 그리고, 더욱 더 바람직하게는 중량으로 약 42 내지 약 85%의 올레산, 약 8% 내지 약 1.5%의 포화 지방산, 약 2% 내지 약 45%의 리놀렌산의 오일 조성을 갖는다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 약 65~80%의 올레산, 약 3~8%의 포화 지방산, 및 약 12~32%의 다중불포화 지방산의 오일 조성을 갖는다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 약 65~80%의 올레산, 약 2~3.5%의 포화 지방산, 및 약 16.5~33%의 다중불포화 지방산의 오일 조성을 갖는다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 오일은 약 47~83%의 올레산 및 약 5%의 포화 지방산; 약 60~80%의 올레산 및 약 5%의 포화 지방산; 약 50~85%의 올레산 및 약 2~7%의 포화 지방산; 약 55~85%의 올레산 및 약 2.5~7%의 포화 지방산; 약 47~88%의 올레산 및 약 3~7%의 포화 지방산; 약 43~85%의 올레산 및 약 5~7%의 포화 지방산; 약 81~85%의 올레산 및 약 5%의 포화 지방산; 약 74~83%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 65~87%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 66~80%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 42~77%의 올레산 및 약 5~8%의 포화 지방산; 약 60~77%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 70~ 81%의 올레산 및 약 5~7%의 포화 지방산; 약 52~71%의 올레산 및 약 5~7%의 포화 지방산; 약 44~71%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 61~71%의 올레산 및 약 8%의 포화 지방산; 약 57~71%의 올레산 및 약 7%의 포화 지방산; 약 23~58%의 올레산 및 약 8~14%의 포화 지방산; 약 20~70%의 올레산 및 약 6%의 포화 지방산; 약 21~35%의 올레산 및 약 5~6%의 포화 지방산; 또는 약 19~28%의 올레산 및 약 5%의 포화 지방산의 오일 조성을 갖는다.
다른 구체예에 있어서, 올레산의 백분율 함량은 50% 이상; 55% 이상; 60% 이상; 65% 이상; 70% 이상; 75% 이상; 또는 80% 이상이거나; 또는 50 내지 80%; 55 내지 80%; 55 내지 75%; 55 내지 65%; 60 내지 85%; 60 내지 80%; 60 내지 75%; 60 내지 70%; 65 내지 85%; 65 내지 80%; 65 내지 75%; 65 내지 70%; 또는 69 내지 73%의 범위이다. 또한, 본 발명의 오일 내의 올레산 함량의 적절한 백분율 범위는 하한이 다음의 백분율로부터 선택되고: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80%; 그리고, 상한이 다음의 백분율로부터 선택되는 범위를 포함한다: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 또는 90%.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 내의 리놀레산의 백분율은 10 내지 40%; 10 내지 39%; 10 내지 30%; 10 내지 29%; 10 내지 28%; 10 내지 25%; 10 내지 21%; 10 내지 20%; 11 내지 30%; 12 내지 30%; 15 내지 25%; 20 내지 25%; 20 내지 30%; 또는 21 내지 24%의 범위이다. 또한, 본 발명의 오일 내의 리놀레산 함량의 적절한 백분율 범위는 하한이 다음의 백분율로부터 선택되고: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30%; 그리고, 상한이 다음의 백분율로부터 선택되는 범위를 포함한다: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40%.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 내의 리놀렌산의 백분율은 10% 이하; 9% 이하; 8% 이하; 7% 이하; 6% 이하; 5% 이하; 4.5% 이하; 4% 이하; 3.5% 이하; 3% 이하; 3.0% 이하; 2.5% 이하; 또는 2% 이하이거나; 또는, 0.5 내지 2%; 0.5 내지 3%; 0.5 내지 4.5%; 0.5% 내지 6%; 3 내지 5%; 3 내지 6%; 3 내지 8%; 1 내지 2%; 1 내지 3%; 또는 1 내지 4%의 범위이다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 조성 내의 포화 지방산의 백분율은 15% 이하; 14% 이하; 13% 이하; 12% 이하, 11% 이하; 10% 이하; 9% 이하; 8% 이하; 7% 이하; 6% 이하; 5% 이하; 4% 이하; 또는 3.6% 이하이거나; 또는, 2 내지 3%; 2 내지 3.6%; 2 내지 4%; 2 내지 8%; 3 내지 15%; 3 내지 10%; 3 내지 8%; 3 내지 6%; 3.6 내지 7%; 5 내지 8%; 7 내지 10%; 또는 10 내지 15% 범위이다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 내의 포화 지방산은 팔미트산 및 스테아르산의 조합을 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, 포화 지방산의 백분율은 약 10% 이하; 약 9% 이하; 약 8% 이하; 약 7% 이하; 약 6% 이하; 약 5% 이하; 약 4.5% 이하; 약 4% 이하; 약 3.5% 이하; 약 3% 이하; 약 3.0% 이하; 약 2.5% 이하; 또는 약 2% 이하이거나; 또는, 0.5 내지 2%; 0.5 내지 3%; 0.5 내지 4.5%; 0.5 내지 6%; 0.5 내지 7%; 0.5 내지 8%; 0.5 내지 9%; 1 내지 4%; 1 내지 5%; 1 내지 6%; 1 내지 7%; 1 내지 8%; 1 내지 9%; 1.5 내지 5%; 1.5 내지 6%; 1.5 내지 7%; 1.5 내지 8%; 1.5 내지 9%; 2 내지 5%; 2 내지 6%; 2 내지 7%; 2 내지 8%; 2 내지 9%; 3 내지 5%; 3 내지 6%; 3 내지 7%; 3 내지 8%; 3 내지 9%; 4 내지 7%; 4 내지 8%; 4 내지 9%; 5 내지 7%; 5 내지 8%; 및 5 내지 9%의 범위이다. 이러한 구체예에 있어서, 또한, 본 발명의 오일 내의 포화 지방산 함량의 적절한 백분율 범위는 하한이 다음의 백분율로부터 선택되고: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 또는 6.5%; 그리고, 상한이 다음의 백분율로부터 선택되는 범위를 포함한다: 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 또는 0.5%.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 조성 내의 팔미트산의 백분율은 6% 이하; 5% 이하; 4.5% 이하; 4% 이하; 3.5% 이하; 3% 이하; 3.0% 이하; 2.5% 이하; 또는 2% 이하의 범위이거나; 또는, 0.5 내지 2%; 0.5 내지 3%; 0.5 내지 4.5%; 0.5 내지 6%; 1 내지 3%; 1 내지 4%; 1 내지 5%; 1 내지 6%; 1.5 내지 2%; 1.5 내지 3%; 1.5 내지 4%; 1.5 내지 4.5%; 1.5 내지 5%; 1.5 내지 5.5%; 1.5 내지 6%; 1.5 내지 6.5%; 1.5 내지 7%; 2 내지 3%; 2 내지 3.5%; 2 내지 4%; 2 내지 4.5%; 2 내지 5%; 2 내지 6%; 2 내지 7%; 2 내지 8%; 3 내지 5%; 3 내지 6%; 3 내지 7%; 3 내지 8%; 3 내지 9%의 범위이다. 이러한 구체예에 있어서, 또한, 본 발명의 오일 내의 리놀레산 함량의 적절한 백분율 범위는 하한이 다음의 백분율로부터 선택되고: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 또는 7.5%; 그리고, 상한이 다음의 백분율로부터 선택되는 범위를 포함한다: 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2%.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 오일 조성 내의 스테아르산의 백분율은 3% 이하; 3.0% 이하; 2.5% 이하; 또는 2% 이하이거나; 또는, 0.5 내지 1%; 0.5 내지 1.5%; 0.5 내지 2%; 0.5 내지 2.5%; 0.5 내지 3%; 0.5 내지 4%; 1 내지 2%; 1 내지 3%; 1 내지 4%; 1.5 내지 2%; 1.5 내지 3%; 또는 1.5 내지 4%의 범위이다. 이러한 구체예에 있어서, 또한, 본 발명의 오일 내의 리놀레산 함량의 적절한 백분율 범위는 하한이 다음의 백분율로부터 선택되고: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 또는 3.5%; 그리고, 상한이 다음의 백분율로부터 선택된다: 3.5, 3, 2.5, 2, 또는 1.5%.
본 발명의 오일은 쿠킹 오일 또는 튀김용 오일로 사용하는데 특히 적합하다. 그것의 감소된 다중불포화 지방산 함량으로 인하여, 본 발명의 오일은 전형적인 오일의 복잡한 가공공정을 요하지 않는데, 이는 더 적은 이취 화합물 및 착색 화합물이 존재하기 때문이다. 추가적으로, 본 발명의 오일의 저 포화 지방산 함량은 오일의 냉간유동 특성을 개선시키고, 결정화 또는 고형화를 막기 위하여 저장된 오일을 가열할 필요성을 미리 차단할 수 있다. 또한, 향상된 냉간유동성은 튀김용 오일로부터 튀겨진 음식물을 제거할 때, 튀겨진 음식물로부터 오일의 배출을 향상시켜, 저 지방 생산물을 얻을 수 있다. Bouchon 등, J. Food Science 66: 918~923 (2001) 참고. 본 발명의 오일의 리놀렌산의 저 수준은 특히 나쁜 풍미를 제거하기 위한 튀김에 유익하다.
또한, 본 발명의 오일은 샐러드 오일(40~50℉의 냉장 온도에서 투명성을 유지하는 오일)로서 사용되기에 아주 적합하다. 저 포화 지방산 또는 중간 정도의 리놀레산 함량에 기인한, 냉장 온도에서의 향상된 투명성은 샐러드 오일로 사용되기 전에 오일을 윈터라이징할 필요성을 감소 또는 제거시킨다.
추가적으로, 본 발명의 오일의 중간 정도의 리놀레산 함량 및 저 리놀렌산 함량은 쇼트닝, 마아가린 및 식료품에 사용되는 반-고형 식물성 지방의 생산에 특히 적당하다. 이러한 지방들의 생산은 전형적으로 대두 오일, 옥수수 오일, 또는 캐놀라 오일과 같은 불포화 오일의 수소화를 포함한다. 본 발명의 오일의 증가된 산화적 안정성 및 풍미 안정성은 전형적인 식물성 오일이 마아가린 및 쑈트닝으로 사용되기 위한 정도로 수소화될 필요가 없다는 것을 의미하므로, 가공 비용 및 건강에 해로운 트랜스 아이소머의 생성을 감소시킨다.
또한, 본 발명의 오일은 바이오디젤을 생산하기 위한 재료로서 사용하기에 적합한데, 특히, 이러한 오일로부터 제조된 바이오디젤은 개선된 냉간유동 특성, 개선된 점화능(세탄가(cetane number)), 개선된 산화적 안정성 및 감소된 산화질소 방출을 갖는다. 바이오디젤은 포화, 단일불포화 및 다중불포화 C16~C22 지방산의 메틸 에스테르를 전형적으로 포함하는 대체 디젤 연료이다. 세탄가는 점화능의 측정치이며, 엔진내의 연료의 점화 지연 시간이 짧을수록 더 큰 세탄가를 나타낸다. 바이오디젤 연료에 대한 ASTM 표준 규격(D 6751-02)은 47의 최소 세탄가를 요구한다.
통상의 디젤 엔진에서의 바이오디젤의 사용은 설페이트, 일산화탄소와 같은 대기 오염원의 실질적인 감소로 결과되고, 그리고, 특히 석유 디젤 연료와 비교하여, 학교버스에 사용시 독성 디젤 배기물질에의 어린이의 노출을 크게 감소시킬 수 있다. 연료로서 종래의 바이오디젤을 100% 사용하는 경우의 문제점은, 2번 디젤(-16℃)과 비교하여, 종래의 콩 바이오디젤(2℃)의 고 클라우드점(cloud point)이다. Dunn 등, Recent. Res. Devel. in Oil Chem., 1:31~56 (1997) 참고. 본 발명의 오일로부터 제조된 바이오디젤은 개선된 (감소된) 클라우드점 및 저온 필터 막힘점을 가지며, 또한, 동물성 지방(탈로우(tallow), 라드, 닭 지방) 및 팜유와 같은 저가의, 고 포화 원료로부터 제조된 바이오디젤의 저온 특성을 향상시키기 위하여 블렌드되어 사용될 수 있다. 또한, 바이오디젤은 어떤 수준으로 석유 디젤과 블렌드될 수 있다.
바이오디젤은 전형적으로 유리 지방 및 인지질을 제거시키기 위하여 대두 오일을 추출, 여과 및 정제하고, 다음으로 지방산의 메틸 에스테르를 형성하기 위하여 메탄올로 상기 오일을 트랜스에스테르화시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 제 5,891,203호 참고. 결과의 콩 메틸 에스테르는 일반적으로 "바이오디젤"로 언급된다. 또한, 본 발명의 오일은 예를 들어, 아세탈과 오일의 혼합에 의한 것과 같은 메틸 에스테르의 형성 없이 디젤 연료로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 제6,013,114호 참고. 본 발명의 오일은 개선된 냉간유동 특성 및 산화적 안정성에 기인하여, 윤활제로서, 그리고 디젤 연료 첨가제로서 또한 사용된다. 예를 들어, 미국 특허번호 제5,888,947호, 제5,454,842호 및 제4,557,734호 참고.
또한, 본 발명의 대두 및 오일은 두유, 소이 너트 버터(soy nut butter), 나토(natto) 및 템페(tempeh)와 같은 대두 전체로부터 제조된 콩식품, 및 대두 가루, 콩가루(soy flour), 콩 단백질 농축물, 콩 단백질 분리물, 섬유화된 콩 단백질 농축물, 가수분해된 콩 단백질, 윕 토핑(whipped topping), 쿠킹 오일, 샐러드 오일, 쇼트닝 및 레시틴을 포함하는 가공된 대두 및 대두 오일로부터 제조된 다양한 콩식품에 사용되기에 적합하다. 또한, 전체 대두는 식용이고, 전형적으로 소비자에게 날 것, 구운 것 또는 에다마메(edamame)로서 판매된다. 전형적으로 전체 대두를 침지시킨 후 갈아서 제조되는 두유는 스프레이-건조된 형태 또는 콩 요구르트, 콩 치즈, 두부 또는 유바(yuba)를 형성하기 위하여 가공된 형태로 소비될 수 있다. 본 발명의 대두 또는 오일은, 그것의 개선된 산화적 안정성, 나쁜 풍미 전구체의 감소 및 저 포화 지방산 수준으로 인하여 여러 콩 식품에 유익하게 사용될 수 있다.
G. 억제의 조절
본 발명의 다른 구체예는 유전자 억제 수준을 조절하는 방법을 제공한다. 유전자 억제의 조절에 의해 다소간의 유전자 억제가 이루어질 수 있다. 유전자 생산물의 억제는 식물 게놈 내로의 본 발명의 구조물의 삽입에 의해 이루어질 수 있다. 유사하게, 유전자 억제의 조절은 식물 게놈 내로의 본 발명의 구조물의 삽입에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 억제를 조절하기 위한 다른 예시적인 방법은, 제한되지는 않지만, 본 발명의 구조물을 사용한 안티센스 기술, 동시억제, RNA 간섭(dsRNAi), 형질전환 동물, 하이브리드 및 리보자임을 포함한다. 다음의 예들은 예시로서 제공되며, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
유전자의 억제는, 억제를 위하여 사용된 전사 가능한 DNA의 길이를 변화시키므로써 조절될 수 있으며, 그 서열은 억제를 위하여 표적화된 유전자로부터 유래된다. 전사 후 유전자 사일런싱 메커니즘을 사용하여 유전자를 억제하기 위한 여러 방법들이 사용될 수 있다. 이론에 제한됨이 없이, 이러한 방법들은 통상적으로 다른 RNA 분자와 혼성화되는 RNA 분자의 발현을 포함하는 것으로 여겨진다. 놀랍게도, 표적화된 내생적 유전자의 정상 수준의 발현의 억제를 조절 또는 완화하기 위한 특정 길이의 RNA 분자를 사용하는 것이 이점이 있을 수 있다.
FAD2-1의 유전자 억제는 올레산의 증가된 수준 및 리놀레산 수준의 감소를 유도한다. FAD2-1이 매우 억제되었을 때, 올레산의 수준은 65% 이상일 수 있고, 이는 팔미트산 및 리놀렌산 수준의 감소를 야기한다. 예를 들어, FAD2-1이 억제될 때, 올레산 수준은 85%에 도달하고, 팔미트산 및 스테아르산의 합계된 수준은 약 10%까지 감소한다. 유사하게, FATB의 하향 조절은 포화 지방산, 특히 팔미테이트의 감소된 수준을 야기한다. FAD2 및 FATB가 억제되어, 올레산 수준이 약 85%일 때, 포화 지방산 수준은 약 10%이다. FAD2 및 FATB가 억제되어, 올레산 수준이 85% 이상일 때, 포화 지방산 수준은 10% 이하로 떨어질 수 있다.
본 발명의 견지에서, 포화 지방산 수준은 올레산을 85% 이상으로 증가시킴 없이 10% 이하으로 감소시킬 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, FAD2의 억제는 식물 내로 도입된 FAD2-1 인트론의 길이를 감소시키므로써 조절된다. 더 적은 FAD2의 억제는 중간 정도의 올레산 수준, 약 40~85%의 올레산으로 결과된다. 도입된 FAD2-1 인트론 단편의 길이가 감소될수록, FAD2의 억제가 감소된다. 예를 들어, 적어도 100개의 연속적인 뉴클레오티드 길이로 감소된 FAD2-1 인트론은 FAD2의 억제를 감소시킬 수 있고, 상응하는 올레산의 증가 및 리놀레산 수준의 감소를 야기시킨다.
내생적 유전자 억제의 감소 및 상동성 DNA의 길이의 감소 사이의 상관관계는 다른 길이의 DNA들을 도입하므로써 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 상동성 도입 DNA의 길이의 감소에 의하여 얻어질 수 있는 억제의 감소 양은 도입된 상동성 DNA의 결실 부분을 점점 증가시키면서, 표적 유전자의 발현을 검정하므로써 결정될 수 있다.
식물에서 포화 지방산 수준의 강한 감소를 여전히 유지하면서, FAD2의 억제를 조절하는 방법이 본 발명에 포함된다. 이러한 식물에 있어서, 올레산 수준은 40~85%의 범위일 수 있다. 유사하게, 완전한 길이의 FATB 유전자가 숙주 세포 내로 도입되었을 때와 비교하여, 결합된 3' 및 5' 비번역 부위가 도입되었을 때, FATB의 완전한 억제보다 적은 억제가 발생한다. 유사한 방식으로, 엽록체 전이 펩티드를 대부분 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 5' 부분이 숙주 세포 내로 도입되었을 때, FATB의 억제 수준은 감소된다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여 억제된 FAD2 및 FATB를 갖는 세포에서, 포화 지방산 수준은 1 내지 9%로 유지할 수 있으면서, 올레산 수준은 40~85%일 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명은 완전한 유전자, 완전한 엑손, 완전한 인트론, 완전한 신호 서열 또는 완전한 UTR일 수 있는 완전한 유전자 인자로부터 얻어지는 억제에 비하여 억제를 감소시키기 위해 유전자 억제를 조절하고, 상기 유전자 인자로부터의 내생적 유전자의 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자를 구성하고; 숙주 세포 내에서 상기 재조합 핵산 분자의 발현을 개시하고; 그리고, 상기 재조합 핵산 분자로 상기 내생적 유전자를 억제하는 방법과 관련된다. 억제되어질 유전자는 FAD2 및 FATB를 포함하는 어떤 유전자일 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명은, 숙주 세포에서 부분적인 FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열을 발현시키는 단계(여기서, FAD2 또는 FATB 유전자 인자는 숙주 세포 내의 내생적 FAD2 또는 FATB 유전자로부터 유래하고, FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열은 FAD2 또는 FATB 유전자, FAD2 또는 FATB 엑손, FAD2 또는 FATB 인트론, FAD2 또는 FATB 전이 펩티드 코딩 지역, 또는 FAD2 또는 FATB UTR일 수 있고; 그리고, 상기 부분적인 FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열은 완전한 FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열보다 짧다); 및, 상기 부분적 FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열로 내생적 FAD2 또는 FATB을 억제하는 단계(여기서, 숙주 세포 내에서의 FAD2 또는 FATB 내생적 유전자의 억제 수준은 유사한 유전적 기반 및 FAD2 또는 FATB 유전자 인자의 완전한 FAD2 또는 FATB 유전자 인자 서열을 포함하는 제2의 FAD2 또는 FATB 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에서의 FAD2 또는 FATB 내생적 유전자의 억제 수준 보다 적다)를 포함하는, FAD2 또는 FATB 억제를 조절하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은, FAD2, FATB, 또는 FAD2 및 FATB의 내생적 발현을 억제하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계, 여기서 상기 DNA 서열은 유전자, 엑손, 인트론, 전이 펩티드 코딩 지역, 3' UTR, 5' UTR 및 오픈 리딩 프레임으로부터 선택된 완전한 유전적 인자의 완전한 서열보다 짧은 FAD2, FATB, 또는 FAD2 및 FATB의 핵산 서열을 포함한다; 및, 상기 DNA 서열의 전사가 개시되는 조건하에서 상기 식물 세포를 성장시켜, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 핵산 분자를 결한 식물 세포와 비교하여 오일 조성을 변화시키는 단계를 포함하는, 식물세포의 오일 조성을 변화시키는 방법에 관한 것이다. FAD2 또는 FATB의 유전자 인자는 50, 75, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 800, 1000, 2000, 3000, 또는 4000 뉴클레오티드 길이까지 짧아질 수 있다. FAD2 또는 FATB의 유전자 인자의 길이는 50, 75, 100, 150, 175, 200, 220, 250, 300, 320, 350, 400, 420, 450, 500, 550 600, 800, 또는 1000 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 ⅰ) 형질전환된 식물로부터 FAD2 발현의 억제의 양이, 유사한 유전적 기반을 갖고, 완전한 외생적 FAD2 유전자 DNA 서열을 갖는 숙주 세포 내에서의 FAD2 발현의 억제와 비교하여 적어도 부분적으로 감소될 때까지, 숙주 세포 내의 외생적 FAD2 DNA 서열의 길이를 짧게하고; 그리고, ⅱ) FAD2의 내생적 발현을 적어도 부분적으로 억제하는 상기 짧아진 FAD2 DNA 서열을 포함하는 핵산 서열 분자를 갖는 식물을 성장시키고; 그리고, ⅲ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 짧아진 FAD2 DNA 서열을 결한 식물로부터의 종자와 비교하여 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 재배하므로써, 식물 종자내의 올레산 함량을 증가시키고, 포화 지방산 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 내생적 FAD2의 억제를 적어도 부분적으로 감소시키기 위하여 외생적 FAD2 DNA 서열의 짧아지는 정도는, 다른 길이의 DNA들을 도입하므로써 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 도입된 상동성 DNA의 길이를 감소시키므로써 얻어질 수 있는 억제 감소의 양은 도입되는 상동성 DNA의 결실 부분을 점점 증가시키면서, 표적 유전자의 발현을 검정하므로써 결정될 수 있다. FAD2 발현의 억제의 양은 3개 이상, 6개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 식물의 종자들의 평균으로 얻어질 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 FAD2 및 FATB의 내생적 발현을 억제하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환시키고(여기서, 상기 DNA 서열은 유전자, 엑손, 인트론, 전이 펩티드 코딩 지역 및 UTR로부터 선택되는 완전한 유전적 인자의 완전한 서열보다 짧은 FAD2의 핵산 서열을 포함한다); 그리고, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 재조합 핵산 분자를 결한 식물로부터의 종자와 비교하여 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 형질전환 식물을 성장시키므로써, 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 가지는 형질전환 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 지방산 합성 경로에서 내생적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 적어도 40 뉴클레오티드 길이의 유전적 인자를 분리하고; 하나 이상의 짧아진 유전적 인자의 단편을 생성하고; 형질전환 식물을 생산하기 위하여 온대성 오일종자 작물의 식물 세포 내로 상기 하나 이상의 짧아진 단편의 각각을 도입하고; 그리고, 종자 오일 지방산 조성의 원하는 변화를 일으키는 결정된 길이 및 서열의 짧아진 단편을 포함하는 형질전환 식물을 선별하므로써, 온대성 오일 종자 작물의 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 또한, 상기 방법은, 종자 오일 지방산 조성에서 다른 원하는 변화들을 일으키는 다른 두개의 내생적 유전자들의 적어도 두 개의 짧아진 단편들을 갖는 재조합 DNA 구조물을 구성하고; 형질전환 식물을 생산하기 위하여 온대성 오일종자 작물의 식물 세포 내로 상기 재조합 DNA 구조물을 도입하고; 그리고, 상기 적어도 두 개의 짧아진 단편들을 포함하고, 상기 적어도 두 개의 짧아진 단편에 의하여 나타난 하나 이상의 원하는 변화를 갖는, 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 가지는 형질전환 식물을 선별하는 것을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 숙주 세포에서 FAD2의 내생적 발현을 억제하는 DNA 서열을 갖는, 매우 감소된 포화 지방산 함량 및 중간 정도로 증가된 올레산 함량을 갖는 오일 조성을 나타내는 대두 종자에 관한 것이며, 상기 DNA 서열은 유전자, 엑손, 인트론, 전이 펩티드 코딩 지역 및 UTR로부터 선택된 완전한 유전적 인자의 완전한 서열보다 짧은 FAD2의 핵산 서열을 갖는다.
다음의 실시예들은 본 발명의 예시하기 위한 것이며, 어떤 방법으로도 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명의 명세서에 언급된 모든 문헌들, 특허들 및 특허출원들은, 각 개별적인 문헌, 특허 또는 특허출원이 참고문헌으로 본원에 통합되는 것으로 특별히, 개별적으로 언급된 것과 동일한 정도로, 참고문헌으로 본원에 통합된다.
실시예 1 FATB -2 서열들의 분리
잎 조직을 Asgrow사의 콩 변종 A3244로부터 얻어서, 액체 질소에서 그라인딩한 후, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. SDS 추출 완충액 6㎖(650㎖의 살균 ddH2O, 100㎖의 1M Tris-Cl pH8, 100㎖의 0.25M EDTA, 50㎖의 20% SDS, 100㎖의 5M NaCl, 4㎕의 β-머캡토에탄올)를 동결된/그라인딩된 잎 조직 2㎖에 첨가하고, 그리고 상기 혼합물을 65℃에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 매 15분마다 진탕 시켰다. 빙냉의 5M 포타슘아세테이트 2㎖를 시료에 첨가하고, 시료를 진탕시킨 후, 20분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. CHCl3 3㎖를 시료에 첨가하고, 시료를 10분간 진탕시켰다.
시료를 20분간 10,000rpm에서 원심분리시키고, 상등액을 모았다. 이소프로판올 2㎖를 상등액에 첨가하고, 혼합시켰다. 다음으로, 시료를 20분간 10,000rpm에서 원심분리시키고, 상등액을 제거하였다. 펠릿을 RNase 200㎕에 재현탁시키고, 65℃에서 20분간 인큐베이션시켰다. 암모늄아세테이트/이소프로판올(1:7) 300㎕를 첨가하고, 혼합시켰다. 다음으로, 시료를 10,000rpm에서 15분간 원심분리시키고, 상등액을 제거시켰다. 펠릿을 80% 에탄올 500㎕로 헹구고, 공기건조시켰다. 다음으로, 게놈 DNA의 펠릿을 T10E1(10mM Tris:1mM EDTA) 200㎕에 다시 현탁시켰다.
유전자 F1(서열번호:48), F2(서열번호:49), F3(서열번호:50), F4(서열번호:51), F5(서열번호:52), F6(서열번호:53), F7(서열번호:54), R1(서열번호:55), R2(서열번호:56), R3(서열번호:57), R4(서열번호:58), R5(서열번호:59), 및 R6(서열번호:60)로 나열된 13개의 올리고뉴클레오티드를 설계하기 위하여, 콩 FATB -2 cDNA 콘티그 서열(contig sequence)(서열번호:42)을 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오티드들을 분리된 콩 게놈 DNA로부터 PCR 증폭을 위하여 쌍으로 사용하였다: 쌍1(F1+R1), 쌍2(F2+R1), 쌍3(F3+R2), 쌍4(F4+R3), 쌍5(F5+R4), 쌍6(F6+R5), 및 쌍 7(F7+R6). 쌍5에 대한 PCR 증폭을 다음의 조건으로 실시하였다: 1사이클, 95℃ 10분간; 30사이클, 95℃ 15초간, 43℃ 30초간, 72℃ 45초간; 1사이클, 72℃ 7분간. 모든 다른 올리고 쌍들에 대하여, PCR 증폭을 다음의 조건으로 실시하였다: 1사이클, 95℃ 10분간; 30사이클, 95℃ 15초간, 48℃ 30초간, 72℃ 45초간; 1사이클, 72℃ 7분간. 프라이머 쌍 1, 2, 4, 5, 6 및 7로부터 양성 단편들을 얻었다. 각 단편을 벡터 PCR2.1(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 단편 2, 4, 5 및 6을 확인하고, 시퀀싱하였다. FATB -2 유전자(서열번호:43)에 대한 게놈 서열을 만들기 위하여, 상기 4개의 서열들을 정렬하였다.
cDNA서열에 대한 게놈 서열의 비교에 의해, 대두 FATB -2 유전자 내에서 4개의 인트론들을 동정하였다: 인트론Ⅰ(서열번호:44)은 게놈 서열(서열번호:43)의 염기 119로부터 염기 1333에 걸쳐있고, 1215bp의 길이이고; 인트론Ⅱ(서열번호:45)는 게놈 서열(서열번호:43)의 염기 2231로부터 염기 2568에 걸쳐있고, 338bp의 길이이고; 인트론Ⅲ(서열번호:46)는 게놈 서열(서열번호:43)의 염기 2702로부터 염기 3342에 걸쳐있고, 641bp의 길이이며; 그리고 인트론Ⅳ(서열번호:47)는 게놈 서열(서열번호:43)의 염기 3457로부터 염기 3823에 걸쳐있고, 367bp의 길이이다.
실시예 2 억제 구조물들
2A. FAD2 -1 구조물들
FAD2 -1A 인트론 #1(서열번호:1)을 센스 및 안티-센스 방향으로, 발현 카셋트 pCGN3892 내로 클로닝하였다. 벡터 pCGN3892는 대두 7S 프로모터 및 완두 rbcS 3'를 포함한다. 다음으로, 양 유전자 융합체들을 FMV 프로모터에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 pCGN9372 내로 각각 라이게이션시켰다. 결과로 얻은 발현구조물들(pCGN5469 센스 및 pCGN5471 안티센스)을 대두의 형질전환을 위해 사용하였다.
FAD2 -1B 인트론(서열번호:2)을 (FAD2 -1A 인트론(센스) 및 완두콩 rbcS 3'와 융합된 대두 7S 프로모터를 포함하는) 플라스미드 pCGN5468 또는 (FAD2 -1A 인트론(안티센스) 및 완두콩 rbcS 3'와 융합된 대두 7S 프로모터를 포함하는) pCGN5470 내의 FAD2 -1A 인트론 #1의 3' 말단에 센스 및 안티센스 방향으로 각각 융합시켰다. 다음으로, 결과로 얻은 인트론 조합 융합체들을 FMV 프로모터에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 pCGN9372 내로 각각 라이게이션시켰다. 결과로 얻은 발현구조물들(pCGN5485, FAD2 -1A & FAD2 -1B 인트론 센스 및 pCGN5486, FAD2 -1A & FAD2-1B 인트론 안티센스)을 대두의 형질전환을 위해 사용하였다.
2B. FAD3 -1 구조물들
FAD3 -1A 인트론 #1, #2, #4 및 #5(각각 서열번호:7, 8, 10 및 11), FAD3 -1B 인트론 #3C(서열번호:23) 및 #4(서열번호:24)를 모두 pCGN3892 내로 센스 또는 안티센스 방향으로 각각 라이게이션시켰다. pCGN3892는 대두 7S 프로모터 및 완두콩 rbcS 3'를 포함한다. 이러한 융합체들을 대두 내로 형질전환시키기 위하여 FMV 프 로모터에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 pCGN9372 내로 라이게이션시켰다. 결과로 얻은 발현구조물들(pCGN5455, FAD3 -1A 인트론 #4 센스; pCGN5459, FAD3 -1A 인트론 #4 안티센스; pCGN5456, FAD3 인트론 #5 센스; pCGN5460, FAD3 -1A 인트론 #5 안티센스; pCGN5466, FAD3 -1A 인트론 #2 안티센스; pCGN5473, FAD3 -1A 인트론 #1 안티센스)을 대두의 형질전환을 위해 사용하였다.
2C. FatB 구조물들
대두 FATB -1 인트론 Ⅱ 서열(서열번호:30)을 주형으로서 FATB -1 부분 게놈 클론을 사용하여 PCR을 통해서 증폭시켰다. PCR 증폭을 다음과 같이 실시하였다: 1사이클, 95℃ 10분간; 25사이클, 95℃ 30초간, 62℃ 30초간, 72℃ 30초간; 1사이클, 72℃ 7분간. PCR 증폭으로 양쪽 말단에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 길이가 854bp인 산물들을 얻었다. PCR 산물은 pMON70674를 만들기 위해, PCR 프라이머들의 5'말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 발현 카세트 pCGN3892 내로 센스 방향으로 직접 클로닝시켰다. 벡터 pCGN3892는 대두 7S 프로모터와 완두콩 rbcS 3'를 포함한다. 다음으로, pMON70674를 NotⅠ로 절단하고, FMV 프로모터에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과로 얻은 유전자 발현구조물 pMON70678은 아그로박테리움 방법들을 사용하여 대두의 형질전환을 위해 사용하였다.
대두 FATB -1 인트론 Ⅱ 서열(서열번호:30)을 포함하는 두 개의 다른 발현 구 조물들을 제조하였다. pMON70674는 NotⅠ로 절단하고, FMV 프로모터에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자와 나핀 프로모터에 의해 조절되는 KAS Ⅳ 유전자를 포함하는 pMON70675 내로 라이게이션시켜, 결과적으로 pMON70680을 얻었다. 다음으로, 발현 벡터 pMON70680을 SnaBⅠ로 절단하고, 7S 프로모터에 의해 센스방향으로 조절되는 조조바(jojoba) Δ-9 탈포화효소 유전자(서열번호:41)의 유전자 융합체와 라이게이션시켰다. 발현 구조물들, pMON70680과 pMON70681을 아그로박테리움 방법들을 사용하여 대두의 형질전환을 위해 사용하였다.
2D. 조합 구조물들
제1세트의 DNA 서열들의 다양한 변이체들을 포함하는 발현 구조물들을 제조하였다. 제1세트의 DNA 서열들은 도 5 및 도 6에서 설명되거나 또는 예시된 것들 중의 어떤 것이거나, 또는 dsRNA 구조물들, 센스 동시억제 구조물들, 안티센스 구조물들, 또는 전술한 것의 여러 가지 조합을 형성할 수 있도록 센스, 안티센스 또는 센스와 안티-센스 FAD2, FAD3, 및 FATB 비-코딩 또는 코딩 지역들의 여러 가지의 조합들을 포함하는 어떤 다른 세트의 DNA 서열들이다.
도 5a 내지 도 5c는 아래 표 1과 표 2에서 설명되는 비-코딩 서열들인, 본 발명에 따르는 센스 동시억제 또는 안티-센스 구조물들을 발현할 수 있는 몇 가지 제1세트의 DNA 서열들을 나타낸다. 상기 비-코딩 서열들은 단일 서열들, 서열들의 조합들(예를 들어, 3' UTR에 연결된 5' UTR), 또는 전술한 것의 어떤 조합일 수 있 다. 센스 동시억제 구조물을 발현시키기 위하여, 모든 비-코딩 서열들은 센스 서열들이고, 안티센스 구조물들을 발현시키기 위하여, 모든 비-코딩 서열들은 안티센스 서열들이다. 도 5d는 본 발명에 따른 센스와 안티센스 구조물들을 발현시킬 수 있는 제1세트의 DNA 서열들을 설명한다.
도 6a 내지 도 6c는 아래 표 1과 표 2에서 설명되는 비-코딩 서열들인, 본 발명에 따르는 dsRNA 구조물들을 발현시킬 수 있는 몇 가지 제1세트의 DNA 서열들을 나타낸다. 도 6에 도시된 제1세트의 DNA 서열들은, 예를 들어, 제1의 센스 서열에 의해 발현된 RNA가 제1의 안티-센스서열에 의해 발현된 안티센스 RNA와 이중-가닥을 형성할 수 있도록 배열된, 관련된 센스 및 안티센스 서열들의 쌍을 포함한다. 예를 들어, 도 6a와 (표 1의) 예시적인 조합 번호 1을 참조하면, 제1세트의 DNA 서열들은 센스 FAD2 -1 서열, 센스 FAD3 -1 서열, 안티센스 FAD2 -1 서열 및 안티센스 FAD3 -1 서열을 포함한다. 안티센스 서열들 모두는 센스 서열들에 상응하므로, 제1세트의 DNA 서열들의 발현 산물들은 서로 이중-가닥 RNA를 만들 수 있다. 상기 센스 서열들은 스페이서 서열에 의해, 바람직하게는 dsRNA 분자의 생성을 촉진시키는 스페이서 서열에 의해, 안티센스 서열들로부터 분리될 수 있다. 이러한 스페이서 서열들의 예들은 Wesley 등의 상게서 및 Hamilton 등, Plant J., 15:737~746(1988)에 설명된 것들을 포함한다. 상기 프로모터는 식물 내에서 기능성이 있는 어떤 프로모터 또는 어떤 식물 프로모터이다. 제한되지는 않지만, 적절한 프로모터들의 예는 상세한 설명의 파트 D에 설명되어 있다.
제1세트의 DNA 서열들은 다양한 DNA 조작 기술들을 사용하여, 센스 또는 안티-센스 방향 중의 어느 방향으로 발현 구조물 내에 삽입된다. 만일 적절한 제한 사이트들이 DNA 서열들 내에 존재하면, 이들은 제한 엔도뉴클레아제들로 절단되어, 하나 이상의 이용가능한 클로닝 사이트에서 절단된 구조물 내로 라이게이션되므로써 발현 구조물 내로 삽입될 수 있다. 만일 적절한 제한 사이트들이 DNA 서열들 내에 존재하지 않으면, 구조물 또는 DNA 서열들 중의 어느 것의 DNA는 상기 구조물 내로 DNA 서열들의 클로닝을 촉진시키는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. DNA를 변경시키는 방법들의 예는, PCR, 합성 링커 또는 어뎁터 라이게이션, 시험관 내 사이트-특이적 돌연변이 유발, 오버행잉(overhanging) 5' 또는 3' 말단들의 채워넣기(filling in) 또는 잘라내기(cutting back) 등을 포함한다. DNA를 조작하는 이들 방법들과 다른 방법들은 당업자들에게 공지되어 있다.
pMON97552는, 3' 말단으로부터 140개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 140개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB-1α CTP 코딩 지역은 FAD3 -1A 인트론 4로부터 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3 -1A 인트론 4로부터 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α CTP 코딩 지역에 안티센 스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 140개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 140개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93758은, 5' 말단으로부터 160개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 5' 말단으로부터 160개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 5' 말단으로부터 160개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 5' 말단으로부터 160개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON97553은, 3' 말단으로부터 200개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 200개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드에 라이게이션되고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB -1α CTP 코딩 지역은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 200개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 200개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환 용으로 이용된다.
pMON93770은, 3' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93759는, 5' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 5' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 5' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 5' 말단으로부터 240개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON97554는, 3' 말단으로부터 260개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 260개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드에 라이게이션되고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB -1α CTP 코딩 지역은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인 트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 260개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 260개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93771은, 3' 말단으로부터 300개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 300개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 300개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부 터 300개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON97555는, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드에 라이게이션되고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB -1α CTP 코딩 지역은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)는 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되 어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93760은, 5' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 5' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 5' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 5' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)는 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93772는, 3' 말단으로부터 360개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 360개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)는 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션되고, FATB -1α 5' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 5' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 3' UTR이 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 360개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 360개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON97556은, 3' 말단으로부터 380개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 380개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드에 라이게이션되 고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB -1α CTP 코딩 지역은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드는 3' 말단으로부터 380개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 380개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)는 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON93764는, 3' 말단으로부터 400개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 400개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FATB -1α CTP 코딩 지역에 라이게이션되고, FATB -2α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB -2α CTP 코딩 지역은 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3-1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -2α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되 고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 안티센스 방향으로 이어지고, 3' 말단으로부터 400개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 400개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)는 FATB -2α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -2α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드가 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 FATB -2α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드는 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
[표 1]
조합들의 설명 비-코딩 또는 코딩 서열들 (센스 또는 안티센스)
제1 제2 제3 제4
1 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C
2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B
3 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
4 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -1
5 FAD2 -1A 또는 B FATB -1 FAD3 -1A 또는 B 또는 C
6 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B FATB -1
7 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -1 FAD2 -1A 또는 B
8 FATB -1 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B
9 FATB -1 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C
10 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -1
11 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -1
12 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B FATB -1
13 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 는 C FATB -1 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
14 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B FATB -1 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
15 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -1 FAD2 -1A 또는 B
16 FAD2 -1A 또는 B FATB -1 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
17 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -1 FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
18 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -1 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B
19 FATB -1 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
20 FATB -1 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
21 FATB -1 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B
22 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -2
23 FAD2 -1A 또는 B FATB -2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C
24 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B FATB -2
25 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -2 FAD2 -1A 또는 B
26 FATB -2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B
27 FATB -2 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C
28 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -2
29 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -2
30 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B FATB -2
31 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -2 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
32 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B FATB -2 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
33 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FATB -2 FAD2 -1A 또는 B
34 FAD2 -1A 또는 B FATB -2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
35 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -2 FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
36 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FATB -2 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B
37 FATB -2 FAD2 -1A 또는 B FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
38 FATB -2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C FAD2 -1A 또는 B 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열
39 FATB -2 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 다른 FAD3 -1A 또는 B 또는 C 서열 FAD2 -1A 또는 B
[표 2]
표 1에서 서열번호들과 서열들의 상관관계
FAD2 -1A FAD2 -1B FAD3 -1A FAD3 -1B FAD3 -1C FATB -1 FATB -2
3' UTR 서열번호:5 적용없음 서열번호:16 서열번호: 26 서열번호:61 서열번호: 36 적용없음
5' UTR 서열번호:6 적용없음 서열번호:17 서열번호: 27 서열번호:62 서열번호: 37 적용없음
5'+3' UTR (또는 3'+5' UTR) 연결된 서열번호:5 및 6 적용없음 연결된 서열번호:16 및 17 연결된 서열번호: 26 및 27 적용없음 연결된 서열번호: 36 및 37 적용없음
인트론 #1 서열번호:1 서열번호:2 서열번호:7 서열번호: 19 적용없음 서열번호: 29 서열번호:44
인트론 #2 적용없음 적용없음 서열번호:8 서열번호: 20 적용없음 서열번호: 30 서열번호:45
인트론 #3 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 서열번호: 31 서열번호:46
인트론 #3A 적용없음 적용없음 서열번호:9 서열번호: 21 적용없음 적용없음 적용없음
인트론 #3B 적용없음 적용없음 서열번호:12 서열번호: 22 적용없음 적용없음 적용없음
인트론 #3C 적용없음 적용없음 서열번호:13 서열번호: 23 적용없음 적용없음 적용없음
인트론 #4 적용없음 적용없음 서열번호:10 서열번호: 24 서열번호:14 서열번호: 32 서열번호: 47
인트론 #5 적용없음 적용없음 서열번호:11 서열번호: 25 적용없음 서열번호: 33 적용없음
인트론 #6 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 서열번호: 34 적용없음
인트론 #7 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 적용없음 서열번호: 35 적용없음
실시예 3 조합 구조물들
실시예 3 조합 구조물들
도 7~15에서, 프로모터들은 화살표로 표시되고, 인코딩 서열들(코딩 서열과 비-코딩 서열 모두)는 오각형으로 표시되며, 전사 방향으로 표시되고, 센스 서열들은 정상으로 표시되고, 안티센스 서열들은 상하반전으로 표시된다. 상기 도면에서 표시되는 약어들은 다음과 같다: 7Sa=7Sα 프로모터; 7Sa'=7Sα' 프로모터; Br napin=브라시카 나핀 프로모터; FMV=FMV 프로모터; ARC= 아르셀린 프로모터; RBC E9 3'=루비스코 E9 종결 신호; Nos 3'=nos 종결 신호; TML 3'=tml 종결 신호; napin 3'= 나핀 종결 신호; (FAD 또는 FAT와 같은 동일한 박스 내의) 3'=3' UTR; (FAD 또는 FAT와 같은 동일한 박스 내의) 5'=5' UTR; Cr=쿠페아 풀케리마; Gm=글리신 맥스; Rc=리시너스 코뮤니스; FAB2=Δ-9 스테아로일-탈포화효소 유전자의 FAB2 대립유전자; 및 Intr 또는 Int=인트론.
3A. dsRNA 구조물들
도 7~9는 제1세트의 DNA 서열들이 dsRNA를 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 분자를 나타낸다. 도 7~9에서 도시된 제1세트의 DNA 서열들은, 예를 들면, 제1의 센스 서열에 의하여 발현된 RNA는 제1의 안티센스 서열에 의하여 발현된 안티센스 RNA와 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있게 배열된, 관련된 센스 및 안티센스 서열들의 쌍을 포함한다. 상기 센스 서열들은 상기 안티센스 서열들에 인접할 수 있거나, 또는 도 9에 나타난 바와 같이, 스페이서 서열에 의하여 안티센스 서열들로부터 분리될 수 있다.
제2세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, KAS Ⅰ, KAS Ⅳ, Δ-9 탈포화효소, 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 단백질 및 전사체 중 어느 하나 또는 모두를 증가시킬 수 있는 서열을 코딩하는 DNA 서열인 각각의 코딩 서열들을 포함한다. 각각의 코딩 서열은 프로모터와 결합되며, 상기 프로모터는 식물 내에서 작동하는 어떤 프로모터, 또는 어떤 식물 프로모터일 수 있고, FMV 프로모터, 나핀 프로모터, 7S(7Sα 또는 7Sα') 프로모터, 아르셀린 프로모터, Δ-9 탈포화효소 프로모터, 또는 FAD2 -1A 프로모터일 수 있다.
도 7에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39), 및 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68539를 도 7에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), 및 FATB -1 인트론Ⅱ(서열번호:30) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68540을 도 7에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), 및 FATB -1 인트론Ⅱ(서열번호:30) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68544를 도 7에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), FATB-1 인트론Ⅱ(서열번호:30) 및 FAD3 -1B 인트론 4(서열번호:24) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68546을 도 7에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 8에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68536을 도 8에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소들로 절단시키고, tml 3' 종결 서열 바로 상류에 라이게이션시켰다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션 시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68537을 도 8에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68538을 도 8에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 9에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FAD3 -1B 3' UTR(서열번호:26) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80622를 도 9에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 스플라이싱이 가능한 대두 FAD3 -1A 인트론 5(서열번호:11)에 의해 분리되게, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80623을 도 9에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FATB -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨), FAD3-1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FAD3 -1B 5' UTR-3' UTR(서열번호:27 및 서열번호:26이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O5를 도 9에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FATB -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨), 및 FAD3-1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O6을 도 9에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
3B. 센스 동시억제 구조물들
도 10~13 및 19~20은 제1세트의 DNA 서열들이 센스 동시억제 구조물들을 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 분자를 설명한다. 제2세트의 DNA 서열들은, 발현될 때, KAS Ⅰ, KAS Ⅳ, Δ-9 탈포화효소, 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 단백질 및 전사체 중 어느 하나 또는 모두를 증가시킬 수 있는 서열을 코딩하는 DNA 서열인 각각의 코딩 서열들을 포함한다. 각각의 코딩 서열은 프로모터와 결합되며, 상기 프로모터는 식물 내에서 작동하는 어떤 프로모터, 또는 어떤 식물 프로모터일 수 있고, FMV 프로모터, 나핀 프로모터, 7S(7Sα 또는 7Sα') 프로모터, 아르셀린 프로모터, Δ-9 탈포화효소 프로모터, 또는 FAD2-1A 프로모터일 수 있다.
도 10에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1C 인트론 4(서열번호:14), FATB -1 인트론Ⅱ(서열번호:30), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), 및 FAD3 -1B 인트론 4(서열번호:24) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68522를 도 10에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), FAD3 -1B 인트론 4(서열번호:24), 및 FATB -1 인트론Ⅱ(서열번호:30) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39), 및 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적 절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80614를 도 10에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68531을 도 10에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클 로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39), 및 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68534를 도 10에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON68535를 도 10에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 11에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1B 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80605를 도 11에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1B 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열 에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80606을 도 11에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80607을 도 11에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FATB -1 3' UTR(서열번호:36) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39), 및 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80614를 도 11에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 12에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80629를 도 12에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2), FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10), FATB -1 인트론 Ⅱ(서열번호:30) 및 FAD3 -1A 인트론 4(서열번호:10) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON81902를 도 12에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FAD3 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:17 및 서열번호:16이 함께 라이게이션됨), 및 FATB-1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물 들을 얻었다. FAD2 -1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 유사하게, FAD3 -1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. FATB-1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 아르셀린 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 이러한 벡터들을 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O1을 도 12에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FAD3 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:17 및 서열번호:16이 함께 라이게이션됨), 및 FATB-1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. FAD2 -1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 유사하게, FAD3 -1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. FATB-1 PCR 산물을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 아르셀린 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 이러한 벡터들을 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O2를 도 12에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FATB -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨), FAD3-1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FAD3 -1B 5' UTR-3' UTR(서열번호:27 및 서열번호:26이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 이러한 벡터들을 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종 결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O7을 도 13에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1 또는 서열번호:2)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 대두 FATB -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨), FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FAD3 -1B 5' UTR-3' UTR(서열번호:27 및 서열번호:26이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 nos 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 이러한 벡터들을 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O9를 도 13에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 19에 나타난 바와 같이, 대두 FATB -2 비-코딩 서열들(서열번호:44~47), FAD2-1 비-코딩 서열들(서열번호:1, 5 및 6), 및 FATB -1 비-코딩 서열들(서열번호:29~37)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON80612 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 19a에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
Δ-9 탈포화효소를 포함하는 DNA 서열은 7Sα 프로모터에 의하여 조절되고, TML 3' 종결 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단되고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 19b에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 아르셀린 프로모터 및 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단되고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 19c에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 20에 나타난 바와 같이, 대두 FATB -2 비-코딩 서열들(서열번호:44~47), FAD2-1 비-코딩 서열들(서열번호:1, 5 및 6), 및 FATB -1 비-코딩 서열들(서열번호:29~37), FAD3 -1A 비-코딩 서열들(서열번호:7~13 및 16~17), 및 FAD3 -1B 비-코딩 서열들(서열번호:19~27)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON80612 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 20a에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
Δ-9 탈포화효소를 포함하는 DNA 서열은 7Sα 프로모터에 의하여 조절되고, TML 3' 종결 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 20b에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
브라시카 대두 아르셀린 프로모터 및 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 20c에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
pMON 93501은, 대두 7Sα' 프로모터와 H6 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1), 브라시카 나핀 프로모터와 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 C. 풀케리마 KAS Ⅳ유전자(서열번호:39), 대두 7SA 프로모터와 nos 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 리시너스 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소 유전자(미국 특허공개번호 제2003/00229918 A1), 및 EFMV 프로모터(피크워트 모자이크 바이러스(figwort mosaic virus)로부터 유래된 구성적 프로모터) 및 완두콩 루비스코 EP 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하고, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 접하게 된다. 결과로 얻은 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
3C. 안티센스 구조물들
도 14는 안티센스 구조물들을 발현할 수 있는 제1세트의 DNA 서열들인, 본 발명의 핵산 분자들을 도시하고, 도 15 내지 도 18은 센스 및 안티센스 구조물들의 조합물들을 발현할 수 있는 제1세트의 DNA 서열들인, 본 발명의 핵산 분자를 도시한다. 제2세트의 DNA 서열들은 코딩 서열들을 포함하며, 그것의 각각은, 발현될 때, KAS Ⅰ, KAS Ⅳ, Δ-9 탈포화효소, 및 CP4 EPSPS로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 단백질 및 전사체 중 어느 하나 또는 모두를 증가시킬 수 있는 서열을 코딩하는 DNA 서열이다. 각 코딩 서열은 프로모터와 결합되며, 상기 프로모터는 식물 내에서 작용하는 어떤 프로모터, 또는 어떤 식물 프로모터이고, 그리고, FMV 프로모터, 나핀 프로모터, 7S(7Sα 또는 7Sα') 프로모터, 아르셀린 프로모터, Δ-9 탈포화효소 프로모터, 또는 FAD2 -1A 프로모터일 수 있다.
도 14에 나타난 바와 같이, 대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함 하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80615를 도 14에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80616을 도 14에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머 들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 대두 FAD2 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 유전자(서열번호:40)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80617을 도 14에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 3' UTR(서열번호:5), FATB -1 3' UTR(서열번호:36), 및 FAD3 -1A 3' UTR(서열번호:16) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 안티센스 방향으로, 대두 7Sα 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 pMON80630을 도 14에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FATB -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨), FAD3-1A 3' UTR(서열번호:16), 및 FAD3 -1B 5' UTR-3' UTR(서열번호:27 및 서열번호:26이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터들을 적절한 제한 효소들로 절단시키고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O8을 도 14에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FAD3 -1A 5' UTR-3' UTR(서열번호:17 및 서열번호:16이 함께 라이게이션됨), 및 FATB-1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 Xho Ⅰ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 상기 센스 및 안티센스 서열 사이에 배치된 추가적인 대두 7Sα 프로모터를 가지며, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O3을 도 15에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 FAD2 -1 5' UTR-3' UTR(서열번호:6 및 서열번호:5가 함께 라이게이션됨), FAD3 -1A 5' UTR-3' UTR(서열번호:27 및 서열번호:26이 함께 라이게이션됨), 및 FATB-1 5' UTR-3' UTR(서열번호:37 및 서열번호:36이 함께 라이게이션됨) 서열들을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 상기 PCR 프라이머들의 5' 말단 상에 조작된 XhoⅠ 사이트를 통하여, 센스 및 안티센스 방향으로, 상기 센스 및 안티센스 서열 사이에 배치된 추가적인 대두 7Sα 프로모터를 가지며, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 NotI로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소들로 절단시키 고, pMON41164 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물인 O4를 도 15에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 16에 나타난 바와 같이, 대두 FATB -2 비-코딩 서열들(서열번호:44~47), FATB-1 비-코딩 서열들(서열번호:29~37), 및 FAD2 -1 비-코딩 서열들(서열번호:1, 5 및 6)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON80612 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 16a에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
Δ-9 탈포화효소를 포함하는 DNA 서열은 7Sα 프로모터에 의하여 조절되고, TML 3' 종결 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 16b에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 아르셀린 프로모터 및 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 16c에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 17에 나타난 바와 같이, 대두 FATB -2 비-코딩 서열들(서열번호:44~47), FATB-1 비-코딩 서열들(서열번호:29~37), FAD2 -1 비-코딩 서열들(서열번호:1, 5 및 6), 및 FAD3 -1A 비-코딩 서열들(서열번호:7~13 및 16~17)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON80612 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 17a에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
Δ-9 탈포화효소를 포함하는 DNA 서열은 7Sα 프로모터에 의하여 조절되고, TML 3' 종결 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 17b에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 아르셀린 프로모터 및 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 17c에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
도 18에 나타난 바와 같이, 대두 FATB -2 비-코딩 서열들(서열번호:44~47), FATB-1 비-코딩 서열들(서열번호:29~37), FAD2 -1 비-코딩 서열들(서열번호:1, 5 및 6), FAD3 -1A 비-코딩 서열들(서열번호:7~13 및 16~17), 및 FAD3 -1B 비-코딩 서열들(서열번호:19~27)을 PCR을 통해 증폭시켜, 양쪽 말단들에 재조작된 제한 사이트들을 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. 상기 PCR 산물들을, 센스 및 안티센스 방향으로, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내로 직접 클로닝하였다. 다음으로, 상기 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의해 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터인 pMON80612 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 18a에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
Δ-9 탈포화효소를 포함하는 DNA 서열은 7Sα 프로모터에 의하여 조절되고, TML 3' 종결 서열은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 18b에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
대두 아르셀린 프로모터 및 나핀 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39)를 포함하는 벡터는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단시키고, 상기 발현 구조물 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 도 18c에 나타내고, 이는 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다. 상기 설명된 핵산 분자들은 본 발명의 목적, 특징 및 이점을 달성하는 바람직한 구체예들이다. 본 발명은 상기 설명된 구체예들에 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 핵산 분자 내의 제1세트 및 제2세트의 DNA 서열들 내의 서열들의 배열은 예시되고, 설명된 배열들에 한정되지는 않으며, 첨부된 도면에 도시되고, 본원에서 설명된 것과 같은 본 발명의 목적, 특징 및 이점을 달성하는데 적절한 어떤 방식으로도 변경될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다.
3D. 생체 내 어셈블리
본 발명의 하나의 측면은, 식물 염색체 상의 재조합 전사 단위 내로 인 플란타(in planta) 방식으로 어셈블리되어 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있는 DNA 구조물을 포함한다. 그러한 구조물의 어셈블리 및 생체내에서 유전자 억제를 위한 재조합 전사 단위체를 어셈블리하는 방법들은 국제특허출원 PCT/US2005/00618에 설명되어 있고, 이는 그 전체 내용이 참고문헌으로 본원에 통합된다.
pMON93505는 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 5' UTR에 의하여 이어진 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 브라시카 나핀 프로모터 및 브라시카 나핀 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 C. 풀케리마 KAS Ⅳ 유전자(서열번호:39), 대두 7SA 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소 유전자(미국 특허공개번호 제2003/00229918 A1), 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)의해 접하게 된다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접하는 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 5' UTR에 의하여 이어진 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로된 배열로 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON93506은 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 5' UTR에 의하여 이어진 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 대두 7SA 프로모터 및 nos 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 R. 코뮤니스 Δ-9 탈포화효소 유전자(미국 특허공개번호 제2003/00229918 A1), 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 좌측 경계 DNA(LB) 및 우측 경계 DNA(RB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 5' UTR에 의하여 이어진 FATB -1α 3' UTR에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON95829는 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역에 의하여 이어진 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드들에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역에 의하여 이어진 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드들에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON97595는 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역에 의하여 이어진 FATB -1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드들에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박 테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α CTP 코딩 지역에 의하여 이어진 FATB-1α 5' UTR의 42개의 연속된 뉴클레오티드들에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON97581은 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB-1α CTP 코딩 지역에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON97596은 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역의 5' 180bp에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서 열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α CTP 코딩 지역의 5' 180bp에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON97597은 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전 이 펩티드("CTP") 코딩 지역의 5' 120bp에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α CTP 코딩 지역의 5' 120bp에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
pMON97598은 생체 내에서의 어셈블리용으로 사용되는 구조물이고, 2개의 T-DNA 단편들을 갖고, 이들 단편 각각은 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접하게 된다. 제1의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 340개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB -1α 엽록체 전이 펩티드("CTP") 코딩 지역에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터, 및 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 포함하며, 상기의 모두는 아그로박테리움 T-DNA 경계 인자들, 즉, 우측 경계 DNA(RB) 및 좌측 경계 DNA(LB)에 의해 접한다. 동일한 구조물 상에서, 다른 RB 및 LB에 의해 접한 제2의 T-DNA 단편은, 3' 말단으로부터 340개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, FATB-1α CTP 코딩 지역에 라이게이션된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)에 작동가능하게 연결된 H6 3' 종결 서열이다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 이용된다.
상기 구조물의 두 T-DNA 단편들이 숙주 생물의 엽색체의 단일 유전자좌 내로 RB 대 RB 방향으로 삽입될 때, 어셈블리된 전사 단위체는 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 대두 FAD2 -1A 인트론 1 및 FATB -1α DNA 단편들에 작동가능하게 연결된 대두 7Sα' 프로모터를 가진다. 전사될 때, 작동가능하게 연결된 센스 및 안티센스 방향으로 배열된 RNA 서열들은 FAD2 -1A 및 FATB의 억제에 효과적인 이중-가닥 RNA를 형성할 수 있다.
실시예 4 식물 형질전환 및 분석
실시예 2 및 3의 구조물들을 McCabe 등, Bio / Technology , 6:923~926(1988) 또는 아그로박테리움-매개 형질전환법을 포함하는 이전에 설명된 방법들에 의하여 대두(예를 들어, Asgrow variety A4922 또는 Asgrow variety A3244 또는 Asgrow variety A3525) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들을 글리포세이트를 포함하는 배지상에서 선별하므로써 동정하였다. 상기 구조물들로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 지방산 조성을 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 추가적으로, 상기 구조물의 어떤 것은 프로모터들의 다양한 조합뿐 아니라, 다른 목적하는 서열들을 포함할 수 있다.
어떤 적용을 위하여, 자라는 종자들에서는 변경된 지방산 조성이 검출되는 반면, 오일 프로파일 분석, FAS 경로의 후기에 발생하는 지방산 변경의 검출, 또는 지방산 조성에 대한 작은 변경의 검출과 같은 예들에서는 성숙 종자들로부터 지방산 또는 오일의 분석이 바람직하다. 나아가, 특히, 분리된 R1 종자 군집에 있어서의 오일 변경의 검출에서는, 개별 종자들의 오일 및/또는 지방산 함량의 분석이 요구될 수 있다. 본 발명에서 설명되는 것과 같이, R0 세대는 본원에서 설명된 형질전환/재생 프로토콜로부터 형성된 식물을 나타내고, R1 세대는 자기화된(selfed) 형질전환 R0 식물상에서 성장한 종자들을 나타낸다. R1 식물들은 R1 종자들로부터 성장된다.
실시예 3의 구조물들로 형질전환된 대두 계통들의 종자에 대한 지방산 조성 을 결정하였다. 오일 추출물을 얻기 위하여, 형질전환체 및 대조군 대두 계통 각각의 10개의 종자 중 하나를, 오일 추출을 위하여 조직 균질화기(tissue homogenizer)(Pro Scientific)를 사용하여 개별적으로 갈았다. 갈아진 대두로부터의 오일을 트리헵타데카노인(0.50mg/ml)를 포함하는 1.5ml의 헵탄에서 밤새 추출하였다. 상기 추출된 오일의 200㎕ 분액을 순수 메탄올 내의 500㎕의 소듐 메톡사이드의 첨가로 메틸에스테르로 유도체화시켰다. 상기 유도체화 반응을 50℃에서 20분 동안 진행되도록 두었다. 500㎕의 10%(w/v) 소듐클로라이드 및 400㎕의 헵탄의 동시 첨가에 의하여, 상기 반응을 정지시켰다. 헥산으로 추출된 결과의 지방산 메틸에스테르들을 Hewlett-Packard model 6890 GC(Palo Alto, CA) 상에서 기체 크로마토그래피(GC)로 분리하였다. 상기 GC는 Supercowax 250 column(30m, 0.25mm id, 0.25micron film thickness)으로 고정되었다. 컬럼 온도는 주입시에 175℃이고, 상기 온도를 40℃/분의 속도로 175℃로부터 245℃로, 다시 175℃로 프로그램화하였다. 주입기와 검출기 온도는 각각 250℃ 및 270℃로 하였다.
실시예 5 개선된 바이오디젤 특성들을 갖는 합성 연료 오일
다음의 지방산 메틸 에스테르의 혼합물을 갖는 합성 연료 오일 지방산 조성물을 제조하였다: 73.3% 올레산, 21.4% 리놀레산, 2.2% 팔미트산, 2.1% 리놀렌산 및 1.0% 스테아르산 (모두 중량%). 정제된 지방산 메틸 에스테르를 Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN, USA로부터 얻었다. 이 조성물의 세탄가 및 점화 지연은 Ignition Quality Tester("IQT") 613을 사용하여 Southwest Research Institute(Southwest Research Institute, San Antonio, Texas, USA)에 의뢰하여 결정하였다.
IQT는 전기적으로 가열되는 정압 연소실(constant volume combustion chamber), 연료 주입 시스템, 및 실험을 조절하고, 데이터를 기록하고, 그리고 데이터 해석을 제공하는데 사용되는 컴퓨터로 구성된다. 상기 연료 주입 시스템은 상기 연소실로의 진입통로를 형성하는 연료 주입 노즐을 포함한다. 상기 연료 주입 노즐의 니들 리프트 센서는 연소실 내로의 연료 흐름을 검출한다. 연소실에 부착된 압력 전환기(pressure transducer)는 실린더 압력, 연소실 내의 압력을 측정한다. IQT의 기본적인 개념은 연소실 내로의 연료 주입 개시 시점으로부터 연소 개시까지의 시간 측정이다. 연소실의 열역학적인 조건들을 점화 지연 시간의 일정한 측정을 제공하기 위하여 정확하게 조절하였다.
세탄가 및 점화 지연 테스트를 위하여, 상기 테스트 연료를 5미크론 필터를 사용하여 여과하였다. 연료 저장소, 주입 라인 및 노즐을 가압 질소로 퍼지하였다. 다음으로 연료 저장소를 보풀 없는 천으로 청소하였다. 테스트 연료의 일부분을 연료 저장소, 주입 라인 및 노즐에 채우기 위하여 사용하였다. 저장소를 테스트 연료로 채우고, 모든 공기를 시스템으로부터 제거하였다. 저장소는 50psig의 압력으로 만들었다. 방법은 기본적으로 원하는 압력 및 온도로 공기로 충전한 연소실 내로 테스트 연료의 정확하게 계량된 양을 고압하에서 주입하는 것으로 구성된다. 측정 은 점화 지연 시간으로 종종 언급되는 주입 개시 시점으로부터 연소의 시작까지의 시간을 결정하는 것으로 구성된다. 이러한 결정은 측정된 니들 리프트 및 연소실 압력에 기초한다. 정상적인 세탄 등급화 과정(cetane rating procedure)은 567.5℃의 표면 온도 및 2.1Mpa의 공기압의 셋팅을 요구한다.
상기 유닛이 정상 파라미터들 내에서 작동하는 것을 보장하기 위하여, 공지된 주입 지연을 갖는 연료를 시험일의 시작 시점에서 IQT 연소 봄베(IQT combustion bomb)에서 운전시켰다. 그런 다음, 테스트 합성 연료를 운전시켰다. 시스템이 변화되지 않았다는 것을 확인하기 위하여, 상기 공지의 연료를 다시 운전시켰다. 연료 저장소가 연료 주입 펌프에 재연결되면, 테스트 과정을 PC 콘트롤러 상에서 개시하였다. 상기 컴퓨터 콘트롤러는 공기 충전, 연료 주입 및 배기 과정을 포함하는 모든 과정을 통제한다. 32회의 반복된 연소 과정을 수행하였다.
점화 지연은 주입시점부터 점화시점까지의 시간이다. 그것은 니들 리프트 및 실린더 압력 데이터로부터 결정하였다. 주입 니들의 상승은 주입 시작을 알려준다. 실린더 압력은 연료의 증기화의 냉각 효과에 기인하여 서서히 떨어진다. 연소의 개시는 실린더 압력의 회복 시간으로 규정되며, 연소에 기인하여 그것은 연료 주입 바로 전의 압력으로 증가된다.
다음으로, 측정된 점화 지연 시간을, 데이터 획득 및 환산 소프트웨 어(reduction software) 내로 통합된 캘리브레이션 커브에 기초하여 세탄가를 결정하기 위하여 사용하였다. 점화 지연 시간의 함수로서의 세탄가를 구성하는 캘리브레이션 커브를 초기 참고 연료 및 NEG 체크 연료의 블렌드를 사용하여 형성하였다. 주위 조건에서 액체인 테스트 연료의 경우에 있어서, 캘리브레이션 커브는 적어도 하나의 공지된 세탄가의 체크 연료를 사용하여 매일 체크하였다(Ryan, "Correlation of Physical and Chemical Ignition Delay to Cetane Number", SAE Paper 852103 (1985); Ryan, "Diesel Fuel Ignition Quality as Determined in a Constant Volume Combustion Bomb", SAE Paper 870586 (1986); Ryan, "Development of a Portable Fuel Cetane Quality Monitor", Belvoir Fuels and Lubricants Research Facility Report No. 277, May (1992); Ryan, "Engine and Constant Volume Bomb Studies of Diesel Ignition and Combustion", SAE Paper 881616 (1988); 및 Allard 등, "Diesel Fuel Ignition Quality as Determined in the Ignition Quality Tester ("IQT")", SAE Paper 961182 ( 1996)). 표 3에 나타난 바와 같이, 합성 오일 조성물은 예를 들어, 제한되지는 않으나, 바이오디젤 오일로 사용하기에 적합한 세탄가 및 점화 지연을 나타낸다.
[표 3]
연료명 테스트 번호 세탄가 세탄가 표준편차 점화 지연 (ms) 점화 지연 표준편차
체크-하이1 체크-하이 1777 1778 49.55 49.33 0.534 0.611 4.009 4.028 0.044 0.051
평균 49.4 4.02
합성 오일 합성 오일 합성 오일 1779 1780 1781 55.02 55.65 55.63 1.897 1.807 1.649 3.622 3.583 3.583 0.116 0.109 0.098
평균 55.4 3.60
체크-하이 1786 49.2 0.727 4.04 0.061
1"체크-하이"로 명명된 연료는 캘리브레이션 연료이다. 그것은 49.3±0.5의 세탄가를 가져야 한다. 상기 유닛은 합성 테스트 연료를 운전하기 전과 후에 캘리브레이션으로 체크하였다.
밀도(ASTM D-4052), 클라우드점(ASTM D-2500), 유동점(ASTM D- 97), 및 저온 필터 막힘점(IP 309/ASTM D-6371)을 ASTM D 프로토콜을 사용하여 합성 오일에 대하여 결정하였다. ASTM D 프로토콜은 ASTM, 100 Barr Harbor Drive, West Conshohocken, PA, USA로부터 얻었다. 이러한 테스트들의 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타난 바와 같이, 합성 오일 조성물은, 예를 들어, 제한되지는 않으나, 바이오디젤 오일로 사용하기에 적합한 수치를 나타낸다.
[표 4]
테스트 방법 결과
밀도 ASTM D-4052 0.8791g/mL
클라우드점 ASTM D-2500 -18℃
유동점 ASTM D- 97 -21℃
저온 필터 막힘점 IP 309(ASTM D-6371과 동일) -21℃
산화질소의 방출 수준을, 생물계 연료의 불포화 수준을 평가하거나, 또는 연료 밀도를 측정하여, 방출 수준을 간접적으로 계산하거나, 또는 직접적으로 측정하는 것에 의하여 평가하였다. 또한, 산화질소 방출의 수준을 직접적으로 측정하기 위하여 이용가능한 표준 프로토콜이 존재한다. 합성 오일은 합성 오일 내의 전체적인 불포화 수준의 평가에 기초하여, 종래의 대두 오일로부터 제조되는 지방산의 메틸 에스테르보다 낮은 산화질소 방출 수준을 갖는 것으로 평가된다. 더 많은 수의 이중 결합을 포함하는, 즉, 더 높은 불포화도를 갖는 오일은 더 높은 산화질소 방출을 보이는 경향이 있다. 표 5에 나타난 바와 같이, 종래의 대두 오일의 총 153개의 이중결합과 비교하여, 상기 오일은 총 123개의 이중결합을 갖는다.
[표 5]
합성 오일
73% 올레산 (18:1) x 1 이중결합 = 73 22% 리놀레산 (18:2) x 2 이중결합 = 44 2% 리놀렌산 (18:3) x 3 이중결합 = 6 총 이중결합 123
종래 대두 오일
23% 올레산 (18:1) x 1 이중결합 = 23 53% 리놀레산 (18:2) x 2 이중결합 = 106 8% 리놀렌산 (18:3) x 3 이중결합 = 24 총 이중결합 153
The National Renewable Energy Laboratory, Contract No. ACG-8-17106-02 Final Report, The Effect Of Biodiesel Composition On Engine Emissions From ADDC Series 60 Diesel Engine, (June 2000)에서 보고된 바와 같이, 바이오디젤 조 성물의 산화질소 방출은 식 y = 46.959x - 36.388으로 나타낼 수 있으며, 여기에서, y는 grams/brake horse power hours단위로 표시되는 산화물의 방출이고; x는 바이오디젤의 밀도이다. 상기 식은 16종의 바이오디젤 연료에 대한 테스트에서 얻어진 질산 방출 데이터의 회귀 분석에 기초를 두고 있다. 상기 테스트는 1991 calibration, production series 60 model Detroit Diesel Corporation engine을 사용하여 수행되었다.
합성 오일의 밀도는 ASTM D4052를 사용하여 Southwest Research Institute에 의뢰하여 결정하였다. 표 4에 나타난 결과를 상기 식에 사용하여, 산화질소 방출 값 4.89g/bhp-h를 예측하였다. 이 결과를 대조군 대두 생산물과 비교하였다. National Renewable Energy Laboratory의 보고서는 콩에 기초를 둔 대조군 바이오디젤(메틸 콩 에스테르 IGT)의 밀도 및 산화질소 방출을 제공한다. 상기 대조군 바이오디젤의 밀도는 0.8877g/mL이고, 이를 이용하여 계산된 산화질소 방출은 5.30g/bhp-h으로 주어졌다. 이러한 계산된 방출 값은 산화질소 방출에 대한 실험값인 5.32g/bhp-h와 유사하다. 합성 오일 조성물은 대조군과 비교하여 개선된 값을 나타내며, 예를 들어, 제한되지는 않으나, 바이오디젤 오일로서 사용하기에 적합하다.
실시예 6 건강한 혈청 지질 수준을 위한 최적의 지방산 조성
종래의 대두 오일보다 혈청 지질 수준에 더 우수한 효과를 갖는 지방산 조성 을 확인하기 위하여(즉, 낮은 LDL-콜레스테롤 및 높은 HDL-콜레스테롤), 식물성 조성물의 콜레스테롤 저감 특성을 결정하였다. 인간 혈청 지질 수준에 대한 신규한 종자 오일 조성물의 효과와 정상 대두 오일의 효과를 비교하기 위하여, 27차례의 임상시험에 기초를 둔 공개된 식(Mensink, R.P.와 Katan, M.B. Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:911~919 (1992))을 사용하였다.
아래 표 6은, 탄수화물로부터의 다이어트 에너지의 30%가 지질로 치환된 경우에 혈청 지질 수준에서의 변화의 결과를 나타낸다. 결과는, 음식에서 탄수화물이 대두 오일로 대체될 때, 혈청 지질에 대한 더 나은 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 이러한 조성의 개선은 포화 지방 수준을 저감하고, 리놀레산 수준을 총 지방산의 10~30%, 바람직하게는 총 지방산의 15~25%로 획득하므로써 가능하게 된다. 리놀레산의 비율이 총 지방산의 10% 미만일 때, 신규 조성물은 대조군 대두 오일과 비교하여, 포화 지방 함량이 총 지방산의 5%로 낮아지더라도 LDL-콜레스테롤을 증가시킨다. 리놀레산의 비율이 증가될 때, 혈청 HDL 수준을 증가시키기 위한 조성물의 능력은 감소된다. 따라서, 바람직한 리놀레산 조성은 총 지방산의 약 15~25%가 되게 결정하였다.
[표 6]
지방산 혈청 지질
C16 :0 C18 :0 C18 :1 C18 :2 C18 :3 기타 ( C20 :1)
콩 대조군 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 11.000 3.300 4.224 1.551 4.000 1.200 1.536 0.564 23.400 7.020 1.685 2.387 53.200 15.960 8.778 4.469 7.800 2.340 1.287 0.655 0.600 0.180 0.043 0.061 -6.033 9.687
3% 18:2, <6% 포화 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) 대(vs.) 대조군 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) 3.000 0.900 1.152 0.423 2.000 0.600 0.768 0.282 85.000 25.500 6.120 8.670 3.000 0.900 0.495 0.252 3.000 0.900 0.495 0.252 4.000 1.200 0.288 0.408 -5.478 0.555 10.287 0.600
10% 18:2, <6% 포화 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) 3.000 0.900 1.152 0.423 2.000 0.600 0.768 0.282 72.000 21.600 5.184 7.344 10.000 3.000 1.650 0.840 3.000 0.900 0.495 0.252 10.000 3.000 0.720 1.020 -6.129 -0.096 10.161 0.474
20% 18:2, <6% 포화 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) 3.000 0.900 1.152 0.423 2.000 0.600 0.768 0.282 65.000 19.500 4.680 6.630 20.000 6.000 3.300 1.680 3.000 0.900 0.495 0.252 7.000 2.100 0.504 0.714 -7.059 -1.026 9.981 0.294
21% 18:2, <3.2% 포화 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) 2.000 0.600 0.768 0.282 1.000 0.300 0.384 0.141 72.000 21.600 5.184 7.344 21.000 6.300 3.465 1.764 1.000 0.300 0.165 0.084 3.000 0.900 0.216 0.306 -7.878 -1.845 9.921 0.234
30% 18:2, <6% 포화 (%) 30% 지방 E의 비율 (%) LDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) HDL 계산값 (mg/dl) 대 대조군 (mg/dl) 3.000 0.900 1.152 0.423 2.000 0.600 0.768 0.282 57.000 17.100 4.104 5.814 30.000 9.000 4.950 2.520 3.000 0.900 0.495 0.252 5.000 1.500 0.360 0.510 -7.989 -1.956 9.801 0.114
실시예 7
다음의 14단계들은 대두에서 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들의 억제 및 Δ-9 탈포화효소를 과발현시키기 위한 식물 형질전환용으로 설계된 벡터 pMON68537의 구성을 설명한다. 특히, 상기 구조물은 대두 센스 방향 인트론 및 3' UTR들, 즉, FAD2-1A 인트론 #1, FAD3 -1A 3' UTR, FATB -1 3' UTR, 헤어핀 루프-형성 스플라이싱 가능 인트론, 및 대두 안티센스 방향 인트론 및 3' UTR들의 상보적인 시리즈들, 즉, FATB -1 3' UTR, FAD3 -1A 3' UTR 및 FAD2 -1A 인트론 #1 및 Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터에 작동가능하게 연결된 7Sα프로모터를 포함한다.
단계 1 - dsRNAi 구조물의 스플라이싱 가능 인트론 부분으로 작용하는 대두 FAD3-1A 인트론 #5를 대두 게놈 DNA를 주형으로 하여 다음의 프라이머들로 PCR 증폭시켰다:
5' 프라이머 = 19037 =
ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCACTGCAGTGGATATTGTTTAAACATAGCTAGCATATTACGCGTATATTATACAAGCTTATATTCCCGGGATATTGTCGACATATTAGCGGTACATTTTATTGCTTATTCAC
3' 프라이머 = 19045 =
ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCTGCAGGATATTCTCGAGATATTCACGGTAGTAATCTCCAAGAACTGGTTTTGCTGCTTGTGTCTGCAGTGAATC.
이러한 프라이머들은 5' 및 3' 말단에 클로닝 사이트들을 첨가한다. 5' 말단: SpeⅠ, SacⅠ, BstⅩⅠ, PmeⅠ, NheⅠ, MluⅠ, HindⅢ, XmaⅠ, SmaⅠ, SalⅠ. 3' 말단: SpeⅠ, SacⅠ, Sse8387Ⅰ, XhoⅠ. 대두 FAD3 -1A 인트론 #5 PCR 산물을 pCR2.1 내로 클로닝하여, KAWHIT03.0065를 얻었다. 다음으로, KAWHIT03.0065를 SpeⅠ으로 절단하고, 말단을 Pfu 폴리머라아제로 채우고, pMON68526(비어있는 클로람페니콜(이하, CM) 저항성 벡터)를 HindⅢ로 절단하고, 말단을 Pfu 폴리머라아제로 채웠다. 다음으로, pMON68541(Amp 저항성 벡터 내에 다중 클로닝 사이트를 갖는 FAD3-1A 인트론 #5)를 얻기 위하여, KAWHIT03.0065와 pMON68526를 라이게이션시켰다.
단계 2 - 대두 FATB -1 3' UTR을 다음의 프라이머들로 증폭시켰다:
18662 = TTTTAATTACAATGAGAATGAGATTTACTGC(5' 말단에 Bsp120Ⅰ을 첨가) 및 18661 = GGGCCCGATTTGAAATGGTTAACG. 다음으로, KAWHIT03.0036을 얻기 위하여 PCR 산물을 pCR2.1 내로 라이게이션시켰다.
단계 3 - 다음으로, KAWHIT03.0036를 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ로 절단하고, KAWHIT03.0037(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 FATB -1 3' UTR)을 제조하기 위하여, KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 클로닝하였다.
단계 4 - 대두 FAD3 -1A 3' UTR을 다음의 프라이머들로 증폭시켰다:
18639 = GGGCCCGTTTCAAACTTTTTGG(5' 말단에 Bsp120Ⅰ을 첨가) 및 18549 = TGAAACTGACAATTCAA. 다음으로, KAWHIT03.0034를 제조하기 위하여, PCR 산물을 pCR2.1 내로 라이게이션시켰다.
단계 5 - KAWHIT03.0034를 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ로 절단시키고, 다음으로, KAWHIT03.0035(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 FAD3 -1A 3' UTR)를 제조하기 위하여, KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 라이게이션시켰다.
단계 6 - 대두 FAD2 -1A 인트론 #1을 대두 게놈 DNA를 주형으로 하여 다음의 프라이머들로 PCR 증폭시켰다: 5' 프라이머 = 18663 = GGGCCCGGTAAATTAAATTGTGC(5' 말단에 Bsp120Ⅰ 사이트를 첨가); 및 3' 프라이머 = 18664 = CTGTGTCAAAGTATAAACAAGTTCAG. 결과의 PCR 산물을 pCR2.1 내로 클로닝하여, KAWHIT03.0038를 얻었다.
단계 7 - KAWHIT03.0038 내의 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 PCR 산물을 제한 사이트 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ을 사용하여 KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 클로닝시켰다. 결과의 플라스미드는 KAWHIT03.0039(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 대두 FAD2 -1A 인트론 #1)이다.
단계 8 - KAWHIT03.0039를 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, pMON68541(FAD3-1A 인트론 #5 dsRNAi AMP 저항성 기초 벡터)를 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0071(대두 FAD3 -1A 인트론 #5를 갖는 대두 FAD2 -1A 인트론 #1)을 생성시키기 위하여, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1을 pMON68541 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 9 - KAWHIT03.0035(CM 저항성 벡터 내의 FAD3 -1A 3' UTR)를 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, KAWHIT03.0071(FAD2 -1A 인트론 및 FAD3 -1A 인트론 #5 dsRNAi AMP 저항성 기초 벡터)을 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0072(대두 FAD2 -1A 인트론 #1 및 대두 FAD3 -1A 인트론 #5를 가진 FAD3 -1A 3' UTR)를 형성시키기 위하여, 대두 FAD3 -1A 3' UTR을 KAWHIT03.0071 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 10 - KAWHIT03.0037(CM 저항성 벡터 내의 FATB -1 3' UTR)을 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, KAWHIT03.0072를 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0073(대두 FAD2 -1A 인트론, FAD3 -1A 3' UTR, FAD3 -1A 인트론 #5를 가진 FATB-1 3' UTR)을 제조하기 위하여, FATB -1 3' UTR을 KAWHIT03.0072 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 11 - KAWHIT03.0073을 BstⅩⅠ 및 SalⅠ로 절단하고, FAD2 -1A 인트론, FAD3-1A 3' UTR 및 FATB -1 3' UTR을 포함하는 단편을 겔로 정제하였다. 다른 튜브 에서, KAWHIT03.0073을 XhoⅠ 및 Sse8387Ⅰ로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0074(대두 FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FA TB-1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스)를 제조하기 위하여, 인트론/3' UTR 단편을 KAWHIT03.0O73 내의 대두 FAD3 -1A 인트론 #5의 다른 사이트 상에 반대 방향으로 역(back) 클로닝시켰다.
단계 12 - dsRNAi 구조물을 7Sα' 프로모터 및 TML 3'과 연결시키기 위하여, KAWHIT03.0074 및 pMON68527(7Sα'/TML 3' 카세트)을 SacⅠ로 절단시키고, pMON68563(7Sα' 프로모터 - FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3-1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스 - TML 3')을 제조하기 위하여, 함께 라이게이션시켰다.
단계 13 - 어셈블리된 dsRNAi 구조물을 pMON70682 내로 도입시키기 위하여, pMON68563 및 pMON70682를 NotⅠ로 절단시키고, FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3-1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2-1A 인트론 #1 안티-센스 및 TML 3' 터미네이터의 이중-가닥 RNA-형성 구조물에 작동가능하게 연결된 7Sα' 프로모터를 포함하는 pMON68536을 형성시키기 위하 여, 함께 라이게이션시켰다.
단계 14 - 다음으로, pMON68536을 AscⅠ 및 RsrⅡ로 절단시키고, pMON68529(FMV 프로모터 및 RBCS 3'에 융합된 선별 가능한 마커 CP4 및 Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터를 포함)를 SanDⅠ 및 AscⅠ로 절단시켰다. 다음으로, pMON68537(FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스 및 TML 3' 터미네이터의 이중-가닥 RNA-형성 구조물에 작동가능하게 연결된 7Sα' 프로모터 및 Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터)을 형성시키기 위하여, pMON68536의 dsRNAi 부분을 pMON68529 내로 직접 클로닝시켰다.
실시예 8
다음의 15단계들은 대두에서 FAD2, FAD3 및 FATB 유전자들의 억제 및 Δ-9 탈포화효소 및 KASⅣ 효소를 과발현시키기 위한 식물 형질전환용으로 설계된 벡터 pMON68539의 구성(도 22)을 설명한다. 특히, 상기 구조물은 대두 센스-방향 인트론 및 3' UTR들, 즉, FAD2 -1A 인트론 #1, FAD3 -1A 3' UTR, FATB -1 3' UTR, 헤어핀 루프-형성 스플라이싱 가능 인트론, 및 대두 안티센스 방향 인트론 및 3' UTR들의 상보적인 시리즈들, 즉, FATB -1 3' UTR, FAD3 -1A 3' UTR 및 FAD2 -1A 인트론 #1, Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터, 및 KASⅣ를 작동시키는 나핀 프로모터에 작동가능하게 연결된 7Sα프로모터를 포함한다.
단계 1 - dsRNAi 구조물의 스플라이싱 가능 인트론 부분으로 작용하는 대두 FAD3-1A 인트론 #5를 대두 게놈 DNA를 주형으로 하여 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭시켰다:
5' 프라이머 = 19037 =
ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCACTGCAGTGGATATTGTTTAAACATAGCTAGCATATTACGCGTATATTATACAAGCTTATATTCCCGGGATATTGTCGACATATTAGCGGTACATTTTATTGCTTATTCAC
3' 프라이머 = 19045 =
ACTAGTATATTGAGCTCATATTCCTGCAGGATATTCTCGAGATATTCACGGTAGTAATCTCCAAGAACTGGTTTTGCTGCTTGTGTCTGCAGTGAATC.
이러한 프라이머들은 5' 및 3' 말단에 클로닝 사이트들을 첨가한다. 5' 말단: SpeⅠ, SacⅠ, BstⅩⅠ, PmeⅠ, NheⅠ, MluⅠ, HindⅢ, XmaⅠ, SmaⅠ, SalⅠ. 3' 말단: SpeⅠ, SacⅠ, Sse8387Ⅰ, XhoⅠ. 대두 FAD3 -1A 인트론 #5 PCR 산물을 pCR2.1 내로 클로닝하여, KAWHIT03.0065를 얻었다. 다음으로, KAWHIT03.0065를 SpeⅠ으로 절단하고, 말단을 Pfu 폴리머라아제로 채우고, pMON68526(비어있는 CM 저항 성 벡터)을 HindⅢ으로 절단하고, 말단을 Pfu 폴리머라아제로 채웠다. 다음으로, pMON68541(Amp 저항성 벡터 내에 다중 클로닝 사이트를 갖는 대두 FAD3 -1A 인트론 #5)을 얻기 위하여, KAWHIT03.0065와 pMON68526을 라이게이션시켰다.
단계 2 - 대두 FATB -1 3' UTR을 다음의 프라이머들로 증폭시켰다:
18662 = TTTTAATTACAATGAGAATGAGATTTACTGC(5' 말단에 Bsp120Ⅰ을 첨가) 및 18661 = GGGCCCGATTTGAAATGGTTAACG. 다음으로, KAWHIT03.0036을 얻기 위하여 PCR 산물을 pCR2.1 내로 라이게이션시켰다.
단계 3 - 다음으로, KAWHIT03.0036을 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ로 절단하고, KAWHIT03.0037(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 FATB -1 3' UTR)을 제조하기 위하여, KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 클로닝시켰다.
단계 4 - 대두 FAD3 -1A 3' UTR을 다음의 프라이머들로 증폭시켰다:
18639 = GGGCCCGTTTCAAACTTTTTGG(5' 말단에 Bsp120Ⅰ을 첨가) 및 18549 = TGAAACTGACAATTCAA. 다음으로, KAWHIT03.0034를 제조하기 위하여, PCR 산물을 pCR2.1 내로 라이게이션시켰다.
단계 5 - KAWHIT03.0034를 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ으로 절단시키고, 다음으로, KAWHIT03.0035(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 FAD3 -1A 3' UTR)를 제조하기 위하여, KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 라이게이션시켰다.
단계 6 - 대두 FAD2 -1A 인트론 #1을 대두 게놈 DNA를 주형으로 하여 다음의 프라이머들로 PCR 증폭시켰다: 5' 프라이머 = 18663 = GGGCCCGGTAAATTAAATTGTGC(5' 말단에 Bsp120Ⅰ 사이트를 첨가); 및 3' 프라이머 = 18664 = CTGTGTCAAAGTATAAACAAGTTCAG. 결과의 PCR 산물을 pCR2.1 내로 클로닝하여, KAWHIT03.0038을 얻었다.
단계 7 - KAWHIT03.0038 내의 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 PCR 산물을 제한 사이트 Bsp120Ⅰ과 EcoRⅠ을 사용하여 KAWHIT03.0032(다중 클로닝 사이트를 갖는 비어있는 CM 저항성 벡터) 내로 클로닝시켰다. 결과의 플라스미드는 KAWHIT03.0039(비어있는 CM 저항성 벡터 내의 대두 FAD2 -1A 인트론 #1)이다.
단계 8 - KAWHIT03.0039를 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, pMON68541(FAD3 -1A 인트론 #5 dsRNAi AMP 저항성 기초 벡터)을 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0071(대두 FAD3 -1A 인트론 #5를 갖는 대두 FAD2 -1A 인트론 #1)을 생성시키기 위하여, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1을 pMON68541(다중 클로닝 사이트를 갖는 Amp 저항성 벡터내의 FAD3 -1A 인트론 #5) 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 9 - KAWHIT03.0035(CM 저항성 벡터 내의 FAD3 -1A 3' UTR)를 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, KAWHIT03.0071(FAD2 -1A 인트론 및 FAD3 -1A 인트론 #5 dsRNAi AMP 저항성 기초 벡터)을 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0072(대두 FAD2 -1A 인트론 #1 및 대두 FAD3 -1A 인트론 #5를 가진 FAD3 -1A 3' UTR)를 형성시키기 위하여, 대두 FAD3 -1A 3' UTR을 KAWHIT03.0071 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 10 - KAWHIT03.0037(CM 저항성 벡터 내의 FATB -1 3' UTR)을 AscⅠ과 HindⅢ으로 절단하고, KAWHIT03.0072를 MluⅠ과 HindⅢ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0073(대두 FAD2 -1A 인트론, FAD3 -1A 3' UTR, FAD3 -1A 인트론 #5를 가진 FATB-1 3' UTR)을 제조하기 위하여, FATB -1 3' UTR을 KAWHIT03.0072 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 11 - KAWHIT03.0073을 BstⅩⅠ 및 SalⅠ으로 절단하고, FAD2 -1A 인트론, FAD3 -1A 3' UTR 및 FATB -1 3' UTR을 포함하는 단편을 겔로 정제하였다. 다른 튜브에서, KAWHIT03.0073을 XhoⅠ 및 Sse8387Ⅰ으로 절단하였다. 다음으로, KAWHIT03.0074(대두 FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FA TB-1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스)를 제조하기 위하여, 인트론/3' UTR 단편을 KAWHIT03.0O73 내의 대두 FAD3 -1A 인트론 #5의 다른 사이트 상에 반대 방향으로 역 클로닝시켰다.
단계 12 - dsRNAi 구조물을 7Sα' 프로모터 및 TML 3'과 연결시키기 위하여, KAWHIT03.0074 및 pMON68527(7Sα'/TML 3' 카세트)를 SacⅠ으로 절단시키고, pMON68563(7Sα' 프로모터 - FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3-1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스 - TML 3')을 제조하기 위하여, 함께 라이게이션시켰다.
단계 13 - 어셈블리된 dsRNAi 구조물을 pMON70682 내로 도입시키기 위하여, pMON68563 및 pMON70682를 NotⅠ으로 절단시키고, FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3-1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2-1A 인트론 #1 안티-센스 및 TML 3' 터미네이터의 이중-가닥 RNA-형성 구조물에 작동가능하게 연결된 7Sα' 프로모터를 포함하는 pMON68536을 형성시키기 위하여, 함께 라이게이션시켰다.
단계 14 - 다음으로, pMON68536를 AscⅠ 및 RsrⅡ로 절단시키고, pMON68529(FMV 프로모터 및 RBCS 3'에 융합된 선별 가능한 마커 CP4 및 Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터를 포함)를 SanDⅠ 및 AscⅠ으로 절단시켰다. 다음으로, pMON68537(FAD2 -1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스 및 TML 3' 터미네이터의 이중-가닥 RNA-형성 구조물에 작동가능하게 연결된 7Sα' 프로모터 및 Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터)를 형성시키기 위하여, pMON68536의 dsRNAi 부분을 pMON68529 내로 직접 클로닝시켰다.
단계 15 - 다음으로, pMON68537을 SanDⅠ 및 AscⅠ으로 절단시키고, pMON70683(KasⅣ를 작동시키는 나핀)을 AscⅠ 및 RsrⅡ로 절단시켰다. pMON68539(FAD2-1A 인트론 #1 센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 센스, 대두 FATB -1 3' UTR 센스, 스플라이싱 가능 대두 FAD3 -1A 인트론 #5, 대두 FATB -1 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD3 -1A 3' UTR 안티-센스, 대두 FAD2 -1A 인트론 #1 안티-센스 및 TML 3' 터미네이터의 이중-가닥 RNA-형성 구조물에 작동가능하게 연결된 7Sα' 프로모터, Δ-9 탈포화효소를 작동시키는 대두 FAD2 프로모터 및 KasⅣ를 작동시키는 나핀 프로모터)를 제조하기 위하여, 나핀/KasⅣ 단편을 pMON68537 내로 직접 클로닝시켰다.
실시예 9
본 실시예에서는 억제된 유전자들을 갖는 대두 식물들을 생산하기 위한 식물 형질전환을 설명한다.
Δ12 탈포화효소, Δ15 탈포화효소, 및 FATB 유전자들을 억제하기 위하여 대두 내에 인트론/3' UTR 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입시키기 위하여, 실시예 7에서 제조된 형질전환 벡터 pMON68537를 사용하였다. 또한, 벡터 pMON68537은 Δ-9 탈포화효소(FAB2) 및 CP4 유전자들을 포함한다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
지방산 조성은 인트론/3' UTR dsRNAi 발현 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 분석되었다. R1 풀(pool) 종자 및 R1 단일 종자 오일 조성은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여, 형질전환 대두 계통으로부터의 종자의 오일 내의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성이 변화되었다는 것을 보여준다(표 7 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공하고; FAD3 억제는 감소된 리놀렌산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공하고; 그리고, FATB 억제는 감소된 포화 지방산 에스테르 화합물들, 예를 들어, 팔미테이트 및 스테아레이트를 갖는 식물들을 제공한다. 선별은 이러한 계통들로부터 상대적인 원하는 지방산 조성에 따라 수행될 수 있다. 지방산 조성은 구조물들로 형질전환된 대두 계통들의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 분석된다.
실시예 10
본 실시예는 억제된 유전자들을 갖는 대두 식물들을 생산하기 위한 식물 형질전환을 설명한다.
Δ12 탈포화효소, Δ15 탈포화효소, 및 FATB 유전자들을 억제하기 위하여 대두 내에 인트론/3' UTR 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입시키기 위하여, 실시예 3에서 제조된 형질전환 벡터 pMON68539를 사용하였다. 또한, 벡터 pMON68539는 Kas Ⅳ 및 CP4 유전자들을 포함한다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별 가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
지방산 조성은 인트론/3' UTR dsRNAi 발현 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 분석되었다. R1 풀 종자 및 R1 단일 종자 오일 조성은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여, 형질전환 대두 계통으로부터의 종자의 오일 내의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성이 변화되었다는 것을 보여준다(표 8 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공하고; FAD3 억제는 감소된 리놀렌산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공하고; 그리고, FATB 억제는 감소된 포화 지방산 에스테르 화합물들, 예를 들어, 팔미테이트 및 스테아레이트를 갖는 식물들을 제공한다. 선별은 이러한 계통들로부터 상대적인 원하는 지방산 조성에 따라 수행될 수 있다. 지방산 조성은 구조물들로 형질전환된 대두 계통들의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 분석된다.
[표 7] pMON68537 계통들로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 18:1 18:3 16:0 18:0 18:2
PMON68537 GM_A36305 74.92 4.42 6.35 2.93 10.24
PMON68537 GM_A36305 74.8 4.33 6.57 2.93 10.23
PMON68537 GM_A36305 74.43 3.95 5.98 2.82 11.81
PMON68537 GM_A36305 73.32 3.99 6.79 3.24 11.48
PMON68537 GM_A36305 72.87 4.33 7.06 3.08 11.7
PMON68537 GM_A36305 16.63 9.53 13.5 4.06 55.31
PMON68537 GM_A36305 16.52 9.61 13.92 4.24 54.79
PMON68537 GM_A36305 15.67 9.66 13.64 4.19 55.89
PMON68537 GM_A36306 77.45 3.93 6.76 2.47 8.4
PMON68537 GM_A36306 74.51 4.38 6.58 2.47 10.94
PMON68537 GM_A36306 73.21 4.64 7.04 3.08 11.04
PMON68537 GM_A36306 72.78 4.4 6.97 2.55 12.21
PMON68537 GM_A36306 71.67 4.76 6.94 3.25 12.2
PMON68537 GM_A36306 71.01 4.86 7.64 3.05 12.41
PMON68537 GM_A36306 69.72 4.76 7.66 2.95 13.75
PMON68537 GM_A36306 17.41 8.88 13.35 3.85 55.63
PMON68537 GM_A36307 77.22 3.71 6.8 2.77 8.5
PMON68537 GM_A36307 76.79 3.65 6.76 2.85 8.75
PMON68537 GM_A36307 71.44 4.54 7.2 3.58 12.17
PMON68537 GM_A36307 18.83 8.62 13.94 4.02 53.61
PMON68537 GM_A36307 18.81 8.38 13.27 3.7 54.97
PMON68537 GM_A36307 15.68 9.97 14.06 4.55 54.79
PMON68537 GM_A36307 15.28 10.64 14.68 4.43 53.97
PMON68537 GM_A36307 14.08 9.36 14.39 4.31 56.89
PMON68537 GM_A36309 78.67 3.53 6.09 2.5 8.18
PMON68537 GM_A36309 75.43 3.96 6.7 2.53 10.3
PMON68537 GM_A36309 71.41 4.19 6.92 2.74 13.67
PMON68537 GM_A36309 70.51 4.14 6.85 3.16 14.33
PMON68537 GM_A36309 67.51 5.01 7.45 3.15 15.69
PMON68537 GM_A36309 66.99 4.92 7.15 3.9 15.79
PMON68537 GM_A36309 20.09 8.46 12.41 5 52.97
PMON68537 GM_A36309 15.15 9.73 14.61 3.85 55.79
PMON68537 GM_A36310 74.28 4.77 7.31 1.85 10.9
PMON68537 GM_A36310 74.03 5.43 8.23 1.63 9.66
PMON68537 GM_A36310 73.07 5.09 7.37 1.76 11.75
PMON68537 GM_A36310 71.83 5.04 7.78 1.86 12.54
PMON68537 GM_A36310 68.01 6.26 9.8 1.97 13.13
PMON68537 GM_A36310 67.22 6.28 8.71 3.28 13.45
PMON68537 GM_A36310 65.37 6.87 10.01 1.94 14.9
PMON68537 GM_A36310 15.76 10.09 13.4 4.28 55.52
PMON68537 GM_A36311 77.87 3.56 5.9 2.46 9.05
PMON68537 GM_A36311 75.8 3.87 5.91 2.93 10.22
PMON68537 GM_A36311 75.61 3.71 6.21 2.56 10.75
PMON68537 GM_A36311 73.68 4.06 6 3.09 11.98
PMON68537 GM_A36311 72.66 4.11 6.41 3.14 12.48
PMON68537 GM_A36311 70.89 4.39 6.52 3.11 13.93
PMON68537 GM_A36311 70.82 3.97 6.52 3.18 14.29
PMON68537 GM_A36311 16.67 9.39 13.65 4.44 54.77
PMON68537 GM_A36312 78.32 4.3 6.36 1.79 8.16
PMON68537 GM_A36312 77.55 4.46 6.51 2.13 8.23
PMON68537 GM_A36312 77.43 4.17 6.31 1.81 9.24
PMON68537 GM_A36312 76.98 4.29 6.25 2.27 9.05
PMON68537 GM_A36312 76.43 4.55 6.82 2.16 8.96
PMON68537 GM_A36312 76.38 4.5 6.46 2.04 9.54
PMON68537 GM_A36312 75.25 4.27 6.41 1.97 11.06
PMON68537 GM_A36312 18.24 9.43 13.6 3.07 54.75
PMON68537 GM_A36313 80.18 4.07 6.17 2.59 5.85
PMON68537 GM_A36313 79.96 4.16 6.03 2.59 6.11
PMON68537 GM_A36313 78.88 3.9 5.6 2.8 7.65
PMON68537 GM_A36313 78.76 3.92 5.44 2.91 7.82
PMON68537 GM_A36313 77.64 4.22 5.88 2.9 8.25
PMON68537 GM_A36313 76.15 4.14 6.06 3.13 9.42
PMON68537 GM_A36313 19.05 8.87 13.45 3.71 54.03
PMON68537 GM_A36313 18.47 8.46 13.13 3.63 55.41
PMON68537 GM_A36314 80.27 3.17 5.77 3.4 6.03
PMON68537 GM_A36314 79.66 3.24 5.72 3.19 6.91
PMON68537 GM_A36314 79.5 3.45 5.83 3.23 6.74
PMON68537 GM_A36314 77.42 3.52 5.76 3.57 8.42
PMON68537 GM_A36314 77.33 3.71 6.36 3.34 8.01
PMON68537 GM_A36314 76.83 3.71 6.38 3.24 8.59
PMON68537 GM_A36314 16.6 9.3 12.63 4.43 55.99
PMON68537 GM_A36314 15.26 8.59 13.71 4.54 56.84
PMON68537 GM_A36315 20.21 8.25 13.61 3.59 53.37
PMON68537 GM_A36315 17.47 9.22 13.46 3.35 55.57
PMON68537 GM_A36315 16.75 9.3 13.61 3.66 55.75
PMON68537 GM_A36315 16.54 9.18 13.54 3.88 55.9
PMON68537 GM_A36315 16.06 10.07 13.44 4.01 55.42
PMON68537 GM_A36315 16.05 9.58 12.82 4.25 56.29
PMON68537 GM_A36315 15.95 10.42 13.12 3.63 55.91
PMON68537 GM_A36315 15.5 10.22 13.25 3.78 56.3
PMON68537 GM_A36316 79.61 3.56 5.79 2.94 6.87
PMON68537 GM_A36316 75.11 4.01 6.45 3.44 9.76
PMON68537 GM_A36316 75.07 4.25 6.74 3.09 9.64
PMON68537 GM_A36316 73.92 3.97 6.53 3.56 10.75
PMON68537 GM_A36316 17.26 9.59 13.1 4.26 54.78
PMON68537 GM_A36316 17.15 9.03 12.81 4.04 55.97
PMON68537 GM_A36316 16.62 9.2 13.15 3.99 56.03
PMON68537 GM_A36316 16.6 9.44 13.19 3.95 55.84
PMON68537 GM_A36317 18.96 7.55 13.2 3.75 55.51
PMON68537 GM_A36317 16.19 9.43 13.33 3.96 56.04
PMON68537 GM_A36317 16.05 9.1 14.02 3.94 55.91
PMON68537 GM_A36317 15.33 9.4 13.91 4.22 56.11
PMON68537 GM_A36317 15.28 9.2 13.87 4.27 56.36
PMON68537 GM_A36317 14.58 10.15 13.74 4.38 56.15
PMON68537 GM_A36317 13.95 9.47 13.98 4.76 56.79
PMON68537 GM_A36317 13.91 9.88 14.26 4.62 56.25
PMON68537 GM_A36318 78.82 3.64 5.7 2.77 7.87
PMON68537 GM_A36318 77.94 3.73 5.9 2.94 8.29
PMON68537 GM_A36318 75.18 4.11 6.08 3.48 9.95
PMON68537 GM_A36318 75.1 3.93 6.02 3.04 10.75
PMON68537 GM_A36318 75.01 4.22 6.57 3.29 9.72
PMON68537 GM_A36318 74.17 4.2 6.51 3.27 10.68
PMON68537 GM_A36318 73.47 4.27 6.7 3.22 11.16
PMON68537 GM_A36318 30.57 10.54 14.83 5.55 36.92
PMON68537 GM_A36319 80 3.65 5.83 2.31 7.02
PMON68537 GM_A36319 79.89 3.65 5.64 2.35 7.26
PMON68537 GM_A36319 79.4 3.59 5.73 1.76 8.46
PMON68537 GM_A36319 78 3.87 6.11 2.35 8.5
PMON68537 GM_A36319 76.08 4.22 6.5 2.35 9.74
PMON68537 GM_A36319 75.56 3.89 6.41 1.78 11.3
PMON68537 GM_A36319 75.26 4.27 6.47 2.37 10.5
PMON68537 GM_A36319 75.16 4.1 6.48 2.49 10.66
PMON68537 GM_A36320 81.27 3.19 5.84 2.4 6.09
PMON68537 GM_A36320 80.21 3.27 5.18 2.44 7.76
PMON68537 GM_A36320 79.64 3.38 5.5 2.67 7.63
PMON68537 GM_A36320 79.46 3.38 5.82 2.67 7.42
PMON68537 GM_A36320 78.5 3.59 6.24 2.49 8
PMON68537 GM_A36320 73.83 3.79 6.72 2.78 11.74
PMON68537 GM_A36320 73.1 3.95 6.9 2.39 12.48
PMON68537 GM_A36320 22.99 8.03 12.19 4.81 50.89
PMON68537 GM_A36324 75.93 3.77 6.58 2.76 9.76
PMON68537 GM_A36324 75.1 4.05 7.01 2.83 9.8
PMON68537 GM_A36324 17.83 8.79 12.78 4.11 55.49
PMON68537 GM_A36324 16.46 8.88 12.84 4.48 56.29
PMON68537 GM_A36324 16.35 9.25 13.51 4.17 55.66
PMON68537 GM_A36324 15.25 8.99 13.73 4.28 56.69
PMON68537 GM_A36324 14.16 10.17 13.95 4.11 56.58
PMON68537 GM_A36324 13.59 9.87 14.61 4.5 56.33
PMON68537 GM_A36357 80.19 3.03 5.59 3.2 6.62
PMON68537 GM_A36357 79.78 3.19 5.51 3.24 6.89
PMON68537 GM_A36357 78.5 3.55 5.75 3.17 7.71
PMON68537 GM_A36357 77.48 3.68 5.71 3.55 8.23
PMON68537 GM_A36357 77.28 3.79 5.66 3.48 8.46
PMON68537 GM_A36357 77.1 3.51 5.43 3.65 8.99
PMON68537 GM_A36357 71.9 4.24 6.47 3.67 12.39
PMON68537 GM_A36357 17.66 9.32 13.26 4.21 54.51
PMON68537 GM_A36359 77.91 3.35 5.67 3.24 8.53
PMON68537 GM_A36359 77.85 3.29 5.42 3.29 8.87
PMON68537 GM_A36359 76.71 3.65 6.07 3.35 8.95
PMON68537 GM_A36359 71.73 4.01 6.79 3.49 12.68
PMON68537 GM_A36359 69.32 4.51 6.99 3.66 14.13
PMON68537 GM_A36359 68.63 4.44 6.91 3.76 14.89
PMON68537 GM_A36359 18.87 8.03 13.38 3.86 54.81
PMON68537 GM_A36359 16.81 9.83 13.08 4.68 54.55
PMON68537 GM_A36360 79.34 3.29 5.99 3.15 6.88
PMON68537 GM_A36360 75.42 3.47 6.47 3.08 10.26
PMON68537 GM_A36360 75.3 3.86 6.69 3.2 9.64
PMON68537 GM_A36360 74.51 3.8 6.39 3.32 10.67
PMON68537 GM_A36360 21.49 6.95 13.07 3.92 53.46
PMON68537 GM_A36360 20.05 7.4 13.09 3.83 54.57
PMON68537 GM_A36360 16.08 9.14 13.02 4.64 56.03
PMON68537 GM_A36360 15.86 9.07 13.44 4.49 56.04
PMON68537 GM_A36361 82.13 2.83 5.67 3.13 4.81
PMON68537 GM_A36361 80.99 3.2 5.79 3.01 5.64
PMON68537 GM_A36361 74.39 3.85 6.33 3.5 10.59
PMON68537 GM_A36361 18.01 8.46 13.18 3.92 55.41
PMON68537 GM_A36361 17.99 8.11 13.05 4.09 55.7
PMON68537 GM_A36361 17.35 8.31 13.4 4 55.88
PMON68537 GM_A36361 16.81 10.2 12.9 4.32 54.87
PMON68537 GM_A36361 16.55 8.5 13.21 4.22 56.45
PMON68537 GM_A36362 78.05 3.89 6.29 2.81 7.76
PMON68537 GM_A36362 76.89 3.69 6.32 3.12 8.76
PMON68537 GM_A36362 76.1 4 6.57 3.02 9.24
PMON68537 GM_A36362 76.01 4.08 6.24 3.03 9.48
PMON68537 GM_A36362 75.86 3.76 5.68 3.56 9.95
PMON68537 GM_A36362 75.79 4.07 6.43 3.15 9.34
PMON68537 GM_A36362 74.89 4.14 6.63 3.11 10.07
PMON68537 GM_A36362 17.22 8.8 13.75 3.77 55.54
PMON68537 GM_A36363 79.15 3.57 6.2 3.03 6.84
PMON68537 GM_A36363 75.69 3.83 7.07 2.73 9.53
PMON68537 GM_A36363 73.97 4.22 6.82 3.39 10.33
PMON68537 GM_A36363 72.53 4.31 6.64 3.7 11.59
PMON68537 GM_A36363 68.42 4.5 7.05 3.95 14.79
PMON68537 GM_A36363 18.39 8.7 13.61 4.1 54.28
PMON68537 GM_A36363 17.54 8.87 14.08 4.07 54.56
PMON68537 GM_A36363 15.87 9.66 14.56 4.2 54.69
PMON68537 GM_A36365 78.79 3.11 5.87 1.27 9.9
PMON68537 GM_A36365 76.76 3.86 5.79 1.66 10.91
PMON68537 GM_A36365 75.41 3.49 6.06 1.83 12.15
PMON68537 GM_A36365 73.57 3.65 6.11 1.5 14.19
PMON68537 GM_A36365 71.55 3.56 6.62 1.24 16.08
PMON68537 GM_A36365 70.41 4 6.07 2.15 16.33
PMON68537 GM_A36365 66.66 3.9 6.84 1.5 20.21
PMON68537 GM_A36365 63.96 4.22 7.08 2.27 21.52
PMON68537 GM_A36366 75.44 4.33 6.49 3.21 9.32
PMON68537 GM_A36366 74.75 4.21 6.87 2.71 10.33
PMON68537 GM_A36366 74.69 4.65 6.91 3.06 9.65
PMON68537 GM_A36366 73.23 4.89 7.23 2.99 10.52
PMON68537 GM_A36366 72.53 4.76 7.42 3.26 10.85
PMON68537 GM_A36366 67.15 5.05 7.47 3.33 15.87
PMON68537 GM_A36366 65.81 5.6 7.9 3.37 16.09
PMON68537 GM_A36366 62.31 6.19 8.71 3.22 18.55
PMON68537 GM_A36367 80.56 3.3 6.07 2.58 6.34
PMON68537 GM_A36367 77.78 3.58 6.47 2.66 8.45
PMON68537 GM_A36367 77.78 3.46 6.25 2.84 8.51
PMON68537 GM_A36367 77.39 3.81 6.71 2.86 8.11
PMON68537 GM_A36367 77.32 3.74 6.17 3.12 8.47
PMON68537 GM_A36367 75.93 3.97 6.23 3.43 9.29
PMON68537 GM_A36367 72.82 4.09 6.85 3.25 11.88
PMON68537 GM_A36367 19.31 7.58 13.7 3.59 55
PMON68537 GM_A36410 21.67 7.62 13.38 3.43 53.1
PMON68537 GM_A36410 20.9 8.33 12.93 3.64 53.33
PMON68537 GM_A36410 20.21 8.04 13.28 3.86 53.66
PMON68537 GM_A36410 20.02 8.71 12.79 3.71 53.87
PMON68537 GM_A36410 18.96 8.95 13.3 3.77 54.15
PMON68537 GM_A36410 18.18 8.98 13.56 3.74 54.66
PMON68537 GM_A36410 17.61 9.29 12.93 4.12 55.13
PMON68537 GM_A36410 16.78 9.8 13.78 3.92 54.83
PMON68537 GM_A36411 75.06 4.33 6.49 2.93 10.08
PMON68537 GM_A36411 74.32 4.46 6.76 2.96 10.38
PMON68537 GM_A36411 73.41 4.76 6.91 3.11 10.78
PMON68537 GM_A36411 73.24 4.87 7.28 2.89 10.67
PMON68537 GM_A36411 22.38 8.17 13.47 3.6 51.51
PMON68537 GM_A36411 18.26 9.07 14.14 3.81 54.02
PMON68537 GM_A36411 17.52 10.1 13.1 4.03 54.36
PMON68537 GM_A36411 17.02 9.71 13.45 4.02 54.89
A3244 A3244 18.29 7.79 13.69 4.15 55.08
A3244 A3244 17.54 8.19 13.32 4.32 55.57
A3244 A3244 17.13 8.13 13.21 4.46 56.04
A3244 A3244 15.47 9.56 13.04 4.43 56.46
A3244 A3244 15.17 8.95 13.79 4.3 56.78
A3244 A3244 15.05 9.03 14.16 4.01 56.8
A3244 A3244 13.51 10.07 12.95 5.07 57.3
A3244 A3244 13.49 9.91 13.31 4.56 57.67
[표 8] pMON68539 계통들로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON68539 GM_A36448 4.51 2.65 79.64 8.66 3.55
PMON68539 GM_A36448 4.62 2.64 78.35 9.99 3.77
PMON68539 GM_A36448 5.89 2.65 76.86 9.79 3.84
PMON68539 GM_A36448 4.92 2.62 72.61 14.61 4.01
PMON68539 GM_A36448 5.48 2.86 71.07 15.63 4.16
PMON68539 GM_A36448 13.5 4.2 16.28 56.86 8.29
PMON68539 GM_A36448 14.49 4.67 14.88 56.56 9.07
PMON68539 GM_A36449 5.16 2.42 81.91 6.54 3.12
PMON68539 GM_A36449 4.26 2.41 79.99 8.4 3.94
PMON68539 GM_A36449 4.26 2.72 79.07 9.32 3.38
PMON68539 GM_A36449 5.01 2.54 75.71 11.94 3.9
PMON68539 GM_A36449 4.34 2.76 75.07 12.75 4.16
PMON68539 GM_A36449 11.57 3.52 44.08 35.22 4.98
PMON68539 GM_A36449 13.42 3.84 21.35 52.38 8.17
PMON68539 GM_A36449 13.25 3.99 15.3 57.6 9.04
PMON68539 GM_A36450 3.28 2.6 82.21 7.26 3.95
PMON68539 GM_A36450 4.16 2.51 80.93 7.72 3.76
PMON68539 GM_A36450 4.3 3.42 78.78 8.43 4.22
PMON68539 GM_A36450 4.84 3.16 77.07 9.6 4.22
PMON68539 GM_A36450 5.11 3.1 75.21 10.98 4.49
PMON68539 GM_A36450 13.74 4.26 17.31 54.32 10.11
PMON68539 GM_A36450 13.82 4.34 17.13 54.96 9.47
PMON68539 GM_A36450 13.56 3.83 17.06 56.7 8.6
PMON68539 GM_A36705 9.73 1.83 75.04 8.23 4.27
PMON68539 GM_A36705 10.85 1.74 72.89 9.29 4.53
PMON68539 GM_A36705 10.05 1.78 72.68 9.83 4.48
PMON68539 GM_A36705 10.02 1.77 72.57 10.04 4.36
PMON68539 GM_A36705 10.75 1.75 72.37 9.68 4.77
PMON68539 GM_A36705 10.58 1.78 70.35 11.64 4.43
PMON68539 GM_A36705 7.69 5.63 16.21 60.39 8.85
PMON68539 GM_A36705 8.02 5.69 15.58 60.65 8.86
A3244 13.03 4.31 21.23 52.61 7.77
A3244 12.69 3.98 20.71 55.12 6.53
A3244 15.2 5.02 19.83 49.96 8.83
A3244 12.63 4.84 19.55 53.18 8.66
A3244 13.27 4.48 18.28 54.4 8.5
A3244 13.22 4.91 17.38 54.73 8.63
A3244 13.44 4.81 15.46 56.49 8.91
실시예 11
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 3D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON95829를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다. 이어서, 형질전환된 식물들의 게놈들을, 제1의 T-DNA 및 제2의 T-DNA의 동시 일렬 삽입(tandem insertion), 즉, "우측 경계로부터 우측 경계" 어셈블리에 대하여 스크리닝하였다. 스크리닝을 서던 하이브리다이제이션 맵핑법(Southern hybridization mapping methods)으로 수행하였다. 그들의 게놈 내에 바람직한 배열을 포함하는 형질전환된 대두 식물들을 종자 생산을 위하여 온실로 이동시켰다.
예를 들어, 잎 조직을 구조물 pMON95829로 형질전환된 R0 식물로부터 취하고, 서던 분석을 수행하였다. 양 T-DNA의 우측 경계-우측 경계("RB-RB") 어셈블리를 포함하는 계통을 확인하기 위하여, 프로브들과 제한 효소 절단을 순서대로 선택하였다. 전형적으로, 모든 형질전환체의 약 25%가 적절하게 어셈블리된 RB-RB T-DNA들을 가졌다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON95829 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON95829로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들(positive seeds)을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 9 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 9] pMON95829 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON95829 GM_A94247 2.1 2.8 83.0 6.0 5.5
PMON95829 GM_A94296 2.6 2.9 80.6 7.1 5.8
PMON95829 GM_A93590 2.5 2.8 80.4 7.4 5.8
PMON95829 GM_A93437 2.6 2.8 79.8 7.9 6.0
PMON95829 GM_A93517 2.9 2.8 79.5 7.7 6.0
PMON95829 GM_A93647 2.3 3.0 78.6 9.0 6.5
PMON95829 GM_A93670 3.1 2.9 77.3 10.1 6.2
PMON95829 GM_A92396 2.9 2.6 76.0 11.1 7.0
PMON95829 GM_A92455 3.6 3.1 74.9 12.0 5.5
PMON95829 GM_A93678 2.8 3.4 74.0 11.9 7.4
PMON95829 GM_A93640 2.5 2.7 71.6 14.6 7.6
PMON95829 GM_A94937 4.5 3.3 67.2 17.7 7.1
PMON95829 GM_A92481 4.9 2.8 58.1 25.3 8.1
PMON95829 GM_A94306 3.1 3.2 55.9 29.0 7.9
PMON95829 GM_A94211 3.0 2.7 47.0 38.3 8.7
실시예 12
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 3D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93505를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다. 이어서, 형질전환된 식물들의 게놈들을, 제1의 T-DNA 및 제2의 T-DNA의 동시 일렬 삽입, 즉, "우측 경계로부터 우측 경계" 어셈블리에 대하여 스크리닝하였다. 스크리닝은 서던 하이브리다이제이션 맵핑법으로 수행하였다. 그들의 게놈 내에 바람직한 배열을 포함하는 형질전환된 대두 식물들을 종자 생산을 위하여 온실로 이동시켰다.
예를 들어, 잎 조직을 구조물 pMON93505로 형질전환된 R0 식물로부터 취하 고, 서던 분석을 수행하였다. 양 T-DNA의 우측 경계-우측 경계("RB-RB") 어셈블리를 포함하는 계통을 확인하기 위하여, 프로브들과 제한 효소 절단을 순서대로 선택하였다. 전형적으로, 모든 형질전환체의 약 25%가 적절하게 어셈블리된 RB-RB T-DNA들을 가졌다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93505 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93505로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들(positive seeds)을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 10 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 10] pMON93505 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93505 GM_A87814 1.3 1.0 84.9 5.5 6.3
PMON93505 GM_A86449 1.5 0.9 84.9 4.9 6.8
PMON93505 GM_A86032 1.5 1.1 83.5 6.3 7.0
PMON93505 GM_A86159 1.5 0.9 82.8 6.7 7.5
PMON93505 GM_A86178 1.7 1.0 82.5 6.7 7.3
PMON93505 GM_A86075 1.4 0.9 81.4 6.6 8.5
PMON93505 GM_A86303 1.0 0.6 81.4 7.4 8.8
PMON93505 GM_A86454 1.4 0.9 79.9 7.4 8.8
PMON93505 GM_A86799 1.4 1.1 79.4 9.6 7.7
PMON93505 GM_A85997 2.2 2.5 79.3 7.7 7.4
PMON93505 GM_A86058 1.8 1.0 76.8 11.3 8.3
PMON93505 GM_A86274 1.2 0.7 74.6 10.2 11.9
PMON93505 GM_A86325 1.1 0.7 72.8 15.4 9.2
PMON93505 GM_A85969 2.0 0.7 70.7 13.6 12.1
PMON93505 GM_A86033 1.7 0.9 69.1 18.2 9.5
PMON93505 GM_A86372 1.7 1.0 65.7 12.6 17.6
PMON93505 GM_A86403 1.5 0.9 64.6 16.8 15.4
PMON93505 GM_A87803 1.1 0.6 57.7 26.0 13.8
PMON93505 GM_A86036 3.1 1.5 54.8 30.4 9.7
PMON93505 GM_A86269 4.9 1.8 51.4 31.9 9.5
실시예 13
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 3D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93506을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다. 이어서, 형질전환된 식물들의 게놈들을, 제1의 T-DNA 및 제2의 T-DNA의 동시 일렬 삽입, 즉, "우측 경계로부터 우측 경계" 어셈블리에 대하여 스크리닝하였다. 스크리닝은 서던 하이브리다이제이션 맵핑법으로 수행하였다. 그들의 게놈 내에 바람직한 배열을 포함하는 형질전환된 대두 식물들을 종자 생산을 위하여 온실로 이동시켰다.
예를 들어, 잎 조직을 구조물 pMON93506으로 형질전환된 R0 식물로부터 취하고, 서던 분석을 수행하였다. 양 T-DNA의 우측 경계-우측 경계("RB-RB") 어셈블리를 포함하는 계통을 확인하기 위하여, 프로브들과 제한 효소 절단을 순서대로 선택하였다. 전형적으로, 모든 형질전환체의 약 25%가 적절하게 어셈블리된 RB-RB T-DNA들을 가졌다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93506 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93506으로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 11 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 11] pMON93506 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93506 GM_A87174 2.2 0.8 88.1 2.3 5.1
PMON93506 GM_A86998 2.1 0.6 87.1 3.4 5.5
PMON93506 GM_A87075 2.7 1.2 85.9 4.8 4.2
PMON93506 GM_A87255 2.9 0.8 84.8 5.5 5.4
PMON93506 GM_A91253 2.7 0.9 84.5 5.9 5.1
PMON93506 GM_A86561 2.8 0.7 83.8 5.9 6.0
PMON93506 GM_A86875 3.1 1.0 83.6 6.2 5.5
PMON93506 GM_A89967 1.8 1.3 83.2 4.1 7.9
PMON93506 GM_A86927 2.1 0.8 82.6 4.8 8.5
PMON93506 GM_A87883 2.7 0.7 82.4 6.5 7.2
PMON93506 GM_A87133 3.0 3.1 81.5 5.2 6.3
PMON93506 GM_A88072 2.8 0.7 80.6 8.2 7.1
PMON93506 GM_A87069 3.8 0.7 80.4 8.2 6.4
PMON93506 GM_A86835 2.7 3.0 80.3 6.4 6.4
PMON93506 GM_A87929 2.7 1.0 76.3 7.8 11.5
PMON93506 GM_A87298 3.0 1.2 72.9 13.0 9.1
PMON93506 GM_A91226 3.4 1.0 69.3 18.0 7.7
PMON93506 GM_A88076 3.7 3.9 68.0 15.4 8.1
PMON93506 GM_A86530 2.9 1.0 59.3 25.0 11.5
PMON93506 GM_A87292 4.6 4.3 54.2 27.6 8.3
PMON93506 GM_A87076 5.5 0.9 46.7 38.0 8.4
실시예 14
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 3B에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93501을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93501 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93501로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 12 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 12] pMON93501 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93501 GM_A85435 4.4 1.1 85.8 2.5 5.1
PMON93501 GM_A85439 4.6 0.9 84.8 3.7 5.1
PMON93501 GM_A85276 4.8 1.4 84.3 3.0 4.9
PMON93501 GM_A85697 4.8 1.3 83.6 3.8 5.6
PMON93501 GM_A85777 6.6 1.8 80.0 4.5 6.4
PMON93501 GM_A84790 7.2 5.7 78.3 2.9 4.7
PMON93501 GM_A85910 4.2 1.1 77.8 6.9 9.3
PMON93501 GM_A86186 5.3 1.1 77.4 7.4 7.7
PMON93501 GM_A85065 7.3 2.2 76.8 5.7 6.9
PMON93501 GM_A85744 4.1 0.9 76.0 7.4 10.6
PMON93501 GM_A85261 4.7 1.0 75.8 4.9 11.9
PMON93501 GM_A85479 3.7 1.1 75.8 8.6 9.8
PMON93501 GM_A85819 4.5 1.7 74.9 6.9 11.1
PMON93501 GM_A85945 4.6 1.2 74.6 8.7 10.0
PMON93501 GM_A85301 6.9 1.2 73.1 9.5 8.4
PMON93501 GM_A85929 6.1 1.4 72.4 10.8 8.7
PMON93501 GM_A85908 6.9 1.3 70.0 8.0 13.6
PMON93501 GM_A85393 4.8 1.3 67.0 13.3 12.2
PMON93501 GM_A85756 4.8 1.8 57.3 17.6 17.8
PMON93501 GM_A85415 5.0 1.3 52.9 26.0 12.1
PMON93501 GM_A85950 5.5 1.8 47.5 38.6 6.1
PMON93501 GM_A84705 5.7 2.3 46.0 37.7 7.4
PMON93501 GM_A85787 4.5 1.6 43.4 37.0 13.1
실시예 15
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON97552를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON97552 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로 부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON97552로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 13 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 13] pMON97552 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97552 GM_A98359 2.1 2.7 84.4 4.7 5.3
PMON97552 GM_A98361 2.3 2.7 84.0 5.3 4.8
PMON97552 GM_A98358 2.3 2.7 81.6 6.8 6.2
실시예 16
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93758을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특 허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93758 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93758로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 14 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 14] pMON93758 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93758 GM_A89686 2.7 2.9 82.7 5.3 5.5
PMON93758 GM_A89678 2.9 2.9 81.8 5.5 6.0
PMON93758 GM_A89670 2.8 3.0 81.7 5.6 6.1
PMON93758 GM_A89688 2.7 3.2 81.6 5.8 5.9
PMON93758 GM_A89683 2.9 2.9 81.5 5.8 6.1
PMON93758 GM_A89699 2.7 3.1 81.4 5.8 6.1
PMON93758 GM_A89675 2.9 3.0 81.4 5.6 6.2
PMON93758 GM_A89690 3.0 2.8 81.3 5.7 6.3
PMON93758 GM_A89680 3.0 2.8 81.3 5.9 6.0
PMON93758 GM_A89674 2.9 2.9 80.4 6.3 6.7
PMON93758 GM_A89677 3.0 2.8 79.7 7.0 6.8
PMON93758 GM_A89676 3.0 2.9 78.7 7.6 7.4
PMON93758 GM_A89694 3.2 2.8 76.7 8.8 8.0
PMON93758 GM_A89696 3.0 2.6 74.7 10.4 8.9
실시예 17
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON97553을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸 에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON97553 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON97553으로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들 에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 15 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 15] pMON97553 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97553 GM_A98670 2.1 2.6 86.7 2.9 4.3
PMON97553 GM_A98595 2.3 2.7 86.3 3.5 4.7
PMON97553 GM_A98649 2.2 2.9 86.3 3.6 4.7
PMON97553 GM_A98669 2.1 3.0 85.5 3.3 4.6
PMON97553 GM_A98656 2.4 2.8 85.5 4.2 4.6
PMON97553 GM_A98643 2.3 2.8 85.0 3.8 4.9
PMON97553 GM_A98647 2.2 2.8 84.2 5.1 5.6
PMON97553 GM_A98582 2.6 2.8 84.0 4.1 5.6
PMON97553 GM_A98674 2.1 2.3 83.9 5.8 5.3
PMON97553 GM_A98663 2.2 2.8 83.3 5.5 5.1
PMON97553 GM_A98587 2.8 2.8 83.0 5.5 5.3
PMON97553 GM_A98592 2.9 2.9 82.9 4.6 5.8
PMON97553 GM_A98677 2.2 3.0 82.4 5.9 5.4
PMON97553 GM_A98594 2.2 2.9 82.3 6.5 5.4
PMON97553 GM_A98659 2.5 3.0 82.2 5.4 6.1
PMON97553 GM_A98622 2.8 3.0 81.6 6.0 6.1
PMON97553 GM_A98589 2.9 3.0 81.3 6.2 6.1
PMON97553 GM_A98679 2.2 3.1 81.2 6.7 5.7
PMON97553 GM_A98642 2.3 3.1 80.0 7.4 6.1
PMON97553 GM_A98639 2.7 3.0 78.4 8.0 6.8
PMON97553 GM_A98563 3.3 2.9 78.1 9.9 5.6
PMON97553 GM_A98618 2.9 2.8 78.0 8.8 6.9
PMON97553 GM_A98567 2.7 3.2 77.5 9.1 6.3
PMON97553 GM_A98625 2.3 2.9 77.4 9.5 6.9
PMON97553 GM_A98660 3.3 2.9 77.1 10.7 5.6
PMON97553 GM_A98615 2.7 3.2 76.4 9.9 7.1
PMON97553 GM_A98561 3.3 3.1 75.3 10.9 6.7
PMON97553 GM_A98603 2.9 3.6 73.5 11.0 7.8
PMON97553 GM_A98648 2.7 3.3 70.2 14.4 8.3
PMON97553 GM_A98565 3.2 2.8 67.9 17.9 7.2
PMON97553 GM_A98681 3.1 3.0 65.9 19.3 7.7
실시예 18
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93770을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93770 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93770으로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 16 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 16] pMON93770 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93770 GM_A97973 2.8 2.7 80.0 7.3 6.2
PMON93770 GM_A97996 2.5 3.5 76.6 9.5 6.8
PMON93770 GM_A97977 2.7 3.1 75.8 9.8 7.5
PMON93770 GM_A97981 3.1 3.0 71.8 13.2 8.0
PMON93770 GM_A97971 3.4 3.1 70.3 14.8 7.5
PMON93770 GM_A97985 2.9 2.7 67.9 15.9 9.6
PMON93770 GM_A97991 3.2 2.9 66.4 19.0 7.6
실시예 19
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93759를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93759 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93759로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 17 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한 다.
[표 17] pMON93759 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93759 GM_A88219 3.0 2.7 77.0 9.1 7.4
PMON93759 GM_A88212 3.1 2.7 76.6 9.1 7.6
PMON93759 GM_A88205 3.1 2.8 73.9 11.5 7.8
PMON93759 GM_A88209 2.9 2.7 73.9 11.6 8.2
PMON93759 GM_A88222 3.1 2.6 73.7 11.9 8.0
PMON93759 GM_A88223 2.7 2.6 73.5 12.4 8.3
PMON93759 GM_A88215 2.9 2.9 73.3 12.1 7.9
PMON93759 GM_A88202 3.4 2.8 72.9 12.6 7.7
PMON93759 GM_A88220 3.0 3.0 72.1 13.3 7.7
PMON93759 GM_A88213 2.9 3.0 71.8 13.1 8.3
PMON93759 GM_A88210 3.3 2.8 71.6 13.5 8.3
PMON93759 GM_A88217 2.5 2.7 71.5 14.9 7.8
PMON93759 GM_A88206 2.9 2.9 71.3 13.3 8.8
PMON93759 GM_A88211 3.1 3.0 71.3 13.8 7.9
PMON93759 GM_A88204 3.1 2.8 70.5 14.3 8.8
PMON93759 GM_A88201 3.2 2.7 69.4 15.5 8.4
PMON93759 GM_A88200 3.3 3.0 67.3 17.1 8.5
PMON93759 GM_A88214 3.3 2.9 60.6 23.7 8.7
PMON93759 GM_A88203 3.5 3.1 60.6 23.3 8.9
PMON93759 GM_A88226 3.0 2.8 60.5 23.7 9.5
PMON93759 GM_A88198 4.7 3.1 42.7 39.6 9.1
실시예 20
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON97554를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON97554 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON97554로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 18 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 18] pMON97554 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97554 GM_A98420 2.3 2.6 80.4 8.0 5.7
PMON97554 GM_A98445 2.1 3.0 77.4 10.1 6.3
PMON97554 GM_A98423 2.7 2.9 77.0 10.3 6.1
PMON97554 GM_A98440 2.7 2.8 76.0 10.8 6.6
PMON97554 GM_A98438 2.8 3.0 70.6 15.2 7.3
PMON97554 GM_A98435 3.6 3.0 69.6 16.5 6.3
실시예 21
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93771을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93771 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93771로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 19 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한 다.
[표 19] pMON93771 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93771 GM_A97841 2.5 2.3 70.8 17.0 6.6
PMON93771 GM_A97839 3.8 3.0 65.8 18.3 8.1
PMON93771 GM_A97836 4.1 2.9 65.5 19.3 7.1
PMON93771 GM_A97844 2.6 2.7 65.2 20.9 8.0
PMON93771 GM_A97835 4.4 2.9 62.9 21.0 7.8
PMON93771 GM_A97852 3.3 3.1 62.9 21.0 8.9
PMON93771 GM_A97857 3.4 2.7 61.7 22.6 8.7
PMON93771 GM_A97846 4.2 2.7 52.0 30.8 9.6
실시예 22
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON97555를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON97555 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON97555로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 20 참고). 예를 들어, FAD2 억제는 증가된 양의 올레산 에스테르 화합물들을 갖는 식물들을 제공한다.
[표 20] pMON97555 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97555 GM_A98913 2.7 2.9 71.0 14.5 7.8
PMON97555 GM_A98912 2.1 2.2 70.5 18.0 6.4
PMON97555 GM_A98905 2.7 3.1 65.9 19.0 8.2
PMON97555 GM_A98909 2.4 2.8 63.5 21.5 9.1
PMON97555 GM_A98936 4.9 2.4 61.9 24.9 5.3
PMON97555 GM_A98893 2.5 2.8 61.5 23.7 8.6
PMON97555 GM_A98924 3.0 3.0 61.4 23.5 8.1
PMON97555 GM_A98904 3.1 2.9 60.6 24.0 8.3
PMON97555 GM_A98938 2.3 2.9 58.3 28.1 7.6
PMON97555 GM_A98900 3.2 2.8 56.7 28.4 8.0
PMON97555 GM_A98906 2.7 2.9 56.7 27.8 8.8
PMON97555 GM_A98917 2.7 3.1 53.0 32.1 8.4
PMON97555 GM_A98939 3.0 3.1 52.9 31.4 8.9
PMON97555 GM_A98935 4.5 3.2 48.2 35.4 7.8
PMON97555 GM_A98919 3.1 3.4 44.2 40.3 8.0
실시예 23
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93760을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93760 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93760으로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 21 참고). 예를 들어, 서열번호:1의 5' 말단으로부터 320개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, dsRNA를 형성할 수 있는 FAD2 -1 인트론은 적어도 부분적으로 FAD2를 억제한다.
[표 21] pMON93760 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93760 GM_A88236 10.0 3.6 58.3 23.4 4.4
PMON93760 GM_A88240 2.9 2.6 56.0 28.4 9.5
PMON93760 GM_A88245 3.3 3.2 54.8 28.7 9.6
PMON93760 GM_A88231 3.2 2.7 48.8 35.0 9.6
PMON93760 GM_A88234 3.8 2.7 47.7 36.1 9.1
PMON93760 GM_A88252 3.1 2.5 45.3 40.9 7.5
PMON93760 GM_A88244 3.4 3.0 41.6 42.2 9.2
PMON93760 GM_A88256 2.7 2.7 41.3 44.6 8.5
PMON93760 GM_A88243 2.8 2.7 36.6 50.4 7.1
PMON93760 GM_A88254 3.7 2.6 27.5 58.1 7.6
PMON93760 GM_A88253 3.7 2.8 25.4 60.6 6.9
PMON93760 GM_A88239 7.2 2.8 25.0 58.6 6.2
PMON93760 GM_A88250 4.7 2.9 24.4 59.2 8.4
PMON93760 GM_A88251 5.5 3.0 22.7 60.0 8.6
실시예 24
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93772를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93772 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93772로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 22 참고). 예를 들어, 서열번호:1의 3' 말단으로부터 360개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, dsRNA를 형성할 수 있는 FAD2 -1 인트론은 몇몇 계통들에서 적어도 부분적으로 FAD2를 억제한다.
[표 22] pMON93772 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93772 GM_A97768 3.4 2.3 69.6 17.6 6.3
PMON93772 GM_A97781 3.3 2.6 55.1 30.9 7.3
PMON93772 GM_A97763 3.7 2.6 45.2 38.2 9.6
PMON93772 GM_A97796 2.3 2.9 35.1 50.3 8.7
PMON93772 GM_A97798 3.3 2.6 33.5 51.2 8.6
PMON93772 GM_A97782 2.6 2.7 33.4 52.0 8.5
PMON93772 GM_A97819 3.8 3.1 30.1 53.8 8.7
PMON93772 GM_A97777 3.3 2.7 28.1 56.7 8.6
PMON93772 GM_A97767 2.9 2.8 26.3 57.9 9.6
PMON93772 GM_A97792 3.7 2.6 26.2 57.8 9.1
PMON93772 GM_A97808 3.0 3.0 25.7 58.4 9.2
PMON93772 GM_A97790 2.8 2.7 25.1 59.7 9.2
PMON93772 GM_A97805 3.5 2.8 24.6 59.7 8.7
PMON93772 GM_A97817 3.5 2.9 24.0 59.4 9.5
PMON93772 GM_A97828 3.2 2.9 23.4 60.3 9.8
PMON93772 GM_A97812 2.5 2.9 23.0 61.3 9.8
PMON93772 GM_A97765 2.8 3.0 20.7 63.0 10.1
실시예 25
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON97556을 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON97556 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON97556으로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 23 참고). 예를 들 어, 서열번호:1의 3' 말단으로부터 200개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, dsRNA를 형성할 수 있는 FAD2 -1 인트론은 적어도 부분적으로 FAD2를 억제한다.
[표 23] pMON97556 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97556 GM_A98772 3.6 2.8 34.3 51.0 7.4
PMON97556 GM_A98744 2.4 2.6 26.6 60.3 7.4
PMON97556 GM_A98787 2.5 2.8 26.4 58.9 8.7
PMON97556 GM_A98745 2.2 2.5 26.3 60.2 8.0
PMON97556 GM_A98758 2.5 2.9 25.6 59.6 8.7
PMON97556 GM_A98789 2.1 2.5 22.3 64.9 7.7
PMON97556 GM_A98790 2.2 3.0 22.1 62.8 9.4
PMON97556 GM_A98783 2.5 2.6 21.5 64.0 8.7
PMON97556 GM_A98761 2.3 2.3 20.9 65.2 8.7
실시예 26
FAD2 유전자를 억제하기 위하여, 대두 내로 FAD2 -1A 인트론, 이중-가닥 RNA-형성 구조물을 도입하는데, 실시예 2D에서 설명된 바와 같은 구조물 pMON93764를 사용하였다. 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 종 ABI(Martinell, 미국 특허번호 제6,384,301호)를 통하여 대두(Asgrow variety A4922) 내로 안정하게 도입시켰다. 형질전환된 대두 식물들은 글리포세이트 제초제를 포함하는 배지 상에서 CP4 선별가능한 마커를 통해 선별하므로써 확인되었다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, pMON93764 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 구조물 pMON93764로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다(표 24 참고). 또한, 서열번호:1의 3' 말단으로부터 400개의 연속된 뉴클레오티드 길이로 감소되고, dsRNA를 형성할 수 있는 FAD2 -1 인트론은 FAD2 발현을 실질적으로 감소시키지 않는다.
[표 24] pMON93764 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 # 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON93764 GM_A98489 2.1 2.2 28.1 60.5 6.5
PMON93764 GM_A98452 2.2 2.2 27.4 61.3 6.8
PMON93764 GM_A98451 2.3 2.5 26.2 60.7 7.8
PMON93764 GM_A98467 2.5 2.8 25.4 60.9 8.2
PMON93764 GM_A98455 1.8 2.3 24.4 63.5 7.8
PMON93764 GM_A98499 1.8 2.5 24.1 63.5 7.8
PMON93764 GM_A98453 2.5 2.6 23.7 63.2 7.5
PMON93764 GM_A98492 1.6 2.7 23.7 63.6 7.7
PMON93764 GM_A98456 1.8 2.4 23.4 64.2 8.0
PMON93764 GM_A98471 2.2 2.7 23.4 64.2 7.4
PMON93764 GM_A98500 2.5 2.3 22.9 64.1 7.9
PMON93764 GM_A98482 2.3 2.5 22.9 64.6 7.3
PMON93764 GM_A98485 2.5 2.7 22.8 63.8 8.0
PMON93764 GM_A98463 1.9 2.2 22.6 64.7 8.3
PMON93764 GM_A98469 3.4 2.5 22.1 63.3 8.5
PMON93764 GM_A98474 1.6 2.3 21.5 65.7 8.4
PMON93764 GM_A98483 2.0 2.5 21.4 65.4 8.5
PMON93764 GM_A98476 2.7 2.6 21.2 64.4 8.8
PMON93764 GM_A98498 2.5 2.5 21.1 64.8 8.9
PMON93764 GM_A98496 2.5 2.3 20.6 65.2 8.9
PMON93764 GM_A98468 1.9 2.7 19.3 66.0 9.7
실시예 27
TaqMan은 선택적인 증폭 및 리얼-타임 형광 측정(또한, 리얼-타임 PCR로 명명됨)을 통하여 핵산을 정량하는 검정법이다. 이 과정은 형질전환성 발달 종자 내에서 표적 전사체 억제의 정도를 결정하기 위하여 사용된다. 샘플에서 표적 mRNA의 절대적인 전사체 수준을 결정하기 위하여, 표준 곡선이 각 TaqMan 실험을 위하여 정하여 졌다. 이러한 목적을 위하여, 캐놀라로부터의 20ng의 총 RNA 내에 희석된, 다양한 양의 클로닝된 콩 표적 유전자 서열을 알려지지 않은 표적량을 갖는 샘플들과 함께 대칭적으로 증폭시켰다. 이러한 방식으로 결정된 전사체 사본수의 정확성은 25% 오차한계를 가진다.
주형 물질에 대하여, 총 RNA를 ABI 6100 Nucleic Acid Prep Station을 사용 하여 추출하고, TaqMan 샘플당 20ng을 사용하였다. 상기 샘플들을 ABI Prism-One Step RT-PCR Master Mix Chemistry를 사용하여, ABI 700 서열분석기 상에서 분석하였다. TaqMan Count(Ct) 값들을, 알려지지 않은 샘플 내의 FAD2 -1 표적 DNA의 양을 각 TaqMan PCR 반응의 종료시 얻어진 TaqMan Count(Ct) 값으로부터 결정할 수 있도록 선형 회귀분석을 위하여, TaqMan PCR 반응의 종료시에 얻은 공지된 양의 합성 표적 서열에 대해 도표화(plotting)하였다.
식물들은, FAD2 -1A를 억제하는 pMON68540, pMON68546, 또는 pMON80623 중 어느 하나로 형질전환되었다(구조물들의 설명을 위하여 섹션 3A 및 도 7 참고).
총 RNA를 널 식물들(null plants) 및 형질전환된 식물들로부터 ABI 6100 Nucleic Acid Prep Station을 사용하여 얻었다. 형질전환된 식물들은 제3세대 동형접합자(third generation homozygous)이고, 50% 이상의 올레산 수준을 갖는다. FAD2-1A 프라이머들, FAD2 -1B 프라이머들, 또는 FAD2 -2A 프라이머들을, 분리된 TaqMan 샘플들 내의, 테스트될 각 식물들로부터의 총 RNA에 첨가하였다. 상기 샘플들을 ABI Prism-One Step RT-PCR Master Mix Chemistry를 사용하여 ABI 700 서열분석기 상에서 분석하였다.
모든 형질전환 식물들은 FAD2 -1A 및 FAD2 -1B 전사체 수준을 실질적으로 억제하였다. 어떠한 형질전환 식물들도 FAD2 -2A 또는 FAD2 -2B 수준을 부분적으로 조차 도 감소시키지 않았다.
널 식물들 내의 FAD2 -1A 전사체 수준의 식물 대 식물 비교는 식물들 사이의 자연적인 오차를 결정한다. 개발 종자로부터의 FAD2 -1A mRNA가 PCR 프라이머들을 사용하여 검정되었고, 이로부터 다양한 식물들에서의 프로브 서열을 생산하였다. 0.2g 생중량(fresh weight)의 종자들을 각각 다른 계통으로부터의 4개의 다른 R2 널(null) 격리 식물들로부터 취하였다. 4개의 다른 널 식물 격리체로부터의 동일 크기군의 R2 종자 풀(pool)들을 테스트하였다. PCR 반응을 3회 수행하였고, 결과는 각 샘플에 있어서 18S RNA의 양을 비교하여 정규화(normalize)시켰다. FAD2 -1A에서의 식물 대 식물의 생물학적 다양성은 낮았다. 네 샘플 중 세 샘플은 약 65의 정규화된 TaqMan Count(Ct) 값을 가지고, 하나의 샘플은 약 50의 정규화된 Ct 값을 가진다.
실시예 28
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1) 서열의 200개의 연속적인 단편을 PCR로 증폭시켜, 서열번호:1의 5' 말단에서 출발하여 서열번호:1의 첫 200개의 뉴클레오티드를 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. PCR 산물들을, PCR 프라이머들의 5' 말단 상에서 조작된 제한 사이트들을 통하여, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내의 센스 방향으로 직접 클로닝시켰다. 다음으로, 상기 벡터를 제한 효소로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 사용하였다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, 이 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 이 구조물로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다.
실시예 29
대두 FAD2 -1 인트론 1(서열번호:1) 서열의 180개의 연속적인 단편을 PCR로 증폭시켜, 서열번호:1의 3' 말단에서 출발하여 서열번호:1의 첫 180개의 뉴클레오 티드를 포함하는 PCR 산물들을 얻었다. PCR 산물들을, PCR 프라이머들의 5' 말단 상에서 조작된 제한 사이트들을 통하여, 대두 7Sα' 프로모터 및 tml 3' 종결 서열을 포함하는 벡터 내의 센스 방향으로 직접 클로닝시켰다. 다음으로, 상기 벡터를 제한 효소로 절단하고, FMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 의하여 조절되는 CP4 EPSPS 유전자를 포함하는 벡터 내로 라이게이션시켰다. 결과의 유전자 발현 구조물을 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 형질전환용으로 사용하였다.
종자들로부터 추출된 지방산의 메틸에스테르 화합물들을 확인하기 위하여 실시예 4에서 설명된 것과 같이, 이 구조물로 형질전환된 대두 계통의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다. 먼저, 이 구조물로 형질전환된 대두 식물들로부터 취한 6개의 R1 종자들을 수확하고, 각 단일 종자의 지방산 조성을 결정하였다. 각 계통의 R1 식물들은 형질전환 유전자들에 의해 구별되므로, 변경된 대두 조성을 갖는 종자뿐만 아니라, 종래의 대두 조성을 갖는 종자들도 산출된다. 양성 종자들을 모으고, 각 계통별로 균분하였다. 모아진 균분된 양성 종자들은, 비-형질전환된 대두로부터의 종자의 단일- 및 다중불포화 지방산 조성과 비교하여 형질전환된 대두 계통으로부터의 종자들의 오일에서 단일- 및 다중불포화 지방산 함량이 변화된다는 것을 보여준다.
실시예 30
pMON97562는, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FAD3 -1A 5' UTR에 연결되고, FAD3 -1A 3' UTR이 이어지고, 상기 FAD3 -1A 3' UTR은 FAD3 -1B 5' UTR에 연결되고, FAD3 -1B 3' UTR이 이어지고, FATB-1α 5' UTR이 이어지고, FATB -1α 3' UTR이 이어지고, 상기 FATB -1α 3' UTR은 FAD3 -1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3 -1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -1α 3' UTR에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 상기 FATB-1α 5' UTR은 FAD3 -1B 3' UTR에 안티센스로 연결되고, FAD3 -1B 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 상기 FAD3 -1B 5' UTR은 FAD3 -1A 3' UTR에 안티센스로 연결되고, FAD3-1A 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 안티센스로 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일한 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 콩 형질전환용으로 사용된다. 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 이 구조물로 형질전환 된 대두 계통들의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 결정하였다. 표 25는 대표적인 종자들의 조성을 제공한다. 18:3의 수준이 약 1%까지 감소하였다.
[표 25] pMON97562 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97562 GM_A103478 2.82 3.17 82.88 9.18 1.15
PMON97562 GM_A103481 2.99 2.75 82.7 9.39 1.13
PMON97562 GM_A103476 3.13 3.11 81.35 10.25 1.12
실시예 31
pMON97563은, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2-1A 인트론 1(서열번호:1)에 대두 7Sα' 프로모터가 작동가능하게 연결되고, 상기 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 FAD3 -1A 5' UTR에 연결되고, FAD3 -1A 3' UTR이 이어지고, 상기 FAD3 -1A 3' UTR은 FAD3 -1B 5' UTR에 연결되고, FAD3 -1B 3' UTR이 이어지고, 상기 FAD3 -1B 3' UTR는 FAD3 -1C 5' UTR에 연결되고, FAD3 -1C 3' UTR이 이어지고, FATB-1α CTP 코딩 지역이 이어지고, FATB -2α CTP 코딩 지역이 이어지고, 상기 FATB-2α CTP 코딩 지역은 FAD3 -1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 FAD3 -1A 인트론 4로부터의 70개의 뉴클레오티드는 FATB -2α CTP 코딩 지역에 안티센스 방향으로 작동가능하게 연결되고, FATB -1α CTP 코딩 지역이 안티센스 방향으로 이어지고, 상기 FATB -1α CTP 코딩 지역은 FAD3 -1C 3' UTR에 안 티센스로 연결되고, FAD3 -1C 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 상기 FAD3 -1C 5' UTR은 FAD3 -1B 3' UTR에 안티센스로 연결되고, FAD3 -1B 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 상기 FAD3 -1B 5' UTR은 FAD3 -1A 3' UTR에 안티센스로 연결되고, FAD3-1A 5' UTR이 안티센스로 이어지고, 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)이 이어지고, 상기 3' 말단으로부터 100개의 연속된 뉴클레오티드로 감소된 대두 FAD2 -1A 인트론 1(서열번호:1)은 EFMV 프로모터 및 완두콩 루비스코 E9 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 CP4 EPSPS 유전자를 갖는 H6 3' 폴리아데닐레이션 단편에 작동가능하게 연결되어 이루어지며, 상기의 모두는 동일한 DNA 분자 상에서 RB 및 LB에 의해 접하게 된다. 결과의 유전자 발현 구조물은 본 발명에서 설명된 방법들을 사용하여 식물 형질전환용으로 사용된다. 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 이 구조물로 형질전환된 대두 계통들의 종자로부터 기체 크로마토그래피를 사용하여 지방산 조성을 결정하였다. 표 26은 대표적인 종자들의 조성을 제공한다. 18:3의 수준이 약 1%까지 감소하였다.
[표 26] pMON97563 계통으로부터의 R1 단일 종자들의 지방산 조성
구조물 계통 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
PMON97563 GM_A109156 2.21 2.78 85.05 8.48 0.69
PMON97563 GM_A109196 2.07 2.31 84.4 9.42 0.97
PMON97563 GM_A109207 2.24 2.78 83.98 9.36 0.82
PMON97563 GM_A103543 2.21 2.63 83.94 10.28 0.95
PMON97563 GM_A103547 2.06 2.47 83.67 10.47 0.89
PMON97563 GM_A109146 1.71 2.34 81.14 13.71 0.91
PMON97563 GM_A109155 2.33 2.7 80.76 12.28 1.11
PMON97563 GM_A109164 2.07 2.61 78.8 14.6 1
PMON97563 GM_A109170 2.68 1.95 78.78 14.14 1.55
PMON97563 GM_A109277 2.49 3.19 78.19 14.51 0.93
PMON97563 GM_A109194 2.46 2.81 76.62 16.26 0.92
PMON97563 GM_A109177 2.56 2.49 72.64 20.14 1.44
PMON97563 GM_A109201 2.46 2.9 72.21 20.13 1.11
PMON97563 GM_A103550 2.18 2.67 70.84 22.25 1.17
PMON97563 GM_A109203 2.18 2.81 69.93 22.91 0.98
본원에서 설명되고, 청구된 모든 조성물들 및/또는 방법들은 본 발명의 개시에 의하여 과도한 반복실험 없이도 제조되고, 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물들과 방법들이 바람직한 구체예를 통하여 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고도, 여러 변경들이 본원에서 설명된 상기 조성물들 및/또는 방법들 및 상기 방법의 단계들 또는 그 순서에 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백한 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 임의의 제제들이, 동일 또는 유사한 결과가 달성될 수 있는 한, 본원에서 설명된 제제들을 대체할 수 있다는 것은 명백한 것이다. 당업자에게 명백한 그러한 모든 유사한 치환들 및 변경들은 첨부된 특허청구범위에 의하여 특정된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Toni Voelker JoAnne J. Fillatti Neal A. Bringe Tim N. Ulmasov <120> Nucleic Acid Constructs and Methods for Producing Altered Seed Oil Compositions <130> 16518.180 <150> 38-21(54449) <151> 2006-03-07 <150> 38-21(54449) <151> 2006-03-10 <150> US 10/669,888 <151> 2003-09-25 <150> US 10/668,240 <151> 2003-09-24 <150> US 10/393,347 <151> 2003-03-21 <150> PCT/US03/08610 <151> 2003-03-21 <150> US 60/365,794 <151> 2002-03-21 <150> US 60/390,185 <151> 2002-06-21 <160> 62 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 420 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1A intron 1 <400> 1 gtaaattaaa ttgtgcctgc acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga 60 ggaaaagaaa ctcccgaaat tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt 120 cctgaaggct taggtgtagg cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt 180 gataaacaat tggctgtaat gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac 240 tttttgtttt atggtcatga tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc 300 attatcttta gatttttcac tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac 360 atattacaca ttcagcaaaa caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag 420 <210> 2 <211> 405 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1B intron 1 <400> 2 gtatgatgct aaattaaatt gtgcctgcac cccaggatat ttcatgtggg attcatcatt 60 tattgaggaa aactctccaa attgaatcgt gcatttatat tttttttcca tttctagatt 120 tcttgaaggc ttatggtata ggcacctaca attatcagca cttctctcta ttgataaaca 180 attggctgta ataccacagt agagaacgat cacaacattt tgtgctggtt accttttgtt 240 ttatggtcat gatttcactc tctctaatct gtcacttccc tccattcatt ttgtacttct 300 catatttttc acttcctggt tgaaaattgt agttctcttg gtacatacta gtattagaca 360 ttcagcaaca acaactgaac tgaacttctt tatactttga cacag 405 <210> 3 <211> 1704 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1B promoter <400> 3 actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc ggtgtgactc agccccaagt 60 gacgccaacc aaacgcgtcc taactaaggt gtagaagaaa cagatagtat ataagtatac 120 catataagag gagagtgagt ggagaagcac ttctcctttt tttttctctg ttgaaattga 180 aagtgttttc cgggaaataa ataaaataaa ttaaaatctt acacactcta ggtaggtact 240 tctaatttaa tccacacttt gactctatat atgttttaaa aataattata atgcgtactt 300 acttcctcat tatactaaat ttaacatcga tgattttatt ttctgtttct cttctttcca 360 cctacataca tcccaaaatt tagggtgcaa ttttaagttt attaacacat gtttttagct 420 gcatgctgcc tttgtgtgtg ctcaccaaat tgcattcttc tctttatatg ttgtatttga 480 attttcacac catatgtaaa caagattacg tacgtgtcca tgatcaaata caaatgctgt 540 cttatactgg caatttgata aacagccgtc cattttttct ttttctcttt aactatatat 600 gctctagaat ctctgaagat tcctctgcca tcgaatttct ttcttggtaa caacgtcgtc 660 gttatgttat tattttattc tatttttatt ttatcatata tatttcttat tttgttcgaa 720 gtatgtcata ttttgatcgt gacaattaga ttgtcatgta ggagtaggaa tatcacttta 780 aaacattgat tagtctgtag gcaatattgt cttctttttc ctcctttatt aatatatttt 840 gtcgaagttt taccacaagg ttgattcgct ttttttgtcc ctttctcttg ttctttttac 900 ctcaggtatt ttagtctttc atggattata agatcactga gaagtgtatg catgtaatac 960 taagcaccat agctgttctg cttgaattta tttgtgtgta aattgtaatg tttcagcgtt 1020 ggctttccct gtagctgcta caatggtact gtatatctat tttttgcatt gttttcattt 1080 tttcttttac ttaatcttca ttgctttgaa attaataaaa caatataata tagtttgaac 1140 tttgaactat tgcctattca tgtaattaac ttattcactg actcttattg tttttctggt 1200 agaattcatt ttaaattgaa ggataaatta agaggcaata cttgtaaatt gacctgtcat 1260 aattacacag gaccctgttt tgtgcctttt tgtctctgtc tttggttttg catgttagcc 1320 tcacacagat atttagtagt tgttctgcat acaagcctca cacgtatact aaaccagtgg 1380 acctcaaagt catggcctta cacctattgc atgcgagtct gtgacacaac ccctggtttc 1440 catattgcaa tgtgctacgc cgtcgtcctt gtttgtttcc atatgtatat tgataccatc 1500 aaattattat atcatttata tggtctggac cattacgtgt actctttatg acatgtaatt 1560 gagtttttta attaaaaaaa tcaatgaaat ttaactacgt agcatcatat agagataatt 1620 gactagaaat ttgatgactt attctttcct aatcatattt tcttgtattg atagccccgc 1680 tgtccctttt aaactcccga gaga 1704 <210> 4 <211> 4497 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1A genomic clone <400> 4 cttgcttggt aacaacgtcg tcaagttatt attttgttct tttttttttt atcatatttc 60 ttattttgtt ccaagtatgt catattttga tccatcttga caagtagatt gtcatgtagg 120 aataggaata tcactttaaa ttttaaagca ttgattagtc tgtaggcaat attgtcttct 180 tcttcctcct tattaatatt ttttattctg ccttcaatca ccagttatgg gagatggatg 240 taatactaaa taccatagtt gttctgcttg aagtttagtt gtatagttgt tctgcttgaa 300 gtttagttgt gtgtaatgtt tcagcgttgg cttcccctgt aactgctaca atggtactga 360 atatatattt tttgcattgt tcattttttt cttttactta atcttcattg ctttgaaatt 420 aataaaacaa aaagaaggac cgaatagttt gaagtttgaa ctattgccta ttcatgtaac 480 ttattcaccc aatcttatat agtttttctg gtagagatca ttttaaattg aaggatataa 540 attaagagga aatacttgta tgtgatgtgt ggcaatttgg aagatcatgc gtagagagtt 600 taatggcagg ttttgcaaat tgacctgtag tcataattac actgggccct ctcggagttt 660 tgtgcctttt tgttgtcgct gtgtttggtt ctgcatgtta gcctcacaca gatatttagt 720 agttgttgtt ctgcatataa gcctcacacg tatactaaac gagtgaacct caaaatcatg 780 gccttacacc tattgagtga aattaatgaa cagtgcatgt gagtatgtga ctgtgacaca 840 acccccggtt ttcatattgc aatgtgctac tgtggtgatt aaccttgcta cactgtcgtc 900 cttgtttgtt tccttatgta tattgatacc ataaattatt actagtatat cattttatat 960 tgtccatacc attacgtgtt tatagtctct ttatgacatg taattgaatt ttttaattat 1020 aaaaaataat aaaacttaat tacgtactat aaagagatgc tcttgactag aattgtgatc 1080 tcctagtttc ctaaccatat actaatattt gcttgtattg atagcccctc cgttcccaag 1140 agtataaaac tgcatcgaat aatacaagcc actaggcatg gtaaattaaa ttgtgcctgc 1200 acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga ggaaaagaaa ctcccgaaat 1260 tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt cctgaaggct taggtgtagg 1320 cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt gataaacaat tggctgtaat 1380 gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac tttttgtttt atggtcatga 1440 tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc attatcttta gatttttcac 1500 tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac atattacaca ttcagcaaaa 1560 caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag ggtctagcaa aggaaacaac 1620 aatgggaggt agaggtcgtg tggcaaagtg gaagttcaag ggaagaagcc tctctcaagg 1680 gttccaaaca caaagccacc attcactgtt ggccaactca agaaagcaat tccaccacac 1740 tgctttcagc gctccctcct cacttcattc tcctatgttg tttatgacct ttcatttgcc 1800 ttcattttct acattgccac cacctacttc cacctccttc ctcaaccctt ttccctcatt 1860 gcatggccaa tctattgggt tctccaaggt tgccttctca ctggtgtgtg ggtgattgct 1920 cacgagtgtg gtcaccatgc cttcagcaag taccaatggg ttgatgatgt tgtgggtttg 1980 acccttcact caacactttt agtcccttat ttctcatgga aaataagcca tcgccgccat 2040 cactccaaca caggttccct tgaccgtgat gaagtgtttg tcccaaaacc aaaatccaaa 2100 gttgcatggt tttccaagta cttaaacaac cctctaggaa gggctgtttc tcttctcgtc 2160 acactcacaa tagggtggcc tatgtattta gccttcaatg tctctggtag accctatgat 2220 agttttgcaa gccactacca cccttatgct cccatatatt ctaaccgtga gaggcttctg 2280 atctatgtct ctgatgttgc tttgttttct gtgacttact ctctctaccg tgttgcaacc 2340 ctgaaagggt tggtttggct gctatgtgtt tatggggtgc ctttgctcat tgtgaacggt 2400 tttcttgtga ctatcacata tttgcagcac acacactttg ccttgcctca ttacgattca 2460 tcagaatggg actggctgaa gggagctttg gcaactatgg acagagatta tgggattctg 2520 aacaaggtgt ttcatcacat aactgatact catgtggctc accatctctt ctctacaatg 2580 ccacattacc atgcaatgga ggcaaccaat gcaatcaagc caatattggg tgagtactac 2640 caatttgatg acacaccatt ttacaaggca ctgtggagag aagcgagaga gtgcctctat 2700 gtggagccag atgaaggaac atccgagaag ggcgtgtatt ggtacaggaa caagtattga 2760 tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 2820 ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa 2880 cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa 2940 agtgttctgc ttatagcttt ctgcctaaaa tgcacgctgc acgggacaat atcattggta 3000 atttttttaa aatctgaatt gaggctactc ataatactat ccataggaca tcaaagacat 3060 gttgcattga ctttaagcag aggttcatct agaggattac tgcataggct tgaactacaa 3120 gtaatttaag ggacgagagc aactttagct ctaccacgtc gttttacaag gttattaaaa 3180 tcaaattgat cttattaaaa ctgaaaattt gtaataaaat gctattgaaa aattaaaata 3240 tagcaaacac ctaaattgga ctgattttta gattcaaatt taataattaa tctaaattaa 3300 acttaaattt tataatatat gtcttgtaat atatcaagtt ttttttttta ttattgagtt 3360 tggaaacata taataaggaa cattagttaa tattgataat ccactaagat cgacttagta 3420 ttacagtatt tggatgattt gtatgagata ttcaaacttc actcttatca taatagagac 3480 aaaagttaat actgatggtg gagaaaaaaa aatgttattg ggagcatatg gtaagataag 3540 acggataaaa atatgctgca gcctggagag ctaatgtatt ttttggtgaa gttttcaagt 3600 gacaactatt catgatgaga acacaataat attttctact tacctatccc acataaaata 3660 ctgattttaa taatgatgat aaataatgat taaaatattt gattctttgt taagagaaat 3720 aaggaaaaca taaatattct catggaaaaa tcagcttgta ggagtagaaa ctttctgatt 3780 ataattttaa tcaagtttaa ttcattcttt taattttatt attagtacaa aatcattctc 3840 ttgaatttag agatgtatgt tgtagcttaa tagtaatttt ttatttttat aataaaattc 3900 aagcagtcaa atttcatcca aataatcgtg ttcgtgggtg taagtcagtt attccttctt 3960 atcttaatat acacgcaaag gaaaaaataa aaataaaatt cgaggaagcg cagcagcagc 4020 tgataccacg ttggttgacg aaactgataa aaagcgctgt cattgtgtct ttgtttgatc 4080 atcttcacaa tcacatctcc agaacacaaa gaagagtgac ccttcttctt gttattccac 4140 ttgcgttagg tttctacttt cttctctctc tctctctctc tcttcattcc tcatttttcc 4200 ctcaaacaat caatcaattt tcattcagat tcgtaaattt ctcgattaga tcacggggtt 4260 aggtctccca ctttatcttt tcccaagcct ttctctttcc ccctttccct gtctgcccca 4320 taaaattcag gatcggaaac gaactgggtt cttgaatttc actctagatt ttgacaaatt 4380 cgaagtgtgc atgcactgat gcgacccact cccccttttt tgcattaaac aattatgaat 4440 tgaggttttt cttgcgatca tcattgcttg aattgaatca tattaggttt agattct 4497 <210> 5 <211> 206 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1A 3'UTR <400> 5 tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 60 ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa 120 cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa 180 agtgttctgc ttatagcttt ctgcct 206 <210> 6 <211> 125 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD2-1A 5'UTR <400> 6 ccatatacta atatttgctt gtattgatag cccctccgtt cccaagagta taaaactgca 60 tcgaataata caagccacta ggcatgggtc tagcaaagga aacaacaatg ggaggtagag 120 gtcgt 125 <210> 7 <211> 191 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 1 <400> 7 gtaataattt ttgtgtttct tactcttttt tttttttttt tgtttatgat atgaatctca 60 cacattgttc tgttatgtca tttcttcttc atttggcttt agacaactta aatttgagat 120 ctttattatg tttttgctta tatggtaaag tgattcttca ttatttcatt cttcattgat 180 tgaattgaac a 191 <210> 8 <211> 346 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 2 <400> 8 ttagttcata ctggcttttt tgtttgttca tttgtcattg aaaaaaaatc ttttgttgat 60 tcaattattt ttatagtgtg tttggaagcc cgtttgagaa aataagaaat cgcatctgga 120 atgtgaaagt tataactatt tagcttcatc tgtcgttgca agttctttta ttggttaaat 180 ttttatagcg tgctaggaaa cccattcgag aaaataagaa atcacatctg gaatgtgaaa 240 gttataactg ttagcttctg agtaaacgtg gaaaaaccac attttggatt tggaaccaaa 300 ttttatttga taaatgacaa ccaaattgat tttgatggat tttgca 346 <210> 9 <211> 142 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 3A <400> 9 gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg ttcttgattc aattacattt tatttatttg 60 gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg cttcctgagg ctgttcttga acatggctct 120 tttttatgtg tcattatctt ag 142 <210> 10 <211> 1228 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 4 <400> 10 taacaaaaat aaatagaaaa tagtgggtga acacttaaat gcgagatagt aatacctaaa 60 aaaagaaaaa aatataggta taataaataa tataactttc aaaataaaaa gaaatcatag 120 agtctagcgt agtgtttgga gtgaaatgat gttcacctac cattactcaa agattttgtt 180 gtgtccctta gttcattctt attattttac atatcttact tgaaaagact ttttaattat 240 tcattgagat cttaaagtga ctgttaaatt aaaataaaaa acaagtttgt taaaacttca 300 aataaataag agtgaaggga gtgtcatttg tcttctttct tttattgcgt tattaatcac 360 gtttctcttc tctttttttt ttttcttctc tgctttccac ccattatcaa gttcatgtga 420 agcagtggcg gatctatgta aatgagtggg gggcaattgc acccacaaga ttttattttt 480 tatttgtaca ggaataataa aataaaactt tgcccccata aaaaataaat attttttctt 540 aaaataatgc aaaataaata taagaaataa aaagagaata aattattatt aattttatta 600 ttttgtactt tttatttagt ttttttagcg gttagatttt tttttcatga cattatgtaa 660 tcttttaaaa gcatgtaata tttttatttt gtgaaaataa atataaatga tcatattagt 720 ctcagaatgt ataaactaat aataatttta tcactaaaag aaattctaat ttagtccata 780 aataagtaaa acaagtgaca attatatttt atatttactt aatgtgaaat aatacttgaa 840 cattataata aaacttaatg acaggagata ttacatagtg ccataaagat attttaaaaa 900 ataaaatcat taatacactg tactactata taatattcga tatatatttt taacatgatt 960 ctcaatagaa aaattgtatt gattatattt tattagacat gaatttacaa gccccgtttt 1020 tcatttatag ctcttacctg tgatctattg ttttgcttcg ctgtttttgt tggtcaaggg 1080 acttagatgt cacaatatta atactagaag taaatattta tgaaaacatg taccttacct 1140 caacaaagaa agtgtggtaa gtggcaacac acgtgttgca tttttggccc agcaataaca 1200 cgtgtttttg tggtgtacta aaatggac 1228 <210> 11 <211> 625 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 5 <400> 11 gtacatttta ttgcttattc acctaaaaac aatacaatta gtacatttgt tttatctctt 60 ggaagttagt cattttcagt tgcatgattc taatgctctc tccattctta aatcatgttt 120 tcacacccac ttcatttaaa ataagaacgt gggtgttatt ttaatttcta ttcactaaca 180 tgagaaatta acttatttca agtaataatt ttaaaatatt tttatgctat tattttatta 240 caaataatta tgtatattaa gtttattgat tttataataa ttatattaaa attatatcga 300 tattaatttt tgattcactg atagtgtttt atattgttag tactgtgcat ttattttaaa 360 attggcataa ataatatatg taaccagctc actatactat actgggagct tggtggtgaa 420 aggggttccc aaccctcctt tctaggtgta catgctttga tacttctggt accttcttat 480 atcaatataa attatatttt gctgataaaa aaacatggtt aaccattaaa ttcttttttt 540 aaaaaaaaaa ctgtatctaa actttgtatt attaaaaaga agtctgagat taacaataaa 600 ctaacactca tttggattca ctgca 625 <210> 12 <211> 98 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 3B <400> 12 ggtgagtgat tttttgactt ggaagacaac aacacattat tattataata tggttcaaaa 60 caatgacttt ttctttatga tgtgaactcc atttttta 98 <210> 13 <211> 115 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A intron 3C <400> 13 ggtaactaaa ttactcctac attgttactt tttcctcctt ttttttatta tttcaattct 60 ccaattggaa atttgaaata gttaccataa ttatgtaatt gtttgatcat gtgca 115 <210> 14 <211> 1037 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> Fad3-1C intron 4 <400> 14 gtaacaaaaa taaatagaaa atagtgagtg aacacttaaa tgttagatac taccttcttc 60 ttcttttttt tttttttttt gaggttaatg ctagataata gctagaaaga gaaagaaaga 120 caaatatagg taaaaataaa taatataacc tgggaagaag aaaacataaa aaaagaaata 180 atagagtcta cgtaatgttt ggatttttga gtgaaatggt gttcacctac cattactcaa 240 agattctgtt gtctacgtag tgtttggact ttggagtgaa atggtgttca cctaccatta 300 ctcagattct gttgtgtccc ttagttactg tcttatattc ttagggtata ttctttattt 360 tacatccttt tcacatctta cttgaaaaga ttttaattat tcattgaaat attaacgtga 420 cagttaaatt aaaataataa aaaattcgtt aaaacttcaa ataaataaga gtgaaaggat 480 catcattttt cttctttctt ttattgcgtt attaatcatg cttctcttct tttttttctt 540 cgctttccac ccatatcaaa ttcatgtgaa gtatgagaaa atcacgattc aatggaaagc 600 tacaggaacy ttttttgttt tgtttttata atcggaatta atttatactc cattttttca 660 caataaatgt tacttagtgc cttaaagata atatttgaaa aattaaaaaa attattaata 720 cactgtacta ctatataata tttgacatat atttaacatg attttctatt gaaaatttgt 780 atttattatt ttttaatcaa aacccataag gcattaattt acaagaccca tttttcattt 840 atagctttac ctgtgatcat ttatagcttt aagggactta gatgttacaa tcttaattac 900 aagtaaatat ttatgaaaaa catgtgtctt accccttaac cttacctcaa caaagaaagt 960 gtgataagtg gcaacacacg tgttgctttt ttggcccagc aataacacgt gtttttgtgg 1020 tgtacaaaaa tggacag 1037 <210> 15 <211> 4010 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> partial FAD3-1A genomic clone <400> 15 acaaagcctt tagcctatgc tgccaataat ggataccaac aaaagggttc ttcttttgat 60 tttgatccta gcgctcctcc accgtttaag attgcagaaa tcagagcttc aataccaaaa 120 cattgctggg tcaagaatcc atggagatcc ctcagttatg ttctcaggga tgtgcttgta 180 attgctgcat tggtggctgc agcaattcac ttcgacaact ggcttctctg gctaatctat 240 tgccccattc aaggcacaat gttctgggct ctctttgttc ttggacatga ttggtaataa 300 tttttgtgtt tcttactctt tttttttttt ttttgtttat gatatgaatc tcacacattg 360 ttctgttatg tcatttcttc ttcatttggc tttagacaac ttaaatttga gatctttatt 420 atgtttttgc ttatatggta aagtgattct tcattatttc attcttcatt gattgaattg 480 aacagtggcc atggaagctt ttcagatagc cctttgctga atagcctggt gggacacatc 540 ttgcattcct caattcttgt gccataccat ggatggttag ttcatactgg cttttttgtt 600 tgttcatttg tcattgaaaa aaaatctttt gttgattcaa ttatttttat agtgtgtttg 660 gaagcccgtt tgagaaaata agaaatcgca tctggaatgt gaaagttata actatttagc 720 ttcatctgtc gttgcaagtt cttttattgg ttaaattttt atagcgtgct aggaaaccca 780 ttcgagaaaa taagaaatca catctggaat gtgaaagtta taactgttag cttctgagta 840 aacgtggaaa aaccacattt tggatttgga accaaatttt atttgataaa tgacaaccaa 900 attgattttg atggattttg caggagaatt agccacagaa ctcaccatga aaaccatgga 960 cacattgaga aggatgagtc atgggttcca gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg 1020 ttcttgattc aattacattt tatttatttg gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg 1080 cttcctgagg ctgttcttga acatggctct tttttatgtg tcattatctt agttaacaga 1140 gaagatttac aagaatctag acagcatgac aagactcatt agattcactg tgccatttcc 1200 atgtttgtgt atccaattta tttggtgagt gattttttga cttggaagac aacaacacat 1260 tattattata atatggttca aaacaatgac tttttcttta tgatgtgaac tccatttttt 1320 agttttcaag aagccccgga aaggaaggct ctcacttcaa tccctacagc aatctgtttc 1380 cacccagtga gagaaaagga atagcaatat caacactgtg ttgggctacc atgttttctc 1440 tgcttatcta tctctcattc attaactagt ccacttctag tgctcaagct ctatggaatt 1500 ccatattggg taactaaatt actcctacat tgttactttt tcctcctttt ttttattatt 1560 tcaattctcc aattggaaat ttgaaatagt taccataatt atgtaattgt ttgatcatgt 1620 gcagatgttt gttatgtggc tggactttgt cacatacttg catcaccatg gtcaccacca 1680 gaaactgcct tggtaccgcg gcaaggtaac aaaaataaat agaaaatagt gggtgaacac 1740 ttaaatgcga gatagtaata cctaaaaaaa gaaaaaaata taggtataat aaataatata 1800 actttcaaaa taaaaagaaa tcatagagtc tagcgtagtg tttggagtga aatgatgttc 1860 acctaccatt actcaaagat tttgttgtgt cccttagttc attcttatta ttttacatat 1920 cttacttgaa aagacttttt aattattcat tgagatctta aagtgactgt taaattaaaa 1980 taaaaaacaa gtttgttaaa acttcaaata aataagagtg aagggagtgt catttgtctt 2040 ctttctttta ttgcgttatt aatcacgttt ctcttctctt tttttttttt cttctctgct 2100 ttccacccat tatcaagttc atgtgaagca gtggcggatc tatgtaaatg agtggggggc 2160 aattgcaccc acaagatttt attttttatt tgtacaggaa taataaaata aaactttgcc 2220 cccataaaaa ataaatattt tttcttaaaa taatgcaaaa taaatataag aaataaaaag 2280 agaataaatt attattaatt ttattatttt gtacttttta tttagttttt ttagcggtta 2340 gatttttttt tcatgacatt atgtaatctt ttaaaagcat gtaatatttt tattttgtga 2400 aaataaatat aaatgatcat attagtctca gaatgtataa actaataata attttatcac 2460 taaaagaaat tctaatttag tccataaata agtaaaacaa gtgacaatta tattttatat 2520 ttacttaatg tgaaataata cttgaacatt ataataaaac ttaatgacag gagatattac 2580 atagtgccat aaagatattt taaaaaataa aatcattaat acactgtact actatataat 2640 attcgatata tatttttaac atgattctca atagaaaaat tgtattgatt atattttatt 2700 agacatgaat ttacaagccc cgtttttcat ttatagctct tacctgtgat ctattgtttt 2760 gcttcgctgt ttttgttggt caagggactt agatgtcaca atattaatac tagaagtaaa 2820 tatttatgaa aacatgtacc ttacctcaac aaagaaagtg tggtaagtgg caacacacgt 2880 gttgcatttt tggcccagca ataacacgtg tttttgtggt gtactaaaat ggacaggaat 2940 ggagttattt aagaggtggc ctcaccactg tggatcgtga ctatggttgg atcaataaca 3000 ttcaccatga cattggcacc catgttatcc accatctttt cccccaaatt cctcattatc 3060 acctcgttga agcggtacat tttattgctt attcacctaa aaacaataca attagtacat 3120 ttgttttatc tcttggaagt tagtcatttt cagttgcatg attctaatgc tctctccatt 3180 cttaaatcat gttttcacac ccacttcatt taaaataaga acgtgggtgt tattttaatt 3240 tctattcact aacatgagaa attaacttat ttcaagtaat aattttaaaa tatttttatg 3300 ctattatttt attacaaata attatgtata ttaagtttat tgattttata ataattatat 3360 taaaattata tcgatattaa tttttgattc actgatagtg ttttatattg ttagtactgt 3420 gcatttattt taaaattggc ataaataata tatgtaacca gctcactata ctatactggg 3480 agcttggtgg tgaaaggggt tcccaaccct cctttctagg tgtacatgct ttgatacttc 3540 tggtaccttc ttatatcaat ataaattata ttttgctgat aaaaaaacat ggttaaccat 3600 taaattcttt ttttaaaaaa aaaactgtat ctaaactttg tattattaaa aagaagtctg 3660 agattaacaa taaactaaca ctcatttgga ttcactgcag acacaagcag caaaaccagt 3720 tcttggagat tactaccgtg agccagaaag atctgcgcca ttaccatttc atctaataaa 3780 gtatttaatt cagagtatga gacaagacca cttcgtaagt gacactggag atgttgttta 3840 ttatcagact gattctctgc tcctccactc gcaacgagac tgagtttcaa actttttggg 3900 ttattattta ttgattctag ctactcaaat tacttttttt ttaatgttat gttttttgga 3960 gtttaacgtt ttctgaacaa cttgcaaatt acttgcatag agagacatgg 4010 <210> 16 <211> 184 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A 3'UTR <400> 16 gtttcaaact ttttgggtta ttatttattg gattctagct actcaaatta cttttttttt 60 aatgttatgt tttttggagt ttaacgtttt ctgaacaact tgcaaattac ttgcatagag 120 agacatggaa tatttatttg aaattagtaa ggtagtaata ataaattttg aattgtcagt 180 ttca 184 <210> 17 <211> 143 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1A 5'UTR <400> 17 tgcggttata taaatgcact atcccataag agtatttttc gaagatttcc ttcttcctat 60 tctaggtttt tacgcaccac gtatccctga gaaaagagag gaaccacact ctctaagcca 120 aagcaaaagc agcagcagca gca 143 <210> 18 <211> 2683 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> partial FAD3-1B genomic clone <400> 18 gttcaagcac agcctctaca acatgttggt aatggtgcag ggaaagaaga tcaagcttat 60 tttgatccaa gtgctccacc acccttcaag attgcaaata tcagagcagc aattccaaaa 120 cattgctggg agaagaacac attgagatct ctgagttatg ttctgaggga tgtgttggta 180 gtgactgcat tggtagctgc agcaatcggc ttcaatagct ggttcttctg gccactctat 240 tggcctgcac aaggcacaat gttttgggca ctttttgttc ttggacatga ttggtaacta 300 attattatta caaattgtta tgttatgtta tgttatgttg ttgtgccttt ttctcagtga 360 tgctttagtc atttcatttc acttggttat gcatgattgt tcgttcatat gttctgtcat 420 ggtgagttct aatttgattg atgcatggaa cagtggtcat ggaagttttt caaacagtcc 480 tttgttgaac agcattgtgg gccacatctt gcactcttca attcttgtac cataccatgg 540 atggtcggtt ccttttagca acttttcatg ttcactttgt ccttaaattt ttttttatgt 600 ttgttaaaaa atctttggtc tgatttaaca acctaaccat ttttacaact catggatttt 660 ttgcaggaga attagccaca ggactcacca tcagaaccat ggccatgttg agaaggatga 720 atcatgggtt ccggtattac tatgagtttg cttgattaat ttccacattt tttctttctt 780 cttaatttta atcagtggtt agatttggtt gtgttccgat agaagaaaag ggggtatcta 840 gagagatgtg aatttcatga agtggttcat gattatgtgt ctttatgcct ttatgtcagc 900 ttacagagaa agtttacaag aatctagaca acatgacaag aatgatgaga ttcactcttc 960 ctttccccat ctttgcatac cccttttatt tggtgagacc ctctttttcc agaatgacag 1020 cattatttta ctatatagta cctcaatttt tatatttcta aaattttgaa ttcttgaaat 1080 tgaaaggaaa ggactttatt gggtctagca tctcactctc tctttgtgat atgaaccata 1140 tatttcagtg gagcagaagc cctggaaaag aaggctctca tttcaaccct tacagcaact 1200 tgttctctcc tggtgagaga agagatgtgc taacttcaac tctatgttgg ggcatcatgc 1260 tttctgtgct tctctatctt tccctcacaa tgggtccact ttttatgctc aagctctatg 1320 gggttcccta tttggtaatc tcactctcac actttcttta tacatcgcac gccagtgtgg 1380 gttatttgca acctacaccg aagtaatgcc ctataattaa tgaggttaac acatgtccaa 1440 gtccaatatt ttgttcactt atttgaactt gaacatgtgt agatcttcgt catgtggctg 1500 gatttcgtca cgtacttgca tcatcatggt tacaagcaga aactgccttg gtaccgtggc 1560 caggtatccc atttaacaca atttgtttca ttaacatttt aagagaattt ttttttcaaa 1620 atagttttcg aaattaagca aataccaagc aaattgttag atctacgctt gtacttgttt 1680 taaagtcaaa ttcatgacca aattgtcctc acaagtccaa accgtccact attttatttt 1740 cacctacttt atagcccaat ttgccatttg gttacttcag aaaagagaac cccatttgta 1800 gtaaatatat tatttatgaa ttatggtagt ttcaacataa aacatactta tgtgcagttt 1860 tgccatcctt caaaagaagg tagaaactta ctccatgtta ctctgtctat atgtaatttc 1920 acaggaatgg agttatctaa ggggtggtct tacaacagta gatcgcgact atggttggat 1980 caacaacatt caccatgaca ttggcaccca tgttatccat caccttttcc ctcaaattcc 2040 acattatcat ttaatcgaag cggtattaat tctctatttc acaagaaatt attgtatgtc 2100 tgcctatgtg atctaagtca attttcacat aacacatgat caaactttct taattctttc 2160 ttctaaattg aaaaagtgga ttatatgtca attgaaaatt ggtcaagacc acaaacatgt 2220 gatgatctcc caccttacat ataataattt ctcctattct acaatcaata atccttctat 2280 ggtcctgaat tgttcctttc ttttttcatt ttcttattct ttttgttgtc ccacaataga 2340 ctaaagcagc aaaggcagtg ctaggaaagt attatcgtga gcctcagaaa tctgggccat 2400 tgccacttca tctaataaag tacttgctcc acagcataag tcaggatcac ttcgttagcg 2460 actctggcga cattgtgtac taccagactg attcccagct ccacaaagat tcttggaccc 2520 agtccaacta aagtttttga tgctacattt acctatttca ctcttaaata ctatttccta 2580 tgtaatatgt aatttagaat atgttaccta ctcaaatcaa ttaggtgaca tgtataagct 2640 ttcataaatt atgctagaaa tgcacttact tttcaaagca tgc 2683 <210> 19 <211> 160 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 1 <400> 19 gtaactaatt attattacaa attgttatgt tatgttatgt tatgttgttg tgcctttttc 60 tcagtgatgc tttagtcatt tcatttcact tggttatgca tgattgttcg ttcatatgtt 120 ctgtcatggt gagttctaat ttgattgatg catggaacag 160 <210> 20 <211> 119 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 2 <400> 20 gttcctttta gcaacttttc atgttcactt tgtccttaaa ttttttttta tgtttgttaa 60 aaaatctttg gtctgattta acaacctaac catttttaca actcatggat tttttgcag 119 <210> 21 <211> 166 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 3a <400> 21 gtattactat gagtttgctt gattaatttc cacatttttt ctttcttctt aattttaatc 60 agtggttaga tttggttgtg ttccgataga agaaaagggg gtatctagag agatgtgaat 120 ttcatgaagt ggttcatgat tatgtgtctt tatgccttta tgtcag 166 <210> 22 <211> 156 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 3b <400> 22 gtgagaccct ctttttccag aatgacagca ttattttact atatagtacc tcaattttta 60 tatttctaaa attttgaatt cttgaaattg aaaggaaagg actttattgg gtctagcatc 120 tcactctctc tttgtgatat gaaccatata tttcag 156 <210> 23 <211> 148 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 3c <400> 23 gtaatctcac tctcacactt tctttataca tcgcacgcca gtgtgggtta tttgcaacct 60 acaccgaagt aatgccctat aattaatgag gttaacacat gtccaagtcc aatattttgt 120 tcacttattt gaacttgaac atgtgtag 148 <210> 24 <211> 351 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 4 <400> 24 taacacaatt tgtttcatta acattttaag agaatttttt tttcaaaata gttttcgaaa 60 ttaagcaaat accaagcaaa ttgttagatc tacgcttgta cttgttttaa agtcaaattc 120 atgaccaaat tgtcctcaca agtccaaacc gtccactatt ttattttcac ctactttata 180 gcccaatttg ccatttggtt acttcagaaa agagaacccc atttgtagta aatatattat 240 ttatgaatta tggtagtttc aacataaaac atacttatgt gcagttttgc catccttcaa 300 aagaaggtag aaacttactc catgttactc tgtctatatg taatttcaca g 351 <210> 25 <211> 277 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B intron 5 <400> 25 gtattaattc tctatttcac aagaaattat tgtatgtctg cctatgtgat ctaagtcaat 60 tttcacataa cacatgatca aactttctta attctttctt ctaaattgaa aaagtggatt 120 atatgtcaat tgaaaattgg tcaagaccac aaacatgtga tgatctccca ccttacatat 180 aataatttct cctattctac aatcaataat ccttctatgg tcctgaattg ttcctttctt 240 ttttcatttt cttattcttt ttgttgtccc acaatag 277 <210> 26 <211> 158 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B 3'UTR <400> 26 agtttttgat gctacattta cctatttcac tcttaaatac tatttcctat gtaatatgta 60 atttagaata tgttacctac tcaaatcaat taggtgacat gtataagctt tcataaatta 120 tgctagaaat gcacttactt ttcaaagcat gctatgtc 158 <210> 27 <211> 83 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FAD3-1B 5'UTR <400> 27 tctaatacga ctcactatag ggcaagcagt ggtatcaacg cagagtacgc gggggtaaca 60 gagaaagaaa catttgagca aaa 83 <210> 28 <211> 4083 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 genomic clone <400> 28 gggaaacaac aaggacgcaa aatgacacaa tagcccttct tccctgtttc cagcttttct 60 ccttctctct ctccatcttc ttcttcttct tcactcagtc aggtacgcaa acaaatctgc 120 tattcattca ttcattcctc tttctctctg atcgcaaact gcacctctac gctccactct 180 tctcattttc tcttcctttc tcgcttctca gatccaactc ctcagataac acaagaccaa 240 acccgctttt tctgcatttc tagactagac gttctaccgg agaaggttct cgattctttt 300 ctcttttaac tttattttta aaataataat aatgagagct ggatgcgtct gttcgttgtg 360 aatttcgagg caatggggtt ctcattttcg ttacagttac agattgcatt gtctgctttc 420 ctcttctccc ttgtttcttt gccttgtctg atttttcgtt tttatttctt acttttaatt 480 tttggggatg gatatttttt ctgcattttt tcggtttgcg atgttttcag gattccgatt 540 ccgagtcaga tctgcgccgg cttatacgac gaatttgttc ttattcgcaa cttttcgctt 600 gattggcttg ttttacctct ggaatctcac acgtgatcaa ataagcctgc tattttagtt 660 gaagtagaat ttgttcttta tcggaaagaa ttctatggat ctgttctgaa attggagcta 720 ctgtttcgag ttgctatttt ttttagtagt attaagaaca agtttgcctt ttattttaca 780 tttttttcct ttgcttttgc caaaagtttt tatgatcact ctcttctgtt tgtgatataa 840 ctgatgtgct gtgctgttat tatttgttat ttggggtgaa gtataatttt ttgggtgaac 900 ttggagcatt tttagtccga ttgatttctc gatatcattt aaggctaagg ttgacctcta 960 ccacgcgttt gcgtttgatg ttttttccat ttttttttta tctcatatct tttacagtgt 1020 ttgcctattt gcatttctct tctttatccc ctttctgtgg aaaggtggga gggaaaatgt 1080 attttttttt tctcttctaa cttgcgtata ttttgcatgc agcgacctta gaaattcatt 1140 atggtggcaa cagctgctac ttcatcattt ttccctgtta cttcaccctc gccggactct 1200 ggtggagcag gcagcaaact tggtggtggg cctgcaaacc ttggaggact aaaatccaaa 1260 tctgcgtctt ctggtggctt gaaggcaaag gcgcaagccc cttcgaaaat taatggaacc 1320 acagttgtta catctaaaga aggcttcaag catgatgatg atctaccttc gcctcccccc 1380 agaactttta tcaaccagtt gcctgattgg agcatgcttc ttgctgctat cacaacaatt 1440 ttcttggccg ctgaaaagca gtggatgatg cttgattgga agccacggcg acctgacatg 1500 cttattgacc cctttgggat aggaaaaatt gttcaggatg gtcttgtgtt ccgtgaaaac 1560 ttttctatta gatcatatga gattggtgct gatcgtaccg catctataga aacagtaatg 1620 aaccatttgc aagtaagtcc gtcctcatac aagtgaatct ttatgatctt cagagatgag 1680 tatgctttga ctaagatagg gctgtttatt tagacactgt aattcaattt catatataga 1740 taatatcatt ctgttgttac ttttcatact atatttatat caactatttg cttaacaaca 1800 ggaaactgca cttaatcatg ttaaaagtgc tgggcttctt ggtgatggct ttggttccac 1860 gccagaaatg tgcaaaaaga acttgatatg ggtggttact cggatgcagg ttgtggtgga 1920 acgctatcct acatggttag tcatctagat tcaaccatta catgtgattt gcaatgtatc 1980 catgttaagc tgctatttct ctgtctattt tagtaatctt tatgaggaat gatcactcct 2040 aaatatattc atggtaatta ttgagactta attatgagaa ccaaaatgct ttggaaattt 2100 gtctgggatg aaaattgatt agatacacaa gctttataca tgatgaacta tgggaaacct 2160 tgtgcaacag agctattgat ctgtacaaga gatgtagtat agcattaatt acatgttatt 2220 agataaggtg acttatcctt gtttaattat tgtaaaaata gaagctgata ctatgtattc 2280 tttgcatttg ttttcttacc agttatatat accctctgtt ctgtttgagt actactagat 2340 gtataaagaa tgcaattatt ctgacttctt ggtgttgggt tgaagttaga taagctatta 2400 gtattattat ggttattcta aatctaatta tctgaaattg tgtgtctata tttgcttcag 2460 gggtgacata gttcaagtgg acacttgggt ttctggatca gggaagaatg gtatgcgtcg 2520 tgattggctt ttacgtgact gcaaaactgg tgaaatcttg acaagagctt ccaggtagaa 2580 atcattctct gtaattttcc ttcccctttc cttctgcttc aagcaaattt taagatgtgt 2640 atcttaatgt gcacgatgct gattggacac aattttaaat ctttcaaaca tttacaaaag 2700 ttatggaacc ctttcttttc tctcttgaag atgcaaattt gtcacgactg aagtttgagg 2760 aaatcatttg aattttgcaa tgttaaaaaa gataatgaac tacatatttt gcaggcaaaa 2820 acctctaatt gaacaaactg aacattgtat cttagtttat ttatcagact ttatcatgtg 2880 tactgatgca tcaccttgga gcttgtaatg aattacatat tagcattttc tgaactgtat 2940 gttatggttt tggtgatcta cagtgtttgg gtcatgatga ataagctgac acggaggctg 3000 tctaaaattc cagaagaagt cagacaggag ataggatctt attttgtgga ttctgatcca 3060 attctagaag aggataacag aaaactgact aaacttgacg acaacacagc ggattatatt 3120 cgtaccggtt taagtgtatg tcaactagtt tttttgtaat tgttgtcatt aatttctttt 3180 cttaaattat ttcagatgtt gctttctaat tagtttacat tatgtatctt cattcttcca 3240 gtctaggtgg agtgatctag atatcaatca gcatgtcaac aatgtgaagt acattgactg 3300 gattctggag gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt 3360 taaccaaagg actgtccttt gattgtttgc agagtgctcc acagccaatc ttggagagtc 3420 atgagctttc ttccgtgact ttagagtata ggagggagtg tggtagggac agtgtgctgg 3480 attccctgac tgctgtatct ggggccgaca tgggcaatct agctcacagt ggacatgttg 3540 agtgcaagca tttgcttcga ctcgaaaatg gtgctgagat tgtgaggggc aggactgagt 3600 ggaggcccaa acctatgaac aacattggtg ttgtgaacca ggttccagca gaaagcacct 3660 aagattttga aatggttaac ggttggagtt gcatcagtct ccttgctatg tttagactta 3720 ttctggcctc tggggagagt tttgcttgtg tctgtccaat caatctacat atctttatat 3780 ccttctaatt tgtgttactt tggtgggtaa gggggaaaag ctgcagtaaa cctcattctc 3840 tctttctgct gctccatatt tcatttcatc tctgattgcg ctactgctag gctgtcttca 3900 atatttaatt gcttgatcaa aatagctagg catgtatatt attattcttt tctcttggct 3960 caattaaaga tgcaattttc attgtgaaca cagcataact attattctta ttatttttgt 4020 atagcctgta tgcacgaatg acttgtccat ccaatacaac cgtgattgta tgctccagct 4080 cag 4083 <210> 29 <211> 109 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron I <400> 29 gtacgcaaac aaatctgcta ttcattcatt cattcctctt tctctctgat cgcaaactgc 60 acctctacgc tccactcttc tcattttctc ttcctttctc gcttctcag 109 <210> 30 <211> 836 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron II <400> 30 gttctcgatt cttttctctt ttaactttat ttttaaaata ataataatga gagctggatg 60 cgtctgttcg ttgtgaattt cgaggcaatg gggttctcat tttcgttaca gttacagatt 120 gcattgtctg ctttcctctt ctcccttgtt tctttgcctt gtctgatttt tcgtttttat 180 ttcttacttt taatttttgg ggatggatat tttttctgca ttttttcggt ttgcgatgtt 240 ttcaggattc cgattccgag tcagatctgc gccggcttat acgacgaatt tgttcttatt 300 cgcaactttt cgcttgattg gcttgtttta cctctggaat ctcacacgtg atcaaataag 360 cctgctattt tagttgaagt agaatttgtt ctttatcgga aagaattcta tggatctgtt 420 ctgaaattgg agctactgtt tcgagttgct atttttttta gtagtattaa gaacaagttt 480 gccttttatt ttacattttt ttcctttgct tttgccaaaa gtttttatga tcactctctt 540 ctgtttgtga tataactgat gtgctgtgct gttattattt gttatttggg gtgaagtata 600 attttttggg tgaacttgga gcatttttag tccgattgat ttctcgatat catttaaggc 660 taaggttgac ctctaccacg cgtttgcgtt tgatgttttt tccatttttt ttttatctca 720 tatcttttac agtgtttgcc tatttgcatt tctcttcttt atcccctttc tgtggaaggt 780 gggagggaaa atgtattttt tttttctctt ctaacttgcg tatattttgc atgcag 836 <210> 31 <211> 169 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron III <400> 31 gtaagtccgt cctcatacaa gtgaatcttt atgatcttca gagatgagta tgctttgact 60 aagatagggc tgtttattta gacactgtaa ttcaatttca tatatagata atatcattct 120 gttgttactt ttcatactat atttatatca actatttgct taacaacag 169 <210> 32 <211> 525 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron IV <400> 32 gttagtcatc tagattcaac cattacatgt gatttgcaat gtatccatgt taagctgcta 60 tttctctgtc tattttagta atctttatga ggaatgatca ctcctaaata tattcatggt 120 aattattgag acttaattat gagaaccaaa atgctttgga aatttgtctg ggatgaaaat 180 tgattagata cacaagcttt atacatgatg aactatggga aaccttgtgc aacagagcta 240 ttgatctgta caagagatgt agtatagcat taattacatg ttattagata aggtgactta 300 tccttgttta attattgtaa aaatagaagc tgatactatg tattctttgc atttgttttc 360 ttaccagtta tatataccct ctgttctgtt tgagtactac tagatgtata aagaatgcaa 420 ttattctgac ttcttggtgt tgggttgaag ttagataagc tattagtatt attatggtta 480 ttctaaatct aattatctga aattgtgtgt ctatatttgc ttcag 525 <210> 33 <211> 389 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron V <400> 33 gtagaaatca ttctctgtaa ttttccttcc cctttccttc tgcttcaagc aaattttaag 60 atgtgtatct taatgtgcac gatgctgatt ggacacaatt ttaaatcttt caaacattta 120 caaaagttat ggaacccttt cttttctctc ttgaagatgc aaatttgtca cgactgaagt 180 ttgaggaaat catttgaatt ttgcaatgtt aaaaaagata atgaactaca tattttgcag 240 gcaaaaacct ctaattgaac aaactgaaca ttgtatctta gtttatttat cagactttat 300 catgtgtact gatgcatcac cttggagctt gtaatgaatt acatattagc attttctgaa 360 ctgtatgtta tggttttggt gatctacag 389 <210> 34 <211> 106 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron VI <400> 34 tatgtcaact agtttttttg taattgttgt cattaatttc ttttcttaaa ttatttcaga 60 tgttgctttc taattagttt acattatgta tcttcattct tccagt 106 <210> 35 <211> 82 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 intron VII <400> 35 gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt taaccaaagg 60 actgtccttt gattgtttgc ag 82 <210> 36 <211> 208 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 3'UTR <400> 36 gatttgaaat ggttaacgat tggagttgca tcagtctcct tgctatgttt agacttattc 60 tggttccctg gggagagttt tgcttgtgtc tatccaatca atctacatgt ctttaaatat 120 atacaccttc taatttgtga tactttggtg ggtaaggggg aaaagcagca gtaaatctca 180 ttctcattgt aattaaaaaa aaaaaaaa 208 <210> 37 <211> 229 <212> DNA <213> Glycine max <220> <223> FATB-1 5'UTR <400> 37 acaattacac tgtctctctc ttttccaaaa ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca 60 caatagccct tcttccctgt ttccagcttt tctccttctc tctctctcca tcttcttctt 120 cttcttcact cagtcagatc caactcctca gataacacaa gaccaaaccc gctttttctg 180 catttctaga ctagacgttc taccggagaa gcgaccttag aaattcatt 229 <210> 38 <211> 1398 <212> DNA <213> Cuphea pulcherrima <220> <223> KAS I gene <400> 38 atgcattccc tccagtcacc ctcccttcgg gcctccccgc tcgacccctt ccgccccaaa 60 tcatccaccg tccgccccct ccaccgagca tcaattccca acgtccgggc cgcttccccc 120 accgtctccg ctcccaagcg cgagaccgac cccaagaagc gcgtcgtgat caccggaatg 180 ggccttgtct ccgttttcgg ctccgacgtc gatgcgtact acgacaagct cctgtcaggc 240 gagagcggga tcggcccaat cgaccgcttc gacgcctcca agttccccac caggttcggc 300 ggccagattc gtggcttcaa ctccatggga tacattgacg gcaaaaacga caggcggctt 360 gatgattgcc ttcgctactg cattgtcgcc gggaagaagt ctcttgagga cgccgatctc 420 ggtgccgacc gcctctccaa gatcgacaag gagagagccg gagtgctggt tgggacagga 480 atgggtggtc tgactgtctt ctctgacggg gttcaatctc ttatcgagaa gggtcaccgg 540 aaaatcaccc ctttcttcat cccctatgcc attacaaaca tggggtctgc cctgctcgct 600 attgaactcg gtctgatggg cccaaactat tcaatttcca ctgcatgtgc cacttccaac 660 tactgcttcc atgctgctgc taatcatatc cgccgtggtg aggctgatct tatgattgct 720 ggaggcactg aggccgcaat cattccaatt gggttgggag gctttgtggc ttgcagggct 780 ctgtctcaaa ggaacgatga ccctcagact gcctctaggc cctgggataa agaccgtgat 840 ggttttgtga tgggtgaagg tgctggagtg ttggtgctgg agagcttgga acatgcaatg 900 aaacgaggag cacctattat tgcagagtat ttgggaggtg caatcaactg tgatgcttat 960 cacatgactg acccaagggc tgatggtctc ggtgtctcct cttgcattga gagtagcctt 1020 gaagatgctg gcgtctcacc tgaagaggtc aattacataa atgctcatgc gacttctact 1080 ctagctgggg atctcgccga gataaatgcc atcaagaagg ttttcaagaa cacaaaggat 1140 atcaaaatta atgcaactaa gtcaatgatc ggacactgtc ttggagcctc tggaggtctt 1200 gaagctatag cgactattaa gggaataaac accggctggc ttcatcccag cattaatcaa 1260 ttcaatcctg agccatccgt ggagttcgac actgttgcca acaagaagca gcaacacgaa 1320 gttaatgttg cgatctcgaa ttcatttgga ttcggaggcc acaactcagt cgtggctttc 1380 tcggctttca agccatga 1398 <210> 39 <211> 1218 <212> DNA <213> Cuphea pulcherrima <400> 39 atgggtgtgg tgactcctct aggccatgac cctgatgttt tctacaataa tctgcttgat 60 ggaacgagtg gcataagcga gatagagacc tttgattgtg ctcaatttcc tacgagaatt 120 gctggagaga tcaagtcttt ctccacagat ggttgggtgg ccccgaagct ctctaagagg 180 atggacaagt tcatgctata catgctgacc gctggcaaga aagcattaac agatggtgga 240 atcaccgaag atgtgatgaa agagctagat aaaagaaaat gcggagttct cattggctca 300 gcaatgggtg gaatgaaggt attcaatgat gccattgaag ccctaaggat ttcatataag 360 aagatgaatc ccttttgtgt acctttcgct accacaaata tgggatcagc tatgcttgca 420 atggacttgg gatggatggg gcccaactac tcgatatcta ctgcttgtgc aacgagtaac 480 ttttgtataa tgaatgctgc gaaccatata atcagaggcg aagcagatgt gatgctttgc 540 gggggctcag atgcggtaat catacctatt ggtatgggag gttttgttgc atgccgagct 600 ttgtcccaga gaaattccga ccctactaaa gcttcaagac catgggacag taatcgtgat 660 ggatttgtta tgggggaagg agctggagtg ctactactag aggagttgga gcatgcaaag 720 aaaagaggtg cgactattta cgcagaattt ctaggtggga gtttcacttg cgatgcctac 780 cacatgaccg agcctcaccc tgatggagct ggagtgattc tctgcataga gaaggctttg 840 gctcagtcag gagtctctag ggaagacgta aattacataa atgcccatgc cacatccact 900 ccggctggag atatcaaaga gtaccaagct cttatccact gtttcggcca aaacagagag 960 ttaaaagtta attcaaccaa atcaatgatt ggtcaccttc tcggagcagc cggtggtgtg 1020 gaagcagttt cagtagttca ggcaataagg actgggtgga tccatccgaa tattaatttg 1080 gaaaacccag atgaaggcgt ggatacaaaa ttgctcgtgg gtcctaagaa ggagagactg 1140 aacgttaagg tcggtttgtc taattcattt gggtttggtg ggcacaactc gtccatactc 1200 ttcgcccctt acatctag 1218 <210> 40 <211> 1191 <212> DNA <213> Ricinus communis <220> <223> delta-9 desaturase <400> 40 atggctctca agctcaatcc tttcctttct caaacccaaa agttaccttc tttcgctctt 60 ccaccaatgg ccagtaccag atctcctaag ttctacatgg cctctaccct caagtctggt 120 tctaaggaag ttgagaatct caagaagcct ttcatgcctc ctcgggaggt acatgttcag 180 gttacccatt ctatgccacc ccaaaagatt gagatcttta aatccctaga caattgggct 240 gaggagaaca ttctggttca tctgaagcca gttgagaaat gttggcaacc gcaggatttt 300 ttgccagatc ccgcctctga tggatttgat gagcaagtca gggaactcag ggagagagca 360 aaggagattc ctgatgatta ttttgttgtt ttggttggag acatgataac ggaagaagcc 420 cttcccactt atcaaacaat gctgaatacc ttggatggag ttcgggatga aacaggtgca 480 agtcctactt cttgggcaat ttggacaagg gcatggactg cggaagagaa tagacatggt 540 gacctcctca ataagtatct ctacctatct ggacgagtgg acatgaggca aattgagaag 600 acaattcaat atttgattgg ttcaggaatg gatccacgga cagaaaacag tccatacctt 660 gggttcatct atacatcatt ccaggaaagg gcaaccttca tttctcatgg gaacactgcc 720 cgacaagcca aagagcatgg agacataaag ttggctcaaa tatgtggtac aattgctgca 780 gatgagaagc gccatgagac agcctacaca aagatagtgg aaaaactctt tgagattgat 840 cctgatggaa ctgttttggc ttttgctgat atgatgagaa agaaaatttc tatgcctgca 900 cacttgatgt atgatggccg agatgataat ctttttgacc acttttcagc tgttgcgcag 960 cgtcttggag tctacacagc aaaggattat gcagatatat tggagttctt ggtgggcaga 1020 tggaaggtgg ataaactaac gggcctttca gctgagggac aaaaggctca ggactatgtt 1080 tgtcggttac ctccaagaat tagaaggctg gaagagagag ctcaaggaag ggcaaaggaa 1140 gcacccacca tgcctttcag ctggattttc gataggcaag tgaagctgta g 1191 <210> 41 <211> 1194 <212> DNA <213> Simmondsia chinensis <220> <223> delta-9 desaturase <400> 41 atggcgttga agcttcacca cacggccttc aatccttcca tggcggttac ctcttcggga 60 cttcctcgat cgtatcacct cagatctcac cgcgttttca tggcttcttc tacaattgga 120 attacttcta aggagatacc caatgccaaa aagcctcaca tgcctcctag agaagctcat 180 gtgcaaaaga cccattcaat gccgcctcaa aagattgaga ttttcaaatc cttggagggt 240 tgggctgagg agaatgtctt ggtgcatctt aaacctgtgg agaagtgttg gcaaccacaa 300 gattttctac ccgacccggc ctccgaggga tttatggatc aagtcaagga gttgagggaa 360 agaaccaaag aaatcccgga tgagtacctt gtggtgttgg ttggcgatat gatcactgaa 420 gaagctcttc cgacctacca gacgatgcta aacacgctcg atggagtacg tgatgagacg 480 ggtgccagcc ttacttcttg ggctatctgg acccgggcat ggaccgctga agagaatagg 540 cacggtgatc ttttgaacaa gtatctttac cttactggtc gagttgacat gaagcagata 600 gagaagacaa tccagtatct aatcggatct ggaatggacc ctcgaagtga aaacaacccc 660 tatctaggct tcatctacac ttccttccaa gagagagcaa ccttcatctc ccatggaaac 720 accgctaggc tcgccaaaga ccacggcgac tttcaactag cacaagtatg tggcatcatc 780 gctgcagatg agaagcgcca cgaaactgcc tacacaaaaa ttgtcgaaaa gctctttgaa 840 atcgacccag acggcgctgt tctagcacta gctgacatga tgagaaagaa ggtttccatg 900 ccagcccact taatgtatga tggcaaagat gacaatctct ttgagaacta ctcagccgtc 960 gctcaacaaa ttggagttta caccgcgaag gactacgctg acatcctcga acacctcgtt 1020 aatcgctgga aagtcgagaa tttaatgggt ctgtctggcg agggacataa ggctcaagat 1080 ttcgtatgtg ggttggcccc gaggatcagg aaactcgggg agagagctca gtcgctaagc 1140 aaaccggtat ctcttgtccc cttcagctgg attttcaaca aggaattgaa ggtt 1194 <210> 42 <211> 2077 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FATB-2 cDNA Contig <400> 42 gagggaaaca aggaagcgaa atgacacaat agtccttctt ccctgtttcc actttccagg 60 ttttctcctt ctcgtttgtt gagcgctttt ctctccctct ccctcttctt cactcagtca 120 gctgccgtag aaattcatta tggtggcaac agctgcaact tcatcatttt tccctgttac 180 ttcaccctcg ccggactctg gtggacatgc aaagttactc aaaataatcg ctggccctat 240 cacattattg ttaatattct tcccttcttt accttctact ttccgaatcc agaaaacacc 300 acaacaccac ccagaattgt tgggttccat tctcaaaaca gagaacaaga agaagaagaa 360 agagagagag tgaaaacggg aaaagcaaaa agttgtttct gtgattgatt ctctgcaacc 420 gaatcatcat cagccacttc ttcccgtttc atctctccca tttcttcttt tcttccgctc 480 tggttcagta aggcgaagag ggttaacgtt attcataatg gttgcaacag ccgctacggc 540 gtcgtttctt cccgtgcctt tgccagacgc tggaaaaggg aaacccaaga aactgggtgg 600 tggtggcggt ggcggtggcg gttctgtgaa cctcggagga ctcaaacaga aacaaggttt 660 gtgcggtggc ttgcaggtca aggcaaacgc acaagcccct ccgaagaccg tggagaaggt 720 tgagaatgat ttgtcgtcgt cgtcctcgtc gatttcgcac gccccgagga ctttcatcaa 780 ccagttacct gactggagca tgcttctggc cgccatcacc accgtgttcc tggcggcgga 840 gaagcagtgg atgatgctgg attggaagcc gcggcgcccc gacatgctca ttgacccctt 900 tgggattggg aagatcgtgc aggatgggct tgtgttcagg cagaacttcc ccattaggtc 960 ctatgagatt ggcgccgata aaaccgcgtc tatcgagact ttaatgaatc atttgcagga 1020 gactgcactt aatcatgtta agactgctgg gcttcttggt gatggatttg gttccacgcc 1080 tgaaatgtgc aaaaagaacc tgatatgggt ggtgactaag atgcaggttg tggttgataa 1140 atatcccaca tggggtgatg ttgttcaagt agacacttgg gtatctgcat cagggaagaa 1200 tggtatgtgt cgtgattggc ttgtgcgtga cgcgaaatct ggtgaaatct tgacaagagc 1260 ctccagtgtt tgggtcatga tgaataaagt gacaagaaga ctgtctaaaa ttcccgaaga 1320 agtcagggca gagataagct cttattttgt ggactctgct ccagttgtgc cagaggataa 1380 cagaaaacta accaaacttg atgaatccgc taatttcatt cgcactggtt taagtcccag 1440 atggaatgat ctagatgtga atcagcatgt taacaatgtg aagtatgttg ggtggattct 1500 ggagagtgct ccacagccac ttttggagag ccatgagctg tgtgccatga cattggagta 1560 caggagggag tgtggcagga acagtgtgct ggattccctc tctgatctct ctggtgctga 1620 tgtaggaaac ttggcagatg gtggattttt tgagtgcaag cacttgcttc gacttgatga 1680 tggtgctgag attgtgaggg gtaggactca atggaggccc aaacctttaa gcagcaactt 1740 tggtcatgtt ttgagtcagg ttccagttcc agcagaaagc acctgaatct tatcttattg 1800 attggcatca ctggaggagg agtggcataa attcatagag agctttgctt gtttttatca 1860 aatctacgta tcttaaaata tatataaaag aaagtgtgtt actttggcta aaaaagggga 1920 ggggaagtag aaagtaaaaa aaaaaaaaaa aatctcgctc tcatgatttt gtaattaaaa 1980 aatagctcct agcactactt tctcctacct gctccatttt ctgtttcact tatggttatg 2040 ctgctgcttg gtgtcatcaa tatttaattg tttcatc 2077 <210> 43 <211> 4634 <212> DNA <213> Glycine max <400> 43 ggaaacaagg aagcgaaatg acacaatagt ccttcttccc tgtttccact ttccaggttt 60 tctccttctc gtttgttgag cgcttttctc tccctctccc tcttcttcac tcagtcaggt 120 acgctaacaa atctgctatt caatcaattc ctctttctct ctgatctacg tacgtgtccg 180 caaactgcac ctccactctc cactcattcc atctaatctt cccttttcgc ttcagagatc 240 caactcctca tataattcaa gacaaaatcc cgcgttttct gcatttctag acgttctacc 300 ctacaaggtt ctcgattctt cttttttctt tttttttaga ctattattat tttaaaaaaa 360 taaaaataat aatgagagct ggatgcgtct gttcgttgtg aatttcgagg caatggggtt 420 ctgattttcg ttacagattg cattgtttgc tttcctcctc tccgtttttt ctttgccttg 480 tttttatttt taattttggg gatgttttcg gtcttgcctt tgtttctgca tttttttttc 540 ggtttgcgat gttttcagat ctgcgctggc ttatacgacg aatttgttct tattcgtgac 600 tttccgcttg attgacctgt tttacctctg gaatctcaca cgtgatcaaa taaggctgct 660 attttagttg aagtagaatc tatacacact ttgtagcatt ctttttacga tcacttacac 720 gggtggtttt taatcaggct ttttttgtgg gggtataaac atcttcctcc tcgattcttt 780 ccgataaaag cttaattgga ttataggaag tgggaaacaa tgcgtgggag ctctttggtt 840 tgtttttcgt aggttaaact tgcaggttta agttctgaat caggagttcc aaatatagag 900 gctgggggca taaaaaaaga gaattctatg gatctgttct gaaattggag ccactgtttc 960 gagttgctat ttttttacta gtattaataa gaacaagttt gctttttatt ttacattttt 1020 tcccgtttct tttgccaaaa gtatttatga tcactctctt ctgtttgtga tattacttat 1080 aagtgctgtg ctgtaattat ttgttatttg gggtgaagta taatttttgg gtgaacttgg 1140 agcgttttta gttagattga tttctcgata tcatttaagg tttaggttga ccccttccac 1200 tcgtttgtgg ttgattgttt tttttttttt atctcttatc atttacagtg cttctttgcc 1260 tatttttttc attatcccct ttcgtgaaag gtaggagaag aaaaacaatg acttgcgtaa 1320 attttgcatg cagctgccgt agaaattcat tatggtggca acagctgcaa cttcatcatt 1380 tttccctgtt acttcaccct cgccggactc tggtggacat gcaaagttac tcaaaataat 1440 cgctggccct atcacattat tgttaatatt cttcccttct ttaccttcta ctttccgaat 1500 ccagaaaaca ccacaacacc acccagaatt gttgggttcc attctcaaaa cagagaacaa 1560 gaagaagaag aaagagagag agtgaaaacg ggaaaagcaa aaagttgttt ctgtgattga 1620 ttctctgcaa ccgaatcatc atcagccact tcttcccgtt tcatctctcc catttcttct 1680 tttcttccgc tctggttcag taaggcgaag agggttaacg ttattcataa tggttgcaac 1740 agccgctacg gcgtcgtttc ttcccgtgcc tttgccagac gctggaaaag ggaaacccaa 1800 gaaactgggt ggtggtggcg gtggcggtgg cggttctgtg aacctcggag gactcaaaca 1860 gaaacaaggt ttgtgcggtg gcttgcaggt caaggcaaac gcacaagccc ctccgaagac 1920 cgtggagaag gttgagaatg atttgtcgtc gtcgtcctcg tcgatttcgc acgccccgag 1980 gactttcatc aaccagttac ctgactggag catgcttctg gccgccatca ccaccgtgtt 2040 cctggcggcg gagaagcagt ggatgatgct ggattggaag ccgcggcgcc ccgacatgct 2100 cattgacccc tttgggattg ggaagatcgt gcaggatggg cttgtgttca ggcagaactt 2160 ccccattagg tcctatgaga ttggcgccga taaaaccgcg tctatcgaga ctttaatgaa 2220 tcatttgcag gtcagctttt gcaaaaaatt gctgagaatt gcattcagca atcacgataa 2280 atataacttt taataaatta ttatagaagt taagtaactt atcacgggtt gtcaacaaaa 2340 atttagagaa taattgcata ggacaaaact tacctacagt tcgtttgaca ttttttgtgt 2400 cgtttttaaa tcaaaattaa aattttatct tggtaatttg cagattatta gatacaactc 2460 caatttcgat caaagaacaa tgccaaaaac acctatggaa tctaagtttt gtgcaattgc 2520 ttattgatga ttttatttta ttgcctaaat tgtctgtttt ccaaacagga gactgcactt 2580 aatcatgtta agactgctgg gcttcttagt gatggatttg gttccacgct gaaatgtgca 2640 aaaagaacct gatatgggtg gtgactaaga tgcaggttgt ggttgataaa tatcccacat 2700 ggtaagttgg tgtgactaag aagaaccttt ttgatgtgtg aagaattgca aaggcgtcca 2760 tgctcagctg tgaaatcttc ttttgcctta ctcatcttta ctttgacttt atatagtatc 2820 tggttgaatt attttgtact tctgcatttg tttctgtcac ttgtgctttt ttgtttcaca 2880 aaattggtat gatagttagg aacttgggat taaaggcatg tttggaatat attgtgattg 2940 tgaattattt ttaaaaatat tttcactttt caaaatctat ctcatgaatc tgtaaaaata 3000 agaataaaaa ataaaactac tgtaatgtgt ataaaaaatt cttcttggat ggtaattgat 3060 ctgataagca catgcttttt acataatgaa ttatatgaag tcctttgcct taagtctgtt 3120 agactgggta tgagatatgg tagtaaattc tttttacatt ccgtacattt ttttgcatat 3180 ttctgtctta ttattgtaaa atgttggatg catatacagg ttttcaaaag aagcaactta 3240 taccatgtgc ccttttctgc attttggtct gttcgagaat aatctcttta gtaaattctg 3300 aatctgttca tctgaagttg agtgaatcta tatttgcttc aggggtgatg ttgttcaagt 3360 agacacttgg gtatctgcat cagggaagaa tggtatgtgt cgtgattggc ttgtgcgtga 3420 cgccaaatct ggtgaaatct tgacaagagc ctccaggtag atatcagttt caggaatcct 3480 ttttttctgt tgcctataga catgttttga agagtttttc tgaatctgaa tgtttctctc 3540 tggtgatttg gcactgcttt taatctcacg aggctgtgtg aagttatcta ttatcatatt 3600 tactttctct taatacacca ctattgaaag gcaattcatt acagatttaa gcatacaaaa 3660 ttttgttgat gataattttt taatctacca acagtatcta atatcttctt aatttgttat 3720 taagtaccag ccttcaactt gtgtacatgt tgcaccttgg tgctacgaac ttataagcat 3780 tttctgattg gttgagtttg attttgattt tgatgttatg cagtgtttgg gtcatgatga 3840 ataaagtgac aagaagactg tctaaaattc ccgaagaagt cagggcagag ataagctctt 3900 attttgtgga ttctgctcca gttgtgccag aggataacag aaaactaacc aaacttgatg 3960 attcagctaa tttcattcgc actggtttaa gtcccagatg gaatgatcta gatgtgaatc 4020 agcatgttaa caatgtgaag tatgttgggt ggattctgga gagtgctcca cagccacttt 4080 tggagagcca tgagctgtgt gccatgacat tggagtacag gagggagtgt ggcaggaaca 4140 gtgtgctgga ttccctctct gatctctctg gtgctgatgt aggaaacttg gcagatggtg 4200 gattttttga gtgcaagcac ttgcttcgac ttgatgatgg tgctgagatt gtgaggggta 4260 ggactcaatg gaggcccaaa cctttaagca gcaactttgg tcatgttttg agtcaggttc 4320 cagttccagc agaaagcacc tgaatcttat cttattgatt ggcatcactg gaggaggagt 4380 ggcataaatt catagagagc tttgcttgtt tttatcaaat ctacgtatct taaaatatat 4440 ataaaagaaa gtgtgttact ttggctaaaa aaggggaggg gaagtagaaa gtaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaat ctcgctctca tgattttgta attaaaaaat agctcctagc actactttct 4560 cctacctgct ccattttctg tttcacttat ggttatgctg ctgcttggtg tcatcaatat 4620 ttaattgttt catc 4634 <210> 44 <211> 1215 <212> DNA <213> Glycine max <400> 44 gtacgctaac aaatctgcta ttcaatcaat tcctctttct ctctgatcta cgtacgtgtc 60 cgcaaactgc acctccactc tccactcatt ccatctaatc ttcccttttc gcttcagaga 120 tccaactcct catataattc aagacaaaat cccgcgtttt ctgcatttct agacgttcta 180 ccctacaagg ttctcgattc ttcttttttc ttttttttta gactattatt attttaaaaa 240 aataaaaata ataatgagag ctggatgcgt ctgttcgttg tgaatttcga ggcaatgggg 300 ttctgatttt cgttacagat tgcattgttt gctttcctcc tctccgtttt ttctttgcct 360 tgtttttatt tttaattttg gggatgtttt cggtcttgcc tttgtttctg catttttttt 420 tcggtttgcg atgttttcag atctgcgctg gcttatacga cgaatttgtt cttattcgtg 480 actttccgct tgattgacct gttttacctc tggaatctca cacgtgatca aataaggctg 540 ctattttagt tgaagtagaa tctatacaca ctttgtagca ttctttttac gatcacttac 600 acgggtggtt tttaatcagg ctttttttgt gggggtataa acatcttcct cctcgattct 660 ttccgataaa agcttaattg gattatagga agtgggaaac aatgcgtggg agctctttgg 720 tttgtttttc gtaggttaaa cttgcaggtt taagttctga atcaggagtt ccaaatatag 780 aggctggggg cataaaaaaa gagaattcta tggatctgtt ctgaaattgg agccactgtt 840 tcgagttgct atttttttac tagtattaat aagaacaagt ttgcttttta ttttacattt 900 tttcccgttt cttttgccaa aagtatttat gatcactctc ttctgtttgt gatattactt 960 ataagtgctg tgctgtaatt atttgttatt tggggtgaag tataattttt gggtgaactt 1020 ggagcgtttt tagttagatt gatttctcga tatcatttaa ggtttaggtt gaccccttcc 1080 actcgtttgt ggttgattgt tttttttttt ttatctctta tcatttacag tgcttctttg 1140 cctatttttt tcattatccc ctttcgtgaa aggtaggaga agaaaaacaa tgacttgcgt 1200 aaattttgca tgcag 1215 <210> 45 <211> 338 <212> DNA <213> Glycine max <400> 45 gtcagctttt gcaaaaaatt gctgagaatt gcattcagca atcacgataa atataacttt 60 taataaatta ttatagaagt taagtaactt atcacgggtt gtcaacaaaa atttagagaa 120 taattgcata ggacaaaact tacctacagt tcgtttgaca ttttttgtgt cgtttttaaa 180 tcaaaattaa aattttatct tggtaatttg cagattatta gatacaactc caatttcgat 240 caaagaacaa tgccaaaaac acctatggaa tctaagtttt gtgcaattgc ttattgatga 300 ttttatttta ttgcctaaat tgtctgtttt ccaaacag 338 <210> 46 <211> 641 <212> DNA <213> Glycine max <400> 46 gtaagttggt gtgactaaga agaacctttt tgatgtgtga agaattgcaa aggcgtccat 60 gctcagctgt gaaatcttct tttgccttac tcatctttac tttgacttta tatagtatct 120 ggttgaatta ttttgtactt ctgcatttgt ttctgtcact tgtgcttttt tgtttcacaa 180 aattggtatg atagttagga acttgggatt aaaggcatgt ttggaatata ttgtgattgt 240 gaattatttt taaaaatatt ttcacttttc aaaatctatc tcatgaatct gtaaaaataa 300 gaataaaaaa taaaactact gtaatgtgta taaaaaattc ttcttggatg gtaattgatc 360 tgataagcac atgcttttta cataatgaat tatatgaagt cctttgcctt aagtctgtta 420 gactgggtat gagatatggt agtaaattct ttttacattc cgtacatttt tttgcatatt 480 tctgtcttat tattgtaaaa tgttggatgc atatacaggt tttcaaaaga agcaacttat 540 accatgtgcc cttttctgca ttttggtctg ttcgagaata atctctttag taaattctga 600 atctgttcat ctgaagttga gtgaatctat atttgcttca g 641 <210> 47 <211> 367 <212> DNA <213> Glycine max <400> 47 gtagatatca gtttcaggaa tccttttttt ctgttgccta tagacatgtt ttgaagagtt 60 tttctgaatc tgaatgtttc tctctggtga tttggcactg cttttaatct cacgaggctg 120 tgtgaagtta tctattatca tatttacttt ctcttaatac accactattg aaaggcaatt 180 cattacagat ttaagcatac aaaattttgt tgatgataat tttttaatct accaacagta 240 tctaatatct tcttaatttg ttattaagta ccagccttca acttgtgtac atgttgcacc 300 ttggtgctac gaacttataa gcattttctg attggttgag tttgattttg attttgatgt 360 tatgcag 367 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 ctgtttccac tttccagg 18 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 cttctcgttt gttgagc 17 <210> 50 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 50 cagctgcaac ttcatc 16 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 51 cttccccatt aggtcc 16 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 52 cacttaatca tgttaaga 18 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 53 gtcgtgattg gcttgtg 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 54 ctctgctcca gttgtgc 17 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 55 gcgagggtga agtaacag 18 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 56 gcacaaacct tgtttctg 18 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 57 caagaagccc agcagtc 17 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 58 gatttcacca gatttcg 17 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 59 gtgcgaatga aattagc 17 <210> 60 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 60 ctttctgctg gaactgg 17 <210> 61 <211> 97 <212> DNA <213> Glycine max <400> 61 aaaagatttc attcttcctc ttctaggtta ttacgcacca cccaccacgt atccctgaaa 60 agagagaaaa acacactaag ccaaagccaa agcagca 97 <210> 62 <211> 159 <212> DNA <213> Glycine max <400> 62 gttatttatt ggattctagc tactcaaatt actttttttt taatgttacg tttttggagt 60 tttaacgttt tctgaacaac ttgcaaatta catgcataga gagacaggaa ttcatagtgg 120 gcctcaatgg aatatttatt tgaaattagt aaggtggta 159

Claims (30)

  1. 총 지방산의 약 42중량% 내지 약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종자는 내생적 대두 FAD2 -1 및 FATB의 발현을 억제하는 핵산 서열을 갖는 게놈을 더 포함하고, 상기 핵산 서열은 약 20개 내지 약 420개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 약 40개 내지 약 450개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 포함하며, 상기 게놈은 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 Δ-9 탈포화효소의 어느 하나 또는 모두의 발현을 증가시키는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 상기 대두 FATB의 단편은 각각 센스- 및 안티센스-방향으로 전사되어, 적어도 부분적으로 이중-가닥의 RNA를 생성시키는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 내생적 대두 FAD2 -1 및 FATB의 발현을 억제하는 핵산 서열은 식물 염색체 내로 삽입된 후, 기능성 전사 단위로서 어셈블리되는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 종자는 약 20개 내지 약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 약 40개 내지 약 450개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 포함하는 핵산 서열을 갖는 게놈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 대두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 상기 대두 FATB의 단편은 각각 센스- 및 안티센스-방향으로 전사되어, 적어도 부분적으로 이중-가닥의 RNA를 생성시키는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 핵산 서열은 식물 염색체 내로 삽입된 후, 기능성 전사 단위로서 어셈블리되는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 종자는 약 20개 내지 약 420개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2 -1 인트론의 단편을 포함하는, 내생적 대두 FAD2 -1의 발현을 억제하는 핵산 서열을 갖는 게놈을 더 포함하고, 상기 게놈은 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 Δ-9 탈포화효소의 어느 하나 또는 모두의 발현을 증가시키는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대두 종자.
  9. 다음의 단계들을 포함하는, 완전한 FAD2 인트론 또는 완전한 FAD2 UTR로 이 루어지는 이종성 FAD2 서열을 포함하는 dsRNAi 구조물을 발현하므로써 얻어지는 FAD2 유전자 억제의 양과 비교하여 FAD2 유전자 억제의 양을 감소시키는 방법:
    ⅰ) 식물 세포 내의 내생적 FAD2 유전자로부터 유래되고, FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는 이종성 FAD2 서열을 식물 세포 내에서 발현시키는 단계; 및
    ⅱ) 상기 이종성 FAD2 서열로 내생적 FAD2 유전자를 억제하는 단계, 여기에서 FAD2 유전자 억제의 양은 완전한 길이의 FAD2 인트론 또는 완전한 길이의 FAD2 UTR로 이루어지는 이종성 FAD2 서열을 발현하므로써 얻어지는 유전자 발현의 양보다 적다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 FAD2 인트론 단편은 완전한 FAD2 인트론 1의 약 40개 내지 약 320개의 연속된 뉴클레오티드이고, 상기 FAD2 UTR 단편은 완전한 FAD2 3' UTR의 약 100개 내지 약 140개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음의 단계들을 포함하는, 식물 세포의 오일 조성을 변화시키는 방법:
    FAD2 인트론 단편 또는 FAD2 UTR 단편으로 이루어지는, 내생적 FAD2 유전자의 부분으로부터 유래된 이종성 FAD2 서열로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 식물 세포를 상기 이종성 FAD2 서열의 전사가 개시되는 조건 하에서 성장시키므로써, 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 이종성 FAD2 서열을 결한 식물 세포와 비교하여, 상기 오일 조성을 변화시키는 단계.
  12. 다음의 단계들을 포함하는, 식물 종자 내에서 올레산 함량을 향상시키고, 포화 지방산 함량을 감소시키는 방법:
    ⅰ) 제1의 이종성 FAD2 서열로 형질전환된 식물로부터의 FAD2 유전자 억제의 양이, 유사한 유전적 기반을 가지고, 제2의 이종성 FAD2 서열을 포함하는 식물 세포 내에서의 FAD2 유전자 억제의 양과 비교하여, 적어도 부분적으로 감소될 때까지 상기 제1의 이종성 FAD2 서열의 길이를 줄이는 단계, 여기에서 상기 제2의 이종성 FAD2 서열은 상기 제1의 이종성 FAD2 서열보다 더 많은 내생적 FAD2 서열로 이루어진다;
    ⅱ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 이종성 FATB 서열을 결한 식물 세포 내에서의 FATB의 억제와 비교하여, 식물 세포 내에서의 FATB 유전자 발현을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 이종성 FATB 서열을 발현시키는 단계;
    ⅲ) 상기 제1의 이종성 FAD2 서열 및 상기 이종성 FATB 서열을 갖는 게놈을 포함하는 식물을 성장시키는 단계; 및
    ⅳ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 제1의 이종성 FAD2 서열 및 상기 이종성 FATB 서열을 결한 식물로부터의 종자와 비교하여, 감소된 포화 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물을 재배하는 단계.
  13. 지방산 합성 경로에서 내생적 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 적어도 40개의 뉴클레오티드 길이의 유전 인자의 단편을 분리하는 단계; 상기 유전 인자를 온대성 오일종자 작물의 식물 세포 내로 도입시키는 단계; 형질전환 식물을 생산하는 단계; 및, 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 상기 유전 인자를 포함하는 형질전환 식물 종자를 선별하는 단계를 포함하는, 온대성 오일종자 작물의 종자로부터의 오일의 지방산 조성을 조절하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 내생적 유전자는 지방산 합성 경로에서의 2 이상의 내생적 유전자들인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 유전 인자는 인트론, 엑손, 전이 펩티드 코딩 DNA 서열, 3' UTR, 5' UTR, 지방산 합성 경로에서의 상기 내생적 유전자의 오픈 리딩 프레임 또는 전사체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 내생적 유전자는 FAD2 -1, FAD3, FATB 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 온대성 오일종자 작물은 대두, 캐놀라, 해바라기, 땅콩, 옥수수 및 목화로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 총 지방산의 약 42중량% 내지 약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자의 세포.
  19. 약 20개 내지 약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 약 40개 내지 약 450개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  20. 약 20개 내지 약 420개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FAD2 -1 인트론의 단편과 약 40개 내지 약 450개의 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 포함하는 핵산 서열, 및 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ 및 Δ-9 탈포화효소의 어느 하나 또는 모두의 발현을 증가시키는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  21. 총 지방산의 약 42중량% 내지 약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 8중량% 이하의 포화 지방산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일.
  22. 총 지방산의 약 42중량% 내지 약 85중량%의 올레산 함량 및 총 지방산의 약 8중량% 미만의 포화 지방산 함량을 포함하는 종자 오일 지방산 조성을 갖는 대두 종자로부터 유래된 대두 가루.
  23. 다음의 단계들을 포함하는, 대두 종자의 리놀렌산 함량을 감소시키는 방법:
    ⅰ) FAD3 유전자 패밀리의 적어도 두 멤버들로부터의 핵산 서열을 포함하는 이종성 핵산 분자를 대두 세포 내로 도입시키는 단계;
    ⅱ) 식물 세포 내에서 내생적 FAD3 유전자 발현을 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있는 FAD3 유전자로부터 핵산 서열을 발현시키는 단계;
    ⅲ) 상기 FAD3 유전자 패밀리의 적어도 두 멤버들로부터의 상기 핵산 서열을 갖는 게놈을 포함하는 식물 세포를 성장시키는 단계; 및
    ⅳ) 유사한 유전적 기반을 갖지만, 상기 FAD3 유전자 패밀리의 적어도 두 멤버를 결한 식물 세포와 비교하여, 감소된 리놀렌산 함량을 갖는 상기 식물 세포를 재배하는 단계.
  24. 제23항에 있어서, 상기 FAD3 유전자 패밀리는 FAD3 -1A, FAD3 -1B, 및 FAD3 -1C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 DNA 단편들은 FAD3의 전사 지역의 5'- 또는 3' UTR로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. FAD3 유전자 패밀리의 적어도 두 멤버들로부터의 DNA 단편들을 포함하는 재조합 DNA 구조물.
  27. 제26항에 있어서, 약 20개 내지 약 420개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대 두 FAD2 -1 인트론의 단편 및 약 40개 내지 약 450개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 대두 FATB 유전자의 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 구조물.
  28. 총 지방산의 약 42중량% 내지 약 85중량%의 올레산 함량, 총 지방산의 약 8중량% 이하의 포화 지방산 함량, 및 총 지방산의 약 1.5중량% 이하의 리놀렌산 함량을 포함하는 지방산 조성을 갖는 비-블렌드 대두 오일.
  29. 제26항의 재조합 DNA 구조물을 포함하는 대두 종자.
  30. 제29항의 대두 종자로부터 유래된 대두 가루.
KR1020087022540A 2006-02-13 2007-02-12 변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법 KR101259217B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77261406P 2006-02-13 2006-02-13
US60/772,614 2006-02-13
US78151906P 2006-03-10 2006-03-10
US60/781,519 2006-03-10
US11/376,328 2006-03-16
US11/376,328 US7566813B2 (en) 2002-03-21 2006-03-16 Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
PCT/US2007/003823 WO2007095243A2 (en) 2006-02-13 2007-02-12 Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080107415A true KR20080107415A (ko) 2008-12-10
KR101259217B1 KR101259217B1 (ko) 2013-04-29

Family

ID=38109483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087022540A KR101259217B1 (ko) 2006-02-13 2007-02-12 변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법

Country Status (9)

Country Link
US (3) US7566813B2 (ko)
EP (3) EP2857517A1 (ko)
KR (1) KR101259217B1 (ko)
AR (1) AR059450A1 (ko)
AU (1) AU2007215181B2 (ko)
CA (1) CA2641264C (ko)
ES (1) ES2532351T3 (ko)
UY (1) UY30147A1 (ko)
WO (1) WO2007095243A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018117377A1 (ko) * 2016-12-22 2018-06-28 주식회사 툴젠 Fad2 유전자 조작된 올레인산 강화 식물체 및 이의 제조 방법

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7566813B2 (en) * 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20040107460A1 (en) * 2002-03-21 2004-06-03 Fillatti Joanne J. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20060080750A1 (en) * 2002-03-21 2006-04-13 Fillatti Joanne J Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
PT1656449E (pt) 2003-08-21 2009-07-27 Monsanto Technology Llc Dessaturases dos ácidos gordos a partir de prímulas
EP1734947B1 (en) 2004-04-16 2015-04-15 Monsanto Technology, LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
BRPI0510132A (pt) 2004-04-22 2007-10-02 Commw Scient Ind Res Org sìntese de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa por células recombinantes
CN102559364B (zh) 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US8859794B2 (en) 2005-04-26 2014-10-14 Battelle Memorial Institute Use of fatty acids as feed material in polyol process
WO2007092569A1 (en) 2006-02-07 2007-08-16 Battelle Memorial Institute Esters of 5 -hydroxymethylfurfural and methods for their preparation
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
CN101500403A (zh) 2006-03-10 2009-08-05 孟山都技术有限责任公司 大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
CN101516181B (zh) 2006-07-14 2015-09-30 联邦科学技术研究组织 改变水稻的脂肪酸组成
CA2679085C (en) * 2007-05-22 2018-04-10 Ls9, Inc. Hydrocarbon-producing genes and methods of their use
WO2009042950A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Ls9, Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation
EP2245166A4 (en) * 2008-01-28 2012-12-05 Univ Oklahoma VERY LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACIDS, METHODS OF MAKING THE SAME AND USES THEREOF
EP2257628A4 (en) * 2008-03-04 2011-11-02 Univ Washington State COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIFFERENTIAL REGULATION OF THE INSETICITY OF FATTY ACIDS IN MEMBRANLIPIDES AND SEED OIL
WO2010009500A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
CN102202498B (zh) * 2008-07-21 2016-09-07 澳大利亚联邦科学与工业研究组织 改良的棉籽油及应用
US20110146142A1 (en) * 2008-08-18 2011-06-23 Ls9, Inc. Systems and methods for production of mixed fatty esters
CN107699545A (zh) * 2008-09-29 2018-02-16 孟山都技术公司 大豆转基因时间mon87705及其检测方法
CN110129296A (zh) 2008-12-23 2019-08-16 Reg生命科学有限责任公司 硫酯酶相关的方法和组合物
EP2382292B1 (en) 2008-12-31 2018-02-21 Battelle Memorial Institute Pre-esterification of primary polyols to improve solubility in solvents used in polyol process
CN102333755B (zh) 2008-12-31 2016-02-24 巴特尔纪念研究院 通过初始的脂肪酸氧化分解后的酯化反应制备酯和多元醇
EP2382293B1 (en) 2008-12-31 2019-01-16 Battelle Memorial Institute Solvent-less preparation of polyols by ozonolysis
WO2010104609A2 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Battelle Memorial Institute Modified vegetable oil lubricants
CA2759273C (en) 2009-04-27 2018-01-09 Ls9, Inc. Production of fatty acid esters
US9480271B2 (en) 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
NZ600206A (en) 2009-12-18 2014-06-27 Cargill Inc Brassica plants yielding oils with a low total saturated fatty acid content
RU2012156277A (ru) 2010-05-25 2014-06-27 Карджилл, Инкорпорейтед Растения brassica, дающие масла с низким содержанием альфа-линоленовой кислоты
US9695434B2 (en) 2010-05-25 2017-07-04 Cargill, Incorporated Brassica plants yielding oils with a low alpha linolenic acid content
CN103201379B (zh) 2010-06-28 2015-08-19 联邦科学技术研究组织 生产脂质的方法
BR112012033668A2 (pt) 2010-07-01 2017-06-13 Du Pont planta e semente transgênica, método para a produção de um planta transgênica, produto e/ou subproduto obtido a partir da semente transgênica, polinucleotídeo isolado e planta ou semente compreendendo uma cosntrução de dna recombinante
CN102676548B (zh) * 2011-03-16 2014-10-08 嘉汉林业(广州)有限公司 麻疯树δ9脂肪酸脱氢酶突变体及其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用
US11639507B2 (en) 2011-12-27 2023-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
MY196561A (en) 2011-12-27 2023-04-19 Commw Scient Ind Res Org Processes for Producing Lipids
NZ631696A (en) * 2012-04-25 2017-02-24 Grains Res & Dev Corp High oleic acid oils
US9049872B2 (en) 2012-06-03 2015-06-09 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1026244
US8816111B2 (en) 2012-06-15 2014-08-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising polyunsaturated fatty acids
US9192119B2 (en) 2013-06-10 2015-11-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety A1036554
CN104726473B (zh) 2013-12-18 2020-02-14 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质
CN110211637B (zh) * 2014-06-26 2023-10-27 10X基因组学有限公司 核酸序列装配的方法和系统
CN105219789B (zh) 2014-06-27 2023-04-07 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
EP4303288A3 (en) 2014-07-07 2024-03-06 Nuseed Global Innovation Ltd Processes for producing industrial products from plant lipids
CA2980738C (en) 2015-03-25 2020-02-25 Cl Products International, Llc Candle products comprising vegetable oil that is low in polyunsaturation and gelling agent
CN104745715B (zh) * 2015-04-22 2017-03-08 南京农业大学 与大豆油脂含量显著关联的GmTPR基因分子标记及其应用
US9999186B2 (en) 2016-06-07 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059533
US9968056B2 (en) 2016-06-07 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01051641
US9974266B2 (en) 2016-06-07 2018-05-22 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01059566
CN110462043A (zh) 2016-09-02 2019-11-15 联邦科学技术研究组织 具有修饰的性状的植物
US10058058B1 (en) 2017-07-06 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063616
US10194615B2 (en) 2017-07-06 2019-02-05 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063576
US10064380B1 (en) 2017-07-06 2018-09-04 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01063585
US10058059B1 (en) 2017-07-14 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01067522
US10660293B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077434
US10743493B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077438
US10743492B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077433
US10660294B2 (en) 2018-08-27 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077435
US10743491B2 (en) 2018-08-27 2020-08-18 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077432
US10512242B1 (en) 2018-08-27 2019-12-24 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077436
US10602706B2 (en) 2018-08-27 2020-03-31 Monsanto Technology Llc Soybean variety 01077437

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4633436A (en) 1983-12-16 1986-12-30 International Business Machines Corp. Real-time rub-out erase for an electronic handwriting facility
US5447858A (en) 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
US4557734A (en) 1984-08-08 1985-12-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Microemulsions from vegetable oil and lower alcohol with octanol surfactant as alternative fuel for diesel engines
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4957748A (en) 1987-03-23 1990-09-18 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Ruminant feed, method of making and method of using
US5534425A (en) 1988-02-03 1996-07-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans having low linolenic acid content and method of production
ES2060765T3 (es) 1988-05-17 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Sistema promotor de ubiquitina en plantas.
US5633441A (en) 1989-08-04 1997-05-27 Plant Genetic Systems, N.V. Plants with genetic female sterility
DK0426641T3 (da) 1989-10-31 2000-10-23 Monsanto Co Promotor til transgene planter
US5391725A (en) 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5585535A (en) * 1990-01-05 1996-12-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybeans and soybean products having low palmitic acid content
US7037692B1 (en) 1990-03-16 2006-05-02 Calgene, Inc. Plant desaturases compositions and uses
US5475099A (en) 1990-08-15 1995-12-12 Calgene Inc. Plant fatty acid synthases
US5219596A (en) 1990-08-24 1993-06-15 Cargill, Incorporated Composition and method thereof for increasing milk production in dairy cattle
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5100679A (en) 1990-10-03 1992-03-31 Cargill B.V. Method of making a modified proteinaceous product and composition thereof
US6022577A (en) * 1990-12-07 2000-02-08 Nabisco Technology Company High stearic acid soybean oil blends
EP0667906A1 (en) * 1991-11-15 1995-08-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company $g(b)-KETOACYL-ACP SYNTHETASE II GENES FROM PLANTS
DE69233118T2 (de) 1991-12-04 2004-04-15 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen
JPH08502891A (ja) 1992-11-02 1996-04-02 カルジーン，インコーポレイティド 植物脂肪酸シンターゼ
DE69333025T2 (de) 1992-11-17 2004-04-29 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Für mikrosom delta 12 fettsäuredesaturase kodierende gene und verwandte enzyme von pflanzen
US6372965B1 (en) * 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
WO1995013390A2 (en) 1993-11-10 1995-05-18 Calgene, Inc. Plant acyl acp thioesterase sequences
US5516980A (en) * 1994-01-10 1996-05-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean variety XB37ZA
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
USRE37317E1 (en) 1994-08-31 2001-08-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequences of canola and soybean palmitoyl-ACP thioesterase genes and their use in the regulation of fatty acid content of the oils of soybean and canola plants
US5454842A (en) 1994-12-02 1995-10-03 Exxon Research & Engineering Co. Cetane improver compositions comprising nitrated fatty acid derivatives
US6150512A (en) * 1995-05-15 2000-11-21 Yuan; Ling Engineering plant thioesterases and disclosure of plant thioesterases having novel substrate specificity
US5955329A (en) 1995-05-15 1999-09-21 Calgene, Inc. Engineering plant thioesterases for altered substrate specificity
ATE290580T1 (de) 1995-06-06 2005-03-15 Agro Man Group Inc Biologisch abbaubare schmierflüssigkeiten auf pflanzlicher basis
US5811636A (en) 1995-09-22 1998-09-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Apomixis for producing true-breeding plant progenies
US5936069A (en) 1995-12-06 1999-08-10 Iowa State University Research Foundation Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans
US5844086A (en) 1996-01-31 1998-12-01 Stilts Corporation Oil seed protein extraction
ZA973565B (en) 1996-04-26 1998-10-26 Du Pont Soybean oil having high oxidative stability
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
DE19631919C2 (de) 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US5850030A (en) * 1996-12-23 1998-12-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Reduced linolenic acid production in soybeans
EP0969714A4 (en) 1997-01-10 2004-10-06 Univ California RESISTANCE GENE NUCLEIC ACIDS FOR PROVIDING DISEASE RESISTANCE PLANTS
DE19702989A1 (de) 1997-01-28 1998-07-30 Clariant Gmbh Umweltfreundlicher Dieseltreibstoff
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US6331664B1 (en) 1997-05-05 2001-12-18 Dow Agrosciences Llc Acyl-ACP thioesterase nucleic acids from maize and methods of altering palmitic acid levels in transgenic plants therewith
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
US6933378B2 (en) 1997-05-30 2005-08-23 Joseph Atabekov Methods for coexpression of more than one gene in eukaryotic cells
WO1998056239A1 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
GB9720148D0 (en) 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US5891203A (en) 1998-01-20 1999-04-06 Ethyl Corporation Fuel lubricity from blends of a diethanolamine derivative and biodiesel
CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 2005-05-18 Benitec Australia Ltd Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
ES2624549T3 (es) 1998-04-08 2017-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisati Métodos y medios para obtener fenotipos modificados
US6426448B1 (en) * 1998-05-11 2002-07-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene combinations that alter the quality and functionality of soybean oil
US6146669A (en) 1998-05-14 2000-11-14 Cargill Incorporated Method for processing oilseed material
EP0959133A1 (en) 1998-05-22 1999-11-24 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) A process for inhibiting expression of genes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
EP1084256A2 (en) 1998-06-05 2001-03-21 Calgene LLC Acyl coa:cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences
US7008664B1 (en) 1998-06-11 2006-03-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for improving the carcass quality of an animal
JP4514952B2 (ja) 1998-07-02 2010-07-28 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質
US6281375B1 (en) 1998-08-03 2001-08-28 Cargill, Incorporated Biodegradable high oxidative stability oils
US6365802B2 (en) * 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
AU6166499A (en) 1998-09-30 2000-04-17 Regents Of The University Of California, The Inhibition of farnesyltransferase activity in plants
JP2002534129A (ja) 1999-01-14 2002-10-15 モンサント テクノロジー エルエルシー ダイズ形質転換方法
EP2314700A1 (en) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US6156227A (en) 1999-03-01 2000-12-05 Cargill, Incorporated Deicer composition which includes a plant material which is a corrosion inhibitor
AR023885A1 (es) 1999-05-10 2002-09-04 Syngenta Participations Ag Metodo para conferir resistencia o tolerancia a mas de un virus seleccionado del grupo formado por un furovirus, potivirus, tospovirus y cucovirus en una celula de planta, y celula de planta que no regenera en una planta completa.
AU6551300A (en) 1999-08-04 2001-03-05 University Of British Columbia, The Regulation of embryonic transcription in plants
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
IL148374A0 (en) 1999-08-26 2002-09-12 Calgene Llc Plants with modified polyunsaturated fatty acids
EP1228229B1 (en) 1999-11-12 2006-08-09 University of South Carolina Control of post-transcriptional gene silencing in plants
BR0015631A (pt) 1999-11-17 2002-07-09 Mendel Biotechnology Inc Planta, polinucleotìdeo, vetor, célula, composição, polipeptìdeo, métodos para produzir uma planta e para identificar um fator que é modulado por, ou interage com, um polipetìdeo codificado por um polinucleotìdeo, uma molécula que module a atividade ou a expressão de um polinucleotìdeo ou polipetìdeo de interesse, e uma sequência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotìdeos, e, sistema integrado, meio computadorizado ou legìvel em computador
US6369296B1 (en) 2000-02-01 2002-04-09 Plant Bioscience Limited Recombinant plant viral vectors
GB2377221B (en) 2000-03-17 2004-08-18 Benitec Australia Ltd Genetic silencing
ES2349892T3 (es) 2000-04-18 2011-01-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Procedimiento de modificación del contenido de aceite de semilla de algodón.
JP3829595B2 (ja) 2000-07-06 2006-10-04 不二製油株式会社 耐寒性油脂組成物及びその製造法
WO2002010365A2 (en) 2000-08-02 2002-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Down-regulation of single genes and simultaneous down-regulation of multiple genes by nuclear localization of rna transcripts
EP2410060A1 (en) 2000-08-22 2012-01-25 Mendel Biotechnology, Inc. Genes for modifying plant traits IV
US6800748B2 (en) 2001-01-25 2004-10-05 Large Scale Biology Corporation Cytoplasmic inhibition of gene expression and expression of a foreign protein in a monocot plant by a plant viral vector
AU2002224668B2 (en) 2001-01-26 2007-09-20 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
WO2002081711A1 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Cropdesign N.V. The use of double and opposite recombination sites for the single step cloning of two dna segments
WO2002088301A2 (en) 2001-05-02 2002-11-07 Gavish Galilee Bio Applications Ltd. Increased methionine in transgenic plants expressing mutant cystathionine gamma-synthase
CA2349970A1 (en) 2001-05-31 2002-11-30 Martin Gagnon Ventilation method and device
US6675809B2 (en) 2001-08-27 2004-01-13 Richard S. Stack Satiation devices and methods
WO2003052108A2 (en) 2001-12-18 2003-06-26 Bayer Bioscience N.V. Improved methods and means for delivering inhibitory rna to plants and applications thereof
US20030166282A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
US7166771B2 (en) * 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20060080750A1 (en) * 2002-03-21 2006-04-13 Fillatti Joanne J Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20040107460A1 (en) * 2002-03-21 2004-06-03 Fillatti Joanne J. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
CA2483544A1 (en) 2002-05-03 2003-11-13 Monsanto Technology, Llc Seed specific usp promoters for expressing genes in plants
AU2003277812A1 (en) 2002-06-21 2004-01-06 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods
EP1516051A4 (en) 2002-06-21 2007-05-02 Monsanto Technology Llc INTRON DOUBLE-STRANDED RNA HYBRID GENES, AND USES THEREOF
AU2003256493A1 (en) * 2002-07-11 2004-02-02 Monsanto Technology, Llc High yielding soybean plants with increased seed protein plus oil
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US8609934B2 (en) 2004-02-13 2013-12-17 Monsanto Technology Llc In vivo assembly of transcription units
CN105557503A (zh) 2009-07-08 2016-05-11 密苏里大学管委会 利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018117377A1 (ko) * 2016-12-22 2018-06-28 주식회사 툴젠 Fad2 유전자 조작된 올레인산 강화 식물체 및 이의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR101259217B1 (ko) 2013-04-29
EP2336334A1 (en) 2011-06-22
EP2857517A1 (en) 2015-04-08
US10280430B2 (en) 2019-05-07
EP1984508A2 (en) 2008-10-29
WO2007095243A3 (en) 2007-12-21
US20090151029A1 (en) 2009-06-11
CA2641264A1 (en) 2007-08-23
CA2641264C (en) 2014-12-02
WO2007095243A2 (en) 2007-08-23
US20140310836A1 (en) 2014-10-16
EP2336334B1 (en) 2014-12-17
US20060206963A1 (en) 2006-09-14
AU2007215181A2 (en) 2008-10-30
AU2007215181B2 (en) 2012-08-23
US7566813B2 (en) 2009-07-28
AR059450A1 (es) 2008-04-09
AU2007215181A1 (en) 2007-08-23
UY30147A1 (es) 2007-09-28
US8802922B2 (en) 2014-08-12
ES2532351T3 (es) 2015-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101259217B1 (ko) 변화된 종자 오일 조성물을 생산하기 위한 핵산 구조물 및 방법
US20040107460A1 (en) Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
AU2003214247B2 (en) Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
CA2490195C (en) A non-blended soybean oil with high oleic acid content
BRPI0708748A2 (pt) composições de óleo e semente de soja e métodos de preparação das mesmas
AU2023202628A1 (en) Plants with modified traits
US20030084480A1 (en) Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acid levels
AU2016203154B2 (en) Soybean seed and oil compositions and methods of making same
JP5242418B2 (ja) 核酸構築体および変化した種子油組成の生成方法
CN101565716A (zh) 核酸构建体及其生产改良的种子油组合物的方法
KR20050024367A (ko) 핵산 서열 및 변형 다중불포화지방산을 갖는 식물의생산을 위한 사용방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160408

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170412

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180412

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190410

Year of fee payment: 7