CN102676548B - 麻疯树δ9脂肪酸脱氢酶突变体及其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用 - Google Patents
麻疯树δ9脂肪酸脱氢酶突变体及其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体及其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用，该酶属于酰基-酰基载体蛋白脱氢酶，具有良好水溶性，与野生型Δ9脂肪酸脱氢酶相比，使酵母细胞的总脂肪酸、不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸的产量均提高1倍。该编码基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。Δ9脂肪酸脱氢酶突变基因共有25个核苷酸发生突变，导致20个氨基酸发生突变，氨基酸序列见SEQIDNO:2所示。本发明还提供含有该基因核苷酸序列的可进行功能性表达的重组质粒、含有该重组质粒的细胞生物体及其子代、用上述重组质粒或含有该重组质粒的细胞生物体及其子代提高不饱和脂肪酸产量的方法及其在酵母发酵生产油脂方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域和遗传工程领域，具体涉及麻疯树（Jatropha curcas）的Δ9脂肪酸脱氢酶突变体、其编码基因、重组质粒、宿主细胞与应用。
背景技术
麻疯树（Jatropha curcas）又名小桐子，为大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha），广泛生长在亚洲、非洲和拉丁美洲等国家和地区。麻疯树是一种多用途的含油灌木植物，除作绿篱栽植外，其有效成分可以用于土壤和水资源防护、抗艾滋、杀菌剂生产、生物柴油、肥皂和蜡烛生产等。麻疯树的最大价值在于其种子油可以作为生物柴油。研究显示麻疯树的种子含油量高达50~60%，每公顷产油可达2700公斤左右。因此，麻疯树也成为当前生产生物柴油的最具开发价值和应用前景的作物之一。印度、东南亚以及我国等多个国家和地区已经将麻疯树生产生物柴油列为生物能源开发的重点领域。研究麻疯树的脂肪酸合成和调控基因，可为进一步进行基因工程改造、获得高产油的优良品种奠定基础，具有重要意义。
油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）等不饱和脂肪酸是麻疯树种子油的主要组分，其含量分别占种子油总量的50%和30%左右。脂肪酸脱氢酶（脂肪酸去饱和酶）可以将脂肪酸链上的C-C单键转化为C=C双键，产生不饱和脂肪酸。脂肪酸去饱和酶分为三类：酰基辅酶A去饱和酶、酰基-酰基载体蛋白（ACP）去饱和酶和酰基脂肪去饱和酶（Murata N，Wada H，Biochem J，1995. 300: 1-8）。在植物和蓝细菌中，大部分去饱和反应由酰基脂肪去饱和酶完成，其将双键引入到以酯形式存在的脂肪酸中。在植物细胞的质体中存在酰基-酰基载体蛋白去饱和酶，可以将双键引入到与酰基载体蛋白结合的脂肪酸中。在动物、酵母、霉菌中广泛存在酰基辅酶A去饱和酶可将双键引入到与辅酶A结合的脂肪酸中。目前只有植物的酰基-酰基载体蛋白去饱和酶是唯一可知的可溶性去饱和酶家族，它包括Δ9-硬脂酰ACP脱氢酶、Δ4-软脂酰ACP脱氢酶、Δ6-软脂酰ACP脱氢酶等。对脂肪酸ACP脱氢酶的晶体分析表明，此类酶可形成一个双铁活性中心，两个铁原子的结合高度对称，其中1个铁原子和E105和H146的侧链作用；另一个与E105和H146的侧链作用。在晶体结构中，从酶表面到内部有一个深的空穴，该空穴为脂肪酰的结合位（Caboon E B.，J Boil Chem，1994. 269:27519-526）。硬脂酸（C18:0）去饱和产生油酸，一般认为该反应由Δ9-硬脂酰ACP脱氢酶在质体的基质中催化完成，然后以脂形式存在的油酸被转运到类囊体膜或进入细胞质中进一步去饱和。研究表明，硬脂酸Δ9脂肪酸脱氢酶广泛存在于油籽植物中，其表达受到生长环境中营养物和其它环境因素的影响（V.M.McDonough，J.E. Stukey，et al. J Boil Chem，1992. 267: 5931-5936）。由于Δ9脂肪酸脱氢酶是第一个向脂肪酸引入双键的酶，其决定了生物体中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量比，在不饱和脂肪酸的合成中起了关键作用。目前，已有多种动物、植物、微生物等不同来源的脂肪酸脱氢酶基因的同源序列被分离获得，有些推定的脂肪酸脱氢酶基因已证明具有相应的酶功能。研究Δ9脂肪酸脱氢酶的表达、生理功能和应用是当前的热点之一 （Luo Tong et al.，2006. Biotechnology Letters 28, 657-662）。同时，作为天然Δ9脂肪酸脱氢酶蛋白，其稳定性、底物亲合性等酶学性质均有待进一步提高。更重要的是高油含量的植物中含有的Δ9脂肪酸脱氢酶， 如麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶，能否在异源真核细胞如酵母中生产不饱和脂肪酸并用于酵母发酵生产油脂仍是一个有待解决的问题。利用分子进化的手段对天然的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶。因此，利用分子进化的手段对Δ9脂肪酸脱氢酶分子进行改造，改善其酶学性质，就显得越发重要。定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需事先了解蛋白质的结构、活性位点以及催化机制等，而是通过模拟自然进化机制，在体外对酶基因进行广泛的突变，产生基因多样性，再结合定向筛选，获得具有某些预期特征的进化酶。易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，通过致错PCR技术获得一种比麻疯树的野生型Δ9脂肪酸脱氢酶进一步提高不饱和脂肪酸产量的突变基因，并提供编码这一突变基因的核苷酸或其核苷酸序列的片段、类似物或者衍生物。
本发明进一步所要解决的技术问题是提供该基因所编码的Δ9脂肪酸脱氢酶突变体多肽、或其片段、类似物或衍生物。
本发明更进一步所要解决的技术问题是提供含有该基因核苷酸序列可进行功能性表达的重组质粒。
本发明更进一步所要解决的技术问题是提供该基因核苷酸序列或包含该基因核苷酸序列的重组质粒转化或转导的真核宿主细胞及其后代。
本发明更进一步所要解决的技术问题是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞，提高相应不饱和脂肪酸产量的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
首先，本发明提供一种通过致错PCR技术获得的编码麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的基因，该基因具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
其次，本发明还提供由上述核苷酸序列所编码的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体，该突变体具有上述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，即序列表中SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。
所述氨基酸序列是与野生型麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶相比含有缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的突变体氨基酸序列，而且该序列具有提高的Δ9脂肪酸脱氢酶的活性。
第三方面，本发明也提供含有上述编码Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的核苷酸序列，可进行功能性表达的重组质粒。在本发明的实施例中，该重组表达载体是上述的核苷酸序列连接异源启动子而成的重组pYES2/CT/JcΔ9mut质粒。
第四方面，本发明还提供被上述核苷酸序列或包含上述核苷酸序列的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。它是细菌细胞、或真菌细胞、或植物细胞、或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。特别是酿酒酵母细胞。
第五方面，本发明还涉及一种上述突变体、突变基因、宿主细胞在生产不饱和脂肪酸中的应用。提供一种用含有上述核苷酸序列、或上述核苷酸序列与异源调节序列连接的重组质粒转化或转导的宿主细胞及其后代细胞，提高相应不饱和脂肪酸产量的方法。
在本发明的一个实施例中，上述含有重组质粒的酿酒酵母细胞的Δ9不饱和脂肪酸产量得到显著提升。
本发明的有益效果如下：本发明通过易错PCR技术对麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶进行体外定向进化，获得的突变酶可以大幅提高不饱和脂肪酸含量。
附图说明
图1A为本发明实施例中所用的酵母表达载体pYES2/CT的模式图。
图1B为本发明麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变基因重组表达质粒（或载体）pYES2/CT/JcΔ9mut的模式图。
图2为本发明实施例中的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体在酿酒酵母中表达的免疫印记图。
图3为本发明实施例中在酿酒酵母中表达的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白经质谱鉴定的多肽片段（阴影部分）。
图4A及图4B为本发明实施例中在酿酒酵母中表达的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白经质谱鉴定的多肽片段的二级质谱图。
图5A为本发明实施例中表达麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白的宿主细胞的不饱和脂肪酸组分的气相色谱对比图。
图5B为表达野生型Δ9脂肪酸脱氢酶的宿主细胞的不饱和脂肪酸组分的气相色谱对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例一 麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变文库的构建
一、麻疯树cDNA的制备
选取新鲜的麻疯树叶片，放入液氮中冰冻，然后放入-80℃冰箱中保存备用。
使用十六烷基三甲基溴化胺（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，CTAB）法提取组织总RNA，具体实施：1）65℃水浴中预热15 ml CTAB提取液；2）液氮中研磨2-3克麻疯树冷冻组织；3）转移样品至有CTAB提取液的离心管中，立即在室温下以100~300转/分钟的转速进行激烈涡旋30s，然后65℃水浴4-5分钟；4）加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋混合，10000转/分钟室温离心15分钟；5）将上清液转移至一新的离心管中，重复抽提一次；6）将上清液转移至一新的离心管中，加入1/3体积的氯化锂，至终浓度为2 M，4℃沉淀过夜；7）4℃下以全速离心（转速为10000~15000转/分钟，下同）1小时，弃上清液，用500 μl 70%乙醇（体积百分比，下同）洗沉淀，然后用500 μl 100%乙醇洗沉淀；8）用500 μl SSTE溶解沉淀，转移至1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；9）加入2倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时；10）4℃下全速离心20分钟，沉淀RNA；11）先用400μl 70%乙醇洗沉淀，然后用400 μl 100%乙醇洗沉淀，吹干后用100 μl的二乙基焦碳酸酯处理的水溶解RNA；12）用DNA酶处理提取的RNA，-20℃保存备用。
将约5 μg麻疯树叶片组织的总RNA，采用Invitrogen公司的反转录试剂盒（Superscript III First Strand）合成cDNA。
二、致错PCR
根据已知的麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶基因设计引物：JcDES_F (5’- CCC AAG CTT ACC ATG Gct ctc aag ctc aat cct -3’, HindIII) 和JcDES_R (5’-CCG GAA TTC CAG CTT CAC TTC TCT ATC AAA-3’, EcoRI)。
以麻疯树叶片组织的cDNA作为模板，进行易错PCR扩增。每50 μl反应体系包含：1×Taq DNA聚合酶缓冲液(50 mM氯化钾，10 mM三羟甲基氨基甲烷，pH9.0，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（w/v，g/l））；0.2 mM dNTP混合物；引物JcDES_F和JcDES_R各15 pmol；0.15 mM氯化锰;1.5 mM氯化镁；cDNA模板4 μl；Taq DNA 聚合酶5 U。PCR程序为：94℃ 5分钟；94℃ 50秒，55℃ 45秒，72℃ 1分20秒，40个循环；72℃ 7分钟。
三、表达载体简介
实验所用酿酒酵母表达载体为pYES2/CT（来自Invitrogen公司），长度5,963 bp（见图1A）。pYES2/CT带有GAL1启动子，该启动子为诱导型，在葡萄糖存在时转录受到抑制，除去葡萄糖加入半乳糖可以诱导转录；该载体具有8-9个单克隆位点和2个BstX克隆位点；具有CYC1转录终止信号；具有pUC复制起始子，能够在大肠杆菌中保持和复制；具有氨苄选择抗性（Ampicillin，Amp），用于筛选大肠杆菌转化子；具有URA3基因，用于在缺乏尿嘧啶的最小培养基(SC/-U)中筛选酵母转化子。与以往的pYES表达载体相比，pYES2/CT最大特色在于其具有羧基末端标签，可表达多肽-V5抗原决定簇和6×His氨基酸短肽，用于重组蛋白的检测和纯化。
四、突变文库的构建
将致错PCR所得的PCR产物纯化后，与pYES2/CT质粒同时以HindIII和EcoRI双酶切。酶切产物经胶纯化后，在T4 DNA连接酶的作用下连接，然后通过电转化的方法转入大肠杆菌DH10B细胞，涂布LB(含100 μg/ml Amp)平板，挑选具有插入片段的克隆，组成突变体库。
实施例二 突变文库的筛选
一、酵母感受态细胞的制备和转化
实验所用宿主细胞为INVSc1酿酒酵母（来自Invitrogen公司），其基因型为：his3Δ1/his3Δ1, leu2/leu2, trp1-289/trp1-289, ura3-52/ura3-52；表型为：His-, Leu-, Trp-, Ura-。此外，INVSc1宿主细胞可以在棉子糖作为碳源的培养基中生长，棉子糖既不诱导也不抑制克隆基因的转录，在其存在的情况下向培养基中加入半乳糖同样可以诱导转录。
1）取INVSc1酵母细胞于30℃在YPD平板上划线培养；2）挑选直径2 mm的单菌落于50 ml液体YPD培养基，30℃培养过夜；3）将过夜培养物转移至300 ml新鲜的YPD培养基在27℃下继续培养2-3小时，至OD600约为0.5；4）室温下1,000×g离心5分钟收集菌体，以25 ml TE溶液(10 mM三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5，1 mM乙二胺四乙酸)洗一次，菌体重悬于1 ml醋酸锂/TE溶液(0.1 M醋酸锂，10 mM三羟甲基氨基甲烷，pH 7.5，1 mM乙二胺四乙酸)中；5）加入2 mg变性鲑鱼精DNA (使用前于100℃加热5分钟，立即置于冰上)和10-50 μg突变文库DNA，混匀；6）加入6 ml聚乙二醇/醋酸锂/TE溶液（含40％聚乙二醇4000的醋酸锂/TE溶液（w/v，g/l）），轻柔混匀，30℃摇床培养30分钟；7）加入700 μl二甲基亚砜，于42℃水浴热激15分钟，然后冷却细胞1-2分钟；8）室温下1,000×g离心5分钟；9）将细胞重悬于1 ml TE溶液中，涂布于SC/-U（2%葡萄糖（w/v，g/l，下同））选择性平板，30℃培养72小时。
二、酵母工程菌的诱导和表达
将含有突变文库质粒的阳性克隆及含有野生型Δ9脂肪酸脱氢酶质粒的对照菌在SC/-U（2%葡萄糖）平板上划线培养，温度30℃，至长出菌落；挑单克隆接入40 ml SC/-U（2%葡萄糖）液体培养基，30℃培养至OD600为0.4；将菌液离心，去掉上清，然后以等体积的去离子水洗两次；将菌体重悬于40 ml SC/-U（2%半乳糖和1%棉子糖（均为w/v，g/l））液体培养基中，于30℃诱导培养12-36小时，至OD600为2.0；离心收集菌体，放-20℃备用。
三、脂肪酸提取及甲酯化
将收集的酵母菌体于真空冷冻干燥机中干燥过夜，然后称重；加入7.6 ml氯仿/甲醇/水（1:2:0.8，v/v），再加入3 μl十七烷酸（C17:0）（10 mg/ml）做内标；室温剧烈震荡至少2 h；加入氯仿和水各2 ml，然后于4,000转/分钟，离心15分钟；将下层有机相于快速真空器中挥发干净；加入4 ml甲苯/石油醚/0.4 M KOH甲醇溶液（1:1:2，v/v），剧烈震荡使其充分溶解，于室温放置1小时；加入5 ml水，混匀后于4,000转/分钟离心15分钟；取0.5 ml上层有机相做GC-MS分析。
四、脂肪酸GC-MS分析
所用GC-MS仪为7890A/5975C（Agilent公司）。毛细管：HP-5MS，30m×0.25 mm × 0.25 μm。进样条件为：用氦气做载气相，气流速度为0.7 ml/分钟，进样量为2 μl，分离比例为10:1，气化室温度为250℃；柱温程序为100℃保温2分钟，然后以10℃/分钟升温至180℃，再以4℃/分钟升温至260℃，最后冷却仪器结束测量。气相色谱分离峰经质谱检测并采用Agilent MSD ChemStation分析软件比对NIST 08质谱数据库可得知对应的脂肪酸组分。
实施例三 一种提高不饱和脂肪酸产量的Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的构建及检测
一、Δ9脂肪酸脱氢酶突变体表达载体的构建
在对随机挑取的含有Δ9脂肪酸脱氢酶突变体质粒的酵母菌的脂肪酸含量分析后发现，其中一个菌株比野生型的脂肪酸含量提高了将近一倍。我们将突变后的基因测序后发现，有20个氨基酸发生了突变，而且由于A1102T颠换导致第368位密码子的无义突变。由此，我们以此突变基因为模板，构建从第368位氨基酸缺失的突变体。为此，我们以JcDES_F为上游引物，以JcDES_deletion_R （5’-CCGGAATTCAATTCTTGGAGGTAACCGAC-3’, EcoRI）为下游引物，进行常规PCR扩增。
将所得PCR产物纯化后，与pYES2/CT质粒同时以HindIII和EcoRI双酶切。酶切产物经胶纯化后，在T4 DNA连接酶的作用下连接，然后通过电转化的方法转入大肠杆菌DH10B细胞，涂布LB(含100 μg/ml Amp)平板。挑选单克隆，提取质粒。采用双酶切方法鉴定重组质粒，将含有插入片段的重组质粒（见图1B）命名为pYES2/CT/JcΔ9mut。然后将其转入INVSc1酵母细胞。
二、Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的检测
将上述少量经诱导表达后的酵母菌体重悬于5 ml缓冲液A（8M尿素，300mM氯化钠，0.5%壬基酚聚氧乙烯醚，50mM磷酸氢二钠，50mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，1mM苯甲基磺酰氟）；利用高压细胞破碎仪破碎细胞；于15,000 × g，10℃，离心20分钟；将离心后的上清液加入缓冲液A平衡过的250 μl Ni-NTA琼脂糖中，于4℃孵育1小时；于2,000转/分钟，4℃，离心1分钟，去上清液，用缓冲液A洗两次；加入500 μl洗脱液（含250 mM咪唑的缓冲液A）于室温孵育10分钟；于2,000转/分钟，4℃，离心1分钟，收获上清液。取一定量的洗脱组分进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：一块凝胶用以将蛋白质电转至聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜做免疫印记，另一块凝胶做考马斯亮蓝染色。
电泳后的蛋白经湿法转膜至PVDF膜，经过脱脂牛奶封闭后，以抗6×His的鼠源抗体作为一抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗，作用于目的蛋白；最后采用辣根过氧化物酶-电化学发光法对目的蛋白进行分析鉴定（见图2）。
对应于免疫印记的结果，将考马斯亮蓝染色的凝胶上相对应的阳性条带切下并切成小胶粒，使用含50%乙腈和50 mM的碳酸氢铵溶液将其脱色彻底。然后使用10 mM的二硫苏糖醇和55 mM的碘乙酰胺对蛋白质进行还原烷基化，随后使用100%的乙腈将胶粒完全脱水后使用约为目标蛋白1/30质量的胰酶（25mmol/l的碳酸氢铵溶液配制）于37℃酶切过夜。酶切完成后，经过抽提和脱盐的步骤，样品即可进行质谱分析。
质谱分析使用的是Waters UPLC-Q-TOF质谱仪。流动相为：溶液A（0.1% 甲酸）和溶液B（99%乙腈/0.1%甲酸）。分析时间为90 分钟。梯度为1%-40%溶液B，40分钟；40%-80%溶液B，5分钟；80%溶液B，15分钟；1%溶液B，30分钟。质谱结果分析使用Waters公司的ProteinLynx软件的AutoMode模式，以Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的基因序列的理论蛋白序列进行分析。质谱鉴定结果如图3所示，Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白共有7段胰酶酶切多肽片段得到鉴定（二级质谱图如图4A及图4B所示），其覆盖率为21.7%。重要的是，两段包含点突变的多肽片段VTHSMPPQKIEV(I→V)FK和DN(D→N)D(N→D)LFDHFSAVAQR也得到质谱鉴定。
三、含有Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的酵母工程菌的脂肪酸含量分析
麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白与野生型蛋白的GS-MS的结果分别如图5A、图5B所示，麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体蛋白与野生型相比，可明显提高酿酒酵母的不饱和脂肪酸的产量。经所加内标C17:0的浓度校正后得知，酵母工程菌的主要脂肪酸含量如表1所示。表达突变蛋白与表达野生型蛋白的宿主细胞相比，其C16:1Δ9不饱和脂肪酸的含量提高了1倍，C18:1Δ9不饱和脂肪酸的含量提高了1.5倍。
表1 酵母工程菌的主要脂肪酸组分与含量
四、Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的序列分析
突变基因的序列分析表明，Δ9脂肪酸脱氢酶突变基因共有25个核苷酸发生了突变，其中有22个是转换，有3个是颠换；22个转换中有12个发生在T、C之间，10个发生在A、G之间。此外，由于密码子的兼并性，3个核苷酸的突变没有影响氨基酸的变化（即同义突变）。
表2 Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的序列分析
Claims (6)
1.一种编码麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的基因，其特征在于，该基因由序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。
2.一种麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体，其特征在于，该突变体由权利要求1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，即序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.一种表达麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体基因的重组质粒，其特征在于，该重组质粒是权利要求1中的核苷酸序列插入pYES2/CT质粒而成的重组质粒。
4.一种产生麻疯树Δ9脂肪酸脱氢酶突变体的转基因宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞选自：
a）用权利要求1所述的基因转化或转导的细菌细胞或真菌细胞；
b）用权利要求3所述的重组质粒转化或转导的细菌细胞或真菌细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为酿酒酵母细胞。
6.权利要求1所述的基因、或权利要求2所述的突变体、或权利要求3所述的重组质粒、或权利要求4或5所述的宿主细胞在通过酵母发酵生产不饱和脂肪酸中的应用。
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