KR20080099355A - 동통, 염증 및 연골 퇴화를 억제하기 위한 용액 및 억제방법 - Google Patents

동통, 염증 및 연골 퇴화를 억제하기 위한 용액 및 억제방법 Download PDF

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파멜라 피. 팔머
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Abstract

관절경 외과 수술을 포함하는 일반적인 외과 수술로부터의 상처에서 각종 동통 및 염증 진행을 억제하기 위한 방법 및 용액이 기술되어 있다. 당해 용액은 바람직하게는 식염수 또는 유산을 가한 링거 액과 같은 생리적 담체중의 묽은 농도에서의 다수 동통 및 염증의 억제를 포함한다. 당해 용액은 대용량의 제제를 경구, 근육내, 피하 또는 정맥내 적용하는 경우와 관련된 바람직하지 않은 부작용을 피하면서 동통 및 염증을 우선적으로 억제하기 위한 외과 수술 동안에 상처 부위에 연속 관주함으로써 적용할 수 있다. 또한, 연골 퇴화 억제제들의 배합물에 있어서, 당해 용액은 관절내로 직접 주사할 수 있다.
Figure P1020087026279
관절경 외과 수술, 연골 퇴화 억제, 연골 보호제, 소염제, 사이토킨

Description

동통, 염증 및 연골 퇴화를 억제하기 위한 용액 및 억제 방법{Solutions and methods for inhibition of pain, inflammation and cartilage degradation}
본 발명은 치료 용액 및 치료 방법에 관한 것이며, 특히 소염, 항-동통(anti-pain) 및 항-연골 퇴화 용액 및 방법에 관한 것이다.
관절경검사(arthroscopy)는 원격 광원과 비디오 모니터에 장착된 카메라를 피부위와 관절막내의 작은 문맥 절개를 통해 해부된 관절(예: 무릎, 어깨 등)내로 삽입시키는 외과 수술 절차이다. 유사한 문맥 절개를 통해, 외과 장치를 관절내에 위치시킬 수 있으며, 이의 사용은 관절경 투시에 의해 조절된다. 관절경검사자의 기술이 개선됨으로써, "개방" 외과 수술이 수행된 이후로, 현재 관절경검사에 의한 외과 수술 횟수가 증가하고 있다. 이러한 수술은 예를 들면, 무릎에서의 반월상 연골 절제술과 인대 재건, 견봉성형술(shoulder acromioplasty)과 어깨 회선 근개 소제법, 및 팔굽 활막절제술을 포함한다. 외과적 조치의 확대 및 소 직경 관절경검사의 발달로 인하여, 손목과 발목 관절경검사 또한 일반화되었다.
각각의 관절경검사를 통해, 생리학적 관주액(예: 일반 염수 또는 유산을 가한 링거액)을 관절을 통해 연속해서 플러싱하여 관절 막을 팽창시키고 수술시 파편을 제거함으로써, 더욱 선명한 관절내 투시가 제공된다. 마르샬(Marshall)에게 허여된 미국 특허 제4,504,493호는 관절경검사용의 비-전도성이고 광학적으로 선명한 관주 용액용의 수중 글리세롤의 삼투액을 기술하고 있다. 통상의 생리학적 관주액은 마취, 소염 및 항-연골 퇴화 효과를 제공하지 않는다.
수술후 환자에서 동통 및 고통의 완화는 특히 매년 수행되는 외래환자 수술의 증가와 함께, 임상 의약에서 중요한 관심 분야이다. 가장 광범위하게 사용된 전신계 제제인, 사이클로옥시게나제 억제제(예: 이부프로펜) 및 아편(예: 모르핀, 펜타닐)는 위장 자극/출혈 및 호흡 곤란을 포함하는 심각한 부작용을 지닌다. 아편 관련된 오심 및 구토의 높은 발생빈도는 특히 수술후 기간동안에 문제가 된다. 수술후 동통을 치료하면서 유해한 부작용을 방지하는데 촛점이 맞추어진 치료제는 쉽게 개발되지 않는데, 그 이유는 이들 제제에 대한 분자 표적이 인체에 광범위하게 분산되어 다양한 생리학적 작용을 중재하기 때문이다. 동통과 염증 및 연골 퇴화를 억제하기 위한 현저한 임상적 요구에도 불구하고, 전신계적 부작용을 최소화하면서, 동통, 염증 및 연골 퇴화 억제제를 유효 투여량으로 전달하는 방법은 개발되지 않고 있다. 예를 들어, 치료학적 투여량으로 오피에이트를 투여하는 통상의 방법(예: 정맥내, 경구, 피하 또는 근육내 투여 방법)은 흔히 심각한 호흡 곤란증, 기분 변화, 정신 혼란, 심한 오심 및 구토를 포함하는 심각한 부작용과 연관되어 있다.
선행의 연구들은 세로토닌(5-하이드록시트립타민, 때때로 본원에서 "5-HT"로 언급), 브래디키닌 및 히스타민과 같은 내인성 제제의 동통 및 염증 유발능력을 입증하였다[참조: Sicuteri, F., et. al., Serotonin Bradykinin Potentiation in the Pain Receptors in Man, Life Sci. 4, pp. 309-316 (1965); Rosenthal, S. R., Histamine as the Chemical Mediator for Cutaneous Pain, J. Invest. Dermat. 69, pp. 98-105 (1977); Richardson, B. P., et. al., Identification of Serotonin M-Receptor Subtypes and their Specific Blockade by a New Class of Drugs, Nature 316, pp. 126-131 (1985); Whalley, E. T., et. al., The Effect of Kinin Agonists and Antagonists, Naunyn-Schmiedeb Arch. Pharmacol. 36, pp. 652-57 (1987); Lang, E., et. al., Chemo-Sensitivity of Fine Afferents from Rat Skin In Vitro, J. Neurophysiol. 63, pp. 887-901 (1990)].
예를 들어, 사람 수포 기저부[나화된 피부(denuded skin)]에 적용된 5-HT는 5-HT3 수용체 길항제에 의해 억제될 수 있는 동통을 유발하는 것으로 입증되었다[참조: Richardson et al., (1985)]. 유사하게, 말초에 적용된 브래디키닌은 브래디키닌 수용체 길항제에 의해 차단될 수 있는 동통을 유발한다[참조: Sicuteri et al., 1965; Whalley et al., 1987; Dray, A., et. al., Bradykinin and Inflammatory Pain, Trends Neurosci. 16, pp. 99-104 (1993)]. 말초에 적용된 히스타민은 히스타민 수용체 길항제에 의해 억제될 수 있는 혈관확장, 소양증 및 동통을 유발한다[참조: Rosenthal, 1977; Douglas, W. W.,"Histamine and 5- Hydroxytryptamine (Serotonin) and their Antagonists", in Goodman, L. S., et. al., ed., The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Company, New York, pp. 605-638 (1985); Rumore, M. M., et. al., Analgesic Effects of Antihistaminics, Life Sci 36, pp. 403-416 (1985)]. 함께 적용된 이들 3개의 길항제(5-HT, 브래디키닌 및 히스타민)의 배합물은 장기간 지속되며 강력한 동통 시그날을 생성하는 상승적인 동통 유발 효과를 나타내는 것으로 입증되었다[참조: Sicuteri et al., 1965; Richardson et al., 1985; Kessler, W., et. al.,"Excitation of Cutaneous Afferent Nerve Endings In Vitro by a Combination of Inflammatory Mediators and Conditioning Effect of Substance P,"Exp. Brain Res. 91: 467-476 (1992)].
체내에서, 5-HT는 혈소판 및 중추 신경에 위치하며 히스타민은 유방 세포에서 발견되고, 브래디키닌은 조직 손상, pH 변화 및 온도 변화동안 더욱 큰 전구체 분자로부터 생성된다. 5-HT는 조직 손상 부위에서 혈소판으로부터 다량 방출되어 잔류 수준보다 20배 이상 높은 혈장 수준을 생성할 수 있으므로[참조: Ashton, J. H., et. al.,"Serotonin as a Mediator of Cyclic Flow Variations in Stenosed Canine Coronary Arteries," Circulation 73: 572-578 (1986)], 내인성 5-HT가 수술후 동통, 통각과민 및 염증을 유발하는데 관여할 수 있다. 실제로, 혈소판의 활성화는 실험관내에서 말초 유해수용기의 여기를 초래하는 것으로 밝혀졌다[참조: Ringkamp, M., et. al.,"Activated Human Platelets in Plasma Excite Nociceptors in Rat Skin, In Vitro", Neurosci. Lett. 170: 103-106 (1994)]. 유사하게, 히스 타민과 브래디키닌도 외상동안에 조직내로 방출된다[참조; Kimura, E., et. al.,"Changes in Bradykinin Level in Coronary Sinus Blood After the Experimental Occlusion of a Coronary Artery,"Am Heart J. 85: 635-647 (1973); Douglas, 1985; Dray et. al. (1993)].
더우기, 프로스타글란딘 또한 동통과 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 사이클로옥시게나제 억제제, 즉 이부프로펜은 프로스타글란딘의 생산을 차단함으로써 프로스타글란딘으로 중재된 동통 및 염증을 감소시키기 위한 비-외과적 및 수술후 환경설정에 일반적으로 사용된다[참조: Flower, R. J., et. al., Analgesic Antipyretics and Anti-Inflammatory Agents; Drugs Employed in the Treatment of Gout, in Goodman, L. S., et. al., ed., The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Company, New York, pp. 674-715 (1985)]. 사이클로옥시게나제 억제제는 통상적으로 적용하는 경우 몇몇 전신계적 부작용과 연관되어 있다. 예를 들어, 인도메타신 또는 케토롤락은 위장 및 신장 부작용이 있는 것으로 잘 알려져 있다.
논의한 바와 같이, 5-HT, 히스타민, 브래디키닌 및 프로스타글란딘은 동통 및 염증을 유발한다. 말초 조직에서 이들 제제가 자체 효과를 중재하는 각종 수용체는 공지되어 있고/있거나 과거 20년동안 검토되어 왔다. 대부분의 연구는 랫트 또는 기타 동물 모델에서 수행되었다. 그러나, 사람과 동물간에는 약리학 및 수용체 서열에 있어 차이점이 있다.
더우기, 이들 중재자의 길항제는 현재 수술후 동통 치료용으로 사용되지 않는다. 5-HT로 명명되는 약물 부류 및 아미트립틸린을 포함하는 노르에피네프린 흡수 길항제는 만성 동통 상태를 성공적으로 완화시키기 위해 경구적으로 사용되어 왔다. 그러나, 급성 동통 상태에 대한 만성 동통 상태의 메카니즘은 현저히 상이한 것으로 고려되고 있다. 실제로, 아미트립틸린을 말초적으로 사용하는 급성 동통 환경설정에서의 2개 연구는 아미트립틸린에 동통 완화 효과가 없음을 나타내고 있다[참조: Levine, J. D. et. al., "Desipramine Enhances Opiate Postoperative Analgesia, Pain 27: 45-49 (1986); Kerrick, J. M. et. al.,"Low-Dose Amitriptyline as an Adjunct to Opioids for Postoperative Orthopedic Pain: a Placebo-Controlled Trial Period,"Pain 52: 325-30 (1993)]. 이들 연구 둘다에서 약물은 경구적으로 투여되었다. 두번째 연구는 경구 이미트립틸린이 실제로 수술후 환자에서 전체적으로 더욱 악화된 느낌의 건강 상태를 유발하며, 이러한 현상은 뇌에서 다수의 아민 수용체에 대한 약물 친화성에 기인할 수 있다.
아미트립틸린은 5-HT 및 노르에피네프린의 흡수를 차단하는 것 외에 강력한 5-HT 수용체 길항제이다. 따라서, 앞서 언급한 연구에서 수술후 동통을 완화시키는 효능의 상실은 급성 동통에서 내인성 5-HT에 대한 역활의 제안과 상충될 수 있다. 이들 2개의 연구에서 아미트립틸린을 사용하여 발견된 급성 동통 완화의 상실에 대해 다수의 이유가 존재한다. (1) 첫번째 연구(참조: Levine et al., 1986)에 서는 아미트립틸린을 수술전 1주 내지 9주동안 사용하는 반면, 두번째 연구(참조: Kerrick et al., 1993)에서는 아미트립틸린을 단지 수술후에만 사용한다. 따라서, 실제 조직 손상 상태동안 수술 부위 조직에 존재하는 아미트립틸린의 농도 및 5-HT가 방출되는 것으로 의도되는 시간은 알려져 있지 않다. (2) 아미트립틸린은 간에 의해 주로 대사되는 것으로 공지되어 있다. 경구 투여시, 수술 부위 조직에서의 아미트립틸린의 농도는 두번째 연구에서 수술후 방출된 5-HT의 활성을 억제하기에 충분히 긴 시간동안 충분히 높지 않을 수 있다. (3) 다수의 염증 중재자가 존재하고 연구들은 염증 중재자들간의 상승 효과를 입증하고 있으므로, 단지 하나의 (5-HT) 제제만을 차단하는 것은 조직 손상에 대한 염증 반응을 강력히 억제할 수 없다.
외과 수술동안 국소 마취제로서 작용하는 고 농도(1% 내지 3% 용액, 즉 10-30mg/ml)의 히스타민1(H1) 수용체 길항제의 능력을 입증하는 소수의 연구가 있다. 그러나, 이러한 마취 효과는 H1 수용체를 통해 중재되는 것으로 여겨지는 것이 아니라, 오히려 신경막 나트륨 채널과의 비-특이적인 상호작용(리도카인의 작용과 유사)에 기인한다. 이러한 높은 "마취" 농도의 히스타민 수용체 길항제와 연관된 부작용(즉, 진정 효과)을 고려할 때, 히스타민 수용체 길항제의 국소 투여는 수술전 환경설정에서 사용되지 않는다.
발명의 요약
본 발명은 생리학적 전해질 담체액내에서 동통, 염증 및 연골 퇴화의 중재자를 국소적으로 억제하도록 지시된 저 농도의 다수 제제의 혼합물로 구성되는 용액을 제공한다. 본 발명은 또한 수용체 및 효소 농도에서 국소적으로 작용하여 수술 부위에서의 동통, 염증 및 연골 퇴화를 우선적으로 제한하기위해, 당해 수술 부위에 이들 제제를 함유하는 관주 용액을 수술전 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 수술전 국소 전달 방법에 의해, 제제를 다른 전달 방법(예: 정맥내, 근육내, 피하내 및 경구)을 사용하는 경우에 요구되는 투여량보다 적은 투여량으로 바람직한 치료 효과를 달성할 수 있다. 당해 용액에서 항-동통제 및/또는 소염제 및/또는 항-연골 퇴화제는, 각각 동통 및/또는 염증 억제 및/또는 연골 퇴화에 대해 상이한 분자 메카니즘 작용을 통해 작용하는 다음 부류의 수용체 길항제와 효능제, 및 효소 활성화제와 억제제중에서 선택된 제제를 포함한다. 동통 및/또는 염증 억제용의 대표적인 제제는 예를 들면, (1) 세로토닌 수용체 길항제; (2) 세로토닌 수용체 효능제; (3) 히스타민 수용체 길항제; (4) 브래디키닌 수용체 길항제; (5) 칼리크레인 억제제; (6) 뉴로키닌1 및 뉴로키닌2 수용체 아형 길항제를 포함하는 태키키닌 수용체 길항제; (7) 칼시토닌 유전자와 관련된 펩타이드(CGRP) 수용체 길항제; (8) 인터루킨 수용체 길항제; (9) (a) PLA2 동형 억제제와 PLC 동형 억제제, (b) 사이클로옥시게나제 억제제 및 (c) 리포옥시게나제 억제제를 포함하는, 아라키돈산 대사물질에 대한 합성 경로에서 활성인 효소 억제제; (10) 에이코사노이드 EP-1 및 EP-4 수용체 아형 길항제 및 트롬복산 수용체 아형 길항제를 포함하는 프로스타노이드 수용체 길항제; (11) 류코트리엔 B4 수용체 아형 길항제 및 류코트리엔 D4 수용체 아형 길항제를 포함하는 류코트리엔 수용체 길항제; (12) μ-아편, δ- 아편 및 κ-아편 수용체 아형 효능제를 포함하는 아편 수용체 길항제; (13) P2X 수용체 길항제 및 P2Y 수용체 길항제를 포함하는 퓨리노셉터 길항제 및 (14) 칼슘 채널 길항제를 포함한다. 상기 제제들 각각은 소염제 및/또는 항-유해수용기 제제, 즉, 항-동통제 또는 마취제로서 작용한다. 이들 화합물 부류로부터의 제제의 선택은 특정 적용에 대해 조절된다. 연골 퇴화 억제용의 대표적인 제제는 예를 들면, (1) IL-1β, IL-17 및 IL-18을 포함하는 인터루킨-1 그룹의 단백질에 대한 수용체 길항제; (2) 예를 들어, TNF-R1을 포함하는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 그룹 길항제; (3) 인터루킨 4, 10 및 13 수용체에 대한 효능제; (4) 예를 들면, BMP-2, BMP-4 및 BMP-7을 포함하는 TGFβ-수용체 상위 그룹에 대한 효능제; (5) COX-2의 억제제; (6) 예를 들면, p38 MAP 키나제를 포함하는 MAP 키나제 그룹 억제제; (7) 예를 들면, MMP-3 및 MMP-9를 포함하는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 억제제; (8) 예를 들면, IκB와의 p50/p65 이량체 복합체를 포함하는 NF-κB 단백질 그룹 억제제; (9) 예를 들면, iNOS를 포함하는 산화질소 신타제(NOS) 그룹 억제제; (10) 예를 들면 αvβ3 인테그린 효능제를 포함하는 인테그린 수용체의 효능제 및 길항제; (11) 단백질 키나제 C(PKC) 그룹 억제제; (12) 예를 들면, src 아그룹을 포함하는 단백질 타이로신 키나제 억제제; (13) 단백질 타이로신 포스파타제 중재자 및 (14) 단백질 src 동족체 2(SH2) 영역(domain) 억제제를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서는 앞서 기술한 바와 같이, 동통, 염증 등의 억제용 제제 하나 이상과 함께 하나 이상의 대사적으로 활성인 연골보호제를 포함하는 조성물 또는 달리는 관절내 전달용의 약제학적으로 유효한 담체중의 2개 이상의 대사적으로 활성인 연골보호제의 배합물을 환자의 관절에 직접 투여함으로써 관절내 관절 연골의 파괴를 감소시키거나 방지하기위한 방법 및 용액이 제공된다. 대사적으로 활성인 제제는 혈장막의 전기적 전위차, 세포 수용체의 리간드 결합 또는 효소 활성, 세포내적으로 또는 세포외적으로 위치한 효소, 단백질-단백질 상호작용, RNA-단백질 상호작용 또는 DNA-단백질 상호작용을 변경시키는 제제를 포함하는, 세포의 생물학적, 생화학적 또는 생물리학적 상태를 중재하거나 변경하는데 직간접적으로 작용하는 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 한 양태에서는 명백한 분자 표적에 동시에 작용하는 2개 이상의 제제의 배합물을 기초로 하는, 대사적으로 활성인 연골보호제의 약제학적 조성물이 제공된다. 대표적인 양태에서, 적어도 하나의 제제는 소염 활성을 직접적으로 제공하고/하거나 연골 동화 과정을 촉진하는 사이토킨 또는 성장 인자 수용체 효능제이고 적어도 두번째 제제는 전-염증 과정(pro-inflammatory process) 및/또는 연골 이화 과정을 억제하는데 작용하는 수용체 길항제 또는 효소 억제제이다. 관절내에서 전-염증 사이토킨의 역활을 억제하는데 기능적으로 작용하는 소염/동화성 사이토킨은 연골 매트릭스 합성을 촉진하고 매트릭스 퇴화를 억제한다. 이들 수용체 효능제는 예를 들면, 인터루킨(IL) 효능제(예: IL-4, IL-10 및 IL-13) 및 형질전환 성장 인자-β 상위그룹의 특정 구성원(예: TGFβ 및 BMP-7)과 같은 특정의 소염 및 동화 사이토킨(anabolic cytokine), 인슐린-유사 성장 인자(예: IGF-1) 및 섬유아세포 성장 인자(예: bFGF)를 포함한다. 적어도 두번째 제제는 전-염증 분자 표적의 활성 또는 발현을 억제하고 감소시키는데 작용하는 수용체 길항제 또는 효소 억제제 부류[예: IL-1 수용체 길항제, TNF-α 수용체 길항제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, MAP 키나제 억제제, 산화질소 신타제(NOS) 억제제 및 핵 인자 카파B(NFκB) 억제제]로 부터 선택된다. 동화작용 제제 및 이화작용 억제제의 다수 제제 배합물은 외과 관절경 수술동안 수술과 더불어(즉, 수술전 및/또는 수술중 및/또는 수술후) 투여함을 포함하는 관절내 주사 또는 주입에 의해 국소적으로 전달할 수 있다.
관전 연골은 대사적으로 활성인 관절 연골세포에 의해 생산되고 유지되는 전문화된 세포외 매트릭스이다. 정상의 건강한 세포외 매트릭스의 유지는 매트릭스 성분의 생합성과 혼입율 및 매트릭스 성분의 퇴화율과 연골로부터 활액내로의 후속적인 상실율간의 동적 균형을 반영한다. 매트릭스 항상성을 겪는 조절 매카니즘은 잘 이해되고 있지 않으나, 이들은 관절염 질병 및 관절 외상에 반응하여 명확히 변경됨으로써 매트릭스 퇴화율은 매트릭스 성분의 새로운 합성율을 초과하게 된다. 매트릭스 항상성은 일반적으로 이화 사이토킨(catabolic cytokin)의 효과와 동화 사이토킨(성장 인자 포함)의 효과간의 동적 균형을 나타내는 것으로 고려된다. 연골 보호에 유용한 치료제의 최적 배합은 합성율을 가속화하고 동시에 퇴화율을 억제시킴에 의해 매트릭스의 동적 평형을 이동시킴으로써 동화 과정을 최대화시키고 회복을 촉진시킨다.
IL-1β 및 TNF-α와 같은 이화 사이토킨은 매트릭스 퇴화가 TGF-β, BMP-2 및 IGF-1과 같은 동화 사이토킨에 의해 억제되는 동안 매트릭스 퇴화를 유도하는 MMP의 생산을 유도하는 연골세포상의 특정 수용체에서 작용한다. 즉, 이화 과정을 억제하는 것에만 기초하는 치료학적 시도(즉, MMP 억제제 및 IL-1 길항제의 배합물의 사용)는, 동화제가 매트릭스 생산용 성분의 생합성과 구성을 유도시키거나 가속화시키는데 요구되기 때문에 연골 회복에 최적이지 않다. 둘째로, 연골 매트릭스 퇴화에 기여하는 동화 사이토킨(IL-1, TNF, IL-17, IL-18 및 LIF)의 다양성은 실제적으로 이들이 이화 사이토킨 활성 모두를 차단하지 못할 것임을 나타낸다. 역으로, IGF-1, BMP-2 또는 MBP-7과 같은 동화제의 사용에만 의존하는 시도는, 이러한 시도가 이화 사이토킨의 역-조절 역활에 촛점을 두고 있지 않기 때문에 최적이지 않다. TGF-β, BMP-2 및 IGF-1은 또한 특정 수용체에서 작용하여 IL-1β, TNF-α, IL-17 및 LIF에 의해 억제되는 매트릭스 성분을 생산하는 연골세포를 유도한다. 따라서, 연골보호용으로 최적인 치료학적 배합물은 하나 이상의 동화제 및 하나의 연골 동화작용 억제제로 이루어진다.
본 발명은 또한 관절경 수술 과정동안 수술 부위, 통상적으로 환자의 관절 부위를 연속적으로 관주시키는데 사용하기 위한 희석 관주액으로서 배합된 약제를 제조하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 생리학적 전해질 담체액속에 하나 이상의 항-연골 퇴화제와 바람직하게는 하나 이상의 항-동통/소염제 및 일부 적용을 위한 항-연골 퇴화제를 용해시킴을 포함하며, 이들 각각의 제제는 바람직하게는 약 100,000나노몰 이하, 더욱 바람직하게는 약 25,000나노몰 이하 및 가장 바람직하게는 약 10,000나노몰 이하의 농도로 포함된다.
본 발명의 방법은 동통, 염증 및 연골 퇴화의 억제를 위한 치료 과정 또는 진단 과정동안에 다수의 수용체 길항제와 효능제 및 효소 억제제와 활성화제의 희석 배합물을 외상 또는 수술 부위에 직접 전달하는 것을 제공한다. 용액중 활성 성분은 수술 조직에 연속적인 양식으로 직접 국소 적용되기 때문에, 당해 약물은, 동일한 약물이 경구적, 근육내, 경피적 또는 정맥내로 전달되는 경우보다 치료학적 효과를 위해 요구되는 투여량에 비해 현저히 낮은 투여량에서 효과적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 것으로써, 용어 "국소"는 외상 또는 기타 수술 부위내 및 주변에 약물을 적용하는 것을 포함하며 경구, 피하내, 정맥내 및 근육내 투여는 제외된다. 본원에 사용된 것으로써, 용어 "연속"은 지속적인 적용, 짧은 간격의 반복적인 적용 및 기타 약물 또는 제제의 도입 또는 수술 장비의 도입을 허용하는 정도의 짧은 중단을 제외한 지속적인 적용에 의해 실질적으로 예정된 일정 농도가 상처 또는 수술 부위에서 국속적으로 유지됨을 포함한다.
제제들의 저 투여량 적용의 장점은 3가지이다. 가장 중요한 것은 이들 제제의 사용을 제한하지 않는 전신계적 부작용의 부재이다. 추가로, 본 발명의 용액중의 특정 적용을 위해 선택된 제제는, 이들이 작용하는 중재자 및 중재 표적에 대해 고도로 특이적이다. 이러한 특이성은 사용한 저 투여량에 의해 유지된다. 최종적으로 수술당 이들 활성 제제의 비용이 저렴하다.
관주 또는 기타 유액 적용을 통한 제제의 국소 투여의 잇점은 다음과 같다: (1) 국소 투여는 물질대사, 혈류 등에 있어서의 환자내 변화에 상관없이 표적 부위에서 공지된 농도를 보장한다; (2) 직접적인 전달 방식으로 인하여, 치료학적 농도 가 즉시 이루어지므로, 투여량 조절이 개선된다 및 (3) 외상 또는 수술 부위로 활성 제제의 직접적인 국소 투여는, 또한, 제제가 경구, 정맥내, 피하내 또는 근육내 제공되는 경우에 발생될 수 있는 전신계적 과정 즉, 1차 및 2차 통과 물질대사를 통한 제제의 분해를 실질적으로 감소시킨다. 이는 특히 신속하게 대사되는 펩타이드인 활성제의 경우에 그렇다. 따라서 국소 투여는 또한 치료학적으로 사용될 수 없는 화합물 또는 제제의 사용도 허용한다. 예를 들면, 다음 부류중 일부 제제는 펩타이드성이다: 브래디키닌 수용체 길항제; 태키키닌 수용체 길항제; 아편 수용체 효능제; CGRP 수용체 길항제; 및 인터루킨 수용체 길항제; TNF-수용체 길항제; TGF-β 수용체 길항제; BMP-2와 BMP-7 수용체 길항제; IL4, IL10과 IL-13 수용체 길항제; 및 인테그린 수용체 효능제와 길항제. 외상 또는 수술 부위로의 연속적인 국소 전달은 약물 분해 또는 약물 대사를 최소화하면서 또한 분해될 수 있는 제제 일부를 지속적으로 대체시킴으로써 수용체 점유 또는 효소적 포화를 유지시키기에 충분한 치료학적 국소 농도가 수술 전체 과정동안에 유지된다.
본 발명에 따라 수술 전체 과정동안 수술과 더불어 용액을 국소 투여하는 것은 우선적인 마취, 소염 및 연골 보호 효과를 제공한다. 본원에 사용된 것으로써, 용어 "수술기주의적인"은 수술 과정 동안, 수술 과정 전과 수술 과정 동안, 수술 과정 동안과 수술 과정 후 및 수술 과정 전, 수술 과정 동안 및 수술 과정 후를 포함한다. 우선적인 소염, 마취(특정 적용의 경우) 및 연골 보호(특정 적용의 경우) 효과를 최대화하기 위해, 본 발명의 용액을 가장 바람직하게는 수술 전, 수술 중 및 수술 후에 적용한다. 국소적으로 심한 수술 외상의 개시전에 표적 수용체를 점 유하거나 표적 효소를 불활성시키거나 활성화시킴에 의해, 본 발명의 제제는 특정 경로를 조절하여 표적된 병리학적 과정을 우선적으로 억제한다. 염증 중재자 및 염증 과정이 조직 손상을 일으킬 수 있기 전에 본 발명에 따라 우선적으로 억제되는 경우, 이의 잇점은, 손상이 개시된 후에 제공되는 것보다도 더욱 우수하다.
본 발명의 다수의 제제 용액을 적용함으로써 하나 이상의 동통, 염증 또는 연골 퇴화 중재자를 억제하는 것은 염증 및 동통 정도를 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌으며 이론적으로 연골 보호 효과를 제공한다. 본 발명의 관주 용액은 약물의 배합물을 포함하며, 각각의 용액은 다수의 수용체 또는 효소에서 작용한다. 따라서, 약물 제제는 동통 및 염증을 포함하는 병리학적 과정 및 연골 항상성의 상실의 조합에 대해 동시에 효과적이다. 이들 제제의 작용은 상승 효과가 있는 것으로 여겨지며, 여기서, 본 발명의 다수의 수용체 길항제와 억제 효능제는 개개 제제의 효능에 대해 상대적으로 불균형적으로 증가된 효능의 조합을 제공한다. 본 발명의 몇몇 제제의 상승 작용은 예로써, 이들 제제를 상세히 기술하고 있는 하기에서 기술한다.
수술과 더불어 사용하는 경우, 당해 용액은 현재 사용된 관주액에 비해 수술 부위 동통과 염증에 있어서 및 연골 퇴화의 임상적으로 현저한 감소를 가져오므로, 환자의 수술후 마취(예: 아편) 요구성을 감소시키며 경우에 따라, 환자가 수술 부위를 더욱 용이하게 움직일 수 있도록 한다. 통상의 관주액에 비해 본 발명의 용액을 사용하는데 있어 외과의 및 수술실 요원 일부에 대한 추가의 작업은 필요하지 않다. 최적의 연골보호를 위해, 본 발명의 용액을 외과 수술 전, 수술 중 및/또는 수술 후 관절에 직접 투여한다.
본 발명의 관주 및 주사액은 생리학적 담체중의 하나 이상의 연골보호제와 임의로 하나 이상의 동통 및/또는 염증 억제제의 희석액이다. 담체는 액체 용액이며, 본원에 사용된 것으로서의 담체는 생적합성 용매, 현탁액, 중합가능한 겔과 중합가능하지 않은 겔, 페이스트와 연고 및 단백질, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물 또는 무기 화합물로 구성된 미세입자, 미세구 또는 나노입자와 같은 서방성 전달 시스템 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는 담체는 일반 염수 또는 유산을 가한 링거액과 같은 생리학적 전해질을 포함할 수 있는 수용액이다.
소염 및/또는 항-동통제는 (1) 세로토닌 수용체 길항제; (2) 세로토닌 수용체 효능제 (3) 히스타민 수용체 길항제; (4) 브래디키닌 수용체 길항제; (5) 칼리크레인 억제제; (6) 뉴로키닌1 및 뉴로키닌2 수용체 아형 길항제를 포함하는 태키키닌 수용체 길항제; (7) 칼시토닌 유전자와 관련된 펩타이드(CGRP) 수용체 길항제; (8) 인터루킨 수용체 길항제; (9) (a) PLA2 동형 억제제와 PLC 동형 억제제를 포함하는 포스포리파제 억제제, (b) 사이클로옥시게나제 억제제 및 (c) 리폭시게나제 억제제를 포함하는 아라키돈산 대사물질에 대한 합성 경로에서 활성인 효소 억제제; (10) 에이코사노이드 EP-1 및 EP-4 수용체 아형 길항제와 트롬복산 수용체 아형 길항제를 포함하는 프로스타노이드 수용체 길항제; (11) 류코트리엔 B4 수용체 아형 길항제와 류코트리엔 D4 수용체 아형 길항제를 포함하는 류코트리엔 수용체 길항제; (12) μ-아편, δ-아편과 κ-아편 수용체 아형 효능제를 포함하는 아편 수용 체 효능제; (13) P2X 수용체 길항제와 P2Y 수용체 길항제를 포함하는 퓨리노셉터 효능제와 길항제 및 (14) 칼슘 채널 길항제로 이루어진 그룹중에서 선택된다.
적합한 연골 보호제는 예를 들면, (1) 예를 들어, IL-1β, IL-17과 IL-18을 포함하는 인터루킨 1 단백질 그룹에 대한 수용체의 길항제; (2) 예를 들어, TNF-R1을 포함하는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 그룹의 길항제; (3) 인터루킨 4, 10 및 13 수용체용 효능제; (4) 예를 들어, BMP-2, BMP-4와 BMP-7을 포함하는 TGF-β 수용체 상위그룹용 효능제; (5) COX-2 억제제; (6) 예를 들어, p38 MAP 키나제를 포함하는 MAP 키나제 그룹의 억제제; (7) 예를 들어, MMP-3과 MMP-9를 포함하는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 단백질 그룹의 억제제; (8) 예를 들어 IκB와의 p50/p65 이량체 착체를 포함하는 NF-κB 단백질 그룹의 억제제; (9) 예를 들어, iNOS를 포함하는 산화질소 신타제(NOS)의 억제제; (10) 예를 들어, αVβ3 인테그린 효능제를 포함하는 인테그린 수용체의 효능제와 길항제; (11) 단백질 키나제 C(PKC) 그룹의 억제제; (12) 예를 들어, src 아그룹을 포함하는 단백질 타이로신 키나제 그룹의 억제제; (13) 단백질 타이로신 포스파타제의 중재자 및 (14) 단백질 src 상동 2(SH2) 영역의 억제제를 포함한다.
연골 보호와 관절경 수술에 사용하기 위한 본 발명의 용액의 특정의 바람직한 양태는 연골 동화작용을 촉진하고 조절되지 않거나 과량의 연골 이화 과정을 억제하는데 동시에 작용하여 염증 과정을 최대로 억제하고 연골 항상성을 유지함으로써 관절내 연골보호 효과를 달성하는 제제의 배합물을 포함한다.
본 발명의 외과 용액 각각에서, 이들 제제는 액체 또는 유액중에 낮은 농도로 포함되며 목적한 치료학적 효과를 달성하기 위한 약물 투여의 통상적인 방법을 사용하는 경우에 요구되는 농도와 투여량에 비해 낮은 농도에서 국소적으로 전달된다. 본원에 사용된 것으로서, "액체(liquid)" 또는 "유액(fluid)"은 약제학적으로 허용되는, 생적합한 용매, 현탁액, 중합가능한 겔과 중합가능하지 않은 겔, 페이스트 및 연고를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는 담체는 일반 염수 또는 유산을 가한 링거액과 같은 생리학적 전해질을 포함할 수 있는 수용액이다. 전신계적으로 투여된 약물은 1차 및 2차적 통과 물질대사를 거치기 때문에 유사한 투여량의 제제를 다른 경로(예: 정맥내, 피하내, 근육내 또는 경구)를 통해 전달함으로써 동등한 치료학적 효과를 달성하는 것은 불가능하거나 어렵다. 각각의 제제의 농도는 부분적으로는 이의 수용체 해리 상수, Kd 또는 효소 억제 상수, Ki에 기초하여 측정한다. 본원에 사용된 것으로써, 용어 해리 상수는 제제의 각각의 효능제-수용체 또는 길항제-수용체 상호작용에 대한 평형 해리 상수와 제제의 각각의 활성화제-효소 또는 억제제-효소 상호작용에 대한 평형 억제 상수 둘다를 포함하는 것으로 의도된다. 각각의 제제는 바람직하게는 선택된 특정 억제제에 따라 더욱 높은 농도가 요구될 수 있는 사이클로옥시게나제 억제제를 제외하고는, 0.1 내지 10,000배의 Kd 또는 Ki의 낮은 농도로 포함된다. 바람직하게는 각각의 제제는 1.0 내지 1,000배의 Kd 또는 Ki 및 가장 바람직하게는 약 100배의 Kd 또는 Ki의 농도로 포함된다. 이들 농도는 국소 전달 부위에서 물질대사 전환없이 희석에 의해 필요한 정도 로 조절된다. 용액중에 사용하기 위해 선택되는 정확한 제제와 이들 제제의 농도는 하기 기술한 바와 같은 특정 적용에 따라 변한다.
본 발명에 따른 용액은 하나 또는 다수의 동통 및/또는 염증 억제제, 하나 이상이 동화작용 연골보호제이고 다른 하나 이상이 연골 이화작용의 억제제인 다수의 연골보호제 또는 연골보호제와 동통 및/또는 염증 억제제 둘다의 배합물을 저 농도로 포함할 수 있다. 그러나, 다수 제제의 상술한 상승 효과, 동통과 염증의 광범위한 차단 요구도 및 연골 파괴로 인하여, 다수 제제를 사용하는 것이 바람직하다.
외과 용액은 명백한 수용체 및/또는 효소 분자 표적에서 작용하는 다수의 약리학적 제제를 배합함으로써 새로운 치료학적 시도를 달성한다. 지금까지, 약리학적 방법은 개개인의 수용체 아형에 대해 선택적인 고도로 특이적인 약물 및 개개의 시그날 전달 신경전달인자와 호르몬에 대한 반응을 중재하는 효소 동형의 개발에 촛점을 맞추어 왔다. 더우기, 단일 수용체 아형 또는 효소의 불활성화에도 불구하고, 다른 수용체 아형 또는 효소의 활성화와 이로 인한 신호 변환은 흔히 캐스케이드 효과(cascade effect)를 유발할 수 있다. 이는 다수의 시그날 전달 중재자(즉, 사이토킨, 성장 인자 또는 에이코소노이드)가 역활을 하는 병리생리학적 과정을 차단하기 위한 단일의 수용체 특이적인 약물을 사용하는 것이 매우 어렵다는 것을 설명해준다. 따라서, 단지 하나의 특이적인 개개 수용체 아형 또는 동형을 표적화시키는 것은 효과적이지 않다.
약리학적 치료요법에 대한 표준 시도와는 대조적으로, 본 발명의 외과 용액 의 치료학적 시도는 명백한 분자 표적물에서 동시에 작용하는 약물들의 배합물이 병리생리학적 상태가 악화되는 상태의 모든 스펙트럼의 억제에 있어 매우 효과적이라는 합리적인 분석에 기초한다. 또한, 특정 수용체 아형만을 표적화하는 것 대신, 외과 용액은 동통, 염증 및 연골 퇴화의 악화에 포함된 상이한 세포 생리학적 과정에 작동하는 일반적인 분자 메카니즘을 표적화하는 약물로 구성된다(참조: 도 1). 따라서, 유해수용기, 염증 및 연골 퇴화 경로에서 추가의 수용체 및 효소의 캐스케이드화는 본 외과 용액에 의해 최소화된다. 이들 병리생리학적 경로에서, 외과 용액은 "상부(upstream)" 및 "하부(downstream)" 둘 다의 캐스케이드 효과를 억제한다.
"상부" 억제의 예는 동통 및 염증의 상태에서의 사이클로옥시게나제 길항제이다. 당해 사이클로옥시게나제 효소(COX1 및 COX2)는 아라키돈산을 프로스타글란딘, 류코트리엔 및 트롬복산을 포함하는 염증 및 유해수용기 중재자의 생합성시 중간체인 프로스타글란딘 H로의 전환을 촉진한다. 사이클로옥시게나제 억제제는 이러한 염증 및 유해수용기 중재자의 형성을 "상부" 방향으로 차단한다. 이러한 방법은 프로스타노이드 수용체의 기술한 아형 7개와 COX 생화학 경로의 프로스타노이드 생성물의 상호작용을 차단할 필요가 없다. 외과 용액에 포함된 유사한 "상부" 억제제는 아프로티닌 및 칼리크레인 억제제이다. 효소 칼리크레인인, 세린 프로테아제는 혈장에서 고 분자량 키니노겐을 분해하여 동통과 염증의 중요한 중재자인 브래디키닌을 생성한다. 칼리크레인의 억제에 의해, 아프로티닌은 브래디키닌의 합성을 효과적으로 억제함으로써, 이러한 염증 중재자의 효과적인 "상부" 억제를 제공한다.
외과 용액은 또한 "하부" 억제제를 사용하여 병리생리학적 경로를 조절한다. 진행성의 관절 연골 퇴화에 관여하는 각종의 염증 사이토킨(예: IL-1β 및 TNFα)로 처리된 활막형성 세포 및 연골 세포 제제에서, MAP 키나제 억제제는 연골보호 효과를 생성한다. p38 MAP 키나제는 다수의 동화 사이토킨에 대한 시그날 전달 경로에서 전달점이며, 이의 억제는 연골 퇴화를 중재하는 다수의 세포 생성물의 상향조절을 방지한다. 따라서, MAP 키나제 억제제는 이동 연골 항상성을 개시하는 사이토킨 수용체 효능제의 생리학적 배합물과는 별도로 "하부" 연골 보호 효과를 제공함으로써 연골 염증 상태에서 외과 용액에 현저한 잇점을 제공한다.
다음에서는 소염/항-동통제 및 연골 보호제의 상술한 부류에 속하는 적합한 약물과 본 발명의 용액중에 사용하기에 적합한 농도를 기술한다. 이론에 한정되지 않고, 제제가 작동적인 것으로 여겨지는 각종 부류의 제제의 선택 이면의 규정 또한 기술한다.
I. 동통 및/또는 염증 억제제
1. 세로토닌 수용체 길항제
세로토닌(5-HT)은 말초에서 유해수용기 뉴우런상의 세로토닌2(5-HT2) 및/또는 세로토닌3(5-HT3) 수용체를 자극함으로써 동통을 유발하는 것으로 고려된다. 대 부분의 연구자들은 말초 유해수용기상에서 5-HT3 수용체가 5-HT에 의해 유발된 즉각적인 동통 감각을 중재한다는 사실에 동감하고 있다(참조: Richardson et al., 1985). 5-HT 유발된 동통을 억제하는 것 외에, 5-HT3 수용체 길항제는 유해수용기 활성화를 억제함으로써 신경에 유래하는 염증을 억제할 수 있다[참조: Barnes P. J., et al., Modulation of Neorogenic Inflammation: Novel Approaches to Inflammatory Disease, Trends in Pharmacological Sciences 11, pp. 185-189(1990)]. 그러나, 랫트의 과관절 연구는 5-HT2 수용체가 5-HT에 의한 유해수용기 활성화에 관여함을 나타낸다[참조: Grubb, B.D., et al., A Study of 5-HT-Receptors Associated with Afferent Nerves Located in Normal and Inflamed Rat Ankle Joints, Agents Actions 25, pp. 216-18(1988)]. 따라서, 5-HT2 수용체의 활성화는 말초 동통 및 신경에 유래하는 염증에 있어 역활을 할 수 있다.
본 발명의 용액의 하나의 목표는 동통 및 다수의 염증 과정을 차단하는 것이다. 즉, 5-HT2 및 5-HT3 수용체 길항제는 둘 다, 이후 기술될 바와 같이, 본 발명의 용액중에서 개별적으로 또는 함께 적합하게 사용된다. 아미트립틸린(ElavilTM)은 본 발명에서 사용하기에 적합한 5-HT2 수용체 길항제이다. 아미트립틸린은 수년동안 항 억울증 제제로서 임상적으로 사용되어 왔으며, 특정의 만성 동통 환자에 있어 유리한 효과를 갖는 것을 밝혀졌다. 메토클로프라미드(ReglanTM)은 항-구토 약물로서 임상적으로 사용되나 5-HT3 수용체에 대해 중간정도의 친화도를 나타내며 이 수용체에서 5-HT의 작용을 억제하고, 가능하게는 혈소판으로부터의 5-HT 방출에 따른 동통을 억제할 수 있다. 따라서, 메토클로프라미드는 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
다른 적합한 5-HT2 수용체 길항제는 이미프라민, 트라조돈, 데시프라민 및 케탄세린을 포함한다. 케탄세린은 이의 항-고혈압 효과로 인해 임상적으로 사용되어 왔다[참조; Hedner, T., et al., Effects of a New Serotonin Antagonist, Ketanserin, in Experimental and Clinical Hypertension, Am J of Hypertension, pp. 317s-23s(Jul. 1988)]. 다른 적합한 5-HT3 수용체 길항제는 시사프리드 및 온단세트론을 포함한다. 적합한 세로토닌1B 수용체 길항제는 요힘빈, 즉 N-[-메톡시-3-(4-메틸-1-피페라지닐)페닐]-2'-메틸-4'-(5-메틸-1,2,4-옥사디아졸-3-일)[1,1-비페닐]-4-카복스아미드("GR127935") 및 메티오테핀을 포함한다. 본 발명의 용액에서 이들 약물의 치료학적 및 바람직한 농도는 표 1에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
세로토닌2 수용체 길항제
아미트립틸린 0.1-1,000 50-500
MDL-11,939 0.1-1,000 50-500
AMI-193 0.1-2,000 50-500
데시프라민 0.1-1,000 50-500
케타세린 0.1-1,000 50-500
세로토닌3 수용체 길항제
트로피세트론 0.01-100 0.05-50
메토클로프라미드 10-10,000 200-2,000
시사프리드 0.1-1,000 20-200
온단세트론 0.1-1,000 20-200
세로토닌1B(사람 1Dβ) 길항제
이사몰타레 0.1-1,000 50-500
GR127935 0.1-1,000 10-500
메티오테핀 0.1-500 1-100
SB216641 0.2-2,000 2-200
2. 세로토닌 수용체 효능제
5-HT1A, 5-HTIB 및 5-HT1D 수용체는 아데닐레이트 사이클라제 활성을 억제하는 것으로 공지되어 있다. 즉, 용액중에 저 용량의 이들 세로토닌1A, 세로토닌1B 및 세로토닌1D 수용체 효능제를 포함하는 것은 뉴우런 중재된 동통 및 염증을 억제할 수 있다. 동일한 작용이 세로토닌1E 및 세로토닌1F 수용체 효능제로부터도 기대되는데, 이는 이들 수용체가 또한 아데닐라제 사이클라제를 억제하기 때문이다.
부스피론은 본 발명에서 사용하기에 적합한 1A 수용체 효능제이다. 수마트립탄이 적합한 1A, 1B, 1D 및 1F 수용체 효능제이다. 적합한 1B 및 1D 수용체 효능제는 디하이드로에르고타민이다. 적합한 1E 수용체 효능제는 에르고노빈이다. 이들 수용체 효능제에 대한 치료학적 및 바람직한 농도는 표 2에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
세로토닌1A 효능제
부스피론 1-1,000 10-200
수마트립탄 1-1,000 10-200
세로토닌1B 효능제
디하이드로에르고타민 0.1-1,000 10-100
수마트립탄 1-1,000 10-200
나라트립탄 1-1,000 10-200
리자트립탄 1-1,000 10-200
졸미트립탄 1-1,000 10-200
L-694,247 1-1,000 10-200
세로토닌1D 효능제
디하이드로에르고타민 0.1-1,000 10-100
수마트립탄 1-1,000 10-200
나라트립탄 1-1,000 10-200
리자트립탄 1-1,000 10-200
졸미트립탄 1-1,000 10-200
L-694,247 1-1,000 10-200
세로토닌1E 효능제
에르고노빈 10-2,000 100-1,000
세로토닌1F 효능제
수마트립탄 1-1,000 10-200
3. 히스타민 수용체 길항제
히스타민 수용체는 일반적으로 히스타민1(H1)과 히스타민2(H2) 아형으로 나누어진다. 히스타민의 말초 투여에 대한 고유의 염증 반응은 H1 수용체를 통해 중재된다(참조: Douglas, 1985). 따라서, 본 발명의 용액은 바람직하게는 히스타민 H1 수용체 길항제를 포함한다. 프로메타진(PhenerganTM)이 H1 수용체를 강력하게 차단하는 일반적으로 사용되는 항-rn토 약물이며 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 흥미롭게도, 이 약물은 또한 국소 마취 효과를 지니는 것으로 밝혀졌으나 이러한 효과에 요구되는 농도는 H1 수용체를 차단하는데 요구되는 것 보다 수배 더 높으므로 이 효과는 상이한 메카니즘에 의해 일어나는 것으로 여겨진다. 본 발명의 용액중 히스타민 수용체 길항제의 농도는 유해수용기 활성화에 관여하는 H1 수용체를 억제하기에 충분하지만 "국소 마취" 효과를 달성하기에는 충분하지 않으므로, 전신계적 부작용에 관한 걱정을 제거할 수 있다.
다른 적합한 H1 수용체 길항제는 테르페나딘, 디펜하이드라민, 아미트립틸린, 메피라민 및 트리폴리딘을 포함한다. 아미트립틸린은 또한 세로토닌2 수용체 길항제로서 효과적이므로, 본 발명에서 사용하는 경우 이중 작용을 지닌다. 이들 H1 수용체 길항제 각각에 대한 치료학적 및 바람직한 농도는 표 3에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
히스타민1 수용체 길항제
프로메타진 0.1-1,000 50-200
디펜하이드라민 0.1-1,000 50-200
아미트립틸린 0.1-1,000 50-500
테르페나딘 0.1-1,000 50-500
메피라민(피릴라민) 0.1-1,000 5-200
트리폴리딘 0.01-100 5-20
4. 브래디키닌 수용체 길항제
브래디키닌 수용체는 일반적으로 브래디키닌1(B1)과 브래디키닌2(B2) 아형으로 나누어진다. 연구들은 브래디키닌에 의해 유발된 급성의 말초 동통 및 염증이 B2 아형에 의해 중재되는 반면, 만성 염증 상태에서 브래디키닌-유발된 동통은 B1 아형을 통해 중재됨을 나타내고 있다[참조: Perkins, M.N., et al., Antinociceptive Activity of the Bradykinin B1 and B2 Receptor Antagonists, des-Arg9, [Leu8]-BK and HOE 140, in Two Models of Persistent Hyperalgesia in the Rat, Pain 53, pp. 191-97(1993); Dray, A., et al., Bradykinin and Inflammatory Pain, Trends Neurosci 16, pp. 99-104(1993), 이들 각각의 문헌은 본원에 참조로 도입된다].
현재, 브래디키닌 수용체 길항제는 임상적으로 사용되지 않는다. 이들 약물의 일부는 펩타이드이므로, 이들은 소화되기 때문에 경구적으로 투여될 수 없다. B2 수용체에 대한 길항제는 브래디키닌-유발된 급성 동통과 염증을 차단단다(참조: Dray et al., 1993). B1 수용체 길항제는 만성 염증 상태에서 동통을 억제한다(참조: Perkins et al., 1993; Dray et al., 1993). 따라서, 적용에 따라, 본 발명의 용액은 브래디키닌 B1과 B2 수용체 길항제 각각 또는 둘 다를 포함한다. 예를 들면, 관절경검사는 급성 및 만성 조건 둘 다에 대해 수행되므로, 관절경검사용 관주 용액은 B1 및 B2 수용체 길항제 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 브래디키닌 수용체 길항제는 다음 브래디키닌1 수용체 길항제를 포함한다: D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK (Hoechst Pharmaceuticals사에서 시판되는 "HOE 140의 [des-Arg10] 유도체"); 및 [Leu8] des-Arg9-BK. 적합한 브래디키닌2 수용체 길항제는 [D-Phe7]-BK; D-Arg- (Hyp3-Thi5,8-D-Phe7)-BK("NPC 349"); D-Arg-(Hyp3--D-Phe7)-BK ("NPC 567") 및 D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK ("HOE 140")를 포함한다. 이들 화합물은 앞서 도입된 문헌(참조: Perkins et al., 1993 및 Dray et al., 1993)에 더욱 상세히 기술되어 있다. 적합한 치료학적 및 바람직한 농도는 표 4에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
브래디키닌1 수용체 길항제
[Leu8] des-Arg9-BK 1-1,000 50-500
HOE 140의 [des-ArglO] 유도체 1-1,000 50-500
[leu9] [des-ArglO]칼리덴 0.1-500 10-200
브래디키닌2 수용체 길항제
[D-Phe7]-BK 100-10,000 200-5,000
NPC 349 1-1,000 50-500
NPC 567 1-1,000 50-500
HOE 140 1-1,000 50-500
5. 칼리크레인 억제제
펩타이드 드래디키닌은 앞서 나타낸 바와 같이 동통 및 염증의 중요한 중재자이다. 브래디키닌은 혈장중 고 분자량 키니노겐상에서의 칼리크레인의 작용에 의한 분해 산물로 생성된다. 따라서, 칼리크레인 억제제는 브래디키닌 생성과 이로 인한 동통 및 염증을 억제하는데 치료학적으로 가치가 있을 것으로 여겨진다. 본 발명에 사용하기에 적합한 칼리크레인 억제제는 아프로티닌이다. 본 발명의 용액에 사용하기 위한 적합한 농도는 표 5에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
칼리크레인 억제제
아프로티닌 0.1-1,000 50-500
6. 태키키닌 수용체 길항제
태키키닌(TK)는 물질 P, 뉴로키닌 A(NKA) 및 뉴로키닌 B(NKB)를 포함하는 구조적으로 관련된 펩타이드의 그룹이다. 뉴우런은 말초에서 TK의 주요 공급원이다. TK의 중요한 일반적인 효과는 뉴우런성 자극이나, 다른 효과로는 엔도텔린-의존성 혈관확장, 혈장 단백질 일혈, 유방 세포 점증원과 과립감소 및 염증 세포의 자극을 포함한다[참조: Maggi, C. A., Gen. Pharmacol., Vol. 22, pp. 1-24(1991)]. TK 수용체의 활성화에 의해 중재된 생리학적 작용의 상기 조합으로 인하여, TK 수용체의 표적화는 마취의 촉진과 신경성 염증의 치료를 위한 중요한 시도이다.
6a. 뉴로키닌 1 수용체 아형 길항제
물질 P는 NK1이라고 언급되는 뉴로키닌 수용체 아형을 활성화시킨다. 물질 P는 감각 신경 말단에 존재하는 운데카펩타이드이다. 물질 P는 C-섬유 활성화후 말초에서 염증과 동통을 유발하는 다수의 작용(혈관확장, 혈장 일혈 및 유방 세포의 과립감소를 포함)을 지니는 것으로 공지되어 있다[참조: Levine, J. D., et al., Peptides and the Primary Afferent Nociceptor, J. Neurosci. 13, p. 2273 (1993)]. 적합한 물질 P 길항제는 ([D-pro9[스피로-감마-락탐]Leu10,Trp11]피살라민-(1-11))("GR82334")이다. NK1 수용체에 작용하는 본 발명에 사용하기 위한 다른 적합한 길항제는 1-이미노-2-(2-메톡시-페닐)-에틸)-7,7-디페닐-4-퍼하이드로이소인돌론(3aR, 7aR)("RP 67580") 및 2S, 3S-시스-3-(2-메톡시벤질아미노)-2-벤즈하이드릴퀴누클리딘("CP 96,345")이다. 이들 제제의 적합한 농도는 표 6에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
뉴로키닌1 수용체 아형 길항제
GR 82334 1-1,000 10-500
CP 96345 1-10,000 100-1,000
RP 67580 0.1-1,000 100-1,000
6b. 뉴로키닌 2 수용체 아형 길항제
뉴로키닌 A는 물질 P와 함께 감각 뉴우런에서 공국재화(colocalization)되며 또한 염증과 동통을 촉진하는 펩타이드이다. 뉴로키닌 A는 NK2 라고 언급되는 특정 뉴로키닌 수용체를 활성화시킨다[참조: Edmonds-Alt, S., et. al., A Potent and Selective Non-Peptide Antagonist of the Neurokinin A (NK2) Receptor, Life Sci. 50: PL101 (1992)]. 적합한 NK2 길항제의 예는 ((S)-N-메틸-N-[4-(4-아세틸아미노-4-페닐피페리디노)-2-(3,4-디클로로페닐)부틸]-벤즈아미드("(±)-SR 48968"); Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu ("MEN 10,627"); 및 cyc(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-Met)("L659,877")를 포함한다. 이들 제제의 적합한 농도는 표 7에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
뉴로키닌2 수용체 아형 길항제
MEN 10,627 1-1,000 10-1,000
L 659,877 10-10,000 100-10,000
(±)-SR 48968 10-10,000 100-10,000
7. CGRP 수용체 길항제
칼시토닌 유전자와 관련된 펩타이드(CGRP)는 물질 P와 함께 감각 뉴유런에 공국재화되며, 혈관확장제로서 작용하여 물질 P의 작용을 강화시킨다[참조: Brain, S. D., et. al., Inflammatory Oedema Induced by Synergism Between Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) and Mediators of Increased Vascular Permeability, Br. J. Pharmacol. 99, p. 202 (1985)]. 적합한 CGRP 수용체 길항제의 예는 CGRP의 절단된 버젼인, I-CGRP-(8-37)이다. 이 폴리펩타이드는 CGRP 수용체의 활성화를 억제한다. 이 제제의 적합한 농도는 표 8에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
CGRP 수용체 길항제
I-CGRP-(8-37) 1-1,000 10-500
8. 인터루킨 수용체 길항제
인터루킨은 사이토킨으로 분류되며 백혈구와 기타 세포들에 의해 염증 중재자에 대해 반응하여 생성되는 펩타이드의 그룹이다. 인터루킨(IL)은 말초적으로 강력한 통각과민성 제제이다[참조: Ferriera, S. H., et. al., Interleukin-lβ as a Potent Hyperalgesic Agent Antagonized by a Tripeptide Analogue, Nature 334, p. 698 (1988)]. 적합한 IL-1β 수용체 길항제는 IL-1β의 절단된 버젼이 Lys-D-Pro-Thr이다. 당해 트리펩타이드는 IL-1β 수용체의 활성화를 억제한다. 이러한 제제의 적합한 농도는 표 9에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
인터루킨 수용체 길항제
Lys-D-Pro-Thr 1-1,000 10-500
9. 아라키돈산 물질대사용 합성 경로에서 활성인 효소의 억제제
9a. 포스포리파제 억제제
포스포리파제 A2(PLA2) 효소(cPLA2, iPLA2, sPLA2) 및 포스포리파제 C(PLC)에 의한 아라키돈산의 생산은 에이코사노이드로 알려져 있는 다수의 염증 중재자를 생성하는 캐스케이드 반응을 초래한다. 이 경로 전체에는 억제시킴으로써 이들 염증 중재자의 생성을 감소시킬 수 있는 다수의 단계들이 존재한다. 이들 각종 단계에서의 억제 예는 하기에 나타낸다.
효소 PLA2 동형의 억제는 세포막으로부터의 아라키돈산의 방출을 억제시키므로 프로스타글란딘과 류코트리엔의 생성을 억제하여 염증과 동통을 감소시킨다[참조: Glaser, K. B., Regulation of Phospholipase A2 Enzymes : Selective Inhibitors and Their Pharmacological Potential, Adv. Pharmacol. 32, p. 31 (1995)]. 적합한 PLA2 동형 억제제의 예는 마노알리드이다. 당해 제제의 적합한 농도는 표 10에 나타낸다. 포스포리파제 Cγ(PLCγ) 동형의 억제는 또한 프로스타노이드와 류코트리엔의 생성을 감소시킬 것이므로 동통과 염증을 감소시킨다. PLCγ 동형 억제제는 1-[6-((17β-3-메톡시에스트라-1,3,5(10)-트리엔-17-일)아미노)헥실]-1H-피롤-2,5-디온이다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
포스포리파제 억제제
마노알리드 100-100,000 500-10,000
아리스톨로크산 40-400,000 400-40,000
ACA 10-100,000 100-10,000
HELSS 6-6,000 60-6,000
9b. 사이클로옥시게나제 억제제
비스테로이드성 소염 약물(NSAID)은 소염제, 해열제, 혈전증 치료제 및 마취제로서 광범위하게 사용된다[참조: Lewis, R. A., Prostaglandins and Leukotrienes, In: Textbook of Rheumatology, 3d ed. (Kelley W. N., et. al., eds.), p. 258 (1989)]. 이들 약물에 대한 분자 표적은 제 I형 및 제 II형 사이클로옥시게나제(COX-1 및 COX-2)이다. 이들 효소는 프로스타글란딘 H 신타제(PGHS)-1(구성적) 및 PGHS-2(유도성)로 또한 공지되어 있으며 아라키돈산이 프로스타글란딘과 트롬복산의 생합성시 중간체인 프로스타글란딘 H로 전환하는 것을 촉진한다. COX-2 효소는 내피 세포, 대식 세포 및 섬유아세포에서 확인되었다. 당해 효소는 IL-1과 TNF-α에 의해 유도되며 이의 발현은 염증 부위에서 상향조절된다. COX-1의 구성적 활성 및 COX-2의 유도된 활성 둘 다는 동통과 염증을 구성하는 프로스타글란딘의 합성을 가져온다.
현재 사판되고 있는 다수의 NSAID(디클로페낙, 나프록센, 인도메타신, 이부프로펜 등)는 일반적으로 COX의 동형들 둘다의 일반적인 비선택적 억제제이나, 비록 상이한 화합물에 대한 비가 변한다 할지라도, COX-2에 비해 COX-1에 대해 더욱 더 선택적일 수 있다. 프로스타글란딘의 형성을 차단하기 위한 COX-1과 2의 사용은 프로스타노이드 수용체의 기술된 아형 7개와 천연 리간드의 상호작용을 차단하려고 시도하는 것보다 더욱 우수한 치료학적 방법인 것으로 나타났다. 보고된 에이코사노이드 수용체(EP-1, EP-2 및 EP-3)의 길항제는 매우 드물며 트롬복산 A2 수용체의 특이적이고도 고도로 친화성인 길항체만이 보고되었다[참조: Wallace, J. and Cirino, G. Trends in Pharm. Sci., Vol. 15 pp. 405-406 (1994)].
본 발명의 용액에 사용하기 위한 사이클로옥시게나제 억제제의 대표적인 치료학적 및 바람직한 농도는 표 11에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
사이클로옥시게나제 억제제
케토롤락 100-10,000 500-5,000
인도메타신 1,000-500,000 10,000-200,000
9c. 리포옥시게나제 억제제
효소 리포옥시게나제의 억제는 염증과 동통의 중요한 중재자인 것으로 알려져 있는 류코트리엔 B4와 같은 류코트리엔의 생산을 억제한다[참조: Lewis, R. A., Prostaglandins and Leukotrienes, In : Textbook of Rheumatology, 3d ed. (Kelley W. N., et. al., eds.), p. 258 (1989)]. 5-리포옥시게나제 길항제의 예는 2,3,5-트리메틸-6-(12-하이드록시-5,10-도데카디이닐)-1,4-벤조퀴논("AA 861")이며, 이의 적합한 농도는 표 12에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
리포옥시게나제 억제제
AA 861 100-10,000 500-5,000
카페인산 500-50,000 2,000-20,000
10. 프로스타노이드 수용체 길항제
아라키돈산의 대사물질로서 생산된 특정 프로스타노이드는 프로스타노이드 수용체의 활성화를 통해 이들의 염증 효과를 중재한다. 특정의 프로스타노이드 길항제 부류의 예는 에이코사노이드 EP-1과 EP-4 수용체 아형 길항제 및 트롬복산 수용체 아형 길항제이다. 적합한 프로스타글란딘 E2 수용체 길항제는 8-클로로디벤즈[b,f][1,4]옥사제핀-10(11H)-카복실산, 2-아세틸하이드라지드("SC 19220")이다. 적합한 트롬복산 수용체 아형 길항제는 [15-[1α, 2β(5Z), 3β, 4α]-7-[3- [2-(페닐아미노)-카보닐]하이드라지노]메틸]-7-옥소비사이클로-[2,2,1]-헵트-2-일]-5-헵탄산("SQ 29548")이다. 이들 제제의 적합한 농도는 표 13에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
에이코사노이드 EP-1 길항제
SC 19220 100-10,000 500-5,000
11. 류코트리엔 수용체 길항제
류코트리엔(LTB4, LTC4 및 LTD4)는 효소적으로 생성되는 아라키돈산 물질대사의 5-리포옥시게나제 경로의 산물이며 중요한 생물학적 특성을 갖는다. 류코트리엔은 염증을 포함하는 다수의 병리학적 상태와 연관되어 있다. 특정의 길항제가 현재 이들 병리에 있어 강력한 치료학적 조절을 위해 많은 약제사로부터 시판되고 있다[참조: Halushka, P. V., et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 213-239 (1989); Ford-Hutchinson, A. Crit. Rev. Immunol. 10: 1-12 (1990)]. LTB4 수용체는 호산구(eosinophils) 및 호중구(neutrophils)를 포함하는 특정의 면역 세포에서 발견된다. 이들 수용체에 대한 LTB4의 결합은 화학주성 및 리소좀 효소를 방출시킴으로써 염증 과정에 기여한다. LTB4 수용체의 활성화와 연관된 신호 변환 과정은 G-단백질-중재된 포스포티딜이노시톨(PI) 물질대사의 자극 및 세포내 칼슘의 상승을 포함한다(참조: 도 2).
적합한 류코트리엔 B4 수용체 길항제의 예는 SC(+)-(S)-7-(3-(2-(사이클로프로필메틸)-3-메톡시-4-[(메틸아미노)-카보닐]페녹시(프로폭시)-3,4-디하이드로-8-프로필-2H-1-벤조피란-2-프로판산("SC 53228")이다. 본 발명을 실시하는데 적합한 당해 제제의 농도는 표 14에 나타낸다. 다른 적합한 류코트리엔 B4 수용체 길항제는 [3-[2-(7-클로로-2-퀴놀리닐)에테닐]페닐][[3-(디메틸아미노-3-옥소프로필)티오]메틸]티오프로판산("MK 0571") 및 약물 LY 66,071과 ICI 20,3219를 포함한다. MK 0571은 또한 LTD4 수용체 아형 길항제로서 작용한다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
류코트리엔 B4 길항제
SC 53228 100-10,000 500-5,000
12. 아편 수용체 길항제
아편 수용체의 활성화는 항-유해수용기 효과를 가져오므로, 이들 수용체에 대한 효능제가 바람직하다. 아편 수용체는 μ-, δ- 및 κ-아편 수용체 아형을 포함한다. μ-수용체는 말초의 감각 뉴우런 말단에 위치하며 이들 수용체의 활성화는 감각 뉴우런의 활성을 억제한다[참조: Basbaum, A. I., et. al., Opiate analgesia : How Central is a Peripheral Target?, N. Engl. J. Med., 325: 1168 (1991)]. δ- 및 κ-수용체는 교감신경계의 원심성 말단에 위치하며 프로스타글란딘의 방출을 억제함으로써 동통과 염증을 억제한다[참조: Taiwo, Y. O., et. al., Kappa- and Delta-Opioids Block Sympathetically Dependent Hyperalgesia, J. Neurosci., Vol. 11, page 928 (1991)]. 아편 수용체 아형은 G-단백질이 커플링된 수용체 상위그룹의 구성원이다. 따라서, 모든 아편 수용체 효능제는 이들의 동족 G-단백질이 커플링된 수용체를 통해 상호작용하여 시그날 전달을 개시한다. 적합한 μ-아편 수용체 효능제는 펜타닐 및 Try-D-Ala-Gly-[N-MePhe]-NH(CH2)-OH ("DAMGO")이다. 적합한 μ-아편 수용체 효능제의예는 [D-Pen2, DPen5]엔케팔린("DPDPE")이다. 적합한 κ-아편 수용체 효능제의 예는 (트랜스)-3,4-디클로로-N-메틸-N-[2-(1-피롤리디닐)사이클로헥실]-벤젠 아세트아미드(("U50,488")이다. 이들 제제 각각의 적합한 농도는 표 15에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
μ-아편 효능제
DAMGO 0.1-100 0.5-20
설펜타닐 0.01-50 1-20
펜타닐 0.1-500 10-200
PL 017 0.05-50 0.25-10
δ-아편 효능제
DPDPE 0.1-500 1.0-100
κ-아편 효능제
U50,488 0.1-500 1.0-100
13. 푸리노셉터 길항제
세포외 ATP는 P2 푸리노셉터와의 상호작용을 통해 시그날 전달 분자로서 작용한다. 퓨리노셉터의 1개의 주요 부류는 Na+, K+ 및 Ca2 +에 대해 투과성인 고유의 이온 채널을 지닌 리간드-게이트화 이온 채널(ligand-gated ion channel)인 P2x 퓨리노셉터이다. 감각 뉴우런에 기술된 P2x 수용체는 주요 구심성 신경전달 및 유해수용기에 중요하다. ATP는 감각 뉴우런을 감극시키는 것으로 알려져 있으며 손상된 세포로부터 방출된 ATP는 P2x 수용체를 자극시켜 유해수용기적 신경 섬유 말단을 감극화하기 때문에 유해수용기 활성화에 중요한 역활을 담당한다. P2X3 수용체는 고도로 제한된 분포를 지니는데[참조: Chen, C. C., et. al., Nature, Vol. 377, pp. 428-431 (1995)] 이는 P2X3 수용체가 척수로 향하는 감각 C-섬유 신경에서 선택적으로 발현되기 때문이며 이들 C-섬유 다수는 동통 자극에 대해 수용체를 운반하는 것으로 알려져 있다. 즉, P2X3 수용체 소단위에 대한 발현의 고도로 제한된 국재화는 이들 아형이 마취 작용에 대해 탁월한 표적이 되도록 한다(참조: 도 3 및 7).
G-단백질 수용체 상위그룹에 속하는 칼슘-이동성 퓨린 수용체는 포유동물 관절 연골세포의 표면에 존재하는 것으로 기술되어 있다. ATP는 분화된 주요 연골 세포에서 칼슘 이온의 농도를 용량 의존적으로 일시적 상승시키는 것으로 알려져 있다. 이종 탈감작화 실험은 연골 세포가 ATP를 사용한 초기 자극후 UTP에 대해 연속적인 반응을 나타내지 않음을 입증한다. 이러한 결과는 연골 세포의 세포 표면의 P2Y 수용체의 존재와 일치한다. 계대배양된 연골 세포에서의 퓨린-유도된 칼슘 이동은 효능제 감도와 관련하여 동일한 약력학적 측면을 나타낸다. ATP 및 UTP는 연골 체외이식조직 또는 주요 연골 세포에 의한 [35S]설페이트의 글리코사미노글리칸으로의 도입율로 측정되는 바와 같이, 연골 매트릭스 합성을 변경시키지 않는다. 연골 체외이식조직으로부터의 글리코사미노글리칸의 방출에 의해 측정되는 매트릭스 퇴화는 효능제에 의해서도 변경되지 않는다. 주요 관절 연골 세포의 표면에서 작용성 P2Y 퓨린 수용체의 존재는 ATP와 같은 세포외 퓨린의 농도를 가능케함으로써 연골 세포 물질대사를 활성화시킨다.
다른 연구는 사람 관절 연골 세포에 의한 P1 및 P2 퓨린 수용체 유전자 둘다의 발현을 규정하였으며 리간드-중재된 프로스타글란딘 E2 방출을 분석하였다. P2Y2 수용체 효능제 ATP 및 UTP는 사람 IL-1α를 사용한 예비처리 후 상승적으로 증가된 PGE2의 소 방출을 자극한다. IL-1 예비처리후 ATP 및 UTP의 동시첨가에 대한 반응시 PGE2 방출은 포르볼 미리스테이트 아세테이트에 의해 모사된다. P2Y2 수용체의 작용은 IL-1-중재된 PGE2 방출을 증가시킴으로써 관절내 동통과 염증을 촉진시킨다. 즉, 본 발명의 P2Y 길항제의 사용은 활막형성세포와 연골 세포 둘다에 의한 염증 중재자 생성의 활성화를 방지할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 P2x/ATP 퓨리노셉터의 길항제는 예를 들면, 수라민 및 피리독실포스페이트-6-아조페닐-2,4-디설폰산("PPADS")을 포함한다. 이들 제제의 적합한 농도는 표 16에 나타낸다.
동통 및/또는 염증 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
P2X 및/또는 P2Y 길항제
수라민 100-100,000 10,000-100,000
PPADS 100-100,000 10,000-100,000
14. Ca 2 + 채널 길항제
칼슘 채널 길항제는 세포 반응 중재된 신경염증의 활성화에 요구되는 칼슘 이온의 전이막 유출(transmembrane flux)을 방해하는 약물의 명백한 그룹이다. 활막형성세포와 연골 세포로의 칼슘 도입은 이들 세포에 있어 반응의 활성화를 중재하는 주요 현상이다. 또한, 신경염증 시그날 변환 경로를 중재하는데 있어 브래디키닌, 히스타민, 세로토닌(SHT2) 및 뉴로키닌 수용체(NK1 및 NK2)의 역활은 세포내 칼슘의 증가를 포함함으로써, 혈장막상의 칼슘 채널의 활성화를 초래한다. 많은 조직에서, 니페디핀과 같은 칼슘 채널 길항제는 각종 자극에 의해 유발되는 아라키돈산, 프로스타글란딘 및 류코트리엔의 방출을 감소시킬 수 있다[참조: Moncada, S., Flower, R. and Vane, J. in Goodman's and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, (7th ed.), MacMillan Publ. Inc., pp. 660-5 (1995)].
최종적으로, 칼슘 채널 길항제와 태키키닌, 히스타민 또는 브래디키닌 길항제는 신경염증을 억제하는데 있어서 상승 효과를 나타낸다. 신경염증을 중재하는데 있어서 뉴로키닌 수용체의 역활은 확립되어 있다. 뉴로키닌1(NK1) 및 뉴로키닌2(NK2) 수용체(G-단백질이 커플링된 상위그룹의 구성원) 신호 변환 경로는 세포내 칼슘의 증가를 포함함으로써, 혈장막상의 칼슘 채널의 활성화를 초래한다. 유사하게, 브래디키닌2(BK2) 수용체의 활성화는 활막형성세포와 연골 세포내 세포내 칼슘의 증가와 함께 이루어진다. 즉, 칼슘 채널 길항제는 일부가 L-형 채널을 통해 도입되는 세포내 칼슘의 상승을 포함하는 일반적인 메카니즘을 방해한다. 이는 칼슘 채널 길항제 및 뉴로키닌, 히스타민, P2Y와 브래디키닌2 수용체에 대한 길항제사이에 상승 상호작용의 기초이다.
본 발명을 실시하는데 적합한 칼슘 채널 길항제는 니솔디핀, 니페디핀, 니모디핀, 락시디핀, 이스라디핀 및 암로디핀을 포함한다. 이들 제제의 적합한 농도는 표 17에 나타낸다.
경축 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
제제의 부류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
칼슘 채널 길항제
니솔디핀 1-10,000 100-1,000
니페디핀 1-10,000 100-5,000
니모디핀 1-10,000 100-5,000
락시디핀 1-10,000 100-5,000
이스라디핀 1-10,000 100-5,000
암로디핀 1-10,000 100-5,000
II . 연골 퇴화 억제제
염증 및 연골 퇴화의 생화학 및 분자 생물학을 이해하는데 있어서의 최근의 진전은 다수의 내인성 사이토킨의 역활과 연관되어 있다. 염증이 있는 관절내 연골의 상실을 유발하는 것과 관련된 다수의 전-염증 중재자는 사이토킨, TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-8이다. 다수의 이들 전-염증 사이토킨의 상승된 수준은 급성의 손상된 무릎 관절의 활막액내에서 급격하게 존재하며 4주 이상동안 환자에게서 상승된 상태로 유지된다[참조: Cameron, ML et al.,"Synovial fluid cytokine concentrations as possible prognostic indicators in the ACL-deficient knee," Knee Surg. Sports Traumatol. Arthroscopy 2: 38-44 (1994)]. 이들 사이토킨은 활막 섬유아세포, 활막 대식세포 및 연골 세포를 포함하는 몇몇의 활성화된 세포 형태로부터 관절내에서 국소적으로 생성된다. 국소적으로 생성된 사이토킨은 급성 및 만성 염증 상태에서 병리생리학적 현상을 중재하며 연골 이화작용의 중요한 오토크린(autocrine) 및 파라크린(paracrine) 중재자이다. 이들 사이토킨의 작용은 명백한 세포 표적에서의 다수의 효과를 유발하는 이들의 능력 및 다른 사이토킨과의 양성 및 음성의 상승 방식으로 상호작용하는 능력에 의해 특성화된다. IL-1 및 TNF-α는 내인성 단백질, 즉, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 및 메탈로프로테이나제(TIMP)의 조직 억제제의 활성화를 조절함으로써 연골 매트릭스 성분의 정상적인 회복 및 파괴사이에서의 균형을 파괴함으로써 연골 퇴화 효과를 개시하기 때문에 특히 중요하다. 연골 항상성의 사이토킨 조절은 매트릭스 퇴화 또는 회복이 일어나는지를 측정하는, 연골 세포에서 작용하는 활성 중재자사이의 고도로 조절된 균형을 나타낸다.
연골에 대한 손상은 흔히 활막 조직을 포함하는 관절 공간내에 염증 반응을 유발시키며 관절 연골의 퇴화를 가져올 수 있다. 사람 무릎의 활막 및 연골 물질대사에 있어서의 놀라운 이동은 다음의 연골 손상과 관절경 수술에 기술되어 있다[참조: Cameron, M. L. et al. (1994), supra; Cameron, M. L. et al.,"The natural history of the anterior cruciate ligament-deficient knee: Changes in synovial fluid cytokine and keratan sulfate concentrations,"Am. J. Sports Med. 25: 751-754 (1997)]. 특정의 전-염증 사이토킨 농도는 전방 십자 인대(ACL) 파열후 관측되는 급성 염증 상태동안에 무릎 관절 활막액에서 현저히(2배 내지 4배 크기) 증가한다. 현저한 변화는 또한 급성 외상후 환자의 활막액에서 상승하는 콜라게나제와 스트로멜라이신-1과 같은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 과생산에 기인하여 연골 매트릭스 분자의 농도에서도 일어난다[참조: Lohmander, L. S. et al.,"Temporal patterns of stromelysin-1 tissue inhibitor, and proteoglycan fragments in human knee joint fluid after injury to the cruciate ligament or meniscus,"J. Orthopaedic Res. 12: 21-28 (1994))]. 일시적으로, 연골 퇴화와 연관되어 있는, 활막액내 사이토킨과 연골 매트릭스 마커(예: 프로테오글리칸)에 있어서의 변화는 급성 손상 기간동안에 최대이나 연장된 기간(3개월 내지 1년)동안 지속되고, 서서히 감소하여 손상 전의 기본 수치보다 더욱 높게 유지된다.
관절경 수술 자체로 인한 외상은 사이클로옥시게나제-2와 다른 전-염증성 사이토킨의 상향조절을 포함하는, 관절내 세포의 추가적인 염증 활성화를 반영하는 현저한 수술후 염증을 유발한다. ACL이 파열된 환자의 현저한 비율(60 내지 90%)은 손상된지 10 내지 15년후 골관절염(OA)의 무릎 지표의 방사선사진상의 변화를 나타낸다[참조: Cameron, M.L. et al. (1994) 상기 참조). 즉, 초기 관절 손상과 외과적 외상의 배합 효과는 지속적인 염증 상태 및 관절 연골내 퇴행성 변화의 후속적인 진행 및 골관절염의 초기 진행을 가져오는 원인 인자인 것으로 여겨지는 연골 매트릭스 물질대사에 있어서의 관련된 변화를 유도할 수 있다. 1996년 미국에서만 수행된 관절경 수술의 예상되는 총 수는 180만건이며 해마다 약 10%의 예상 증가율로 증가하므로 이러한 건강 문제는 매우 중요하다. 즉, 관절내 관절 연골의 퇴화를 방지하기 위한 약제학적 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
외과수술후 동통 및 염증은 중요한 임상적 문제로 여겨지지만, 현재 관절경 수술을 위한 약리학적 치료 방법은 단지 단기간의 수술후 마취에 촛점이 맞추어져 있다. 존재하는 외과적 치료 양상은 수술후 유도되는 만성 염증 상태와 수술로 치료된 관절의 연골 파괴을 억제하기 위한 요구에 촛점이 맞추어져 있지 않다. 따라서, 동통 및 염증의 급성 및 만성 상태 둘다와 손상되고 수술로 치료된 관절에 있어서의 연골 대사의 병리학적 변화에 촛점이 맞추어질 효과적이고 통합된 약물 치료요법을 개발하는 것이 명백히 요구된다.
본 발명의 하나의 양태에 따라서, 환자의 관절에 하나 이상의 대사적으로 활성인 연골 보호제와 앞서 기술한 바와 같은 동통 및/또는 염증 억제용 제제 하나 이상 또는 달리는 2개 이상의 대사적으로 활성인 연골 보호제(이들중 하나는 연골 동화 과정을 촉진하고 다른 하나 이상은 연골 이화 과정 억제제이다)를 관절내 전달용의 약제학적으로 효과적인 담체속에 포함하는 조성물을 환자의 관절에 직접 투여함으로써 관절내 관절 연골의 파괴를 감소시키거나 방지하는 방법이 제공된다. 대사적으로 활성인 제제는 혈장 막의 전위차, 세포 수용체의 리간드 결합 또는 효소적 활성, 세포내적으로 또는 세포외적으로 위치하는 효소, 단백질-단백질 상호작용, RNA-단백질 상호작용, 또는 DNA-단백질 상호작용을 변경시키는 제제를 포함하는, 세포의 생물학적, 생화학적 또는 생물리학적 상태를 조절하거나 변경시키는데 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 모든 화합물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 이러한 제제는 신호 변환 캐스케이드, 시그날 전달 경로를 억제하는 수용체 길항제, 세포내 또는 세포외 효소의 활성화제와 억제제 및 DNA에 대한 전사 인자의 결합을 조절하는 제제를 포함할 수 있다.
더욱 상세하게, 본 발명의 하나의 양태는 국소적으로 전달하여 최대의 치료학적 잇점을 달성하는 연골 보호제의 배합물을 사용한 손상되거나 수술로 치료된 관절의 약리학적 치료방법을 제공하는 것이다. 연골 보호제의 배합물의 사용은 합성 및 분해사이의 이동이 이화 과정쪽으로 일어나는 다인성 연골 파괴 과정을 차단하기 위해 하나의 제제를 사용함에 따라 존재하는 치료학적 시도의 한계를 극복한다. 본 발명의 하나의 양태는 별개의 분자 표적에 동시에 작용하는 제제의 배합 시도를 유일하게 이용하여 연골 동화작용을 촉진시키고 조절되지 않거나 과도한 연골 이화작용 과정을 억제하여 최대의 염증 과정을 억제하고 연골 항상성을 유지함으로써 관절내 연골보호 효과를 달성하는 것이다. 인터루킨-1(IL-1) 수용체에 결합하는 IL-1을 억제하는 것과 같이 연골 파괴(이화작용)을 유도하는 것으로 알려져 있는 단일의 분자 표적 또는 생화학적 대사의 억제는 최적의 방법이 아닌 것으로 보이는데, 이는 자체의 유일한 수용체를 통해 중재되는 TNF-α의 작용이 IL-1과 다수의 겹쳐지는 전-염증 작용 및 연골 이화작용 기능을 공유하며 또한 관절내 연골 파괴의 주요 중재자인 것으로 인지되기 때문이다. 유사하게, 이화과정을 억제시키는 것을 제외하고 단지 연골 동화작용을 증강시키는 약제학적 제제를 이용하는 것은 손상된 관절내에 존재하는 이화작용 인자를 최적으로 중화시키지 않는다.
상세하게, 본 발명의 하나의 양태는 명백한 분자 표적에 동시에 작용하는 2개 이상의 제제의 배합물을 기초로 하는 대사적으로 활성인 연골 보호제의 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 대표적인 양태로서, 적어도 하나의 제제는 소염 활성을 제공하고/하거나 연골 동화 과정을 촉진시키는 성장 인자 수용체 효능제 또는 사이토킨이고 적어도 다른 하나의 제제는 전-염증 및/또는 연골 이화 과정을 억제하는데 작용하는 효소 억제제 또는 수용체 길항제이다. 대표적인 약물 배합물은 관절내에서 전-염증성 사이토킨의 역활을 억제하고 연골 매트릭스 합성을 촉진하며 매트릭스 퇴화를 억제하는데 기능적으로 작용하는 소염성/동화작용성 사이토킨의 부류로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함한다. 이들 수용체 효능제는 인터루킨(IL) 효능제(예: IL-4, IL-10 및 IL-13)과 형질전환 성장 인자-β 상위 그룹의 특정 구성원(예: TGFβ 및 BMP-7)과 같은 특정의 소염 및 동화성 사이토킨, 인슐린 유사 성장 인자(예: IGF-1) 및 섬유아세포 성장 인자(예: bFGF)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 적어도 두번째 제제는 전-염증성 분자 표적(예: IL-1 수용체 길항제, TNF-α 수용체 길항제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, MAP 키나제 억제제, 산화질소 신타제(NOS) 억제제 및 핵 인자 카파B(NFκB)억제제)의 활성화 또는 발현을 억제하거나 감소시키는데 작용하는 효소 억제제 또는 수용체 길항제의 부류로부터 선택된다. 대사적으로 활성인 제제는 세포 표면상에 위치하는 수용체의 작용성 효능제와 길항제 둘다 및 막에 결합되거나 세포외로 분비된 효소(예: 스트로멜라이신 및 콜라게나제)의 억제제를 포함한다. 또한, 많은 당해 제제들이 세포외적을 위치하는 효소이며 효소 NOS의 억제제, COX-2, 및 유사분열물질로 활성화된 단백질 키나제(MAPK)와 전사인자 NFκB와 같은 단백질-DNA 상호작용 억제제를 포함하는, 표면 수용체의 신호를 변환시키고 통합하는 전사 인자인 신규의 표적에 대해 지시된다. 당해 방법은 사이토킨-유도된 이화 과정을 촉진하고 이화 과정을 동시에 억제함으로써 연골의 항상성이 유지되도록 한다.
다수의 약물 배합물이 외과 관절경 수술동안 수술과 더불어(예: 수술전 및/또는 수술중 및/또는 수술후) 투여함을 포함하는 관절내 주사에 의하거나 주입을 통해 단독으로, 또는 조절된 펌프 전달 시스템 또는 기타 서방성 전달 시스템의 의한 전달과 같은 수술후 지속적인 전달과 연계하여 국소적으로 전달될 수 있다. 서방성 전달 시스템은 단백질, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물 또는 무기 화합물로 구성된 미세입자, 미세구 또는 나노입자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 일부 양태에서, 본 발명은 단독으로, 또는 마취제 및/또는 소염제와 함께 주사 또는 주입을 통해 전달된 제제의 배합물을 제공한다. 손상 시기 또는 손상후 즉시(예를 들면, 수술과 더불어) 연골보호제의 직접적인 국소 전달에 의해 달성된 신속한 작용은, 이들이 연속적인 반응을 개시하기 전에 초기 반응을 억제하는 잠재력을 지님으로써 국소적 조직 손상과 후속되는 연골 손실을 우선적으로 제한할 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 장점은 다음을 포함한다: 1) 배합 약물 치료요법이 급성 및 만성 상태동안 연골 파괴의 다인성 원인에 대해 지시된다; 2) 연골 보호제의 배합물이 소염제 및 마취제와 배합될 수 있다; 3) 약물 배합물의 국소 전달은 관절내 연골 보호제의 신속한 치료학적 농도를 달성한다; 4) 수술과 더불어 관주 용액의 사용은 관절경 수술동안 관절내에 치료학적으로 바람직한 범위의 약물 농도를 지속적으로 유지시킨다; 5) 국소 전달은 전신계적 전달과 비교하여 총 약물 투여량 및 투여 획수를 감소시킨다; 6) 관절내로 국소 부위에 지시된 전달은 전신계적 독성을 방지하고 부작용을 감소시킨다 및 7) 관절내로의 직접적인 국소 전달은 전신계적 투여 경로로 제한되는 경우 치료학적으로 유용하지 않을 수 있는, 사이토킨 및 성장 인자를 포함하는, 신규의 약제학적 활성 펩타이드와 단백질의 사용을 가능하게 한다.
1. 인터루킨-1( IL -1) 수용체 길항제
인터루킨 IL-1은 2개의 형태, 즉 IL-1α 및 IL-1β로 존재하며, 이들은 면역조절기능과 소염 기능의 유사한 스펙트럼을 공유하는 별개의 유전자 산물로부터 기원한 폴리펩타이드이다. IL-1은 둘 다 작용할 수 있고 활막 섬유아세포와 대식 세포를 포함하는 관절내 다수의 세포 유형, 연골세포, 내피세포 및 단핵세포와 대식세포에 의해 생산되는 17kD의 폴리펩타이드이다. IL-1은 관절 염증 및 손상된 관절내에서 일어나는 관절 연골의 병리생리학적 손상에 있어 중용한 역활을 한다.
이러한 연골 파괴 사이토킨 형태 둘 다의 작용은 2개의 IL-1 수용체(IL-1R)중 하나, 즉 제I형 IL-1 수용체 또는 제II형 IL-1 수용체에 의해 중재된다. IL-1 수용체는 구조적으로 명백하며 면역글로불린 결합 영역의 존재에 의해 특성화된 별개의 상위그룹에 속한다. 이들 수용체는 면역글로불린 영역을 포함하는 다른 수용체와 밀접한 아미노산 상동성을 지닌다. 보다 큰 제I형 IL-1 수용체의 발현은 T 세포 및 섬유아세포상에 존재하는 반면, 유사한 제II형 IL-1 수용체는 B 세포, 단핵세포, 호중구 및 골수 세포에 존재한다.
제II형 IL-1 수용체는 높은 친화도로 IL-1β에 결합하나, IL-1β 결합은 제I형 IL-1 수용체에 결합하는 경우와 같이 세포내 신호 변환을 개시하지 않는다. 대조적으로, 제II형 수용체는 세포로부터 방출되는 것으로 밝혀진 가용성 IL-1 결합 인자에 대한 전구체로서 작용하며 당해 가용성 수용체는 생리학적 IL-1β 길항제로서 작용한다. 천연적으로 존재하는 IL-1 결합 단백질은 제II형 수용체의 외부 가용성 부위에 상응하는 것으로 기술되어 있다.
달리 IL-1 수용체 길항제로 언급되는, IL-1 수용체에 결합하는 천연적으로 존재하여 분비되는 가용성 리간드(sIL-1RA, IL-1Ra 및 IL-1ra)는 클론되고(cloned), 서열분석되어 22kD 단백질을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. IL-1Ra는 제I형 및 제II형 IL-1 수용체 둘다에 대한 IL-1α 및 IL-1β의 결합을 경쟁적으로 억제한다. IL-1Ra는 수용체에 대한 이의 결합이 막 연관된 IL-1 수용체의 세포 신호 변환을 활성화시키지 않으므로 순수한 수용체 길항제이다. IL-1Rs에 대한 당해 단백질의 고 친화성 결합에도 불구하고, 제I형 IL-1R을 발현시키는 세포의 IL-1 생물학적 반응을 억제하는데 10 내지 100배의 몰 과량이 요구된다. IL-1Ra를 생산하는 것으로 알려진 세포는 단핵세포, 호중구, 대식세포, 활막형성세포 및 연골세포를 포함한다. IL-1Ra는 PGE2 합성, 전-염증성 사이토킨과 MMP의 유도, 및 산화질소 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 분비된 IL-1Ra는 실험적으로 유도시킨 염증동안 생체내에서 방출된다. 중요하게는, IL-1Ra는 활막 조직에서 발현되며 정상의 사람 활막액중에 존재한다. 무릎이 손상된 환자에 있어, 활막액중 IL-1Ra의 농도는 손상후 급성 상태에서 현저히 증가하며 연속해서 아-급성 및 만성 상태에서 정상치 이하로 감소된다. 즉, IL-1Ra는 손상에 대한 관절의 반응에 있어 생리학적 역활을 하는 것으로 밝혀졌다.
IL-1은 연골세포 및 활막형성세포 둘다에 의해 분해성 효소 및 전-염증성 사이토킨의 생산을 자극하는 자체 능력으로 인해 연골 파괴에 중요한 역활을 하는 것으로 여겨진다. 또한, IL-1β는 연골세포에 의한 프로테오글리칸 및 콜라겐 합성의 중요한 억제제이다. 세포 수준에서, 활막 섬유아세포의 IL-1β로 유도된 반응은 PGE2, 콜라게나제 및 다른 중성 프로테아제의 증가된 생산 및 전-염증성 사이토킨인, IL-6 및 IL-8의 상향조절을 포함한다.
*관절 질병이 있는 환자의 관절액에 존재하는 IL-1은 연골세포를 자극하여 1) 증가된 양의 스트로멜라이신, 섬유아세포 및 호중구 콜라게나제와 같은 효소 및 플라스미노겐 활성인자를 합성하고, 2) 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 및 TIMP의 합성을 억제한다. 또한, IL-1β는 관절 연골에서 우세한 형태의 콜라겐인, 제II 형 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 매트릭스 구성물 합성의 강력한 억제제이다. 억제제 및 프로테아제의 농도사이의 불균형은 활성 프로테아제의 양에 있어서의 증가를 가져온다. 매트릭스 생합성의 억제와 결합된 이러한 증가는 연골의 퇴화를 초래한다. 동물 연구에서, 토끼 무릎 관절내로의 IL-1의 주사는 관절 연골로부터 프로테오글리칸의 고갈을 유발한다.
IL-1은 만성 활막퇴화와 연골 퇴화의 발병에 관여하는 주요 사이토킨중 하나이므로, 이의 생산을 감소시키거나 이의 작용을 차단시키는 것은 활막 염증을 감소시키고 연골 보호 효과를 제공하는 새로운 치료의 적절한 방법임을 나타낸다. 효능제 IL-1과 이의 천연의 막 결합된 수용체의 상호작용을 길항하기 위한 각종의 치료학적 시도가 사용될 수 있으며, 이에는 1) IL-1Ra 및 가용성 IL-1 수용체를 포함하는, 현재까지 특성화되어 있는, 천연적으로 존재하는 IL-1 활성의 특이적 억제제; 2) 항-IL-1 Abs 및 3) 펩타이드성 또는 비펩타이드성일 수 있는 소 분자 길항제가 포함된다.
당해 주요 사이토킨의 작용을 차단하는 능력은 관절내 많은 세포 유형(예: 활막 섬유아세포 및 연골세포)에서 효과를 지니므로, 관절내로 염증 세포의 침윤, 활막 과형성, 활막 세포 활성화외에, 연골 파괴 및 연골 매트릭스 합성의 억제와 같은 연속적인 병리학적 효과를 억제하는데 있어 효과를 발휘한다. IL-1 수용체 길항제는 IL-1에 의한 염증 반응의 증식을 차단함으로써 질병 과정을 차단한다. 다수의 IL-1 수용체 길항제의 치료학적 효능은 염증 및 관절염(RA 및 OA)의 동물 모델에서 확립되어 있다. RA로 고생하는 환자는 IL-1Ra 의 피하 주사 또는 가용성의 제I형 IL-1R의 관절내 주사에 의해 임상적으로 개선된다.
IL-1β 및 IL-1Ra의 효과는 이들 각각의 국소 농도에 따른다. RA 활막 조각의 상층액에서, IL-1β 농도는 IL-1Ra의 것보다 3배 더 높다. 즉, IL-1Ra의 자발적인 국소적 생산은, 더욱 많은(10 내지 100배) 몰 과량의 IL-1Ra가 제I형 IL-1R을 발현하는 세포내에서 IL-1 유도된 생물학적 반응을 억제하는데 요구되기 때문에 IL-1β 효과를 억제하는데 충분하지 않다. 따라서, 고 투여량의 IL-1Ra가, RA가 있는 환자중 사람 지원자에서 IL-1을 차단하기 위해 생체내에서 사용되어 왔다. 활막속에 국소적으로 존재하는 IL-1Ra는 손상 조직내 백혈구 축적, PGE2 생산 및 활막 세포에 의한 콜라게나제 생산과 같은 활막내 IL-1-중재된 과정의 적어도 일부를 하향 조절하는 음성 신호를 제공한다. IL-1Ra의 연골보호 효과는 개 ACL 모델에서 연골내로 IL-1Ra를 직접 주사하고 사람 활막 섬유아세포내로 IL-1Ra 유전자를 형질감염시킴을 기초로 하는 유전자 치료요법 시도를 사용함으로써 입중되었다.
본 발명은 IL-1R의 세포외 영역으로 구성되며 용액속에서 IL-1 사이토킨 분자와 결합할 수 있는 IL-1 가용성 수용체 단백질의 국소 전달을 기술한다. 특히 실시예의 방법에 의해, 미국 특허 제5,319,071호 및 미국 특허 제5,726,148호에 기술된 아미노산 서열 1번 내지 312번을 필수적으로 포함하는 가용성 사람 IL-1 수용체(shuIL-1R) 폴리펩타이드가 소염 부류, 항-동통 부류 또는 연골보호 부류로부터 선택된 하나 이상의 약물과의 배합 사용을 위해 본원에 기술되어 있다. 달리는, sIL-1R 결합 영역 폴리펩타이드로 이루어진 융합 단백질의 국소 전달이 미국 특허 제5,319,071호에 기술된 바와 같이, 연골보호를 촉진하는데 사용하기 위해 제안되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,817,306호에 기술된 IL-1 수용체 길항제의 국소 전달이 본 발명에 사용하기 위해 기술되어 있다. shuIL-1R 가용성 수용체는 나노몰 친화성으로 IL-1에 결합하는 것으로 밝혀져 있다. shuIL-1R과 같은 IL-1R 가용성 수용체의 치료학적으로 효과적인 농도의 국소 전달은 연골내에 또는 관주 용액속(즉, 관절경 외과 수술 동안)으로, 본원에 각종 염증 또는 병리생리학적 상태에서 관절의 조직내로 국소 적용하는 경우 연골 보호제로서 기술되어 있는, 하나 이상의 연골 보호 약물, 소염 약물 또는 항-동통 약물과 배합하여 직접 주입함으로써 달성할 수 있다. 이러한 치료는 콜라게나제-1과 스트로멜라이신-1 생산의 IL-1 자극을 우선적으로 억제할 것이다. IL-1 및/또는 TNF-α에 대한 제1형의 가용성 수용체의 국소 생산을 위한 유전자 전달을 기초로하는 전체적으로 상이한 방법을 사용하여, 이들 사이토킨에 대한 가용성 수용체의 존재가 항원으로 유발된 관절염의 급성 염증 상태동안에 토끼 무릎 관절을 보호할 수 있음이 밝혀졌다.
사람 제I형 IL-1 수용체에 대해 고 친화성으로 특이적 결합하는 IL-1 수용체 길항제 펩타이드(11 내지 15개의 아미노산)는 연골 보호제로서 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 이들 소 펩타이드는 합성의 용이성과 비용 및 생물학적 장벽에 대한 침투능을 포함하는 다수의 장점을 재조합 IL-1 가용성 수용체 또는 재조합 IL-1ra보다 더욱 많이 제공한다. 실험관내 효능을 기초로 하는 가장 강력한 펩타이드중 2개는 Ac-FEWTPGWYQJYALPL-NH2(AF12198, IC50=0.5-2nM)와 Ac-FEWTPGWYQJY-NH2(AF11567)이다. AF11567은 AF12198의 절단된 버젼으로서, 4개의 C-말단 잔기가 결실되어 있고 제I형 IL-1 수용체에 대해 약간의 낮은 친화성을 나타내나 2.3 내지 2.6 시간의 유사한 혈장 반감기를 지닌다. 난용성 및 신속한 물질대사는 정맥내 주입을 통한 전신계적 투여시 AF12198의 생체내 효능을 제한하는 것으로 여겨진다. 이러한 제한은 본 발명에 기술된 바와 같은 관절내 공간으로의 주사 또는 외과 관주 용액내으로의 도입 또는 다른 주입과 같은 직접적인 국소 전달 방법을 통해 부분적으로 극복된다. 본 발명에 적합한 IL-1 수용체 길항제의 예는 하기에 나열되어 있다. 모든 국소 전달 유형(예: 주사, 주입 및 관주)에 대해 각각의 적합한 제제의 최적 투여량 및/또는 농도는 치료학적으로 효과적인 투여량 및/또는 농도이다. 예로써, 나열된 각각의 제제에 대해, 나열된 제제를 함유하는 관주 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도를 제공하며, 이러한 농도는 치료학적으로 효과적인 것으로 여겨진다.
인터루킨-1 수용체 길항제의 치료학적 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(nM) 가장 바람직한 농도(nM)
rshuIL-lR 0.2-2000 200
rhIL-lra 0.2-2000 200
항-IL1-항체 0.2-2000 200
AF12198 0.2-2000 200
AF11567 0.2-2000 200
2. 종양 괴사 인자( TNF ) 수용체 길항제
활성화된 대식세포에 의해 주로 생산되는 사이토킨인 TNF-α는 특정 TNF 수용체에 의해 중재되는 몇몇 유전자의 전사적 조절 및 면역조절 활성을 포함하는 많은 생물학적 작용을 지닌다. 근본적으로, TNF-R1 및 TNF-R2로 명명되는 2개의 상이한 수용체가 클론되어 특성화되었으며 가용성 수용체로서 생산되는 것으로 밝혀졌다.
당해 그룹에서의 수용체는 자체 세포외 영역내에 상동성이 높은 단일의 전이막 단백질인 반면 이들의 비교적 짧은 세포내 영역은 서열 상동성이 거의 없다. TNF의 작용은 당해 인자가 연구하는 실제 모든 세포 유형에 존재하는 세포 표면 수용체에 결합한 결과이다. 2개의 수용체가 확인 및 클론 되어 있다. TNFR-II(또는 제A형 또는 75kDa)이라 명명되는 하나의 수용체는 439개의 아미노산의 전이막 단백질을 암호화하며 정확한 분자량이 75kDa이다. TNFR-I(또는 제B형 또는 55kDa)이라 명명되는 두번째 수용체 유형은 55kDa의 정확한 분자량을 나타내며 426개 아미노산의 전이막 단백질을 암호화한다. TNFR1은 NF-kB 경로를 통해 시그날 전달을 개시할 수 있는 세포내 영역을 포함한다.
TNF 수용체 둘다는 TNFα 결합에 대해 높은 친화성을 나타낸다. 가용성 TNF 수용체(sTNFR)가 분리되었고 막 결합된 수용체의 세포외 영역의 제거 결과로써 발생하는 것으로 입증되었다. 2개 유형의 sTNFR이 확인되어 TNFR1(TNF BPI) 및 sTNFRII(TNF BPII)로 지정되었다. 이들 가용성 수용체 형 둘다는 상술한 TNFR의 2개 유형의 절단된 형태를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
TNF-α는 염증 반응과 연골 파괴가 일어나는 세포 및 분자 현상의 서열에서 중요한 역활을 한다. TNF-α의 많은 효과는 IL-1의 전-염증 효과와 겹쳐진다. TNF-α의 전-염증 작용중에는 IL-1, IL-6 및 IL-8을 포함하는 다른 전-염증 사이토킨 방출의 자극이 있다. TNF-α는 또한 부분적으로 콜라게나제의 자극을 통해 연골을 분해하는 호중구, 섬유아세포 및 연골세포로부터 매트릭스 메탈로프로테이나제의 방출을 유도한다. 또한, TNF-α는 정상의 사람 관절 연골세포와 활막 섬유아세포에서 COX-2를 상향조절함으로써 PGE2 생산을 증가시킨다.
IL-1과 함께 당해 사이토킨은 백혈구 침윤, 활막 과형성, 활막 세포 활성화, 연골 파괴 및 연골 매트릭스 합성의 억제를 포함하는 관절내 연골상에서의 병리학적 효과를 개시하고 유발하는 것으로 고려된다. 특히, 활막 염증동안, TNF-α의 증가된 수준은 관절의 활막액에서 발견되며 활막 세포에 의한 TNF-α의 생산이 증가된다. 즉, 관주 용액, 주입 또는 주사로서의 가용성 TNF-α 수용체의 국소 전달은 유리된 TNF-α에 결합하고 주변 조직에서 TNF 수용체의 길항제로서 작용함으로써 연골 보호 효과를 제공한다.
본 발명은 유용한 유리 리간드의 제거 또는 수용체 자체와의 직접적인 경쟁적 상호작용에 의해, 단독으로 또는 연골 보호 효과를 제공하는 다른 제제와 함께 리간드와 이의 동족의 막 수용체와의 상호작용을 차단하도록 세포외적으로 작용하는 TNF-α의 작용적 길항제의 사용을 기술한다. 1) 가용성 TNF-α 수용체를 포함하는, 현재까지 특성화된 TNF-α 활성의 천연적으로 존재하는 특이적 억제제의 사용; 2) 항-TNF-α 항체의 사용 및 3) 펩타이드성 또는 비펩타이드성일 수 있는 소분자 길항체의 사용을 포함하는, 효능제인 TNF-α와 이의 천연막 결합된 수용체의 상호작용을 길항하기 위한 각종의 치료학적 시도가 이용될 수 있다.
본 발명은 TNF 분자에 대한 결합 활성을 지닌 TNF 수용체의 세포외 영역이 IgG 분자의 영역에 공유적으로 연결된 가용성의 키메라 수용체(chimeric soluble receptor: CSR) 단백질의 사용을 기술하고 있다. 특히 및 예로써, 미국 특허 제5,447,851호에 기술된 바와 같이, 마우스 IgG1 중쇄 폴리펩타이드의 CH2 및 CH3 영역에 커플링된 TNF 수용체 세포외 폴리펩타이드의 세포외 영역을 포함하는 키메라 폴리펩타이드(재조합체 키메라)가 사용될 수 있다. 키메라 TNF 가용성 수용체(또한 미국 특허 제5,447,851호에서는 "키메라 TNF 억제제"로 명명)는 TNF-α와 높은 친화성으로 결합하는 것으로 밝혀져 있고 TNF-α 생물학적 활성의 억제제로서 고도로 활성인 것으로 입증되어 있다. 또한, 두번째 예는 TNF-α 수용체에 대해 창조된 Fc 항체(가용성의 Fc 융합 수용체로 명명)의 부위와 TNF 수용체의 리간드 결합 영역을 포함하는 키메라 융합 작제물이다. 본 발명은 또한 미국 특허 제5,605,690호에 기술된 바와 같은, 가용성 TNF 수용체:Fc 융합 단백질 또는 어떠한 변형된 형태의 사용을 기술하고 있다. 활성인 가용성 수용체 융합 단백질의 분자 형태는 단량체성이거나 이량체성일 수 있다. 현존하는 연구는 이러한 TNF 수용체:Fc 융합 단백질이 TNF-α에 대해 높은 결합 친화성을 보유한다는 사실을 입증하고 있다.
약리학적 길항제로서의 가용성 수용체를 정의하는데 있어서, 용어 가용성 수용체는 (1) 전체 길이의 막 수용체의 세포외 영역으로 이루어진 천연적으로(내인성으로) 생산된 아미노산 서열 또는 이의 가용성 단편에 상응하는 가용성 수용체, (2) 동종의 리간드에 결합하는 능력을 보유하고 이의 생물학적 활성과 동족체를 보유하는, 전체 길이의 천연적으로 존재하는 수용체 아미노산 서열의 절단되거나 부분 서열인 재조합 가용성 수용체 및 (3) 생물학적 활성과 동종의 리간드에 결합하는 능력을 보유한 IgG 폴리펩타이드(예: IgG 힌지 및 Fc 영역)의 일부에 상응하는 서열에 올리고머(예: 아미노산)을 통해 부착된 전체 길이의 수용체 아미노산 서열의 세포외 결합 영역의 일부에 상응하는 절단되거나 부분적인 서열을 포함하는 재조합 가용성 수용체인 가용성의 키메라 수용체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사이토킨 수용체의 가용성인 세포외 리간드 결합 영역은 체액속에서 천연적으로 생성되며 사이토킨의 생물학적 활성을 조절하는데 관여하는 것으로 고려되고 있다. 천연적으로 존재하는 다수의 조혈성 사이토킨 수용체의 가용성인 절단된 형태는 (IL-1R, IL-4R, IL-6R 및 TNFR)인 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 가용성 TNFR은 건강한 사람의 혈청 및 뇨에서 약 1 내지 2ng/ml의 농도로 발견된다. 신호 변환 작용을 상실하면, 완전한 수용체 서열(막 결합형)에 대한 mRNA의 다른 스플라이싱 또는 수용체의 막 결합된 형태의 단백질분해적 절단 및 방출의 결과로써 이들 사이토킨 결합 단백질이 생성된다. 비록, 이들 가용성의 절단된 수용체의 생체내 작용이 완전히 확립되어 있지 않다고 해도, 이들은 자체의 완전한 내인성 사이토킨의 생리학적 길항제로서 작용하는 것으로 여겨진다. 이러한 길항작용은, (1) 결합을 통하여 유리 리간드가 자체의 동종의 가용성 수용체에 결합하는 유리 리간드의 제거는 막에 결합된 수용체에 대한 유효한 유리 농도를 감소시키고 (2) 사이토킨의 작용이 세포 표면 수용체에 대한 결합에 대해 후속적으로만 생성되기 때문에 발생한다.
TNF-α 가용성 수용체는 유리 리간드의 일반적인 풀(pool)에 대해 이들 세포 표면 수용체를 경쟁시킴으로써 TNF-R1 및 TNF-E2의 천연 길항제로서 작용할 것이다. 약리학적으로, TNF 가용성 수용체는 경쟁적 억제(즉, 막 수용체상에서 일반적인 결합 부위에 대한 내인성 리간드와의 경쟁)의 메카니즘에 의해서라기 보다는 유리 리간드 생유용성을 감소시키는 자체의 능력을 통해 길항제로서 작용할 것이다. 관절로 치료학적 유효량의 TNF 가용성 수용체를 첨가하는 것은 리간드의 생물학적 활성을 효과적으로 중화시킨다. 재조합의 가용성 수용체를 생체내로 투여하는 실험은 염증 반응을 억제하고 길항제로서 작용함이 입증되었다.
본 발명에서, 연골 파괴를 억제하는 다른 연골 보호제, 항-동통제 및/또는 소염제와 함께 사용하기 위한 연골 보호제로서 적합한 제제는 가용성 TNFR, 사람 IgG1의 Fc 부위에 결합된 TNF-α 수용체(p80)의 세포외 영역 및 항-TNF-α 항체를 포함하는 사람 키메라 폴리펩타이드(재조합 키메라)를 포함한다. 모든 유형의 국소 전달(즉, 주사, 주입 및 관주)을 위한 각각의 적합한 제제의 최적 투여량 및/또는 농도는 치료학적으로 효과적인 양이다. 예로써, 나열된 각각의 제제에 대해, 치료학적으로 효과적인 것으로 예상되는, 나열된 제제를 포함한 관주 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도를 제공한다.
TNF-수용체 길항제의 치료학적 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(nM) 가장 바람직한 농도(nM)
sTNFR 0.1-2000 200
키메라 rhTNFR:Fc 0.1-2000 200
항-TNF-α 항체 0.2-2000 200
3. 인터루킨 수용체 길항제
일부 사이토킨은 활막 염증 및 연골 파괴의 중요 중재자인 시그날 전달 당단백질이다. 연골 파괴의 메카니즘에 대한 최신의 분석은 연골 상실을 측정하는데 중요한 절대 농도의 전-염증 주도 사이토킨, IL-1 뿐만 아니라, 연골 항상성의 사이토킨 조절이 이화 및 동화 조절 사이토킨의 조화 및 동화작용 성장 인자에 의해 조절됨을 제안하고 있다. IL-1β와 IL-1Ra 생산사이의 균형은 IL-1β에 상관없이 염증 상태를 변경시키며, 무릎 관절 수술후 발생하는 것으로 알려져 있는 만성 염증 상태 및 연골 파괴의 발병에 기여한다. 관절내 염증 부위에서 전-염증 사이토킨의 생산을 억제하는 강력한 치료제는 항-염증 사이토킨인, IL-4, IL-10 및 IL-13을 포함한다. 이들 사이토킨은 IL-1의 충격을 감소시키는 경로 범위에서의 이들의 효과를 통해 실험관내 및 생체내에서 관절 연골 퇴화를 현저히 감소시키는 것으로 관측되었다. 즉, IL-4, IL-10 및 IL-13과 같은 소염성 사이토킨은 1) 소염성 사이토킨의 생산을 감소시키고, 2) IL-4에 대해 생체내에서 최근 입증된 바와 같이, IL-1Ra와 같은 천연의 소염성 사이토킨의 생산을 유도함으로써 염증을 완화시키는데 유용할 수 있다.
IL-4는 류마치스 관절염(RA) 환자의 활막에서 염증 과정에 기여하는 것으로 여겨진다. 류마치스성 활막에서, IL-4는 활막 조각에 의한 소염성 사이토킨의 생산을 억제하고, 활막형성세포의 증식을 억제하며 골 재흡수를 감소시킴으로써 전-염증성 사이토킨의 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. IL-4는 사람 관절 연골세포에서 매트릭스 메탈로프로테이나제-3(MMP-3)의 억제를 통해 직접적인 연골 보호 효과를 촉진할 수 있다. 사람 관절 연골세포를 사용하는 세포 배양 시스템을 사용하여 MMP-3 및 메탈로프로테이나제-1(TIMP-1)의 조직 억제제의 IL-1 유도된 생산에 있어서의 IL-4의 효과를 평가한다. IL-4는 IL-1 자극된 MMP-3 단백질 및 효소 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, IL-4는 IL-1 유도된 MMP-3 mRNA를 억제한다. iNOS의 유도는 IL-4, IL-10 및 IL-13에 의해 억제될 수 있다. 즉, IL-4는 관절 염증 질병에서 관측되는 관절 파괴의 보호 중재자로 특성화될 수 있다.
또한, IL-1 조절 사이토킨 농도의 균형에 있어서 IL-4의 효과는 연골 보호 역활을 지지하는 것으로 밝혀졌다. IL-4와 IL-10은 새로이 제조된 류마치스성 활막 세포에 의해 염증성 사이토킨의 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 인터루킨이 단독으로 효과적이라 해도, IL-4와 IL-10의 배합물은 세포 생존력에 영향을 미치지 않으면서, IL-6과 IL-8의 IL-1과 TNF-α 자극된 생산을 상승적으로 억제한다. RA 활막 배양물로의 IL-4의 첨가는 IL-1Ra의 생산을 증가시키고 IL-1β의 생산을 감소시킨다. IL-4를 사용한 생체내 치료는 현재 IL-1β/IL-1Ra 균형에 있서 차별적으로 작용함으로써 랫트의 실험적 관절염의 완화를 촉진시키는 것으로 보고되었다. IL-4와 많은 특성을 공유하는 다른 사이토킨인 IL-13은 또한 RA 활막에서 IL-1Ra를 유도시킨다. 따라서, IL-4와 IL-13 배합물의 국소 전달은 싱승적인 치료학적 가치를 제공할 수 있다.
IL-10은 연골 파괴를 억제하는 우수한 후보물질임을 나타내는 다수의 특성을 지닌다. 이는 IL-1과 TNF-α 방출 둘다를 억제하고 TIMP-1 생산을 자극하는 반면, MMP-2를 억제한다. RA 활막내 IL-10의 생산은 최근에 보고되었으며 IL-10의 소염 효과가 특성화되었다. IL-10은 활막 조각을 사용한 생체내 RA 모델에서 IL-1β 생산을 억제하지만 IL-4보다는 더욱 적은 정도로 억제한다.
연골 파괴에서 IL-4와 IL-10의 보호 효과는 사이토킨에 대한 비-국소적 전달 방법을 사용한 관절염의 동물 모델에서 밝혀졌다. 랫트의 콜라겐으로 유도된 관절염 모델에서, IL-4와 IL-10의 배합 치료는 관절염을 실질적으로 개선시켰다. 염증의 현미경적 신호의 억제외에, IL-4와 IL-10의 배합 치료는 또한 활막 조직에서 세포내 침윤물을 감소시키고 연골 파괴에 대해 현저히 보호하였다. 더우기, TNF-α 및 IL-1에 대한 mRNA의 수준은 활막 조직 및 관절 연골 둘다에서 크게 억제되었다. 대조적으로 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 수준은 상승된 채로 유지되었는데, 이는 보호 메카니즘이 TNF-α와 IL-1의 억제된 생산 및 IL-1Ra/IL-1 균형의 공동된 상향 조절과 관련될 수 있음을 제시한다. 이들 데이타는 염증 반응과 관절 연골의 파괴에 대한 내인성 억제시 IL-10의 주요 역활과 일치하며, IL-4와 IL-10을 사용한 배합 치료는 강력한 치료학적 가치를 보인다.
대식세포 의존성인 랫트의 연쇄상구균 세포 벽(streptococcal cell wall: SCW) 관절염 모델의 초기 단계에서 관절 염증과 연골 파괴시 내인성 IL-4와 IL-10의 역활 및 이들 사이토킨의 첨가에 대한 치료학적 효과가 또한 시험되었다. 이 시험은, 내인성 IL-10이 SCW 관절염의 조절에 역활함을 입증한다. 내인성 IL-10의 첨가는 또한 내인성 IL-10의 억제 효과를 증대시킨다. IL-4와 IL-10의 배합물과 관련하여 보다 많은 공지 효과가 밝혀졌다. 당해 배합물은 팽윤을 감소시키고 연골세포 프로테오글리칸의 합성을 증가시킨다. IL-4와 IL-10의 배합물을 사용한 치료는 IL-10 단독 치료에서 발생하는 것과 같이, TNF-α의 수준을 실질적으로 감소시키나, 또한 강력한 임상적 잇점의 추가 효과인 활막내 IL-1β 수준을 강력히 감소시킨다. 전체적으로, 당해 데이타는 연골 파괴를 방지하기 위해 관절에 국소 전달된 연골 보호제로서 IL-4 및 IL-10 둘다에 대한 역활과 일치하며 IL-4와 IL-10을 함유하는 배합물이 제제 단독보다 더욱 강력한 치료학적 가치를 제공할 수 있음을 나타낸다.
몇몇의 조합된 면역결핍성(SCID) 마우스를 단핵 세포(MNC) 점증원 및 연골 퇴화에 있어 생체내 사람 류마티스 관절염 활막으로 IL-4 또는 IL-10를 주사한 효과를 평가하는 동물 모델로서 사용한다. 5명의 류마티스 관절염 환자로부터의 사람 류마티스성 활막과 연골을 재조합 사람 IL-4(rhIL-4, 100ng; rhIL-10, 100ng), IL-4와 IL-10의 배합물, TNF-α(1000U) 또는 인산염으로 완충된 염수와 함께 4주 동안 1주에 2회 주사한다. 사람 IL-4와 IL-10의 배합물은 연골 퇴화와 사람 활막 조직에 의한 침입을 억제하며, 이러한 사실은 이들 인터루킨 효능제의 연골보호 효과를 입증한다.
사람 IL-13은 클론되어 서열분석되어 있으며 IL-4의 특성 다수를 공유하는 것으로 밝혀졌다. IL-13은 IL-4와 약 25% 상동성이다. IL-4와 같이, IL-13은 활막액 단핵 세포에 의해 IL-1과 TNF-α를 포함하는 전-염증성 사이토킨의 생산을 감소시킨다. IL-13은 생체내에서 소염 효과를 나타내므로 관절내 연골 퇴화의 치료시 치료학적 효능을 지닌다.
IL-4, IL-10 및 IL-13 효능제와 같은 유용한 화합물은 천연적으로 존재하는 사람 IL-4, IL-10과 IL-13, 사람 재조합 IL-4(rhIL-4), rhIL-10과 rhIL-13 및 이의 일부 서열, 또는 IL-4, IL-10과 IL-13 수용체를 인지하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고 세포 표면에서 이들 수용체를 활성화시킬 수 있는 펩타이드 서열을 포함한다. 이들은 특히 항-Fc 수용체 부위 및 항-IL-4, 항-IL-10와 항-IL-13 수용체 부위(여기서, 하나 이상의 수용체 부위는 재조합 DNA 기술로 제작된다)로 이루어진 다특이적 분자를 포함한다. 인터루킨 효능제를 약리학적 효능제로 정의하는데 있어서, 용어 인터루킨 효능제는 (1) 천연적으로(내인성) 생산된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 상응하는 펩타이드 서열, (2) 동족의 수용체에 결합하는 능력을 보유하고 이의 생물학적 활성과 동족체를 보유하는 전체 길이의 천연적으로 존재하는 인터루킨 아미노산 서열의 절단되거나 일부 서열인 재조합 인터루킨 및 (3) 동족의 수용체에 결합하는 능력을 보유하고 생물학적 활성을 보유하는 IgG 폴리펩타이드의 부위(예: IgG 힌지 및 Fc 영역)에 상응하는 서열에 올리고머(예: 아미노산)를 통해 부착된 전체 길이의 아미노산 서열의 일부에 상응하는 절단되거나 일부 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드인 키메라 인터루킨을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 적합한 인터루킨 효능제의 예는 하기에 나타낸다. 국소 전달의 모든 유형(예: 주사, 주입 및 관주)에 있어, 각각의 적합한 제제의 최적 투여량 및/또는 농도는 치료학적으로 효과적인 양이다. 예로써, 나열된 제제 각각에 대해 나열된 제제를 함유하는 관주 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도를 나타내며, 당해 농도는 치료학적으로 효과적인 것으로 기대된다.
인터루킨 효능제의 치료학적 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
r사람IL-4 0.5-5,000 5-500
r사람IL-10 0.5-5,000 5-500
r사람IL-13 0.5-5,000 5-500
4. 형질전환 성장 인자-β 상위 그룹 효능제
형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상위 그룹 구성원은 다양한 세포 기능에 영향을 줄 수 있는 25kD의 다상유전성인 다작용성 단백질이며 조직 회복 및 재구성에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 많은 경우에, 형질전환 성장 인자-β는 세포외 매트릭스(ECM)와의 세포 상호작용을 증진시키고 ECM 단백질과 프로테아제 억제제의 생산 및 분비를 자극함으로써 ECM의 축적을 증가시킨다. TGF-β는 또한 일반적으로 소염 활성을 나타내는 다른 사이토킨과의 상승적 상호작용을 갖는 것으로 밝혀졌다. 밀접한 아미노산 서열 상동성을 공유하는 TGF-β의 다수의 동형이 확인되어 있다. TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3가 사람 조직에서 발견되었으며 비록 결합 친화성이 상이하다고 해도, 포유 동물 세포에서 활성이다.
TGF-β 부그룹의 구성원은 연골세포 증식, 분화 및 세포외 매트릭스 축적의 강력한 중재자이다. 연골 기관 배양시, TGF-β1은 프로테오글리칸의 물질대사를 조절하고 콜라겐과 글리코사미노글리칸 합성을 토끼 관절 연골세포에 의해 자극시킨다. 또한, TGF-β1은 사람 관절 연골세포에서 TIMP 발현을 증가시키며 관절 연골에서 IL-1 수용체의 발현을 하향조절한다.
골 형태발생 단백질(BMP)은 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 상위그룹에 속하는 세포 성장, 분화 및 세포자살(apoptosis)의 다기능적 조절인자이다. BMP 단백질 그룹의 20가지 이상의 구성원이 포유동물에서 확인되었으며, 이들은 자체 구조에 따라 몇몇 그룹으로 소분류될 수 있다. BMP-2와 BMP-4는 서로 고도로 유사하다. BMP-5, BMP-6, 골형성 단백질(OP)-1(또한 BMP-7로도 명명됨) 및 OP-2/BMP-8은 구조적으로 서로 유사하다. 성장 분화 인자(GDF)-5(또한 연골에서 기원하는 다형성 단백질-1), GDF-6(또한 연골에서 기원하는 다형성 단백질-2) 및 GDF-7은 다른 관련된 그룹을 형성한다. 생체내에서 골과 연골 형성을 유도하는 BMP-2, BMP-4, BMP-6 및 OP-1/BMP-7과는 대조적으로, GDF-5, GDF-6 및 GDF-7은 생체내에서 연골과 건-유사 구조을 더욱 효과적으로 유도한다.
다수의 TGF-β 상위그룹은 2개 유형의 세린/트레오닌 키나제 수용체에 결합함으로써 자체의 효과를 발휘하며, 이들 둘다는 신호 변환에 필수적이다(참조: Massague, 1998). 제II형 수용체는 리간드 결합시 제I형 수용체를 트랜스포스포릴레이트화시키는 구성적으로 활성인 키나제이다. 제I형 수용체는 Smad 단백질과 같은 세포내 기질을 활성화시키며 이러한 메카니즘을 통해 세포내 신호 변환의 특이성이 발생한다. 몇몇 유형의 제I형 수용체가 포유동물에서 분리되었으며, 이들은 기본적으로 액티빈 수용체 유사 키나제(ALK)-1-ALK7로 명명된다. 제IA형 BMP 수용체(BMPRIA 또는 ALK-3)과 제IB형 BMP 수용체(BMPR-IB 또는 ALK-6)은 서로 구조적으로 유사하며 제II형 수용체와 함께 BMP에 특이적으로 결합한다. ALK-2는 액티빈에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, 최근 데이타는 이것이 특정의 BMP, 즉 OP-1/BMP-7에 대한 제I형 수용체임을 나타내고 있다(참조: Macias-Silva et al., 1998). ALK-1은 ALK-2와 구조적으로 유사하나, 이의 생리학적 리간드는 아직 알려져 있지 않다. ALK-5와 ALK-4는 각각 TGF-β(TβR-I) 및 액티빈(ActR-IB)에 대한 제I형 수용체이다. ALK-7은 ALK-4 및 ALK-5와 구조적으로 유사하나, 이의 리간드는 아직 측정되지 않았다.
본 발명의 연골 보호 용액에 사용하기에 적합한 천연적으로 존재하는 TGF-β와 BMP 효능제 및 합성 또는 사람 재조합(rh) 효능제는 상술한 BMP 수용체의 어느것과 상호작용할 수 있다. 본원에 사용된 것으로써, 용어 "TGF-β 및 BMP 효능제"는 천연적으로 발생하는 사람 TGF-β 및 BMP 효능제 리간드의 생물학적 특성을 보유하는 단편(fragments), 결실부, 첨가부, 아미노산 치환부, 돌연변이 및 이의 변이체를 포함한다. TGF-β 또는 BMP 효능제는 단독으로, 또는 동화작용 연골 제제(연골생성제 또는 연골 매트릭스 회복 촉진제)로서의 TGF-β 상위그룹의 다른 구성원과의 상승 배합물로서 또는 연골 이화작용을 차단하는 억제제와의 배합물로서 사용될 수 있다.
제I형 수용체는 제II형 수용체의 하부 성분으로서 작용한다. 제I형 수용체에 의한 세포내 신호의 특이성은 L45 루프라고 명명되는 세린/트레오닌 키아제 영역내 특정 영역에 의해 측정된다. 즉, BMPR-IA/ALK-3 및 BMPR-IB/ALK-6(BMPR-I 그룹)의 L45 루프의 구조는 각각 서로 동일하며, 이들은 세포내에서 유사 신호를 변환시킬 수 잇다. 유사하게, TβR-I/ALK-5, ActR-IB/ALK-4 및 ALK-7(TβR-I 그룹)의 L45 루프는 각각 서로 동일하며, 이들은 유사한 기질을 활성화시킨다(참조: Chen et al. 1998). ALK-1과 ALK-2(ALK-1 그룹)의 L45 루프는 다른 제I형 수용체로부터 가장 발산성(divergent)이나, 이들은 BMPR-I 그룹의 제I형 수용체의 기질과 유사한 기질을 활성화시킨다(참조; Armes et al., 1999).
각종 단백질이 TGF-β 및 BMP 세린/트레오닌 키나제 수용체로부터의 신호를 변환시킬 수 있다. 이들중에서, 가장 잘 연구된 분자는 Smad 그룹의 분자이다. 8개의 상이한 Smad 단백질이 포유동물에서 확인되었으며, 이들 단백질은 3개의 아그룹, 즉, 수용체-조절된 Smad(R-Smad), 일반적인 파트너 Smad(Co-Smad) 및 억제성 Smad로 분류된다. R-Smad는 제I형 수용체에 의해 Co-Smad와의 착물로부터 직접 활성화되어 핵내로 이전된다. Smad 이량체는 다른 DNA-결합 단백질을 통해 DNA에 직접 및 간접적으로 결합함으로써 표적 유전자의 전사를 조절한다. Smad1, Smad5 및 Smad8은 BMP에 의해 활성화되는 반면, Smad2와 Smad3은 TGF-β에 의해 활성화된다. 예를 들어, Co-Smad로서 작용하는 Smad4와 배합된 Smad2는 핵내로 이전되어 TGF의 생물학적 효과를 중재하는 유전자의 전사를 활성화시킨다. Smad6 및 Smad7은 다른 Smad와 구조적으로 밀접하게 관련되어 있으며 억제성 Smad로 작용한다. BMP는 실험관내 및 생체내에서 새로운 연골 형성과 골 형성을 유도하며 연골세포 성장 및 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 더우기, 이들 단백질은 또한 연골 회복 과정에 관여한다. 각종 연구는 BMP가 또한 연골생성 현상을 촉진하고 유지시키며 이는 닭 지아 세포(chick limb bud cell) 배양물과 태아 랫트 연골세포, 및 토끼와 소 관절 연골세포에서 프로테오글리칸 합성을 자극하는 능력에 의해 제시된다. 연골 및 골 형성에 대한 BMP의 중요성은 특정 BMP 유전자 녹아웃이 연구되어 있는 트랜스겐 시도(transgenic approach)에 의해 입증되었다.
BMP 그룹의 한 구성원인 골생성 단백질(OP-1 또는 BMP-7)은 연골 회복동안과 같은 병리학적 상태 및 정상 상태하에서 연골 항상성에 특히 중요한 것으로 여겨진다. OP-1은 연골에서 기원한 형태발생 단백질과 함께 성인의 관절 연골세포에 의해 발현되는 BMP 그룹의 유일한 구성원인 것으로 여겨진다[참조: Chubinskaya, S., J. Histochemistry and Cytochemistry 48: 239-50 (2000)]. OP-1은 근본적으로 골 매트릭스로부터 정제되며 연골 및 골 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 사람 OP-1 유전자는 클론되어 있으며 생물학적으로 활성인 재조합 OP-1 동종이량체가 생산되고 있다. 사람 재조합 OP-1은 실험관내에서 사람 관절 연골세포에 의해 아그레칸과 제II형 콜라겐의 합성을 자극한다. 이것은 또한 이들 연골세포의 물질대사에 있어 IL-1의 유해 효과에 역으로 작용하고 피브로넥틴 단편에 의해 중재된 소 연골 손상을 차단한다. 이러한 효과는 인터루킨-1β의 존재하에 배양된 사람 관절 연골세포에 의한 프로테오글리칸, 프로스타글란딘 E2 및 IL-1 수용체 길항제의 생산시 재조합 사람 OP-1의 효과를 연구함으로써 입증되었다. OP-1을 사용한 사람 관절 연골세포의 치료는 저 투여량의 IL-1β에 의해 유도된 프로테오글리칸 합성의 하향조절을 극복하는데 효과적이다. 또한, 연구는 OP-1이 하이알루로난, CD44 및 사람 연골세포에 의한 매트릭스 구성에 요구되는 기타 분자의 합성을 자극함을 밝혔다. 사람 성인 연골에서 OP-1에 대한 발현 및 조절의 이러한 연구들은 연골 보호 및 회복에서 OP-1에 대한 역활을 제시하고 OP-1이 연골 동화작용 및 사람 관절 연골의 회복을 촉진하는 치료제로서 사용될 수 있음을 제시하고 있다.
OP-1(BMP-7)은 생체내에서 골격내 및 골격외에 이식되는 경우 연골 및 골 형성을 유도한다. 관절 연골의 깊은 손상의 치유시 OP-1의 영향은 토끼 무릎 관절의 관절 연골을 통해 2개의 인접한 구멍을 뚫어 시험하였다. OP-1은 관절 연골 치유 및 성숙한 관절 연골세포와 유사한 세포를 포함하는 관절 표면의 재생을 유도하였다.
상기 데이타는 외과적 외상후 사람에 있어 연골 퇴화를 방지하고 관절 연골의 생물학적 항상성을 유지하기 위해 본 발명을 실시하는데 유용한 용액의 한가지 바람직한 양태가 TGF-β 상위그룹의 구성원, 바람직하게는 TGF-β2, BMP-7(OP-1) 또는 BMP-2, 또는 이들 리간드에 의해 사용된 동일한 수용체를 통해 작용하는 동등한 효능제의 국소 적용을 포함할 수 있음을 제시한다. 국소 전달은 연골 이화 과정의 억제제(예: MAP 키나제 억제제, MMP 억제제 또는 산화질소 신타제 억제제) 및/또는 동통과 염증 억제용 기타 제제인 약물(들)과 배합되어 일어날 수 있다.
약리학적 효능제로서 TGF-β 및 BMP 효능제를 정의하는데 있어서, 용어 TGF-β 및 BMP 효능제는 (1) 천연적으로(내인성) 생산된 아미노산 서열에 상응하는 펩타이드 서열 또는 이의 단편; (2) 이들 각각의 수용체에 결합하는 능력을 보유하고 이의 생물학적 활성과 동족체를 보유하는 전체 길이의 천연적으로 존재하는 TGF-β와 BMP 아미노산 서열의 절단된 서열 또는 부분 서열인 재조합 TGF-β 및 BMP 및 (3) 동족의 수용체에 결합하는 능력을 보유하고 생물학적 활성을 보유하는 IgG 폴리펩타이드의 일부(예: IgG 힌지 및 Fc 영역)에 상응하는 서열에 대한 올리고머(예: 아미노산)를 통해 부착된 전체 길이의 아미노산 서열의 일부에 상응하는 절단된 서열 또는 부분 서열로 구성된 재조합 폴리펩타이드인 키메라 TGF-β 및 BMP를 포함하며, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 적합한 TGF-β 및 BMP 효능제의 예를 하기에 나타낸다. 모든 유형의 국소 전달(예: 주사, 주입 및 관주)의 경우, 각각의 적합한 제제의 최적 투여량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 양이다. 예로써, 나열된 제제 각각의 경우, 나열된 제제를 함유하는 관주 용액의 바람직한 용액 및 가장 바람직한 농도가 제공되며, 당해 농도는 치료학적으로 유효한 것으로 여겨진다.
외과 용액으로 관절에 전달하기 위한 치료학적 농도의 범위는 동족의 수용체에 대한 각각의 리간드의 해리 상수(Kd)의 값으로부터 추정될 수 있다. 이들 값은 특정 세포 유형 및 조직에 따라 변할 수 있으며, 다음 예는 BMP-4에 대한 것이다. 125I-BMP-4를 사용한 결합 실험은 세포당 명확한 해리상수가 110pM이고 수용체가 약 6000개인 특이적인 고 친화성 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 11nM BMP-4에서, 리간드의 결합은 최대로 되며 유용한 수용체가 완전히 점유(포화)될 것이다. 주요 관절 연골세포에서 BMP-4에 대한 작용성 수용체의 존재는 입증되어 있다.
TGF-β 및 BMP-수용체 효능제의 치료학적 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(나노몰) 가장 바람직한 농도(나노몰)
TGF-βl 0.05-500 0.5-100
TGF-β2 0.05-500 0.5-100
BMP-2 0.1-2000 1-200
BMP-4 0.1-2000 1-200
BMP-7(OP-1) 0.1-2000 1-200
5. 사이클로옥시게나제 -2 ( Cox -2) 억제제
비스테로이드성 소염 약물(NSAID)이 소염제로서 광범위하게 사용되고 있지만, 연골보호제로서 구체적으로 개발되거나 치료학적으로 사용되는 않았다. NSAID 약물에 대한 직접적인 분자 표적은 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 신타제 또는 지방산 사이클로옥시게나제로서 언급되는, 프로스타글란딘 합성 경로에서의 제1 효소이다. 사이클로옥시게나제-1 또는 제1형(COX-1) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)로 언급되는 사이클로옥시게나제의 2개의 관련 형태가 특징화되어 있다. 이들 아이소자임은 프로스타글란딘 G/H 신타제(PGHS)-1 및 PGHS-2로서도 공지되어 있다. 두가지 효소는 아라키돈산의 프로스타글란딘 H2로의 전환인 프로스타노이드의 형성에서 율속 단계를 촉진시킨다. COX-1은 혈소판과 내피 세포에 존재하며, 구성적인 활성을 나타낸다. 이와 대조적으로, COX-2는 관절 의 내피 세포, 대식 세포, 섬유아세포 및 기타 세포에서 확인되며 이의 발현은 전-염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-1 및 TNF-α에 의해 유도된다.
염증이 있는 관절 내에서, COX-2 발현은 상향조절되고 COX-2의 활성의 큰 증가가 이의 상향조절과 동반해서 발생하여 염증성 관절병증으로 고통받는 환자의 활막 액에 존재하는 프로스타글란딘의 합성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 관절 내의 프로스타글란딘(PG)의 세포 공급원은 활성화 연골세포, 제A형 및 제B형 활막 세포 및 침투 대식 세포를 포함한다. PG에 의해 조절된 연골 대사에서 중요한 세포 기능은 유전자 발현, 세포외 매트릭스 합성 및 증식을 포함한다. COX-2가 염증 관절 조직에서 발현되거나 염증의 중재자에 노출된 후(즉, 부상 또는 외과적 외상의 결과)에 발현되기 때문에, COX-2 억제제의 사용은 소염 및 연골 보호 활성 둘 다를 제공하는 것으로 기대된다.
염증성 관절병증에서의 연골 파괴는 관절 부상의 결과 및 관절경 외과 수술의 결과로서 개시될 수 있다. 연골세포는 관절 연골에서 유일한 세포 형태이고 PG를 포함하는 내인성 염증 중재자의 방출을 통해 이들 자신의 매트릭스를 파괴시키는데 관여하는 것으로 공지되어 있다. 연구 결과, 정상 사람 관절 연골 세포중에서의 COX-2 유전자 발현, 단백질 합성 및 PG 방출은 IL-1, TNF-α 및 IL-6을 포함한 사이토킨에 의해 신속하게 유도되는 것으로 밝혀졌다. mRNA의 수준은 사이토킨 유도 후 2시간 정도로 빠르게 검출되며 6시간에서 고 수준에 도달하고 72시간 이상 동안의 현저하게 장기간 동안 지속되는 것으로 나타났다. 유사하게, 사람 활막 세포의 IL-1α 및 TNF-α 활성화의 세포 배양 연구 결과, COX-2의 발현의 큰 증가 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 생성이 크게 증가하는 것으로 밝혀졌다. 케토프로펜과 같은 각종 NSAID를 사용한 처리는 유도된 PGE2 반응을 제거시킨다. 연골 세포 배양 시스템에서, 특이적 COX-2 억제제 화합물 NS-398은 사이토킨에 의해 유도된 PGE2 생성의 증가를 방지하지만, COX-1 수준은 안정하게 잔류한다[참조: Morisset, S., 1998, J. Rheumatol. 25: 1146-53]. 따라서, COX-2의 발현과 관련되는 활성화 연골 세포에 의한 PG 생성의 차단은 연골 보호 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
NSAID는 골관절염 또는 류마티스 관절염이 있는 환자의 치료에 일반적으로 사용되지만, 이러한 연골 질환의 맥락에서 연골 대사에 대한 이들의 효과는 논쟁의 대상이 되고 있다. 예를 들면, 골관절염 및 류마티스 관절염의 임상적 치료는 염증을 감소시키는데 성공적이다. 그러나, COX-2에 대하여 선택성이 아닌 일부 NSAID, 주로 살리실레이트 및 인도메타신은 연골 세포에 의한 프로테오글리칸 합성을 손상시킴으로써 골관절 연골 파괴를 촉진시키는 반면, 기타 NSAID는 연골 손상을 자극함으로써 어느정도 연골 보호 효과를 지니는 것으로 고려된다. 대부분의 연구 결과는 NSAID가 연골에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 외상성 관절 손상 및 외과적 외상에 따른 활막염 및 연골 파괴의 치료시 이러한 종류의 약물 사용의 현재의 결핍으로 인하여, 연골 파괴에 기여하는 병생리학적 메카니즘에 대한 각각의 NSAID의 독특한 특성을 설정할 필요가 있게 될 것이다.
2개의 COX 아이소자임(isozymes)은 약리학적으로 구별되기 때문에, 소염 치료에 유용한 아이소자임 특이적(선택적) 사이클로옥시게나제 억제제를 개발하였고 이러한 동일한 COX-2 중의 일부는 관절 염증 모델에서 시험되었다. 그러나, IL-1, IL-6, IL-8 및 프로스타노이드의 연골 생성 뿐만 아니라 연골 프로테오글리칸의 합성 및 분해에 대한 COX-2 억제제의 시험관내에서의 영향은, 특정한 NSAID가 인터루킨 및 에이코소노이드의 연골 및 활막 생성에 대한 생체내에서의 이들의 영향에서 상당히 변하여, 이들 인자의 통합된 영향이 연골 일체성에 대한 COX-2 억제제의 결과에 영향을 미치게 할 수 있다. 예를 들면, 일부 NSAID는 전-염증성 사이토킨의 생성을 증진시키거나 연골 프로테오글리칸 합성을 억제시킴으로써 골관절염에서의 관절 손상을 촉진시킬 수 있다. 그러나, COX-2 특이적 억제제 중에서 임상적 효과의 가능한 변이에도 불구하고, COX-2는 전형적으로 활막염을 감소시키며 연골 손상의 위험을 저하시킨다.
COX-1 및 COX-2에 동형에 대한 억제제의 상대적 선택성을 평가하기 위해 각종 생화학적 및 세포 및 동물 분석이 개발되어 왔다. 일반적으로, 선택성을 정의하는 기준은 소정의 생화학적 또는 세포적 평가 시스템에 대하여 수득된 COX-1/COX-2 억제 상수의 비(또는 COX-2/COX-1)이다. 선택성 비는 미소체 분석 시스템과 세포 분석 시스템[예: 재조합 사람 COX 아이소자임을 안정적으로 발현하는 혈소판 및 대식구 세포주] 사이에서 수득한 효소 활성 억제에 대한 상이한 절대 IC50 값에 대한 것이다. 또한, COX-2의 억제는 세포내 COX-2 합성을 하향 조절하는 IL-4와 같은 연골보호(억제) 사이토킨에 의해 억제되는 억제 효과를 최소화한다. 45NSAID 및 선택성 COX-2 억제제[1997, CAN. J.Physiol. Pharamacol. 75:1088-95]의 선택성을 비교하면, COX-2 : COX-1이 다음과 같은 등급 순서의 상대 선택성을 나타내었고, IC50 값은 7nM 내지 17μM의 범위이었다: DuP 697> SC-58451=셀레콕시브>니메설라이드=멜로시캄=피록시캄=NS-398=RS-57067>SC-57666>SC-58125>프로설라이드>에토돌락>L-745,337>DFU-T-614.
동물 연구로부터 뿐만 아니라, 셀레콕시브 및 로테콕시브와 같은 선택적 COX-2 억제제에 대하여 전의된 작용의 분자 및 세포 메카니즘으로부터, 이들 화합물은 관절에 직접 주사하거나 관주 용액으로 우선적으로 적용하는 경위 연골보호작용을 나타내는 것으로 기대된다. 특히, COX-2 억제제는 관절에 대한 외과 수술 또는 기타 부상 전, 동안 또는 후에 관절 속에 직접 주사하거나 관절경 외과 수술동안에 관주 용액으로 전달된 유효한 약물인 것으로 기대된다.
본 발명에 적합한 COX-2 억제제의 예는 다음에 나타낸 바와 같다. 국소 전달(즉, 주사, 주입 및 관주)의 모든 양태에서, 각각의 제제의 최적 용량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 것이다. 예로써, 열거된 제제 각각에 있어서, 열거된 제제를 함유하는 관주 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도는 치료학적으로 유효하리라 기대되는 농도로 제공한다.
사이클로옥시게나제-2 억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
화합물 치료학적으로 바람직한 농도(nM) 가장 바람직한 농도(nM)
로페콕시브(MK 966) 0.3-30,000 30-3,000
SC-58451 0.3-30,000 30-3,000
셀레콕시브(SC-58125) 0.3-30,000 30-3,000
멜록시캄 0.5-50,000 50-5,000
니메술라이드 0.5-50,000 50-5,000
디클로페낙 0.3-30,000 30-3,000
NS-398 0.3-30,000 30-3,000
L-745,337 0.2-100,000 20-10,000
RS57067 0.2-100,000 20-10,000
SC-57666 0.2-100,000 20-10,000
플로술라이드 0.2-100,000 20-10,000
6. MAP 키나제 억제제
유사분열물질 활성화 단백질(MAP) 키나제는 세포 표면으로부터 세포 핵으로의 신호를 전달하는 각종의 세포외 자극 및 기능에 응답하여 활성화되는 단백질 세린/트로오닌 키나제의 그룹이다. MAP 키나제 캐스케이드는 신호를 성장 인자, 호르몬 및 염증성 사이토킨으로부터 중간 조기 유전자로 전달하는 주 세포간 시그날 전달 경로중의 하나이다. 기타 시그날 전달 경로와 조합하여, 이들 활성화 유사분열물질 활성화 단백질-키나제(MAPK)는 전사 인자의 포스포릴화 상태와 활성을 차별적으로 변경시키고, 궁국적으로는 세포 증식, 분화 및 환경 스트레스에 대한 세포 반응을 조절한다. 예를 들면, MAPK 류(p38)의 구성원은 잠재적 전-염증성 사이토킨 IL-1 및 TNF-α로부터의 생화학적 신호 전달 경로를 중재시켜, COX-2 유전자의 전사 조절에 포함된 시스-작용 인자를 통해, 자극화된 대식 세포에서 사이이클로옥시게나제-2(COX-2)를 유도시킨다.
제제의 MAP 키나제류의 구성원은 서열, 활성화 루프의 크기, 세포외 자극에 의한 활성화 및 분명한 신호 전사의 참여가 상이한 것으로 공지되어 있는 적어도 3개 이상의 류로 이루어진다. MAP 키나제의 당해 류 중에서 우세한 구성원은 세포외 신호 조절된 키나제 (ERKs), ERK1 및 ERK2 (각각 p44MAPK 및 p42MAPK)를 포함하며, JNK로서도 언급되는 응력 활성화 단백질 키나제 1(SAPK1) 류 또는 jun N-말단 키나제 류; 및 응력 활성화 키나제 2/3(SAPK-2/3)으로도 공지된 p38 MAP 키나제 류를 포함한다. p38 키나제는 응력에 의해 활성화되며, 전-염증성 사이토킨이 가장 주목할만하다. p38 류내에는, 각각 SAPK2a, SAPK2b, SAPK2d, SAPK3, 또는 p38 α, β,δ (SAPK4) 및 γ 중의 하나인 표준 명명법으로 언급되는, 4개 이상의 분명한 동족체(동형 또는 동효소)가 존재한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 MAP 키나제 억제제는 상기한 MAP 키나제 중의 어느 하나 또는 이들의 조합과 상호작용할 수 있다. 특이적 MAP 키나제 억제제에 있어서, 정제된 시험관내 효소 분석 및 세포 분석을 통해 특성화한 억제성 상수는 광범위한 농도에 걸쳐 변할 수 있으며 본원에서 유용성을 입증한다. p38 MAP 키나제의 활성화는 트레오닌 및 타이로신 잔기의 이중 포스포릴화에 의해 중재된다. 세포의 TNF-a 및 IL-1 치료 둘 다는 포스포릴화를 신속히(5분내) 증가시키고 p38 MAP 키나제를 활성화시킨다.
앞선 작업은 소분자 억제제가 p38 MAP 키나제[참조: Lee, J. et al., Nature 372: 739-746 (1994)]를 구체적으로 억제시키고 생화학 수준에서 및 각종 동물 모델에서 소염 효과를 생성시킬 수 있는 것을 입증하였다. 쿠엔다 및 공동 연구자[참조: Cuenda, A. et al., FEBS Lett. 364: 229 (1995)]는 화합물 SB203580 [4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸솔피닐페닐)-5-(4-피리딜)이미다졸]이 시험관내(IC50 = 0.6μM) p38을 억제하고, MAPK 활성화 단백질 키나제-2의 활성화를 억제하며 생체내 IL-1 및 세포 스트레스에 반응하여 열 충격 단백질(hsp) 27의 포스포릴화를 방지한다. p38에 대한 SB 203580 [4-(4-플루오로펜닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-5-(4-피리딜)이미다졸]은 시험관내(IC50 = 0.6μM) p38을 억제하고, MAPK 활성화 단백질 키나제-2의 활성화를 억제하며 IL-1에 반응하여 열 충격 단백질(hsp) 27의 포스포릴화를 방지하는 것을 밝혀내었다. p38에 대한 SB 203580 억제 작용의 키나제 선택성은 PKC, PKA, src 및 수용체 티롭신 키나제 류[참조:(Lee, J, Pharmacol. Ther. 82: 389-397 (1999))]의 구성원을 포함하여, 시험관내의 15개 이상의 기타 단백질 키나제의 실패 또는 기껏해야 약한 억제에 의해 입증된다. 세포 연구에서, SB 203580를 사용한 예비 배양은 효소의 IL-1 및 TNF-a 유도된 포스포릴화 및 후속적인 IL-8 생산을 차단한다. 이는 수술 과정 동안 억제제를 운반하는 선제 효과를 지지한다.
연골을 파괴시키는 생화학적 소염 반응에서의 p38 유사분열물질 활성화 단백질 키나제(MAPK)의 역할은 SB203580를 이용하여 연구하였으며, 이는 효소를 구체적으로 억제한다. p38 MAPK에 의해 선택적으로 조절되는 IL-1의 작용은 프로스타글란딘 H 신타제-2(COX-2), 메탈로프로테이나제 및 IL-6의 조절이다[참조: Ridley, S et al., 1997, J. Immunol. 158: 3165-73]. 사람 섬유아세포 및 내피 세포에서, SB 203580은 기타 공지된 IL-1-활성화 단백질 키나제 경로(p42/p44 MAPK, p54 MAPK/c-Jun N-말단 키나제)에 영향을 미치지 않고 섬유아세포에서 hsp 27(p38 MAPK 활성의 지시제)은 (IC50 = 0.5μM) IL 1-유도된 포스포릴화를 억제한다. 또한, SB 203580은 IL-1-자극 IL-6(1μM에서 30 내지 50%)을 상당히 억제하지만 사람 섬유아세포 및 내피 세포로부터 IL-8을 억제하지는 못한다.
중요하게는, SB 203580은 섬유아세포 및 사람 내피세포에 의한 IL-1-자극 프로스타글란딘을 억제한다. 이는 COX-2 단백질 및 mRNA의 유도의 억제와 관련이 있으며, PGE2는 연골 퇴화의 중요한 중재자인 매트릭스 메탈로프로테이나제의 발현을 증가시킨다. 연골 섬유아세포 및 연골세포는 사이토킨 및 세포외 자극에 의해 활성화되는 경우 COX-2 유전자를 고수준으로 발현시킨다. MAPK 억제제는 이러한 세포 형태 및 기타 세포 형태에서 발현된 MAP 키나제에서의 억제 활성으로 인하여 세포 보호 활성을 제공한다.
MAPK 억제제는 각종 염증 또는 병리생리학적 조건에서 관절의 조직에 국소 전달되는 경우 연골 보호제로서 효과적인 것으로 기대된다. SB 203580은 생체내에서 수개의 약리학적 모델에서 특성화되고 장기간 동안의 경구 투여하에 활성을 갖는 것으로 입증되었다. SB 203580은 TIMP-1의 합성에 영향을 미치지 않고 IL-1에 의한 콜라게나제-1 및 스트로멜라이신-1 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, SB 203580은 IL-1-자극 콜라게나제-1 및 스트로멜라이신-1 mRNA에서의 증가를 방지한다. 연골 파괴의 모델에서, 단기간 IL-1-자극 프로테오글리칸 재흡수 및 프로테오글리칸 합성의 억제는 SB 203580에 의해 영향을 받지는 않지만, 장기간 콜라겐 파괴는 방지된다. 또한, SB 203580은 송아지 연골 체외 이식조직 및 연골 세포(Badger 1998)에서 IL-1-유도된 산화질소 생성을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 시험관내 관찰은 괄절에서 이러한 조직에 직접 및 국소 투여된, MAP 키나제 억제제의 연골 보호 활성에 대한 토대를 제공한다.
p38 MAP 키나제는 TNF-유도된 사이토키닌 발현에 포함되며 p38 MAP 키나제 활성의 억제제로서 작용하는 약물은 전-염증성 사이토킨의 생성을 차단한다[참조: Beyaert, R. et al., EMBO J. 15: 1914-23 (1996)]. 세포의 TNF-a 처리는 p38 MAPK 자체 및 이의 기질 단백질의 증가된 포스포릴화에 의해 나타낸 바와 같은 p38 MAPK 경로를 활성화한다. SB 203580을 사용한 세포의 예비처리는 MAPK 활성화 단백질 키나제-2 및 hsp 포스포릴화의 TNF-α 유도된 활성화를 완전히 차단한다. 동일한 조건하에, SB 203580은 또한 IL-6의 TNF-α 유도된 합성 및 2개의 NF-6B 원소를 함유하는 최소 촉진제에 의해 구동되는 리포터 유전자의 발현을 완전히 억제한다. 따라서, 기타 p38 억제제에 대한 이러한 연구 및 관련 연구는 연골 퇴화에 연결된 각종 단백질의 TNF-α- 및 IL-1-유도된 활성화와 함께 선택적으로 간섭하는 p38 MAPK에 대한 SB 203580 및 FR 133605와 같은 억제제의 작용을 나타낸다. 따라서, 수용체의 키나제 하부 억제에 의한 이러한 주 전-염증성 사이토킨의 MAP 키나제 시그날 전달 경로의 선택적 억제는 MAP 키나제 억제제가 연골 보호 효과를 제공할 수 있음을 나타낸다.
SB 203580은 사이토킨 억제 및 염증성 질병의 수개의 동물 모델에서 평가하였다. 이는 IC50 값 15 내지 25 mg/kg에서 마우스와 랫트 둘다에서 생체내 염증성 사이토킨 생산의 강력한 억제제인 것으로 입증되었다. SB 203580은 50mg/kg의 용량을 사용하여 DBA/LACJ 마우스에서 콜라겐 유도된 관절염에서 치료학적 활성을 지녀서 발 염증을 상당히 억제시키는 것으로 입증되었다. 또한, SB 203580을 30 및 60mg/kg/day에서 경구 투여하는 경우 루이스 랫트(Lewis rat)에서 보조제 유도된 관절염에서 항관절염적 활성이 관찰된다. 0.6μM의 IC50을 사용한 골 재흡수에 대한 유리한 영향에 대한 추가의 증거가 수득되었다.
요약하면, 각종의 생화학적, 세포 및 동물 연구 결과, p38 MAPK는 IL-1 및 TNF-α에 대한 반응의 조절에 있어서 중요한 역할을 담당하고 COX-2와 같은 일부 염증-응답 유전자의 mRNA 수준의 조절에 포함된다는 것이 밝혀졌다.
IL-1 및 TNF-α와 같은 주요한 전-염증성 사이토킨의 작용을 차단하는 MAPK 억제제의 사용은 연골 섬유아세포, 대식 세포 및 연골 세포를 포함한 관절에서 다수의 세포 형태에 유리한 효과를 지니게 되어 염증 세포의 관절, 연골 과형성, 연골 세포 활성화 및 연골 파괴와 같은 후속적인 병원성 효과를 억제한다. 따라서, MAPK 억제제는 위에서 언급한 사이토킨에 의한 염증 반응의 진행을 차단함으로써 질병 진행을 차단한다.
본 발명에 유용한 MAPK 억제제의 예는 하기한 바와 같다. 국소 전달(즉, 주사, 주입 및 관주)의 모든 모델에서, 각각의 적합한 제제의 최적 용량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 것이다. 예로서, 기록된 제제 각각에 있어서, 기록된 제제를 함유하는 세척 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도가 제공되며, 이러한 농도는 치료학적으로 유효한 것으로 기대된다.
MAP 키나제 억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
SB 203580 0.5-50,000 50-5,000
SB 203580요오도 0.5-50,000 50,5,000
SB 202190 0.2-20,000 20-2,000
SB 242235 0.2-10,000 20-1,000
SB 220025 0.2-10,000 20-1,000
RWJ 67657 0.3-30,000 30-3,000
RWJ 68354 0.9-90,000 90-9,000
FR 133605 1-100,000 10-10,000
L-167307 0.5-50,000 50-5,000
PD 98059 0.1-10,000 10-1,000
PD 169316 1-100,000 10-10,000
7. 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제
관절 연골의 파괴는 골관절염 및 류마티스 관절염과 같은 관절 질환에서 일반적인 특징이지만, 관절에 대한 후속 손상이 발생한다. 병리생리학적으로, 프로테오글리칸 및 콜라겐의 구조적 파괴가 관찰되며, 이는 연골의 생역학적 특성을 손상시킨다. 정상적인 건강한 세포외 매트릭스의 유지는 매트릭스 성분의 생합성과 혼입 사이의 균형을 반영하며, 이의 분해율과 연골로부터 활막액으로의 후속적인 손실률 사이의 균형을 반영한다. 각종 프로테제가 연골을 절단하는데 잠재성을 지니며 분해 공정에 포함되며, 가장 주목할만한 것은 매트릭스 메탈로프로테이나제이다.
매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 또는 매트릭신은 세포외적으로 작용하고 조직의 병리학적 퇴화에서 중요한 역할을 담당하는 15개 이상의 아연 엔도펩티다제의 류이다. MMP의 구성원에 대한 현재의 명명법 및 또다른 명칭은 표 23에 나타내었다. 대부분의 MMP는 고도로 조절되며 대부분은 정상 조직에서 구성적으로 발현되지 않는다. 그러나, IL-1 및 TNF-α와 같은 전-염증성 사이토킨은 전사와 발현을 개시한다. 조직 퇴화성 MMP의 상향 조절 및 활성화에 의해 생성된 불균형은 만성 염증 질환 동안의 연골 파괴 과정에서의 주요한 인자이며 관절 부상에 후속적인 활막 염증 반응을 지속시킨다. 연골 매트릭스 대사를 무릅의 반월관절 부상 또는 앞십자인대 파괴가 있는 환자에게서 연구하였다. 스트로멜라이신-1(MMP-3), 콜라게나제, 메탈로프로테이나제(TIMP-1)의 조직 억제제, 및 외상성 무릎 부상후의 사람 무릎 부상 후의 사람 무릎 활막액에서 증가된 프로테오글리칸 단편의 농도가 밝혀졌다.
매트릭스 메탈로프로테이나제
MMP 다른 명칭 EC 번호 기질
MMP-1 콜라게나제 섬유아세포 콜라게나제 간극 콜라게나제 EC3.4.24.7 콜라겐(I, II, VII 및 X); 겔라틴; 아그렉칸; 하이알루로니다제 처리된 베르시칸; 프로테오글리칸 링크 단백질; 대형 테나신-C; α1-안티트립신/α1-프로테이나제 억제제(α1-AT);α1안티키모트립신(α1-ACHYM);α2M;랫트 α1M; 임신 영역 단백질; 랫트 α1I3(α1-억제제 3); 오보스타틴; 엔탁틴; MBP;GST-TNF/TNF 펩타이드;L-선택; IL-1β; 혈청 아밀로이드 A; IGF-BP5; IGF-BP3; MMP-2; MMP-13
MMP-2 72-kDa 겔라티나제 EC.3.4.24.24 겔라티나제 제A형 제IV형 콜라게나제 호중구 겔라티나제 EC3.4.24.24 콜라겐(I, IV, VI, X, XI 및 XIV); 젤라틴; 엘라스틴; 피브로넥틴; 라미닌-1, 라미닌-5; 젤락틴-3; 아그렉칸; 데코린; 하이알루로니다제 처리된 베르시칸; 프로테오글리칸 링크 단백질; 오스테오넥틴; MBP; GST-TNF/TNF 펩티드; IL-1β; Aβ1-40;Aβ10-20; APP695;α1-AT; 프롤리실 옥시다제 융합 단백질; IGF-BP5; IGF-BP3; FGF R1; MMP-1; MMP-9; MMP-13
MMP-3 스트로멜라이신-1 트란신 EC3.4.24.17 콜라겐(III, IV, V, IX); 겔라틴; 아그렉칸; 베르시칸 및 하이알루로니다제 처리된 베르시칸; 페를렉칸; 데코린; 프로테오글리칸 링크 단백질; 대형 테나스신-C; 피브로넥틴; 라미닌;엔탁틴; 오스테오넥티온; 엘라스틴; 카제인; α1-ACHYM; 안티트롬빈-III; αM;오보스타인; 물질 P;MBP; GST-TNF/TNF펩티드; IL-1β; 혈청 아밀로이드 A;IGF-BP3; 피브리노겐 및 가교결합된 피브린; 플라스미노겐; MMP-1 "초활성화", MMP-2/TIMP-2 착체; MMP-7;MMP-8; MMP-9,; MMP-13
MMP-7 마트릴리신 PUMP EC3.4.24.23 콜라겐 IV 및 X; 겔라틴; 아그레칸; 데코린; 프로테오글리칸 링크 단백질; 피브로넥틴 및 라미닌; 불용성 피브로넥틴 피브릴; 에낙틴; 대형 및 소형 테나스신-C; 오스테오넥틴; β4인테그린; 엘라스틴; 카제인; 트랜스페린; MBP; α1-AT; GST-TNF/TNF펩티드; 플라스미노겐; MMP-1; MMP-2; MMP-9; MMP-9/MMP-1
MMP-8 호중구 콜라게나제 콜라게나제 I EC3.4.24.34 콜라겐(I, II, III, V, VII 및 X); 겔라틴; 아그레칸; α1-AT; α1-ACHYM; α2-아미노플라스민; 피브로넥틴
MMP-9 9kDa 겔라티나제 겔라티나제 B EC3.4.24.35 콜라겐(IV, V, VII, X 및 XIV); 겔라틴; 엘라스틴; 갈렉틴-3; 아그렉칸; 하이알루론디제 처리된 베르시칸; 프로테오글리칸 링크 단백질; 피브로넥틴; 엔탁틴; 오스테오넥틴; α1-AT; MBP; GST-TNF/TNF 펩타이드; IL-1β; Aβ1-40; 플라스미노겐
MMP-10 스트로멜라이신-2 EC3.4.24.22 콜라겐(III, IV 및 V); 겔라틴; 카제인; 아그렉칸; 엘라스틴; 프로테오글리칸 링크 단백질; MMP-1; MMP-8
MMP-11 스트로멜라이신-3 사람 효소; α1-AT;α2M;카베인, 라미닌, 피르로넥틴, 겔라틴, 콜라겐 IV 및 카복시메틸화 트랜스페린
MMP-12 대식구 메탈로엘라스타제 콜라겐 IV; 겔라틴; 엘라스틴 및 κ-엘라스틴; ;카제인; α1-AT; 피브로넥틴; 비트로넥틴; 라미닌; 에낙틴; 프로테오글리칸 단량체; GST-TNF; MMP; 피브리노겐; 피브린; 플라스미노겐
MMP-13 콜라게나제-3 콜라겐(I, II 및 III, IV, IX, X 및 XIV); 겔라틴, α1-ACHYM 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 2; 아그렉칸; 페르렉칸; 대형 데나스신 C, 피브로넥틱; 오스테오넥틴; MMP-9
MMP-14 MT-MMP-1 콜라겐(I, II 및 III); 겔라틴, 카제인, κ-엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 프로테오글리칸, 대형 테나스신-C, 에낙틴; α1-AT, α2M; GST-TNF; MMP-2; MMP-13
MMP-15 MT-MMP-2 피브로넥틴, 대형 테나스신-C, 라미닌, 아그렉칸, 페를렉칸; GST-TNF; MMP-2
효소의 MMP 류는 사람 연골세포로부터 분비되고 활막 섬유아세포와 같은 활막 세포에 의해 분비되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 동일계내의 하이브리드 형성을 이용하여, 사람 활막은 스트로멜라이신-1과 콜라게나제 둘다를 합성하는 것으로 밝혀졌다. 스트로멜라이신-1(MMP-3)은 연골 매트릭스의 모든 성분을 퇴화시킬 수 있다. 연골 세포는 매트릭스 퇴화 효소, 콜라게나제-3의 방출에 의해 연골 퇴화에 기여한다는 증거가 있다. 전-염증성 사이토킨에 의해 활성화되는 경우, MMP는 잠재적 형태로 세포로부터 숨겨지고, 세포외적으로 활성화되며 메탈로프로테이나제(TIMP)의 조직 억제제에 의해 억제된다. MMP와 TIMP의 활성 사이의 균형은 순수한 연골 매트릭스의 유지에 중요한 것으로 고려된다. 골관절염 및 류마티스 관절염과 같은 병리학적 조건하에, 수개의 연구가 MMP의 상승된 양을 나타내어 MMP와 TIMP 사이에 불균형을 일으키는데, 이는 관찰된 연골 파괴의 원인인 것으로 고려된다.
MMP는 인터루킨-1(IL-1)과 같은 사이토킨, 및 이의 프로테아제 생성을 증진시키는 연골 세포 및 활막 세포에 작용하는 성장 인자에 의해 조절된다. IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 기타 전-염증성 사이토킨은 또한 매트릭스 퇴화 효소의 생성을 상향 조절한다. 이는 연골 파괴를 일으키며, 이는 대개 황산염화 글리코사미노글리칸(GAG)의 손실 및 관절 질환을 갖는 환자의 관절 액에 존재하는 콜라겐, IL-1의 분해로서 평가되며, 스트로멜라이신, 섬유아세포 및 호중구 콜라게나제와 같은 효소, 및 플라스미노겐 활성화제의 상승된 양을 합성하기 DLN한 연골 세포를 자극한다. 또한, IL-1은 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 및 TIMP의 합성을 억제하며, 또한 콜라겐과 같은 매트릭스 성분의 합성을 억제한다. 억제제와 효소의 양 사이의 불균형은 활성 프로테아제의 양을 증가시키며 매트릭스 생합성의 억제와 조합하여 연골을 분해시킨다.
생체내 모델에서와 같이 연골 조각을 사용하는 경우, 콜라게나제 억제제는 류마티스성 활막 섬유아세포(RSF)에 의한 관절 연골의 공략을 자극하는 IL-1 또는 IL-8을 억제할 수 있다. 콜라게나제 억제제, 1,10-o 페난트롤린 및 포스포르아미돈은 10-150μM의 농도에서 RSF 세포에 의한 연골의 농도 의존성 침투를 실질적으로 억제한다. 프로테이나제의 분비에 대한 사이토킨의 선택적 효과는 활막 섬유아세포 유사 세포 중재된 분해가 고도로 조절된 공정이라는 것을 입증한다. 따라서, 관절내의 국소적인 프로테아제 활성 및 관련된 매트릭스 퇴화를 억제시키는 능력은 연골 파괴공정을 억제하는 것으로 예측된다. 제한된 시험관내 시스템에서의 억제제의 작용은 적합한 약력학을 지닌 합성 MMP 억제제의 국소 전달을 이용하는 치료학적 제제가 세포보호제로서 효과적일 것이라는 것을 제시한다.
본 발명에 적합한 MMP 억제제의 예는 U24522 ((R, S)-N-[2-[2-(하이드록실아미노)-2-옥소에틸]-4-메틸-1-옥소페닐]-L-류실-L-페닐알라닌아미드), MMP억제제 I 및 MMP-3 억제제, 및 TIMP-1와 같은 거대 단백질을 포함하며, 하기 표에 나타내었다. 국소 전달(즉, 주사, 주입 및 관주)의 모든 모델에 있어서, 각각의 적합한 제제의 최적 용량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 것이다. 예를 들면, 기록된 제제 각각에 있어서, 기재된 제제를 포함하는 세척 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도는 치료학적으로 유효한 농도로 제공된다.
매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 억제제의 치료학적 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(나노몰) 가장 바람직한 농도(나노몰)
U-24522 0.2-2,000 20-200
미노사이클린 30-500,000 300-3,000
MMP 억제제 I 0.3-3,000 3-600
4-Abz-Gly-Pro-D-Leu-D-Ala-NHOH MMP 억제제 0.5-5,000 5-500
Ac-Arg-Cys-Gly-Val-Pro-Asp-NH2 루만 TIMP1 0.5-5,000 5-500
루만 TIMP2 0.3-3,000 3-600
포스포라미돈 1,000-500,000 5,000-100,000
8. 핵 인자 카파 B( NF κ B) 억제제
전-염증성 및 연골 파괴성 세포 경로는 신규한 치료학적 약물의 국소 전달용 표적인 세포내 및 세포외 시그날 전달 메카니즘에 의해 조절된다. 전사인자인 핵 인자 카파B(NFκB)를 활성화하기 위한 전-염증성 사이토류킨(IL-1)에 의해 이용되는 완전한 분자 시그날 전달 메카니즘은 불량하게 정의된다. 그럼에도 불구하고, 유전자 전사 수준에서의 세포내 시그날 전달에 포함되는 주요한 분자는 전-염증성 전사 인자, (NFκB)이다. NFκB 활성은 동종 이량체 또는 이종 이량체 형태인 DNA에 결합된 전사 인자 서브유닛의 류에 의해 중재된다. 이러한 서브유닛은 IκB라고 불리우는 억제성 서브유닛의 결합으로 인하여 비활성 형태로 세포의 세포질내에 전형적으로 존재한다. IL-1 수용체 및 기타 세포외 신호의 활성화는 IκB의 분해를 유도하며 억제제로부터 NFκB를 동반해서 분해시킨 다음, 핵으로 전위시킨다. NFκB는 IL-1 유도된 발현에 포함되는 것으로 밝혀졌고 RA 활막 섬유아세포에서 전-염증성 COX-2 단백질 발형을 증가시킬 수 있다.
주요한 분자 표적으로서 NFκB의 확인은 관절 염증 및 연골 파괴적 경로에 결합된 수개의 중요한 염증성 중재자의 일반적인 하부 시그날 전달 인자로서의 역할을 기본으로 한 것이다. 다수의 유전자(COX-2, 콜라게나제, IL-6, IL-8)의 응답은 NFκV 촉진자 원소 둘 다를 포함하는 촉진자에 이해 조절된다. NFκB의 활성화는 사이토킨, 세포 부착 분자, 메탈로프로테이나제 및 활막 세포에서 프로스타글란딘 및 류코트리엔(COX-2)의 생성에 관여하는 기타 단백질과 같은 염증성 공정에 중심에 있는 다수의 단백질의 유도를 중재한다. 따라서, 이러한 전사 인자는 사람 활막 섬유아세포, 사람 관절 연골 세포 뿐만아니라 관절내의 기타 세포에서의 손상 응답에 관한 이론에서 생리학적으로 중요한 표적을 나타낸다.
구체적으로, 인터루킨 1베타(IL-1베타)에 대한 사람 류마티스 활막 섬유아세포(RSF)의 노출은 85-κD 포스포리파제 A2 (PLA2) 및 유도할 수 있는 사이클로옥시게나제(COX2)의 동등한 상향조절을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이와 함께, 이들 2개의 효소는 PGE2의 후속적인 생합성, 관절에서의 주요한 염증성 중재자, 올리고뉴클레오타이드 데코이 및 안티센스를 사용하여 프로스타노이드 대사 효소의 조절에서의 (NFκB)의 참여를 입증한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 NFκB mRNA를 길항시키면 COX 유전자 촉진제에 대한 결합을 감소시킨다.
해양 천연 생성물인 하이메니알디신은 최근 농도 의존성 방법(IC50= 1μM)에서 NFκB 활성화 및 IL-1-자극된 RSF-억제된 PGE2 생성의 노출 억제제로서 특성화하여다. 분자 표적의 특수성은 비활성인 동족체인 알디신 및 단백직 키나제 C 억제제인 RO 32-0432의 사용을 통해서 나타내었으며, 이는 비활성이다. IL 1-유도된 NFκB 활성화에 대한 하이메니알디신의 직접적인 작용은 전통적인 κB 콘센서스 모티프에 대한 NFκB 결합의 상당한 감소(대략 80%) 및 치료된 세포의 세포질로부터의 자극된 p65 이동의 억제에 의해 입증된다. NFκB 전사 조절의 억제제에 대해서 기대되는 바와 같이, 하이메니알디신 처리된 RSF는 IL-1에 응답하여 COX-2 또는 PLA2에 대한 mRNA를 전사하지 않았다. 결과적으로, 이러한 효소에 대한 감소된 단백질 수준 및 PGE2를 생산하기 위한 능력의 감소가 관찰된다. 또한, NFκB 조절된 이벤트로 공지되어 있는 IL-1-자극된 인터루킨-8(IL-8) 생성은 또한 하이메니알디신에 의해 억제되지만, 혈관 내피 성장인자인 IL-1-유도된 생성은 하이메니알디신에 대한 노출에 의해 영향받지 않는다. 따라서, 하이메니알디신은 NFκB 활성화에 대한 억제 효과를 통해 PGE2의 IL-1-자극된 활막 섬유아세포 혐성을 억제한다. 이는 관절 염증 및 연골 파괴에서의 NFκB의 역할을 차단하는 신규한 억제제로서의 이의 용도를 제한하는 토대를 제공한다.
본 발명에 적합한 NFκB 억제제의 예를 하기에 나타내었다. 모든 모델 1에 대하여, 각각의 적합한 제제의 최적 용량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 것이다. 예를 들면, 기록된 제제 각각에 있어서, 기재된 제제를 포함하는 세척 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도는 치료학적으로 유효한 농도로 제공된다.
NFκB 억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(나노몰) 가장 바람직한 농도(나노몰)
카페산 페닐에틸 에스테르(CAPE) 1-100,000 50-20,000
DM-CAFE 0.5-50,000 50-5,000
SN-50 펩타이드 0.1-100,000 100-20,000
히메니알디신 1-100,000 100-10,000
피롤리돈 디티오카바메이트 1-50,000 50-10,000
9. 산화질소( NO ) 신타제 억제제
산화질소(NO)는 일부 연속 조직 질환의 병생리학적 메카니즘에 포함된 광범위한 세포내 및 세포간 중재자이다. NO는 효소 류에 의해 L-아르기닌으로부터 형성되며, 이는 세포내적으로 국부화된다. NO 신타제의 3개의 동형을 클론화하고, 서열화한다. 내피 세포 NO 신타제(ecNOS) 및 뇌 NO 신타제(bNOS)는 구성적으로 활성이다. NO 신타제, 유도가능한 NOS(iNOS)의 분명한 동형이 연골 세포를 포함한 다수의 세포 형태에서 발견된다. 기본 조건하에서는 부재하지만, IL-1β 및 TNF-α와 같은 전-염증성 중재자에 응답해서는 상부 조절된다. 최근에 발견된 바에 의하면, IL-1은 연골세포 NO 합성의 매우 강력한 자극제이며 IL-1은 iNOS의 수준을 상부 조절하는 능력을 통해 작용한다. 연골내에서, 연골 세포는 NO의 주 공급원이고 전-염증성 사이토킨에 의해 유도된 iNOS는 염증성 관절병증에서 il-1의 다수의 영향을 중재하는 것으로 고려된다.
연골세포 유도성 NO 신타제(iNOS)를 구체적으로 억제하는 약물은 골절 손상(즉, 관절을 포함하는 외과적 과정)으로 인해 발생하는 연골 파괴를 방지하는 치료학적 역할을 지닐 수 있다. 이러한 유리한 치료학적 효과를 지지하는 증거는 배양된 연골 세포 및 골관절염을 지닌 환자로부터의 연골 외부이식체에서의 유도가능한 NO 신타제를 억제하는 능력을 위한 각종 iNOS 억제제를 평가하는 실질적으로 다수의 연구를 기초로 한 것이다. S-치환된 이소티오우레아라고 명명되는 화합물 류를 연골에서 NO 생합성의 강력한 억제제로서 특성화한다. S-메틸 이소티오우레아 및 S-(아미노에틸) 이소티오우레아는 NG-모노메틸-L-아르기닌 보다 2 내지 4배 더 강력하고 아미노구아니딘 보다 5 내지 10배 더 강력하며 Nω-니트로-L-아르기닌 및 N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 보다 300배 이상 더 강력하다. 이러한 이소티오우레아 화합물은 연골중의 iNOS 억제제의 강력하고 비교적 특수한 부류를 제공하기 때문에 본 발명에서 국소 전달용으로 적합하다[참조: Jang, D., 1996, Eur. J. Pharmacol. 312: 341-347].
NO 신타제 억제제의 연골 보호성 치료학적 잠재성은 또한 연골 매트릭스에서의 영향을 정의하기 위한 분리된 연골 세포와 같은 시험관내 시스템을 사용하여 평가한다. NG-모노메틸-L-아르기닌(L-NMMA), 설정된 NO 신타제 억제제에 의한 내인성 NO 생성 억제는 겔라티나제, 콜로게나제, 및 IL-1β-자극된 연골 세포에 의한 스트로멜라이신 생성을 억제시킨다. NO 생성의 억제는 또한 연골세포의 IL-1β로의 노출로부터 발생하는 락테이트 생성의 증가를 부분적으로 저하시킨다. L-NMMA를 사용한 연골 단편의 치료는 글리코사미노글리칸 합성의 IL-1β 억제 효과를 부분적으로 역적시키고, IL-1β-자극 MMP 활성을 억제시키며, IL-1 수용체 효능제(IL-Ira) 생성을 증가시킨다. NO는 또한 IL-1에 노출된 연골세포에 의한 TGF-βl의 생성을 감소시킴으로써 간접적으로 프로테오글리칸 합성을 조절함으로써 연골세포에서의 당해 사이토킨의 동화적 영향을 감소시킨다.
본 연구는 프로테오글리칸 합성 및 NO 생성에 대한 재조합 사람 IL-1 반응의 억제 효과에 대한 신규한 아미노구아니딘, S-메틸이소티오우레아(SMT), S-아미노에틸이소티오우레아(AETU), L-NMMA 및 N-니트로메틸이소티오우레아(SMT), S-아미노에틸이소티오우레아(AETU), L-NMMA 및 N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME) NOS 억제제의 효능을 비교한다. 상이한 배양 시스템이 NO 생성의 큰 증가 및 프로테오글리칸 합성의 현저한 억제를 지닌 IL-1 챌린지에 대한 농도 의존성 방법에서의 반응을 나타내었다. 상기한 NOS 억제제(1 내지 1000μM)는 IL-1을 사용하여 처리한 연골 세포에 의한 NO 생성을 억제하며 연골 세포에서 프로테오글리칸 합성을 복원하는데 있어서의 현저한 효과를 갖는다. 따라서, NO 생성이 치료학적으로 효과적인 농도 및 용량을 사용하여 차단되는 경우, 프로테오글리칸 합성의 IL-1β 억제는 방지될 것이다.
NO 신타제는 관절 질병을 갖는 환자의 관절로부터 수득된 연골에서 나타난다. 류마티스 관절염 또는 골 관절염을 나타내는 환자에서, 아질산염의 양의 증가가 활막 액에서 관찰되며 이러한 환자에서 NO 생성의 중요한 공급원은 관절 연골로부터 유도된다. 또한, iNOS의 강력한 억제제인 L-NIL의 지속된 계통적 운반은 도그에서의 실험적 OA(ACL의 단편화에 의해 유도됨)의 진행을 감소시키고 IL-1β, PGE2, NO 및 MMP 생성의 실질적인 감소를 유발시킨다. 이러한 발견은, NO가 IL-1의 효과의 강력한 조절자이며 관절 질병의 병생리학에 기여한다는 것을 제안한다.
따라서, 이러한 시험관내 및 생체내 결과는 NO 신타제의 구체적인 억제제가 활막 염증의 임상적 치료용으로 강력한 신규 약물임을 나타내며, 외과적으로 치료된 관절 또는 기타 손상된 관절을 치료하기 위한 소염, 연골 보호성 및 항-동통류로부터 선택된 하나 이상의 약물과의 배합물로 국소 전달되는 경우 연골 보호 효과를 제공할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 적합한 NO 신타제의 예는 다음에 나타낸 바와 같다. 국소 전달(즉, 주사, 주입 및 관주)의 모든 모델에 있어서, 각각의 적합한 제제에 대한 최적 용량 및/또는 농도는 치료학적으로 유효한 것이다. 예로서, 기재된 제제 각각에 대하여, 기재된 제제를 포함하는 관주 용액의 바람직하고 가장 바람직한 농도가 제공되며, 당해 농도는 치료학적으로 유효한 것으로 고려된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 용액중에 포함시키기 위한 바람직한 NO 신타제 억제제는 1400W ((N-3-(아미노메틸)벤질)아세트아미딘), iNOS, 디페닐렌요요디늄 및 1,3-PBIT의 선택적이고, 느리고 긴밀한 억제제이다.
산화질소 신타제 억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
화합물 치료학적 농도(μM) 가장 바람직한 농도(μM)
NG-모노메틸-L-아르기닌 50-50,000 3,000
1400W 0.1-1,000 1-20
디페닐렌요오듐 0.1-1,000 1-100
S-메틸 이소티오우레아 1-1,000 10-100
S-(아미노에틸)이소티오우레아 1-1,000 10-100
L-N6-(1-이미노에틸)라이신 1-1,000 10-100
1,3-PBITU 0.5-500 5-100
2-에틸-2-티오슈도우레아 2-20,000 20-2,000
10. 세포 부착 분자
10a 인테그린 효능제 및 길항제
인테그린은 세포외 매트릭스(ECM) 성분이거나 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틱, 오스테오폰틴(OPN) 및 피브로넥틱(FN)과 같은 기타 대형 단백질일 수 있는 리간드를 결합시키는 α 및 β 서브유닛을 포함하는 플라즈마 막에 위치한 이종 이량체 수용체이다. 연골 매트릭스의 퇴화는 ECM과 이들 세포와의 상호작용에 좌우되는 메카니즘을 통해 연골 세포에 의해 조절된다. 연골 세포 유전자 발현은 부분적으로는 연골 세포를 둘러싸는 환경에서 ECM 성분과 인테르린의 상호작용을 포함하는 세포 접촉을 통해 조절된다. 따라서, 연골 세포상의 인테그린은 연골 항상성의 조절에 포함되며, 이러한 수용체 류는 연골 퇴화를 방지하기 위한 치료학적 표적의 부류를 나타낸다.
사람 연골세포는 α1β1, α5β1, αVβ1및 소량의 기타의 것들을 포함한 분명한 α 및 β 서브유닛으로 이루어진 인테그린 수용체의 배열을 나타낸다. 특히 중요한 것은 OPN을 결합하는 것으로 공지되어 있는 αVβ3인테그린이다. αVβ3 착체-특이적 기능 차단 모노클로날 항체(mAb) LM609는 리간드 OPN과 유사한 방법으로 효능제로서 작용한다. 이는 IL-1, NO 및 PGE2와 같은 전-염증성 및 연골 파괴성 중재자 다수의 생성을 감소시킨다. 따라서, 길항적 mAb LM609는 본 발명에서 적합한 것으로 고려된다.
또한, 2개의 펩티도미메틱스, MK-383 (Merck) 및 RO 4483 (Hoffmann-LaRoche)은 단계 II 임상물에서 연구하였다. 이들은 둘다 작은 분자이기 때문에, 반감기가 짧으며 효능이 크다. 그러나, 이들은 또한 특이성이 적은 것으로 보이며, 기타 밀접하게 관련된 인테그린과 상호작용한다. 이들 펩티도미메틱스는 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다.
인테그린의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
제제의 종류 인테그린: 치료학적 농도(μg/ml) 바람직한 농도(μg/ml)
αVβmAb LM 609 0.05-5,000 5-500
에치스타틴 0.1-10,000 100-1,000
11. 항-주화제( anti - chemotactic agent )
항주화제는 염증 세포의 주화성을 방지한다. 이러한 제제로 작용하는 항-주화성 표적의 대표적인 예는 F-Met-Leu-Phe 수용체, IL-8 수용체, MCP-1 수용체 및 MIP-1-I/RANTES 수용체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 제제 부류내의 약물은 개발 단계의 초기에 있지만, 이들은 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 것으로 이론화된다.
12. 세포내 시그날 전달 억제제
12a. 단백질 키나제 억제제
i. 단백질 키나제 C ( PKC ) 억제제
단백질 키나제 C (PKC)는 다수의 생리학적 공정에 있어서 세포 표면 신호 전사에서 중요한 역활을 담당한다. PKC 아이소자임은 G-단백질 커플링화 수용체(예: 세로토닌, 브래디키닌 등) 또는 전-염증성 사이토킨 수용체 중의 어느 하나의 초기 활성화로부터 수득되는 하부 표적으로서 활성화될 수 있다. 이들 수용체 부류 둘 다는 연골 파괴를 중재하는데 있어서 중요한 역활을 담당한다.
분자 클론 분석 결과, PKC는 8개의 아종(아이소자임) 이상으로 이루어진 대형 그룹으로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 아이소자임은 특이 세포의 증식 반응의 변화에 대한 결화 수용체 활성화를 위한 구조와 메카니즘이 사실상 상이하다. 특이 아이소자임의 발현은 활막 세포, 연골 세포, 호중구, 골수세포 및 연근 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에서 발견된다. PKC 억제제는 따라서 억제제가 아이소자임 특이성을 나타내지 않는 한 수개의 세포 유형에서 시그날 전달 경로에 영향을 주는 경향이 있다. 따라서, PKC 억제제는 활막 세포 및 연골 세포 활성화를 차단하는데 효과적인 것으로 예측되고 호중구 활성화 및 후속적인 부착을 차단하는데 항-염증성 영향도 지닐 수 있다. 수개의 억제제가 기술되어 왔고 초기의 보고에서는 칼포스틴 C 억제 활성에 대하여 IC50이 50μM인 것으로 나타내고 있다. G-6203(Go 6979로서도 공지됨)은 IC50 값이 2-10μM 범위인 특정 PKC 동형에 대한 선택성이 큰 신규하고도 강력한 PKC 억제제이다. Go 6850 또는 비스인도일말레이미드 I(Warner-Lambert로부터 입수가능함)로서도 공지되어 있고 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 밝혀진 이들 및 또다른 약물인 GF 109203X를 다음에 나타내었다.
연골 파괴 억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
제제의 종류 단백질 키나제 C 억제제: 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
칼포스틴 C 0.5-50,000 100-5,000
CF 109203X 0.1-10,000 1-1,000
G-6203(Go 6976) 0.1-10,000 1-1,000
ii. 단백질 타이로신 키나제 억제제
수용체 타이로신-키나제(R사) 류의 다수의 구성원 중에는 엄청난 다양성이 존재하지만, 이러한 수용체에 의해 사용된 시그날 전달 메카니즘은 다수의 공통적인 특징을 공유한다. 생화학적 및 분자 유전자성 연구 결과, RTK의 세포외 영역에 대한 리간드의 결합은 세포내 영역의 고유한 타이로신 키나제 촉매 활성을 신속하게 활성화시키는 것으로 밝혀졌다[도 5 참조]. 증가된 활성은 일반적인 서열 모티프를 포함하는 세포내 기질 다수의 타이로신-특이적 포스포릴화를 일으킨다. 결과적으로, 이는 다수의 "하부" 시그날 전달 분자의 활성화 및 인지질 대사, 아라키돈산 대사, 단백질 포스포릴화(단백질 키나제 이외의 메카니즘 포함), 칼슘 대사 및 전사 활성화를 조절하는 분자내 경로의 캐스케이드를 유발시킨다[도 2 참조]. RTK 세포질 영역의 성장 인자 의존성 타이로신 키나제 활성은 세포 증식을 일으키는 세포내 신호의 발생을 위한 주요 메카니즘이다. 따라서, 억제제는 이러한 시그날 전달을 차단하는 잠재성을 지니기 때문에 활막 세포 및 연골 세포 활성화를 방지한다.
수 개의 관련된 티르포스틴 화합물중의 어느 것도 타이로신 키나제 활성(시험관내 IC50이 0.5 내지 1.0μM임)의 특수한 억제제로서의 잠재성을 갖는데, 그 이유는 이들이 기타 단백질 키나제 및 기타 신호 전사 시스템에 대한 영향이 거의 없기 때문이다. 현재까지, 다수의 티르포스틴 화합물중의 단지 일부만이 시판되고 있으며, 본 발명에서 사용된 바와 같은 이들 제제의 적합한 농도는 하기한 바와 같다. 또한, 스타우로스포린은 src 아그룹의 수개의 단백질 타이로신 키나제에 대하여 강력한 억제 효과를 입증하는 것으로 기록되었으며 본 발명에서 사용된 이러한 제제에 대한 적합한 농도는 또한 다음에 나타내었다.
억제제의 치료학적 농도 및 바람직한 농도
제제의 종류 치료학적 농도(나노몰) 바람직한 농도(나노몰)
단백질 키나제 억제제 라벤두스틴 A 10-100,000 100-10,000
티로포스핀 AG1296 10-100,000 100-10,000
티로프로핀 AG1295 10-100,000 100-10,000
스타우로스포린 1-100,000 10-1,000
PD 158780 0.1-10,000 10-500
PD 174265 0.1-10,000 10-500
12b. 세포내 단백질 타이로신 포스파타제의 조절제
src-단독체2 SH2 영역을 포함하는 비-전이막 단백질 타이로신 포스파타제(PT아제)가 공지되어 있으며 이들을 SH-PTP1 및 SH-PTP2라고도 부른다. 또한, SH-PTP1은 PTP1C, HCP 또는 SHP로도 공지되어 있다. SH-PTP2는 또한 PTP1D 또는 PTP2C로 공지되어 있다. 유사하게, SH-PTP1는 모든 계열 및 모든 분화 단계의 조혈 세포에서 고수준으로 발현되며, SH-PTP1 유전자는 오래된(me) 마우스 표현형에 관여하는 것으로 확인되었으며 이는 이의 세포 기질과의 상호작용을 차단하는 억제제의 효과를 예측하는 토대를 제공한다. 주화성 펩타이드를 지닌 호중구의 자극은 호중구 반응(참조: Cui, et al., 1994 J. Immunol.)을 중재하는 타이로신 키나제의 활성화를 일으키는 것으로 공지되어 있으며 PTP아제 활성은 세포 자극의 초기 단계에서 활성화된 타이로신 키나제의 영향을 반전시킴으로써 작용제 유도된 활성을 조절한다. PT아제 활성을 자극할 수 있는 제제는 소염성 중재자로서 강력한 치료학적 적용을 지닐 수 있다.
이러한 동일한 PT아제는 특정한 RTK의 활성을 조절하는 것으로도 공지되어 있다. 이들은 활성화된 수용체 키나제의 영향을 역 균형시켜서 중요한 약물 표적을 나타낼 수 있는 것으로 나타났다. 시험관내 시험 결과, PTP아제가 내인성 단백질에 대한 티로실 잔사의 인슐린 자극된 포스포릴화를 차단하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PTP아제 활성은 재관류에서 RTK-수용체 작용의 역 활성화를 역전시킬 수 있으며, 본 발명의 용액에서 유용한 것으로 밝혀졌다. 또한, 수용체 결합된 PTP아제는 또한 세포외 리간드로서 작용하며, 세포 부착 분자의 것들과 유사하다. 세포외 영역에 대한 리간드의 결합의 작용적 결과는 아직 정의되어 있지 않지만, 결합이 세포내의 포스파타제 활성을 조절하는 작용을 하는 것으로 추정하는 것이 바람직하다[참조: Fashena and Zinn, 1995, Current Biology, 5,1367-1369]. 이러한 작용은 기타 세포 표면 부착 분자(NCAM)에 의해 중재된 부착을 차단할 수 있으며 소염 효과를 제공한다. 지금까지 어떠한 약물도 이러한 적용을 위해 개발되지 않았다.
12c. SH2 영역 억제제( src Homology 2 영역)
단백질 타이로신 키나제(PTK)의 src 아그룹에서 기원해서 확인된 SH2 영역은 비촉매성 단백질 서열이며 다양한 신호 형질도입 단백질 중에서 보존된 약 100개의 아미노산으로 이루어진다(Cohen, et al., 1995). SH2 영역은 포스포타이로신 결합 모듈로서 작용하며 이에 따라 세포내의 신호 형질도입 경로에서 중요한 단백질-단백질 결합을 중재한다. 특히, SH2 영역의 역활은 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 수용체의 경우에서와 같이 수용체 타이로신 키나제(RTK) 중재된 시그날 전달용으로 중요한 것으로 명백히 정의되어 왔다. 자가 포스포릴화 RTK에 대한 포스포타이로신 함유 부위는 SH2-단백질용 결합 부위로서 작용하기 때문에 생화학적 시그날 전달 경로를 중재한다[도 2 참조](Carpenter, G., FASEB J. 6: 3283-3289,1992; Sierke, S. and Koland, J. Biochem. 32: 10102-10108,1993). SH2 영역은 유전자 발현에서의 변형을 포함하는 세포 반응, 및 궁극적인 세포 증식에 대한 활성화 성장 인자 수용체를 커플링하는데 책임이 있다. 따라서, 활막 세포 표면에 발현된 특이적 RTK(IGFR 및 FGFR 제외)DML 활성화의 영향을 선택적으로 차단하는 억제제는 관절경 검사 후의 연골 파괴를 차단하는데 효과적인 것으로 예측된다.
SH2 영역을 포함하고 세포내 시그날 전달에서 작용하는 20개 이상의 세포질 단백질이 확인된다. SH2 영역의 분배는 특별한 단백질 류에 제한되지는 않지만, 수 개의 단백질 부류에서 탄백질 키나제, 지질 키나제, 단백질 포스파타제, 포스포리파제, Ras-조절 단백질 및 일부 전사 인자가 발견되었다. SH2-함유 단배질 다수는 공지된 효소 활성을 지니지만, 다른 것들(Grb2 및 Crk)은 세포 표면 수용체들 사이의 "링커" 및 "어댑터" 및 "하부" 이펙터 분자로서 기능한다[Marengere, L., et al., Nature 369: 502-505,1994]. 신호 형질도입에서 활성화되는 효소 활성을 지닌 단백질 함유 SH2 영역의 예는 단백질 타이로신 키나제(src (pp60c - src), abl, lck, fyn, fgr 및 기타의 것들), 포스포리파제Cγ(PLCγ), 포스페이티딜리노지톨 3-키나제(PI-3-키나제), p21-ras GTP아제 활성화 단백질(GAP) 및 SH2 함유 단백질 타이로신 포스파타제(SH-PTP아제) (참조: Songyang, et al., Cell 72,767-778,1993). 이러한 각종 SH2 단백질이 활성화 세포 표면 수용체로부터의 신호를 세포 반응을 궁극적으로 정의하는 추가의 분자 상호작용의 캐스케이드 속으로 전달하는데 있어서 점유하는 중심적인 역할로 인하여, 특이적 SH2 단백질 결합, 예를 들면, c-src를 차단하는 억제제가 연골 보호에서 잠재적인 치료학적 적용을 갖는 제제로서 바람직하다.
또한, 다수의 면역/염증 반응의 조절은 비 수용체 타이로신 키나제 함유 SH2 영역을 통해 시호를 전송하는 수용체를 통해 중재된다. 항체 특이성 T-세포 수용체(TCR)을 통한 T-세포 활성화는 신호 형질도입 캐스케이드를 개시시켜 림포킨 분비 및 T-세포 증식을 일으킨다. TCR 활성화 이후의 최초 생화학적 반응중의 하나는 타이로신 키나제 활성의 증가이다. 특히, 호중구 활성화는 세포 표면 이뮤노글로블린 G 수용체의 반응을 통해 부분적으로 조절된다. 이러한 수용체의 활성화는 SH2 영역을 지니는 것으로 공지된 미확인 타이로신 키나제의 활성화를 중재한다. 추가의 증거는 수개의 src-류 키나제(Ick, blk, fyn)가 사이토킨 및 인테그린 수용체로부터 유도되는 신호 형질도입 경로에 관여하여 수개의 독립적인 수용체 구조로부터 접수된 자극을 통합시키는 작용을 할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 특이적 SH2 영역은 다수의 호중구 작용을 차단하는 잠재성을 지니며 소염 중재자로서 작용한다.
SH2 영역에 대해 표적화된 약물을 개발하기 위한 노력이 현재 시험관내 및 세포 수준에서 생화학적으로 수행되고 있다. 이러한 노력은 성공적이지만, 수득한 약물은 본 발명을 실시하는데 유용한 것으로 이론화된다.
III. 항- 동통제 및/또는 소염제 및 연골보호 용액에 사용된 기타 제제의 치료학적 배합물로부터 유도된 상승적 상호작용
관절경 외과 수술의 치료학적 과정 후의 염증 및 연골 항상성의 상실과 관련된 질병 과정의 복잡성 및 포함된 분자 표적의 복수성, 단일 분자 표적의 차단 또는 억제는 연골 퇴화를 방지하고 골관절염의 진행을 방지하는데 적절한 효험을 제공하지 못한다. 실제로, 상이한 개별 분자 수용체 및/또는 효소를 표적화하는 다수의 동물 연구는 동물 모델에서 효과적인 것을 입증하지 못했거나 현재까지 임상 시험에서 효험을 수득하지 못했다. 따라서, 분명한 분자 표적에서 작용하고 국소 전달되는 약물의 치료학적 배합물은 연골 보호를 위한 치료학적 접근에서 임상적 유효성을 위해 바람직한 것으로 나타난다. 하기하는 바와 같이, 이러한 상승적 분자 표적화된 치료용 비율은 활막 및 연골에서 활막세포 및 연골 세포가 관절경 외과 수술동안에 노출되는 자극을 전달하고 통합시키는 기본적인 생화학적 메카니즘을 이해하는데 있어서 최근의 진보로부터 유도된다.
주 시그날 전달 경로에서의 " 크로스톡 " 및 수렴
세포 시그날 전달에 책임있는 분자 변환은 전통적으로 주 이산 시그날 전달 경로로 분할되며, 여기서 각각은 세포외 자극의 특별한 세트에 대한 전달장치로서 작용하는 분명한 세트의 단백질 류를 함유하며 분명한 세포 반응을 중재한다. 이러한 한가지 경로는 G-단백질 커플링화된 수용체(GPCR)을 통해 신경전달자 및 호르몬으로부터의 신호를 변환하여 PGE2와 같은 염증 중재자의 생성을 포함하는 수축성 반응을 생성한다. GPCR은 삼량체성 G 단백질의 활성화를 통해 세포내 표적으로 커플링된다[도 2 참조]. GPCR 경로를 통한 활막 세포 및 연골세포의 활성화에 포함된 시그날 전달 분자의 예는 히스타민, 브래디키닌, 세로토닌 및 ATP이다. 두번째 주 경로는 IL-1과 같은 전-염증성 사이토킨으로부터의 신호를 키나제 캐스케이드 및 NF-6 단백질을 통해 전환시켜 유전자 발현을 조절하고 NO를 포함하는 대사적 사이토킨 및 기타 대사적 인자를 생성시킨다.
신경 전달자 및 호르몬으로부전 전달된 신호는 두 가지 부류의 수용체: 7개의 전이막 영역으로 이루어진 GPCR 또는 리간드 게이트화 채널중의 하나를 자극한다. 두 종류의 수용체로부터의 "하부" 신호는 세포질 Ca2 +의 농도 조절에 수렴된다[도 3 참조]. 각각의 GPCR 변환막 수용체는 Gp, Gi 또는 기타의 것들을 포함하는 특정 부류의 삼량체성 G 단백질을 활성화한다. Gp 서브유닛은 포스포리파제 Cγ를 활성화하여 단백질 키나제 C(PKC)를 활성화시키며 세포질 칼슘의 수준을 증가시킨다[도 3]. 또한, 상승된 세포내 칼슘은 cPLA2를 활성화하고 아라키돈산(AA)를 생성시킨다. AA는 활막세포와 연골세포 둘다에서 COX에 대한 대체물로서 작용하여 PGE2를 생성시킨다. PKC 활성화는 또한 MAP 키나제를 활성화시켜서 NFB를 활성화시키며, 전-염증성 사이토킨에 노출시킴으로써 프라이밍된 세포 및 조직에서, 연골이화작용에 포함된 단백질의 증가된 유전자 발현을 중재한다.
분명한 동족 수용체를 통해 IL-1 및 TNF-a 둘다에 의해 중재되는 것과 같은 전-염증성 사이토킨 시그날 전달은 또한 세포 유전자 발현의 조절을 수렴한다. 이러한 분명한 수용체에 의해 이용딘 신호 형질 전달 경로는 수용체에 근사한 분명한 키나제를 이용하지만 시그날 전달 경로는 후속적으로 MAP 키나제의 수준에서 수렴한다[도 3 및 도 4]. 신호 형질도입은 p38 MAP 키나제와 같은 "하부" 효소를 포함하는 키나제의 캐스케이드 형태의 잔사의 포스포릴화에 좌우된다. IL-1 수용체 및 TNF-수용체는 또한 Gq 커플링화된 GPCR에 의해 공유된 MAP 키나제를 자극시킨다[도 3]. 현재, 리간드-의존성 "크로스톡"은 IL-1과 같은 특이적 GPCR 및 사이토킨의 동시자극에 대한 반응에서 키나제 경로를 변환활성화할 수 있는 것으로 인식된다[도 3 참조]. 따라서, 통상적인 시그날 전달 경로(도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같음)의 변환 활성화를 차단하여 전-염증성 사이토킨, iNOS, COX-2 및 MMP의 증가된 유전자 발현을 일으키는 선택적 억제제들의 배합물은 관절검경적 외과 과적 후의 염증 및 연골 퇴화를 방지하는데 상승적으로 작용한다.
IV . 요약
이러한 연골보호제에 대하여 정의된 작용의 분자 및 세포 메카니즘으로부터, 이들 화합물은 세척 용액(기타 세포 보호제와의 배합물 형태로 또는 본원에 기재된 기타 항-동통제 및 소염제와의 배합물 형태로)으로 적용하는 경우 또는 주입 또는 주사를 통해 관절에 직접 투입하는 기타의 경우 연골 보호 작용을 나타내는 것으로 기대된다. 특히, 이러한 제제는 관절경 외과 수술동안에 관주 용액에 의해 운반되는 경우 효과적인 약물인 것으로 기대된다. 각각의 대사적으로 활성인 연골보호제는 저분자 약물, 펩타이드, 단백질, 재조합 키메릭 단백질, 항체, 올리고뉴클레오타이드 또는 유전자 치료 벡터(바이러스성 및 비바이러스성)를 포함하는, 하나 이상의 기타 연골보호제와 함께 관절의 공간으로 운반할 수 있다. 예를 들면, MAPK 억제제와 같은 약물은 관절의 비정상 작용에 포함되거나 병원체적 조건으로 인해 존재하는 관절을 포함하는 구조 및 관절액 공간과 결합된 특정 세포에 대한 이의 작용을 발휘할 수 있다. 이러한 세포와 구조는 제A형 섬유아세포 및 제B형 대식구 세포를 포함한 활막 세포; 골막세포, 골세포, 골모세포, 파골세포; 림프구, 디식구, 유방세포, 단핵구, 호산구; 및 내피 세포, 연골 세포, 섬유아세포 및 신경 세포를 포함한 기타 세포; 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 이러한 측면은 또한 약물을 바람직하지 않고 용량에 따라 역 부작용을 일으킬 수 있는 표적화된 관절 이외의 조직내에 고농도를 일으키는 콘드로프로트의 운반, 흡수, 안정화 또는 약리역학을 증진시키는 관절내로 도입하고 투여하기에 유용한 제형으로 운반할 수 있는 활성 치료제의 제형을 제공한다. 이러한 제형은 단백질, 리포좀, 탄수화물, 합성 유기 화합물 또는 무기 화합물로 이루어진 미세입자, 미세구 또는 나노입자를 포함하지만, 이로써 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 연골 보호제의 배합물, 또는 균질한 비히클(예: 단일 캡슐화 미소구)내의 다중 약제학적 활성 물질로서나 개개 전달 비히클(예: 하나 이상의 제제를 캡슐화하는 미소구의 그룹)의 이산 배합물로서 존재하는 하나 이상의 항-동통제 및/또는 소염제와의 하나 이상의 연골 보호제의 배합물의 전달용으로 제공된다. 제형 분자의 예는 물질을 특정 세포 형태, 겔, 서방성 매트릭스, 가용성 및 불용성 입자는 물론 기재되지 않은 제형 성분도 표적화할 수 있는 친수성 중합체, 다중양이온(예: 프로트아민, 스페르미딘, 폴리라이신), 펩티드 또는 합성 리간드 및 항체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
한가지 측면에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 저농도로 존재하고 약물을 영향을 미치는 조직 또는 관절로 직접 전달할 수 있도록 하는 약물을 함유하는 주입액, 관주 용액을 통해, 하나 이상의 항-동통제 및/또는 소염제와의 배합물로서나 단독으로, 2개 이상의 연골보호제 또는 하나 이상의 항-동통제 및/또는 소염제와 배합된 2개 이상의 연골 보호제를 국소 전달하기 위한 것이다. 약물 함유 주입액 또는 관주 용액은 수술 과정과 연결하여 수술 전 및/또는 수술 동안 및/또는 수술 후에 사용할 수 있거나 수술 과절과 관련이 없는 기타 시점에 투여할 수 있다. 약물 전달에 사용되는 기타의 통상적인 방법은 표적 관절에 상당한 치료학적 농도를 성취하도록 하기 위해 환자에 투여해야하는 고농도의 약물(및 높은 총 용량)이 필수적인 체계적인(예: 근육내, 정맥내, 피하) 투여를 필요로 한다. 전신 투여는 또한 바람직하지 않은 표적 관절 보다 조직내에 고농도를 생성시키며, 용량에 따라, 역 부작용을 일으킬 수 있다. 이러한 체계적인 방법은 약물을 제2 통과 대사 및 신속한 대사에 처리하기 때문에 유효한 치료학적 농도의 지속을 제한한다. (항-동통제 및/또는 소염제 하나 이상과 함께 또는 이들 없이) 연골 보호제와의 배합물이 주입 또는 관주에 의해 관절에 직접 투여되기 때문에, 약물을 목적하는 조직에 운반하기 위해서 혈관 관류가 필요하지 않다. 이러한 상당한 이점은 각종 세포보호제를 위한 낮은 치료학적으로 유효한 용량의 국소 전달을 가능하게 한다.
V. 적용 방법
본 발명의 용액은 외과적, 진단학적 및 치료학적 기술을 포함한 다양한 수술/개재 과정에 적용한다. 본 발명의 연골 보호제의 배합물은 주사 또는 관주에 의해 투여할 수 있다. 주사 용액에 있어서, 단일 용량 형태를 생성하기 위한 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 환자, 용액중의 활성제의 성상 및 특정한 투여 방법에 따라 변할 수 있다. 그러나, 특정한 환자에 대한 구체적인 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성 및 식이를 포함한 각종 인자에 따라 변할 것이다.
주사가능한 제제, 예를 들면, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하는 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한, 예를 들면, 1/3-프로판디올로서 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균성 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적으로, 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 무자극성 고정유를 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능한 물질중에서 사용된다.
본 발명의 주사 용액은 관절경 외과 수술과 연관해서 또는 환자를 치료하고 있는 전문의가 결정하는 임의의 시점에서 투여할 수 있다.
본 발명의 관주 용액은 해부적 관절의 관절경 외과 수술 동안에 골막적으로 적용할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "골막적"이라는 용어는 내부 과정적으로, 예비- 및 내부 과정적으로, 내부- 및 후 과정적으로, 및 예비-, 내부- 및 후 과정적으로의 적용을 망라한다. 바람직하게는, 용액은 예비 과정적으로 및/또는 후 과정적으로 뿐만 아니라 내부 과정적으로도 적용한다. 이러한 과정은 통상적으로 당해 기술분야의 숙련가들에게 익히 공지된 기술에 의해 외과적 부위에 적용되는, 정상 식염수 또는 유산을 가한 링거액과 같은 생리적 관주액을 이용한다. 본 발명의 방법은 통상적으로 적용된 관주액에 대한 본 발명의 항-동통/소염/세포 보호 관주 용액을 대체시킴을 포함한다. 관주 용액은 과정의 개시 전에, 바람직하게는 조직 외상 앞에서 및 과정의 지속 전반에 걸쳐 연속해서 상처 부위 또는 수술 부위에 적용하여 동통과 염증 및 연골 파괴를 선제적으로 방지한다. 본 발명에서 사용된 "관주"라는 용어는 유액 스트림을 사용하여 상처 또는 해부적 구조를 플러슁(flushing)하는 것을 의미하도록 하는 것이다. "적용"이라는 용어는 용액의 겔화성 변형물을 겔화 용액을 사용하여 수술 부위로 도입시킨 다음 과정 전반에 걸쳐 당해 부위에 잔류하도록 하는 것과 같은. 본 발명의 용액을 국소 도입시키는 관주 및 기타 방법을 망라하고자 하는 것이다. 본 발명에서 사용된 "연속적으로"라는 용어는 적용된 제제의 소정의 치료학적 국소 농도를 유지시키기에 충분한 주기로 상처의 반복되고 빈번한 관주가 존재하는 상황, 및 수술 기술에 의해 필요한 관주액 유동의 간헐적인 중단일 수 있는 적용을 포함한다.
본 발명의 용액내의 제제 각각에 대한 농도는 수술 부위에서 소정의 유효량을 성취하기 위한 수술 부위에 대한, 대사적 형질전환의 부재하에, 국소 전달된 제제의 농도이다. 소정 용액중에서 약물 농도는 전달시 국소 희석에 필요하도록 조정할 필요가 있을 수 있다. 용액 농도는 전체 신체 분배에 의한 대사적 형질전환 또는 희석으로 인하여 조정할 수 없는데, 그 이유는 이들 환경이 경구, 정맥내, 피하 또는 근육내 적용과 대조적으로 국소 전달에 의해 회피되기 때문이다.
본 발명의 용액이 사용될 수 있는 관절경 외과 수술은 비제한적인 예로서, 무릎, 어깨 봉우리 빗장 관절, 회전 커프 소제, 팔꿈치 활막 절제술, 및 허리 및 발목 관절 검경술에서의 부분 반월상 연골 절제술 및 인대 재구성을 포함한다. 관주 용액은 관절 캡슐을 팽창시키고, 수술 부스러기를 제거하며 방해되지 않은 관절내부를 가시화할 수 있도록하기 위하여 연속적으로 수술도중에 공급한다.
이러한 관절경 외과 수술동안 동통 및 염증을 조절하고 연골 퇴화를 억제하기 위한 적합한 관절경 외과 수술용 관주 용액은 하기 실시예 1 내지 4에 나타내었다.
본 발명의 각각의 용액에서, 제제는 저농도로 포함되며 목적하는 치료학적 효과를 성취하기 위한 약물 투여의 통상적인 방법에 의해 필요한 농도와 용량에 비하여 저농도로 국소 전달된다. 전신으로 제공된 약제는 제1 및 제2 통과 대사에 처리되고 종종 전신 순환으로부터 신속하게 제거되기 때문에 약물의 기타 투여 경로(즉, 정맥내, 피하, 근육내 또는 경구)를 통해 유사하게 투여된 제제를 운반함으로써 동등한 치료학적 효과를 수득할 수 없다.
본 발명의 실시는 관절경 검사 또는 "개방" 관절(예: 무릎, 어깨 등) 가정의 완결시에 마취제 및/또는 마취의 통상적인 관절내 주입과 분리되어야 한다. 본 발명의 용액은 동통 및 염증의 선행 억제를 제공하기 위한 외과적 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 주입하기 위해 사용된다. 이와 대조적으로, 현재 사용된 국소 마취제를 사용하여 치료학적 효과를 성취하기 위해 필요한 고농도는 심각한 전신 독성을 일으킬 수 있다.
본 발명의 과정을 완성시키는 경우, 마취제에 대한 대체물 또는 보충물로서, 수술 부위에 관주 용액에 사용된 바와 동일한 세포보호제 및/또는 동통 및/또는 염증 억제제를 고농도로 주사하거나 다른 방법으로 적용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 연골 보호제의 배합물을 직접 주입하는 것은 본원에서 상세히 기술하는 바와 같이 바람직할 수 있다. 주입하기 위해 적합한 연골보호 용액은 하기한 실시예 5에 나타내었다.
동화성 과정을 촉진하는 연골 보호제와 이화작용을 억제하는 연골 보호제를 포함하는 용액을 관절에 국소 적용함으로써 관절 퇴화를 효과적으로 억제할 수 있다.
다음은 본 발명의 제제를 이용하는 3개의 임사적 연구의 요약이 뒤따르는 특정한 수술 가정에 적합한 본 발명에 따르는 수 개의 제형이다.
실시예 1
관절경 외사 수술용 관주 용액
다음 조성물은 관절경 과정 동안에 해부학적 관절 관주에 사용하기에 적합한 것이다. 각각의 약물은 다음 실시에에 기재된 나머지 용액에서와 마찬가지로 정상 식염수 또는 락테이트화 링거액과 같은 담체액 함유 생리 전해질중에서 가용화된다.
제제의 종류 약물 농도(나노몰)
MAP 키나제 억제제 SB203580 200
매트릭스 메탈로프로이나제 억제제 U-24522 200
TGF-β효능제 TGF-β2 200
실시예 2
관절경 외과 수술용의 또 다른 관주 용액
다음 조성물은 관절경 검사 과정 동안의 해부학적 관절 관주에 사용하기에 적합한 또다른 제형이다.
제제의 종류 약물 농도(나노몰)
MAP 키나제 억제제 SB203580 200
산화질소 신타제 억제제 L-NIL 1,000
인터루킨 수용체 효능제 L-10 100
실시예 3
또 다른 관주 용액
생리학적 담체액중의 용액중의 다음 약물 및 농도 범위는 본 발명에 사용하기에 적합하다.
제제의 종류 약물 농도(나노몰)
MAP 키나제 억제제 SB242235 200
산화질소 신타제 억제제 L-NIL 10,000
TGF-β효능제 TGF-β2 100
실시예 4
또 다른 관주 용액
다음 조성물은 또한 본 발명에 유용하다.
제제의 종류 약물 농도(나노몰)
MAP 키나제 억제제 SB242235 200
MMP 억제제 U-24522 200
실시예 5
주사용 연골 보호 용액
다음 조성물은 해부학적 관절속으로 주입하기에 적합하다. 각각의 약물은 정상 식염수 또는 유산을 가한 링거액과 같은 담체액 함유 생리 전해질중에서 가용화한다. 20ml 용량의 용액이 환자에게 투여하기에 적합하다.
제제의 종류 약물 농도
BMP 수용체 효능제 BMP-7 100ng/ml
산화질소 신타제 억제제 1,3 PBIT 4.4㎍/ml
TGF-β효능제 피롤리딘-디티오카바메이트 16.4㎍/ml
실시예 6
IL -1 및 GPCR 효능제에 노출시키는 경우 신속한 PGE2 노출의 상승적 자극
섬유아세포 유사 활막 세포는 염증 세포의 특성을 나타내고 관절 염증 및 연골 퇴화의 중요한 조절자인 것으로 보인다. 활막 세포 배양액 모델 시스템을 사용하여 관절경 수술 동안에 조직 손상의 결과로서 발생하는 손상을 포함하는, 관절 조직의 파괴를 조절하는데 있어서 중요한 비-사이토킨 염증성 중재자와 IL-1 사이의 상승적 상호작용을 특성화한다.
실험을 수행하여 배양된 사람 활막 섬유아세포에서의 사이토킨 및 프로스타노이드 생성의 조절에 대한 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 효능제(히스타민, 브래디키닌 및 이소프로테로놀)을 조사하고 당해 시스템내의 케토프로펜의 활성을 특성화한다. 인터루킨-1(IL-1)과의 자극에 반응한 프로스타글란딘 E2(PGE2), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-8(IL-8)의 유도 역학을 기술한다.
실시예 6 내지 8에서, 달리 언급하지 않는 한 다음과 같은 실험 방법과 물질을 사용한다.
세포 배양. 임상 연구 센터, 맥닐 병원을 통한 관절 대체 수술을 수행하는 골관절염 환자로부터 활막 조직을 수득하여, 페니실린(100 units/ml), 스트렙톼이신(100,㎍/ml) 및 푼지존(0.25㎍/ml)을 함유하는 둘베코 개질된 이글 매질(DMEM) 이 있는 실험실로 수송한다. 활막을 가위로 절개하고 절단하며, L-글루타민(2mL), 열 비활성화된 송아지 태아 혈청(10% v/v)와 항생제를 함유하는 DMEM으로 이루어진 배양 매질 중의 외부 이식체로서 플레이팅한다. 배양물을 5% 이산화탄소의 습윤 대기 중에서 37℃ 에서 보관한다. 부착성 활막 세포를 2 내지 3주내에 외부 이식물로부터 성장시킨 다음, 트립신 처리하여 통과시킨다. 씨드 배양액을 일주일에 2회 공급하고 합류점에서 통과시킨다. 3 내지 8회 통과로부터 세포에 대하여 실험을 수행한다. 실험적 배양물을 2ml 배양액중의 7.5 X 103 세포/cm2의 밀도로 35mm 접시 속에 플레이팅한다. 배양물은 실험용으로 합류점 근처로 성장시키고, 2.3 ± 0.3 X 105 세포(평균 + S. E. M., n=3), 및 104 ± 13μg 단백질 (n=10)을 함유한다. 성장 매질을 주당 2회 대체시킨다.
실험적 처리. 실험적 처리 개시 1일 전에, 매질을 상기한 바와 같이 2% 열 비활성화 송아지 태아 혈청과 L-글루타민 및 항생제를 함유하는 DMEM으로 이루어진 실험적 성장 매질로 변화시켜 세포가 정지하도록 한다. 다음날, 배양물을 특정한 농도의 IL-1 또는 추가의 리간드를 나타낸 바와 같이 12 내지 24시간 간격으로 컨디셔닝된 성장 매질에 첨가함으로써 프라이밍한다. 일부 실험에서, 컨디셔닝된 성장 매질을 IL-1을 사용한 프라이밍 다음의 분석을 위해 수집한다. 이러한 프라이밍 간격 후에 급성 실험 처리를 다음과 같이 수행한다. 배양물을 인큐베이터로부터 제거하고 록케의 생리 완충액(Locke's physiological buffer)(LB 조성물 mM: NaCl, 154; KCI, 2.6; KH2PO4, 2.15; K2HPO4, 0.85; MgCl2, 5; CaCl2, 2; D-글루코스, 10; HEPES, 10; pH 7.4, BSA, 0.1% w/v) 2ml 분취량을 사용하여 3회 세척한 다음, 37˚욕조에서 10분 동안 특정한 리간드를 함유하는 LB 추가 분취량을 사용하여 평형시킨다. 이 용액을 흡입하여 제거하고 37˚욕조에서 특정한 시간 간격 동안 나타낸 리간드를 함유하는 새로운 완충제 분취량으로 대체시킨다. 약리학적 억제제는 전형적으로 10분간의 예비 배양 간격 동안 가하고, 효능제와 특정한 억제제는 3분 챌린지 간격 동안 존재한다.
프로스타글란딘 E2 의 측정. 나타낸 치료 프로토콜에 따라, 배양물 상등액 분취량(1ml)를 수집하고 액체 질소 속에서 신속하게 동결시킨다. 샘플을 가공될 때까지 -80˚에서 저장한다. 배양물 상등액의 분취량을 프로스타글란딘 E2 및 E1에 대한 동등한 반응성을 갖는 항체를 사용하여, 제조자(Sigma Chemical Co.)가 명시한 경쟁적 결합 방사면역 분석을 이용하여 분석한다. 정량화를 위하여, [3H] 프로스타글란딘 E2의 고정 농도를 사용하고 진정한 경쟁 프로스타글란딘 E2의 농도를 증가시키는 각각의 분석을 사용하여 표준 그래프를 작성한다.
IL -6의 측정. 사이토킨, IL-6의 생산은 또한 -80℃에서 동결 저장한 상등액 배양 매질의 분취량에서 측정한다. IL-6은 제조자(Pharmingen)가 기술한 바와 같은 알칼리성 포스파타제 검출법을 사용하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하고 각각의 순수한 재조합 사람 사이토킨을 사용하여 작성한 표준 그래프를 이용하여 정량화한다. 실험적 측정을 복제 배양물에서 수행한다.
[ 3 H] 티미딘 혼입 및 MTT 대한 분석
활막세포 라인을 [3H]티미딘(Kimball & Fisher, 1988)의 혼입으로서 측정한, IL-1에 대한 반응세서 증식하는 힘에 대하여 통상적으로 평가한다. 당해 제조에서, 최대로 효과적인 농도의 IL-1은 2% 혈청(데이타는 나타내지 않았음)중에 유지된 정지 배양물에 비하여 10 내지 20배로 [3H] 티미딘 혼입을 자극한다.
데이타 분석. 각각의 배양물로부터의 이중 분취액중에서 면역분석을 통상적으로 수행한다. 2중 또는 3중 배양물에서 실험적 측정을 수행한다. 각각의 실험을 2개 이상의 세포주에서 반복한다. 비선형 회귀 곡선 핏팅 및 통계학적 분석을 Graph-PAD Prism software (San Diego, CA)을 이용하여 수행한다. 각각의 실험을 2개 이상의 세포주에서 반복한다.
물질. 세포 배양물: 세포 배양물을 Sigma 또는 Gibco/BRL로부터 입수한다. Atlanta Biologicals Inc. (Norcross, GA)으로부터 송아지 태아 혈청을 입수한다. 약물: Genzyme (Cambridge, MA)로부터 재조합 사람 인터루킨-1을 입수한다. 케토프로펜은 Omeros Medical Systems, Inc. (Seattle, WA)에서 공급한다. 아미트립틸린, 포르스콜린, 5-하이드록시트립타민, 이소프로테레놀, 브래디키닌, 히스타민 및 프로스타글란딘 E2를 Sigma. Radiochemicals로부터 입수하고, [3H]프로스타글란딘 E2를American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO)로부터 입수한다. 다른 모든 시약은 표준 통상적인 공급자로부터 최고 순도로 입수한다.
사람 활막 세포에서의 PGE2 생산에 대한 GPCR 효능제, 히스타미 및 브래디키닌의 영향을 상이한 부류의 수용체를 통한 공통적인 약리학적 영향을 중재하는 효능제들 상이의 기본적인 상호작용을 평가하기 위한 IL-1에 대한 선행 자극과 함께 또는 자극 없이 측정한다. IL-1(10 U/ml)에 대한 배양된 사람 활막 섬유아세포를 밤새 노출시킨 결과, 지연(4시간)되고 유지된 다량 증진된 PGE2를 생성시키는데, 이는 배양물 상등액중의 증가된 PGE2로서 방사면역분서으로 측정할 수 있다. 진행된 IL-1 처리(16-24시간) 동안의 PGE2 생성의 급진적인 증가는 cPLA2 및 COX-2의 동시 상승 조절된 발현으로부터 발생하는 것으로 밝혀졌다(Crofford, 1984, Hulkower et al., 1984). 추가의 신속(분)하고 강한 PGE2가 생성되는 히스타민(100 yM) 또는 브래디키닌(1, uM)의 최대 유효 농도를 사용한 후속적인 챌린지에 반응하는 IL-1에 대한 밤샘 노출에 의해 배양물을 프라이밍한다. 히스타민 또는 브래디키닌 자극에 반응하는 PGE2 생성 가정 동안의 대표적인 데이카를 도 7에 나타내었다. 이러한 조건하에, 히스타민은 GPCR 효능제를 첨가하지 않은 IL-1 프라이밍된 세포에 비하여 PGE2 생산성을 5 내지 10배 증가시킨다. 브래디키닌은 10 내지 15배 증가된다. 짧은 2분간의 효능제 챌린지 동안에 생성된 PGE2의 절대량은 전체 18시간 IL-1 프라이밍 간격 동안 누적적으로 생산되는 양에 근접하거나 이를 초과한다. 이는 도 7에 관한 한 현저한데, 이는 PGE2 생산에서 히스타민 유도된 대부분의 파열이 초기 2분간내에 발생하는데, 그 이유는 최소의 추가 누적이 후속적인 60분 기간에 걸쳐 관찰되기 때문이다. 프라디키닌 자극된 PGE2 반응은 동일한 시간P 걸쳐 계속해서 (2배) 증가한다. IL-1 프라이밍의 부재하에, 순수한 활막 세포는 GPCR 효능제 단독을 사용한 자극에 반응하여 검출할만한 PGE2 생성이 나타나지 않는다. IL-1 프라이밍 조건하에, 히스타민 및 브래디키닌 둘 다는 상승적으로 강화된 PGE2를 방출한다.
골관절염 환자로부터의 배양된 활막 섬유아세포를 사용하여, 본 발명의 발명자는 PGE2 생성에 대한 전-염증성 사이토킨, IL-1과 약리학적으로 관련된 G-단백질 커플링화된 수용체 사이의 시간 의존성 상승적 상호작용을 밝혀내었고, 목적하는 치료제의 작용을 평가하였다. 세포내 칼슘, 이노지톨 인산염 및 PKC 시그날 전달 경로의 증가에 대하여 커플링화하는 내인성 활막 세포 수용체를 통해 작용하는 GPCR 효능제는 IL-1에 M이해 미리 프라이밍된 세포중의 PGE2 생성을 신속하고 현저하게 증폭시킨다. COX 억제제는 PGE의 장기간 축적과 효능제 유도된 신속한 파열 둘 다를 효과적으로 감소시킨다. 따라서, 세포내 신호 혈질전환을 위한 상이한 GPCR 및 IL-1 경로는 PGE2 반응의 신속하거나 느린 장기간 조절을 상승적으로 상호작용시킨다.
신속한 PGE2 파열을 일으키는 IL-1과 칼슘 조절성 GPCR 사이의 상승작용은 다수의 세포 형태에서 cPLA2의 척도인 아라키돈산 방출의 신속한 증대에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. COX-2 발현을 유도하는 것 외에도, IL-1은 cPLA2(Hulkower et al., 1994)의 발현을 증가시킨다. 이들 2개의 단백질은 함께 작용하여 COX-2에 유리 아라키돈산 기질을 제공한다. 아라키도네이트 방출을 활성화하기 위한 GPCR 리간드의 능력과 조합된, IL-1에 의해 유도된 주요한 에이코소노이드 대사 효소의 상향조절은 따라서 프로스타노이드 합성을 통한 전체 기질 플럭 스를 증가시키는 것으로 예측된다. cPLA2는 수용체 조절을 나타내는 작용 특성을 나타내며 에이코소노이드 생성 및 세포내 시그날 전달에 포함되는 경향이 있다. cPLA2는 완전 활성을 위한 칼슘 농도를 증가시킴으로써 활성화되며 브래디키닌 B2 및 히스타민 H1 수용체 활성화는 세포내 칼슘의 대사를 커플링화시키기 때문에, 이는 PGE2 생성에 있어서 신속한 효능제 자극된 파열을 조절하는 우세한 인자이다, 최종적으로, BE 또는 HI 수용체 활성화에 의해 방해되는 세포질 칼슘의 매우 신속하고 잠정적인 증가는 cPLA2 활성화, 아라키돈산 방출 및 관찰된 PGE2 파열로 공지된 역학과 유사하다.
실시예 7
사이클로옥시게나제 억제제에 의한 PGE2 파열의 억제
PGE2 형성을 감소시키기 위한 케토프로펜, 사이클로옥시게나제의 작용은 도 8에 나타낸 바와 같이, 진행된 노출(16시간) 동안 IL-1을 사용한 동시 배양 및 후속적인 GPCR 효능제 챌린지 간격 전에 짧게 예비 배양에 의해 측정한다. IL-1을 사용한 밤샘 프라이밍 동안에 특정 농도의 케토프로펜을 첨가하여 PGE2 형성을 제거하면, 비선형 회귀 분석(평균 SEM, n=4 활막세포주)으로 측정한 IC50 = 4.5 ±0.8nM이다. 사이클로옥시게나제 억제제 에토돌락 (IC50 = 15.2 ±4.6 nM, n=4), 케토롤락(2.2 ±0.4 nM, n=4), 및 인도메타신(3.2 ±1.5 nM, n=2)을 사용하여 유사한 측정(데이타는 나타내지 않았음)을 수행한다.
도 8은 또한 IL-1(10 U/ml)을 사용하여 밤새 프라이밍한 활막세포중의 100 μM 히스타민(IC50 = 3.4 ±0.2nM, n=3) 또는 1μM 브래디키닌(IC50 = 9.5 ±2.0 nM, n=3)에 의한 챌린지에 반응하는 효능제 유도돈 PGE2 파열의 케토프로펜 농도 의존성 억제를 나타낸다. 이러한 값은 PGE2의 IL-1 유도 동안에 케토프로펜 억제에 대하여 관찰된 것과 비교할만하다. 이러한 결과는 COX 억제제에 의한 억제의 개시가 COX 활성의 직접적인 가역적 억제와 동시에, CPCR 길할제 전에 10분 예비처리 간격내에 발생하며 프로스타노이드 조절 효소의 발현 수준의 변화에 연결된 메카니즘에 기인하지 않음을 입증한다. 이러한 즉각적인 억제 효과는 또한 관절경 외과 수술 동안에 관주 용액을 관절내로 국소 전달하는 경우에 이러한 약물에 대한 즉각적인 유효성에 대한 토대를 제공한다.
실시예 8
케토프로펜에 의한 IL -1 및 GPCR 효능제에 의한 IL -6 생성의 유도
IL-1를 사용한 자극에 반응하는 인터루킨-6의 역학을 기술한다. 활막 세포 배양물을 IL-1과 히스타민을 사용하여 지시된 처리에 노출시켜 이노지톨 트리포스페이트(InsP3)/단백질 키나제 C 경로 또는 이소프로테레놀을 통해 시그날 전달을 활성화하여 세포내 cAMP의 증가를 활성화시킨다. PGE2, IL-6 및 IL-8의 생산은 1, 2, 4, 6 및 24시간 처리에 따라 배양물 상등액중에서 측정한다. 당해 실험에서, 각각의 처리 기간을 별도의 배양액중에서 수행한다. 상기한 처리 방법에서, IL-6의 생산을 24시간 노출 다음에 IL-6에 의해 강하게 증가시키지만, IL-6이 조기 6시 간 간격내에 전혀 검출되지 않았으며, 히스타민 단독은 IL-6 생산을 자극하는데 실패하였다. IL-1은 또한 IL-8(2000 pg/ml)을 상당히 상승시키는데, 이는 처리 6시간에서 먼저 측정할 수 있고, IL-8 생산은 유지시키고 IL-1에 대한 24시간 노출에서 상당히 증가한다.
IL-1 및 GPCR 효능제에 의한 사이토킨 생성의 유도에 태한 케토프로펜의 영향을 조사한다. 또한, 프로토콜은 IL-1 일정 상태 유도에 대한 IL-1 농도 의존성의 영향을 시험한다. 활막 세포 배양물을 IL-1 및 GPCR 효능제의 나타낸 농도에 노출시킨다. 배양물 상등액을 회수하고 8시간 간격으로 동일한 효능제 첨가물을 함유하는 새로운 매질 분취량으로 대체시킨다. 상등액중의 PGE2, IL-6 및 IL-8을 기술된 바와 같이 분석한다.
IL-6 생산에 대한 데이타를 표 9에 나타내었는데, 이는 IL-1과 첨가된 리간드의 나타낸 농도의 존재하에 16시간(8 내지 16시간의 처리 간격에 상응함)에서 IL-6 생성을 나타낸다. 히스타민 또는 이소프로테레놀의 첨가는 IL-1 단독과 비교하여 IL-6 생산을 증진시키지 않는다. 1.0pg/ml IL-1에서, 케토프로펜은 IL-1 유도된 IL-6 생산의 억제에 비하여 부분(≤ 50%)를 일으킨다.
활막세포 배양물 시스템을 사용하여 관절경 외과 수술 동안 조직 손상의 결과로서 발생하는 손상을 포함하는, 괄절 조직의 파괴를 조절하는데 중요한 IL-1과 비-사이토킨 염증성 중재자 사이의 상승적 상호작용을 특성화한다. 결과는 다음과 같이 요약할 수 있다: (1) IL-1은 배양된 활막세포중의 PGE2, IL-6 및 IL-8을 크 게 증가시키는 반면, 정지 배양물은 검출가능한 양의 이들 중재자를 생성하지는 않는다; (2) PGE2의 유도는 가장 신속하게 일어나며 4시간에서 배양물 상등액, 6시간에서 IL-8 및 더 긴 간격에서 IL-6에 대하여 PGE2를 방출시킨다; (3) 모든 3개의 중재자는 24시간 IL-1 노출 다음에 배양물 상등액에서 상승된 채로 잔류한다.
PGE2 생산에 대한 이들의 작용과 대조적으로, GPCR 효능제는 IL-6 또는 IL-8의 IL-1 유도를 증진시키지 않으며 또한 IL-1을 사용한 프라이밍 다음에 IL-6 및 IL-8을 증가시키지 않는다. 케토프로펜이 IL-1에 반응하여 이들 사이토킨의 생산을 감소시키기 때무에 IL-6 및 IL-8의 IL-1 유도는 PGE2의 동반 유도에 의해 강화되는 것으로 보인다. 이 결과는 케토프로펜이 외과적 과정 동안에 관절로 운반되는 경우 치료학적 효과를 제공할 수 있음을 나타낸다.
이와 함께 고려하는 경우, 이들 결과는 IL-1을 사용한 전-염증성 자극에 의한 활막세포의 활성화와 특이적 G-커플링화 수용체 시그날 전달 경로 사이의 상호작용을 입증한다. 유사한 메카니즘이 연골 세포에서 작동하는 것으로 기대된다. 이러한 상호작용은 관절내의 오토코이드 또는 신경전달자 수용체 시스템으로부터의 입력에 좌우되는 활막 및 연골세포의 전-염증 반응을 통합하고 중재하는 수단을 제공한다. 이러한 발견은 칼슘 이동화, 포스포이니지타이드 가수분해 및 PKC 활성화를 통해 시그날 전달을 중재하고 관절경 수술에서 PGE2의 생산을 증가시키토록 커플링화하는 G-단백질 커플링화된 수용체의 억제를 목표로하는 치료학적 개입의 이론 적 및 잠재적인 임상적 이점을 강조한다. 활막세포 및 연골세포상의 이러한 수용체는 히스타민 H1, 브래디키닌, 물질 P, 5HT2 및 퓨린성 P2Y 수용체를 포함한다.
이제 본 발명은 예로써, 첨부된 도면을 참조로 하여 더욱 상세히 기술하고자 한다:
*도 1은 연골 대사에 있어 분자 표적 및 염증 중재자의 생성 및 이동을 가져오는 시그날 전달 정보의 흐름을 보여주는 개략도이다. 인터루킨-1(IL-1) 수용체 그룹 및 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 그룹과 같은 사이토킨 수용체, TGF-β 수용체 상위 그룹 및 인테그린을 포함하는 세포 표면 수용체의 몇몇 그룹을 통한 고유 신호의 통합은 본 발명의 용액중에 포함된 약물의 치료학적 표적인 단백질 분자(MAP 키나제, PKC, 타이로신 키나제, SH2 단백질, COX, PLA2 및 NF-6B)의 주요 그룹을 포함하는 일반적인 세포내 시그날 전달 경로에 집중되는 것으로 나타나있다. 이들 시그날 전달 경로의 활성화는 IL-1, TNF-α, IL-6, IL-8 및 스트로멜라이신(MMP-3)을 포함하는 다수의 유도성 유전자 산물과 염증 및/또는 연골 퇴화를 초래할 수 있는 기타 중재자[산화질소(NO) 및 PGE2)의 연골세포 발현 또는 매트릭스 분자의 합성과 연골세포 증식을 조절한다.
도 2는 연골 대사에 있어 분자 표적 및 염증 중재자의 생성과 이동을 가져오는 시그날 전달 정보의 흐름을 나타내는 활막형성 세포의 개략도이다. 인터루킨-1(IL-1) 수용체 그룹과 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 그룹을 포함하는 사이토킨 수용체, 브래디키닌, 히스타민과 세로토닌 아형을 포함하는 G-단백질이 커플링된 수용체 및 인테그린을 포함하는 사이토킨 수용체를 포함하는 세포 표면 수용체의 몇 몇 그룹을 통한 고유 신호의 통합은 본 발명의 용액중에 포함된 약물의 치료학적 표적인 단백질 분자((MAP 키나제, PCK, 타이로신 키나제, SH2 단백질, COX, PLA2 및 NF-6B)의 주요 그룹을 포함하는 일반적인 세포내 시그날 전달 경로에 집중되는 것으로 나타나 있다. 이들 시그날 전달 경로의 활성화는 염증 및/또는 연골 퇴화를 초래할 수 있는, IL-1, TNF-α, IL-6, IL-8 및 스트로멜라이신(MMP-3)을 포함하는 다수의 유도성 유전자 산물의 연골세포 발현을 조절한다.
도 3은 염증 및/또는 연골 퇴화를 초래하는 GPCR 활성화된 수용체 경로 및 전-염증 사이토킨 경로(pro-inflammation cytokine pathway) 사이의 "크로스톡(crosstalk)"에 관여하는 주요 시그날 전달 단백질을 포함하는 연골 세포 및 활막형성 세포 둘 다에 있어서의 일반적인 시그날 전달 경로의 도식이다.
도 4는 GPCR 활성화된 수용체 경로 및 전-염증 사이토킨 경로사이의 "크로스톡"에 관여하는 주요 시그날 전달 단백질을 포함하는 연골 세포와 활막형성 세포 둘 다에 있어서의 일반적인 시그날 전달 경로의 도식이다. 본 발명의 바람직한 연골보호 용액의 일부 약물의 특정의 분자 작용 부위는 확인되어 있다.
도 5는 연골의 동화 반응을 촉진하는 연골 세포 또는 활막형성 세포에 존재하는 분자 표적의 도식이다. 본 발명의 바람직한 연골 보호 용액중의 일부 약물의 특정 작용 부위는 확인되어 있다.
도 6은 연골에서 이화 반응을 촉진하는 연골 세포 또는 활막형성 세포에 존재하는 분자 표적의 도식이다. 본 발명의 연골보호 용액중의 일부 약물의 특정 작용 부위는 확인되어 있다.
도 7은 G-단백질 조절 효능제에 이어 인터루킨-1(IL-1, 10U/ml)을 사용한 밤새 프라이밍(priming)에 의한 활막 배양시 프로스타글란딘 E2의 생산을 그래프적으로 나타낸 것이다. 배양물은 지정된 시간동안 히스타민(100μM, 흰색막대) 또는 브래디키닌(1μM, 검은막대)로 관주시키고, 배양물 상층액으로 방출된 프로스타글란딘 E2를 실시예 6에 기술된 바와 같이 측정한다. 나타낸 값은 대표적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차이고, 관주하지 않은 배양물에 의한 기본적인 프로스타글란딘 E2 생성에 대하여 교정된다.
도 8은 케토프로펜에 의한 활막 배양에서 프로스타글란딘 E2 생성의 억제를 그래프적으로 나타낸 것이다. 당해 배양물은 지정된 농도의 케토프로펜의 존재("■"로 표시) 또는 부재("△" 또는 "∇"로 표시)하에서 IL-1(10U/ml)으로 밤새 프라이밍시킨다. 1일 후, 프로스타글란딘 E2를 케노프로펜으로 밤새 처리한 배양물 상층액에서 측정하고, 나머지 배양물을 세척하고, 규정된 농도의 케토프로펜으로 10분 동안 항온처리한 후 프로스타글란딘 E2 생성을 규정된 양의 케토프로펜의 지속적인 존재하에 히스타민(100μM, ▽) 또는 브래디키닌(1μM, △)을 사용한 연속 3분간의 챌린지에 대한 반응에서 측정한다. 나타낸 데이타는 각각의 효능제에 대해 수득된 최대 반응을 표준화한 것이며, 상이한 세포주에서 수행한 3회의 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 규정된 농도의 IL-1 및 첨가된 G-단백질이 커플링된 수용체 리간드의 존재하에 16시간 동안의 활막 배양에 의한 IL-6 생산에 있어 케토프로펜의 효과를 그래프적으로 나타낸 것이다. 배양물은 실험 성장 배지중의 0.75μM 케토프로펜 및 다음의 추가의 수용체 리간드, 즉, 1) 캠프 경로를 활성화시키기위한 1.0μM의 이소프로테레놀(ISO) 또는 2) IP3/칼슘 경로를 활성화시키기 위한 100μM의 히스타민(HIS)중 하나의 존재 및 부재하에서 규정된 농도(0.3, 1.0 및 3.0pg/ml)의 IL-1과 함께 16시간 동안 항온처리한다. 배양 상층액을 수집하고 동일한 효능제를 함유하는 새로운 배지 분취량으로 8시간 간격으로 교체한다. 처리후, 8시간 내지 16시간의 처리 간격에 상응하는 상층액 배지를 수집하여 IL-6에 대해 분석한다.

Claims (58)

  1. 치료학적 유효량의 제1 연골보호제 및 치료학적 유효량의 제2 연골 보호제를 포함하는 용액을 함유하고, 상기 제1 연골보호제가 동화성 연골 보호제이고 상기 제2 연골 보호제가 연골 이화작용 억제제이며, 상기 용액이 환자의 관절에 국소적으로 전달되어 관절에서 연골 이화작용 과정을 억제하고 연골 동화성 과정을 촉진시키는데 유효함을 특징으로 하는 약제의 제조 방법.
  2. 치료학적 유효량의 하나 이상의 동화성 연골보호제, 및 동통 또는 염증의 억제제인 하나 이상의 상이한 제제를 액체 담체중에 포함하는 용액을 포함하고, 상기 용액이 환자의 관절에 국소적으로 전달되어 관절에서 연골 퇴화를 억제하는데 효과적인 약제의 제조 방법.
  3. 치료학적 유효량의 제1 연골보호제, 및 제2 연골보호제, 동통 억제제, 염증 억제제 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료학적 유효량의 하나 이상의 제2 제제를 포함하는 용액을 포함하고, 상기 용액이 관절에 대한 외상 후 급성기내(acute phase)에 환자의 관절에 국소적으로 전달되어 관절에서 연골 퇴화를 억제하는데 효과적인 약제의 제조 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 용액을 외과 수술 절차동안 수술기주위적으로(perioperatively) 상기 관절에 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    외과 수술 절차 동안 상기 관절에 상기 용액을 관주하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 외과 수술은 관절경 외과 수술이고, 상기 용액은 그 외과 수술 절차 전에, 수술 절차 동안 또는 수술 절차 후에 관절에 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 외과 수술은 관절경 외과 수술이고, 상기 용액은 그 외과 수술 절차 전에, 수술 절차 동안 또는 수술 절차 후에 관절에 전달되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 용액의 충분한 양을 상기 외과 수술 절차 후에 환자의 관절에 전달하여 상기 수술 절차 후에 환자의 관절에 용액의 농축괴(bolus)가 잔류하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액을 관절내 주사에 의해 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 용액이 서방성 전달 운반체(vehicle)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 서방성 전달 운반체가 마이크로입자, 중심체, 나노입자, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물 및 무기 화합물로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액을 주입(infusion)에 의해 관절에 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 용액을 조절된 펌프 운반 시스템에 의해 관절로 전달하는 것을 특징으 로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 용액을 만성 연골 퇴화 질환의 치료를 위해 상기 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 용액을 상기 관절에서의 예상된 조직 외상에 앞서 상기 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 손상시 또는 직후에 상기 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 외상후 급성기내에, 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 용액을 외과 시술(surgery) 후 급성기 동안 관절로 전달하는 것을 특징 으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 외상 후 4주의 기간 내에 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 외상 후 아급성기(sub-acute phase) 내에 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 외상 후 만성기(chronic phase) 내에 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 3 항에 있어서,
    상기 제2 연골보호제가 연골 동화 과정을 촉진하는 인터루킨(IL) 작용제, 연골 동화 과정을 촉진하는 TGF-β 작용제 및 골 형성 단백질 작용제를 포함하는 형질전환 성장 인자-β 상과(superfamily) 구성원, 연골 동화 과정을 촉진하는 인슐린형 성장 인자, 및 연골 동화 과정을 촉진하는 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동화성 연골보호제임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 동화성 연골보호제가 연골 동화 과정을 촉진하는 인터루킨(IL) 작용제, 연골 동화 과정을 촉진하는 TGF-β 작용제 및 골 형성 단백질 작용제를 포함하는 형질전환 성장 인자-β 상과(superfamily) 구성원, 연골 동화 과정을 촉진하는 인슐린형 성장 인자, 및 연골 동화 과정을 촉진하는 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 동화성 연골보호제가 IL-4, IL-10, IL-13, TGFβ1, TGFβ2, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IGF-1, 및 bFGF 로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 3 항에 있어서, 연골보호제가 연골 이화작용을 억제하는 IL-1 수용체 길항제, 연골 이화작용을 억제하는 TNF-α 수용체 길항제, 연골 이화작용을 억제하는 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 MAP 키나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 산화질소 합성효소 억제제 및 연골 이화작용을 억제하는 핵 인자 κB 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 IL-1 수용체 길항 제, 연골 이화작용을 억제하는 TNF-α 수용체 길항제, 연골 이화작용을 억제하는 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 MAP 키나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 산화질소 합성효소 억제제 및 연골 이화작용을 억제하는 핵 인자 κB 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 3 항에 있어서, 상기 연골보호제가 연골 이화작용을 억제하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 인테그린 작용제 및 길항제를 포함하는 세포 유착 분자, 연골 이화작용을 억제하는 항-화학주성제(anti-chemotactic agent), 연골 이화작용을 억제하는 단백질 키나제 C 억제제 및 단백질 티로신 키나제 억제제를 포함하는 세포내 신호 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 세포내 단백질 티로신 포스파타제 조절제, 및 연골 이화작용을 억제하는 SH2 영역 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 연골 이화작용 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 인테그린 작용제 및 길항제를 포함하는 세포 유착 분자, 연골 이화작용을 억제하는 항-화학주성제(anti-chemotactic agent), 연골 이화작용을 억제하는 단백질 키나제 C 억제제 및 단백질 티로신 키나제 억제제를 포함하는 세포내 신호 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 세포내 단백 질 티로신 포스파타제 조절제, 및 연골 이화작용을 억제하는 SH2 영역 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 3 항에 있어서,
    상기 연골보호제가 연골 이화작용을 억제하는 가용성 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 가용성 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 가용성 수용체가 가용성 인터루킨-1 수용체 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    상기 가용성 수용체가 재조합 가용성 사람 IL-1 수용체, 가용성 종양 괴사 인자 수용체, 및 키메릭 rhTNFR:Fc로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서,
    상기 용액이 하나 이상의 동통 또는 염증 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 동통 또는 염증 억제제가 세로토닌 수용체 길항제, 세로토닌 수용체 작용제, 히스타민 수용체 길항제, 브래디키닌 수용체 길항제, 칼리크레인 억제제, 태키키닌 수용체 길항제, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 수용체 길항제, 인터루킨 수용체 길항제, 아라키돈산 대사물에 대한 합성 경로에서 활성인 효소 억제제, 프로스타노이드 수용체 길항제, 류코트리엔 수용체 길항제, 아편 수용체 작용제, 푸리노셉터 작용제 및 길항제, ATP-감응성 칼륨 채널 개방제 및 칼슘 채널 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 용액을 환자의 관절에 예방 목적으로 국소 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 4 항에 있어서,
    상기 용액의 수술기주의적인 전달이 수술 과정 후 용액의 전달 또는 수술 과정 전 용액의 전달 및 수술 과정 동안의 용액의 전달을 포함하는 것을 특징으로 하 는 방법.
  37. 제 4 항에 있어서,
    상기 용액의 수술기주의적인 전달이 수술 과정 후 용액의 전달 및 수술 과정 전 용액의 전달을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 4 항에 있어서,
    상기 용액의 수술기주의적인 적용이 수술 과정 전, 수술 과정 동안에 및 수술 과정 후에 용액의 적용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 관절에서 연골 퇴화 위험에 처한 환자를 동정한 후 당해 용액을 동정된 환자의 관철에 전달하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액 내의 제제를 상처에 국소적용하였을 때 일정한 수준의 억제 또는 치료 효과를 제공하기에 충분하고, 상처에 동일한 수준의 억제 또는 치료 효과를 달성하기에 요구되는 전신 적용시의 혈장 농도보다 낮은 혈장 농도를 야기시키는 농도 또는 용량으로 포함시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 동화성 연골 보호제인 제1 연골보호제를 하나 이상 포함하고, 연골 이화작용 억제제인 제2 연골보호제를 하나 이상 포함하며, 용액이 관절에 국소 전달되는 경우, 각 제제가 연골 이화작용 과정을 억제하고 연골 동화성 과정을 촉진시키는데 치료학적으로 유효한 용량 또는 농도로 용액 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 연골 퇴화 억제용 용액.
  42. 하나 이상의 동화성 연골 보호제, 및 동통 또는 염증의 억제제인 하나 이상의 상이한 제제를 포함하며, 용액이 관절에 국소 전달되는 경우, 각 제제가 연골 퇴화를 억제하는데 치료학적으로 유효한 용량 또는 농도로 용액 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 연골 퇴화 억제용 용액.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    상기 동화성 연골보호제가 연골 동화성 과정을 촉진하는 인터루킨(IL) 작용제, 연골 동화성 과정을 촉진하는 TGF-β 작용제 및 골 형성 단백질 작용제를 포함하는 형질전환 성장 인자-β 상과 구성원, 연골 동화성 과정을 촉진하는 인슐린형 성장 인자, 및 연골 동화성 과정을 촉진하는 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 동화성 연골보호제가 IL-4, IL-10, IL-13, TGFβ1, TGFβ2, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IGF-1, 및 bFGF 로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  45. 제 41 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 IL-1 수용체 길항제, 연골 이화작용을 억제하는 TNF-α 수용체 길항제, 연골 이화작용을 억제하는 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 MAP 키나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 산화질소 합성효소 억제제 및 연골 이화작용을 억제하는 핵 인자 κB 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  46. 제 41 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 인테그린 작용제 및 길항제를 포함하는 세포 유착 분자, 연골 이화작용을 억제하는 항-화학주성제, 연골 이화작용을 억제하는 단백질 키나제 C 억제제 및 단백질 티로신 키나제 억제제를 포함하는 세포내 신호 억제제, 연골 이화작용을 억제하는 세포내 단백질 티로신 포스파타제 조절제, 및 연골 이화작용을 억제하는 SH2 영역 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  47. 제 41 항에 있어서,
    상기 연골 이화작용 억제제가 연골 이화작용을 억제하는 가용성 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 가용성 수용체가 가용성 인터루킨-1 수용체 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  49. 제 47 항에 있어서,
    상기 가용성 수용체가 재조합 가용성 사람 IL-1 수용체, 가용성 종양 괴사 인자 수용체 및 키메릭 rhTNFR:Fc로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  50. 제 41 항에 있어서,
    상기 용액이 하나 이상의 동통 또는 염증 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용액.
  51. 제 42 항 또는 제 50 항에 있어서,
    상기 동통 또는 염증 억제제가 세로토닌 수용체 길항제, 세로토닌 수용체 작용제, 히스타민 수용체 길항제, 브래디키닌 수용체 길항제, 칼리크레인 억제제, 태키키닌 수용체 길항제, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 수용체 길항제, 인터 루킨 수용체 길항제, 아라키돈산 대사물에 대한 합성 경로에서 활성인 효소 억제제, 프로스타노이드 수용체 길항제, 류코트리엔 수용체 길항제, 아편 수용체 작용제, 푸리노셉터 작용제 및 길항제, ATP-감응성 칼륨 채널 개방제 및 칼슘 채널 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  52. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    상기 용액이 서방성 전달 운반체를 함유하는 것을 특징으로 하는 용액.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 서방성 전달 운반체가 마이크로입자, 중심체, 나노입자, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물 및 무기 화합물로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 용액.
  54. 제 41 항에 있어서,
    상기 용액 내의 각각의 제제를 상처에 국소적용하였을 때 일정한 수준의 억제 또는 치료 효과를 제공하기에 충분하고, 상처에 동일한 수준의 억제 또는 치료 효과를 달성하기에 요구되는 전신 적용시의 혈장 농도보다 낮은 혈장 농도를 야기시키는 농도 또는 용량으로 포함시키는 것을 특징으로 하는 용액.
  55. 제 3 항에 있어서,
    상기 용액을 관절에 대한 외상후 4주 이내에, 관절로 전달하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 23 항에 있어서,
    상기 동화성 연골보호제가 IL-4, IL-10, IL-13, TGFβ1, TGFβ2, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IGF-1, 및 bFGF 로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 33 항에 있어서,
    상기 동통 또는 염증 억제제가 세로토닌 수용체 길항제, 세로토닌 수용체 작용제, 히스타민 수용체 길항제, 브래디키닌 수용체 길항제, 칼리크레인 억제제, 태키키닌 수용체 길항제, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 수용체 길항제, 인터루킨 수용체 길항제, 아라키돈산 대사물에 대한 합성 경로에서 활성인 효소 억제제, 프로스타노이드 수용체 길항제, 류코트리엔 수용체 길항제, 아편 수용체 작용제, 푸리노셉터 작용제 및 길항제, ATP-감응성 칼륨 채널 개방제 및 칼슘 채널 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    상기 용액 내의 각각의 제제를 관절에 국소적용하였을 때 일정한 수준의 억제 또는 치료 효과를 제공하기에 충분하고, 관절에 동일한 수준의 억제 또는 치료 효과를 달성하기에 요구되는 전신 적용시의 혈장 농도보다 낮은 혈장 농도를 야기시키는 농도 또는 용량으로 포함시키는 것을 특징으로 하는 용액.
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