KR20080099274A - 항-ｅｐｈｒｉｎｂ２ 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-EphrinB2 항체, 및 상기 항체를 포함하는 조성물, 및 상기 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
항-EphrinB2 항체, EphrinB2, 혈관신생 억제, 항-혈관신생제

Description

항-ＥＰＨＲＩＮＢ２ 항체 및 그의 사용 방법{ANTI-EPHRINB2 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME}
관련 출원에 대한 상호-참고
본 출원은 35 USC §119하에 2006년 1월 20일 출원된 미국 가출원 번호 제60/760,891호 (본원에서 그의 전문이 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 항-EphrinB2 항체, 및 그의 용도에 관한 것이다.
혈관 공급의 발달은 많은 생리학적 및 병리학적 과정의 기본 요건이다. 활발하게 성장하는 조직, 예를 들어, 배아 및 종양은 적절한 혈액 공급을 필요로 한다. 이들은 혈관신생으로 불리는 과정을 통해 새로운 혈관 형성을 촉진시키는 전-혈관신생 인자를 생산함으로써 상기 필요를 만족시킨다. 혈관 형성은 하기 단계 모두를 또는 다수를 포함하는 것으로, 복잡하지만 규칙적인 생물학적 사건이다: a) 내피 세포(EC)가 기존 EC로부터 증식하거나 기원 세포로부터 분화하고; b) EC가 이동하고 융합하여 코드-유사 구조를 형성하고; c) 이어서 혈관 코드는 관생성을 거쳐 중심 관강을 갖는 관을 형성하고; d) 기존 코드 또는 관이 싹을 내밀어 2차 관 을 형성하고; e) 원시 혈관총은 추가의 재형성 및 재성형을 거치고; f) 주변-내피 세포가 동원되어 내피관을 둘러싸, 관에 유지 및 조절 기능을 제공하며; 상기 세포는 작은 모세혈관에 대한 혈관주위세포, 보다 큰 혈관에 대해 평활근 세포 및 심장에서 심근 세포를 포함한다 (문헌 [Hanahan, Science 277:48-50 (1997)]; [Hogan ＆ Kolodziej, Nat . Rev . Genet. 3:513-23 (2002)]; [Lubarsky ＆ Krasnow, Cell 112:19-28 (2003)]).
현재 혈관신생이 다양한 질병의 발병기전에서 관련됨은 잘 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이, 아테롬성 동맥경화증, 수정체후 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예를 들면, 증식 망막병증, 예를 들어, 당뇨 망막병증, 연령관련 황반 변성(AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 다른 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염 및 건선을 포함한다 (문헌 [Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu . Rev . Physiol. 53:217-39 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases," In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710]).
종양 성장의 경우에, 혈관신생은 과다형성에서 신생물로의 이행, 및 종양의 성장 및 전이를 위한 자양분을 공급하는데 중대한 것으로 보인다 (문헌 [Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]). 신생혈관형성은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 이익과 증식 자율성을 획득하도록 한다. 종양은 보통 이용가능한 모세혈관층으로부터의 거리 때문에 수 세제곱밀리미터의 크기로만 증식할 수 있는 단일 이상 세포로서 시작하고, 장시간 동안 추가의 성장 및 씨딩 없이 '휴면상태'로 머무를 수 있다. 이어서 일부 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시키고, 이는 증식하여 새로운 모세혈관으로 성숙한다. 이들 새로 형성된 혈관은 1차 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만 아니라, 전이성 종양 세포의 씨딩 및 재콜로니형성을 허용한다. 따라서, 종양 절편 내의 미세혈관의 밀도와 유방암 및 일부 다른 종양에서 환자 생존율 사이에 상호관련이 관찰되었다 (문헌 [Weidner et al., N. Engl . J. Med . 324:1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992)]). 혈관신생 전환을 제어하는 정확한 기전은 잘 알려지지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 많은 혈관신생 자극제와 억제제의 순수한 균형으로부터 생성되는 것으로 생각된다 (문헌 [Folkman, Nat . Med . 1(1):27-31 (1995)]).
혈관 발달의 과정은 엄밀하게 조절된다. 지금까지, 대부분 주변 세포에 의해 생산된 분비형 인자인 상당한 수의 분자가 EC 분화, 증식, 이동 및 코드 유사 구조로의 융합을 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관신생을 자극하고, 혈관 투과성을 유도하는데 관여하는 핵심 인자로서 확인되었다 (문헌 [Ferrara et al., Endocr . Rev. 18:4-25 (1997)]. 심지어 단일 VEGF 대립유전자의 상실이 배아 치사를 일으킨다는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에서 상기 인자에 의한 대체불가능한 역할을 지적한다. 또한, VEGF는 종양 및 안내 질병과 관련된 신생혈관형성의 주요 매개자인 것으로 나타났다 (문헌 [Ferrara et al., Endocr . Rev. 상기 문헌]). VEGF mRNA는 검사된 대다수의 인간 종양에서 과다발현된다 (문헌 [Berkman et al., J. Clin . Invest. 91:153-59 (1993)]; [Brown et al., Human Pathol . 26:86-91 (1995)]; [Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993)]; [Mattern et al., Brit . J. Cancer 73:931-34 (1996)]; [Dvorak et al., Am . J. Pathol. 146:1029-39 (1995)]).
또한, 안구액내 VEGF의 농도 수준은 당뇨 및 다른 허혈-관련 망막병증의 환자에서 혈관의 활발한 증식의 존재와 고도로 상호관련된다 (문헌 [Aiello et al., N. Engl . J. Med. 331:1480-87 (1994))]). 또한, 연구에 의해 AMD 환자에서 맥락 신생혈관막에서 VEGF의 편재화가 증명되었다 (문헌 [Lopez et al., Invest . Ophthalmol. Vis . Sci. 37:855-68 (1996)]).
항-VEGF 중화 항체는 누드(nude) 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하고 (문헌 [Kim et al., Nature 362:841-44 (1993)]; [Warren et al, J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995)]; [Borgstroem et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996)]; [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)]), 또한 허혈 망막 질병의 모델에서 안내 혈관신생을 억제한다 (문헌 [Adamis et al., Arch . Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]). 그러므로, 항-VEGF 단일클론 항체 또는 다른 VEGF 작용의 억제제는 종양 및 다양한 안내 신생혈관 질병의 치료를 위한 유망한 후보물이다. 상기 항체는 예를 들어, EP 817,648 (1998년 1월 14일자 공개); 및 W098/45331과 W098/45332 (둘 모두 1998년 10월 15일자 공개)에 기재되어 있다. 항-VEGF 항체의 하나인 베바시주맙 (bevacizumab)은 전이성 직장결장암(CRC)을 치료하기 위한 화학치료 요법과의 조합 사용에 대하여 FDA에서 승인을 받았다. 다양한 암 적응증 치 료를 위해 베바시주맙은 현재 진행 중인 많은 임상 시험에서 연구되고 있다.
EphrinB2 리간드 ("Ephrin-B2" 또는 "EphrinB2")는 인간 게놈에서 거대한 티로신 키나제 수용체 계열을 구성하는 에프린 리간드 계열의 구성원이다 (문헌 [Dodelet, Oncogene, 19: 5614-5619, 2000]에서 검토). 인간 에프린 리간드 티로신 키나제는 서열 동정에 의해 Eph 또는 Eph 수용체로서 명명되는 상응하는 A형 및 B형 수용체를 갖는 A 부류 및 B 부류로 분류된다. 신호 전달은, 수용체 티로신 키나제가 리간드에 의해 활성화되는 전방 방식으로 이루어질 수 있고, 신호 전달은, 막횡단 에프린B 리간드가 수용체와의 상호작용에 의해 활성화되는 역 방식으로도 이루어질 수 있다. Eph 수용체 리간드 상호작용은 축색 돌기 가이던스, 조직 경계 형성, 액포 형성, 및 세포 이동을 비롯한, 매우 다양한 생물학적 기능에 연루되어 있다 (문헌 [Kullander et al. Nat . Rev . Mol . Cell . Biol., 3: 475-486, 2002]; [Cheng et al. Cytokine Growth Factor Rev., 13: 75-85, 2002]; [Coulthard et al. Int . J. Dev . Biol., 46: 375-384, 2002]).
치료제로서, 개발에 최적인 임상적 특징을 갖는 제제가 계속적으로 요구되고 있다는 것은 분명하다. 본원에 기술된 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고, 그외 다른 이점을 제공한다.
특허 출원 및 간행물을 비롯한 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그의 전문이 참고로 인용된다.
발명의 요약
본 발명은 부분적으로 다양한 EphrinB2 결합 물질 (예로서, 항체, 및 그의 단편)의 동정에 기초한다. EphrinB2는 중요하고 이로운 치료제로서 제시되고, 본 발명은 EphrinB2 결합에 기초한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 EphrinB2 결합 물질은 EphrinB2 리간드 경로의 발현 및/또는 활성과 관련된 병적 상태를 표적화하는데 사용하기 위한 것으로서 중요한 치료제 및 진단제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 EphrinB2 결합과 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조 물품을 제공한다.
본 발명은 EphrinB2에 결합하는 (예로서, 특이적으로 결합하는) 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 단리된 항-EphrinB2 항체를 제공하는데, 여기서, 상기 항체의 전장 IgG 형태는 30 pm 또는 그 보다 우수한 결합 친화도로 인간 EphrinB2에 특이적으로 결합하는 것이다. 당업계에 널리 확립된 바와 같이, 그의 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도는 임의의 다양한 분석법을 이용하여 측정될 수 있으며, 다양한 정량적인 값의 용어로 표현된다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 결합 친화도는 Kd 값으로 표현되고, (예를 들어, 최소화된 결합력 효과를 갖는) 고유 결합 친화도를 반영한다. 일반적으로 및 바람직하게, 결합 친화도는 무세포 환경에서든 세포-결합된 환경에서든 시험관내에서 측정된다. 예를 들어, 비아코어(Biacore), 방사성 면역분석법(RIA) 및 ELISA를 비롯한 본원에 기재된 것을 포함하는, 당업계에 공지된 임의 다수의 분석법을 이용하여 결합 친화도 측정치를 수득할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2의 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 결합 영역에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2 세포외 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 구성되거나, 또는 본질적으로 상기 도메인으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2 결합에 대하여 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3)와 경쟁하는 단리된 항-EphrinB2 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2 활성을 억제, 감소 및/또는 차단시키는 단리된 항-EphrinB2 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, EphrinB2 자가인산화는 억제, 감소 및/또는 차단된다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-EphrinB2 항체는
(a) (i) RASQDVSTAVA (서열 6)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1,
(ii) SASFLYS (서열 8)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2,
(iii) EQTDSTPPT (서열 12)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3,
(iv) GFTVSSGWIH (서열 2)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1,
(v) AVIFHNKGGTDYADSVKG (서열 4)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) ARTSAWAQLGAMDY (서열 5)인 서열 F1-F14을 포함하는 HVR-H3
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 초가변 영역(HVR) 서열; 및
(b) 서열 1-12에 도시한 서열 중 1개 이상의 잔기가 변형된 서열을 포함하는 1개 이상의 변이체 HVR을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하며, 여기서 각 HVR은 서열 1-12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 상기 서열로 구성되거나, 또는 본질적으로 상기 서열로 구성되고, 여기서, 서열 6 또는 7은 HVR-L1에 상응하고, 서열 8 또는 9는 HVR-L2에 상응하고, 서열 10, 11 또는 12는 HVR-L3에 상응하고, 서열 1 또는 2는 HVR-H1에 상응하고, 서열 3 또는 4는 HVR-H2에 상응하고, 서열 5는 HVR-H3에 상응하는 것인 항체를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 6, 8, 10, 1, 3, 5를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 7, 9, 11, 1, 3, 5를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 6, 8, 12, 2, 4, 5를 포함한다.
본 발명의 항체에서 변이체 HVR은 HVR 내에 하나 이상의 (예로서, 2, 3, 4, 5개 이상) 잔기 변형을 가질 수 있다.
하나의 실시양태에서, HVR-L1 변이체는 하기 위치: A7 (S 또는 D); A8 (T 또는 S); A9 (A 또는 S); 및 A10 (V 또는 L)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4 개)의 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, HVR-L2 변이체는 하기 위치: B1 (S 또는 A); B4 (F 또는 N); 및 B6 (Y 또는 E)의 임의 조합으로 1-3개 (1, 2 또는 3개)의 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, HVR-L3 변이체는 하기 위치: C1 (Q 또는 E); C3 (S 또는 T); C4 (Y 또는 D); C5 (T, D 또는 S); C6 (T 또는 N); 및 C8 (P 또는 F)의 임의 조합으로 1-6개 (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, HVR-H1 변이체는 하기 위치: D4 (I 또는 V); D5 (T 또는 S); D6 (G 또는 S); 및 D7 (S 또는 G)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4개)의 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, HVR-H2 변이체는 하기 위치: E4 (Y 또는 F); E5 (P 또는 H); E7 (N 또는 K); 및 E9 (A 또는 G)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4개)의 치환을 포함한다.
하나의 실시양태에서, HVR-H3 변이체는 하기 위치: F1 (A); F2 (R); F3 (T); F4 (S); F5 (A); F6 (W); F7 (A); F8 (Q); F9 (L); F10 (G); F11 (A); F12 (M); F13 (D) 및 F14 (Y)에 1-14개의 치환을 포함한다. 각 위치 다음에 오는 괄호 안의 문자(들)는 예시적인 치환 (즉, 대체) 아미노산을 나타내고; 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술된 것과 관련하여 기타 아미노산의 치환 아미노산으로서의 적합성은 당업계에 공지된 기법 및/또는 본원에 기술된 기법을 사용하여 통상적으로 평가될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 서열 1 또는 2의 서열을 포함하는 HVR-H1 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 서열 3 또는 4의 서열을 포함하는 HVR-H2 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 서열 5의 서열을 포함하는 HVR-H3 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열 6 또는 7의 서열을 포함하는 HVR-L1 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열 8 또는 9의 서열을 포함하는 HVR-L2 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 서열 10, 11 또는 12의 서열을 포함하는 HVR-L3 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하기:
(i) 서열 2의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
(ii) 서열 4의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
(iii) 서열 5의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 서열:
(i) 서열 6의 서열을 포함하는 HVR-L1 서열;
(ii) 서열 8의 서열을 포함하는 HVR-L2 서열;
(iii) 서열 12의 서열을 포함하는 HVR-L3 서열 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 항체를 제공한다.
서열 1-12의 아미노산 서열은 도 1에 나타낸 개개의 HVR (즉, H1, H2 또는 H3)과 관련하여 넘버링된 것이며, 상기 넘버링은 하기 기술하는 바와 같은 카바트(Kabat) 넘버링 체계와 일치한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 도 1에 도시한 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 도 1에 도시한 경쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 항체의 일부 실시양태는 하기 서열 13에 도시된, 인간화된 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (허셉틴(HERCEPTIN)®, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)) (미국 특허 번호 제6,407,213호 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에서도 언급됨)의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
Figure 112008058923458-PCT00001
하나의 실시양태에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 30번, 66번 및 91번 위치 (상기에서 각각 굵은/이탤릭체로 표시되어 있는 Asn, Arg 및 His) 중 하나 이상에서 변형되어 있다. 하나의 실시양태에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 30번 위치에 Ser을, 66번 위치에 Gly를, 및 91번 위치에 Ser을 포함한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 14에 도시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
Figure 112008058923458-PCT00002
huMAb4D5-8에 대하여 치환된 잔기는 상기에서 굵은/이탤릭체로 표시되어 있다.
본 발명의 항체는, EphrinB2에 대한 결합 활성이 실질적으로 유지되는 경우라면, 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 이들 항체의 하나의 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 71번, 73번 및/또는 78번 위치에 치환을 포함한다. 이들 항체의 일부 실시양태에서, 71번 위치는 A이고, 73번 위치는 T이고/거나 78번 위치는 A이다. 하나의 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (허셉틴®, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.) (미국 특허 번호 제6,407,213호 ＆ 제5,821,337호, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에서도 언급되어 있음)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이들 항체는 추가로 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이들 항체는 미국 특허 번호 제6,407,213호 ＆ 제5,821,337호에 기재된 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (허셉틴®, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테 크, 인크.) (미국 특허 번호 제6,407,213호 ＆ 제5,821,337호, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에서도 언급되어 있음)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및/또는 37의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 2, 4 및/또는 5인 것인, 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 38, 39, 40 및/또는 41의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열이 각각 서열 6, 8 및/또는 12인 것인, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 42, 43, 44 및/또는 45의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 1, 3 및/또는 5인 것인, 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 15, 16, 17 및/또는 18의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열이 각각 서열 6, 8 및/또는 10인 것인, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 42, 43, 47 및 45의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열이 각각 서열 1, 3 및/또는 5인 것인, 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 프레임워크 서열이 서열 15, 16, 47 및 18의 서열을 포함하고, HVR L1, L2 및 L3 서열이 각각 서열 7, 9 및/또는 11인 것인, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 원하는 표적 결합 친화도를 얻기 위 해 친화도 성숙된 것이다. 일례로, 본 발명의 친화도 성숙된 항체는 아미노산 위치 H29, H30, H31, H32, H52, H52a, H54, H56, L30, L31, L32, L33, L50, L53, L55, L89, L91, L92, L93, L94 및 L96 중 하나 이상에 치환을 포함한다. 일례로, 본 발명의 친화도 성숙된 항체는 하기 치환: (a) 중쇄에서, V29I, S30T, S31G, G32S, F52Y, H52aP, K54N 및 G56A, 또는 (b) 경쇄에서, S30D, T31S, A32S, V33L, S50A, F53N, Y55E, E89Q, T91S, D92Y, S93D 또는 T, T94N, 및 P96F 중 하나 이상을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 49의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 48의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 49의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 48의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 51의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 50의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 51의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 50의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 53의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 53의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 52의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2에 대한 결합에 대하여 상기-언급한 항체들 중 어느 것과 경쟁하는 항체를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 EphrinB2 상의, 상기-언급한 항체들 중 어느 것과 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 그리고 본원 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 구분짓는 아미노산 위치/경계는 문맥상, 그리고 당업계에 공지된 다양한 정의 (하기 기술되는 바와 같은 정의)에 따라 달라질 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는 하나의 조건 세트하에서는 초가변 영역 영역내 존재하는 것으로 간주될 수 있지만, 다른 조건 세트하에서는 초가변 영역 밖에 존재하는 것으로 간주될 수 있다는 점에서 이는 하이브리드 초가변 위치로서 고찰될 수 있다. 이들 위치 중 하나 이상은 또한 확장된 초가변 영역 (하기에 추가로 정의됨)에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 다중클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 또는 scFv이다.
하나의 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종성의 비인간, 인간 또는 인간화된 서열 (예컨대, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비인간 공여자로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 하나의 실시양태에서, 비인간 공여자는 마우스이다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 서열은 합성, 예컨대, 돌연변이유발 (예: 파지 디스플레이 스크리닝 등)에 의해 수득된 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄에 융합된다. 하나의 실시양태에서, 뮤린 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
본 발명의 인간화된 항체는 FR에서의 아미노산 치환 및 이식된 CDR에서 변화를 갖는 친화도 성숙 변이체를 갖는 것들을 포함한다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여자 또는 수용자 항체에 존재하는 것으로만 한정되는 것은 아니다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 추가로 향상된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및 B-세포 사멸을 포함한 개선된 효과기 기능을 일으키는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 변화를 포함한다. 본 발명의 기타 항체는 안정성을 개선시키는 특이적 변화를 갖는 것들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 예컨대, 감소된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및/또는 감소된 B-세포 사멸과 같은 감소된 효과기 기능을 일으키는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 자연 살해(NK) 세포 상의 인간 보체 인자 C1q 및/또는 인간 Fc 수용체에 대한 결합 감소 (예로서, 결합 부재)를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 FcγRI, FcγRIIA, 및/또는 FcγRIIIA에 대한 결합 감소 (예로 서, 결합 부재)를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG 부류 (예컨대, IgGl 또는 IgG4)의 것이며, E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329 (EU 인덱스에 따른 넘버링)에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체가 돌연변이 L234A/L235A 또는 D265A/N297A를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 항원 결합 서열 중 임의의 것을 포함하며, EphrinB2에 특이적으로 결합하는 항-EphrinB2 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 항체는 EphrinB2에 결합하고 (예로서, 특이적으로 결합하고), 일부 실시양태에서는, EphrinB2 활성화, EphrinB2 하류 분자 신호 전달, EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 활성화, EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 하류 분자 신호 전달, EphrinB2에 대한 EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 결합의 파괴, EphrinB2 인산화 및/또는 EphrinB2 다량체화, 및/또는EphrinB2-결합 Eph 수용체 인산화, 및/또는 임의의 생물학적으로 관련된 EphrinB2 및/또는 EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 생물학적 경로의 파괴, 및/또는 종양, 세포 증식 질병 또는 암 치료 및/또는 예방; 및/또는 EphrinB2 발현 및/또는 활성 (예로서, EphrinB2 발현 및/또는 활성의 증가)과 관련된 질병 치료 또는 예방을 포함하나, 이에 한정되지 않는, EphrinB2-관련 효과들 중 하나 이상의 측면을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 EphrinB2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체가 EphrinB2 세포외 도메인(ECD)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체가 EphrinB2 세포외 도메인으로 구성되거나, 본질적으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체가 약 30 pm 또는 그보다 강한 Kd로 EphrinB2에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생체내 또는 시험관내에서 EphrinB2 활성을 감소, 억제 및/또는 차단시킨다. 일부 실시양태에서, 항체가 EphrinB2 자가인산화를 감소, 억제 및/또는 차단시킨다. 일부 실시양태에서, 항체가 EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예를 들어, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3)와의 결합에 대하여 경쟁한다 (감소시키고/거나 차단시킨다).
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-EphrinB2 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 담체는 제약상 허용되는 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세 포를 제공한다. 벡터는 임의 유형, 예를 들어, 재조합 벡터, 예로서, 발현 벡터일 수 있다. 다양한 숙주 세포 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)이다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예로서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항체 (또는 그의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-EphrinB2 항체 (본원에서 정의된 바와 같이, 전장의 항체 및 그의 단편을 포함한다)를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 하나 이상의 본 발명의 항-EphrinB2 항체를 포함하는 것인 제조 물품을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 추가로 담체를 포함하며, 이는 일부 실시양태에서는 제약상 허용되는 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 제조 물품은 추가로 대상체에게 조성물 (예컨대, 항체) 투여에 관한 설명서 (예로서, 본원에 기술된 임의 방법에 관한 설명서)를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하나 이상의, 본 발명의 항-EphrinB2 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 완충액은 제약상 허용되는 것이다. 하나 의 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 추가로 담체를 포함하며, 이는 일부 실시양태에서는 제약상 허용되는 것이다. 하나의 실시양태에서, 키트는 추가로 대상체에게 조성물 (예컨대, 항체) 투여에 관한 설명서를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 항-EphrinB2 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질병은 혈관신생과 관련된 병적 상태이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 혈관신생 억제용 약제의 제조에 있어 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질병은 혈관신생과 관련된 병적 상태이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질병은 혈관신생과 관련된 병적 상태이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이 다. 일부 실시양태에서, 질병은 혈관신생과 관련된 병적 상태이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 제조 물품의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질병, 예로서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식 질병 치료 요법용 및/또는 예방 요법용 약제의 제조에 있어 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 질병은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질병은 혈관신생과 관련된 병적 상태이다.
본 발명은 EphrinB2의 발현 및/또는 활성, 예로서, 증가 또는 감소된 발현 및/또는 활성, 또는 바람직하지 못한 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태를 조정하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, EphrinB2의 증가된 발현 및/또는 활성과 관련된 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 세포 (예로서, 암 또는 종양 세포)를 사멸시키는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 종양 또는 암 성장을 감소, 억제, 차단 또는 방지하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 신경병증 또는 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하거나, 손상된 신경 세포를 수복시키는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 뉴런의 발생, 증식, 유지 또는 재생을 촉진시키는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생 부위는 종양 또는 암이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병이다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 안구내 신생혈관 질환이다.
본 발명의 방법은 임의의 적합한 병적 상태에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 질병은 본원에 기술되어 있고, 소세포 폐암, 신경모세포종, 흑색종, 유방암종, 위암, 직장결장암(CRC), 및 간세포암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 유방암 세포, 직장결장암 세포, 폐암 세포, 유두암종 세포, 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 두경부암 세포, 중추신경계암 세포, 골육종 세포, 신장암종 세포, 간세포암종 세포, 방광암 세포, 위암종 세포, 두경부 편평세포암종 세포, 흑색종 세포, 백혈병 세포, 및 결장 샘종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 과증식성 및/또는 과다형성성 세포이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 이형성 세포이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다.
본 발명의 방법은 추가의 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 하나의 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예컨대, 암 세포의 경우)을 방사선 요법 또는 화학요법제에 노출시키는 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 다른 치료제 (예로서, 항-혈관신생제)와 조합하여 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 항-EphrinB2 항체(들)는 각종 신생물성 또는 비-신생물성 상태를 치료하기 위하여 항암제 또는 항-혈관신생제와 조합되어 사용된다. 하나의 실시양태에서, 신생물성 또는 비-신생물성 상태는 혈관신생과 관련된 병적 상태이다. 일부 실시양태에서, 다른 치료제는 항-혈관신생제, 항-신생물성 제제, 및/또는 화학요법제이다.
항-EphrinB2 항체는 연속적으로 또는 동일한 조성물 또는 별개의 조성물로 상기 목적에 효과적인 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 항-EphrinB2 항체 및 다른 치료제 (예컨대, 항암제, 항-혈관신생제)를 투여하는 것은 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용함으로써 동시에 예컨대, 단일 조성물로서, 또는 2개 이상의 별개의 조성물로서 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 투여는 순차적으로 임의 순서대로 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 본 단계는 순차적으로 및 동시에, 이 둘 모두의 조합으로 임의 순서대로 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 조성물 투여 사이의 시간 간격은 몇 분 내지 몇 일부터 몇 주 내지 몇 개월 범위일 수 있다. 예를 들어, 먼저 항암제를 투여한 후에 항-EphrinB2 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여할 수 있거나, 항-EphrinB2 항체를 먼저 투여하는 것도 고려된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 항-EphrinB2 항체를 투여한 후, 항-혈관신생제 (예로서, 항-VEGF 항체, 예로서, 베바시주맙)를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 조성물 투여 사이의 시간 간격은 몇 분 내지 몇 일부터 몇 주 내지 몇 개월 범위일 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 유효량의 항-EphrinB2 항체 및/또는 혈관신생 억제제(들) 및 하나 이상의 화학요법제를 투여하여 질병 (예로서, 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 각종 화학요법제가 본 발명의 조합 치료법에 사용될 수 있다. 고려되는 화학요법제의 일례로는 비제한적인 화학요법제를 본원 하기의 "정의"에서 제공한다. 항-EphrinB2 항체 및 화학요법제를 투여하는 것은 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용함으로써 동시에 예컨대, 단일 조성물로서, 또는 2개 이상의 별개의 조성물로서 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추 가로, 투여는 순차적으로 임의 순서대로 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 본 단계는 순차적으로 및 동시에, 이 둘 모두의 조합으로 임의 순서대로 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 조성물 투여 사이의 시간 간격은 몇 분 내지 몇 일부터 몇 주 내지 몇 개월 범위일 수 있다. 예를 들어, 먼저 화학요법제를 투여한 후에 항-EphrinB2 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여할 수 있거나, 항-EphrinB2 항체를 먼저 투여하는 것도 고려된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 항-EphrinB2 항체를 투여한 후, 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 조성물 투여 사이의 시간 간격은 몇 분 내지 몇 일부터 몇 주 내지 몇 개월 범위일 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 항-혈관신생제와 조합하여 투여함으로써 항-혈관신생제 억제 활성을 증진시키는 것을 포함하는, 혈관신생과 관련된 병적 상태를 앓는 대상체에서 항-혈관신생제의 효능을 증진시키는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 억제 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장은 환자에게 하나 이상의 현재 이용가능한 요법 (예를 들면, 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 생물학적 요법/면역요법, 항-VEGF 항체 요법, 특히 특정 암에 대한 표준 요법 처방)을 시행하거나 또는 환자를 상기 요법으로 처치하는 조건이 환자를 치료하기에 임상적으로 적합하지 않거나 또는 환자가 더 이상 상기 요법으로부터 어떠한 유익한 효과도 얻지 못 하여 이들 환자에게 추가로 효과적인 요법이 필요하게 되는 것을 설명하기 위해 사용된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 샘플내 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2 검출 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "검출"이라는 용어는 대조군과 관련되거나, 대조군과 무관한 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 질병을 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내에서 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2 발현 및/또는 활성과 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, EphrinB2 발현은 증가된 발현이거나 비정상적인 발현이다. 일부 실시양태에서, 질병은 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 검출가능한 표지를 포함하는, 본원에 기술된 임의의 항-EphrinB2 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항-EphrinB2 항체와 EphrinB2의 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 생체내 또는 시험관내 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-EphrinB2 항체는 검출가능하게 표지된다.
도 1 : 항-EphrinB2 항체의 중쇄 및 경쇄 HVR 루프 서열. 본 도면은 중쇄 HVR 서열, H1, H2, 및 H3, 및 경쇄 HVR 서열, L1, L2 및 L3을 나타낸다. 서열 넘 버링은 하기와 같다: 클론 31.19 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 3이고; HVR-H3은 서열 5이고; HVR-L1은 서열 6이고; HVR-L2는 서열 8이고; HVR-L3은 서열 10이다); 클론 31.19.1D8 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 3이고; HVR-H3은 서열 5이고; HVR-L1은 서열 7이고; HVR-L2는 서열 9이고; HVR-L3은 서열 11이다); 및 클론 31.19.2D3 (HVR-H1은 서열 2이고; HVR-H2는 서열 4이고; HVR-H3은 서열 5이고; HVR-L1은 서열 6이고; HVR-L2는 서열 8이고; HVR-L3은 서열 12이다).
아미노산 위치는 하기 기술되는 바와 같은 카바트 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.
도 2A 및 2B ＆ 3은 하기의 서열 인식자를 사용하여 본 발명을 실시하는데 이용하기 위한 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한다:
가변 중쇄 ( VH ) 컨센서스 프레임워크 (도 2A 및 2B)
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 19)
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 20-22)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 23)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 24-26)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장됨
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 27)
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서 열 28-30)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 31)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 32-33)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 34)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 확장된 초가변 영역 (서열 35-37)
가변 경쇄 ( VL ) 컨센서스 프레임워크 (도 3)
인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 38)
인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (서열 39)
인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 40)
인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 41)
도 4는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 굵은 위 첨자로 표시한 번호는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 5는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 변형된/ 변이체 프레임워크 영역 서열을 도시한다. 굵은 위 첨자로 표시한 번호는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 6은 항-EphrinB2 단일클론 항체 클론 31.19의 경쇄 가변 영역 (서열 48) 및 중쇄 가변 영역 (서열 49), 항-EphrinB2 단일클론 항체 클론 31.19.1D8의 경쇄 가변 영역 (서열 50) 및 중쇄 가변 영역 (서열 51), 및 항-EphrinB2 단일클론 항체 클론 31.19.2D의 경쇄 가변 영역 (서열 52) 및 중쇄 가변 영역 (서열 53)을 도시한다.
도 7은 세포 기재 분석에서 항-에프린B2 단일클론 항체로 처리하면 EphB4 수용체-에프린B2 리간드 신호전달이 차단됨을 보여준다.
도 8은 래트의 등쪽 주머니 챔버(pocket chamber) 분석에서 항-EphrinB2 단일클론 항체로 처리하면 혈관신생이 감소됨을 보여준다.
도 9는 생체내에서 항-EphrinB2 항체로 처리하면 종양 성장이 억제됨을 보여준다.
본원의 발명은 예컨대, EphrinB2의 발현 및/또는 활성, 예로서, 증가된 발현 및/또는 활성, 또는 바람직하지 못한 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 항-EphrinB2 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병을 치료하는데 사용된다.
또다른 측면에서, 본 발명의 항-EphrinB2 항체에는 EphrinB2의 검출 및/또는 단리, 예로서, 다양한 조직 및 세포 유형에서 EphrinB2를 검출하기 위한 시약으로서의 유용성이 존재한다.
본 발명은 추가로 항-EphrinB2 항체, 및 항-EphrinB2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
일반 기법
본원에 기술되어 있거나 본원에서 참고되는 기법과 절차는 일반적으로 잘 이해되고 있고, 당업자에 의해 통상의 방법을 사용하여, 예를 들면, 광범위하게 사용되는, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; 연속물 [METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))]에 기술된 방법을 사용함으로써 보편적으로 사용된다.
정의
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체가 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정하였을 때, 항체의 95 중량%를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, (3) 쿠마시 블루 염색, 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만이 나타나는 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내에 계내의 항체를 포함하는데, 이는 항체의 천연 환경의 성분이 1종 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되는 1종 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 그러므로, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기의 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치의 넘버링"이라는 용어, 및 그의 변형어는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 항체의 편집체의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 체계를 지칭한다. 상기 넘버링 체계를 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축화 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따르면 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 어구는 2개의 수치값 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 하나 및 참고/비교자 항체와 관련된 다른 것) 사이의 유사성이 충분히 높은 정도여서 당업자가 상기 2개의 값 사이의 차이가 상기 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 간주할 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참고/비교자 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50% 미만, 바람직하게는 약 40% 미만, 바람직하게는 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예컨대, 항체)와 그의 결합 상대 (예컨대, 항원)의 단일 결합 부위 사이의 비공유 상호작용의 전체 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예컨대, 항원과 항체) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 비롯한 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 보다 오래 결합을 유지한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 하기에 기재된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 일련의 역가의 표지되지 않은 항원 존재하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 평형화시킨 후, 결합된 항체를 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 분석법에 의해 기재된 바와 같이 당해 항체의 Fab 형태 및 그의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 확립하기 위해, 미세역가 플레이트 (다이넥스(Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)중 포획용 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs)) 5 ㎍/mL으로 밤새도록 코팅한 후, PBS중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 당해 Fab의 일련의 희석액과 혼합한다 (예컨대, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치한다). 이어서, 당해 Fab를 밤새도록 인큐베이션시키되; 인큐베이션은 더 오랜 시간 동안 계속하여 (예를 들어, 65시간) 확실하게 평형에 도달하도록 할 수 있다. 이후, 혼합물을 포획 플레이트에 옮겨 실온에서 (예컨대, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS중 0.1% 트윈-20으로 8회에 걸쳐 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광액 (마이크로신트-20(MicroScint-20); 패커드(Packard)) 150㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(Topcount) 감마 계수기 (패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하인 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 비아코어(BIACore)™ 2000 또는 비아코어™ 3000 (뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.(BIACore Inc.)을 이용하여 ~10 반응 단위(RU)에서 25℃에서 고정화된 항원 CM5로 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략히, 공급자의 설명서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ug/mL (~0.2 uM)로 희석한 후, 5 ul/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위(RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배로 희석된 일련의 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ul/분의 유속으로 0.05% 트윈 20 (PBST)을 포함하는 PBS로 주사한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일대일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참고한다. 온-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1 s-1을 초과할 경우, 온-속도는 흐름-정지가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-아민코 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))와 같은 분광계에서 측정된 바와 같이, 농도가 증가하는 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2)중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-속도" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)을 이용하여 측정될 수 있다. 간략히, 공급자의 설명서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ug/mL (~0.2 uM)로 희석한 후, 5 ul/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위(RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배로 희석된 일련의 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ul/분의 유속으로 0.05% 트윈 20 (PBST)을 포함하는 PBS로 주사한다. 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참고한다. 온-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1 s-1을 초과할 경우, 온-속도는 흐름-정지가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-아민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바와 같이, 농도가 증가하는 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2)중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 그가 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하고자 한다. 벡터의 한 유형은 그 내로 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환형의 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예컨대, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈에 따라 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 그가 작동적으로 연결되어 지는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터" (간단하게는 "재조합 벡터")로서 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서는, 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 형태의 벡터인 바, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 유형의 변형은, 예를 들어, "캡," 유사체로의 1개 이상의 천연적으로 발생된 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 전하를 띠지 않는 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 전하를 띠는 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-라이신 등)과 같은 펜던트(pendant) 부분을 갖는 변형, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)로의 변형, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬화제를 함유하는 변형, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머형 핵산 등)로의 변형 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 기가, 예를 들어, 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가적인 뉴클레오티드에의 추가적인 연결을 준비하도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 탄소수 1 내지 20의 유기 캡핍기 부분으로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환 당 유사체, 알파-아노머형 당, 에피머형 당, 예컨대, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대, 메틸 리보사이드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사 형태를 또한 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대체 연결기로 치환될 수 있다. 이러한 대체 연결기들에는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(OO)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H, 또는 에테르(-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬이다)로 대체된 실시양태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기의 기술은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
일반적으로, 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 필수적이지는 않지만 일반적으로 뉴클레오티드 약 200개 미만인, 짧은, 일반적으로 단일 가닥인, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기술은 동일하게, 그리고 완전히 올리고뉴클레오티드에 적용가능하다.
펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 서열 동일성 퍼센트(%)를 얻기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)를 측정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드(source code)는 하기 표 3A에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 3A에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 A에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 다양하지 않다.
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아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2가 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(%) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성(%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(%)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 문단에 기재되어 있는 바와 같이 얻는다.
본원에서 사용되는 "EphrinB2" (상호교환적으로 "EphrinB2 리간드"로도 명명됨)라는 용어는, 달리 언급하지 않거나, 문맥상 명시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든지 또는 합성이든지 간에) EphrinB2 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 구체적으로 천연적으로 발생된, 말단절단(truncated)된 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연적으로 발생된 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태), 및 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 EphrinB2"는 일반적으로 천연적으로 발생된 EphrinB2 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 EphrinB2 서열"은 일반적으로 천연적으로 발생된 EphrinB2에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "Eph 수용체" (예컨대, EphB 수용체, 예를 들어 EphB1, EphB2 및/또는 EphB3)라는 용어는, 달리 언급하지 않거나, 문맥상 명시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든지 합성이든지 간에) Eph 수용체 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 구체적으로 천연적으로 발생된, 말단절단된 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연적으로 발생된 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태), 및 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 Eph 수용체"는 일반적으로 천연적으로 발생된 Eph 수용체 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 Eph 수용체 서열"은 일반적으로 천연적으로 발생된 Eph 수용체에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미로 상호교환적으로 사용되며, 단일클론 항체 (예로서, 전장 또는 무손상 단일클론 항체), 다중클론 항체, 다가 항체, 다중 특이성 항체 (예컨대, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중 특이성 항체)를 포함하고, (본원에서 더욱 상세히 기술되는) 특정 항체 단편도 포함할 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및/또는 친화도 성숙된 항체일 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중의 서열에서 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 언급한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균일하게 분포하는 것은 아니다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성-결정 부위 (CDR) 또는 초가변 부위로 명명되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 더욱 고도로 보존성인 가변 도메인 부분을 프레임워크 부위(FRs)로 명명한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 주로 베타-쉬트 구조를 채택하고, 3개의 CDR에 의해 연결되어 있으며, 베타-쉬트 구조의 일부를 연결하고, 일부 경우에는, 그를 형성하는 루프를 형성하는 4개의 FRs 부위를 포함한다. 각 쇄에서 CDR은 FRs 부위에 의해 다른 쇄로부터의 CDR와 함께 아주 근접하게 결합하고, 항체의 항원-결합 부위의 형성의 원인이 된다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]을 참고한다). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 작용, 예로서, 항체-의존 세포-매개 세포독성에서의 항체 관여를 나타낸다.
항체를 파파인으로 분해하면 "Fab" 단편이라고 명명되며, 각각 단일 항원-결합 부위를 포함하는, 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 명명된 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신으로 처리하면, 2개의 항원-결합 부위가 있으며, 항원과 여전히 교차-결합할 수도 있는 F(ab")2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 단일-쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합함으로써 경쇄 및 중쇄는 상기의 2-쇄 Fv 종과 유사한 "이량체"로 결합할 수 있다. 이 형태에서 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 형성한다. 총체적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 그와 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체의 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄의 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab') 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇 쌍의 Fab' 단편으로 생산되었다. 또한, 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 명명되는 분명히 다른 두가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다른 부류로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 일부는 하위부류 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, μ로 명명된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차 구조는 잘 공지되어 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하는 것으로, 여기서, 상기 일부는 무손상 항체에 존재하는 경우, 보통 상기 부분과 관련된 기능을 1개 이상, 및 가능한 최대로, 또는 그 모두를 보유한다. 항체 단편의 일례로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 이로써, 항원에 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들면, Fc 영역을 포함하는 것은 무손상 항체에 존재하는 경우, 보통 Fc 영역과 관련된 생물학적 기능, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 1개 이상 보유한다. 하나의 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 그러한 항체 단편은 단편에 대하여 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암(arm)을 포함할 수 있다.
용어 "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"는, 본원에 사용된 경우, 서열 및/또는 형태 구조로 정의된 루프에서 초가변성을 갖는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하며, 이들 중 3개 (H1, H2, H3)는 VH에 존재하고, 다른 3개 (L1, L2, L3)는 VL에 존재한다. 다수의 초가변 영역 모형이 사용되고 있으며, 이들이 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 바탕으로 하며, 가장 통상적으로 사용되고 있다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 대신 구조성 루프의 위치를 나타낸다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조성 루프 사이의 절충안을 나타내며, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조 분석에 기초한다. 이들 초가변 영역 각각으로부터의 잔기를 하기 기재하였다.
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초가변 영역은 VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3)와 같이 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다. 이들 각각의 정의에서는 [Kabat et al., 상기문헌]에 따라 가변 도메인 잔기가 넘버링되었다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역의 잔기가 아닌 가변 도메인의 잔기이다.
비-인간 (예로서, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 수혜자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 수용능을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)이다. 일부의 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 추가로 항체 수행능을 개량시키기 위하여 상기의 변형을 수행할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1개 이상의, 및 전형적으로는 2 이상의 가변 도메인 모두를 포함하되, 여기에서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 일치하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 임의로 면역글로불린 불변 영역(Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로, 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 설명을 위해, 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참고할 수 있다. 또한, 하기 리뷰 논문 및 그에 인용된 참고 문헌도 참고할 수 있다: ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]).
"키메라" 항체 (면역글로불린)는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특별한 종으로부터 유래되거나, 특별한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 것 뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 상기 항체의 단편도 포함한다 (미국 특허번호 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용되는 인간화된 항체는 키메라 항체의 하위세트이다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로는, scFv 폴리펩티드는, scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰를 위해 문헌 [Pluckthan, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참고한다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는, 미리결정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연적으로 발생된 화합물 또는 합성 화합물이다. 바람직하게, 표적 항원은 폴리펩티드이다.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편(VH-VL)을 지칭한다. 너무 짧아서 동일 쇄 상의 2개의 도메인을 연결시킬 수 없는 링커를 사용하여, 도메인을 다른 쇄의 상보적 도메인과 연결시킴으로써 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들면, (EP 404,097; WO93/1161; 및 문헌 [Hollinger et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)])에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것과 일치하는 아미노산 서열을 갖는 것이고/거나, 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기법을 사용하여 제조되는 것이다. 상기의 인간 항체에 대한 정의는 특이적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외시킨다.
"친화도 성숙된" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모체 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 그의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 하나의 실시양태에서, 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. [Marks et al. Bio / Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발법은 문헌 ([Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
항체의 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포 기능; 세포 표면 수용체 (예로서, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예컨대, 자연 살세포(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합되어 있는 분비된 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후에 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성 형태를 나타낸다. 항체는 세포독성 세포의 "무기"로서, 위와 같은 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-92 (1991)]의 제464면 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호, 또는 미국 특허 번호 제6,737,056호 (프레스타(Presta))에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살세포(NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, 문헌 [Clynes et al ., PNAS ( USA ) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 것과 동일한 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 자연 살세포(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들면, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타낸다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)로, 여기에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 그의 세포질 도메인이 상이한, 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초의 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초의 억제 모티프(ITIM)를 함유한다 (검토를 위해, 문헌 [M. Daeron, Annu . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)] 참고). FcR에 대한 검토를 위해, 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol . 9:457-492 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)])을 참고한다. 추후로 동정될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원에 사용된 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 하고 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]), 면역글로불린의 항상성을 조절하는 신생아 수용체 FcRn도 포함한다. WO00/42072 (프레스타)에는 FcR에 대한 결합이 향상되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 특허 공보 내용은 구체적으로 본원에서 참고로 인용된다. 또한 문헌 [Shields et al. J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]도 참고한다.
FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예컨대, [Ghetie 1997, Hinton 2004] 참고). 생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예컨대, 인간 FcRn을 발현시키는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드를 투여받은 영장류에서 분석할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포가 용해되는 것을 나타낸다. 종래의 보체 활성화 경로는 보체와 동종인 항원에 결합된 (적절한 하위부류의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같이 CDC 분석을 수행할 수 있다.
Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고, C1q 결합 능력이 증가하거나 감소된 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 번호 제6,194,551 B1호, WO 99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공보의 내용은 구체적으로 본원에서 참고로 인용된다. [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참고한다.
"Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드"라는 용어는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예로서, 항체 또는 면역어드헤신 (하기 정의 참고)을 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 체계에 따른 447번 잔기)는 예를 들어, 폴리펩티드 정제시, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합적 공학 처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 폴리펩티드, K447가 모두가 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기를 갖는 폴리펩티드와 K447 잔기를 갖지 않는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전하게 억제시킨다.
본원에서 사용된 "효능제 항체"는 당해 폴리펩티드의 기능적 활성 중 1개 이상을 모사하는 항체이다.
본원의 목적상의 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크, 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 미리존재하는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 미리존재하는 아미노산 변화가 존재하는 경우, 바람직하게 5개 이하, 및 바람직하게 4개 이하, 또는 3개 이하로 미리존재하는 아미노산 변화가 존재한다. 미리존재하는 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직하게 상기 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 오직 3개, 2개 또는 1개에 존재하고; 예를 들어, 상기 위치의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 하나의 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 서열상 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열 선별에서 가장 보편적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 이루어진다. 일반적으로, 상기 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군이다. 하나의 실시양태에서, VL 경우, 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 I이다. 하나의 실시양태에서, VH의 경우, 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al.]에서의 가변 중쇄 하위군 III 중 아미노산 서열로부터 수득되는 컨센서스 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열 43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 44)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 45) 중 적어도 일부 또는 모두를 포함한다.
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 문헌 [Kabat et al.]에서의 가변 경쇄 카파 하위군 I 중 아미노산 서열로부터 수득되는 컨센서스 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 15)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 17)-L3-FGQGTKVEIK (서열 18) 중 적어도 일부 또는 모두를 포함한다.
"질병" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로의 치료가 유익한 임의의 상태가다. 질병 또는 질환에는 포유동물이 당해 질병 또는 질환에 걸리기 쉽게 하는 병적 상태를 포함하는 만성 및 급성 질병 또는 질환이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 질병의 비제한적인 예로는 악성 및 양성 종양; 암종, 모세포종, 및 육종을 포함한다.
용어 "세포 증식 질병" 및 "증식 질병"은 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 질병을 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 세포 증식 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "종양"은 악성 또는 양성 여부와 상관없이 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암," "암성," "세포 증식 장애," "증식 질병" 및 "종양"은 본원에서 언급될 때 서로 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 그러한 암의 더욱 특별한 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 침샘암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상샘암, 간암종, 위암, 흑색종 및 다양한 유형의 경부암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈관신생의 조절 장애가 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 다수의 질병을 유발할 수 있다. 이러한 질병은 비-신생물성 및 신생물성 상태, 둘 모두를 포함한다. 신생물성 질병은 하기 기술된 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비-신생물성 질병은 원치않는 또는 이상 비대, 관절염, 류마티스성 관절염(RA), 건선, 건선 플라크, 사코이드증, 아테롬성 동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨성 망막병증, 및 미숙아 망막병증을 비롯한 기타 증식성 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 혈관신생 녹내장, 연령관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식편 신생혈관형성, 각막 이식편 거부, 망막/맥락막 신생혈관형성, 각 신생혈관형성 (피부 홍조), 안구 혈관신생 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형(AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상샘 과다형성 (그레이브스병 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예컨대, 급성 뇌경색/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련) 활막 염증, RA에서 판누스 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염(OA), 불응 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액의 제3 공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조산, 만성 염증, 예로서, IBD (크론병 및 궤양 대장염), 신장 동종이식 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 원치않는 또는 이상 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절증, 비후성 반흔, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농 육아종 수정체뒤 섬유증식, 공피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심장막 삼출 (예로서, 심장막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"신경퇴행성 질환" 및 "신경퇴행성 질병"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 그의 병리가 제한없이, 말초 신경병증; 운동 신경병, 예로서, 근위축성 측삭 경화증 (ALS, 루게릭병), 벨 마비, 및 척수 근육 위축 또는 마비를 비롯한 각종 상태; 및 기타 인간 신경퇴행성 질환, 예로서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 다발 경화증, 헌팅톤 무도병, 다운 증후군, 신경농, 및 메니에르병을 포함하는, 신경세포 퇴행 및/또는 기능 장애를 포함하는, 모든 질병을 포함하는 것으로 사용된다.
"말초 신경병증"은 가장 자주 운동, 감각, 감각운동, 또는 자율 기능 장애 중 하나 또는 그의 조합으로서 징조가 나타나는, 말초 신경에 영향을 주는 신경퇴행성 질병이다. 말초 신경병증은 예를 들어, 유전적으로 획득되거나, 전신 질환으로부터 초래될 수 있거나, 독성제, 예로서, 신경독성 약물, 예컨대, 항신생물성 제제, 또는 산업상 또는 환경상의 오염물에 의해 유도될 수 있다. "말초 감각 신경병증"은 말초 감각 신경 세포의 퇴행을 특징으로 하는데, 이는 특발성일 수 있고, 예를 들어, 당뇨병 (당뇨성 신경병증), 암에서 세포증식억제 약물 요법 (예컨대, 화학요법제, 예로서, 빈크리스틴, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 또는 탁산, 예컨대, 파클리탁셀 [탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 뉴저지주 프린스톤에 소재하는 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)] 및 독세탁셀 [탁소테레(TAXOTERE)®, 프랑스 안토니에 소재하는 롱플랑 로레아(Rhone-Poulenc Rorer)]을 사용하는 요법), 알코올 중독, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 또는 유전적 소인의 결과로서 발생할 수 있다. 유적적으로 획득된 말초 신경병증은 예를 들어, 레프숨병, 크레베병, 이염색 백색질장애, 파브리 질환, 데제린-솟타 증후군, 무베타지방단백혈증, 및 샤르코-마리-투스병(CMT) (비골근 위축증 또는 유전 운동 감각 신경병증(HMSN)으로도 공지되어 있음)을 포함한다. 대부분의 말초 신경병증은 수개월 또는 수년간에 걸쳐 느리게 발전한다. 임상적 실행상, 그러한 신경병증은 만성으로 명명한다. 때때로, 말초 신경병증은 몇 일에 걸쳐 빠르게 발전하는데, 이는 급성으로 명명한다. 말초 신경병증은 일반적으로 감각 및 운동 신경에 함께 영향을 줌으로써 혼합형 감각 및 운동 신경병증을 유발하지만, 순 감각 신경병증 및 순 운동 신경병증 또한 알려져 있다.
본원에서 사용되는 "치료"은 치료되는 개체 또는 세포의 자연적인 경과 과정을 변경시키려는 시도에서의 임상적 간섭을 지칭하며, 이는 예방을 위해, 또는 임상적 병리의 경과 과정시에 수행될 수 있다. 요법의 바람직한 효과는 질환의 발병 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 예후 완화 또는 개선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질병의 발병을 지연시키는데 사용된다.
"개체"는 척추동물이고, 바람직하게는, 포유동물이고, 더욱 바람직하게는, 인간이다. 포유동물로는 사육 동물 (예로서, 소), 경기용 동물, 애완용 동물 (예로서, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료 목적상의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물; 및 동물원용, 경기용, 또는 애완용 동물, 예로서, 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의 동물을 지칭한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 필요한 용량으로, 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기에 유효한 양이다.
본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료학적 유효량"은 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도해내는 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료학적 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료학적으로 이로운 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 기간 동안 원하는 예방학적 결과를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 필수적이지는 않지만 전형적으로, 예방학적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본원에 사용된 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예로서, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예컨대, 메토트렉세이트, 아드리아마신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이팅제; 핵산분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 및 독소, 예로서, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기에 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한다. 다른 세포독성제는 하기에 기술한다. 종양 살생제는 종양 세포를 파괴시킨다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예로서, 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)® 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예로서, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예로서, 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 비롯한, 에틸렌이민 및 메틸렌이민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캠틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토자(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예로서, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 메팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예로서, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예로서, 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히, 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참고); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예로서, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예로서, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예로서, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예로서, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예로서, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예로서, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예로서, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예로서, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예로서, 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (오레곤주 유진에 소재하는 JHS 내츄럴 프러덕츠(JHS Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 아나귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔® 파클리탁셀 뉴저지주 프린스톤에 소재하는 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지), 아브락산(ABRAXANE) 파클리탁셀의 크레모포가 없는 알부민-가공된 나노입자 제형 (일리노이주 샤움버그에 소재하는 아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners)), 및 탁소테레® 독세탁셀 (프랑스 안토니에 소재하는 롱플랑 로레아); 클로란부실; 젬시타빈 (젬자(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예로서, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨란(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (오노보빈(ONVOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예로서, 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 임의의 상기 물질들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라, 임의의 상기중 2종 이상의 배합물, 예로서, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)으로의 치료 요법에 대한 약자인 FOLFOX를 포함한다.
이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제하는 작용을 하고 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제가 또한 포함된다. 이들은 자체가 호르몬일 수 있다. 예로는 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 엘비스타(EVISTA)® 라록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY1 17018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜을 비롯한, 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 막는 기능을 하는 효능제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예로서, 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트 , 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 기타 항-안드로겐 효능제, 예로서, 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이같은 정의에는 비스포스포네이트, 예로서, 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디사(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID®) 틸루드로네이트, 또는 액토넬(ACTONEL®) 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 신호 전달 경로에서의 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어, PKC-알파, Ralf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신, 예로서, 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 루토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016로 또한 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소-분자 억제제); 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예로서, EphrinB2를 발현시키는 세포)의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 기에서의 세포 (예로서, EphrinB2를 발현시키는 세포)의 백분율(%)을 유의적으로 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 세포 주기 진행을 (S-기 이외의 단계에서) 차단하는 제제, 예를 들어, G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 제제가 있다. 종래의 M-기 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1 정지 여파로 S-기 정지를 초래하는 제제의 예로는 DNA 알킬화제, 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C가 있다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1] (특히 제13면)에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (톡소테레®, 롱플랑 로레아)은 파클라탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관의 조립을 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 결과적으로 세포에서의 유사분열을 억제한다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
용어 "항-신생물성 조성물"은 1종 이상의 활성 치료제, 예로서, "항암제"를 포함하며, 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제, 또는 본원에서 "항-신생물성 제제"로도 명명됨)는 예컨대, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 제제, 항-혈관신생제, 세포자사제, 항-튜블린제, 독소, 및 암을 치료하는 다른 약제, 예로서, 항-VEGF 중화 항체, VEGF 길항제, 항-HER-2, 항-CD20, 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 길항제 (예로서, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제, 엘로티닙, COX-2 억제제 (예로서, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, 하나 이상의 ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF 수용체(들)과 결합하는 길항제 (예로서, 중화 항체), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 및/또는 줄기 세포 인자(SCF)에 대한 수용체 티로신 키나제를 위한 억제제 (예로서, 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)® 노파르티스(Novartis)), TRAIL/Apo2, 및 다른 생체활성 및 유기 화학제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용된 용어 "프로드럭"은 모체 약물에 비해 종양 세포에 대하여 세포 독성이 작고, 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 모체 형태로 전환될 수 있는 제약상 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 언급한다. 예로서, 문헌 ([Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-276, Humana Press (1985)])를 참고한다. 본 발명의 프로드럭으로는 보다 활성인 세포 무독성 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형 프로드럭, 글리코실화된 프로드럭, 베타-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포 독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학 요법제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관 생성, 또는 원치않는 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는 소분자 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 그의 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예컨대, VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호 전달을 차단하는 소분자 (예컨대, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT/SU 11248 (말산수니티닙), AMG706)를 포함한다. 항-혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예로서, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예로서, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예로서, 악성 흑색종의 항-혈관신생 요법에 대하여 열거된 표 3)]: [Ferrara ＆ Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예로서, 항-혈관 형성 인자가 열거된 표 2)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) (예로서, 임상 실험에 사용된 항-혈관신생 인자가 열거된 표1)])을 참고한다.
본 발명의 조성물 및 그의 제조 방법
본 발명은 항-EphrinB2 항체; 및 항-EphrinB2 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 제약 조성물을 비롯한 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물은 EphrinB2에 결합하는 하나 이상의 항체, 및/또는 EphrinB2에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 추가로 당업계에 잘 알려져 있는 적합한 담체, 예로서, 완충액을 비롯한, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 단리된 항체 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 항체 및 폴리뉴클레오티드 실시양태를 포함한다.
본 발명의 항-EphrinB2 항체는 바람직하게 단일클론이다. 본원에서 제공되는 항-EphrinB2 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편도 본 발명의 범주내 포함된다. 이들 항체 단편은 예로서, 효소 분해와 같은 종래 수단에 의해 형성될 수 있거나, 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 그러한 항체 단편은 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다. 이들 단편은 하기 설명하는 진단 및 치료 목적에 유용하다.
단일클론 항체는 실질적으로 동질성인 항체 군집으로부터 수득되는 것으로, 즉, 최소량으로 존재할 수 있는, 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외한, 군집을 포함하는 개개의 항체들은 일치한다. 따라서, 수식어구 "단일클론"은 항체의 특징이 별개 항체의 혼합이 아니라는 것을 지시한다.
본 발명의 항-EphrinB2 단일클론 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)]에 기재되어 있는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스, 또는 예로서, 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물을 면역화시켜 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. EphrinB2에 대한 항체는 EphrinB2 및 애주번트의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. EphrinB2는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 이중 일부가 본원에 추가로 기술되어 있다. 예를 들어, EphrinB2의 재조합 생산이 하기에 기술되어 있다. 하나의 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역에 융합된, EphrinB2의 세포외 도메인(ECD)을 함유하는 EphrinB2 유도체로 동물을 면역화시킨다. 바람직한 실시양태에서, EphrinB2-IgG1 융합 단백질로 동물을 면역화시킨다. 보통은 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (몬타나주 해밀톤에 소재하는 리비 이뮤노켐 리서치 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.))와 함께 EphrinB2의 면역원성 접합체 또는 유도체에 대하여 동물을 면역화시키고, 용액을 여러 부위의 진피내로 주사한다. 2주 경과 후, 동물에 추가 접종한다. 7 내지 14일 경과 후, 동물에서 채혈하고, 항-EphrinB2 역가에 대하여 혈청을 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물에 추가 접종한다.
별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이중 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 EphrinB2에 대해 지시된 단일클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예로서, 방사성 면역분석법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 측정한다.
단일클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal . Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석법에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
원하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론에 대하여 스크리닝하기 위하여 조합 라이브러리를 사용함으로써 본 발명의 항-EphrinB2 항체를 제조할 수 있다. 원칙적으로, 파지 외피 단백질에 융합된 다양한 항체 가변 영역(Fv) 단편을 디스플레이하는, 파지 함유의 파지 라이브러리를 스크리닝하여 합성 항체 클론을 선별한다. 그러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대하여 친화성 크로마토그래피함으로써 패닝한다. 원하는 항원에 결합할 수 있는, Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고, 이로써 라이브러리내 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론을 항원으로부터 용리시키고, 추가로, 항원 흡착/용리의 추가적인 순환을 통해 농축시킬 수 있다. 임의의 본 발명의 항-EphrinB2 항체는 당해 파지 클론에 대해 선별하는 적합한 항원 스크리닝 방법을 설계한 후, 당해 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 [Kabat et al., Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역(Fc) 서열을 이용하여 전장 항-EphrinB2 항체를 작제함으로써 수득될 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역(CDR), 둘 모두를 갖는 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 각각으로부터의, 약 110개의 아미노산으로 구성된 2개의 가변(V) 영역으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, VH와 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유결합으로 연결되어 있는 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서, 또는 VH와 VL이 각각 불변 도메인에 융합되고 비공유결합으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, scFv를 코딩하는 파지 클론 및 Fab를 코딩하는 파지 클론들을 모두 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 명명된다.
VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재결합할 수 있고, 이어서, 문헌 [Winter et al., Ann . Rev . Immunol ., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 작제할 필요없이 면역원에 대한 고친화 항체를 제공한다. 별법으로, 상기 고유의 레파토리는 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이, 클로닝되어 넓은 범위의 비-자가 항원과 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 고유의 라이브러리는 줄기세포로부터의 재정렬 되지 않은 V- 또는 VIII-유전자 절편들을 클로닝함으로써 합성될 수도 있고, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 매우 가변적인 CDR3 영역을 코딩하는 무작위 서열을 지닌 PCR 프라이머를 이용하여 시험관 내에서 재정렬될 수도 있다.
필라멘트상 파지는 항체 단편을 융합에 의해 부 외피 단백질 pIII에 디스플레이하는 데 사용된다. 상기 항체 단편은, 예를 들면, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 VH 및 VL 도메인이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 연결되어 있는 단일쇄 Fv 단편들로서, 또는 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl . Acids Res ., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이 하나의 쇄가 pIII에 융합되고, 야생형 외피 단백질의 일부를 교체함으로써 Fab-외피 단백질 구조 조립체가 파지 표면 상에 디스플레이되는 세균 숙주 세포 원형질 내로 다른 쇄가 분비되는 Fab (F(ab')2 포함) 단편들로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물에서 수확된 면역 세포로부터 얻어진다. 항-EphrinB2 클론을 위해 편향된 라이브러리가 필요할 경우, 대상체를 EphrinB2로 면역화시켜 항체 반응을 발생시키고, 비장 세포 및/또는 혈중 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구(PBL)를 회수하여 라이브러리를 작제한다. 바람직한 실시양태에서, 항-EphrinB2 클론을 위해 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는, EphrinB2 면역화가 EphrinB2에 대해 인간 항체를 생산하는 B 세포를 발생하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 배열을 지닌 (그리고, 기능적 내생의 항체 생산 시스템이 결여된) 트랜스제닉 마우스에서 항-EphrinB2 항체 반응을 발생시킴으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에 기술한다.
적합한 스크리닝 방법, 예컨대, EphrinB2 친화성 크로마토그래피를 이용한 세포 분리에 의해, 또는 세포를 플루오로크롬-표지된 EphrinB2에 흡착시킨 후, 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 EphrinB2-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리함으로써 항-EphrinB2 반응성 세포 군집을 추가로 농축시킬 수 있다.
별법으로, 면역화되지 않은 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 이용함으로써 가능한 항체 레파토리의 더 좋은 표현이 제공되고, 또한 EphrinB2가 항원성이 아닌 임의 동물 (인간 또는 비인간)을 이용하여 항체 라이브러리를 작제하는 것이 가능하다. 시험관내 항체 유전자 작제물이 혼입된 라이브러리를 위해, 대상체로부터 줄기세포를 수확하여 재정렬되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 얻는다. 당해 면역 세포는 예로서, 인간, 마우스, 래트, 토끼목(Lagomorpha), 루프린(luprine), 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 닭 종 등과 같은 다양한 동물 종으로부터 얻을 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산을 당해 세포로부터 회수하고 증폭시킨다. 재정렬된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 원하는 DNA는 문헌 [Orlandi et al., Proc . Natl . Acad . Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같이, 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후, 재정렬된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단에 매칭되는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 얻을 수 있고, 이것으로 발현을 위한 다양한 V 유전자 레파토리를 만든다. V 유전자는 문헌 [Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단쪽의 후방 프라이머와 J-절편 내에 기초한 전방 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭시킬 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭에서는, 후방 프라이머가 문헌 [Jones et al., Biotechnol ., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손 내에 기초할 수도 있고, 전방 프라이머가 문헌 [Sastry et al., Proc . Natl . Acad . Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역 내에 기초할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴를 혼입시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 라이브러리 다양성은, 예를 들면, 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재되어 있거나, 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재되어 있는 방법과 같이, 면역 세포 핵산 샘플 중에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 정렬을 증폭시키기 위해 각 V-유전자 계열에 표적화된 PCR 프라이머를 이용함으로써 최대화된다. 상기 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위는 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한쪽 말단에 태그로서 PCR 프라이머 내에 도입되거나, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 더 수행함으로써 도입될 수 있다.
합성적으로 재정렬된 V 유전자의 레파토리는 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편들이 클로닝되었고, 서열분석되었으며 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol . Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 지도화되었다 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레파토리를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 또한, VH 레파토리는 문헌 [Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이, 단일 길이의 긴 H3 루프에 중점을 둔 모든 서열 다양성을 이용하여 만들 수도 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편들은 클로닝 및 서열분석되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur . J. Immunol ., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레파토리를 만드는 데에 이용될 수 있다. VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이의 범위에 기초한 합성 V 유전자 레파토리는 상당한 구조적 다양성을 가진 항체들을 코딩할 것이다. V-유전자를 코딩하는 DNA의 증폭 이후, 생식선 V-유전자 절편은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재정렬될 수 있다.
항체 단편의 레파토리는 VH 및 VL 유전자 레파토리를 다양한 방법으로 서로 조합시킴으로써 작제될 수 있다. 각각의 레파토리는 상이한 벡터 내에서 생성되며, 상기 벡터는 예를 들면, 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서 재조합되거나, 또는 생체내에서 예를 들면, 문헌 [Waterhouse et al., Nucl . Acids Res ., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재되어 있는 loxP 시스템과 같은 조합적 감염에 의해 재조합된다. 생체내 재조합 방법은 Fab 단편의 2-쇄 본성을 개발하여 이. 콜라이 형질전환 효율로 인한 라이브러리의 크기상의 한계를 극복하였다. 고유의 VH 및 VL 레파토리는 개별적으로, 하나는 파지미드 내에 클로닝되고, 다른 하나는 파지 벡터 내에 클로닝된다. 그 후, 파지미드-함유 세균의 파지 감염에 의해 상기 2개의 라이브러리를 조합함으로써, 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포 수 (약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 2개 벡터는 모두 생체내 재조합 신호를 포함하고 있어서, VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상에서 재결합되고 파지 비리온 내로 함께 패키징된다. 이러한 거대 라이브러리는 양호한 친화도 (약 10-8 M의 Kd -1)를 갖는 다수의 다양한 항체들을 제공한다.
별법으로, 상기 레파토리는 예를 들면, 문헌 [Barbas et al., Proc . Natl . Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 서로 조립된 후 클로닝될 수 있다. 또한, PCR 조립은 VH 및 VL DNA를, 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 결합시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레파토리를 만드는데 이용될 수도 있다. 또다른 기법에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl . Acids Res ., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이, "세포내 PCR 조립법"을 이용하여 PCR에 의해 림프구 내에서 VH 유전자와 VL 유전자를 결합시키고, 그 후 연결된 유전자의 레파토리를 클로닝한다.
고유의 라이브러리 (천연 또는 합성 라이브러리)에 의해 생산된 항체는 중간 정도의 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1)를 가질 수 있지만, 문헌 [Winter et al. (1994), 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 친화도 성숙은 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선별에 의해 시험관내에서 모사될 수도 있다. 예를 들면, 문헌 [Hawkins et al., J Mol . Biol ., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류를 쉽게 범하는 중합효소 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 이용하여 시험관내에서 무작위로 돌연변이를 도입할 수 있다. 또한, 친화도 성숙은 예 를 들면, 선택된 개별 Fv 클론에서의 당해 CDR에 걸친 무작위 서열을 지닌 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 고친화 클론에 대해 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 96/07754 (1996년 3월 14일 공개됨)는 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 유발하여 경쇄 유전자 라이브러리를 만드는 방법을 기재하고 있다. 다른 효과적인 접근법은 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이, 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을, 면역화되지 않은 공여자로부터 얻은 천연 발생의 V 도메인 변이체 레파토리와 재결합시키고, 수회의 쇄 재셔플링에서 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 이러한 기법으로 10-9 M 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편이 생산된다.
EphrinB2 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. EphrinB2를 코딩하는 핵산 서열은 원하는 EphrinB2 영역의 아미노산 서열을 사용함으로써 디자인될 수 있다. 별법으로, 진뱅크(GenBank) Accession Nos. NM_004093의 cDNA 서열 (또는 그의 단편)을 사용할 수 있다. EphrinB2를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법으로는 문헌 [Engels et al., Agnew . Chem . Int. Ed . Engl, 28: 716-734 (1989)]에 기재된 방법들 중 임의의 것, 예로서, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 의한 화학적 합성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 실시양태에서, EphrinB2 코딩 DNA 디자인에 발현 숙주 세포에 바람직한 코돈이 사용된다. 별법으로, EphrinB2를 코딩하는 DNA는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
EphrinB2를 코딩하는 DNA 분자를 작제한 후, 상기 DNA 분자는 플라스미드와 같은 발현 벡터의 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되며, 여기서, 조절 서열은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 복제 및 조절 서열을 함유한다. 벡터는 통상적으로 복제 부위 뿐만 아니라, 표현형에 의해 형질전환된 세포를 선별할 수 있게 하는 단백질 코딩 서열을 갖고 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다. 예로서, 효모와 같은 진핵생물 유기체, 또는 예로서, 포유동물과 같은 다세포 유기체로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다.
임의로는, EphrinB2를 코딩하는 DNA는 분비 리더 서열과 작동가능하게 연결됨으로써 숙주 세포에 의한 발현 산물은 배양 배지로 분비된다. 분비 리더 서열의 예에는 stII, 에코틴, lamB, 헤르페스 GD, lpp, 알칼리성 포스파타제, 인버타제 및 알파 인자가 포함된다. 또한 본원에 사용하기에 적합한 것은 단백질 A의 36개 아미노산 리더 서열이다 (문헌 [Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)]).
숙주 세포는 본 발명의 상기 발현 벡터 또는 클로닝 벡터에 의해 형질감염되고, 바람직하게는 형질전환되고, 프로모터의 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하도록 개질된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
형질감염은 임의 코딩 서열의 실제 발현 여부와 상관없이 발현 벡터가 숙주 세포 내로 들어가는 것을 의미한다. 형질감염의 여러 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, CaP04 침전법 및 전기천공법이 있다. 일반적으로, 성공적인 형질감염은 상기 벡터 작동의 임의 표시가 숙주 세포 내에서 발생하는 경우에 인식된다. 형질감염 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다.
형질전환은 DNA를 유기체 내로 도입하여 상기 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하게 되도록 하는 것을 의미한다. 이용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 형질전환 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다.
EphrinB2를 생산하기 위하여 사용되는 원핵생물 숙주 세포는 일반적으로 문헌 [Sambrook et al, 상기 문헌]에 기재되어 있는 바와 같이 배양될 수 있다.
EphrinB2를 생산하기 위하여 사용되는 포유동물 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있고, 이는 당업계에 잘 알려져 있고, 일부는 본원에 추가로 기재되어 있다.
본 개시에서 언급하는 숙주 세포는 시험관내 배양물에 존재하는 세포 뿐만 아니라, 숙주 동물내 존재하는 세포도 포함한다.
EphrinB2의 정제는 당업계에서 승인받은 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이중 일부는 본원에 기재되어 있다.
정제된 EphrinB2를 파지 디스플레이 클론의 친화성 크로마토그래피 분리에 사용하기 위해 적합한 매트릭스, 예로서, 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 비드, 셀룰로스, 각종 아크릴 공중합체, 하이드록실 메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 공중합체, 나일론, 중성 및 이온성 담체 등에 부착시킬 수 있다. EphrinB2 단백질을 매트릭스에 부착하는 것은 문헌 [Methods in Enzymology , vol . 44 (1976)]에 기재된 방법에 의해 수행할 수 있다. 단백질 리간드를 다당류 매트릭스, 예컨대, 아가로스, 덱스트란 또는 셀룰로스에 부착하기 위해 보통 사용되는 기법은 할로겐화 시안으로 담체를 활성화시키고, 펩티드 리간드의 일차 지방족 또는 방향족 아민을 활성 매트릭스와 후속적으로 커플링하는 것을 포함한다.
별법으로, EphrinB2는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는데 이용되거나, 흡착 플레이트에 부착된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 세포 분류시 이용되거나, 스트렙트아비딘-코팅된 비드를 포착하기 위해 비오틴에 접합되거나, 당업계에 공지된 패닝 파지 디스플레이 라이브러리 방법에 이용될 수 있다.
적어도 파지 입자의 부분을 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에서 파지 라이브러리 샘플을 고정된 EphrinB2와 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 세기, 온도 등을 비롯한 조건은 생리적 조건을 모사하기 위해 선택된다. 고상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들면, 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산으로, 예를 들면, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol ., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리로, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 방법으로 EphrinB2 항원 경쟁에 의해 용리시킨다. 1회 선별로 파지를 20 내지 1,000 배 증가시킬 수 있다. 또한, 농축된 파지를 세균 배양액에서 증식시켜 추가로 선별할 수 있다.
선별 효율은 세척하는 동안의 해리 동력학, 및 항원과 단일 파지상의 다중 항체 단편들의 동시 결합 여부를 비롯한 많은 인자에 따라 달라진다. 빠른 해리 동력학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체를 단시간에 세척하고, 다가 파지 디스플레이 및 고상에서 항원의 고밀도 코팅을 이용하여 유지시킬 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합도 촉진한다. 느린 해리 동력학 (및 양호한 결합 친화)를 갖는 항체의 선택은 장시간 세척, 및 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol ., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 항원의 저밀도 코팅을 사용하여 촉진할 수 있다.
EphrinB2에 대해 상이한 친화도를 갖는 파지 항체들은, 이들이 약간 다른 친화도를 갖더라도 선별될 수 있다. 그러나, 선별된 항체의 무작위 돌연변이 (예컨대, 상기한 일부 친화도 성숙 기법을 수행함으로써 발생함)는, 대부분의 항원과 결합하고 일부는 더 높은 친화도로 결합하는 다수의 돌연변이체를 발생시킬 것이다. EphrinB2를 제한하여, 소수의 고친화성 파지를 경쟁시켜 선별할 수 있다. 모든 고친화성 돌연변이체를 유지시키기 위해, 파지를 과량의, 그러나, EphrinB2에 대한 표적 몰 친화 상수보다 낮은 몰농도의 비오틴-접합된 EphrinB2와 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 고친화성-결합 파지를 스트렙트아비딘으로 코팅된 상자성 비드로 포착할 수 있다. 이러한 "평형 포착"은 낮은 친화도를 가진 과량의 파지로부터 2배 정도 높은 친화도를 가진 돌연변이 클론을 단리할 수 있는 민감도로, 항체의 결합 친화도에 따라 항체를 선별한다. 또한, 고상에 결합된 파지를 세척하는데 사용된 조건은 해리 동력학에 기초한 선별을 위해 조정될 수 있다.
항-EphrinB2 클론의 활성이 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 EphB 수용체 (예로서, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3)와 EphrinB2 사이의 결합은 차단하지만, EphB 수용체와 제2 단백질 (예로서, EphrinB1 및/또는 EphrinB3) 사이의 결합은 차단하지 못하는 항-EphrinB2 항체를 제공한다. 그러한 항-EphrinB2 항체에 상응하는 Fv 클론은, (1) 상기 기술된 바와 같이 파지 라이브러리로부터 항-EphrinB2 클론을 분리시키고, 임의로 파지 클론의 단리된 군집을 적합한 세균 숙주에서 성장시켜 상기 군집을 증폭시키고; (2) 각각 차단 활성 및 비-차단 활성이 바람직한지 여부에 대하여 EphrinB2 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-EphrinB2 파지 클론을 고정된 EphrinB2에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여, 제2 단백질의 결합 결정기와 중복되거나, 그와 공유되는 EphrinB2-결합 결정기를 인식하는 원치않는 클론을 용리시키고; (5) 단계 (4) 이후 흡착된 상태로 남아있는 클론을 용리시킴으로써 선별될 수 있다. 임의로, 원하는 차단/비-차단 성질을 갖는 클론은 추가로 본원에 기술된 선별 방법을 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축시킬 수 있다.
본 발명의, 하이브리도마-유래 단일클론 항체 또는 파지 디스플레이 클론을 코딩하는 DNA를 용이하게 단리시키고 종래 방법 (예컨대, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써)을 사용하여 서열 분석한다. DNA가 일단 단리되면, 발현 벡터 내로 배치할 수 있고, 이어서, 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예로서, 이. 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성시킬 수 있다. 세균에서의 항체-코딩 DNA의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문으로는 문헌 ([Skerra et al. , Curr. Opinion in Immunol, 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol Revs, 130: 151 (1992)])을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지 DNA 서열 (예컨대, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al, 상기 문헌]으로부터 수득할 수 있다)과 조합하여 전장의 또는 그의 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. 이러한 목적을 위해, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소타입의 불변 영역이 사용될 수 있으며, 상기와 같은 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 하나의 동물 (예로서, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 이어서, 또다른 동물 종의 불변 영역 DNA로 융합되어 "하이브리드,"의 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에서 사용되는 바와 같은 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 모든 인간의, 전장 또는 그의 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-EphrinB2 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성의 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 변형될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법). 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 모두 또는 일부를 공유결합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편 또한 포함한다. 특정 상황하에서는 전 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 이롭다. 단편 크기가 작을수록 더욱 신속하게 제거될 수 있고, 고형 종양으로의 접근성이 개선될 수 있다.
항체 단편의 제조를 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)])를 참고한다). 그러나, 현재 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현될 수 있고, 그로부터 분비됨으로써, 다량의 이들 단편은 손쉽게 생산될 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 번호 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 생산하는 다른 기법은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체가 단일-쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 제5,571,894호; 및 제5,587,458호를 참고한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이며, 따라서, 이들은 생체내에서 사용하는 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. sFv 융합 단백질을 작제하여 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질의 융합을 얻을 수 있다. [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참고한다. 항체 단편은 또한 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중 특이성일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라, 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써 수행된다 (문헌 ([Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536])). 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 무손상이 아닌 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 제4,816,567호). 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열과 가장 가까운 인간 서열을 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 영역(FR)으로서 수용시킨다 (문헌 ([Sims et al. (1993) J. Immunol ., 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol . Biol., 196:901])). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 일치 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크는 수개의 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌 ([Carter et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623])).
항체가 항원에 대한 고친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것 또한 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 하나의 방법에 따르면, 인간화된 항체는 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화된 산물의 분석의 방법에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 예시 및 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 점검은 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선택하고, 수혜자 및 도입 서열로부터 조합하여 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 원하는 항체 특징이 달성되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 것에 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-EphrinB2 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기술된 바와 같은 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합시킴으로써 작제할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 단일클론 항-EphrinB2 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들면, (문헌 ([(Kozbor, J. Immunol ., 133:3001(1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al, J. Immunol , 147: 86 (1991)]))에 기재되어 있다.
면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에서 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식 계열 돌연변이체 마우스 내의 항체 중쇄 결합 영역(JH)의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전하게 저해시킨다고 기재되었다. 이러한 생식 계열 돌연변이체 마우스 내의 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 예로서, (문헌 ([Jakobovits et al, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al, Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al, Year in Immunol, 7: 33 (1993)]))을 참고한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간 예로서, 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있는데, 여기에서, 인간 항체는 비-인간 출발 항체에 대한 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로도 지칭되는 상기 방법에 따르면, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 파지 디스플레이 기법에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 군집을 생성하는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체된다. 항원에 대한 선택은, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 복구하는 것인 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab를 단리시키며, 즉, 에피토프는 인간 쇄 상대의 선택을 지배한다 (각인시킨다). 잔류하는 비-인간 쇄를 대체하기 위해 본 과정을 반복할 경우, 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT 특허 출원 WO 93/06213). CDR 그라프팅에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 다르게, 상기 기법은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이중 특이성 항체
이중 특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 본 경우에서, 하나의 결합 특이성은 EphrinB2에 대한 것이고, 나머지 하나는 다른 항원에 대한 것이다. 예시적인 이중 특이성 항체는 EphrinB2의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중 특이성 항체는 또한 EphrinB2를 발현하는 세포에 세포독성 물질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 EphrinB2-결합 암, 및 세포독성제 (예로서, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖고 있다. 이중 특이성 항체는 전장의 항체 또는 항체 단편 (예로서 F(ab')2 이중 특이성 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중 특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중 특이성 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는데, 이는 다소 번거롭고, 산물 수율은 낮다. 유사한 방법이 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829 및 [Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 기재되어 있다.
상이하며 더욱 바람직한 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 예를 들면, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시에 형질감염시킨다. 이것은 작제에 사용되는 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 보다 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 비율이 같은 2종 이상의 폴리펩티드 쇄가 고수율로 발현되거나, 상기 비율이 특별히 중요치 않은 경우, 2종의 또는 3종의 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중 특이성 항체는 한 암에 있는, 제1 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 암에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중 특이성 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이하게 분리되도록 하기 때문에, 이러한 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린쇄 조합으로부터 원하는 이중 특이성 화합물을 용이하게 분리할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중 특이성 항체를 생성에 관한 상세한 설명은 예를 들면, [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986)]을 참고한다.
또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화시킬 수 있다. 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)와 크기가 동일하거나 유사한 보충의 "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 경계면에 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율 이상으로 증가시키는 기전을 제공한다.
이중 특이성 항체는 가교-결합된 항체 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체에서 항체들중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체들은 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키는 데 사용하도록 제안된 바 있고 (미국 특허 번호 제4,676,980호), HIV 감염의 치료에도 제안된 바 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교-결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적당한 가교-결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 다수의 가교-결합 기법과 함께 미국 특허 번호 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중 특이성 항체를 생성하는 기법 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 이용하여 이중 특이성 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방해한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체의 하나는 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중 특이성 항체를 형성한다. 생산된 이중 특이성 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근 기술의 발전으로 인해 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접 회수하여 화학적으로 결합시킴으로써 이중 특이성 항체를 형성시킬 수 있게 되었다. [Shalaby et al., J. Exp . Med . 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중 특이성 항체 F(ab')2 분자의 생산이 개시되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 따로 분비되었으며 시험관내에서 직접 화학적으로 커플링됨으로써 이중 특이성 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중 특이성 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양물으로부터 이중 특이성 항체 단편을 직접 제조하고, 단리시키기 위한 각종 기법이 개시되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 생산하였다 [Kostelny et al., J. Immunol . 148(5):1547-1553 (1992)]. 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체의 힌지 부위를 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재-산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 또한, 이러한 방법은 항체 동종이량체를 생산하기 위한 방법으로도 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993))에 기재된 " 디아바디" 기법은 이중 특이성 항체 단편을 제조하는 대체 기전을 제공한다. 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 상기 두 도메인이 쌍을 이루게 할 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루어, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중 특이성 항체 단편을 제조하는 또다른 방법이 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994)]을 참고한다.
항체가가 2를 초과하는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이성 항체도 제조될 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991).
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 보다 신속하게 내재화될 수 있다 (있고/거나 이화될 수 있다). 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 다른 부류; 예를 들어, 4가 항체)일 수 있는데, 이러한 다가 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 부위를 포함한다 (또는 이로 구성되어 있다). 이러한 시나리오에서, 항체가 Fc 영역, 및 이러한 Fc 영역의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 구성되어 있다). 상기와 같은 하나의 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 구성되어 있다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 여기에서, 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기에서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 2개 이상 (예를 들면, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로는 CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징을 갖는다면, 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어진다. 아미노산 변경은 서열이 만들어질 때 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 부위를 동정하는데 유용한 방법은 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법"이라 불린다. 여기에서, 잔기 또는 표적 잔기의 기를 동정하고 (예로서, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 이를 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예로서, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 상기 아미노산 위치를 치환 부위에서, 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이의 성질 그 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 돌연변이의 성능을 소정의 부위에서 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 부위에서 수행하고, 발현된 면역글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N-또는 C-말단의 융합을 포함한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된 것은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 효소를 사용하여 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스중 하나를 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신을 사용할 수도 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하거나, 결실시키는 것은 상기 기술된 트리펩티드 서열중 하나 이상이 생성되거나, 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 원 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌을 부가, 결실, 또는 치환함으로써 변경시킬 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 부착되는 탄수화물을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 결여된, 성숙한 탄수화물 구조를 지닌 항체가 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 (프레스타 L.(Presta, L.))에 기재되어 있다. 또한 US 2004/0093621 (교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))도 참고한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물 내에 이등분 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체가 다음 문헌에 인용되었다: WO 2003/011878 (쟝-메레(Jean-Mairet) 등) 및 미국 특허 번호 제6,602,684호 (우마냐(Umana) 등). 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당류 내에 1종 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등)에 보고되었다. 그의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 수반한 항체에 관해 WO 1998/58964 (라주, S(Raju, S.)) 및 WO 1999/22764 (라주, S)를 참고한다. 또한, 변형된 글리코실화를 갖는 항원-결합 분자에 관해 US 2005/0123546 (우마냐 등)을 참고한다.
본원의 바람직한 글리코실화 변이체는 Fc 영역을 포함하는데, 여기에서, Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조물에 푸코스가 결여되어 있다. 그러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 지니고 있다. 임의로는, Fc 영역이 ADCC를 추가로 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환물을 그 내부에 추가로 포함하는데, 예를 들면, Fc 영역의 298번, 333번, 및/또는 334번 위치 (Eu 잔기 넘버링에 따름)에서의 치환물을 포함한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍성" 항체와 관련된 공개 문헌의 예로는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; 문헌 ([Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]). 탈푸코실화 항체를 생산하는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화에 있어 결핍성인 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (프레스타 L.); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등)에서, 특히 실시예 11), 및 넉 아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉 아웃 CHO 세포 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)]를 포함한다.
또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 상이한 잔기로 대체된 항체 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발법에 대해 가장 큰 당해 부위로는 초가변 영역을 들 수 있지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 표 1에 "바람직한 치환"이라는 표제하에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 초래할 경우, 표 1의 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 부류에 대해 하기에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하여, 산물을 스크리닝할 수 있다.
Figure 112008058923458-PCT00028
항체의 생물학적 성질에 관한 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조를 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연적으로 발생된 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 상기 한 부류의 구성원을 다른 부류의 것으로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
한 가지 유형의 치환 변이체는 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모체 항체에 비해 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간략히, 수개의 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)를 돌연변이화하여 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체는 각각의 입자 내에 패키징된 파지 외피 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)의 적어도 일부에의 융합물로서 섬사상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 스캐닝 돌연변이 유발법 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에 설명된 것을 비롯한 당업계에 공지된 기법에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기술된 것을 비롯한 당업계에 공지된 기법을 이용하여 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선별할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연적으로 발생된 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지정된) 돌연변이 유발법, PCR 돌연변이 유발법, 및 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이 유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 비롯한 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본 명세서 및 당업계의 교시에 따르면, 일부 실시양태에서 본 발명의 항체는 예를 들어, Fc 영역 내의 야생형 상대 항체에 비해, 하나 이상의 변경을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 그의 야생형 상대 항체에 비해 치료 유용성에 대해 요구되는 동일한 특징을 실질적으로 보유할 것이다. 예를 들어, WO 99/51642에 기재된 바와 같이 특정 변경은 Fc 영역에 이루어져 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 변경 (즉, 개선 또는 감소)시킬 것이다. 또한, 다른 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해 (문헌 [Duncan ＆ Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 제5,648,260호; 미국 특허 번호 제5,624,821호; 및 WO 94/29351)을 참고한다. WO 00/42072 (프레스타) 및 WO 2004/056312 (로우맨)에는 FcRs에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용은 구체적으로 본원에서 참고로 인용된다. 또한 문헌 [Shields et al. J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]를 참고한다. 반감기가 증가되고 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체는 모체 IgG를 태아로 전달하는데 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]), 이는 US2005/0014934 A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기재되어 있다. 이들 항체는 Fc 영역의 FcRn에 대한 결합이 개선된 것으로, 그 안에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고, C1q 결합 능력이 증가하거나 감소된 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 번호 제6,194,551 B1호, WO 99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공보의 내용은 구체적으로 본원에서 참고로 인용된다. 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]도 참고한다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질원성 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게, 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성 때문에 제조상의 잇점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료 요법에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 고려 사항을 기초로 결정될 수 있다.
원하는 성질을 갖는 항체 스크리닝
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 각종 분석법에 의해 그의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대하여 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체가 EphrinB2 활성화 감소 또는 차단, EphrinB2 하류 분자 신호 전달 감소 또는 차단, EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예컨대, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 활성화 감소 또는 차단, EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예컨대, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 하류 분자 신호 전달 감소 또는 차단, EphrinB2에 결합하는 EphrinB2-결합 Eph 수용체 (예컨대, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 파괴 또는 차단, EphrinB2 인산화 및/또는 EphrinB2 다량체화, 및/또는 Eph 수용체 (예컨대, EphB1, EphB2 및/또는 EphB3) 인산화 결합 파괴 또는 차단, 및/또는 종양, 세포 증식 질병 또는 암 치료 및/또는 예방; 및/또는 혈관신생의 감소, 차단 또는 억제; 및/또는 EphrinB2 발현 및/또는 활성 (예로서, 증가된 EphrinB2 발현 및/또는 활성)과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 중 임의의 하나 이상을 특징으로 한다.
정제된 항체는 N-말단 서열 분석법, 아미노산 분석법, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광분석법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함하나, 이에 한정되지 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 항체는 그의 생물학적 활성에 대하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험된다. 당업계에 공지되고, 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석법은 제한없이, 예로서, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법, 및 단백질 A 면역분석법 기법을 사용하는 임의의 직접 또는 경쟁적 결합 분석법을 포함한다. 예시적인 항원 결합 분석법은 하기 실시예 섹션에서 제공한다.
추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명은 EphrinB2에 대한 결합에 관하여 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체와 경쟁하는 항-EphrinB2 단일클론 항체를 제공한다. 그러한 경쟁자 항체로는 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체에 의해 인식되는 EphrinB2 에피토프와 동일하거나, 그와 중복되는 EphrinB2 에피토프를 인식하는 항체를 포함한다. 그러한 경쟁자 항체는 고정된 EphrinB2와의 결합에 대해 표지된 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체와 경쟁하는 항-EphrinB2 하이브리도마 상등액을 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 경쟁자 항체를 함유하는 하이브리도마 상등액은 관련이 없는 항체를 함유하는 (또는 항체를 함유하지 않는) 대조군 결합 혼합물에서 검출되는, 결합되어진 표지된 항체의 양과 비교하여, 대상 경쟁 결합 혼합물에서 검출되는, 결합되어진 표지된 항체의 양을 감소시킬 것이다. 본원에 기술된 임의의 경쟁 결합 분석법은 상기 방법에 사용하기에 적합하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체의 하나 이상의 (예로서, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개) HVR을 포함하는 항-EphrinB2 단일클론 항체를 제공한다. 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체의 하나 이상의 HVR(들)을 포함하는 항-EphrinB2 단일클론 항체는, 31.19 항체, 31.19.1D8 항체 및/또는 31.19.2D3 항체의 하나 이상의 HVR(들)을 주형 항체 서열, 예컨대, 모체 항체의 상응하는 뮤린 서열에 가장 가까운 인간 항체 서열, 또는 모체 항체 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에서 모든 인간 항체의 컨센서스 서열 상에 이식시키고, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 재조합 숙주 세포에서 수반하는 불변 영역 서열(들)과 함께, 또는 불변 영역 서열(들) 없이 생성된 키메라 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 서열(들)을 발현시킴으로써 작제될 수 있다.
본원에 기술된 독특한 성질을 갖는 본 발명의 항-EphrinB2 항체는 임의의 종래 방법에 의해 원하는 성질에 대하여 항-EphrinB2 하이브리도마 클론을 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, EphrinB2에 대한 EphrinB2 결합 상대 (예를 들면, EphB 수용체)의 결합을 차단하거나 차단하지 못하는 항-EphrinB2 단일클론 항체가 바람직할 경우, 후보 항체는 결합 경쟁 분석법에서 시험될 수 있으며, 예를 들면, 플레이트 웰이 EphrinB2로 코팅되어 있고, 해당 EphrinB2 결합 상대가 과량으로 존재하는 항체 용액을 코팅된 플레이트상에 층상을 형성하고, 결합된 항체를 효소적으로 검출하고, 예컨대, 결합된 항체를 HRP-접합된 항-Ig 항체 또는 비오틴화된 항-Ig 항체와 접촉시키고, 예컨대, 스트렙트아비딘-HRP 및/또는 과산화수소로 플레이트를 현상시키고, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 분광광도법에 hRP 착색 반응을 검출함으로써 hRP 착색 반응을 현상시키는 경쟁 결합 ELISA에서 시험될 수 있다.
EphrinB2 활성화를 억제시키는 항-EphrinB2 항체가 바람직할 경우, 후보 항체는 EphrinB2 인산화 분석법에 의해 시험될 수 있다. 예로서, 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 그러한 하나의 분석법은 실시예 섹션에 기술되어 있다.
세포 성장을 억제시키는 항-EphrinB2 항체가 바람직할 경우, 후보 항체는 세포 성장을 억제시키는 것에 관해 측정하는 시험관내 및/또는 생체내 분석법에서 시험될 수 있다. 예로서, 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 그러한 하나의 분석법은 실시예 섹션에 기술되어 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 효과기 기능 전부는 아니지만, 그 일부를 가짐으로써, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만, 여전히 특정 효과기 기능 (예로서, 보체 및 ADCC)는 불필요하거나 유새한 다수의 적용에 대해 바람직한 후보가 될 수 있도록 하는 변경된 항체에 고려한다. 특정 실시양태에서, 생산된 면역글로불린의 Fc 활성은 오직 원하는 성질만이 유지되도록 함으로써 측정된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석법은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 분석법은, 항체에 FcγR 결합능은 없지만 (이로써, ADCC 활성은 결여되어 있다), FcRn 결합능은 유지되도록 함으로써 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 제464면 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살세포(NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 것과 동일한 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합하지 못하게 함으로써 CDC 활성이 존재하지 않도록 함으로써 C1q 결합 분석법 또한 수행할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같이 CDC 분석법을 수행할 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정 또한 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 실시예 섹션에 기술되어 있는 것을 사용함으로써 실시할 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합적 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현용의 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석한다. 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 벡터의 선택은 사용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존한다. 일반적으로, 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물) 기원의 것이다. 이러한 목적을 위해, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소 타입의 불변 영역이 사용될 수 있으며, 상기와 같은 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
a) 원핵생물 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
i. 벡터 작제
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기법을 이용하여 수득할 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생성 세포로부터 단리되고 서열 분석될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 원핵생물 숙주 내에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 당업계에 이용가능하고 공지된 다수의 벡터가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 그것이 존재하는 특정 숙주 세포와의 적합성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보좀 결합 부위(RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 상기 숙주와 함께 사용될 수 있다. 벡터는 통상적으로 복제 부위 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 상의 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하며, 따라서, 형질전환된 세포를 확인하는 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지 또한 내인성 단백질의 발현을 위한 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 번호 제 5,648,237호 (카터(Carter) 등)에 기재되어 있다.
추가로, 숙주 미생물에 상용성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터는 상기 숙주와 함께 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM.TM.-11과 같은 박테리오파지는 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조절하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역된 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 유도성 및 구조적 프로모터의 2개의 부류에 해당한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어하에 증가된 수준의 시스트론 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 프로모터를 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터, 둘 모두 표적 유전자의 직접적 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터가 이용되는데, 그 이유는 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 또는 trc 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능성인 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지된 세균 또는 파지 프로모터) 또한 적합하다. 그의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있는 바, 당업자는 임의의 필요한 제한효소 부위를 공급하는 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 이를 작동가능하게 결찰시킬 수 있다 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269]).
본 발명의 하나의 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드를 막을 가로질러 전위시키는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터 내로 삽입된 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티드에 의해 절단된) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 대해 천연인 신호 서열을 인식하지 않고 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 하나의 측면에서, 발현 시스템의 시스트론 둘 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서, 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 조립되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB 균주)는 디설파이드 결합 형성에 바람직한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 하위유니트의 완전한 폴딩 및 조립을 허용한다 [Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체를 발현하기에 적합한 원핵생물 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람 양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예로는 에쉐리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실러스(Bacilli) (예를 들어, B. 서브틸리스(B. subtilis)), 장내세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, P. 애루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르케스칸스(Serratia marcescans), 클레비시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus ), 시겔라 (Shigella ), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 하나의 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명의 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3 를 비롯한 (미국 특허 번호 제5,639,635호), 균주 W3110 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 수탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어, 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608) 이 또한 적합하다. 상기 예는 제한적이라기 보다는 예시적이다. 한정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 세균의 유도체를 작제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, [Bass et al., 단백질s, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같이 잘 알려져 있는 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용될 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 프로테아제를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
ii . 항체 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절하게는 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA를 원핵생물 숙주 내로 도입시켜, DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기법을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또다른 기법은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵생물 세포를 당업계에 공지되고 선별된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 더해진 루리아 브로쓰(luria broth)(LB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵생물 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 작제를 기초로 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장용의 배지에 첨가된다.
단독으로 또는 복합체 질소 공급원과 같은 또다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입된, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 공급물 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵생물 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 특정 실시양태에서, 이. 콜라이 성장을 위한 성장 온도는 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 39℃; 약 25℃ 내지 약 37℃; 또는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이. 콜라이에 대한 pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 하나의 실시양태에서, 포스페이트 -제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147]을 참고한다). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 분쇄되면, 세포 부스러기 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질을 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서, 항체 생성은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 공급-배치 발효 방법은 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 1000 리터 이상의 용량, 특정 실시양태에서는, 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분산시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건하에서 원하는 밀도, 예를 들어, 약 180-220의 OD 550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기술된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12-50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 폴딩을 개선시키기 위해, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤프론 활성을 갖는 펩티딜프로필 시스, 트랜스-이소머라제)와 같은 샤프론 단백질을 발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵생물 세포를 공-형질전환시킬 수 있다. 샤프론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 완전한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 ([Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]]; 미국 특허 번호 제6,083,715호 (조지오(Georgiou) 등); 미국 특허 번호 제6,027,888호 (조지오 등); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210])
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질분해적으로 감수성인 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 프로테아제가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그의 조합과 같은 공지된 세균 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍성 균주가 이용가능하며, 예를 들면, ([Joly et al. (1998), 상기 동일 문헌]; 미국 특허 번호 제5,264,365호 (조지오 등); 미국 특허 번호 제5,508,192호 (조지오 등); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에서, 프로테아제가 결핍되고 1 종 이상의 샤프론 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
iii . 항체 정제
당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 방법은 적합한 정제 방법의 예시이다: 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과.
하나의 측면에서, 고체상 상에 고정된 단백질 A는 본 발명의 항체 산물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 부위에 고친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레아스(Staphylococcus aureas)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체상은 유리 또는 실리카 표면, 또는 공극이 조절되는 유리 칼럼 또는 규산 칼럼을 포함하는 칼럼일 수 있다. 일부 적용에서, 칼럼을 가능하게는 글리콜과 같은 시약으로 코팅하여 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 첫번째 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제조물을 단백질 A 고정된 고체상 상에 적용하여 당해 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 한다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 당해 항체를 용리에 의해 고체상으로부터 회수한다.
b. 진핵생물 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
진핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터는 하기의 성분들중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
진핵생물 숙주 세포에서 사용하기 위한 벡터 또한 당해 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열, 또는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 리딩 프레임에서 항체를 코딩하는 DNA에 결찰된다.
( ii ) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
( iii ) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커로도 지칭되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 관련될 경우 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서, 선별 처방에도 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또다른 예는 항체 핵산, 예를 들어, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 채택하는데 적격인 세포의 동정을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드산 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별가능한 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 번호 제4,965,199호를 참고한다.
( iv ) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되며 당해 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 통상적으로 함유한다. 진핵세포에 대한 프로모터 서열은 공지되어 있다. 예를 들면, 실제적으로, 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는, AT가 풍부한 부위를 갖는다. 많은 유전자의 전사의 개시부로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또다른 서열은 CNCAAT 부위 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에, 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 상기 서열은 적합하게는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 수두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-충격 프로모터로부터 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 편리하게는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 조기 프로모터는 편리하게는 HindIII E 제한 단편으로서 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용한 포유동물 숙주에서의 DNA를 발현하는 시스템은 미국 특허 번호 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 번호 제4,601,978호에 기재되어 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열은 현재 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 이용할 것이다. 그 예로는 복제 기점 (bp 100-270)의 후기 측면 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 관해 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 참고한다. 인핸서는 항체 폴리펩티드-코딩 서열에 대해 5' 내지 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
( vi ) 전사 종결 성분
진핵생물 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 또한 전형적으로 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때때로 3' 비번역부로부터 이용가능하다. 상기 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위이다. WO 94/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참고한다.
( vii ) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯한, 본원에 기재된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양물 (조직 배양물) 내의 척추동물 세포의 전파는 통상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배지에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 갓난 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 버팀 세포 (TM4, [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2) 이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해, 적절하게는 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
( viii ) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 함스(Ham's) F1O (시그마), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 시그마)와 같은 시판되는 배지는 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, ([Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 번호 제30,985호에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 상기 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것들이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.
( ix ) 항체의 정제
재조합 기법을 이용할 경우, 항체는 세포내에서 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 미립자 부스러기, 숙주 세포 또는 용해된 단편을 일반적으로 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 항체가 배지 내로 분비될 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 농축한다. PMSF 와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 일반적으로 허용되는 정제 기법이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소 타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소 타입 및 인간 γ3 에 대해 권장된다 [Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)]. 친화도 리간드에 부착되는 매트릭스는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 공극이 조절되는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 신속한 유속 및 더 단축된 공정 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함할 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (뉴저지주 필립스버그에 소재하는 제이. 티. 베이커 (J. T. Baker))가 정제에 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전법과 같은 다른 단백질 정제 기법 또한 회수하고자 하는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 이후, 당해 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물에 대해 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충액을 이용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가의 정제를 실시할 수 있으며, 바람직하게는 저염농도 (예를 들면, 약 0-0.25 M 염)로 수행된다.
면역접합체
본 발명은 또한 예로서, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된, 본원에 기술된 임의의 항-EphrinB2 항체를 포함하는, 면역접합체 (상호교환적으로 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로도 명명됨)를 제공한다.
암 치료시 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체를 사용하게 되면 (문헌 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]); 미국 특허 제4,975,278호), 상기 약물 부분을 종양에 표적화 전달할 수 있고, 종양 내에 약물이 세포내 축적되게 할 수 있는데, 상기 약물 제제를 접합시키지 않은 채로 전신 투여하게 되면, 제거하고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 허용가능하지 않은 수준의 독성이 초래될 수 있다 (문헌 ([Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506])). 따라서, 최소 독성을 나타내면서 최대 효능을 나타내고자 하였다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체 둘 모두가 상기 전략법에 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87]). 상기 방법에 사용된 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 ([Rowland et al., (1986)] 상기 문헌]. 항체-독소 접합체에 사용된 독소로는 세균 독소, 예를 들어, 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어, 리신, 소분자 독소, 예를 들어, 겔다나마이신 (문헌 ([Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791])), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 ([Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342]))을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 기전에 의해 그의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성화되거나 덜 활성을 나타내는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)® (이브리투모마브 티욱세탄, 바이오젠/아이덱(Biogen/ Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에 발견된 CD20 항원에 대한 뮤린 IgG1 카파 단일클론 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 이루어진 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al. (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12):4336-42]; [Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비호지킨 림프종(NHL)에 대한 활성을 갖긴 하지만, 이를 투여하게 되면 대부분의 환자에게서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주마브 오조가미신; 와이어스 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 번호 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호). 디설피드 링커 SPP를 통하여 메이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체-약물 접합체인 칸투주마브 메르탄신 (이뮤노젠, 인크.(Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어, 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노젠, 인크.)는 메이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 단일클론 항체로 이루어진 항체 약물 접합체로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료에 대해 시험중이다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴(MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 단일클론 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적임)에 접합시켰고 (문헌 [Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 이는 치료제 개발 중에 있다.
이러한 면역접합체를 생성하는데 유용한 화학요법제가 본원에 (상기) 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예컨대, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참고한다. 방사성접합된 합체 생산을 위해 다양한 방사성핵종이 이용가능하다. 그 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 들 수 있다. 항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참고한다.
항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌로스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 상기 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
i. 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카산 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물 또한 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 번호 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시되어 있다 (상기의 개시 내용은 본원에서 명확하게 참고로 인용된다).
메이탄시노이드 약물 부분은, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 상대적으로 접근가능하고, (ii) 비-디설피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 접합체에서 매력적인 약물 부분이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료 용도는, 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,208,020호; 제5,416,064호; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있다 (상기의 개시 내용은 본원에서 명확하게 참고로 인용된다). [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 직장결장암에 대한 단일클론 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 (DM1로 명명됨)를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다. [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 디설파이드 링커를 통하여, 인간 결장암 세포주 상의 항원과 결합하는 뮤린 항체 A7과 접합되어 있거나, HER-2/neu 종양유전자와 결합하는 또다른 뮤린 단일클론 항체 TA.1과 접합되어 있는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은, 세포당 3 x 105개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 시험하였다. 이러한 접합체 약물은 메이탄시노이드 무함유 약물과 유사한 정도의 세포독성을 나타내었는데, 이때 세포독성은 항체 분자 1개당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 강화시킬 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않고 메이탄시노이드 분자에 항체를 화학적으로 결합시킴으로써 제조된다. 예컨대, 미국 특허 번호 제5,208,020호 (상기의 개시 내용은 본원에서 명확하게 참고로 인용된다)를 참고한다. 항체 분자당 접합된 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타내지만, 항체당 독소 심지어 하나의 분자라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,208,020호, 및 상기에 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 환 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어, 각종 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어, 미국 특허 번호 제5,208,020호 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 것을 비롯한, 항체-메이탄시노이드 접합체의 제조를 위한 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/960,602호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는 상기-확인된 특허에 개시된 바와 같은 디설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함하며, 디설파이드기 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되어 있으며 예시되어 있다.
항체와 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)] 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)를 비롯한, 특정 커플링제가 디설파이드 결합을 제공한다.
링커는 결합 유형에 따라서, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기법을 이용하여 하이드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이러한 반응은 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 개질된 C-14 위치, 하이드록실기로 개질된 C-15 위치, 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
ii. 아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드성 유사체 및 유도체, 예로서, 아우리스타틴에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 제5635483호; 제5780588호). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 간섭하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (미국 특허 번호 제5663149호) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 부분은 펩티드성 약물 부분의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 2004년 11월 5일자로 출원된 것으로서 발명의 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"인 미국 출원 번호 제10/983,340호 (상기의 개시 내용 전문이 본원에서 명확하게 참고로 인용된다)에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기초 약물 부분은 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어, 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 지질상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press]를 참조한다)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 부분은 (미국 특허 번호 제5635483호; 미국 특허 번호 제5780588호; (문헌 [Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]))에 따라 제조될 수 있다. 또한, (문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일자로 출원된 것으로서 발명의 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"인 미국 출원 번호 제10/983,340호 (그 전문이 본원에 참고로 인용됨) (예를 들어, 링커, 및 링커에 접합된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물의 제조 방법이 개시됨)을 참조한다.
iii. 칼리케아미신
다른 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 이중가닥 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성할 수 있다. 칼리케아미신 계열의 접합체를 제조하는 방법에 대해서는 미국 특허 번호 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company)의 특허임)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I , α3 I , N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (문헌 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]) 및 상기한 아메리칸 시아나미드의 미국 특허들). 항체와 접합될 수 있는 또다른 항종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 모두는 세포내 작용 부위를 갖고 있고, 형질막을 용이하게 교차하지 않는다. 그러므로, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 제제의 세포 흡수는 그의 세포독성 효과를 상당히 증대시킨다.
iv. 기타 세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 번호 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된, 총체적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 제제 계열 뿐만 아니라, 에스페라마이신 (미국 특허 번호 제5,877,296호)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 특정 항체와, 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 방사성접합된 항체 생성을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용될 수 있다. 일례로 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체를 진단용으로 사용하는 경우에는, 접합체는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를들면, tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 핵자기공명(NMR) 영상화(자기공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성-표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 예를 들어, 수소 대신, 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐(IODOGEN) 방법 [Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57]을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참조한다. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설피드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특별히, 가교제 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (미국 일리노이주 로크포드에 소재하는 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.))를 사용하여 제조된 ADC를 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
v. 항체 약물 접합체의 제조
본 발명의 항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체(Ab)를 하나 이상의 약물 부분(D), 예를 들어, 항체당 약 1 내지 약 20개 약물 부분에 링커(L)를 통하여 접합시킨다. 하기 화학식(I)의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 부분 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 부분의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. 추가의 ADC 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.
Ab-(L-D)p (I)
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분으로는 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로파노일("MP"), 발린-시트룰린("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")를 들 수 있다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에 기재되어 있다. 또한, 2004년 11월 5일자로 출원된 것으로서 미국 출원 번호 제10/983,340호 (발명의 명칭이 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"이며, 그 전문이 본원에 참고로 인용됨)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분으로는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 들 수 있다. 예시적인 디펩티드로는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드로는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연적으로 발생된 것 뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비-천연적으로 발생된 아미노산 유사체, 예를 들어, 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 그의 선택성에서 설계되고 최적화될 수 있다.
항체 상의 친핵기로는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어, 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어, 시스테인; 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체가 글리코실화된다)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 아민, 티올 및 하이드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어, (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 쇄간 디설피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제, 예를 들어, DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 이로써, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시켜 주는 리신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통하여 추가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-반응성 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하도록 항체를 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어, 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적당한 기와 반응할 수 있는 단백질 내에 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 생성될 수 있다 (문헌 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
또한, 약물 부분 상의 친핵기로는 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어, (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
별법으로, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예컨대, 재조합 기법 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 일정 길이의 DNA는 접합체의 원하는 성질을 파괴시키지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 격리되거나 또는 서로 인접해 있는 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비-표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙트아비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 청소제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환물로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합되는 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
제약 제제
본 발명의 항체를 포함하는 치료학적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]) 수용액 형태, 동결건조된 제제 또는 다른 건조된 제제의 형태로 저장용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기가 약 10개 미만인) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 트윈™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 들 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합물 내에 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 매크로에멀젼 내에 포접될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방형 제제는 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 매트릭스가 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태인 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 들 수 있다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 동안에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 체내에 오랜 시간 동안 잔류할 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 소실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래할 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디설피드 상호교환을 통한 분자내 SS 결합 형성인 것으로 밝혀질 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 개질하고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 전개함으로써 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 증가된 EphrinB2의 발현 및/또는 활성과 관련된 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 종양 또는 암 성장을 감소, 억제 또는 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 또한 혈관신생을 억제시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 혈관신생 부위는 종양 또는 암이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 억제시키는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병이다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 안구내 혈관신생 질환이다.
또한, 본 발명의 항체 중 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 예컨대, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 기타 포유동물 대상체 (예컨대, 침팬지, 비비, 명주원숭이, 시노몰구스 및 레수스, 돼지 또는 마우스)에서 특이적인 항원 활성 결합에 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원과 접촉시켜 항원 활성이 억제되도록 함으로써 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 항원은 인간 단백질 분자이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 항원이 결합하도록 하는 것을 포함하는, 증가된 항원 발현 및/또는 활성과 관련된 질병을 앓고 있는 대상체에서 항원을 결합시키는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상체는 인간 대상체이다. 별법으로, 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현시키는 포유동물일 수 있다. 또한 추가로, 대상체는 항원이 도입된 (예컨대, 항원 투여에 의해, 또는 항원 트랜스진 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적으로 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 면역글로불린이 교차-반응하는 항원을 발현하는 비인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 관해서, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어, 투여량 및 투여의 시간 과정을 시험하는데) 유용할 수 있다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 항원 분자의 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 질병 또는 상태를 치료, 억제, 진행의 지연, 재발의 방지/지연, 호전 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
예시적인 질병은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 악성 림프 종양을 포함한다. 더욱 특정의 상기 암의 예로는 편평 세포 암 (예컨대, 편평 상피 세포 암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 비롯한 위암 (gastric 또는 stomach cancer), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 침샘암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상샘암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 흑색종, 다발 골수종 및 B-세포 림프종, 뇌암 뿐만 아니라, 두경부암, 및 관련된 전이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 소세포 폐암, 신경모세포종, 흑색종, 유방암종, 위암, 직장결장암(CRC), 및 간세포암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체는 또한 세포 퇴행 또는 기능장애를 포함하는 병리학적 질병의 치료 (예방 포함)에도 유용하며, 예로서는 각종 (만성) 신경퇴행성 질병 및 급성 신경 세포 손상 치료에도 유용하다. 그러한 신경퇴행성 질병으로는 말초 신경병증; 운동신경병, 예로서, 근위축성 측삭 경화증 (ALS, 루게릭병), 벨 마비, 및 척수 근육 위축 또는 마비를 비롯한 각종 상태; 및 기타 인간 신경퇴행성 질환, 예로서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간질, 다발 경화증, 헌팅톤 무도병, 다운 증후군, 신경농, 및 메니에르병, 및 급성 신경 세포 손상, 예를 들어, 외상 또는 척수 손상에 기인한 것 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포독성제(들)과 접합된 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그가 결합하는 면역접합체 및/또는 항원은 세포에 내재화되어 그가 결합하는 표적 세포를 사멸시킬 때 면역접합체의 치료학적 효능을 증가시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포에서 핵산을 표적하거나 그를 간섭한다. 하나의 실시양태에서, 세포독성제는 미소관 중합화를 표적하거나 그를 간섭한다. 세포독성제의 예로는 본원에서 언급된 화합요법제 (예로서, 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 또는 칼리케아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 중 임의의 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 항체, 화학요법제(들) (화학요법제 칵테일 포함), 기타 세포독성제(들), 항-혈관신생제(들), 사이토카인, 및/또는 성장 억제제(들)와 함께 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제시키는 경우, 또한 종양 성장을 억제시키는 하나 이상의 다른 치료제(들)과 함께 조합되는 것이 특히 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자는 조합 방사선 요법 (예컨대, 방사성 표지된 제제와 함께 사용되는 외부 방사선 조사 또는 외부 방사선 요법)을 받을 수 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합된 투여 (2종 이상의 제제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함될 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 부가 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
조합 요법
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 항-EphrinB2 항체가 또다른 요법과 함께 투여되는 조합 요법을 제공한다. 예를 들어, 항-EphrinB2 항체는 각종 신생물성 또는 비-신생물성 상태를 치료하기 위한 항-암 치료제 또는 항-신생혈관형성 치료제와 함께 조합하여 사용된다. 하나의 실시양태에서, 신생물성 또는 비-신생물성 상태는 이상 또는 원치않는 혈관신생과 관련된 병적 질병을 특징으로 한다. 항-EphrinB2 항체는 상기 목적에 효과적인 또다른 제제와 연속하여 또는 조합하여 동일한 또는 별개의 조성물로서 투여될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 다수의 EphrinB2 억제제가 투여될 수 있다.
항-EphrinB2 항체를 투여하는 것은 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용함으로써 동시에 예컨대, 단일 조성물로서, 또는 2개 이상의 별도의 조성물로서 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 투여는 순차적으로 임의 순서대로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 조성물 투여 사이의 시간 간격은 몇 분 내지 몇 일부터 몇 주 내지 몇 개월 범위일 수 있다. 예를 들어, 먼저 항암제를 투여한 후에 EphrinB2 억제제를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여할 수 있거나, 항-EphrinB2 항체를 먼저 투여하는 것도 고려된다.
항-EphrinB2 항체와 함께 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 재량으로 할 수 있다. 치료하고자 하는 상태를 최대로 관리할 수 있도록 투여량은 투여되고 조정될 것이다. 투여량은 추가로 사용되는 치료제의 유형 및 치료될 특정 환자와 같은 인자에 의존하게 될 것이다. 항암제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 것이며, 이는 항암제 및 항-EphrinB2 항체의 조합된 작용 (시너지)에 의해 감소될 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제제의 조합은 단일 억제제의 효능을 증강시킨다. 상기 "증강시킨다"라는 용어는 그의 공통된, 또는 승인된 용량에서 치료제의 효능이 개선된다는 것은 지칭한다.
전형적으로, 병적 질병, 예로서, 종양 성장 또는 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키는 항-EphrinB2 항체 및 항암제는 동일하거나 유사한 질환에 적합하다. 하나의 실시양태에서, 항암제는 항-혈관신생제이다.
암과 관련된 항혈관신생 요법은 종양 성장을 지지해 주는 영양분을 제공하는데 필요한 종양 혈관 발생을 억제시키는 것을 목적으로 하는 암 치료 전략법이다. 혈관신생이 원발성 종양 성장 및 전이, 둘 모두에 관여하기 때문에 본 발명에 의해 제공되는 항혈관신생 요법은 원발성 부위에서의 종양의 신생물성 성장을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라, 2차 부위에서의 종양의 전이도 예방할 수 있고, 이로써, 다른 치료제에 의해 종양을 공격할 수 있다.
본원에 열거되어 있는 것, 예컨대, 정의부에 열거되어 있거나, 예컨대, 문헌 ([Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)])에 의한 것을 비롯한, 다수의 항-혈관신생제가 동정되었고, 당업계에 공지되어 있다. 또한 US 특허 출원 US20030055006도 참고한다. 하나의 실시양태에서, 항-EphrinB2 항체는 예를 들어, 가용성 VEGF 수용체 (예컨대, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예컨대, NRP1, NRP2)) 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 저분자량 억제제 (RTK), VEGF에 대한 안티센스 전략, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체; 및 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항-VEGF 중화 항체 (또는 단편) 및/또는 또다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, VEGF 길항제 및 기타 제제 이외에도 2개 이상의 혈관신생 억제제가 임의로 환자에게 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대, 항암제가 항-EphrinB2 항체, VEGF 길항제, 및 항-혈관신생제와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 항-EphrinB2 항체와의 조합 종양 요법에 유용한 다른 치료제로는 다른 암 요법 (예컨대, 수술, 방사선 요법 (예컨대, 방사능 물질 조사 또는 투여 포함), 화학요법, 본원에 열거되어 있고 본원에 공지되어 있는 항암제를 사용하는 요법, 또는 그의 조합)을 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시되어 있는, 동일하거나, 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2개 이상의 항체가 환자에게 공-투여될 수 있다. 종종, 환자에게 하나 이상의 사이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다.
화학요법제
특정 측면에서, 본 발명은 암에 걸리기 쉽거나, 암에 걸린 것으로 진단받은 환자에게 유효량의, EphrinB2 길항제 및/또는 혈관신생 억제제(들) 및 하나 이상의 화학요법제를 투여함으로써 종양 성장 또는 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 조합 요법에서 다양한 화학요법제가 사용될 수 있다. 고려시되는 화학요법제의 예시적이며 비-제한적인 목록은 본원 "정의"하에 제공한다.
당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 일반적으로 화학요법제의 적절한 투여량은 대략적으로 이미 임상 요법에 사용되는 것이 될 것이며, 여기서, 화학요법제는 단독 투여되거나, 다른 화학요법제와 함께 조합하여 투여될 것이다. 투여량은 치료하는 상태에 따라 달라질 수 있다. 개체 대상체에 대하여 적절한 투여량은 요법을 투여하는 의사가 결정할 수 있을 것이다.
재발성 종양 성장
본 발명은 또한 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 억제하거나 예방하는 방법 및 조성물을 제공한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장은, 현재 하나 이상의 이용가능한 요법 (예컨대, 암 요법, 예로서, 화학요법, 방사선 조사 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 생물학적 요법/면역요법, 항-VEGF 항체 요법, 특히, 특정 암을 위한 표준 치료 요법)을 받고 있거나, 그로 치료받고 있는 환자에서 임상적으로 환자를 치료하기에 부적합하거나, 환자가 상기 요법으로부터 더 이상 유익한 효능을 얻지 못하여 이들 환자는 추가의 효과적인 요법을 필요로 하는 것인 상태를 기술하기 위하여 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 상기 어구는 또한 예컨대, 요법에 반응하되 여전히 부작용으로 고생하거나, 내성이 발생되었거나, 요법에 반응하지 않거나, 요법에 대하여 만족할 정도의 반응을 나타내지 않는 환자 등을 기술하는, "무-반응/불응" 환자의 상태를 지칭할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 암은 암 세포의 수가 유의적으로 감소하지 않았거나, 그 수가 증가하였거나, 종양 크기가 유의적으로 감소하지 않았거나, 그 크기가 증가하였거나, 암 세포의 크기나 수가 추가로 감소하지 않은 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장이다. 암 세포가 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장인지 여부는 상기와 관련하여 "재발" 또는 "불응" 또는 "무-반응"에 대하여 당업계에서 허용된 수단을 사용함으로써 요법이 암 세포에 미치는 효능을 분석하는 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 생체내 또는 시험관내에서 결정될 수 있다. 항-VEGF 요법에 대하여 내성을 띠는 종양이 재발성 종양 성장의 일례이다.
본 발명은 대상체에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위해 하나 이상의 항-EphrinB2 항체를 투여함으로써 대상체에서 하나 이상의 항-EphrinB2 항체를 차단하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 암 치료제 이후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-EphrinB2 항체는 암 요법과 동시에 투여된다. 별법으로, 또는 추가로, 항-EphrinB2 항체 요법이 또다른 암 요법과 서로 교대로 사용될 수 있고, 이는 임의 순서대로 실시될 수 있다. 본 발명은 또한 암에 대한 소인을 갖는 환자에서 암의 발병 또는 재발을 예방하기 위하여 하나 이상의 억제성 항체를 투여하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 대상체는 암 요법을 받은 경험이 있거나, 현재 받고 있는 중이다. 하나의 실시양태에서, 암 요법은 항-혈관신생제, 예컨대, VEGF 길항제를 사용하는 요법이다. 항-혈관신생제로는 당업계에 공지된 것을 포함하며, 이는 본원 정의 하에서 찾아볼 수 있는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항-혈관신생제는 항-VEGF 중화 항체 또는 단편 (예컨대, 인간화된 A4.6.1, 아바스틴(AVASTIN)® (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 등)이다. 예컨대, 미국 특허 6,582,959, 6,884,879, 6,703,020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868 B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; 문헌 ([Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004)]; 및 WO2005012359를 참조한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단하거나 감소시키기 위하여 VEGF 길항제 및 항-EphrinB2 항체와 함께 조합하여 추가의 제제를 투여할 수 있으며, 예컨대, 본원 조합 요법이란 표제하의 섹션을 참조한다.
본 발명의 항체 (및 부가 치료제)는 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비내, 및 필요할 경우 국소 치료용으로, 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 적합하게는 특히 항체의 감소하는 투여량으로 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여량은 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 부분적으로 투여가 간단한지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의료 실시와 일치하는 방식으로 제제화, 투여량화 및 투여될 것이다. 본 내용에서 고려하는 인자로는 치료될 특정 질병, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 질병 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 실시자에게 공지된 다른 인자를 들 수 있다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 질병을 예방하거나 치료하는데 통상적으로 사용되는 1종 이상의 제제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 질병 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 화학요법제와 같은 다른 제제와 조합으로 사용될 경우)은 치료될 질환의 종류, 항체의 종류, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방학적 또는 치료학적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 의존할 것이다. 항체는 적합하게는 1회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 별개 투여로든 연속 주입으로든, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, O.1 mg/kg 내지 1O mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상이 원하는 정도로 억제될 때까지 지속될 것이다. 한 가지 예시적인 항체의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매 3주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 20회, 예를 들어, 약 6회 투여량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 적재 투여량 후 1회 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 요법은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 적재 투여량 후 약 2 mg/kg의 항체를 매주 유지 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 요법도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
하기 기술하는 바와 같이 표지되고/거나 불용성 매트릭스 상에 고정된, 본 발명의 항-EphrinB2 항체는 특정 세포 또는 조직에서 EphrinB2 발현을 검출하는 분석법 (예로서, 진단 또는 예후 분석법)에 유용하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 샘플에서 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2 검출 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "검출"이라는 용어는 대조군과 관련되거나, 대조군과 무관한 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 질병을 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내에서 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2 발현 및/또는 활성과 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, EphrinB2 발현은 증가된 발현이거나 비정상적인 발현이다. 일부 실시양태에서, 질병은 종양, 암, 및/또는 세포 증식 질병이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 검출가능한 표지를 포함하는, 본원에 기술된 임의의 항-EphrinB2 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항-EphrinB2 항체와 EphrinB2의 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-EphrinB2 항체는 검출가능하게 표지된다.
항-EphrinB2 항체는 잘 공지되어 있는 다수의 검출 분석 방법들 중 어느 하나에서 EphrinB2 검출을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 공급원으로부터 샘플을 수득하고, 상기 샘플을 항-EphrinB2 항체와 혼합하여 항체가 혼합물내 존재하는 임의의 EphrinB2와 함께 항체/EphrinB2 복합체를 형성할 수 있도록 하고, 혼합물내 존재하는 임의의 항체/EphrinB2 복합체를 검출함으로써 생물학적 샘플을 EphrinB2에 대하여 분석할 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 것으로서, 특정 샘플에 적합한 방법에 의해 분석용의 생물학적 샘플을 제조할 수 있다. 샘플과 항체를 혼합하는 방법 및 항체/EphrinB2 복합체를 검출하는 방법은 사용되는 분석법 유형에 따라 선택된다. 예로서, 분석법으로는 면역조직학적 화학법, 경쟁 및 샌드위치 분석법, 및 입체 억제 분석법을 포함한다.
EphrinB2에 대한 분석 방법은 모두 하기 시약들 중 하나 이상을 사용한다: 표지된 EphrinB2 유사체, 고정된 EphrinB2 유사체, 표지된 항-EphrinB2 항체, 고정된 항-EphrinB2 항체 및 입체 접합체. 표지된 시약은 또한 "트레이서"로도 알려져 있다.
사용되는 표지는 EphrinB2와 항-EphrinB2 항체의 결합을 간섭하지 않는, 임의의 검출가능한 관능기이다. 면역분석법용으로 다수의 표지가 공지되어 있고, 예로는 직접 검출될 수 있는 부분, 예로서, 플루오로크롬, 화학발광제 및 방사능 표지뿐만 아니라, 검출되도록 반응되거나 유도화되어야 하는 부분, 예로서, 효소를 포함한다. 그러한 표지의 예로 하기를 포함한다: 사용되는 표지는 EphrinB2와 항-EphrinB2 항체의 결합을 간섭하지 않는, 임의의 검출가능한 관능기이다. 면역분석법용으로 다수의 표지가 공지되어 있고, 예로는 직접 검출될 수 있는 부분, 예로서, 플루오로크롬, 화학발광제 및 방사능 표지뿐만 아니라, 검출되도록 반응되거나 유도화되어야 하는 부분, 예로서, 효소를 포함한다. 그러한 표지의 예로 방사성 동위원소 32 P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 플루오로포어, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플로오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 댄실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예컨대, 반딧불 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 호스래디시 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 과산화수소를 사용하여 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예로서, 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
상기 표지를 단백질 또는 폴리펩티드와 공유 결합하는 데에 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조틴화 벤지딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 상기의 형광, 화학발광 및 효소 표지로 항체를 태깅할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제3,940,475호 (형광분석법) 및 제3,645,090호 (효소), 문헌 ([Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962)], [David et al., Biochemistry , 13: 1014-1021 (1974)], [Pain et al., J. Immunol . Methods, 40: 219-230 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem ., 30: 407-412 (1982)])을 참조한다. 본원에서 바람직한 표지는 호스래디시 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소이다. 효소를 비롯한 상기 표지의 항체와의 접합은 면역분석 기법에서 일반적인 기법 중 하나인 표준 조작 방법이다. 예를 들면, 문헌 [O'Sullivan et al., 'Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,' in Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp.147-166]을 참조한다.
시약의 고정화는 특정 분석 방법에 필요하다. 고정화는 용액에 자유롭게 남아있는 임의의 EphrinB2로부터 항-EphrinB2 항체를 분리시킨다. 이는 통상적으로 분석 방법 전에 항-EphrinB2 항체 또는 EphrinB2 유사체를 불용화시켜, 예를 들면, 수 불용성 매트릭스 또는 표면에 흡착시켜 (Bennich et al., 미국 특허 제3,720,760호), 공유 커플링 (예를 들면, 글루타랄데히드 교차 결합을 사용함)에 의해, 나중에 항-EphrinB2 항체 또는 EphrinB2 유사체를 불용화시켜, 예를 들면, 면역침전에 의해 수행한다.
샘플내 단백질 발현은 면역조직학적 화학법 및 염색 프로토콜을 사용함으로써 검사될 수 있다. 조직 절편의 면역조직학적 화학 염색은 샘플내 단백질의 존재를 평가하거나 검출하는데 있어 신뢰할 수 있는 방법으로 보여진다. 면역조직학적 화학법("IHC") 기법은 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 프로브하고 시각화하기 위하여 항체를 사용한다. 샘플 제조를 위해 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예로는 암 세포, 예로서, 결장암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 난소암 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 췌장암 세포, 림프종암 세포, 및 백혈병암 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 샘플은 수술적 절제술, 흡인 또는 생검을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수득할 수 있다. 조직은 새로운 것이거나, 냉동된 것일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 샘플 파라핀 등에 고정되고 포매된다. 조직 샘플은 종래 방법에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다. 당업계의 숙련인은 샘플이 조직학적으로 염색되거나, 다르게는 분석되도록 하기 위한 목적에 의해 고정액 선택에 대한 결정하게 될 것이라는 것을 이해할 것이다. 당업계의 숙련인은 또한 고정 기간은 사용되는 고정액과 조직 샘플의 크기에 달려있음을 이해할 것이다.
IHC는 예로서, 형태학적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가의 기법과 함께 조합하여 실시될 수 있다. 2개의 일반적인 IHC 방법; 직접 및 간접 분석법이 이용가능하다. 제1 분석법에 따라 표적 항원 (예컨대, EphrinB2)에 대한 항체의 결합을 직접 측정한다. 이러한 직접적인 분석법은 표지된 시약, 예로서, 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용하는데, 이는 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있다. 전형적인 간접 분석법에서, 비접합된 1차 항체는 항원에 결합하고, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소적 표지에 접합되었을 경우, 발색 또는 형광 기질이 첨가되어 항원을 시각화시킨다. 수개의 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호는 증폭된다.
면역조직학적 화학법용으로 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하며, 일반적으로 이는 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, IHC 전, 동안 또는 후에 조직 절편의 추가적인 처리가 요구될 수 있다. 예를 들어, 에피토프 복구 방법, 예를 들어, 시트레이트 완충액에서 조직 샘플을 가열하는 것이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al., Appl . Immunohistochem . 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편은 1차 항체가 조직 샘플 내의 표적 단백질 항원에 결합하도록 적절한 조건하에 충분한 시간 동안 1차 항체에 노출된다. 이를 달성하기에 적합한 조건은 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 임의의 하나를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 다중클론 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
이렇게 제조된 표본을 마운팅(mounting)하여 커버를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어, 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 결정하고, 당업계에서 일상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 염색 강도 기준은 하기와 같이 평가될 수 있다:
염색 패턴 점수
세포에서 염색이 관찰되지 않음 0
희미한/거의 감지할 수 없는 염색이 10%를 초과하는 세포에서 검출됨 1+
약한 수준 내지 중등도의 염색이 10%를 초과하는 세포에서 관찰됨 2+
중등도 내지 강한 염색이 10%를 초과하는 세포에서 관찰됨 3+
전형적으로, 이같은 IHC 분석법에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 점수가 증상을 나타내거나 전조가 된다. 일부 실시양태에서는 약 1+ 이상의 염색 패턴 점수가 증상을 나타내거나 전조가 된다. 다른 실시양태에서, 약 3+ 이상의 염색 패턴 점수가 증상을 나타내거나 전조가 된다. IHC를 사용하여 종양 또는 결장 샘종으로부터의 세포 및/또는 조직을 검사할 때, 염색은 일반적으로 (샘플내 존재할 수 있는 간질 조직 또는 주변 조직과는 대조되는) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정되거나 평가된다는 것을 이해할 것이다.
경쟁 또는 샌드위치 분석법으로 알려진 다른 분석 방법은 상업적인 진단 산업에서 잘 확립되어 있고, 널리 이용된다.
경쟁 분석법은 제한된 수의 항-EphrinB2 항체 항원-결합 부위에 대해 트레이서 EphrinB2 유사체가 시험 샘플 EphrinB2와 경쟁하는 능력에 의존한다. 항-EphrinB2 항체는 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 불용화되고, 그 후 항-EphrinB2 항체에 결합된 트레이서 및 EphrinB2를, 결합되지 않은 트레이서 및 EphrinB2로부터 분리시킨다. 따라내거나 (결합된 파트너가 미리 불용화되는 경우) 원심분리에 의해 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 침전하는 경우) 분리시킨다. 시험 샘플 EphrinB2의 양은 마커 물질의 양에 의해 측정된 결합된 트레이서의 양에 반비례한다. 기지량의 EphrinB2를 사용한 투여량-반응 곡선을 작성하고, 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 EphrinB2의 양을 정량적으로 측정한다. 검출가능한 마커로서 효소를 사용하는 경우에, 이 분석을 ELISA 시스템이라 부른다.
"균질" 분석법이라 불리는 다른 종류의 경쟁 분석법은 파지 분리를 필요로 하지 않는다. 이 방법은, 항-EphrinB2 항체가 EphrinB2에 결합하는 경우 항-EphrinB2 항체 의 존재가 효소 활성을 변형시키도록, EphrinB2와 효소의 접합체를 제조하고 이것을 이용한다. 이 경우에, EphrinB2 또는 그의 면역학적 활성 단편은 이관능성 유기 브리지에 의해 퍼옥시다제와 같은 효소에 접합된다. 항-EphrinB2 항체를 이용하여, 항-EphrinB2 항체의 결합이 표지의 효소 활성을 저해하거나 증가시키는 것에 대해 상기 접합체를 선별한다. 본래 이 방법은 EMIT라는 이름으로 널리 수행된다.
입체 접합체는 균질 분석을 위한 입체 장애 방법에 이용된다. 저분자량 합텐을 작은 EphrinB2 단편과 공유 결합시켜 상기 접합체를 합성함으로써, 합텐에 대한 항체가 실질적으로 항-EphrinB2 항체로서 동시에 접합체를 결합할 수 없게 된다. 이 분석법에서, 시험 샘플에 존재하는 EphrinB2는 항-EphrinB2 항체에 결합하고, 이로 인해 항-합텐이 접합체에 결합되어, 접합체 합텐의 특성이 변하며, 예를 들면, 합텐이 플루오로포어인 경우, 형광이 변한다.
샌드위치 분석법은 특히 EphrinB2 또는 항-EphrinB2 항체의 측정에 유용하다. 연속적인 샌드위치 분석법에서 고정된 항-EphrinB2 항체를 사용하여 시험 샘플 EphrinB2를 흡착시키고, 시험 샘플을 세척으로 제거하고, 결합된 EphrinB2를 사용하여 두번째로 표지된 항-EphrinB2 항체를 흡착시킨 후, 결합된 물질을 잔류 트레이서로부터 분리시킨다. 결합된 트레이서의 양은 시험 샘플 EphrinB2에 직접 비례한다. "동시" 샌드위치 분석법에서 시험 샘플을 표지된 항-EphrinB2를 첨가하기 전에 분리시키지 않는다. 하나의 항체로서 항-EphrinB2 단일클론 항체 및 다른 항체로서 다중클론 항-EphrinB2 항체를 사용하는 연속적인 샌드위치 분석법이 EphrinB2에 대한 샘플 시험에 유용하다.
상기의 것은 단지 EphrinB2에 대한 대표적인 진단 분석법이다. EphrinB2를 측정하기 위해 항-EphrinB2 항체를 사용하는 현재 또는 미래에 개발되는 다른 방법은 상기 기재된 생체분석법을 비롯한 본원의 범위 내에 포함된다.
제조 물품
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 기재된 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 상기 용기 상의 라벨 또는 상기 용기와 결합된 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물(들)과 조합으로 포함하며, 멸균 주입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택의 상태, 예로서, 암을 치료하는데 유용함을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제조 물품은 조성물이 특정 상태, 예로서, 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 제조 물품은 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 일반적 기재가 상기에 제공되었으므로 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다고 이해된다.
실시예 1: 항- EphrinB2 항체의 생성
관심있는 항체가 수득될 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 상보성-결정 영역 (CDR) 내에 다양성을 도입시킴으로써 단일 프레임워크 (인간화된 항-ErbB2 항체, 4D5) 상에서 합성 파지 항체 라이브러리를 구축하였다 (문헌 [Lee, C. V. et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004)]; [Liang, W. C. et al. J Biol Chem 281, 951-61 (2006)]). 맥시소프(maxisorp) 면역플레이트 상에 고정된 His-태그가 부착된 인간 EphrinB2에 대해 온전한 라이브러리를 사용하여 플레이트 패닝(panning)을 수행하였다. 4 라운드의 풍부화를 수행한 후에, 클론을 무작위적으로 피킹(picking)하고, 파지 ELISA를 이용하여 특이적 결합물질을 확인하였다. 생성된 hEphrinB2 결합 클론을 추가로 His-태그 부착된 뮤린 EphrinB2 단백질로 스크리닝하여 교배-종 클론을 동정하였다. 클론 19에 대해 상기 분석을 바람직하게 수행하였고, 추가의 특징화를 위해 선별하였다. 각각의 양성 파지 클론에 대해, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 전 장 IgG 쇄를 발현시키도록 조작된 pRK 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 구축물로 293 또는 CHO 세포를 공동-형질감염시키고, 발현된 항체는 단백질 A 친화도 컬럼을 사용하여 혈청-무함유 배지로부터 정제하였다. EphrinB2 및 EphB 수용체 사이의 상호작용 차단에 대해서는 ELISA를 이용하고, 전장 인간 EphrinB2 또는 뮤린 EphrinB2를 발현시키는 안정한 세포주로의 결합에 대해서는 FACS를 이용하여 정제된 항체를 시험하였다. 친화도 성숙을 위해, 관심있는 초기 클론으로부터 유래된 CDR 루프 (CDR-L3, -H1 및 -H2)의 3 가지 상이한 조합을 포함하는 파지 라이브러리를 유연한 무작위화 전략에 의해 각각의 선별된 위치가 비-야생형 잔기로 돌연변이화되거나 또는 약 50:50의 빈도수로 야생형으로 유지되도록 구축하였다 (Liang et al., 2006, 상기 문헌). 이어서, 점진적으로 증가하는 엄격도를 갖는 인간 및 뮤린 His-태그 부착된 EphrinB2 단백질 둘 모두에 대한 4 라운드의 용액상 패닝을 수행하여 고친화도 클론을 동정하였다. 선별된 클론을 파지 ELISA로 스크리닝한 후에, Fab 단백질로서 발현시키고, 그의 친화도를 비아코어를 사용하여 측정하였다. 모체 클론 19 및 친화도 성숙된 클론의 HVR 영역의 서열을 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 항- EphrinB2 항체의 특징화
마우스 항-에프린B2 Mabs의 결합 친화도를 측정하기 위하여 비아코어™-3000을 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SRP) 측정법을 사용하였다 (뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.). 요컨대, 공급자의 설명서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미 노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항-EphrinB2 항체를 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ug/mL로 희석한 후, 5 ul/분의 유속으로 주사하여 커플링된 항체를 대략 500 반응 단위(RU)에 도달시켰다. 이어서, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 기를 차단시켰다. 동력학 측정을 위해, 인간 또는 뮤린 EphrinB2-His 분자의 2배로 희석된 일련의 희석액 (0.7 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 25 ul/분의 유속으로 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS로 주사하였다. 단순 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산하였다. 상기 실험 결과를 표 3에 나타내었다. "NA"는 측정하지 않았다는 것을 의미한다.
Figure 112008058923458-PCT00029
실시예 3: 항- EphrinB2 항체로의 처리가 세포-기재 분석에서 EphB4 신호전달을 차단한다
항-EphrinB2 항체가 막-결합된 EphrinB2 및 EphB4의 상호작용을 차단하는 능력을 입증하기 위해, 본원 발명자들은 EphB4 및 EphrinB2가 상이한 세포 유형에서 제시되는 세포-기재 분석을 수행하였다. 인간 EphrinB2를 과발현시키는 3T3 세포를 사용하여 EphB4는 높은 수준으로 발현시키나 EphrinB2는 낮은 수준으로 발현시키는 HUVEC 세포를 자극하였으며, 항-EphB4 항체가 EphB4 활성화를 억제하는 능력을 시험하였다.
인간 EphrinB2를 과발현시키는 3T3 세포는 다음과 같이 제조하였다: 인간 전장 EphrinB2를 pcDNA5/FRT 벡터 (인비트로젠; Invitrogen)에 클로닝한 후에, 이를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 3T3.Flp 세포 (인비트로젠)를 갖는 안정한 세포주를 생성하였다.
인간 EphrinB2를 과발현시키는 3T3 세포를 항-EphB4 항체의 존재 또는 부재하에 15 분 또는 30 분 동안 HUVEC 세포 상에 오버레이시켰다. EphB4 단백질을 면역침전시켜 EphB4 수용체의 활성화를 평가한 후에, 웨스턴 블랏팅을 이용하고 항-포스포-티로신 항체 (항체 4G10; 업스테이트(Upstate))를 사용하여 EphB4 수용체 티로신 인산화의 존재 또는 부재 여부를 검출하였다. 요컨대, 세포를 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리에 의해 정화하고, 항-EphB4 항체 35.2D8을 5 ug/샘플로 첨가하였다. 4 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에, 면역복합체를 단백질 A 아가로스를 사용하여 풀 다운시켰다. EphB4 인산화를 1 ug/ml 농도에서 항-포스포티로신 항체 4G10 (업스테이트)을 사용하여 웨스턴 블랏에 의해 분석하였다.
상기 실험 결과를 도 7에 나타내었다. HUVEC 세포 상의 3T3 세포의 오버레이에 의해 EphB4의 뚜렷한 티로신 인산화가 일어났다 (레인 2). 3T3-EphrinB2 세포를 오버레이시킴으로써 유도된 EphB4 티로신 인산화는, 항-EphB4 항체 (5 ug/ml의 클론 19.2D3)와 HUVEC의 30분간의 예비인큐베이션을 통해 효과적으로 소멸되었다 (레인 3). 대조적으로, 처리되지 않은 HUVEC 세포는 EphB4 활성화를 입증하지 못하였고 (레인 1), 처리되지 않은 3T3-에프린B2 세포도 EphB4 활성화를 입증하지 못하였다 (레인 4). 이들 결과는 항-EphrinB2 항체로의 처리가 직접적인 세포-세포 접촉과 관련하여 EphrinB2 리간드-EphB4 수용체 상호작용을 차단함을 입증하였다.
실시예 4: 항- EphrinB2 항체로의 처리는 래트 각막 주머니 분석에서 혈관신생을 억제한다
단일클론 항-EphrinB2 항체의 항-활성을 래트 각막 주머니 분석으로 시험하였다. 요컨대, 할란 스프라그-돌리(Harlan Sprague-Dawley) 래트를 이소플루란 및 낮은 투여량의 주사용 마취제를 사용하여 마취시켰다. 안구를 서서히 돌출시키고, 비외상성 겸자를 사용하여 자리에 고정시켰다. 15호 칼날을 사용하여, 각막 중심 부근을 1.5 mm 절개하였다. 미세주걱을 사용하여, 절개부를 간질을 통해 안구의 바깥쪽 안각 방향으로 주의깊게 블런트-절개하였다. 성장 인자 (200 ng의 VEGF), 메틸셀룰로스 및 알루미늄 수크랄페이트 (100 ㎍)를 함유하는 하이드론-코팅된 펠렛을 주머니의 바닥 부분에 삽입하였다. 항-에프린B2 항체 클론 19.2D3 (10 ug/펠렛)은 첨가하는 경우에 펠렛에 포함시켰다. 수술 후에, 안구를 젠타미신 연고로 코팅하였다. 제6일에, 동물에게 고분자량 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란을 주사하고, 안락사시켜 혈관구조를 가시화시켰다. 적출된 안구 각막의 전체 마운트를 준비하고, 컴퓨터 보조 영상 분석 (이미지-프로 플러스; Image-Pro Plus)을 이용하여 신생혈관 부위 측정을 수행하였다.
상기 실험의 결과를 도 8에 나타내었다. 항-EphrinB2 항체로의 처리는 VEGF-유도된 신생혈관형성을 유의하게 감소시켰으며, 이는 항-에프린B2 항체가 상기 모델에서 항-혈관신생 활성을 가짐을 입증한다. 대조군 처리 (VEGF 결핍)시에는 제한된 신생혈관형성이 나타난 반면, VEGF-처리된 양성 대조군은 상당한 신생혈관형성을 보여주었다.
실시예 5: 항- EphrinB2 항체로의 처리는 마우스 등쪽 챔버 분석에서 혈관신생을 억제한다
단일클론 항-EphrinB2 항체의 항-혈관신생 활성을 마우스 등쪽 챔버 분석으로 시험하였다. 등쪽 윈도우 챔버 분석에 사용되는 절차 및 기술은 본질적으로 문헌 [Papernfuss, D. Microvascs. Res., 18:311-318, 1979] 및 [Shan, S. Clinical Cancer Research, 7: 2590-2596, 2001]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 해부학상 중앙선을 등을 따라 표시하고, 4-0 견 봉합사로 C-클립을 위치에 봉합시켰다. 챔버 칼라의 외부 직경에 상응하는 템플레이트를 멸균 마커와 사용하여 원형 절개 윤곽선을 표시하였다. 근막 위에 위치한 진피를 따라가도록 노력하면서 십자 메스로 외곽 경계선을 따라 원형 절단하였다. 이어서, 한 쌍의 미세 겸자 및 안과수술용 가위를 사용하여 상기 영역을 손질하고 다듬었다. 둘을 제외한 모든 근막층을 피부 폴드의 한 측면으로부터 분리하였으며, 이들 층의 혈관 구조는 온전하게 유지되었다. 이어서, C-클립을 분리하였다. 중앙에 윈도우 프레임이 있는 챔버를 피부 폴드에 삽입하고, 4-0 견 봉합사로 자리에 고정시켰다. 종양 세포를 윈도우에서 근막에 주사하였다. 윈도우를 유리 커버슬립으로 밀폐시켰다. 감염을 방지하기 위해 네오스포린 항생제 연고를 봉합선 및 절개 상처에 얇은 층으로 펴 발랐다. 동물을 해부 입체현미경으로 관찰하여 챔버내 순환을 확인하였다. 동물을 마취에서 완전히 회복될 때까지 순환 난방 담요 상에서 회복시키고, 마지막으로 미세분리기(microisolator) 케이지에 있는 이들의 사육실로 돌려보냈다. 항체 (항-EphrinB2 항체 클론 19.2D3 및 항-마우스 VEGF 항체 G6)를 10 mg/kg으로 2회 투여하였는데, 첫번째 투여는 세포 주입 시점에 정맥내 투여하고, 두번째 투여는 제3일에 챔버에 직접 주사하여 투여하였다. 종양 부위 및 종양 혈관구조를 이미지-프로(Image-Pro)를 사용하여 계산하였다.
항-EphrinB2 항체는 신생혈관형성을 유의하게 감소시켰으며, 이는 항-ephrinB2가 상기 모델에서 항-혈관신생 활성을 나타냄을 입증한다. 양성 대조군 항-마우스 VEGF 항체로의 처리는 예상한 바와 같이 유의하게 신생혈관형성을 감소시키는 것으로 나타났다. 이와 달리, 처리되지 않은 대조군에서 대규모 신생혈관형성이 나타났다.
실시예 6: 항- EphrinB2 항체로의 처리가 생체내에서 종양 성장을 억제한다
항-EphrinB2 항체가 생체내에서 종양 성장을 억제하는 능력을 결정하기 위해, 항-EphrinB2 항체를 종양 이종이식 모델에서 다음과 같이 시험하였다. 요컨대, 베이지색 누드 마우스 (찰스 리버 레보러토리즈(Charles River Laboratories), 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재)를 실험실 동물의 관리 및 사용 안내에 따라 유지하였다. A673 인간 횡문근육종 세포를 혈청-무함유 배지에 현탁시키고, 동일한 부피의 마트리겔과 혼합하였다. 피하 종양 이종이식을 확립하기 위해, 5×106개 세포를 6 내지 8주령 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 주사하였다. 세포 접종하고 24 시간 후에, 동물에게 항체 0.2 ml를 1 주일에 2회 체중 1 kg 당 10 mg의 투여량으로 복강내 투여하였다. 종양 성장을 캘리퍼(caliper) 측정에 의해 정량화하였다. 길이 (l) 및 너비 (w)를 측정하고, 부피를 계산하여 (V = lw2/2) 종양 부피 (mm3)를 결정하였다. 각각의 군에서 10 마리의 동물에게 PBS, 10 mg/kg(체중)의 항-EphrinB2 항체 클론 19.2D3 또는 10 mg/kg(체중)의 항-마우스 VEGF (B6)를 1 주일에 2회 투여하였다 (도 9에서 화살표로 표시함).
상기 실험의 결과를 도 9에 나타내었다. 항-EphrinB2 항체로의 처리는 평균 종양 부피를 감소시켰으며, 이는 항-EphrinB2 항체로의 처리가 생체내에서 종양 성장을 억제함을 입증한다. 평균 종양 부피를 SE와 함께 나타내었다.
명확하게 이해시키기 위한 목적으로 상기 발명은 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기술되었지만, 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
<110> Minhong Yan and Yan Wu <120> ANTI-EPHRINB2 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME <130> P2299R1 <150> US 60/760,891 <151> 2006-01-20 <160> 53 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 1 Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser Trp Ile His 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 2 Gly Phe Thr Val Ser Ser Gly Trp Ile His 5 10 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 3 Ala Val Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 4 Ala Val Ile Phe His Asn Lys Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 5 Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu Gly Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 6 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 5 10 <210> 7 <211> 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Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 15 Asp 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Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 20 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 21 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 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Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 50 55 60 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 35 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 36 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val 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Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 39 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 50 55 60 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 40 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu 50 55 60 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 41 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 20 25 30 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Lys Val Glu Ile Lys 80 <210> 42 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 43 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 44 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 45 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 46 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 46 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 47 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 47 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 48 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly 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synthesized <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 20 25 30 Ser Gly Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Val Ile Phe His Asn Lys Gly Gly Thr Asp Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Ala Trp Ala Gln Leu 95 100 105 Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115

Claims (48)

  1. (a) (i) RASQDVSTAVA (서열 6)인 서열 A1-A11을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) SASFLYS (서열 8)인 서열 B1-B7을 포함하는 HVR-L2,
    (iii) EQTDSTPPT (서열 12)인 서열 C1-C9를 포함하는 HVR-L3,
    (iv) GFTVSSGWIH (서열 2)인 서열 D1-D10을 포함하는 HVR-H1,
    (v) AVIFHNKGGTDYADSVKG (서열 4)인 서열 E1-E18을 포함하는 HVR-H2, 및
    (vi) ARTSAWAQLGAMDY (서열 5)인 서열 F1-F14을 포함하는 HVR-H3
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 초가변 영역(HVR) 서열; 및
    (b) 서열 1-12에 도시한 서열 중 1개 이상의 잔기가 변형된 서열을 포함하는 1개 이상의 변이체 HVR
    을 포함하는, 단리된 항-EphrinB2 항체.
  2. 제1항에 있어서, HVR-L1 변이체가 하기 위치: A7 (S 또는 D); A8 (T 또는 S); A9 (A 또는 S); 및 A10 (V 또는 L)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4개)의 치환을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, HVR-L2 변이체가 하기 위치: B1 (S 또는 A); B4 (F 또는 N); 및 B6 (Y 또는 E)의 임의 조합으로 1-3개 (1, 2 또는 3개)의 치환을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, HVR-L3 변이체가 하기 위치: C1 (Q 또는 E); C3 (S 또는 T); C4 (Y 또는 D); C5 (T, D 또는 S); C6 (T 또는 N); 및 C8 (P 또는 F)의 임의 조합으로 1-6개 (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 치환을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, HVR-H1 변이체가 하기 위치: D4 (I 또는 V); D5 (T 또는 S); D6 (G 또는 S); 및 D7 (S 또는 G)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4개)의 치환을 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항에 있어서, HVR-H2 변이체가 하기 위치: E4 (Y 또는 F); E5 (P 또는 H); E7 (N 또는 K); 및 E9 (A 또는 G)의 임의 조합으로 1-4개 (1, 2, 3 또는 4개)의 치환을 포함하는 것인 항체.
  7. 제1항에 있어서, HVR-H3 변이체가 하기 위치: F1 (A); F2 (R); F3 (T); F4 (S); F5 (A); F6 (W); F7 (A); F8 (Q); F9 (L); F10 (G); F11 (A); F12 (M); F13 (D) 및 F14 (Y)에 1-14개의 치환을 포함하는 것인 항체.
  8. 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하며, 여기서 각 HVR은 서열 1-12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 상기 서열로 구성되거나, 또는 본 질적으로 상기 서열로 구성되고, 여기서, 서열 6 또는 7은 HVR-L1에 상응하고, 서열 8 또는 9는 HVR-L2에 상응하고, 서열 10, 11 또는 12는 HVR-L3에 상응하고, 서열 1 또는 2는 HVR-H1에 상응하고, 서열 3 또는 4는 HVR-H2에 상응하고, 서열 5는 HVR-H3에 상응하는 것인, 단리된 항-EphrinB2 항체.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 6, 8, 10, 1, 3, 5를 포함하는 것인 항체.
  10. 제8항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 7, 9, 11, 1, 3, 5를 포함하는 것인 항체.
  11. 제8항에 있어서, 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하며, 여기서 각각은 순서대로 서열 6, 8, 12, 2, 4, 5를 포함하는 것인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열 중 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  13. 제1항에 있어서, 변형이 치환, 삽입 또는 결실인 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 κ 하위군 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 73번, 73번 또는 78번 위치 중 하나 이상에서 치환을 포함하는 것인 항체.
  17. 제16항에 있어서, 치환이 R71A, N73T, 또는 N78A 중 하나 이상인 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  21. 제19항 또는 제20항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
  23. 제21항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  24. 제23항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
  25. (a) 제20항의 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, (b) 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-EphrinB2 항체를 제조하는 방법.
  26. (a) 제20항의 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, (b) 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-EphrinB2 면역접합체를 제조하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  29. 생물학적 샘플에서 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2를 검출하는 방법.
  30. 질병을 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 에서 EphrinB2-항-EphrinB2 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는, EphrinB2 발현과 관련된 질병을 진단하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 항-EphrinB2 항체가 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-EphrinB2 항체를 포함하는 조성물.
  33. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  35. 혈관신생 억제 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-EphrinB2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 억제시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 대상체에게 유효량의 항-혈관신생제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항-혈관신생제를 항-EphrinB2 항체 투여 이전에 또는 이후에 투여하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 항-혈관신생제를 항-EphrinB2 항체와 동시에 투여하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항-혈관신생제가 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)의 길항제인 방법.
  40. 제39항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙 (bevacizumab)인 방법.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-EphrinB2 항체의 장애의 치료적 및/또는 예방적 치료용 의약의 제조에 있어서의 용도.
  44. 제43항에 있어서, 장애가 암, 종양 및/또는 세포 증식 장애인 용도.
  45. 제43항에 있어서, 장애가 신경병증 또는 신경퇴행성 질환인 용도.
  46. 제43항에 있어서, 장애가 혈관신생과 연관된 병적 상태인 용도.
  47. 제46항에 있어서, 혈관신생과 연관된 병적 상태가 종양, 암 및/또는 세포 증식 장애인 용도.
  48. 제46항에 있어서, 혈관신생과 연관된 병적 상태가 안내 신생혈관 질환인 방법.
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