KR20080092878A - 전립선암 검출 - Google Patents

Abstract

소변 샘플에서 전립선암을 검출하는 방법 및 키트는 다양한 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함한다.

전립선암, 소변 샘플, 메틸화 상태

Description

전립선암 검출{Detecting prostate cancer}

본 발명은 다른 진단 방법들에 도움이 되는 메틸화된 유전자의 검사 방법 및 이러한 방법들에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

고등 진핵생물에서 DNA는 CpG 디뉴클레오타이드 중에서 구아노신의 5'쪽에 위치한 사이토신만이 메틸화된다. 이 변형은 유전자 발현에 중요한 조절 효과가 있으며, 특히 유전자 프로모터 영역에 CpG 풍부 영역(CpG 섬)이 위치해 있는 경우에는 더욱 뚜렷하다. 보통 메틸화되어 있지 않은 CpG 섬의 비정상적 메틸화는 무한증식성이며 형질전환된 세포에서는 흔한 경우이며, 특정 종양 서프레서 유전자 또는 이와 다른 특정 사람 암의 경감과 관련 있는 유전자의 전사 비활성화와 관련이 있다.

최근에는 다수의 잠재적인 메틸화 마커가 개시되었다. 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)는 이를 발현하는 유전자의 메틸화 상태가 전립선 암의 예후 및 진단에 중요한 가치가 있을 수 있는 단백질의 예이다. 이 단백질은 세포내 해독 반응, 예 컨대 글루타치온에 화학적 반응성 친전자체를 접합시켜 친전자성 발암물질을 비활성화시키는 반응 등을 촉매한다(C.B. Pickett et al., Annu. Rev. Blocbern., 58:743, 1989; B. Coles, et al., CRC Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 35:47, 1990; T.H.Rushmore, et al., J.Biol.Chem. 268: 11475, 1993). 여러 유전자좌에서 상이한 여러 유전자에 의해 암호화된 사람 GST는 알파, 뮤, 파이 및 쎄타로 불리는 4가지 그룹으로 분류되었다(B.Mannervik, et al., Biochem., J., 282:305, 1992). 후생학적 변화에 기인하는 GSTP1 발현의 감소는 종종 전립선암 및 간암과 관련이 있다.

S100 단백질은 특히 종양발생과 관련이 있는 칼슘 결합 단백질이다. 그 종류에는 S100A2, S100A4, S100A5, S100A6, S100A8, S100A9 및 S100A11이 있고, 이들은 모두 종양 발생과 약간의 관계가 있는 것으로 밝혀져 있지만, 정확하게 어떤 역할인지는 분명하게 밝혀지지 않았다. S100A6(칼실린) 발현은 전립선암 발생 시에는 감소하는 것으로 보인다. S100A2도 역시 유방암, 폐암 및 전립선암에서 감소된 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이것은 유전자 프로모터의 과메틸화 때문인 것으로 생각되지만, 이러한 구상은 과메틸화가 비악성 전립선 상피 및 BPH에서도 관찰되는 바, 확실하지는 않다.

샘플링 및 샘플 준비는 후생학적 시험에 있어서 중요한 요인이다. 모든 샘플 급원은 자체 문제를 갖고 있다. 환부 조직에서 직접 채취한 생검 샘플조차도 환부 세포의 불균일한 분포로 인해 거짓 음성 결과를 나타낼 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 소변은 다른 많은 잠재적 샘플들보다 덜 침습적으로 수득될 수 있기 때문 에 바람직한 샘플이다. 소변으로 배출된 전립선암세포의 수와 농도는 소변이 수집된 시기, 전립선 마사지에 의해 소변이 수집되었는지의 여부, 및 뉴클레아제의 존재 및 효과와 이러한 효과를 최소화하는 시약 및 방법과 같은 다수의 요인에 따라 매우 달라질 수 있다.

소변 샘플에 대한 전립선암 검사가 제안되기도 했지만, 실제 이러한 검사는 수행하기가 어려운 것으로 입증되었다. 첫째, 이러한 시험의 기본은 종양 또는 병변으로부터 비뇨기계통으로의 암세포의 배출을 가정한 것이다. 사실상 이 과정에 대해 알려진 것은 거의 없다. 또한, 피분석물의 농도가 환자가 물을 마신 정도와 같은 다양한 생리적 및 환경적 요인에 따라서 조직 생검 및 심지어 혈청 샘플과 같은 다른 샘플에서보다 훨씬 더 급격하게 달라질 가능성이 있는 것으로 보인다. 또한, 기질 내에서 피분석물의 안정성은 뉴클레아제 및 핵산에 영향을 미칠 수 있는 다른 다양한 물질의 존재에 비추어서 충분히 이해되지 않는다. 다른 많은 소변 분석에서 샘플 준비는 침전물로 불리는 회전 침강 샘플을 이용한다. 이것이 메틸화 마커에 의미가 있는지는 선험적으로 추정할 수도 없다.

환자 준비 및 전처리 선택 사항도 충분히 이해되지 않는다. 직장수지검사(DRE)는 의사가 해부학적 이상을 확인하는 전립선 건강 측정의 표준 진단 절차이다. 과거, DRE의 결과는 생검이나 다른 진단 또는 치료 절차가 필요한지의 여부를 결정하는데 사용되었다. 하지만, DRE 또는 관련 전립선 마사지와 같은 절차가 세포를 탈피시켜 이 세포가 후속 진단 절차에서 검출될 수 있을지의 여부 및 검출될 수 있는 정도는 분명하지 않았다. 절차상 DRE 및 직장수지마사지 및 이들이 실시되는 시간은 매우 상이한 결과를 초래할 수 있고, 이것은 이 분야의 상세불명의 리스트를 더 늘릴 뿐이다.

본 발명의 일 관점에서, 환자의 전립선암을 특성화하는 방법은 3일간의 소변 수집물에서 소변 중의 GSTP1 메틸화 및 1 이상의 대조용 유전자를 분석하는 것을 포함한다. 이 분석은 GSTP1의 메틸화 정도가 소정의 값을 초과하면 전립선암 양성으로 간주하며, 소정 값을 넘지 않으면 전립선암 음성으로 간주한다.

본 발명의 다른 관점에서, 환자의 전립선암을 특성화하는 방법은 총 3일간의 소변 수집물에서 소변 중의 GSTP1 메틸화, 1 이상의 대조용 유전자 및 S100 유전자를 분석하는 것을 포함한다. GSTP1의 정규 값은 GSTP1 메틸화 분석값을 S100 메틸화 분석값과 비교하여 결정한다. 이 분석은 메틸화 정규 값이 소정의 값을 초과하 면 전립선암 양성으로 간주하고 상기 소정의 값이 넘지 못하면 전립선암 음성으로 간주한다.

또 다른 본 발명의 관점에서, 환자의 전립선암을 특성화하는 방법은 네스티드 PCR 반응으로 수행되는 GSTP1 메틸화 및 1 이상의 대조용 유전자의 분석을 포함한다. 이 분석은 GSTP1의 메틸화 정도가 소정의 값을 초과하면 전립선암 양성으로 간주하고 소정의 값을 넘지 않으면 전립선암 음성으로 간주한다.

또 다른 본 발명의 관점에서는 다음과 같은 유전자 패널의 메틸화가 측정된다:

a. GSTP1, APC.

b. GSTP1, APC, S100A2.

c. GSTP1, RARβ2.

d. GSTP1, RARβ2, S100A2.

이러한 패널들은 추가로 대조용 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 메틸화 상태는 정량적 실시간 PCR을 통해 측정된다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 메틸화된 핵산의 검출에 유용한 키트를 제공한다. 이 키트는 1개 이상의 용기를 포함하는데, 제1 용기는 비메틸화된 사이토신을 변형시키는 시약을 함유하고 제2 용기는 CpG 함유 핵산의 증폭을 개시하는 시약을 함유하며, 이 시약이 변형 메틸화된 핵산과 메틸화되지 않은 핵산을 구별한다. 이러한 키트는 전립선암이 있을 것으로 의심되는 환자에 대하여 분석을 수행하는 지 침서를 함유한다.

본 발명의 또 다른 관점으로서, 키트는 프라이머가 처음에 보관되는 별도의 구성성분을 보유한 반응 용기를 포함하며, 상기 프라이머는 메틸화 상태가 정확하게 평가될 수 있도록 키트 사용 중에 세트 순서에 따라 반응 챔버로 삼출된다. 프라이머는 네스티드 증폭 반응을 수행할 수 있는 것이다.

다양한 유전자의 메틸화 분석값을 비교함으로써 전립선에 대한 양성 또는 음성 여부를 결정할 수 있다.

소변을 기본으로 한 본 발명의 분석은 PSA 분석 시 결과를 결정하기가 모호하거나 어려웠던 환자에게 수행하는 것이 바람직하다(가장 바람직하게는 2.5 내지 4.0ng/ml). 본 발명의 분석에 의한 음성 결과(다른 임상 지표의 부재 시)는 환자가 생검 절차와 같은 더욱 침습적인 검사를 받지 않도록 할 수 있다. 따라서, 가장 포괄적으로 봤을 때, 본 발명에 따른 1가지 방법은 먼저 환자에게 PSA 검사를 수행하는 단계 및 그 다음 PSA 수준이 2.5 내지 4.0ng/ml로 측정된 환자에 대하여 이하에 더 상세히 설명되는 분석을 수행하는 단계를 수반한다.

본 발명의 분석은 메틸화 상태가 전립선암과 상관이 있는 특정 유전자에 대응하는 핵산의 과메틸화를 검출한다. 유전자의 메틸화 상태가 전립선암에 대한 정보를 제공하고 서열이 그 유전자 또는 이의 상보체의 암호 부위, 그 유전자 또는 이의 상보체의 대표적 부위, 그 유전자 또는 이의 상보체의 프로모터 또는 조절 서열, 그 유전자 또는 이의 상보체의 존재를 나타내는 서열 또는 그 유전자 또는 이의 상보체의 전장 서열일 때, 핵산은 메틸화 상태가 전립선암과 상관이 있는 유전자에 대응한다. 이러한 핵산은 본 명세서에서는 마커라고 부른다. 마커는 다음과 같은 유전자들에만 대응한다: GSTP1(서열번호 17), APC(프로모터 = 서열번호 18, 유전자 = 서열번호 19), RARβ2(서열번호 20), S100A2(서열번호 21). 다른 당해 서열로는 베타 액틴(서열번호 22 및 23) 및 PTGS2(프로모터 = 서열번호 24, 유전자 = 서열번호 25)와 같은 분석 대조용으로서 유용한 항상성 유전자가 있다.

과메틸화를 검출하는 분석에는 MSP 및 제한엔도뉴클레아제 분석과 같은 기술이 있다. 프로모터 영역은 이러한 과메틸화 분석을 수행하는데 특히 주목할만한 표적이다. GSTP1 프로모터 영역의 서열분석은 뉴클레오타이드의 거의 72%가 CG이고 약 10%가 CpG 디뉴클레오타이드임을 보여준다.

본 발명은 소변이나 요도세척물에서 마커의 특정 영역에 메틸화 상태를 측정하고, 전립선암과 관련 있는 DNA를 증폭 및 검출하는 단계를 포함한다. 마커에 의해 암호화된 단백질 수준의 감소는 종종 프로모터와 같은 특정 영역의 과메틸화의 결과인 바, 그러한 영역이 과메틸화되었는지의 여부를 측정하는 것이 바람직하다. 이것은 GSTP1 유전자 및 발명의 개요 부분에 제시된 패널들에서 가장 명백하게 관찰된다. 특정 마커 영역에 특이적인 핵산 프로브 또는 리포터는 마커 유전자의 메틸화된 영역의 존재를 검출하는데 사용된다. 과메틸화된 영역은 정상 조직에 비해 환부 조직 유래의 샘플에서 통계적으로 상당히 높은 정도의 메틸화가 이루어진 영 역이다.

앞에서 언급한 바와 같이, 소변은 본 발명의 분석법이 수행되는 기질이다. 소변은 전립선 마사지 후 수집하여 침전될 수 있을 때까지 4℃에서 보관하는 것이 가장 바람직하다. 특히, 4시간 이내로 회전 침강한 것이 가장 바람직하다.

전립선 마사지는 본 발명의 메틸화 분석과 관련하여 수행할 때, 다음과 같이 수행하는 것이 가장 바람직하다: 샘은 충분한 수의 전립선 세포가 방출될 수 있도록 각 엽의 가측선에서부터 중앙선까지, 그리고 기저부터 정점까지 표면을 저하시키기에 충분할 정도로 강하게 압박한다. 이러한 마사지 절차는 20초 이하 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 일부 프라이머/프로브 또는 리포터 시약은 마커 유전자의 발현 조절 서열의 메틸화를 검출하는데 사용된다. 이것은 전사를 조절하고, 몇몇 경우에는 핵산 서열의 해독을 조절하는 핵산 서열이다. 즉, 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, 개시 코돈(즉, ATG), 인트론의 스플라이싱 시그널, mRNA의 적당한 해독을 위한 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 및 종결 코돈과 관련된 서열을 포함할 수 있다.

GSTP1 프로모터는 가장 바람직한 마커이다. 이것은 글루타치온-s-트란스퍼라제 단백질을 생산하는 유전자의 전사를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 프로모터 영역은 구조 유전자의 상류 또는 5'쪽에 위치한다. 프로모터 의존적 유전자 발현이 세포 종류 특이성, 조직 특이성 또는 외부 시그널 또는 제제에 의한 유도성으로 조절할 수 있기에 충분한 구성인자를 포함할 수 있다; 이러한 구성인자 는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 영역이나 3' 영역에 위치할 수 있다.

본 발명의 1가지 방법은 마커를 함유하는 표적 세포를 핵산에 결합하는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 표적 세포 성분은 세포 용해와 단백질이 없는 순수 DNA를 생산하는 정제(컬럼 또는 용액 기반 정제)에 의해 소변으로부터 추출된 DNA와 같은 핵산이다. 상기 시약은 PCR 또는 MSP 반응을 도와주고 탐침 검사하여 표적 서열을 검출하는 성분을 포함한다. 이러한 시약은 스콜피언(Scorpion) 시약 또는 스콜피언 리포터라 불리고 미국 특허 6,326,145 및 6,270,967(Whitecombe et al., 전문이 본 발명에 참고인용됨)에 기술된 바와 같은 자신의 리포터 분절과 혼합되거나 결합된 프라이밍 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "프라이머" 및 "프라이밍 서열"이란 용어는 동일하지는 않지만 핵산 서열의 증폭을 도와주는 분자 또는 분자의 부분을 나타내는데 사용될 수 있다.

메틸화 패턴을 검출하는 1가지 민감한 방법은 메틸화 민감성 효소와 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 조합 사용을 수반한다. 상기 효소로 DNA를 분해한 후, PCR은 DNA 절단이 메틸화에 의해 방해된 경우에만 제한효소 부위에 인접한 프라이머로부터 증폭을 일으킬 것이다. 본 발명의 PCR 프라이머는 GSTP1의 전사 개시 부위로부터 M24485(Genbank)의 게놈 포지셔닝 번호에 따라 대략 -71 내지 +59bp 사이에 위치하는 프로모터와 전사 영역을 표적으로 하도록 디자인된다.

또한, 본 발명의 방법은 비메틸화된 사이토신을 변형시키는 제제와 핵산 함유 표본을 접촉시키는 단계; 표본 중에 CpG 함유 핵산을 CpG 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 메틸화된 핵산을 검출하는 단 계를 포함할 수 있다. 바람직한 변형은 비메틸화된 사이토신을 메틸화된 사이토신과 구별이 되게 하는 다른 뉴클레오타이드로 비메틸화된 사이토신을 변환시키는 것이다. 제제는 비메틸화된 사이토신을 우라실로 변형시키는 것으로서 중아황산나트륨인 것이 바람직하지만, 비메틸화된 사이토신을 변형시키고 메틸화된 사이토신은 변형시키지 않는 다른 제제도 사용될 수 있다. 중아황산나트륨(NaHSO₃) 변형이 가장 바람직하며, 사이토신의 5,6-이중 결합과 쉽게 반응하지만 메틸화된 사이토신과는 거의 반응하지 않는다. 사이토신은 중아황산염 이온과 반응하여 탈아미노화에 민감한 설폰화된 사이토신 반응 중간체를 형성하고 설폰화된 우라실로 생성된다. 설포네이트 기는 알칼리 조건 하에서 제거될 수 있고, 그 결과 우라실이 형성된다. 우라실은 Taq 폴리머라제에 의해 티민으로서 인식되고, 따라서 PCR 시 수득된 산물은 주형 개시부에 5-메틸사이토신이 있는 위치만이 사이토신을 함유하게 된다. 스콜피언 리포터 및 시약과 다른 검출 시스템도 마찬가지로 이러한 방식으로 처리된 변형된 종과 미변형된 종을 구별한다.

본 발명에서 변형 후(예컨대, 중아황산염에 의해) 표본 중의 CpG 함유 핵산을 증폭시키는데 사용된 프라이머는 미처리된 DNA, 메틸화된 DNA 및 비메틸화된 DNA를 특이적으로 구별한다. 메틸화 특이적 PCR(MSPCR)에서, 비메틸화된 DNA의 프라이머 또는 프라이밍 서열은 메틸화된 DNA에서 유지되는 C와 구별되도록 3'CG 쌍 중에 T를 보유하고, 그 상보체가 안티센스 프라이머로 디자인되는 것이 바람직하다. 비메틸화된 DNA의 MSP 프라이머 또는 프라이밍 서열은 일반적으로 센스 프라이 머에 C가 없고 안티센스 프라이머에 G가 없기 때문에 그 서열 중에 C 또는 G의 수가 비교적 적다(C는 U(우라실)로 변형되어 증폭 산물에서 T(티미딘)으로서 증폭된다).

본 발명의 프라이머는 다형성 유전자좌의 상당한 수의 핵산에서 특이적인 중합 개시가 이루어지도록 충분한 길이와 적당한 서열을 보유한 올리고뉴클레오타이드이다. 적당한 프로브 또는 리포터에 노출되었을 때, 증폭된 서열은 메틸화 상태 및 이에 따른 진단 정보를 나타낸다.

바람직한 프라이머는 다형성 유전자좌 가닥에 실질적으로 상보성인 프라이머 연장 산물의 합성을 개시할 수 있는 8개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드인 것이 가장 바람직하다. 합성에 도움이 되는 환경 조건으로는 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 중합용 제제, 예컨대 DNA 폴리머라제, 및 적당한 온도 및 pH의 존재가 포함된다. 프라이머 또는 프라이밍 서열의 프라이밍 분절은 증폭의 최대 효율을 위해 일본쇄인 것이 바람직하나, 이본쇄인 경우도 있다. 이본쇄라면 프라이머는 연장 산물의 제조에 사용되기 전에 먼저 가닥 분리를 위해 처리된다. 프라이머는 중합 유도제의 존재 하에 연장 산물의 합성을 도와주기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 완충제, 양이온 및 뉴클레오타이드 조성물과 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 약 12개 내지 20개의 뉴클레오타이드를 함유하는 것이 가장 바람직하지만, 그보다 많거나 적은 수의 뉴클레오타이드를, 바람직하게는 공지된 디자인 지침서 또는 규칙에 따라 함유할 수도 있다.

프라이머는 증폭될 게놈 유전자좌의 각 가닥에 실질적으로 상보성이도록 설계하며 앞에서 논한 바와 같이 적당한 G 또는 C 뉴클레오타이드를 포함한다. 이는 중합용 제제가 기능할 수 있는 조건 하에서 프라이머가 각 가닥과 하이브리드하기에 충분히 상보성이어야 한다는 것을 의미한다. 환언하면, 프라이머는 하이브리드하는 5' 및 3' 인접 서열(들)과 충분한 상보성을 보유하여 게놈 유전자좌를 증폭시킬 수 있어야 한다.

프라이머는 증폭 과정, 즉 수반되는 반응 단계의 수에 비해 표적 유전자좌의 생산량이 훨씬 많은 반응(바람직하게는 효소적 연쇄 반응)에 이용된다. 가장 바람직한 양태에 따르면, 이 반응은 표적 유전자좌를 지수적으로 더 많은 양으로 생산한다. 이와 같은 반응에는 PCR 반응이 있다. 보통 하나의 프라이머는 유전자좌의 음성(-) 가닥에 상보적이고 다른 프라이머는 양성(+) 가닥에 상보적이다. 변성된 핵산에 프라이머의 어닐링 후 DNA 폴리머라제 I의 큰 단편(클리나우)과 같은 효소 및 뉴클레오타이드를 이용한 연장은 표적 유전자좌 서열을 함유하는 새로 합성된 + 및 - 가닥을 생성한다. 연쇄 반응의 산물은 이용된 특정 프라이머의 말단에 대응하는 말단을 보유하는 분리된 핵산 이본쇄이다.

프라이머는 통상적인 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법, 예컨대 자동화 방법과 같은 임의의 적당한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 자동화 양태에서 디에틸포스포아미다이트는 출발 물질로서 사용되고 문헌[Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 변형된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 미국 특허 4,458,066에 기술되어 있다. 소변이나 요도세척물로부터 채취된, 정제 또는 미정제 형태의 임의의 핵산 표본은 표적 유전자좌(예, CpG)를 함유하는 특정 핵산 서열을 함유하거나 함유할 것으로 의심되는 출발 핵산 또는 핵산들로서 이용될 수 있다. 즉, 이 과정은 예컨대 DNA 또는 RNA, 구체적으로 메신저 RNA를 이용할 수 있다. DNA 또는 RNA는 일본쇄이거나 이본쇄일 수 있다. RNA가 주형으로서 이용되는 경우에는 이 주형을 DNA로 역전사하기에 적합한 효소 및/또는 조건이 사용되어야 한다. 또한, 각각 하나의 가닥을 함유하는 DNA-RNA 하이브리드가 이용될 수도 있다. 핵산의 혼합물도 이용될 수 있고, 이전 증폭 반응에서 동일하거나 상이한 프라이머를 이용하여 생성된 핵산도 이용될 수 있다. 증폭될 특정 핵산 서열, 즉 표적 유전자좌는 더 큰 분자의 분획일 수도 있고, 또는 특정 서열이 전체 핵산을 구성할 정도로 처음부터 분리된 분자로서 존재하는 것일 수도 있다.

추출된 샘플에 불순물이 있다면, 증폭에 앞서 샘플의 세포, 유체, 조직 또는 동물 세포막을 개방시켜 핵산의 가닥(들)을 노출 및/또는 분리하기에 효과적인 상당한 양의 시약으로 처리할 수 있다. 이와 같이 가닥을 노출 및 분리하기 위한 용해 및 핵산 변성 단계는 증폭이 더욱 더 쉽게 일어날 수 있게 할 것이다.

샘플의 표적 핵산 서열이 2 가닥을 함유하는 경우에는 핵산을 주형으로서 사용하기 전에 핵산 가닥을 분리할 필요가 있다. 가닥 분리는 프라이머 연장 산물의 합성과 별도의 단계로서 또는 동시에 실시할 수 있다. 이러한 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 비롯한 각종 적당한 변성 조건을 이용하여 수행할 수 있다. 핵산 가닥을 분리하는 1가지 물리적 방법은 핵산이 변성될 때까지 핵산을 가 열하는 단계를 수반한다. 전형적인 열변성은 약 80 내지 105℃ 범위의 온도에서 10분 이하의 처리를 수반할 수 있다. 가닥 분리는 또한 헬리카제로 알려진 효소계 유래의 효소, 또는 헬리카제 활성을 갖고 있고 리보ATP의 존재 하에 DNA를 변성시키는 것으로 알려진 RecA 효소에 의해 유도될 수 있다. 헬리카제를 이용한 핵산의 가닥 분리에 적합한 반응 조건은 쿤 호프만-버링(Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978)에 의해 개시되어 있다. RecA를 이용한 기술은 씨.래딩(C.Radding, Ann.Rev.Genetics, 16: 405-437, 1982)에 의해 검토된 바 있다. 이러한 기술의 개선 방안도 현재 잘 알려져 있다.

핵산 또는 핵산들의 상보성 가닥이 분리되면, 이 핵산이 본래 이본쇄였는지 또는 일본쇄였는지의 여부에 상관없이, 분리된 가닥은 다른 핵산 가닥을 합성하기 위한 주형으로서 사용되기가 쉽다. 이 때 합성은 주형에 프라이머의 하이브리드화가 일어날 수 있는 조건 하에서 수행한다. 일반적으로, 합성은 완충 수용액, 바람직하게는 pH 7 내지 9, 가장 바람직하게는 약 8에서 일어난다. 두 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 분리된 주형 가닥을 함유하는 완충액에 과도한 몰 함량(게놈 핵산의 경우에는 보통 약 10⁸:1의 프라이머:주형)으로 첨가하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법이 진단용으로 사용되는 경우에는 상보성 가닥의 양을 알고 있지 못할 수 있으며, 따라서 상보성 가닥의 양에 대한 프라이머의 양을 확실하게 결정할 수 없을 수도 있다. 하지만, 사실상 첨가되는 프라이머의 양은 증폭될 서열이 복잡한 장쇄 핵산 가닥의 혼합물에 함유되어 있을 때 상보성 가닥(주형)의 양에 비해 과도 한 몰 함량인 것이 일반적이다. 상당히 과도한 몰 함량은 공정의 효율을 향상시키는데 바람직하다.

데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP는 적당한 양으로 프라이머와 함께 또는 프라이머와 별도로 합성 혼합물에 첨가되며, 수득되는 용액은 약 90 내지 100℃의 온도까지 10분 이하 동안, 바람직하게는 1 내지 4분 동안 가열된다. 이러한 가열 기간 후, 용액은 프라이머 하이브리드화에 바람직한 실온까지 냉각한다. 냉각된 혼합물에 프라이머 연장 반응을 수행하기에 적당한 제제("중합용 제제")를 첨가하고, 당업계에 공지된 조건 하에서 반응이 일어나게 한다. 중합용 제제는 또한 열안정성이라면 다른 시약과 함께 첨가될 수도 있다. 이러한 합성(또는 증폭) 반응은 실온에서부터 중합용 제제가 더 이상 작용하지 않는 온도 이하까지의 온도에서 일어날 수 있다.

중합용 제제는 프라이머 연장 산물의 합성을 수행하는 기능을 하는 임의의 화합물 또는 시스템, 바람직하게는 효소일 수 있다. 이러한 목적에 적합한 효소에는 예컨대 이.콜리 DNA 폴리머라제 I, 이.콜리 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편, T4 DNA 폴리머라제, 다른 유용한 DNA 폴리머라제, 폴리머라제 변이체, 역전사효소 및 다른 효소, 예컨대 열안정성 효소(예, 변성을 유발하기 위해 충분히 상승된 온도로 처리된 후에도 프라이머 연장을 수행하는 효소)가 포함된다. 바람직한 제제는 Taq 폴리머라제이다. 적합한 효소는 각 유전자좌 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성하기에 적당한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉진할 것이다. 일반적으로, 합성은 각 프라이머의 3' 말단에서 시작하고 주형 가닥을 따라 5' 방 향으로 합성이 종결될 때까지 진행하여 여러 길이의 분자를 생성한다. 하지만, 중합용 제제는 5' 말단에서 합성을 개시하여 전술한 바와 같은 방식으로 다른 방향으로 진행할 수도 있다.

가장 바람직한 증폭 방법은 PCR이다. 또한, 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭된 비메틸화된 유전자좌 및 메틸화된 유전자좌가 다른 증폭 방법에 의해 유사하게 증폭되는 한 대체 증폭 방법이 사용될 수도 있다. 이러한 가장 바람직한 양태 중 하나에서 분석법은 네스티드 PCR로서 수행된다. 네스티드 PCR 방법에서는 2단계 이상의 폴리머라제 연쇄 반응이 수행된다. 제1 단계 폴리머라제 연쇄 반응에서는 특정 제1 표적 뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 위치에 각각 인접하는 상부 및 하부 프라이머로 이루어진 외측 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 쌍이 상기 제1 서열을 증폭시키는데 사용된다. 후속 단계에서는 역시 상부 및 하부 프라이머로 이루어진 내재 또는 네스티드형 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 제2 세트가 사용되어 제1 표적 뉴클레오타이드 서열 내에 함유된 더 작은 제2 표적 뉴클레오타이드 서열을 증폭시킨다. 여기서 상부 및 하부 내재 프라이머는 제2 표적 뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 위치에 각각 인접해 있다. 인접 프라이머는 PCR 과정 동안 증폭되는 이본쇄 표적 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단 부 상의 분절에 상보적이다.

제1 단계 폴리머라제 연쇄 반응에서 증폭시키기 위한 표적화된 유전자 영역 내의 제1 뉴클레오타이드 서열은 5' 상류 위치에서 상부 프라이머에 인접하고 3' 하류 위치에서 하부 프라이머에 인접한 것이다. 제1 표적화된 뉴클레오타이드 서열, 및 이로부터 제1 단계 폴리머라제 연쇄 반응의 증폭 산물은 외측 프라이머 쌍 의 상부 프라이머 및 하부 프라이머의 각 5' 상류 및 3' 하류 하이브리드화 위치 사이에 염기쌍 거리에 의해 측정되는 예상 염기쌍 길이를 갖고 있다.

제1 단계 폴리머라제 연쇄 반응의 마지막에, 수득되는 혼합물의 일정량이 제2 단계 폴리머라제 연쇄 반응으로 전달된다. 이것은 세페이드(Cepheid) 제품인 "SMART CAP" 장치 등을 이용하는 밀봉 또는 폐쇄 용기 내에서 자동으로 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 제2 단계 반응에서, 제1 단계 반응 산물은 특이적인 내재 또는 네스티드형 프라이머와 혼합된다. 이러한 내재 프라이머는 제1 표적화된 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드 서열로부터 유래되고 제1 표적화된 뉴클레오타이드 서열 내에 함유된 제2의 더작은 표적화된 뉴클레오타이드 서열에 인접한 것이다. 이러한 혼합물을 먼저 변성, 어닐링 및 연장 단계로 처리한 다음, 다시 제2 표적화된 뉴클레오타이드 서열의 반복 변성, 어닐링 및 연장 또는 복제가 일어나도록 열순환 처리한다. 이러한 제2의 표적화된 뉴클레오타이드 서열은 5' 상류 위치에서는 상부 프라이머 옆에 인접하고 3' 하류 위치에서는 하부 프라이머 옆에 인접한다. 제2의 표적화된 뉴클레오타이드 서열 및 이에 따른 제2 단계 PCR의 증폭 산물의 염기쌍 길이는 내재 프라이머 쌍의 상부 및 하부 프라이머의 각 5' 상류 및 3' 하류 하이브리드화 위치 사이에 염기쌍 길이에 의해 측정되는 예상 염기쌍 길이이다.

증폭된 산물은 미국 특허 4,683,195(Mullis et al., 전문에 본 발명에 참고인용됨)에 기술된 바와 같이 상기 산물에 특이적인 프로브 또는 리포터를 이용하여 메틸화된 것 또는 비메틸화된 것으로 확인하는 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오타이 드를 검출하는 프로브 및 리포터 분야의 진보는 당업자에게 공지되어 있다. 경우에 따라, 핵산의 메틸화 패턴은 제한효소 분해 및 서던 블롯 분석과 같은 다른 기술로 확인할 수도 있다. 5'CpG 메틸화를 검출하는데 사용될 수 있는 메틸화 민감성 제한엔도뉴클레아제의 예에는 SmaI, SacII, EagI, MspI, HpaII, BstU1 및 BssHII가 있다.

본 발명의 다른 관점에서는 메틸화 비가 사용된다. 이것은 수득된 마커의 증폭된 메틸화된 종의 함량과 증폭된 대조 마커의 함량 또는 증폭된 비메틸화된 마커 영역의 함량 간의 비를 정립시켜 수행할 수 있다. 이것은 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 이용하여 수행하는 것이 가장 바람직하다. 정립된 또는 소정의 컷오프 또는 역치 이상의 비는 과메틸화된 것으로 간주하고 암(GSTP1의 경우에 전립선암)과 같은 증식 질환에 걸린 것을 암시한다. 컷오프는 공지된 방법에 따라 정립되는데, 이러한 방법들은 2가지 이상의 샘플 세트, 즉 공지된 질환 상태의 샘플과 공지된 정상 상태의 샘플에 사용한다. 본 발명의 참조 마커는 내부 대조군으로서 사용될 수 있다. 참조 마커는 베타 액틴과 같이 샘플의 세포에서 항상성으로 발현되는 유전자인 것이 바람직하다.

정립된 값 또는 소정의 값(컷오프 또는 역치 값)은 메틸화 비가 사용되지 않는 본 발명에 따른 방법에서 정립되어 사용되기도 한다. 이러한 경우에 컷오프 값은 정상 샘플의 메틸화 함량이나 정도 또는 암이 임상적으로 유의적이지 않은 샘플(임상 관련 상태로 진행되지 않거나 공격성이 아닌 것으로 알려진 샘플)의 메틸화 함량이나 정도와 비교하여 정립시킨다. 이러한 컷오프는 메틸화비를 기반으로 한 방법에서 사용되는 경우와 마찬가지로 공지된 방법에 따라 정립시킨다.

본 발명의 가장 바람직한 양태에 따르면, MSP 또는 다른 적당한 방법에 의해 수득된 GSTP1 메틸화 값은 동일한 방법에 의해 측정된 S100A2 메틸화 값으로 정규화한다. 정규화된 값은 실시예 7에 제시된 바와 같이 GSTP1 값으로부터 S100A2 분석값을 감하여 수득한다. 다른 정규화 방법, 예컨대 메틸화 비 생성법(Ct 값을 당해 유전자의 카피수로 변환시킨 다음, 이 카피수를 동일한 방식으로 수득한 베타 액틴의 카피수로 나누어 수득함)도 사용할 수 있다. 정규화된 값을 사용할 때, 컷오프 값은 먼저 이 컷오프가 최적 감도와 특이성을 나타내는 트레이닝 세트를 만든 다음, 이 컷오프값을 독립 검증 세트에서 검증하여 결정한다.

본 발명의 방법과 키트는 복합체화를 위한 단계와 시약을 포함할 수 있다. 즉, 하나보다 많은 마커가 한번에 분석될 수 있다. 하지만, β-액틴과 같은 내부 대조군과 함께 GSTP1, RAR-β2, APC 및 S100A2와 같은 마커만이 본 발명의 일부로서 분석된다.

마커와 관련된 유전자 전사 수준의 감소는 종종 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 발현 조절 서열(예, 프로모터 서열)의 특정 인자의 과메틸화 결과인 바, 이러한 서열에 부합하도록 제조된 프라이머를 준비했다. 따라서, 본 발명은 마커의 특정 영역, 바람직하게는 마커의 발현 조절 또는 프로모터 영역 내의 특정 영역의 메틸화를 검출하여 세포 증식 질환을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 영역의 메틸화를 검출하는데 유용한 프로브는 그러한 진단 또는 예후 방법에 유용하다.

본 발명의 키트는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브 또는 검출 분자(예, 스콜피언 리포터)를 함유하기만 한다면 다양한 구성성분으로 구성될 수 있다. 일 양태에 따르면, 키트는 과메틸화된 마커 분절을 증폭 및 검출하기 위한 시약을 포함한다. 경우에 따라, 키트는 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 샘플 준비 시약 및/또는 물품(예, 튜브)을 포함한다.

바람직한 키트에서 1튜브 MSP에 필요한 시약으로는 대응하는 PCR 프라이머 세트, 열안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제, 및 적당한 검출 시약(들), 예컨대 가수분해 프로브 또는 분자 비콘 등이 포함된다. 경우에 따라 바람직한 키트에서, 검출 시약은 스콜피언 리포터 또는 시약이다. 또한, 에티디움 브로마이드와 같이 이본쇄 DNA에 특이적인 형광 염료 또는 단독 염료 프라이머도 사용될 수 있다. 프라이머는 고 농도를 생산하는 함량인 것이 바람직하다. 키트의 또 다른 구성성분에는 적당한 반응 튜브 또는 바이엘, 배리어 조성물, 통상적으로 마그네슘을 포함하기도 하는 왁스 비드; 필수 완충액 및 시약, 예컨대 dNTP; 대조용 핵산(들) 및/또는 임의의 추가 완충액, 화합물, 보조인자, 이온 성분, 단백질 및 효소, 중합체 및 MSP 반응에 사용될 수 있는 기타 유사 물질을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 키트는 핵산 추출 시약과 물질을 포함하기도 한다.

실시예

실시예 1: 샘플 준비 및 MSPCR

임상 결과가 알려져 있는 환자로부터 전립선 샘플을 수득했다.

메틸화 분석은 다음과 같이 수행했다. 게놈 DNA는 시판되는 중아황산나트륨 변환 시약 키트(Zymo Research, Orange, CA, USA)를 이용하여 변형시켰다. 이 처리는 비메틸화된 DNA 중의 모든 사이토신을 우라실로 변환시켰고, 메틸화된 DNA 중에서는 구아닌 앞에 있지 않은 사이토신만이 우라실로 변환되었다. 구아닌 앞에 있는 모든 사이토신(CpG 디뉴클레오타이드에서)은 사이토신으로 남아있었다. 이 분석법을 이하에 더 상세히 설명한다.

a. 침전: 침전된 소변 샘플은 다음과 같이 수득했다.

50ml 팔콘 튜브에 소변을 넣고 4℃, VRX Sorvall 원심분리기에서 3000g로 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 펠릿 상의 약 5ml만을 남기고 제거했다. 튜브를 다시 회전 침강(3000g, 5분)시켜 나머지 상청액도 제거했다(1ml 팁을 이용하여). 그 다음, 소변 침전물을 20ml 저온(4℃) PBS로 세척하고 다시 회전 침강(3000g, 5분)시켜, 남은 상청액은 흡인제거했다. 이러한 샘플을 -20℃에 보관했다.

b. 세포 용해 및 DNA 추출:

침전물 중의 세포는 다음과 같이 용해시켰다. 세포용해 용액 700㎕를 소변 세포 펠릿을 함유하는 각 샘플에 첨가했다. 용해물을 그 다음 2.0ml 미량원심분리기 튜브로 옮기고 이 용해물에 프로테이나제 K 용액(20mg/ml) 3㎕를 첨가한 뒤, 25회 뒤집으면서 혼합하고, 1시간 내지 하룻밤 동안 55℃에서 항온처리했다.

샘플을 20℃(가열 블록)에 10분간 방치하여 실온까지 냉각했다. 단백질 침전 용액 300㎕를 그 다음 용해물에 첨가한 뒤, 20초 동안 고속으로 강력하게 볼텍싱했다. 샘플을 얼음조에 5분 동안 방치한 뒤 16000RPM으로 5분 동안 원심분리했다. 침 전된 단백질은 단단한 펠릿을 형성했다. 상청액을 다시 새로운 2.0ml 튜브로 옮겨 침전 단계를 반복했다.

DNA를 함유하는 상청액을 다시 깨끗한 2.0ml 미량원심분리기 튜브로 옮겨 원심분리를 반복한 뒤(16000RPM, 3분) 상청액을 다시 100% 이소프로판올 900㎕와 20mg/ml 글리코겐 2㎕를 담고 있는 깨끗한 2.0ml 미량원심분리기 튜브로 옮겼다. 샘플을 약하게 뒤집는 혼합을 50회 실시한 뒤, 실온에서 적어도 10 내지 15분 동안 락커(rocker) 상에서 진탕시킨 다음, -20℃까지 냉각했다. 그 다음, 샘플을 16000RPM에서 5분 동안 원심분리했다. 그 후, DNA는 작은 백색 펠릿으로 볼 수 있었다. 상청액은 1ml 피펫으로 제거하고 샘플을 16000RPM에서 60초 동안 원심분리했다. 나머지 상청액은 100㎕ 피펫으로 제거했다. 70% 에탄올 900㎕를 첨가하고, 튜브를 10회 뒤집어서 DNA 펠릿을 세척한 다음, 다시 16000RPM에서 1분 동안 원심분리했다. 에탄올은 1ml 피펫으로 제거한 다음, 다시 16000RPM에서 60초 동안 원심분리했다. 나머지 상청액은 100㎕ 피펫으로 제거하고 샘플을 공기 중에서 10 내지 15분 동안 건조시켰다.

건조된 샘플에 LoTE 완충액 45㎕를 첨가하고, 1100rpm으로 진탕시키면서 65℃에서 1시간 동안 항온배양하고 1100rpm으로 진탕시키면서 20℃에서 하룻밤 동안 항온배양하여 재수화시켰다. DNA는 분명한 표지가 부착된 튜브에 넣어 -80℃에서 보관했다.

c. 중아황산염 변형

DNA 샘플은 자이모리서치(ZymoResearch)에서 입수한 EZ-DNA 메틸화 키 트(Cat. No D5001)를 이용하여 변형시켰다.

M-세척 완충액 농축물에 무수에탄올 24ml를 첨가하여 최종 M-세척 완충액을 제조했다. 이러한 M-희석 완충액 5㎕를 DNA 샘플 45㎕에 직접 첨가했다. 이 혼합물을 피펫으로 상하 혼합한 후, 순간 회전시킨 다음 가열 블록에서 1100rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 15분 동안 항온배양했다. 항온배양 동안, 베이커워터(Baker Water) 750㎕와 M-희석 완충액 210㎕를 첨가하여 CT 변환 시약을 준비했다. 그 다음, 2분마다 1분씩 볼텍싱하여 총 10분 동안 혼합했다. 상기 항온배양 후, 준비된 CT 변환 시약(순간 회전시킨 후) 100㎕를 각 샘플에 첨가한 후, 가볍게 볼텍싱하고 순간 회전시켰다. 샘플을 그 다음 알루미늄 호일이 덮인 가열 블록(1100rpm에서 진탕)으로 70℃에서 3시간 동안 항온배양했다.

그 다음, 샘플을 순간 회전 침강시키고 얼음에서 10분 동안 방치했다. 이 샘플에 M-결합 완충액 400㎕를 첨가하고 피펫으로 상하 혼합했다. 상청액을 모두, 2ml 수집 튜브에 배치된 Zymo-Spin 회전 침강컬럼에 적재했다. 이 튜브를 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리하고 관통물(flow-through)은 제거했다. M-세척 완충액 200㎕를 다시 컬럼에 첨가하고, 다시 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리하고 관통물은 제거했다.

이 컬럼에 M-탈설폰화 완충액 200㎕를 첨가하고 실온에서 15분 동안 방치한 다음, 최대 속도로 15 내지 30초 동안 원심분리하고 관통물은 제거했다. 이 절차를 3회 반복하고 마지막에는 30초 동안 원심분리했다. 이 컬럼을 그 다음 깨끗한 1.5ml 튜브 위에 놓고, 여기에 M-용출 완충액 50㎕를 첨가했다. 이 컬럼을 그 다음 RT에서 1분 동안 방치한 다음, 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출시켰다. 용출된 DNA에는 표지를 부치고 "BT 변형물"로서 -80℃에 보관했다.

MSPCR 분석은 다음과 같은 프라이머와 프로브를 사용하여 조성했다.

외측 PCR 프라이머

내측 PCR 스콜피언 프로브/프라이머 세트

네스티드 PCR 반응은 "SMARTCAP" 튜브(Cepheid)와 "SMARTCYCLER"(Cepheid) PCR 분석기를 이용하여 다음과 같이 수행했다.

해동된 시약은 혼합하기 위해 각각 순간 볼텍싱했다. 적당한 Cepheid SmartCap PCR 반응 튜브에는 표지를 붙이고 랙(rack)에 넣어두었다. 각 튜브마다 새로운 피펫팁을 이용하여 제1 단계 PCR 마스터 혼합물 5㎕를 각 튜브에 첨가했다. 다시 각 표본 마다 새로운 피펫팁을 사용하여 표본 5㎕를 각 튜브에 첨가한 뒤, SmartCap을 똑소리가 나게 닫지 않고 덮어두었다. 튜브를 "SMARTCYCLER" 원심분리기에서 30초 동안 원심분리하고 "SMARTCYCLER" 기구에 순서대로 넣고, "SMARTCYCLER" 밀봉 기구 위에 뚜껑을 덮고 반응을 개시했다. Cepheid 검사대에서의 사이클링 조건은 다음과 같다(제1 PCR 단계).

반응을 완료한 후, 튜브를 꺼내고 다음과 같이 제2 PCR 단계를 준비했다. 튜브 뚜껑을 열고 "SMARTCAP" 저장기에 제2 PCR 단계의 마스터 혼합물 15㎕를 첨가하여 최종 부피를 25㎕로 만들었다. 스파이크(spike)를 삽입하고 뚜껑을 제자리에 똑소리가 나게 닫았다. 그 다음, 튜브를 적당한 로터가 장착된 미량원심분리기에서 30초 동안 원심분리했다. 그 다음, Cepheid 검사대에서 다음과 같은 사이클링 조건 하에 내부 PCR 반응을 40회 진행했다(제2 PCR 단계). 이 반응을 완료한 후, Cepheid 튜브는 분리하여 폐기했다.

다음과 같은 사이클링 매개변수를 사용했다.

제1 PCR 단계

온도	시간	순환 횟수
94℃	2분	1
92℃	20초
55℃	30초	18
70℃	30초
70℃	5분	1

제2 PCR 단계

온도	시간	순환 횟수
95℃	1분	1
95℃ 59℃	20초 30초	40 수집

반응 혼합물은 각각 4중체로서 SMARTCAP 튜브에 담아 준비했으며, 각각의 성분은 다음과 같다:

* 제1 PCR 단계(R1)

마스터 혼합물(MM1)
시약	㎕
DNA 주형(㎕)	5.00
10x Magic 완충액	1
Taq(Ab) 폴리머라제	0.5
10x 외측 프라이머 혼합물	1
2.5mM dNTP(100nM)	0.4
물	2.10
합계	10.0
외측 프라이머 PM-1 최종 농도: 총 마커/액틴 마커 - 0.05μM - 0.04μM

* 제2 PCR 단계(R2)

마스터 혼합물(MM2)	예비혼합물(w/o 샘플 ㎕)
시약	㎕
DNA 주형(㎕)	0.0
10x Magic 완충액	1.5
Taq(Ab) 폴리머라제	1.5
25x 내측 프라이머 혼합물-4p	1
25mM dNTP(1mM)	1
물	10.0
합계	15.0
내측 프라이머 최종 농도: GSTP1/RARB/APC - 0.4μM/액틴 - 0.24μM

PCR 마스터 혼합물은 다음과 같이 제조했다(외측 프라이머 및 내측 스콜피언 프로브/프라이머 혼합물):

최종 25㎕ 반응 함유물은 다음과 같다:

성분	반응물 중의 최종 농도
(NH4)2SO4	16.6mM
트리스 pH 8.8	67mM
MgCl2	6.7mM
B-ME	10mM
각 dNTP	1.25mM
각 프라이머	400nM
각 스콜피언	400nM
트리스-HCl, pH 8.3	4mM
KCl	20mM
EDTA	0.02mM
DTT	0.2mM
노니뎃 P40	0.02%(v/v)
트윈 20	0.02%(v/v)
글리세롤	2%(v/v)
TP6-25 항체	0.65㎍
Taq 폴리머라제	5U
트리스-HCl, pH 7.6	1.8mM
글리세롤	0.70%
ProClin 300	0.02%

"SMARTCYCLER" 분석기로부터 데이터를 출력한다.

데이터는 소정의 역치 수행을 통해 분석했고, 기준은 표 1에 제시했다.

수득된 결과는 다음과 같은 분석 수행 특징을 나타낸다: 1 PCR 포맷에서 2의 특정 Ct 컷오프에서 마커 조합물에 대해 계산된 민감도%, 특이성 및 95% 신뢰 구간. 곡선 아래의 면적(AUC) 값은 2개의 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행한 ROC 곡선 분석에 근거하여 계산했다. 하나의 마커 분석마다 AUC 값은 MedC 및 소프트웨어를 사용하여 수득했고, 여러 마커들의 다른 조합물에 대해 S-Plus 통계 소프트웨어의 지수형 회귀 모형을 적용했다.

컷오프값은 암환자와 비암환자 사이에 Ct 값의 상대 분포를 기반으로 설정했다. 메틸화 마커 세트 유래의 Ct 값 중 하나가 특정 컷오프 이하면, 액틴이 "분석 안됨" 케이스를 나타낼지라도 샘플은 메틸화된 것으로 간주했다. 수치들은 본 발명의 다양한 양태들을 예증하기 위해 다양한 모수들에 따라 비교된 데이터를 나타낸다.

실시예 2: 샘플 보관 및 패널 확인 효과

실시예 1에 기술된 절차를, GSTP1, RARβ2 및 APC 유전자 유래의 마커 조합을 포함하는 조합 분석으로 반복했다. 분석은 표시된 바와 같이 샘플 수집 3일 이내, 샘플 수집 5일 이내 및 샘플 수집 16일 이내에 수행했다. 결과는 표 2에 제시했다.

본 실시예의 샘플 세트는 전체(무처리) 소변 샘플이며, 16일 세트에는 148개 샘플(68개는 암이 공지된 샘플), 5일 세트에는 121개 샘플(52개는 암이 공지된 샘플), 3일 세트에는 73개 샘플(30개는 암이 공지된 샘플)로 구성되었다. 놀랍게도, GSTP 및 RARβ2의 조합물이 APC가 공지된 전립선 암 마커임에도 불구하고 GSTP, RARβ2 및 APC의 조합에 비해 성능이 뛰어났다. 이러한 두 유전자 조합은 샘플이 3일 이내로 보관되었을 때 어떤 다른 조합보다도 성능이 매우 뛰어났다. 모든 검사를 고찰할 때, 3일 동안 보관된 샘플의 양성 예측값은 65.9%이었고, 5일 동안 보관된 샘플은 51.35%였으며, 16일 동안 보관된 샘플은 47.22%였다. ROC 곡선 분석은 전체 소변 샘플과 전술한 바와 같이 제조되고 3일 동안 보관된 침전물을 사용한 새로운 데이터 세트(N=73, 암 공지 샘플 = 30, 암이 아닌 것으로 공지된 샘플 = 43)에 대하여 수행했다. 곡선 아래의 면적은 각 마커마다 측정했다. 결과는 표 3에 정리했다.

GSTP 자체는 샘플이 전체 소변 샘플(무처리)일 때 ROC 분석에서 최상의 결과를 나타냈다. 이와 동일한 분석을, 샘플을 회전 침강시킨 침전물에 수행했을 때에는 RARβ 마커의 성능이 엄청나게 향상되었다.

실시예 3: 전립선 마사지

소변을 이용한 분석 성능에 미치는 전립선 마사지의 효과를 측정하기 위해, 2가지 추가 샘플 세트를 시험하고 분석했다. 제1 샘플 세트로서, 전립선 마사지를 20초 미만으로 제한한 환자로부터 36개의 샘플(20개는 암이 공지된 샘플)을 수득했다. 제2 샘플 세트로서, 전립선 마사지를 20초 넘게 실시한 환자로부터 77개의 샘플(30개는 암이 공지된 샘플)을 수득했다. 각각, 샘플 보관 기간은 5일 이내였다. 이러한 샘플들에 수행된 MSPCR의 결과는 표 4에 정리했다.

전립선 마사지를 20초 미만의 기간 동안 실시했을 때 GSTP, RARβ 및 APC를 포함하는 패널에서 최상의 결과가 수득되었다. 이러한 결과는 마사지 시간이 길수록 세포 방출이 더 많아지고 적어도 특이성이 증가할 것으로 예상했는바, 뜻밖의 결과였다.

실시예 4: 직장수지검사

비정상 대 정상 직장수지검사(DRE)를 기초로 한 선택이 소변을 이용한 분석의 성능에 미치는 효과를 측정하기 위해 4가지 추가 샘플 세트를 시험하고 분석했다. 제1 샘플 세트에서 64가지 전체 소변 샘플(23개는 암이 공지된 샘플)은 정상 DRE 환자로부터 수득했다. 제2 샘플 세트에서 33개 전체 소변 샘플(19개는 암이 공지된 샘플)은 비정상 DRE 환자로부터 수득했다. 제3 샘플 세트에는 정상 DRE 환자의 48개 침전 샘플(21개는 암이 공지된 샘플)을 사용했고, 제4 샘플 세트에는 비정상 DRE 환자 유래의 22개 침전 샘플(8개는 암이 공지된 샘플)을 사용했다. 각각의 경우마다 샘플은 5일 이내로 보관했다. 이러한 샘플들에 수행된 MSPCR의 결과는 표 5에 정리했다.

비정상 DRE 환자로부터 선택된 샘플과 함께 사용된 마커는 음성 DRE 환자 유래의 샘플에서보다 상당히 우수한 성능을 나타냈다. 비정상 DRE 환자 유래의 전체 소변 샘플은 GSTP 및 APC로 구성된 마커 패널을 사용했을 때 최상의 침전 샘플과 거의 동일한 민감도 및 특이성의 정도를 나타내는 것으로 분석되었다. 단일 마커(APC) 분석이 비정상 DRE 환자의 침전 샘플에서 최상의 성능을 나타냈지만, GSTP/APC 패널도 그에 못지 않았다.

실시예 5: PSA 수준

PSA 수준을 기초로 한 샘플 선택의 효과를 측정하기 위해 2가지 추가 샘플을 시험하고 분석했다. 제1 샘플 세트에서는 PSA 값이 2.5 내지 4ng/ml 사이인 환자로부터 52개 전체 소변 샘플(25개는 암이 공지된 샘플)을 수득했다. 제2 샘플 세트에서는 PSA 수준이 4 내지 10ng/ml 사이인 환자로부터 169개 샘플(80개가 암이 공지된 샘플)을 수득했다. 각 경우마다, 샘플은 소변 수집과 침전 절차 사이를 5일 이내로 하여 4℃에서 보관했다. 이러한 샘플들에 수행된 MSPCR 결과는 이하 표 6에 정리했다.

PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml 사이인 52명의 검체(25명은 암이고 27명은 암이 아닌 환자)에서는 지수형 회귀 모형을 사용한 경우 58%의 민감도와 88%의 특이성을 나타냈고; Ct 컷오프가 GSTP = 26, RAR = 28, APC = 25인 3개의 마커를 사용한 경우에는 각각 58% 및 81%를 나타냈으며; 무분석율(no test rate)은 3.8%였다. 이와 동일한 마커와 Ct 컷오프를 사용할 때 PSA 4-10인 환자 그룹에서는 민감도/특이성 특징이 59/65% 였다. 두 샘플의 T 검정 결과, PSA 범위가 2.5 내지 4ng/ml 및 4 내지 10ng/ml인 두 그룹 사이에 검정 성능의 통계적 유효 차이는 없음을 확인했다(P=0.000). 결과는 표 6에 정리했다.

실시예 6: 추가 대단위 다중체화

추가 대단위 다중체화는 전립선 암 분석에 유용한 것으로 알려진 또 다른 마커들을 사용하여 수행했다. 최대 분석 특이성 조사는 이 분석의 목적이 모호한 PSA 결과(임상 검사 시 2.5 내지 4ng/ml)를 명백히 하고자 하는 경우에 수행했다. 이 분석은 3일 동안 보관된 침전 샘플을 가지고 실시했다. 제1 PCR 단계는 60개의 샘플(30개는 암 증례, 30개는 암이 아닌 증례의 샘플)마다 수행했다. 3가지 사중체 반응을 이용하는 6가지 마커(GST+RAR+APC+RASS+CDH1+PDLIM4)에 대해 소변 침전물에서 수득되는 데이터는 CDH1, RASS 및 PDLIM4가 80%의 특이성을 유지할 수 있도록 특이성 값을 추가하지 못한다는 것을 보여준다. 총 6개 마커의 첨가는 분석 특이성을 저하시킨다(민감도 44%, 특이성 63%). 더욱이, 6개 마커의 사용은 단독튜브 분석 형식에 적합하지 않다. 결과는 표 7에 정리했다.

실시예 7: S100A2 를 이용한 결과의 정규화

전술한 MPCR 반응에 4개의 마커(GSTP1, RARβ2, APC 및 S100A2)를 사용하여 소변 샘플을 검사했다.

상기 데이터는 20개 암과 10개 비암 샘플의 대표 세트에 대해 3가지 마커가 단독 및 조합으로서 나타내는 성능을 나타낸 것이다. 민감도는 침전 전에 소변 샘플이 최적 보관 시간이 아니어서 일반적인 결과보다 더 낮게 관찰되었다.

동일한 샘플을 그 다음 S100을 가지고 분석했고, S100과 당해 유전자 사이의 δCt를 사용하여 컷오프를 수득했다. 데이터는 RARβ2와 APC는 성능이 개선되고 GSTP1은 그렇지 않은 것을 보여주었다. 이러한 차이는 RARβ2와 APC의 경계선 증례를 현재 암으로서 분명하게 지정할 수 있어 민감도를 증가시키기 때문인 것으로 관찰되었다. 이 데이터 세트에서 GSTP1에 대한 경계선 증례는 없기 때문에 민감도는 변화 없이 유지되었다.

<110> VERIDEX, LLC <120> DETECTING PROSTATE CANCER <130> VDX5047 <150> US 11/734763 <151> 2007-04-12 <160> 25 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> GSTP1_332_U18 <400> 1 tcggggattt tagggcgt 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> GSTP1_513_L21 <400> 2 acgaaaacta cgacgacgaa a 21 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> GSTP1 Scorpion <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> fam- <220> <221> modified_base <222> (32)..(32) <223> BHQ-HEG- <400> 3 cgcacggcga actcccgccg acgtgcgtgt agcggtcgtc ggggttg 47 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> GSTPi Reverse Primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5' <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 3' <400> 4 gccccaatac taaatcacga cg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Actin_309_U24 <400> 5 gatataaggt tagggatagg atag 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Actin_501_L22 <400> 6 aaccaataaa acctactcct cc 22 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Actin Scorpion <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> q670- <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> -BHQ2-HEG- <400> 7 ccgcgcatca ccaccccaca cgcgcgggga gtatataggt tggggaagtt tg 52 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Actin Reverse Primer <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5' <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 3' <400> 8 aacacacaat aacaaacaca aattcac 27 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> APC_Outer_692_U19 <400> 9 ccctataccc cactacgaa 19 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> APC_Outer_830_L25 <400> 10 ggcgggttgt attaatatag ttata 25 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> texas red - <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> -BHQ2-HEG- <400> 11 gccggcgggt tttcgacggg ccggccgaac caaaacgctc ccca 44 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> APC Lower Primer <400> 12 gtcggttacg tgcgtttata tttag 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2_Outer_16_U25 <400> 13 ggaagtgagt tgtttagagg tagga 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2_Outer_239_L25 <400> 14 tccaaactta ctcgaccaat ccaac 25 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2 Scorpion <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> q570 - <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> -BHQ2-HEG- <400> 15 cggcgcccga cgatacccaa agcgccgaac gcgagcgatt cgagtag 47 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2 Lower Primer <400> 16 cttacaaaaa accttccgaa tacg 24 <210> 17 <211> 4260 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|341173|gb|M24485.1|HUMGSTP1G Homo sapiens (clone pHGST-pi) glutathione S-transferase pi (GSTP1) gene, complete cds <400> 17 aacaagagat caatatctag aataaatgga gatctgcaaa tcaacagaaa gtaggcagca 60 aagccaaaga aaatagccta aggcacagcc actaaaagga acgtgatcat gtcctttgca 120 gggacatggg tggagctgga agccgttagc ctcagcaaac tcacacagga acagaaaacc 180 agcgagaccg catggtctca cttataagtg ggagctgaac aatgagaaca catggtcaca 240 tggcggcgat caacacacac tggtgcctgt tgagcggggt gctggggagg gagagtacca 300 ggaagaatag ctaagggata ctgggcttaa tacctgggtg atgggatgat ctgtacagca 360 aaccatcatg gcgcacacac ctatgtaaca aacctgcaca tcctgcacat gtaccccaga 420 acttcaaata aaagttggac ggccaggcgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt 480 gggaagccga ggcgtgcaga tcacctaagg tcaggagttc gagaccagcc cggccaacat 540 ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaatcagcca gatgtggcac gcacctataa 600 ttccacctac tcgggaggct gaagcagaat tgcttgaacc cgagaggcgg aggttgcagt 660 gagccgccga gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcca cagcgtgaga ctacgtcata 720 aaataaaata aaataacaca aaataaaata aaataaaata aaataaaata aaataataaa 780 ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaagcaat ttcctttcct ctaagcggcc 840 tccacccctc tcccctgccc tgtgaagcgg gtgtgcaagc tccgggatcg cagcggtctt 900 agggaatttc cccccgcgat gtcccggcgc gccagttcgc tgcgcacact tcgctgcggt 960 cctcttcctg ctgtctgttt actccctagg ccccgctggg gacctgggaa agagggaaag 1020 gcttccccgg ccagctgcgc ggcgactccg gggactccag ggcgcccctc tgcggccgac 1080 gcccggggtg cagcggccgc cggggctggg gccggcggga gtccgcggga ccctccagaa 1140 gagcggccgg cgccgtgact cagcactggg gcggagcggg gcgggaccac ccttataagg 1200 ctcggaggcc gcgaggcctt cgctggagtt tcgccgccgc agtcttcgcc accagtgagt 1260 acgcgcggcc cgctccccgg ggatggggct cagagctccc agcatggggc caacccgcag 1320 catcaggccc gggctcccgg cagggctcct cgcccacctc gagacccggg acgggggcct 1380 aggggaccca ggacgtcccc agtgccgtta gcggctttca gggggcccgg agcgcctcgg 1440 ggagggatgg gaccccgggg gcggggaggg ggggcaggct gcgctcaccg cgccttggca 1500 tcctcccccg ggctccagca aacttttctt tgttcgctgc agtgccgccc tacaccgtgg 1560 tctatttccc agttcgaggt aggagcatgt gtctggcagg gaagggaggc aggggctggg 1620 gctgcagccc acagcccctc gcccacccgg agagatccga acccccttat ccctccgtcg 1680 tgtggctttt accccgggcc tccttcctgt tccccgcctc tcccgccatg cctgctcccc 1740 gccccagtgt tgtgtgaaat cttcggagga acctgtttac ctgttccctc cctgcactcc 1800 tgacccctcc ccgggttgct gcgaggcgga gtcggcccgg tccccacatc tcgtacttct 1860 ccctccccgc aggccgctgc gcggccctgc gcatgctgct ggcagatcag ggccagagct 1920 ggaaggagga ggtggtgacc gtggagacgt ggcaggaggg ctcactcaaa gcctcctgcg 1980 taagtgacca tgcccgggca aggggagggg gtgctgggcc ttagggggct gtgactagga 2040 tcgggggacg cccaagctca gtgcccctcc ctgagccatg cctcccccaa cagctatacg 2100 ggcagctccc caagttccag gacggagacc tcaccctgta ccagtccaat accatcctgc 2160 gtcacctggg ccgcaccctt ggtgagtctt gaacctccaa gtccagggca ggcatgggca 2220 agcctctgcc cccggagccc ttttgtttaa atcagctgcc ccgcagccct ctggagtgga 2280 ggaaactgag acccactgag gttacgtagt ttgcccaagg tcaagcctgg gtgcctgcaa 2340 tccttgccct gtgccaggct gcctcccagg tgtcaggtga gctctgagca cctgctgtgt 2400 ggcagtctct catccttcca cgcacatcct cttcccctcc tcccaggctg gggctcacag 2460 acagccccct ggttggccca tccccagtga ctgtgtgttg atcaggcgcc cagtcacgcg 2520 gcctgctccc ctccacccaa ccccagggct ctatgggaag gaccagcagg aggcagccct 2580 ggtggacatg gtgaatgacg gcgtggagga cctccgctgc aaatacatct ccctcatcta 2640 caccaactat gtgagcatct gcaccagggt tgggcactgg gggctgaaca aagaaagggg 2700 cttcttgtgc cctcaccccc cttacccctc aggtggcttg ggctgacccc ttcttgggtc 2760 agggtgcagg ggctgggtca gctctgggcc aggggcccag gggcctggga caagacacaa 2820 cctgcaccct tattgcctgg gacatcaacc agccaagtaa cgggtcatgg gggcgagtgc 2880 aaggacagag acctccagca actggtggtt tctgatctcc tggggtggcg agggcttcct 2940 ggagtagcca gaggtggagg aggatttgtc gccagtttct ggatggaggt gctggcactt 3000 ttagctgagg aaaatatgca gacacagagc acatttgggg acctgggacc agttcagcag 3060 aggcagcgtg tgtgcgcgtg cgtgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgtgtgta cgcttgcatt 3120 tgtgtcgggt gggtaaggag atagagatgg gcgggcagta ggcccaggtc ccgaaggcct 3180 tgaacccact ggtttggagt ctcctaaggg caatgggggc cattgagaag tctgaacagg 3240 gctgtgtctg aatgtgaggt ctagaaggat cctccagaga agccagctct aaagcttttg 3300 caatcatctg gtgagagaac ccagcaagga tggacaggca gaatggaata gagatgagtt 3360 ggcagctgaa gtggacagga tttggtacta gcctggttgt ggggagcaag cagaggagaa 3420 tctgggactc tggtgtctgg cctggggcag acgggggtgt ctcaggggct gggagggatg 3480 agagtaggat gatacatggt ggtgtctggc aggaggcggg caaggatgac tatgtgaagg 3540 cactgcccgg gcaactgaag ccttttgaga ccctgctgtc ccagaaccag ggaggcaaga 3600 ccttcattgt gggagaccag gtgagcatct ggccccatgc tgttccttcc tcgccaccct 3660 ctgcttccag atggacacag gtgtgagcca tttgtttagc aaagcagagc agacctaggg 3720 gatgggctta ggccctctgc ccccaattcc tccagcctgc tcccgctggc tgagtcccta 3780 gcccccctgc cctgcagatc tccttcgctg actacaacct gctggacttg ctgctgatcc 3840 atgaggtcct agcccctggc tgcctggatg cgttccccct gctctcagca tatgtggggc 3900 gcctcagtgc ccggcccaag ctcaaggcct tcctggcctc ccctgagtac gtgaacctcc 3960 ccatcaatgg caacgggaaa cagtgagggt tggggggact ctgagcggga ggcagagttt 4020 gccttccttt ctccaggacc aataaaattt ctaagagagc tactatgagc actgtgtttc 4080 ctgggacggg gcttaggggt tctcagcctc gaggtcggtg ggagggcaga gcagaggact 4140 agaaaacagc tcctccagca cagtcagtgg cttcctggag ccctcagcct ggctgtgttt 4200 actgaacctc acaaactaga agaggaagaa aaaaaaagag agagagaaac aaagagaaat 4260 <210> 18 <211> 866 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> APC <220> <221> misc_feature <223> >gi|551463|gb|U02509.1|HSU02509 Human adenomatous polyposis coli (APC) gene, promoter sequence <220> <221> misc_feature <222> (315)..(315) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 acttatatat ctgacagttg atttgtcctc acctctaaat tggaatttaa gcatcacctg 60 gttcgattta atgcaatgta gaatttgcat taaaatacta cattaaagcc tcagatttgt 120 agtagctaac agcacttcta tgtatgtgtc agggactgct ctaaatactt catatatatt 180 aactcctcta ttctgtactt ctgttcccgt tttatacagc aggaaattga aacactgaga 240 ggttaagtaa ctaaagttac agagctagag tgacaggagt aaagcttcaa ctcaggcaac 300 ccagacgtcc agagntctga tctccactac taagctgcta gcatagcttt tctggtaact 360 atttttaatt caatataatt cgaatgatct atctaacaag tcatcactct gacaactcag 420 tgacttgtaa tgtaaaatta ttcattgtaa ttcacttaat attattgttt ctctgtgctg 480 caaaaatcat agcaatcgag atgtaattta ttactctccc tcccacctcc ggcatcttgt 540 gctaatcctt ctgccctgcg gacctccccc gactctttac tatgcgtgtc aactgccatc 600 aacttccttg cttgctgggg actggggccg tgagggcata cccccgaggg gtacggggct 660 agggctaggc aggctgtgcg gttgggcggg gccctgtgcc ccactgcgga gtgcgggtcg 720 ggaagcggag agagaagcag ctgtgtaatc cgctggatgc ggaccagggc gctccccatt 780 cccgtcggga gcccgccgat tggctgggtg tgggcgcacg tgaccgacat gtggctgtat 840 tggtgcagcc cgccagggtg tcactg 866 <210> 19 <211> 10386 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|21626462|ref|NM_000038.2| Homo sapiens adenomatosis polyposis coli (APC), mRNA <220> <221> misc_feature <222> (9521)..(9521) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 attgaggact cggaaatgag gtccaagggt agccaaggat ggctgcagct tcatatgatc 60 agttgttaaa gcaagttgag gcactgaaga tggagaactc aaatcttcga caagagctag 120 aagataattc caatcatctt acaaaactgg aaactgaggc atctaatatg aaggaagtac 180 ttaaacaact acaaggaagt attgaagatg aagctatggc ttcttctgga cagattgatt 240 tattagagcg tcttaaagag cttaacttag atagcagtaa tttccctgga gtaaaactgc 300 ggtcaaaaat gtccctccgt tcttatggaa gccgggaagg atctgtatca agccgttctg 360 gagagtgcag tcctgttcct atgggttcat ttccaagaag agggtttgta aatggaagca 420 gagaaagtac tggatattta gaagaacttg agaaagagag gtcattgctt cttgctgatc 480 ttgacaaaga agaaaaggaa aaagactggt attacgctca acttcagaat ctcactaaaa 540 gaatagatag tcttccttta actgaaaatt tttccttaca aacagatatg accagaaggc 600 aattggaata tgaagcaagg caaatcagag ttgcgatgga agaacaacta ggtacctgcc 660 aggatatgga aaaacgagca cagcgaagaa tagccagaat tcagcaaatc gaaaaggaca 720 tacttcgtat acgacagctt ttacagtccc aagcaacaga agcagagagg tcatctcaga 780 acaagcatga aaccggctca catgatgctg agcggcagaa tgaaggtcaa ggagtgggag 840 aaatcaacat ggcaacttct ggtaatggtc agggttcaac tacacgaatg gaccatgaaa 900 cagccagtgt tttgagttct agtagcacac actctgcacc tcgaaggctg acaagtcatc 960 tgggaaccaa ggtggaaatg gtgtattcat tgttgtcaat gcttggtact catgataagg 1020 atgatatgtc gcgaactttg ctagctatgt ctagctccca agacagctgt atatccatgc 1080 gacagtctgg atgtcttcct ctcctcatcc agcttttaca tggcaatgac aaagactctg 1140 tattgttggg aaattcccgg ggcagtaaag aggctcgggc cagggccagt gcagcactcc 1200 acaacatcat tcactcacag cctgatgaca agagaggcag gcgtgaaatc cgagtccttc 1260 atcttttgga acagatacgc gcttactgtg aaacctgttg ggagtggcag gaagctcatg 1320 aaccaggcat ggaccaggac aaaaatccaa tgccagctcc tgttgaacat cagatctgtc 1380 ctgctgtgtg tgttctaatg aaactttcat ttgatgaaga gcatagacat gcaatgaatg 1440 aactaggggg actacaggcc attgcagaat tattgcaagt ggactgtgaa atgtacgggc 1500 ttactaatga ccactacagt attacactaa gacgatatgc tggaatggct ttgacaaact 1560 tgacttttgg agatgtagcc aacaaggcta cgctatgctc tatgaaaggc tgcatgagag 1620 cacttgtggc ccaactaaaa tctgaaagtg aagacttaca gcaggttatt gcaagtgttt 1680 tgaggaattt gtcttggcga gcagatgtaa atagtaaaaa gacgttgcga gaagttggaa 1740 gtgtgaaagc attgatggaa tgtgctttag aagttaaaaa ggaatcaacc ctcaaaagcg 1800 tattgagtgc cttatggaat ttgtcagcac attgcactga gaataaagct gatatatgtg 1860 ctgtagatgg tgcacttgca tttttggttg gcactcttac ttaccggagc cagacaaaca 1920 ctttagccat tattgaaagt ggaggtggga tattacggaa tgtgtccagc ttgatagcta 1980 caaatgagga ccacaggcaa atcctaagag agaacaactg tctacaaact ttattacaac 2040 acttaaaatc tcatagtttg acaatagtca gtaatgcatg tggaactttg tggaatctct 2100 cagcaagaaa tcctaaagac caggaagcat tatgggacat gggggcagtt agcatgctca 2160 agaacctcat tcattcaaag cacaaaatga ttgctatggg aagtgctgca gctttaagga 2220 atctcatggc aaataggcct gcgaagtaca aggatgccaa tattatgtct cctggctcaa 2280 gcttgccatc tcttcatgtt aggaaacaaa aagccctaga agcagaatta gatgctcagc 2340 acttatcaga aacttttgac aatatagaca atttaagtcc caaggcatct catcgtagta 2400 agcagagaca caagcaaagt ctctatggtg attatgtttt tgacaccaat cgacatgatg 2460 ataataggtc agacaatttt aatactggca acatgactgt cctttcacca tatttgaata 2520 ctacagtgtt acccagctcc tcttcatcaa gaggaagctt agatagttct cgttctgaaa 2580 aagatagaag tttggagaga gaacgcggaa ttggtctagg caactaccat ccagcaacag 2640 aaaatccagg aacttcttca aagcgaggtt tgcagatctc caccactgca gcccagattg 2700 ccaaagtcat ggaagaagtg tcagccattc atacctctca ggaagacaga agttctgggt 2760 ctaccactga attacattgt gtgacagatg agagaaatgc acttagaaga agctctgctg 2820 cccatacaca ttcaaacact tacaatttca ctaagtcgga aaattcaaat aggacatgtt 2880 ctatgcctta tgccaaatta gaatacaaga gatcttcaaa tgatagttta aatagtgtca 2940 gtagtagtga tggttatggt aaaagaggtc aaatgaaacc ctcgattgaa tcctattctg 3000 aagatgatga aagtaagttt tgcagttatg gtcaataccc agccgaccta gcccataaaa 3060 tacatagtgc aaatcatatg gatgataatg atggagaact agatacacca ataaattata 3120 gtcttaaata ttcagatgag cagttgaact ctggaaggca aagtccttca cagaatgaaa 3180 gatgggcaag acccaaacac ataatagaag atgaaataaa acaaagtgag caaagacaat 3240 caaggaatca aagtacaact tatcctgttt atactgagag cactgatgat aaacacctca 3300 agttccaacc acattttgga cagcaggaat gtgtttctcc atacaggtca cggggagcca 3360 atggttcaga aacaaatcga gtgggttcta atcatggaat taatcaaaat gtaagccagt 3420 ctttgtgtca agaagatgac tatgaagatg ataagcctac caattatagt gaacgttact 3480 ctgaagaaga acagcatgaa gaagaagaga gaccaacaaa ttatagcata aaatataatg 3540 aagagaaacg tcatgtggat cagcctattg attatagttt aaaatatgcc acagatattc 3600 cttcatcaca gaaacagtca ttttcattct caaagagttc atctggacaa agcagtaaaa 3660 ccgaacatat gtcttcaagc agtgagaata cgtccacacc ttcatctaat gccaagaggc 3720 agaatcagct ccatccaagt tctgcacaga gtagaagtgg tcagcctcaa aaggctgcca 3780 cttgcaaagt ttcttctatt aaccaagaaa caatacagac ttattgtgta gaagatactc 3840 caatatgttt ttcaagatgt agttcattat catctttgtc atcagctgaa gatgaaatag 3900 gatgtaatca gacgacacag gaagcagatt ctgctaatac cctgcaaata gcagaaataa 3960 aagaaaagat tggaactagg tcagctgaag atcctgtgag cgaagttcca gcagtgtcac 4020 agcaccctag aaccaaatcc agcagactgc agggttctag tttatcttca gaatcagcca 4080 ggcacaaagc tgttgaattt tcttcaggag cgaaatctcc ctccaaaagt ggtgctcaga 4140 cacccaaaag tccacctgaa cactatgttc aggagacccc actcatgttt agcagatgta 4200 cttctgtcag ttcacttgat agttttgaga gtcgttcgat tgccagctcc gttcagagtg 4260 aaccatgcag tggaatggta agtggcatta taagccccag tgatcttcca gatagccctg 4320 gacaaaccat gccaccaagc agaagtaaaa cacctccacc acctcctcaa acagctcaaa 4380 ccaagcgaga agtacctaaa aataaagcac ctactgctga aaagagagag agtggaccta 4440 agcaagctgc agtaaatgct gcagttcaga gggtccaggt tcttccagat gctgatactt 4500 tattacattt tgccacggaa agtactccag atggattttc ttgttcatcc agcctgagtg 4560 ctctgagcct cgatgagcca tttatacaga aagatgtgga attaagaata atgcctccag 4620 ttcaggaaaa tgacaatggg aatgaaacag aatcagagca gcctaaagaa tcaaatgaaa 4680 accaagagaa agaggcagaa aaaactattg attctgaaaa ggacctatta gatgattcag 4740 atgatgatga tattgaaata ctagaagaat gtattatttc tgccatgcca acaaagtcat 4800 cacgtaaagc aaaaaagcca gcccagactg cttcaaaatt acctccacct gtggcaagga 4860 aaccaagtca gctgcctgtg tacaaacttc taccatcaca aaacaggttg caaccccaaa 4920 agcatgttag ttttacaccg ggggatgata tgccacgggt gtattgtgtt gaagggacac 4980 ctataaactt ttccacagct acatctctaa gtgatctaac aatcgaatcc cctccaaatg 5040 agttagctgc tggagaagga gttagaggag gagcacagtc aggtgaattt gaaaaacgag 5100 ataccattcc tacagaaggc agaagtacag atgaggctca aggaggaaaa acctcatctg 5160 taaccatacc tgaattggat gacaataaag cagaggaagg tgatattctt gcagaatgca 5220 ttaattctgc tatgcccaaa gggaaaagtc acaagccttt ccgtgtgaaa aagataatgg 5280 accaggtcca gcaagcatct gcgtcgtctt ctgcacccaa caaaaatcag ttagatggta 5340 agaaaaagaa accaacttca ccagtaaaac ctataccaca aaatactgaa tataggacac 5400 gtgtaagaaa aaatgcagac tcaaaaaata atttaaatgc tgagagagtt ttctcagaca 5460 acaaagattc aaagaaacag aatttgaaaa ataattccaa ggacttcaat gataagctcc 5520 caaataatga agatagagtc agaggaagtt ttgcttttga ttcacctcat cattacacgc 5580 ctattgaagg aactccttac tgtttttcac gaaatgattc tttgagttct ctagattttg 5640 atgatgatga tgttgacctt tccagggaaa aggctgaatt aagaaaggca aaagaaaata 5700 aggaatcaga ggctaaagtt accagccaca cagaactaac ctccaaccaa caatcagcta 5760 ataagacaca agctattgca aagcagccaa taaatcgagg tcagcctaaa cccatacttc 5820 agaaacaatc cacttttccc cagtcatcca aagacatacc agacagaggg gcagcaactg 5880 atgaaaagtt acagaatttt gctattgaaa atactccagt ttgcttttct cataattcct 5940 ctctgagttc tctcagtgac attgaccaag aaaacaacaa taaagaaaat gaacctatca 6000 aagagactga gccccctgac tcacagggag aaccaagtaa acctcaagca tcaggctatg 6060 ctcctaaatc atttcatgtt gaagataccc cagtttgttt ctcaagaaac agttctctca 6120 gttctcttag tattgactct gaagatgacc tgttgcagga atgtataagc tccgcaatgc 6180 caaaaaagaa aaagccttca agactcaagg gtgataatga aaaacatagt cccagaaata 6240 tgggtggcat attaggtgaa gatctgacac ttgatttgaa agatatacag agaccagatt 6300 cagaacatgg tctatcccct gattcagaaa attttgattg gaaagctatt caggaaggtg 6360 caaattccat agtaagtagt ttacatcaag ctgctgctgc tgcatgttta tctagacaag 6420 cttcgtctga ttcagattcc atcctttccc tgaaatcagg aatctctctg ggatcaccat 6480 ttcatcttac acctgatcaa gaagaaaaac cctttacaag taataaaggc ccacgaattc 6540 taaaaccagg ggagaaaagt acattggaaa ctaaaaagat agaatctgaa agtaaaggaa 6600 tcaaaggagg aaaaaaagtt tataaaagtt tgattactgg aaaagttcga tctaattcag 6660 aaatttcagg ccaaatgaaa cagccccttc aagcaaacat gccttcaatc tctcgaggca 6720 ggacaatgat tcatattcca ggagttcgaa atagctcctc aagtacaagt cctgtttcta 6780 aaaaaggccc accccttaag actccagcct ccaaaagccc tagtgaaggt caaacagcca 6840 ccacttctcc tagaggagcc aagccatctg tgaaatcaga attaagccct gttgccaggc 6900 agacatccca aataggtggg tcaagtaaag caccttctag atcaggatct agagattcga 6960 ccccttcaag acctgcccag caaccattaa gtagacctat acagtctcct ggccgaaact 7020 caatttcccc tggtagaaat ggaataagtc ctcctaacaa attatctcaa cttccaagga 7080 catcatcccc tagtactgct tcaactaagt cctcaggttc tggaaaaatg tcatatacat 7140 ctccaggtag acagatgagc caacagaacc ttaccaaaca aacaggttta tccaagaatg 7200 ccagtagtat tccaagaagt gagtctgcct ccaaaggact aaatcagatg aataatggta 7260 atggagccaa taaaaaggta gaactttcta gaatgtcttc aactaaatca agtggaagtg 7320 aatctgatag atcagaaaga cctgtattag tacgccagtc aactttcatc aaagaagctc 7380 caagcccaac cttaagaaga aaattggagg aatctgcttc atttgaatct ctttctccat 7440 catctagacc agcttctccc actaggtccc aggcacaaac tccagtttta agtccttccc 7500 ttcctgatat gtctctatcc acacattcgt ctgttcaggc tggtggatgg cgaaaactcc 7560 cacctaatct cagtcccact atagagtata atgatggaag accagcaaag cgccatgata 7620 ttgcacggtc tcattctgaa agtccttcta gacttccaat caataggtca ggaacctgga 7680 aacgtgagca cagcaaacat tcatcatccc ttcctcgagt aagcacttgg agaagaactg 7740 gaagttcatc ttcaattctt tctgcttcat cagaatccag tgaaaaagca aaaagtgagg 7800 atgaaaaaca tgtgaactct atttcaggaa ccaaacaaag taaagaaaac caagtatccg 7860 caaaaggaac atggagaaaa ataaaagaaa atgaattttc tcccacaaat agtacttctc 7920 agaccgtttc ctcaggtgct acaaatggtg ctgaatcaaa gactctaatt tatcaaatgg 7980 cacctgctgt ttctaaaaca gaggatgttt gggtgagaat tgaggactgt cccattaaca 8040 atcctagatc tggaagatct cccacaggta atactccccc ggtgattgac agtgtttcag 8100 aaaaggcaaa tccaaacatt aaagattcaa aagataatca ggcaaaacaa aatgtgggta 8160 atggcagtgt tcccatgcgt accgtgggtt tggaaaatcg cctgaactcc tttattcagg 8220 tggatgcccc tgaccaaaaa ggaactgaga taaaaccagg acaaaataat cctgtccctg 8280 tatcagagac taatgaaagt tctatagtgg aacgtacccc attcagttct agcagctcaa 8340 gcaaacacag ttcacctagt gggactgttg ctgccagagt gactcctttt aattacaacc 8400 caagccctag gaaaagcagc gcagatagca cttcagctcg gccatctcag atcccaactc 8460 cagtgaataa caacacaaag aagcgagatt ccaaaactga cagcacagaa tccagtggaa 8520 cccaaagtcc taagcgccat tctgggtctt accttgtgac atctgtttaa aagagaggaa 8580 gaatgaaact aagaaaattc tatgttaatt acaactgcta tatagacatt ttgtttcaaa 8640 tgaaacttta aaagactgaa aaattttgta aataggtttg attcttgtta gagggttttt 8700 gttctggaag ccatatttga tagtatactt tgtcttcact ggtcttattt tgggaggcac 8760 tcttgatggt taggaaaaaa atagtaaagc caagtatgtt tgtacagtat gttttacatg 8820 tatttaaagt agcatcccat cccaacttcc tttaattatt gcttgtctta aaataatgaa 8880 cactacagat agaaaatatg atatattgct gttatcaatc atttctagat tataaactga 8940 ctaaacttac atcagggaaa aattggtatt tatgcaaaaa aaaatgtttt tgtccttgtg 9000 agtccatcta acatcataat taatcatgtg gctgtgaaat tcacagtaat atggttcccg 9060 atgaacaagc tttacccagc ctgtttgctt tactgcatga atgaaactga tggttcaatt 9120 tcagaagtaa tgattaacag ttatgtggtc acatgatgtg catagagata gctacagtgt 9180 aataatttac actattttgt gctccaaaca aaacaaaaat ctgtgtaact gtaaaacatt 9240 gaatgaaact attttacctg aactagattt tatctgaaag taggtagaat ttttgctatg 9300 ctgtaatttg ttgtatattc tggtatttga ggtgagatgg ctgctctttt attaatgaga 9360 catgaattgt gtctcaacag aaactaaatg aacatttcag aataaattat tgctgtatgt 9420 aaactgttac tgaaattggt atttgtttga agggtcttgt ttcacatttg tattaataat 9480 tgtttaaaat gcctctttta aaagcttata taaatttttt ncttcagctt ctatgcatta 9540 agagtaaaat tcctcttact gtaataaaaa caattgaaga agactgttgc cacttaacca 9600 ttccatgcgt tggcacttat ctattcctga aattctttta tgtgattagc tcatcttgat 9660 ttttaacatt tttccactta aacttttttt tcttactcca ctggagctca gtaaaagtaa 9720 attcatgtaa tagcaatgca agcagcctag cacagactaa gcattgagca taataggccc 9780 acataatttc ctctttctta atattataga aattctgtac ttgaaattga ttcttagaca 9840 ttgcagtctc ttcgaggctt tacagtgtaa actgtcttgc cccttcatct tcttgttgca 9900 actgggtctg acatgaacac tttttatcac cctgtatgtt agggcaagat ctcagcagtg 9960 aagtataatc agcactttgc catgctcaga aaattcaaat cacatggaac tttagaggta 10020 gatttaatac gattaagata ttcagaagta tattttagaa tccctgcctg ttaaggaaac 10080 tttatttgtg gtaggtacag ttctggggta catgttaagt gtccccttat acagtggagg 10140 gaagtcttcc ttcctgaagg aaaataaact gacacttatt aactaagata atttacttaa 10200 tatatcttcc ctgatttgtt ttaaaagatc agagggtgac tgatgataca tgcatacata 10260 tttgttgaat aaatgaaaat ttatttttag tgataagatt catacactct gtatttgggg 10320 agagaaaacc tttttaagca tggtggggca ctcagatagg agtgaataca cctacctggt 10380 ggtcat 10386 <210> 20 <211> 2762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2 >gi|14916495|ref|NM_016152.2| Homo sapiens retinoic acid receptor, beta (RARB), transcript variant 2, mRNA <400> 20 gtgacagaag tagtaggaag tgagctgttc agaggcagga gggtctattc tttgccaaag 60 gggggaccag aattccccat gcgagctgtt tgaggactgg gatgccgaga acgcgagcga 120 tccgagcagg gtttgtctgg gcaccgtcgg ggtaggatcc ggaacgcatt cggaaggctt 180 tttgcaagca tttacttgga aggagaactt gggatctttc tgggaacccc ccgccccggc 240 tggattggcc gagcaagcct ggaaaatgca attgaaacac agagcaccag ctctgaggaa 300 ctcgtcccaa gccccccatc tccacttcct ccccctcgag tgtacaaacc ctgcttcgtc 360 tgccaggaca aatcatcagg gtaccactat ggggtcagcg cctgtgaggg atgtaagggc 420 tttttccgca gaagtattca gaagaatatg atttacactt gtcaccgaga taagaactgt 480 gttattaata aagtcaccag gaatcgatgc caatactgtc gactccagaa gtgctttgaa 540 gtgggaatgt ccaaagaatc tgtcaggaat gacaggaaca agaaaaagaa ggagacttcg 600 aagcaagaat gcacagagag ctatgaaatg acagctgagt tggacgatct cacagagaag 660 atccgaaaag ctcaccagga aactttccct tcactctgcc agctgggtaa atacaccacg 720 aattccagtg ctgaccatcg agtccgactg gacctgggcc tctgggacaa attcagtgaa 780 ctggccacca agtgcattat taagatcgtg gagtttgcta aacgtctgcc tggtttcact 840 ggcttgacca tcgcagacca aattaccctg ctgaaggccg cctgcctgga catcctgatt 900 cttagaattt gcaccaggta taccccagaa caagacacca tgactttctc agacggcctt 960 accctaaatc gaactcagat gcacaatgct ggatttggtc ctctgactga ccttgtgttc 1020 acctttgcca accagctcct gcctttggaa atggatgaca cagaaacagg ccttctcagt 1080 gccatctgct taatctgtgg agaccgccag gaccttgagg aaccgacaaa agtagataag 1140 ctacaagaac cattgctgga agcactaaaa atttatatca gaaaaagacg acccagcaag 1200 cctcacatgt ttccaaagat cttaatgaaa atcacagatc tccgtagcat cagtgctaaa 1260 ggtgcagagc gtgtaattac cttgaaaatg gaaattcctg gatcaatgcc acctctcatt 1320 caagaaatgc tggagaattc tgaaggacat gaacccttga ccccaagttc aagtgggaac 1380 acagcagagc acagtcctag catctcaccc agctcagtgg aaaacagtgg ggtcagtcag 1440 tcaccactcg tgcaataaga cattttctag ctacttcaaa cattccccag taccttcagt 1500 tccaggattt aaaatgcaag aaaaaacatt tttactgctg cttagttttt ggactgaaaa 1560 gatattaaaa ctcaagaagg accaagaagt tttcatatgt atcaatatat atactcctca 1620 ctgtgtaact tacctagaaa tacaaacttt tccaatttta aaaaatcagc catttcatgc 1680 aaccagaaac tagttaaaag cttctatttt cctctttgaa cactcaagat gcatggcaaa 1740 gacccagtca aaatgattta cccctggtta agtttctgaa gactttgtac atacagaagt 1800 atggctctgt tctttctata ctgtatgttt ggtgctttcc ttttgtcttg catactcaaa 1860 ataaccatga caccaaggtt atgaaataga ctactgtaca cgtctaccta ggttcaaaaa 1920 gataactgtc ttgctttcat ggaatagtca agacatcaag gtaaggaaac aggactattg 1980 acaggactat tgtacagtat gacaagataa ggctgaagat attctacttt agttagtatg 2040 gaagcttgtc tttgctcttt ctgatgctct caaactgcat cttttatttc atgttgccca 2100 gtaaaagtat acaaattccc tgcactagca gaagagaatt ctgtatcagt gtaactgcca 2160 gttcagttaa tcaaatgtca tttgttcaat tgttaatgtc actttaaatt aaaagtggtt 2220 tattacttgt ttaatgacat aactacacag ttagttaaaa aaaatttttt tacagtaatg 2280 atagcctcca aggcagaaac acttttcagt gttaagtttt tgtttacttg ttcacaagcc 2340 attagggaaa tttcatggga taattagcag gctggtctac cactggacca tgtaactcta 2400 gtgtccttcc tgattcatgc ctgatattgg gatttttttc cagcccttct tgatgccaag 2460 ggctaattat attacatccc aaagaaacag gcatagaatc tgcctccttt gaccttgttc 2520 aatcactatg aagcagagtg aaagctgtgg tagagtggtt aacagataca agtgtcagtt 2580 tcttagttct catttaagca ctactggaat tttttttttt gatatattag caagtctgtg 2640 atgtactttc actggctctg tttgtacatt gagattgttt gtttaacaat gctttctatg 2700 ttcatatact gtttaccttt ttccatggac tctcctggca aagaataaaa tatatttatt 2760 tt 2762 <210> 21 <211> 8670 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> S100A2 gene <400> 21 gagctcaaga gttcaagacc cgtctgggca agatggcaaa actccatcac cacaaaagat 60 gcaaaaagat gcgcacagtg gcgcacacct atagccccag ttactgagga ggttaatgtg 120 ggaggatcac atgaggctgc agtgagctgt gatggtgcca ctgtactcca gccttggcga 180 cagtgagtct atgtctcaaa taagtaagta aacaaaaatt aaaaagaatc cagtccacag 240 ggcatttgaa ggcaagagga aaagatgcca gaatcagaga tggggagaag atgggcttca 300 cgcacctgct gaggttgaga aatgagacag ataggctgag tgtggggtgg agagaggatg 360 ggcagagaga ctgaggctgg tctgaatgga aatgaaatgt tagggctctc agggttatcg 420 gggaataatt ggagcttcta ggaaaggttt aacgttgtga ccacctgtgt gcgtcatgcc 480 tccccacccc ttactaattg tgtgaatttg gcagactttg agtctcagtg ttctcctctg 540 tgaagtgggg tcatcttatt ccaactcctg ggattgttgt gtgaattaaa tggggtaatg 600 tacggagagc acctgacgca cagcgagtgc ttcaaaattt cagtctgcac cccccagcaa 660 aggatatgca cacgcccatt gtgagtgaca aatccaggat gacctgaacc caatgtgata 720 acgtgggtcc tcgcatgctg gtcatgctgc cgggagacac ttatggatcc aattagtaca 780 acaggggaaa taaattattt aatgcatttt gctaagacag aatacctcag aacttatttt 840 gtggggtggg gcataataaa gggggtcctt ctgctgaaaa cgtttaagct caggttcgtg 900 gcaccactca accaaggtcg acagtcacac agtaagccag aggcaatgtc aggacttaaa 960 ctaaacctgt ggcccccaca atgaggccat ttctctttcc cctgaacggc ctggggaaag 1020 ggggtgggtg ggcagaactt ggcagtggcc aatccctcac ttctgtcccc tggttttctc 1080 ctgcccttat ctctaggctt gcattgattg attgattgag acagggtctt gctctgtcgt 1140 ccaggctgga gtgcagtggc acgatcatgg ctcactgcag cctcaaactc ctaggctcaa 1200 gtggtctttc cgcctcctat ctcccgagta cccatatccc taggctttta aaatggcttc 1260 caggtatctg gctgccgtct cagacatcca cctgggcttc tgggcaggga ctgtccggga 1320 aacctcatct atgtgaagca ggtgtgggtg taggaaggcc gcttggaaat gaatcagcac 1380 tgtctcctgt ttgagtcgta agcagggcgc cagagggtct ggcggacaag aaagggagga 1440 tgacaggagg ccggcactgc aatgacacgc cttagccacc agagggcacg aagcagctgg 1500 gcaaaatccc gcggggcccc tggtggaaaa tttctggcac ctggagcccg gagatggggt 1560 ggacggaatg tgaggaccca gcttcctgag gctgggccgg ggcagagtca ctgctttgga 1620 tgtccgcagg gcctgcttgt gtcttgacta ctctgccttt gtagacagct ggagaatgtg 1680 agagtgggat tgggatcgga ctctagggcc attccgtaca actctcctgc cctgccgtgg 1740 gggagggagt tgcccaaggt tacgcagcaa gttagtggca aatgaatacg attatcacca 1800 gtctcaggta tatggccatt tgatgggcgc agtcgcagcc tcagttcctg agacagagac 1860 acctgattaa ggacaggcct tcaggagctg accctagtga cccgcggctc tgctgctgtc 1920 tctgtttttc tccctggctt ttccatctga ctgactcttt gtcttcttcg tctgcctgcc 1980 tgtctccgtc tctgcccgct ggggggtttg ctcaactccc tcactgggtc ctgggagccg 2040 cagtttcctg ctgtcactcc tcagggattt gtagctctct gaagctcttt tccgacccgt 2100 tgtctcggtt ccactcttgg gatccagagg agaggtgatt atttcgtagc atagtcagtg 2160 gtgtgatttc acggggtgag aaggactccc ttgctcctaa gcactcctcc agtgacccct 2220 gttgccatgt ggtagccgta agcactggtt ggcacctggt gtgggcgaga cccttacctc 2280 atgcagaaat gagtaagact ggtgagctca ctatgtgggg tgaggctgag agaaaacaag 2340 tacacaggtg attcagtcaa aatcagaatt ctctaagtac acacgaaaag ggcaaaaggg 2400 gcgctttgta caggacagaa caggtagaca ctgaatccgg ttgggccctg ggaaggctcc 2460 ctgcagtggc ctttgaaggg ggggttggat ttcagcagga tagagggcat gggcatgtgt 2520 gggcacgttc tgaacagagg ggtcagcgca agccgagggt cttggccaca ctagttgcat 2580 gtgccggtgt gtttaaggga cacgcagcag caggccgagt ctggagcgcc tcactgccag 2640 gctttttaaa aatttttaat tttaatttaa ttttatttta tttttacttt aagttctggc 2700 atacatgtgc agaatgtggt ttgttacata ggtatacatg tgccatggtg gtttgctgca 2760 cctatcaacc catcatctag gttttaagcc ccgcatgcat caggtattag tcctaatgct 2820 ctccctcccc ttgcccccat ccttctcccc gcaactgccc acaggccctg gtatgtggtg 2880 ttcccttccc tgtgtccata tgttctcatt gttcaactcc cacttatgag tgagaacata 2940 ccgcctggct ttaagggaca gccatgggga tgcactgcag tttctgagca gggaaggccc 3000 tgtggaggcc cttagttaaa aggaaagaat ggctgtgaaa atcgatgcat tgcgctccct 3060 tgtccctcac cctcagtgtg aagggttttt attccgagtt ctacttgaag taggcctcga 3120 tgggaagaca agtagcatga ggggttcaag tactgagggg agcaagggac actcggtggc 3180 tgtgccaagg tgtagaagag gacactgggg gccccaagac ctgacttcat gtacactgct 3240 caggctggcc cccaagtcac acggtgaccg ctaggaaggg accagcctgt tctcagtctg 3300 atcctacagc catgtcatta tccaaagctc ctcctggcag ggcctgtttg gggtctctgt 3360 gccagtgctt tccctgccag gctgggctgg ggcttccacc tactgctctg ggactgctgc 3420 tgccctggcc ctgggggagg agggtgtgcc gctgagtcac tgcctgggca tctgggcctg 3480 gaacctcggg tgagtcactt agggctgagg tagaggggct gggggagggg aagaagctac 3540 tcgacagctg gagcagggag gggagctggg gccacaggaa gggcggtgcc ctgatgccca 3600 gacgggccgg gatagacaaa gggccaagga ggaaggggcc ctgggagggg gcagccctcc 3660 cttgggctgg ggtctgaatg gcacagtgtt tgcctttctc cgggtctggg gaggacatgt 3720 gtgtgggggg cagtgagaga gggctgtggc tgagggctgt gcttcaggcc tggattctgg 3780 cttgggaagc tgtccagctg gtgttttcag ccttgggtag ggatgtaccc ctacccaccc 3840 acccagccct caagctggag aagaggaggc caaagttttc ctgttcagcc tttaactact 3900 cgggacttcc ttatgctccc cacagactgt ggcccagccc aactgcggct gtgtgtagag 3960 caaccccatt tctcactgct tccccatcct tccagacacc ttcctacaca gagggacctt 4020 cccaggtatt tctaagcaca cttagttacc tcattacctc attaagaggt attctggtgc 4080 tggccattaa aagtcactcc acttcatcca tgccctgaag tcagtcctgt ccttctcctc 4140 ctgatgtccc ccagctgcct cctctggccc ccagcttcct aaggtggccc caggttgctt 4200 ctctctcaca cacacgggcg catgtatgta cacgagcact ggaccatgaa gtctcagcgt 4260 gtgctcacag cctctcacac aggagtgggc tgtgactcac aggcatgtca tgagaatgag 4320 gcctggcacc agtctccagg ccccagagca ggggttgcct cccctcaccc cggtccagga 4380 tgcccagtcc ccacgacacc tcccacttcc cactgtggcc tgggtgggct caggggctgc 4440 ccttgacctg gcctagagcc ctcccccagc tggtggtgga gctggcactc tctgggaggg 4500 agggggctgg gagggaatga gtgggaatgg caagaggcca gggtttggtg ggatcaggtt 4560 gaggcaggtt tggtttcctt aaaatgccaa gttgggggcc agtggggccc acatataaat 4620 cctcaccctg ggagcctggc tgccttgctc tccttcctgg gtctgtctct gccacctggt 4680 ctggtgagta cctctgtcct gctgagggca gggtggggag gatccccgtg ggtctctgtc 4740 tttgtctcca cagttctctc attccagctt ccctggtggg atcaacctgg gcctctctgg 4800 gccttccccc ttggaagaac tctctgtgaa gtgctgaagt gttgactgaa gggttttttt 4860 tttttttttt tttttttgag atggagtctc gctctgtcgc ccaggctgga gtacagtggt 4920 gtgatctcag ctcactgcaa actccccctc ccaggttcac gccatttccc tgcctcagcc 4980 tcccgagtag ctgggactgc aggcgcccac caccatgccc ggctaatttt tttgtatttt 5040 tagtagagat ggggtttcac catgttagcc aggatggtct cgatctcctg atctcgtgat 5100 ccacccatct cggcctccca aagtgctggg attacaggag taagccaccg cgcccggccg 5160 actgaagggt ttttctccag gttcctctgt gaggtctcag tgcaggggtt gctctgaggc 5220 cctcccctgg atatctcagt ctaggggccc ttctttgggg gtctaggcct aggagcagga 5280 ggtgtgcatg tgggcgttgc tgcaaaaaga atcctgagat tttttttttt tttttttttt 5340 ttgcaaagtc ctggattcta gcaggactaa ggtgcaagag gcaggggtct caagactctg 5400 cctgggtcat ggccccaagc agcaaagctc tgccccctgc ctcggtgaag gcagggctgg 5460 catgatgggc ccagggcatg ccctgcctct ggcatagctc ctctggcctc accctgaaac 5520 ctgcctaacc tttccaggct ggtctgagta ttctcagagg ccttgccgct gaggtctgtc 5580 ccatcctgat cccaaggcaa tgaacatttc atatctttaa ttctaattcc aacaggatcc 5640 ttcctggtgg agagaatgtt aagttgcccc caccctatcc atgcccctgt ctgcctagag 5700 gctcaggggc cttcagggtg aggggagaca cattccccac cctctgggag ctcctagtct 5760 gagagaggaa acactcctgc ccaagggagc ttccagttag atggcagaga gagatgcctc 5820 tggcttcagg agtcccgagt ctaaggaggg aaacgactcc ttcagggagc ttcctgctcc 5880 taggctgtag ccatggctcc tgccagactg cacaggagcc cccatctgcc agccggtgca 5940 tgtggccctg ctccccagag cctgcgcaga tgccatcaaa atgggactct ggtcaccctg 6000 tcatttccct tctggcagac actaaaatgg ggagccctgc cctcaggggg gtgtcccaag 6060 tgccatcaga ggaggcttgg tgactcccag acacaaggga agctttagcg tctgccctca 6120 gggtgagatg gaggtatccc tccggcctca gggaaccaca gtctgagggg agatgcagcc 6180 cctgccttcc cattcagaga ggggttttgt gaggtggctt gggggcatag ggcagaagtg 6240 gatcctacag gctgagctaa ggccccaaga gcctcagcag tgtacccatc acctggcacc 6300 tctgcagcca cagatccatg atgtgcagtt ctctggagca ggcgctggct gtgctggtca 6360 ctaccttcca caagtactcc tgccaagagg gcgacaagtt caagctgagt aagggggaaa 6420 tgaaggaact tctgcacaag gagctgccca gctttgtggg ggtgagtggc acaggcctgt 6480 gggggaggtc ctggtgtgag tgtgggggtg caggttaaat ctctccccca gttccgggtg 6540 cctgtcgatg caggtgccag ggtggggccc agcccctccc cactttagct tcatggctcc 6600 actggagtgg aaatgaggcc cgagtgggag tgcttaatta atggctgttt cctgcaacat 6660 tccagagaac catgtgctgt gagggccttc cgagtccatc tgtttaatcc tgtcattgga 6720 acttgagaaa ccagagccca gaagggaaaa gtgattgtcc caagatcaca cagcactggc 6780 acgttctctc tctctctttt cttttctttt tttttttttg agatggagtt tccctcttgt 6840 tgcccaggct ggagtgcaat ggcacgatct cggctcactg caacctctgc ctccaggggt 6900 caagcaattc tcctgtctca gcctcctgag tagctgggac tacaggcgca tcccactacg 6960 cccagctaat ttttgtattt ttagtagaga cagggtttca ccatattggc caggctggtc 7020 tcgaactcct gacctcgtga tctacctgcc tcggcttccc aaagtgattt ttgtattttt 7080 agtagagacg gggtttcatc atattggtca ggctggtctc gaactcctga cctcaggtga 7140 tctgccctcc tcggcctctg aaagtgctgg gcttacaggc gtgagcaccg tgcccggact 7200 cctttttttt tttttttttt ttgtggtggg gggacaagat ctcactctgt cacccaggct 7260 ggatcatagc tcactgtaat ctcgaactcc tgggctcaag caatcctccc aagtagttgg 7320 aactacagga gtattgtcac catgcctggc caatttttat tttttgtaga gatggagtct 7380 tgctatgttg tccaggctgg gcttgaactc ctgggttcaa gcaatcctcc cacctcggcc 7440 tcccaaagta ttggaattac agatgtgagc cactgtgctt gacctctttc catttttata 7500 tgccaaacta agaaagtatg ttagggatag aaaagccctg ctcagatata tagtctggga 7560 cattttgtgg agaaatgcat cgaccttcaa tttgtccctc accctcccta tactgactca 7620 ttggtgattc ccaaagttag gtgtcaggct ttgaacacat gaggcaggtc cttctttcct 7680 tggtttaatt ttgtttttgt ggctggttaa atttttctaa ttatttcggc tagtattaaa 7740 aaagtgtttt tcagctgggt gcagtggcct atgcctgtaa tccccacagt gtgggaggct 7800 aaggcaggag gatctcttaa gcccaggagt tcgaccagcc tgggcaacat agcaagactc 7860 catctctaca aaaataaaaa taaaaattgg ccaggcatgg tggcatacgc ttgtagtccc 7920 agctacttgg gaggctaaag gtgggaggat tgctggagcc caggaggttg aggctgcagt 7980 gagttgtgat tgtgccactg cactccaacc tgggctaaca gagcaagacc ttgtcttaaa 8040 aaataaaaag tgttcttttc tgaatctacc tggctggtgt tggggagcag caacttcggt 8100 ttcctcatca gcagaatggg gtgatgatac ctacctcgct gggctcctgt gggattcgag 8160 ctgatgcatg ctcagaggag catccagtgt cctccctgtg tccaggagga gggcacactg 8220 gagatgctca ccaatgagta tctgtctctc tccttactca ctgggccctc ttggtagctc 8280 ccagagcctc ctgcccacct tatacccagc tgcccagtgg ggagggagag ctggaaccaa 8340 cctgaatgtg tgagggtctg ggtgtttggt ggagctgggg ttggggctgg cttggtgatg 8400 agtgtatttc ctgtcacttt caggagaaag tggatgagga ggggctgaag aagctgatgg 8460 gcagcctgga tgagaacagt gaccagcagg tggacttcca ggagtatgct gttttcctgg 8520 cactcatcac tgtcatgtgc aatgacttct tccagggctg cccagaccga ccctgaagca 8580 gaactcttga cttcctgcca tggatctctt gggcccagga ctgttgatgc ctttgagttt 8640 tgtattcaat aaactttttt tgtctgttga 8670 <210> 22 <211> 2011 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> B-Actin >gi|28337|emb|Y00474.1|HSACTBPR Human beta-actin gene 5'-flanking region, CpG Island 1656 to 1955 <400> 22 gagctctgtc tcttggccag ctgaatggag gcccagcggc aacacaggtc ctgcctgggg 60 atcaggtctg ctctgcaccc caccttgctg cctggagccg cccacctgac aacctctcat 120 ccctgctctg tagatccggt cccatcccca ctgcccaccc caccccccca gcactccacc 180 cagttcaacg ttccacgaac ccccagaacc agccctcatc aacaggcagc aagaagggcc 240 ccccgcccat cgccccacaa cgccagccgg gtgaactgta gcgttggcag gtcctgaggc 300 agctgaaaga tacaaggcca gggacaggac agtcccatcc ccaggaggca gggagtatac 360 aggctgggga agtttgccct tgcgtggggt ggtgatggag gaggctcagc aagtcttctg 420 gactgtgaac ctgtgtctgc cactgtgtgc tgggtggtgg tcatctttcc caccaggctg 480 tggcctctgc aaccttcaag ggaggagcag gtcccattgg ctgagcacag ccttgtacgt 540 gaactgaaca agcagcctcc ttcctggcca caggttccat gtccttatat ggactcatct 600 ttgcctattg cgacacacac tcaatgaaca cctactacgc gctgcaaaga gccccgcagg 660 cctgaggtgc ccccacctca ccactcttcc tatttttgtg taaaaatcca gcttcttgtc 720 accacctcca aggaggggga ggaggaggaa ggcaggttcc tctaggctga gccgaatgcc 780 cctctgtggt cccacgccac tgatcgctgc atgcccacca cctgggtaca cacagtctgt 840 gattcccgga gcagaacgga ccctgcccac ccggtcttgt gtgctactca gtggacagac 900 ccaaggcaag aaagggtgac aaggacaggg tcttcccagg ctggctttga gttcctagca 960 ccgccccgcc cccaatcctc tgtggcacat ggagtcttgg tccccagagt cccccagcgg 1020 cctccagatg gtctgggagg gcagttcagc tgtggctgcg catagcagac atacaacgga 1080 cggtgggccc agacccaggc tgtgtagacc cagccccccc gccccgcagt gcctaggtca 1140 cccactaacg ccccaggcct ggtcttggct gggcgtgact gttaccctca aaagcaggca 1200 gctccagggt aaaaggtgcc ctgccctgta gagcccactt ccttcccagg gctgcggctg 1260 ggtaggtttg tagccttcat cacgggccac ctccagccac tggaccgctg gcccctgccc 1320 tgtcctgggg agtgtggtcc tgcgactcta atggccgcaa gccacctgac tcccccaaca 1380 ccacactcta cctctcaagc ccaggtctct ccctagtgac ccacccagca catttagcta 1440 gctgagcccc acagccagag gtcctcaggc cctgctttca gggcagttgc tctgaagtcg 1500 gcaaggggga gtgactgcct ggccactcca tgccctccaa gagctccttc tgcaggagcg 1560 tacagaaccc agggccctgg cacccgtgca gaccctggcc caccccacct gggcgctcag 1620 tgcccaagag atgtccacac ctaggatgtc ccgcggtggg tggggggccc gagagacggg 1680 caggccgggg gcaggcctgg ccatgcgggg ccgaaccggg cactgcccag cgtggggcgc 1740 gggggccacg gcgcgcgccc ccagcccccg ggcccagcac cccaaggcgg ccaacgccaa 1800 aactctccct cctcctcttc ctcaatctcg ctctcgctct tttttttttt cgcaaaagga 1860 ggggagaggg ggtaaaaaaa tgctgcactg tcggcgaagc cggtgagtga gcggcgcggg 1920 gccaatcgcg tgcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tcgagcggcc gcggcggcgc 1980 cctataaaac ccagcggcgc gacgcgccac c 2011 <210> 23 <211> 1792 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|5016088|ref|NM_001101.2| Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA <400> 23 cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60 ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat 120 gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg 180 gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga 240 cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt 300 caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt 360 ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg 420 cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat 480 ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg 540 tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct 600 gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg 660 cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct 720 gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct 780 ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg 840 ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga 900 aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa 960 cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1020 gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1080 gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1140 gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1200 ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1260 acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1320 tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1380 gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1440 ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1500 ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1560 tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1620 acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1680 gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1740 agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tt 1792 <210> 24 <211> 7273 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> PTGS2 >gi|3282785|gb|AF044206.1| Homo sapiens cyclooxygenase (COX-2) gene, promoter and exon 1 <400> 24 ggtacccagg ctggagtgca ctggtgtgat catagctcac taacctcgaa ctcctgggct 60 taggcaatcc tcttgccttg gcctcccaaa gtgccaggat tacaggcatg agccaccaca 120 gtggagctct caattctgat actaataatt tgtgtcttct ctttttttcc ttagcctgac 180 tagagtaatt aactttatgt cttttaaaag aaccaccttt ttggttttac ccattttctt 240 ttttgatttt ctgtttttga tttgattgat atctactcta attttttatt atttcttttc 300 ctctgcttac tttgaattta attacttttc ttttttgtag tctcctaaaa tagaagctta 360 tattattgat tttagatctt tcttcttttc tattacagca ctcaatgcta taaatttccc 420 tctaagcatt gctttcactg catcctacaa tatttcaact ctattgttat ttagctcaaa 480 agaggttctt aatttctatt gggatttctc tttgacccat gtgttattca gaagtgttcc 540 gtgtgatctc caaatatttg ggagtttttc agctatcttt ctattaatca tttcttgttt 600 aattctattg tggcctgaga gcatatattg tatgatttat attcttgtaa atgtgttaag 660 gtgtgtctta tggtgcagaa tgcggtttat cttgctatat gttccttaga gaataatgta 720 tgttctgctg ttattggata aagtagtcta tagatgtcag ttacatctcg ttgattaatg 780 gtgctgttga gttcagctat gtcctaaatg attttctgtc tgctgtatct gtctatttct 840 gacacaaggc tgttgaagtc tccaaccata ataatgaatt aatctatttt tctttgcagt 900 tttatcaatt ttgtcttata tatattgatg ctccattgtt tggcacatac acattaagaa 960 ttgttatgtc ttcttggaga atttaccttt ccataacatg taacatttcc ctttattcct 1020 gataattttt cttgctcaaa agtttgccct gttggaaatt accagaacta ctctggcttt 1080 atttgattag tgttagcatg ctctctcttt ctctattctt acacttttaa tgtatacttg 1140 actttgtatt taaagtgggg ttcttataga aaacatatac ttggtagggt gggaagtaaa 1200 ataaaaagaa atacttgggt attggtttga tccactctaa caatctctat gttttaattg 1260 atgtatttag accattgata cttatttttt tatcctcatc cctgtgatta cccagagagc 1320 tgcttaaatt gattattgat atagacaaat taataattaa tatctaccgt ttgttactgt 1380 tttctatttt tcattgccct tactttctgc tcctattttt tgctcctttt tctgttaatt 1440 taggttttga gttattttat atcattctat tttctctccc ttctcagcat atgaattatc 1500 tttctttttg acttttttag tggctgccct gaaggttgca atgtacattt acaaccagtc 1560 ccaatctcct ttcaaaaaac acaatactgt ttcatggcta gtgcaagtac ctaataataa 1620 gaagtcactc ctaatttctt tctctcattc tttgtatctt tactgttatt catttcactt 1680 gtacataagc tgtaatcttt caatacatta ttgctattat tatttcaaaa catgttatct 1740 attatatcta tttaaaataa gaaaaatagg ccaggtgcag tggcttactc atgtaatccc 1800 agcactttgg gagaccgatg gattgctaga gctcaggaat tcgagaccag cctgggcaac 1860 atagtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaaaaaaa attgctgggc atggtggcat 1920 gggcctgtgg tcacagctac tcgggaggct gaggtgagag gattgcttga gcctgggagg 1980 cagaggttgc agtgaaccaa aatcaagcta ctgcactcca gcctaagtga cagagtgaga 2040 ccctgtctca aaaaaaaaat gaaagaatta tttttattta tcttcactta tttcttctct 2100 aatgctcttt gtttctttag tatgtagatc caagtttcta acctgtatca tttttcttat 2160 ctcaataact tcttttaaca tttctcacaa agcagatcta ctggccacag aatgcctcaa 2220 ttttcatttg tctgagaaaa ccttatttct ccttcacttt tgaaagataa ttttgtaggg 2280 tacagaattc taggttgtag gttttttccc ctcaaagtga aatatttcat tccactcttt 2340 tcttctttgt atggtatctg agaagaagtc agatgtaatt cttatcatta ttacttaaaa 2400 gattgcttct gttcctttct ctcttctcct tcccttcttt ccttctctgt atattacacc 2460 ttttatagtt gccccatatt tcttagatat tatgttttgg ttttcttctg tgtttttttc 2520 tttgattctc agttttagaa gtctctattt atatatctgc aatcgcaggg attctttcct 2580 ctgccatgtc cagtctacta ataagccctt acagacattg ttgacttctg ttccagtgtt 2640 tttgatctct agcatttctc tgattatttc ttggaattgc catctgtcta cttacattac 2700 caacctattc ttgtgtgttg tcttatcata gtaattgcag ttgttttaat ttcataggta 2760 ttgtaatttc aacatctcta ccatatttga cattgattct gatgcttgct ctgtcttatc 2820 aagctatgtt tttgtctttt agtgtgactt ctaatttttt gttgaaagcc aggcatgatg 2880 tactgagtga aagaaactca atacattgta atgtgacgat aagagttcag gggaagtgaa 2940 gcattctata gtcctatagc aggtctcggc cttttagtga gcctgtgcct atgaacggtg 3000 actttcaaca agtgcttttc attccactct tttcctgtcc ttaagtggga caagatcact 3060 gggggggggc tagaattggg tatttccctt ctccaatgta gaagctaaag agagggctgg 3120 agttgggtat ttttcttccc ctgtatggaa agctagaggc agttaaattt ggatattttc 3180 cttcttctaa ttcagttagg ctgcgacaaa aatcccgaca gtttaggctc taatattata 3240 aaataatttc tcttgagtat aggccttatt aagaacacta tactctgatg gagctgaggg 3300 ggagttttct ctgatattca ctgcgagaac ctcgtagagc tccaggaagc aaaactcaca 3360 aaagtgtggg agtcttccag aatttttcct ttgcagactt atctgcactg aacctccaga 3420 aattcatcaa ttacagttca ggttttccta cccaggtact ggttttcatg gaggtttctg 3480 cctgtgcatt tctgctccag taagttgttc ttcttgtatg gtctgtcttt caaatttttt 3540 aagtagggtt atgacctgtc gcctcacttc tctgacagtt ctgagagtgt tgatttttca 3600 gtttgcttag atttttactt gtttttagga tgaagtgaca atttccaagc tcctccctga 3660 catgccagat cagaaactga aagtcctaag cctcatattc tgtgcgtggg tatgttcaca 3720 tcctgcctgc tccagtgccc ccacctcaca ctctctttcc cttccttgtc cccttgtgag 3780 atttctaggt ccaatacaaa gactgtgttc aactcattca actacttggc tcatctgagt 3840 attataatga acaatcacaa aaaaaaatga agtaaaagaa aaatccatca aagaattgag 3900 atatttgaga aaaagaaagg agatcagtgt tttataaaac ttagaaatag attttttaag 3960 tgtttcttca ttgacttatg tgaaaggact tttcttaatt taacaaatta tgtgctttcg 4020 tttatagcct caaaacttct tgtgtagcta agaatgggta aataatcagg ctttactaaa 4080 ggactaacgt aaagatcttc tgtaagtaac atttctgcta ctcaaggaag agataaactt 4140 catggcataa ccttgccaaa gtatactaag aataaccctg acacaaagct cttttttcag 4200 ccaacatgcc atgaaagaaa gaagacaagg ggtgatctcc actctctaag tgaaccacta 4260 aacccaccaa agaagaaacg agggaaatag aaagaggacc cttgcctgag ataatggatc 4320 tgtatgtatg agtagtagaa ccctgctcaa agtacaagga agggaaaaaa aagttagttt 4380 atttggaatt ttggacatta agagtcttta ttgttcattt tcttttaact cacatgaatg 4440 gcttatcact tcaattaata aatatttcat ttcttttcaa tctatattca tgaaacaaat 4500 ctgaaatgaa cagtgcaaca tgtgaatgtt tagaacatta taaaattaaa cacaaaatct 4560 gtctggcaat cttcctagca tcttaggaaa aaagttgaca aaatttcaag cagcagaagg 4620 gggcagtaaa actcaacaga aagctctgga agatttttaa gattcttcct tattttcttt 4680 tcatgtagag tatttcccaa caaatttcag acgctaatag aaattttgta caacagatcc 4740 atatatttgc ctaaaataga cacagaaaca ttgatatatg caaacatgag agctataagt 4800 tttacatgat caaaaccttt tttttatggt acacaatagt cacagtactt ttccatataa 4860 aacaggttta gtggtcttaa tttagtttgg cacatttaat acactcccat gaccagcatc 4920 ccaaatgtac ctatccgttt tattttattg tctcagaatt gtcagttatt taataaatta 4980 tgtaactttt ttccttatgc tcagatttgc acttctttct aaaactctgc ccatccttaa 5040 agtcccagat tctccttgaa cttttttttt tgactttcca agtacatgga actcttcact 5100 ctatcctgct atataagtga cagaatttcc actatgggat agatggagtt caattccttt 5160 gagtttaaaa taatctaaat ataattattc cttatgccct gtttttccct cacttttgta 5220 tccaaatctc ttttcagaca acagaacaat taatgtctga taaggaagac aatgatgatg 5280 atcacttcaa aataagcttg aattcaggat tgtaatgtaa aattttagta ctctctcaca 5340 gtatggattc taacatggct tctaacccaa actaacatta gtagctctaa ctataaactt 5400 caaatttcag tagatgcaac ctactccttt aaaatgaaac agaagattga aattattaaa 5460 ttatcaaaaa gaaaatgatc cacgctctta gttgaaattt catgtaagat tccatgcaat 5520 aaataggagt gccataaatg gaatgatgaa atatgactag aggaggagaa aggcttccta 5580 gatgagatgg aattttagtc atccgtgtct catgaagaat cagatgtgta cactaagcaa 5640 aacagttaaa aaaaaaacct ccaagtgagt ctcttattta tttttttctt ataagacttc 5700 tacaaattga ggtacctggt gtagttttat ttcaggtttt atgctgtcat tttcctgtaa 5760 tgctaaggac ttaggacata actgaatttt ctattttcca cttcttttct ggtgtgtgtg 5820 tatatatata tgtatatata cacacacaca tatacatata tatattttta gtatctcacc 5880 ctcacatgct cctccctgag cactacccat gatagatgtt aaacaaaagc aaagatgaaa 5940 ttccaactgt taaaatctcc cttccatcta attaattcct catccaacta tgttccaaaa 6000 cgagaataga aaattagccc caataagccc aggcaactga aaagtaaatg ctatgttgta 6060 ctttgatcca tggtcacaac tcataatctt ggaaaagtgg acagaaaaga caaaagagtg 6120 aactttaaaa ctcgaattta ttttaccagt atctcctatg aagggctagt aaccaaaata 6180 atccacgcat cagggagaga aatgccttaa ggcatacgtt ttggacattt agcgtccctg 6240 caaattctgg ccatcgccgc ttcctttgtc catcagaagg caggaaactt tatattggtg 6300 acccgtggag ctcacattaa ctatttacag ggtaactgct taggaccagt attatgagga 6360 gaatttacct ttcccgcctc tctttccaag aaacaaggag ggggtgaagg tacggagaac 6420 agtatttctt ctgttgaaag caacttagct acaaagataa attacagcta tgtacactga 6480 aggtagctat ttcattccac aaaataagag ttttttaaaa agctatgtat gtatgtcctg 6540 catatagagc agatatacag cctattaagc gtcgtcacta aaacataaaa catgtcagcc 6600 tttcttaacc ttactcgccc cagtctgtcc cgacgtgact tcctcgaccc tctaaagacg 6660 tacagaccag acacggcggc ggcggcggga gaggggattc cctgcgcccc cggacctcag 6720 ggccgctcag attcctggag aggaagccaa gtgtccttct gccctccccc ggtatcccat 6780 ccaaggcgat cagtccagaa ctggctctcg gaagcgctcg ggcaaagact gcgaagaaga 6840 aaagacatct ggcggaaacc tgtgcgcctg gggcggtgga actcggggag gagagggagg 6900 gatcagacag gagagtgggg actaccccct ctgctcccaa attggggcag cttcctgggt 6960 ttccgatttt ctcatttccg tgggtaaaaa accctgcccc caccgggctt acgcaatttt 7020 tttaagggga gaggagggaa aaatttgtgg ggggtacgaa aaggcggaaa gaaacagtca 7080 tttcgtcaca tgggcttggt tttcagtctt ataaaaagga aggttctctc ggttagcgac 7140 caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc 7200 ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccc gcgccgcgcc 7260 ctgcccgaag ctt 7273 <210> 25 <211> 4465 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|4506264|ref|NM_000963.1| Homo sapiens prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) (PTGS2), mRNA <400> 25 caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc 60 ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccg cgccgcgccc 120 tgcccgccgc tcggatgctc gcccgcgccc tgctgctgtg cgcggtcctg gcgctcagcc 180 atacagcaaa tccttgctgt tcccacccat gtcaaaaccg aggtgtatgt atgagtgtgg 240 gatttgacca gtataagtgc gattgtaccc ggacaggatt ctatggagaa aactgctcaa 300 caccggaatt tttgacaaga ataaaattat ttctgaaacc cactccaaac acagtgcact 360 acatacttac ccacttcaag ggattttgga acgttgtgaa taacattccc ttccttcgaa 420 atgcaattat gagttatgtc ttgacatcca gatcacattt gattgacagt ccaccaactt 480 acaatgctga ctatggctac aaaagctggg aagccttctc taacctctcc tattatacta 540 gagcccttcc tcctgtgcct gatgattgcc cgactccctt gggtgtcaaa ggtaaaaagc 600 agcttcctga ttcaaatgag attgtggaaa aattgcttct aagaagaaag ttcatccctg 660 atccccaggg ctcaaacatg atgtttgcat tctttgccca gcacttcacg catcagtttt 720 tcaagacaga tcataagcga gggccagctt tcaccaacgg gctgggccat ggggtggact 780 taaatcatat ttacggtgaa actctggcta gacagcgtaa actgcgcctt ttcaaggatg 840 gaaaaatgaa atatcagata attgatggag agatgtatcc tcccacagtc aaagatactc 900 aggcagagat gatctaccct cctcaagtcc ctgagcatct acggtttgct gtggggcagg 960 aggtctttgg tctggtgcct ggtctgatga tgtatgccac aatctggctg cgggaacaca 1020 acagagtatg cgatgtgctt aaacaggagc atcctgaatg gggtgatgag cagttgttcc 1080 agacaagcag gctaatactg ataggagaga ctattaagat tgtgattgaa gattatgtgc 1140 aacacttgag tggctatcac ttcaaactga aatttgaccc agaactactt ttcaacaaac 1200 aattccagta ccaaaatcgt attgctgctg aatttaacac cctctatcac tggcatcccc 1260 ttctgcctga cacctttcaa attcatgacc agaaatacaa ctatcaacag tttatctaca 1320 acaactctat attgctggaa catggaatta cccagtttgt tgaatcattc accaggcaaa 1380 ttgctggcag ggttgctggt ggtaggaatg ttccacccgc agtacagaaa gtatcacagg 1440 cttccattga ccagagcagg cagatgaaat accagtcttt taatgagtac cgcaaacgct 1500 ttatgctgaa gccctatgaa tcatttgaag aacttacagg agaaaaggaa atgtctgcag 1560 agttggaagc actctatggt gacatcgatg ctgtggagct gtatcctgcc cttctggtag 1620 aaaagcctcg gccagatgcc atctttggtg aaaccatggt agaagttgga gcaccattct 1680 ccttgaaagg acttatgggt aatgttatat gttctcctgc ctactggaag ccaagcactt 1740 ttggtggaga agtgggtttt caaatcatca acactgcctc aattcagtct ctcatctgca 1800 ataacgtgaa gggctgtccc tttacttcat tcagtgttcc agatccagag ctcattaaaa 1860 cagtcaccat caatgcaagt tcttcccgct ccggactaga tgatatcaat cccacagtac 1920 tactaaaaga acgttcgact gaactgtaga agtctaatga tcatatttat ttatttatat 1980 gaaccatgtc tattaattta attatttaat aatatttata ttaaactcct tatgttactt 2040 aacatcttct gtaacagaag tcagtactcc tgttgcggag aaaggagtca tacttgtgaa 2100 gacttttatg tcactactct aaagattttg ctgttgctgt taagtttgga aaacagtttt 2160 tattctgttt tataaaccag agagaaatga gttttgacgt ctttttactt gaatttcaac 2220 ttatattata agaacgaaag taaagatgtt tgaatactta aacactatca caagatggca 2280 aaatgctgaa agtttttaca ctgtcgatgt ttccaatgca tcttccatga tgcattagaa 2340 gtaactaatg tttgaaattt taaagtactt ttggttattt ttctgtcatc aaacaaaaac 2400 aggtatcagt gcattattaa atgaatattt aaattagaca ttaccagtaa tttcatgtct 2460 actttttaaa atcagcaatg aaacaataat ttgaaatttc taaattcata gggtagaatc 2520 acctgtaaaa gcttgtttga tttcttaaag ttattaaact tgtacatata ccaaaaagaa 2580 gctgtcttgg atttaaatct gtaaaatcag atgaaatttt actacaattg cttgttaaaa 2640 tattttataa gtgatgttcc tttttcacca agagtataaa cctttttagt gtgactgtta 2700 aaacttcctt ttaaatcaaa atgccaaatt tattaaggtg gtggagccac tgcagtgtta 2760 tctcaaaata agaatatttt gttgagatat tccagaattt gtttatatgg ctggtaacat 2820 gtaaaatcta tatcagcaaa agggtctacc tttaaaataa gcaataacaa agaagaaaac 2880 caaattattg ttcaaattta ggtttaaact tttgaagcaa actttttttt atccttgtgc 2940 actgcaggcc tggtactcag attttgctat gaggttaatg aagtaccaag ctgtgcttga 3000 ataacgatat gttttctcag attttctgtt gtacagttta atttagcagt ccatatcaca 3060 ttgcaaaagt agcaatgacc tcataaaata cctcttcaaa atgcttaaat tcatttcaca 3120 cattaatttt atctcagtct tgaagccaat tcagtaggtg cattggaatc aagcctggct 3180 acctgcatgc tgttcctttt cttttcttct tttagccatt ttgctaagag acacagtctt 3240 ctcatcactt cgtttctcct attttgtttt actagtttta agatcagagt tcactttctt 3300 tggactctgc ctatattttc ttacctgaac ttttgcaagt tttcaggtaa acctcagctc 3360 aggactgcta tttagctcct cttaagaaga ttaaaagaga aaaaaaaagg cccttttaaa 3420 aatagtatac acttatttta agtgaaaagc agagaatttt atttatagct aattttagct 3480 atctgtaacc aagatggatg caaagaggct agtgcctcag agagaactgt acggggtttg 3540 tgactggaaa aagttacgtt cccattctaa ttaatgccct ttcttattta aaaacaaaac 3600 caaatgatat ctaagtagtt ctcagcaata ataataatga cgataatact tcttttccac 3660 atctcattgt cactgacatt taatggtact gtatattact taatttattg aagattatta 3720 tttatgtctt attaggacac tatggttata aactgtgttt aagcctacaa tcattgattt 3780 ttttttgtta tgtcacaatc agtatatttt ctttggggtt acctctctga atattatgta 3840 aacaatccaa agaaatgatt gtattaagat ttgtgaataa atttttagaa atctgattgg 3900 catattgaga tatttaaggt tgaatgtttg tccttaggat aggcctatgt gctagcccac 3960 aaagaatatt gtctcattag cctgaatgtg ccataagact gaccttttaa aatgttttga 4020 gggatctgtg gatgcttcgt taatttgttc agccacaatt tattgagaaa atattctgtg 4080 tcaagcactg tgggttttaa tatttttaaa tcaaacgctg attacagata atagtattta 4140 tataaataat tgaaaaaaat tttcttttgg gaagagggag aaaatgaaat aaatatcatt 4200 aaagataact caggagaatc ttctttacaa ttttacgttt agaatgttta aggttaagaa 4260 agaaatagtc aatatgcttg tataaaacac tgttcactgt tttttttaaa aaaaaaactt 4320 gatttgttat taacattgat ctgctgacaa aacctgggaa tttgggttgt gtatgcgaat 4380 gtttcagtgc ctcagacaaa tgtgtattta acttatgtaa aagataagtc tggaaataaa 4440 tgtctgttta tttttgtact attta 4465

Claims (27)

1. 사람으로부터 소변 샘플을 수득하는 단계 및 이 소변 샘플을 수득한 후 3일 이내에 소변 샘플에 존재하는 GSTP1 유전자와 1 이상의 대조군만의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 소정 값을 초과하는 메틸화는 전립선암을 나타내고, 상기 소정 값을 초과하지 않는 메틸화는 전립선암 음성을 나타내는, 전립선암의 검출방법.
2. 제1항에 있어서, 참조 마커의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 소변 샘플을 수집하기 전에 사람에게 전립선 마사지가 약 20초 동안 실시되는 검출방법.
3. 제1항에 있어서, 사람의 PSA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml 사이인 사람에 대해서만 수행되는 검출방법.
4. 제1항에 있어서, 유전자의 메틸화 상태가 제1 PCR 단계에 이어 후속 PCR 단계가 수행되는 네스티드(nested) PCR에 의해 측정되며, 여기서 후속 PCR을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브는 제1 PCR 단계에서 증폭된 서열 내의 서열에 대해 지시된 것이며, 소변 샘플은 제1 PCR 단계를 수행하기 전에 침전물로 회전 침강된 것 인 검출방법.
5. 사람으로부터 소변 샘플을 수득하는 단계, 이 소변 샘플이 수득된 후 3일 이내에 소변 샘플에 존재하는 S100 유전자, 및 GSTP1 유전자, APC 및 RARβ2로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1 이상의 유전자, 및 1 이상의 대조군만의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하며, 이때 S100 유전자의 메틸화 Ct 값보다 적은 GSTP1, APC 또는 RARβ2 유전자의 메틸화 Ct 값이 소정 값을 초과하면 전립선암을 나타내고, 상기 소정 값을 초과하지 않는 메틸화는 전립선암 부재를 나타내는 것인, 전립선암의 검출방법.
6. 제5항에 있어서, 참조 마커의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 소변 샘플의 수집 전에, 사람에게 전립선 마사지가 약 20초 동안 실시되는 검출방법.
7. 제5항에 있어서, 사람의 PSA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 사람에 대해서만 수행되는 검출방법.
8. 제5항에 있어서, 유전자의 메틸화 상태가, 제1 PCR 단계에 이어 후속 PCR 단계가 수행되는 네스티드 PCR에 의해 측정되며, 여기서 후속 PCR을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브는 제1 PCR 단계에서 증폭된 서열 내의 서열에 대해 지시된 것이며, 소변 샘플은 제1 PCR 단계를 수행하기 전에 침전물로 회전 침강된 것인 검출 방법.
9. 환자로부터 소변 샘플을 수득하는 단계, 이 소변 샘플에 존재하는 GSTP1 유전자, RARβ1, APC 유전자와 1 이상의 대조군만의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하고; 이때 소정 값을 초과하는 메틸화는 전립선암을 나타내고, 이 소정 값을 초과하지 않는 메틸화는 전립선암 부재를 나타내며, 방법의 수행 동안에 개방되지 않는 상태로 유지되는 단일 용기 내에서 수행되는, 전립선암의 검출방법.
10. 제9항에 있어서, 참조 마커의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 검출방법.
11. 제9항에 있어서, 사람의 PSA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 사람에 대해서만 수행되는 검출방법.
12. 제9항에 있어서, 유전자의 메틸화 상태가, 제1 PCR 단계에 이어 후속 PCR 단계가 수행되는 네스티드 PCR에 의해 측정되며, 여기서 후속 PCR을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브는 제1 PCR 단계에서 증폭된 서열 내의 서열에 대해 지시된 것이며, 소변 샘플은 제1 PCR 단계를 수행하기 전에 침전물로 회전 침강된 것인 검출방법.
13. 제9항에 있어서, 소변 샘플을 수집하기 전에 사람에게 전립선 마사지가 약 20초 동안 실시되는 검출방법.
14. 비정상 DRE 환자로부터 소변 샘플을 수득하는 단계, 이 소변 샘플에 존재하는 GSTP1 유전자, RARβ1 및 APC 유전자와 1 이상의 대조군만의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 소정 값을 초과하는 메틸화는 전립선암을 나타내고, 상기 소정 값을 초과하지 않는 메틸화는 전립선암 부재를 나타내며, 방법의 수행 동안에 개방되지 않는 상태로 유지되는 단일 용기 내에서 수행되는, 전립선암의 검출방법.
15. 제14항에 있어서, 참조 마커의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 검출방법.
16. 제14항에 있어서, 사람의 PSA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 사람에 대해서만 수행되는 검출방법.
17. 제14항에 있어서, 유전자의 메틸화 상태가, 제1 PCR 단계에 이어 후속 PCR 단계가 수행되는 네스티드 PCR에 의해 측정되며, 여기서 후속 PCR을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브는 제1 PCR 단계에서 증폭된 서열 내의 서열에 대해 지시된 것이며, 소변 샘플은 제1 PCR 단계를 수행하기 전에 침전물로 회전 침강된 것인 검출 방법.
18. 제14항에 있어서, 소변 샘플을 수집하기 전에 사람에게 전립선 마사지가 약 20초 동안 실시되는 검출방법.
19. 비정상 DRE 환자로부터 소변 샘플을 수득하는 단계, 이 소변 샘플에 존재하는 GSTP1 유전자 및 RARβ1과 1 이상의 대조군만의 메틸화 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 소정 값을 초과하는 메틸화는 전립선암을 나타내고, 상기 소정 값을 초과하지 않는 메틸화는 전립선암 부재를 나타내며, 방법의 수행 동안에 개방되지 않는 상태로 유지되는 단일 용기 내에서 수행되는, 전립선암의 검출방법.
20. 제19항에 있어서, 참조 마커의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 검출방법.
21. 제19항에 있어서, 사람의 PSA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하고, PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 사람에 대해서만 수행되는 검출방법.
22. 제19항에 있어서, 유전자의 메틸화 상태가, 제1 PCR 단계에 이어 후속 PCR 단계가 수행되는 네스티드 PCR에 의해 측정되며, 여기서 후속 PCR을 수행하기 위한 프라이머 및 프로브는 제1 PCR 단계에서 증폭된 서열 내의 서열에 대해 지시된 것 이며, 소변 샘플은 제1 PCR 단계를 수행하기 전에 침전물로 회전 침강된 것인 검출방법.
23. 제19항에 있어서, 소변 샘플을 수집하기 전에 사람에게 전립선 마사지가 약 20초 동안 실시되는 검출방법.
24. GSTP1 및 1 이상의 대조군 유전자로 필수적으로 이루어진 유전자의 존재를 검출하기 위한 핵산 증폭 및 검출 시약, 및 측정된 PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 환자에게 사용할 것을 지도하는 지침서를 포함하는, 전립선암을 검출하는 분석을 수행하기 위한 키트.
25. GSTP1, RARβ1 및 1 이상의 대조군 유전자로 필수적으로 이루어진 유전자의 존재를 검출하기 위한 핵산 증폭 및 검출 시약, 및 측정된 PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 환자에게 사용할 것을 지도하는 지침서를 포함하는, 전립선암을 검출하는 분석을 수행하기 위한 키트.
26. GSTP, RARβ1, APC 및 1 이상의 대조군 유전자로 필수적으로 이루어진 유전자의 존재를 검출하기 위한 핵산 증폭 및 검출 시약, 및 측정된 PSA 수준이 2.5 내지 4ng/ml인 환자에게 사용할 것을 지도하는 지침서를 포함하는, 전립선암을 검출하는 분석을 수행하기 위한 키트.
27. S100A2 유전자, 및 GSTP, RARβ1 및 APC로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1 이상의 유전자 및 1 이상의 대조군 유전자의 존재를 검출하기 위한 핵산 증폭 및 검출 시약을 포함하는, 전립선암을 검출하는 분석을 수행하기 위한 키트.