CN101220392B

CN101220392B - 前列腺癌鉴定

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Publication number: CN101220392B
Application number: CN200710306175.5A
Authority: CN
Inventors: H·王; S·瓦德; D·乔达里; J·梅罗特拉; T·维纳; A·马祖姆达
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2007-10-31
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2027-10-31
Also published as: CN101220392A; JP2008206511A; CA2610104A1; KR20080039325A; IL186980A0; MX2007013727A; EP1918710A1

Abstract

本发明涉及前列腺癌鉴定。本发明一方面提供了一种预测前列腺癌的复发或侵袭性的方法，所述方法包括：a)测定前列腺样品的Gleason分值，和b)确定具有的Gleason分值为7或更大的那些患者的生物样品中的Marker的甲基化状态；其中，超过预定值的甲基化表示侵袭型癌症或复发型癌症，而未超过该预定值的甲基化表示温和型癌症。本发明另一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于进行分析以预测前列腺癌的病程或侵袭性，该试剂盒包括：核酸扩增和检测试剂，和指导所述试剂在所引证的Gleason分值为7或更大的患者中的应用的说明书。

Description

前列腺癌鉴定

技术领域

本发明涉及对与其它诊断方法及供这些方法使用的试剂盒相一致的甲基化基因的检查。

背景技术

在高等真核细胞中，DNA仅在CpG二核苷酸中的相对于鸟嘌呤的5′胞嘧啶处甲基化。这一修饰在基因表达上具有重要的调节效果，特别是当它涉及位于基因启动子区域的富含CpG的区域(CpG岛)时。正常的非甲基化CpG岛的异常甲基化是永生化细胞和转化的细胞中的常见事件，并与特定肿瘤抑制基因或其他与特定人体癌症的好转有关的基因的转录失活相联系。

谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)是示例性的蛋白质，其中表达它们的基因的甲基化状态对前列腺癌有重要的预后和诊断价值。所述蛋白质通过使具有化学活性的亲电子试剂和谷胱甘肽结合来催化细胞内解毒反应，包括使亲电子性的致癌物质失活(C.B.Pickett，et al.，Annu.Rev.Blocbern.，58：743，1989；B.Coles，et al.，CRC Crit.Rev.Biochem. Mol.Biol.，25：47，1990；T.H.Rushmore，et al.，J.Biol.Chem.268：11475，1993)。由在不同基因座的几个不同基因编码的人类GSTs已被分为四个不同的家族，称作α、μ、π和θ(B.Mannervik，et al.，Biochem.J.，282：305，1992)。由外遗传改变导致的GSTP1表达的降低常与前列腺癌与肝癌有关。

用于确定前列腺癌患者的预后的常用体系是Gleason评分体系。Gleason评分体系基于病理学家解释来自患者前列腺的活组织检查样本时所评价的微观肿瘤的模式。Kattan及其他人也已经开发了诺模图(Nomograms)，其中，预后包括Gleason分值和许多其它因子。

当前列腺的活组织检查样品中存在前列腺癌时进行Gleason分值评定。Gleason分值基于正常腺体组织结构(即，形状、大小和腺体分化度)的缺失程度，正如最早由Dr.Donald Gleason描述并研发的。参见Gleason DP、MellingerGT和Veterans Administration Coorperative Urological Research Group：Prediction of prognosis for prostatic adenocarcinoma by combined histologicgrading and clinical staging.J Urol 111：58 64，1974。经典的Gleason评分图显示了5种称作肿瘤“级”的基本组织模式。该由癌症引起的正常腺体结构缺失的主观的微观检测，理论上由数值范围从1至5的级表示，5是可能的最差级。Gleason分值(GS)和Gleason总和是一回事。然而，“Gleason分级”和“Gleason分值”(也称为Gleason总和)是不同的。Gleason分值是一级(primary grade)(代表肿瘤的多数)和二级(代表肿瘤的少数)之和，且数值范围从2到10。在目前的应用中，广泛认为Gleason分值越高，肿瘤的侵袭性可能越强，患者的预后越差。尽管有用，但Gleason分值与癌症预后并非直接相关。首先，Gleason分值为7或更大的样品代表异质性癌症组，且该异质性可能使可预见性降低。对显示出的Gleason分值为7或更大的癌症再进行分级十分重要，因为提供给患者的治疗的性质由此决定。

关于不涉及活组织检查样品的诊断和预后，众所周知的是前列腺特异性抗原(“PSA”)是前列腺癌的标准“标记”。该标记的使用有助于诊断应用但不是决定性的，且该标记作为预后的用途很小。用于改善诸如PSA等公知标记的使用的新技术也是有益的。

本发明满足了这些需要。

发明内容

在本发明的一个方面中，提供一种用于在患者中表征前列腺癌的方法，所述方法包括测定患者的Gleason分值，并且在患者的Gleason分值为7或更大时检测其外遗传改变(epigenetic change)，如基因的甲基化。如果外遗传改变的程度或数量超过了预定值则癌症表征为侵袭型(aggressive)，反之则表征为温和型(indolent)。患者的治疗方式始终与前列腺癌为侵袭型或温和型的那些患者相一致。

在本发明的一个方面中，检测来自下列组的一种或多种基因的甲基化：GSTP1、APC、RASSF1A、15-LO-1和CDH1。优选地，GSTP1启动子的甲基化状态在血液、血液组分、尿、尿道冲洗物、精液或组织样品中进行检测。最优选地，所述样品是组织样品。

在本发明的另一个方面中，获得前列腺癌患者的Gleason分值。如果患者被评定为具有的Gleason分值为7或更大，则由该患者采集另一个生物样品，或对得出Gleason分值的样品进行进一步的分析。怀疑具有甲基化目标序列的核酸样品由一个或全部两个生物样品获得，该样品用可以启动(prime)核酸靶的一部分的试剂处理，核酸靶被启动，将来自样品的已扩增靶的甲基化程度与已知的正常样品的甲基化程度或由已知的正常样品得到的预定值相比较。在本发明的又一个方面中，不大可能被甲基化的序列也被扩增并检测，以与扩增了的被甲基化的序列相比较。

在本发明的另一个方面中，甲基化状态由实时定量PCR确定。

在本发明的又一个方面中，提供一种表征前列腺状况的方法，所述方法包括利用诸如标准PSA分析等筛查分析首先对患者进行测试的步骤。对那些标记浓度不指示可能为癌性的状况但是高于正常水平的患者要进行前列腺癌标记例如GSTP1、APC、RASSF1A、15-LO-1、或CDH1的甲基化测试。那些甲基化水平超过预定水平的患者要进行活组织检查。在本方法的一个优选方面中，对PSA水平高于或等于2.5ng/ml的患者进行甲基化分析。作为选择，甲基化分析也可用于PSA为2-4的患者。

在又一个方面中，本发明是用于检测甲基化核酸的试剂盒。所述试剂盒包括一个或多个容器；第一个容器含有用于修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂，第二个容器含有用于启动含CpG的核酸扩增的试剂，其中，所述试剂能区分修饰的甲基化核酸和未甲基化的核酸。所述试剂盒包括指导对患者进行分析的说明书，所述患者的前列腺样品被评定为具有的Gleason分值为7或更大。在另一个实施方式中，所述说明书规定：所述分析对其样品被评定为具有的Gleason分值为7或更大的患者进行。

具体实施方式

确定由切除术或活组织检查(biopsy)得到的前列腺组织样品的Gleason分值。通常分析两个异常组织模式的样品并将其各自的分值相加。用于取样和分配Gleason分值的方法现在是公知的，并得到广泛实施。

在本发明的一些方法中，确定前列腺癌患者、正在治疗前列腺癌的患者、或可能患有前列腺癌的个体的Gleason分值。如果Gleason分值为7或更大，则对患者进行测试以确定核酸的甲基化状态，所述核酸与其甲基化状态与前列腺癌的侵袭性或进展相关的基因相对应。在本发明的试剂盒中，提供说明书以便确定指明其Gleason分值为7或更大的患者的甲基化状态。在本发明的其他试剂盒中，提供说明书以便确定指明其Gleason分值高于7的患者的甲基化状态。

当某基因的甲基化状态提供关于前列腺癌的信息时，核酸对应于其甲基化状态与前列腺癌的相关的该基因，所述序列是该基因的编码段或其补体、该基因的典型段或其补体、该基因的启动子或调控序列或其补体、表示该基因存在的序列或其补体、或该基因的全长序列或其补体。这样的核酸在本说明书中称为Markers。Marker相应下列基因：GSTP1(Seq.ID No.59)、RASSF1A(Seq.ID No.69)、APC(启动子＝Seq.ID No.64，基因＝Seq.ID No.65)、15-LO-1(Seq.ID No.56)和CDH1(Seq.ID No.57)。其它所关注的序列包括可用作分析对照的组成型基因，例如β-肌动蛋白(Seq.ID No.60和61)和PTGS2(启动子＝Seq.ID No.66，基因＝Seq.ID No.67)。

检测超甲基化的试验包括诸如MSP和限制性内切核酸酶分析等技术。启动区域是用于检测这样的超甲基化分析的特别显著的目标。GSTP1的启动子区域的序列分析显示将近72％的核苷酸是CG，约10％是CpG双核苷酸。

本发明包括测定受试者的组织或其他生物学样品中的Markers的特定区域的甲基化状态，其中，与前列腺癌相关的DNA被放大和检测。因为Marker相关(即，较少被转录)基因的蛋白编码的水平缩减通常是由于特定区域如启动子的超甲基化所致，所以希望判断所述区域是否被超甲基化。这在GSTP1基因的情况中是最有可能被论证的。超甲基化区域是与正常组织相比在疾病组织的样品中被甲基化到统计学非常显著程度的区域。

对于本发明来说，对特定Marker区具有特异性的核酸探针或报道试剂用于检测在生物流体或包括前列腺组织的组织、尿、尿道冲洗物、血液、血液成分如血清、精液和其它可能预期有前列腺蛋白的样品中的Marker基因的甲基化区域的存在。基于Marker序列的特定部位的寡聚核苷酸引物对通过使用诸如PCR等技术扩增DNA特别有用。任何含有可检测量的相关聚核苷酸的样本均可使用。对于检测甲基化状态来说，尿和前列腺组织是优选样品。优选地，所述样品含有上皮细胞。

本发明的引物探针或报道试剂中的一些用于检测Marker基因的表达控制序列的甲基化。这些是调节核酸序列的转录的核酸序列，并在一些情况中翻译核酸序列。因此，表达控制序列可以包括与启动子、增强子、转录终止子、起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持正确的许可mRNA恰当翻译的读码框和终止密码子有关的序列。

GSTP1启动子是有用的Marker的示例性表达控制序列。它是能够引导基因转录以生成谷胱甘肽-硫-转移酶蛋白质的聚核苷酸序列。启动子区域位于上游，或相对于结构基因的5′端。它可以包括充足的构成要素(element)，其致使启动子依赖的基因表达对于细胞型-特异性、组织-特异性是可控的，或可通过外来信号或药剂诱导；这样的构成要素可位于聚核苷酸序列的5′或3′区。

本发明的一个方法包括使包含Marker的靶细胞和与核酸结合的试剂接触。所述靶细胞组分是例如DNA或RNA等核酸。所述试剂可以包括探针和引物，例如PCR或MSP引物，或其他经设置以扩增并检测目标序列的分子。例如，所述试剂可以包括化合或键合至其自身的报道基因部分的启动序列，例如在Whitcombe等的美国专利6,326,145和6,270,967中描述的，称为Scorpion试剂或Scorpion报道基因的那些启动序列(在此通过引用的方式而全部引入)。尽管它们并不相同，但术语“引物”和“启动序列”在本说明书中可用于指启动核酸序列的扩增的分子或分子段。

检测甲基化样品的一个灵敏的方法包括联合使用甲基化敏感的酶和聚合酶链式反应(PCR)。在使用酶消化DNA后，只有当DNA裂解被甲基化阻止时才通过限制性酶切位点侧翼的引物来进行PCR扩增。针对其设计本发明的PCR引物的示例性靶区域包括侧切位于根据基因配置号M24485(Genbank)距GSTP1转录启动位点约-71～+59bp之间的区域的引物。

本发明的方法还可以包括使含有核酸的样本与修饰非甲基化的胞嘧啶的试剂接触；使用CpG特异的寡核苷酸引物扩增样品中包含CpG的核酸；以及检测甲基化的核酸。优选的修饰是把非甲基化的胞嘧啶转换成另一个核苷，从而将非甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，将非甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，然而，也可以使用其他的修饰非甲基化的胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶的试剂。最优选亚硫酸氢钠(NaHSO₃)修饰，其易于与胞嘧啶的5，6-双键发生反应，但与甲基化胞嘧啶的反应较差。胞嘧啶与亚硫酸氢盐离子反应以形成对脱氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反应中间体，从而产生磺化尿嘧啶。磺酸盐(酯)基团可以在碱性条件除去，结果形成尿嘧啶。尿嘧啶通过Taq聚合酶被识别为胸腺嘧啶，因此进行PCR时，最终产品仅在初始模板中出现5-甲基胞嘧啶的位置处包含胞嘧啶。Scorpion报道基因和试剂以及其他的检测系统按照这种方式类似地将经修饰的样本与未经修饰的样本区分开来。

本发明中用于扩增样本中包含CpG的核酸的引物在修饰(例如使用亚硫酸氢盐)后，能够明确区分味处理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特异的PCR(MSPCR)中，用于非甲基化DNA的引物或启动序列优选在3′CG对具有T，从而将其与甲基化的DNA中保留的C相区别，补体被设计为反义引物。用于非甲基化DNA的MSP引物或启动序列(priming sequence)通常在序列中包含相对很少的Cs或Gs，因为Cs将在正义引物中缺失，而Gs在反义引物中缺失(C被修饰为U(尿嘧啶)，其在扩增产物中被扩增为T(胸腺嘧啶核苷))。

本发明的引物是具有足够长度和适当序列的寡核苷酸，从而提供在多态性位点(polymorphic locus)的对于大量核酸的特异的聚合启动。当暴露于适当的探针或报道基因时，被扩增的序列显示出甲基化状态，由此显示诊断信息。

优选的引物由八个或八个以上能够引发引物延伸产物(合成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成，其实质上是对多态性位点的补充。有助于合成的环境条件包括三磷酸核苷和聚合用试剂，例如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和pH。所述引物的启动部分或启动序列优选是具有最大扩增效率的单链，不过也可以是双链的。如果为双链，则所述引物在用于制备延伸产物前首先被处理以分离其链。所述引物必须足够长以在存在聚合用诱导试剂时启动延伸产物的合成。引物的精确长度取决于诸如温度、缓冲剂和核苷组成等因素。寡核苷酸引物最优选包含约12～20个核苷，尽管它们可以包含更多或更少的核苷，优选按照公知的设计方针或规则。

引物经设计以充分补充将被扩增的基因座的每个链，并包含如上所述的适当的G或C核苷。这意味着所述引物必须充分互补从而在允许使用聚合用试剂的条件下与其各自的链杂交。换言之，所述引物应当充分补充5′和3′侧切序列(s)，以进行杂交和容许基因座扩增。

在扩增过程中使用引物。也就是说，相对于反应步骤的数目来说反应(优选酶链式反应)产生非常大量的靶基因座。在最优的实施方式中，所述反应按指数规律产生大量的靶基因座。象这样的反应包括PCR反应。通常，一个引物补充基因座的负(-)链，而另一个补充正(+)链。核酸变性后使引物退火然后使用酶(例如DNA聚合酶I(Klenow)的大片段和核苷)进行扩增，结果得到新合成的包含+链和-链的靶基因座序列。链式反应的产物是不连续的核酸双链体，其末端相当于使用的特异引物的末端。

所述引物可以通过使用任何适当的方法制备，例如包括自动化方法的常规的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一个这样的自动化的实施方式中，二乙基亚磷酰胺单体用作起始材料，并可以使用Beaucage等描述的方法合成(Tetrahedron Letters，22：1859-1862，1981)。美国专利号4,458,066中描述了用于在经修饰的载体上合成寡核苷酸的方法。

任何核酸样本(以纯化或非纯化的形式)均可用作本发明的起始核酸，只要其包含，或猜想其包含具有靶基因座(例如CpG)的特定的核酸序列。因此，所述方法可以使用例如，DNA或RNA，包括信使RNA。所述DNA或RNA可以是单链的，也可以是双链的。在RNA用作模板的事件中，可以使用将模板逆转录为DNA的最佳的酶和/或条件。另外，可以使用包含其中各自的一个链的DNA-RNA杂交体。还可以使用核酸的混合物，或者也可以使用通过利用相同或不同的引物在本文中前述的扩增反应中生产核酸。将被扩增的特定的核酸序列，即靶基因座，可能是大分子的一部分，或在开始时显现为不连续的分子从而使特定序列构成全部核酸。

用来检测甲基化的CpG的含有核酸的样本可以是组织(尤其是前列腺组织和淋巴组织)、血液或血液组分、淋巴、尿、尿道冲洗物、精液或其他生物样品，并且可以通过各种技术，如Maniatis等描述的(分子克隆：实验手册，冷泉港，N.Y.，pp 280，281，1982)技术提取。

如果提取的样品不纯，则它可以在扩增之前使用一定量的试剂进行处理，所述试剂能够有效地打开样品的细胞、液体、组织或动物细胞膜，并能够暴露和/或分离核酸的链。用于暴露并分离链的该溶胞和核酸变性步骤将允许扩增更容易地进行。

样品的靶核酸序列包含两个链时，其用作模板之前必须分离核酸的链。链分离可以作为单独的步骤实施，也可以与引物延伸产物的合成同时进行。这样的链分离可以通过使用各种适当的变形条件，包括物理的、化学的或酶的方法完成。一种分离核酸链的物理方法包括加热核酸直至其变性。典型的热变性包括在约80℃～105℃的温度范围内加热不少于10分钟。链的分离也可以通过来自归类为被称作解螺旋酶的酶属的酶或酶RecA诱导，所述酶RecA具有解螺旋酶活性，并在存在riboATP时已知能够使DNA变性。适于通过使用解螺旋酶分离核酸链的反应条件由Kuhn Hoffmann-Berling描述(CSH-Quantitative Biology，43:63，1978)。在C.Radding中对使用RecA的技术进行了评述(Ann.Rev.Genetics，16：405-437，1982)。这些技术的细节现在也是众所周知的。

当核酸的互补链被分离时，不管核酸原来是单链还是双链，分离的链将可以用作合成其他核酸链的模板。该合成在允许引物杂交到模板的条件下进行。合成通常发生在水性缓冲溶液中，优选地pH值为7-9，最优选约8。具有多余摩尔量(对于基因核酸，通常为引物∶模板约10⁸∶1)的两种寡核苷酸引物优选被添加到包含分离的模板链的缓冲液中。如果本发明的方法用于诊断应用，则互补链的量可以不知道，因此相对于互补链的量的引物的量不一定能准确地确定。然而，当将被扩增的序列包含在复杂的长链核酸链的混合物中时，引物的实际添加量通常与互补链(模板)的数量相比过量(摩尔量)。优选使用过量较多的摩尔量以改善所述方法的效率。

将足够量的脱氧核糖核苷三磷酸盐dATP、dCTP、dGTP和dTTP单独地或与引物一起添加至合成混合物，所得溶液加热到大约90℃～100℃不少于10分钟，优选1到4分钟。在该加热阶段后，使溶液冷却至室温，这对于引物杂交是优选的。向冷却的混合物中加入用于产生引物延伸产物的适宜试剂(“聚合用试剂”)，并使反应在本领域公知的条件下发生。聚合用试剂也可以与其他试剂一同加入，只要聚合用试剂具有热稳定性即可。该合成(或扩增)反应可以在室温至聚合用试剂不再起作用的温度下进行。

聚合用试剂可以是任何能用于完成引物延伸产物的合成的化合物或系统，优选酶。用于该目的的适宜的酶包括，例如，E.coil DNA聚合酶I、E.coil DNA聚合酶1的克列诺片段、T4 DNA聚合酶、其他的可利用的DNA聚合酶、聚合酶突变体、反转录酶、和其他酶，包括热稳定的酶(例如，经受充分升高直至导致变性的温度后进行引物延伸的那些酶)。优选试剂是Taq聚合酶。适宜的酶将通过适当的方式促进核苷的结合，从而形成与各基因座核酸链互补的引物延伸产物。通常，合成将在各引物的3′端开始，并沿模板链在5′方向进行，直到合成结束，以得到不同长度的分子。然而，也可以使用这样的聚合用试剂：利用与上述方法相同的方法，合成在5′端开始，并沿另一个方向进行。

最优选地，扩增方法利用PCR。也可以采用替代性的扩增方法，只要使用本发明的引物、通过PCR扩增的甲基化和非甲基化的基因座能够通过所述替代性手段被相似扩增即可。

扩增产物使用产物特异性的探针或报道基因被优选鉴别为甲基化或非甲基化，如授予Mullis等的美国专利4,683,195所描述的，此处通过引用而全部引入。用于检测多核苷酸的探针和报道基因的领域的进展为本领域的技术人员所熟知。可选地，核酸的甲基化模式可以通过其他技术确认，例如限制性内切酶酶解和DNA印迹分析。可用于检测5′CpG甲基化的甲基化敏感的限制性核酸内切酶的例子包括SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、BstUI和BssHII。

在本发明的另一个方面中，使用甲基化率。通过确定所得到的Marker的放大的甲基化种类的数量与放大的参考标记物或放大的非甲基化Marker区域的数量之间的比例可以得到甲基化率。当PCR是实时定量PCR时其提供最多信息。比率超过确定的或预定的临界值(cutoff value)或阈值时被认为是超甲基化的，并表示具有增殖失调如癌症(在GSTP1的情况中为前列腺癌)。临界值按照已知的方法确定，其中所述方法用于至少两组样品：具有已知疾病状况的样品和具有已知的正常状况的样品。本发明的参考Markers还可以用作内部控制。所述参考Marker优选是在样品细胞中以组成型表达的基因，如Beta Actin。

已确定的或预定的数值(临界值或阈值)也可以在不使用比率的本发明的方法中被确定并使用。在这种情况下，临界值由相对于某些基准值，例如正常样品或临床无意义的肿瘤样品(已知不会发展为临床相应的状态或是非侵袭性的)中的甲基化的数量或程度的甲基化的数量或程度来建立。这些临界值按照公知的方法建立，正如其应用于基于甲基化率方法中的情况一样。

本发明的方法和试剂盒可包括用于多路复用(multiplexing)的步骤和试剂。也就是说，一个以上的Marker可以同时被测定。

由于与Marker有关的基因转录水平的降低常常是聚核苷酸序列和/或表达控制序列(例如，启动子序列)的特殊元素超甲基化的结果，因此制备匹配这些序列的引物。因而，发明提供通过检测在Marker的表达控制或启动子区内的特殊区域的甲基化来检测或诊断细胞增殖性失调的方法。用于检测这些区域的甲基化的探针可用于这样的诊断或预后方法。用于检测Markers的优选分子如下所示。Marker基因的简称连同使用的检测系统的类型写显示在括号中。反义仅指引物的方向，所述引物经指定而相关于与其联合的该对的另一成员的启动序列。不必相对于基因DNA反义。

Seq.ID No.1(GSTP1蝎)：

CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT

Seq.ID No.2(GSTP1蝎反义引物)：

AAAATCCCGCGAACTCCCGCC

Seq.ID No.3(GSTP1蝎)：

CCCGAACGTCGACCGCTTTCGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT

Seq.ID No.4(GSTP1蝎反义引物)：

AAAATCCCGCGAACTCCCGCC

Seq.ID No.5(GSTP1蝎)：

CGGCGGGAGTTCGCGGGCGCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC

Seq.ID No.6(GSTP1蝎反义引物)：

CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC

Seq.ID No.7(GSTP1蝎)：

CGGGAGTTCGCGGGTCCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC

Seq.ID No.8(GSTP1蝎反义引物)：

CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC

Seq.ID No.9(GSTP1蝎)：

GTGGTTGATGTTTGGGGTATCAACCAC-BHQ-HEG_AATCCCACAAACTCCCACCAACC

Seq.ID No.10(GSTP1蝎反义引物)：

GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT

Seq.ID No.11(GSTP1蝎)：

ACCCCAGTGGTTGATGTTTGGGGT-BHQ-HEG-AATCCCACAAACTCCCACCAACC

Seq.ID No.12(GSTP1蝎反义引物)：

GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT

Seq.ID No.13(GSTP1蝎)：

CCCCACAGGTTGGTGGGAGTTTGTGGGG-BHQ-HEG-

CCCAATACTAAATCACAACACCAACCAC

Seq.ID No.14(GSTP1蝎反义引物)：

TGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGA

Seq.ID No.15(GSTP1蝎)：

CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT

Seq.ID No.16(GSTP1蝎反义引物)：

AAAATCCCGCGAACTCCCGCC

Seq.ID No.17(GSTP1蝎)：

CGCACGCCGAACGTCGACCGCAAACGTGCG-BHQ-HEG-

CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT

Seq.ID No.18(GSTP1蝎反义引物)；

AAAATCCCGCGAACTCCCGCC

Seq.ID No.19(GSTP1蝎)：

CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCG BHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTG

Seq.ID No.20(GSTP1蝎反义引物)：

GCCCCAATACTAAATCACGACG

Seq.ID No.21(GSTP1蝎)：

CCGACGCACAAAAAAACACCCTAAAATCCGTCGG-BHQ-HEG-

GGTTAGTTGTGTGGTGATTTT

Seq.ID No.22(GSTP1蝎反义引物)：

CACAACACCAACCACTCTTC

Seq.ID No.23(GSTP1 TAQMAN引物)：

CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC

Seq.ID No.24(GSTP1 TAQMAN引物)：

ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA

Seq.ID No.25(GSTP1 TAQMAN探针)：

TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA

Seq.ID No.26(GSTP1蝎)：

CGGCCCTAAAACCGCTACGAGGGCCG-BHQ-HEG-GAAGCGGGTGTGTAAGTTTCGG

Seq.ID No.27(GSTP1蝎反义引物)：

ACGAAATATACGCAACGAACTAACGC

Seq.ID No.28(GSTP1蝎)

CCGGTCGCGAGGTTTTCGACCGG-BHQ-HEG-CCGAAAAACGAACCGCGCGTA

Seq.ID No.29(GSTP1蝎反义引物)：

GGGCGGGATTATTTTTATAAGGTTCGG

Seq.ID No.30(RASSF1A蝎)：

GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG

Seq.ID No.31(RASSP1A蝎反义引物)：

GCGTTGAAGTCGGGGTTC

Seq.ID No.32(RARB2蝎)

CGGCGCCCGACGATACCCAAAGCGCCG-BHQ-HEG-AACGCGAGCGATTCGAGTAG

Seq.ID No.33(RARB2蝎反义引物)：

CTTACAAAAAACCTTCCGAATACG

Seq.ID No.34(APC蝎)：

GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCA

Seq.ID No.35(APC蝎反义引物)：

GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG

Seq.ID No.36(肌动蛋白蝎)：

GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACG

Seq.ID No.37(肌动蛋白蝎反义引物)：

CGACCCGCACTCCGCAAT

Seq.ID No.38(肌动蛋白蝎)：

CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGG-BHQ-HEG-GGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTG

Seq.ID No.39(肌动蛋白蝎反义引物)：

AACACACAATAACAAACACAAATTCAC

Seq.ID No.40(肌动蛋白蝎)：

CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTGTGGTT

Seq.ID No.41(肌动蛋白蝎反义引物)：

CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACC

Seq.ID No.42(肌动蛋白蝎)：

CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGTTTTT

Seq.ID No.43(肌动蛋白蝎反义引物)：

ACATACAACAATCAATAACATAAAACCAC

Seq.ID No.44(PTGS2/COX2蝎)：

CACGCCGCCGTATCTAGGCGTG-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA

Seq.ID No.45(PTGS2/COX2反义引物)：

GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC

Seq.ID No.46(PTGS2/COX2蝎)：

GCCGCGCACAAATTTCCGCGGC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG

Seq.ID No.47(PTGS2/COX2反义引物)：

CCCGAATTCCACCGCC

Seq.ID No.48(PTGS2/COX2蝎)：

GGCGGAACGCACAAATTTCCGCC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG

Seq.ID No.49(PTGS2/COX2反义引物)：

CCCGAATTCCACCGCC

Seq.ID No.50(PTGS2/COX2蝎)：

TGCCGCCGCCGTATCTAATGGCGGCA-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA

Seq.ID No.51(PTGS2/COX2反义引物)：

GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC

Seq.ID No.52(CDH1蝎)：

CGCCGAATACGATCGGCG-BHQ-HEG-GTTCGTTTTAGTTCGGTTCGA

Seq.ID No.53(CDH1蝎反义引物)：

ACCGAAAACGCCGAACGA

Seq.ID No.54(15LO1蝎)：

GGCGGCGTTCGGGCCGCC-HEG-BHQ-CCGTACGAACCACAATCGC

Seq.ID No.55(15LO1蝎反义引物)：

GGGGTTTCGTTTTATGTCGGT

BHQ＝Black Hale Quencher(BioSearch Technologies，San Fransisco，CA)

HEG＝六乙二醇

本发明的试剂盒可以配置有各种构成元件，只要它们都包含至少一个引物或探针或检测分子(例如Scorpion报道基因)即可。在一个实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增和检查超甲基化Marker片段的试剂。可选地，所述试剂盒包括样品制备试剂和/或从样品中提取核酸的制品(例如，管)。

在优选的试剂盒中，包括单管(one-tube)MSP所必需的试剂，例如，相应的PCR引物组、热稳定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)和适当的检测试剂，如水解探针或分子信标。在可选的优选试剂盒中，检测试剂是Scorpion报道基因或试剂。还可以使用对双链DNA特异的单独的染色引物或荧光染料，如溴化乙锭。引物优选是能产生高浓度的量。试剂盒中的其他材料可包括：适宜的反应管或瓶、隔离成分，通常为蜡球(wax bead)，可选的包括镁；必需的缓冲液和试剂如dNTP；对照核酸和/或任何可用于MSP反应的另外的缓冲剂、化合物、辅因子、离子组分、蛋白质和酶、聚合物等。可选地，所述试剂盒包括核酸提取试剂和材料。

在本发明最优选的试剂盒中，提供说明书，从而指导对其前列腺样品被评定为具有的Gleason分值为7或更大的患者进行的分析。在本发明的另一个试剂盒中，说明书用于指导其样品被评定为具有的Gleason分值大于7的患者进行的分析。在本发明的另一个试剂盒中，提供说明书用于指导对具有的PSA水平大于2.5ng/ml的患者进行的分析，而在另一个试剂盒中，提供说明书用于指导对具有的PSA水平在2ng/ml～4ng/ml的患者进行的分析。所述说明书也可以表明应当对甲基化阳性结果进行活组织检查。

实施例

实施例1：甲基化测试和Gleason分值

前列腺样品从具有已知临床结果的患者获得。根据公知的方法确定样品的Gleason分值。根据这些样品可知，52个样品的Gleason分值小于7，36个样品的Gleason分值为7，12个样品的Gleason分值大于7。

使用GSTP1(Seq.ID No.19，20)和APC(Seq.ID No.34，35)对各组进行甲基化分析。

甲基化分析如下进行。使用商售的重亚硫酸钠转化试剂盒(Zymo Research，Orange，CA，USA)修饰基因组DNA。该处理将非甲基化DNA中的所有胞嘧啶转化为尿嘧啶，而在甲基化的DNA中仅有不在鸟嘌呤前面的胞嘧啶被转化为尿嘧啶。所有在鸟嘌呤前面的胞嘧啶(在CpG双核苷酸中)仍然是胞嘧啶。

重亚硫酸钠修饰的基因组DNA(100ng～150ng)在25μl的包含以下成分的反应液中扩增：67mM Tris pH 8.8、16.6mM(NH₄)₂SO₄、6.7mM MgCl₂、10mM β-巯基乙醇；dATP、dCTP、dGTP、dTFP各1.25mM、1U热启动Taq DNA聚合酶、250nM蝎探针、250nM反义或正义引物(根据蝎设计)、625nM中性参比染料。

样品然后在Cepheid SmartCycler

PCR设备上以实时定量PCR分析进行测试。所使用的PCR条件是：

95℃持续60秒；然后为95℃持续30秒、59℃持续30秒的40个循环，最后在72℃延伸5分钟。对于每个循环在59℃时收集光学数据。

对于GSTP1确定其甲基化率[(Marker的拷贝数#/B-肌动蛋白的拷贝数#)×1000]的临界值为1，对于APC确定其甲基化率的临界值为10。所述临界值基于临床相关的敏感度和特异性要求。结果显示在下列表中。

表1.GSTP1

Gleason分值	样品数量	甲基化	非甲基化	不确定	敏感度
						＜7	52	30	16	6	57.6
7	36	24	8	4	66.6
						＞7	12	11	1	0	91.6

表2.APC

Gleason分值	样品数量	甲基化	非甲基化	不确定	敏感度
						＜7	52	33	12	7	63.46
7	36	25	8	3	69.44
						＞7	12	11	1	0	91.6

这些结果显示甲基化分析提供了关于具有的Gleason分值高于7的患者的前列腺癌状态的准确信息。尤其结合其他诊断或预后信息时，对于具有的Gleason分值为7的患者也提供了的有用的和相对准确的信息。

在Gleason为6和7的人群中目前存在很大的两极差异(dichotomy)。大约一半的患者预后较差而半数预后良好。迄今为止，仍然没有方式确定哪些人将得益于更为积极的治疗而哪些人将不会由此受益。在Gleason分值＞7的癌症中，甲基化分析的敏感度越高，癌症的侵袭性通常越大，因而能够预测具有的甲基化分析结果高于临界值的患者由于癌症为侵袭型而具有较差的预后。上述甲基化数据预测Gleason为7的患者中的66％～69％将具有较差的预后且应当进行积极的治疗(aggressive treatment)，而剩下的三分之一可以采用观察等待。因此，在Gleason分值＞7的人群(预后差的人群)中甲基化分析的强烈的正相关显示出预后及诊断价值。

实施例2：血清分析

血清样品从具有已知的前列腺癌结果的患者和由其采集了活组织检查样品并引证Gleason分值的患者获得。在这些样品之中，55个样品来自未患癌症的患者，36个样品来自Gleason分值为5～6的患者，21个样品来自Gleason分值为7～8的患者。

甲基化状态按照实施例1的方法进行确定。

GSTP1 Marker能够正确检测在来自Gleason分值为7～8的患者的26％的样品中的甲基化，且没确检测到Gleason分值为5～6的患者或未患癌症的患者中的甲基化。APC Marker能够正确检测在来自Gleason分值为7～8的患者的26％的样品中的甲基化，在最多9个例子中它也检测出Gleason分值为5～6的患者或未患癌症的患者中的甲基化。两种Markers的组合特异性为84％，对于Gleason分值为5～6时的灵敏度为18％，对于Gleason分值为7～8时为38％。

然后将第3和第4种Markers，RASSF1a和RARb2加入用于检测甲基化的Markers组中，从而得到82％的特异性，以及对于Gleason分值为5～6时的灵敏度82％，对于Gleason分值为7～8时为58％。因而，添加其他的或不同的甲基化标记可用于提高需要进行的血清测试的灵敏度，并能够同时提高灵敏度和特异性要求。

附加Marker测验数据在下面显示并描述。

共有58个样品，包括34个前列腺腺癌(CaP)样品、24个前列腺良性(Neg)样品、6个HG-PIN(Neg)样品、2个萎缩(Neg)样品、4个非典型(Neg)样品和2个炎症(Neg样品)。3个样品缺失活组织检查检查报告且1个样品测试失败(无肌动蛋白hskg的Ct值)。使用GSTP1、RASSF1、RARB2、APC、CDH1和15-LO-1的Markers。

使用这些Markers准备用于msPCR分析的试剂，各试剂显示在表3中。

表3

试剂	量(ul)	最终浓度
			DNA(ul)	5.0	-
10xRoche缓冲液(不含MgCl)	2.5	1x
			Faststart Taq 5U/ul	0.2	0.04U
6.25uM探针-引物混合物	1	0.25uM
			25mM dNTPs	1.25	1.25mM
1mM Rox(1∶500稀释)	1	80nM
			MgCl₂(25mM)	6.7	6.7mM
总反应	25.0	-

0.15uM的最终探针-引物浓度用于3个GSTP1混合物。

用于Markers的引物/探针如下。

GSTP1：Seq.ID No.26/27；Seq.ID No.28/29；Seq.ID No.19/20

RASSF1：Seq.ID No.30/31

RARB2：Seq.ID No.32/33

APC：Seq.ID No.34/35

CDH1：Seq.ID No.52/53

15-LO-1：Seq.ID No.54/55

β-肌动蛋白：Seq.ID No.38/39

PCR条件显示在表4中。

表4

参数	时间	循环
			95C	5分钟	1
95C59C72C	30秒30秒30秒	55(Optics-on)
			72C	5分钟	1

表5显示了具有6种基因特异性标记和—种hkg的Ct值，且包括58个样品的Gleason分值和PAS的可用信息。

表5

空格-在QMSP的55个循环后未检测Ct。

灵敏度和特异性由表6中显示的Ct值直接测定。

表6

对6个或4个标记的Ct临界值设定	APC	GSTP1	Rass	RARb2	CDH1	15_LD
							灵敏度 55％特异性 82％	37	37	40	40	40	40
灵敏度 52％特异性 84％	37	37	40	40	未使用	未使用
							灵敏度 39％特异性 95％	36	37	39	40	未使用	未使用
灵敏度 37％特异性 97％	35	37	39	40	未使用	未使用

实施例3：尿分析

尿样由具有已知的前列腺癌结果的患者和由其采集了活组织检查样品并引证Gleason分值的患者获得。在这些样品之中，42个样品来自Gleason分值为4～6的患者，10个样品来自Gleason分值为7～9的患者。

甲基化状态按照实施例1的方法使用Cepheid的Smart Cycler PCR设备进行确定。

两个Markers，GSTP1和RARb2的组合特异性对于按摩后尿样为89％，对于活组织检查后的样品为91％。在Gleason分值低于7的样品中，对按摩后样品的甲基化分析的灵敏度为40％，而在分值高于7的那些样品中为78％。因此，非侵入性采样可与本发明的其它方面协同使用。

实施例4：血清分析与PSA结果(预测)

血清样品由具有已知的前列腺癌结果的患者获得。PSA浓度根据标准临床方法确定。在这些样品中，55个样品来自没有癌症的具有的PSA水平为1ng/ml～2ng/ml的患者，36个样品来自具有的PSA水平为2ng/ml～4ng/ml的患者，21个样品来自具有的PSA水平高于4的患者。患者的PSA水平高于4表明需要根据已经建立的临床指导方针进行活组织检查检查。

PSA水平低于4的患者的甲基化状态按照实施例1的方法确定。

GSTP1 Marker在来自PSA水平为2～4的患者的20％的样品中检测到甲基化在。这些患者经过活组织检查检查发观具有的Gleason分值为7或更大。有可能表明这些患者需要进一步治疗。在任何来自PSA水平小于2的患者的样品中未发现超甲基化。APC、RASSF1A、15-LO-1和CDH1 Markers用于这些患者的分离的甲基化分析，有15％的样品被发现为超甲基化。这些患者经过活组织检查检查发现具有的Gleason分值为7或更大。有可能表明这些患者需要进一步治疗。在PSA水平低于4的患者中两种Markers的组合特异性为95％，灵敏度为85％。

根据甲基化分析的结果对具有的PSA分值不能确定是否需要进行活组织检查检查的患者分级。通常这在治疗的观察等待阶段或监测策略中特别有用。利用诸如PSA测试等非活组织检查检查分析对患者进行周期性测试，并且当显示活组织检查检查的结果模棱两可或难以解释时测试前列腺Markers的DNA甲基化状态。甲基化结果大于预定的临界值表明必须进行活组织检查检查，Gleason分值为7或更大有可能成为该活组织检查检查的至少一个结果。

序列表

<110>VENER，Tatiana

MEHROTRA，Jyoti

VARDE，Shobha

MAZUMDER，Abhijit

Wang，Haiying

Chowdary，Dondapati

<120>前列腺癌鉴定

<130>VDX5039USPSP

<140>99/999999

<141>2006-10-31

<160>69

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GSTP1蝎子

<220>

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<223>-BHQ-HEG-

<220>

<221>modified_base

<222>(23)..(23)

<223>-BHQ(Black Hole Quencher)-HEG(六乙基二醇)-

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ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46

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<213>人工

<220>

<223>GSTP1蝎子反义引物

<400>2

aaaatcccgc gaactcccgc c 21

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GSTP1蝎子

<220>

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<222>(23)..(23)

<223>-BHQ-HEG-

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cccgaacgtc gaccgctttc gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GSTP1蝎子反义引物

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aaaatcccgc gaactcccgc c 21

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<212>DNA

<213>人工

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<223>GSTP1蝎子

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<223>-BHQ-HEG-

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cggcgggagt tcgcgggcgc cgactaaatc acgacgccga ccgc 44

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<223>GSTP1蝎子

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cggttagttg cgcggcgatt tc 22

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<213>人工

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<223>GSTP1蝎子

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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<212>DNA

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<223>GSTP1蝎子

<220>

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accccagtgg ttgatgtttg gggtaatccc acaaactccc accaacc 47

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gtggtgattt tggggatttt agggtgt 27

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<223>GSTP1蝎子

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<223>-BHQ-HEG-

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ccccacaggt tggtgggagt ttgtggggcc caatactaaa tcacaacacc aaccac 56

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<223>-BHQ-HEG-

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ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46

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<223>GSTP1蝎子

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<223>-BHQ-HEG-

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cgcacgccga acgtcgaccg caaacgtgcg cgatttcggg gattttaggg cgt 53

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<212>DNA

<213>人工

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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aaaatcccgc gaactcccgc c 21

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<212>DNA

<213>人工

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<223>GSTP1蝎子

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<223>-BHQ-HEG-

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<213>人工

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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gccccaatac taaatcacga cg 22

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GSTP1蝎子

<220>

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<223>-BHQ-HEG-

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ccgacgcaca aaaaaacacc ctaaaatccg tcggggttag ttgtgtggtg atttt 55

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<211>20

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<213>人工

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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<223>GSTP1蝎子

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<223>-BHQ-HEG-

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cggccctaaa accgctacga gggccggaag cgggtgtgta agtttcgg 48

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<212>DNA

<213>人工

<220>

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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<223>GSTP1蝎子

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<223>GSTPI蝎子

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<222>(24)..(24)

<223>-BHQ-HEG-

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<213>人工

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<223>GSTP1蝎子

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<223>GSTP1蝎子反义引物

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<213>人工

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<223>RARB2蝎子

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<222>(27)..(27)

<223>-BHQ-HEG-

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cggcgcccga cgatacccaa agcgccgaac gcgagcgatt cgagtag 47

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>RARB2蝎子

<220>

<221>misc_feature

<223>RARB2蝎子反义引物

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<213>人工

<220>

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<222>(25)..(25)

<223>-BHQ-HEG-

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gccggcgggt tttcgacggg ccggccgaac caaaacgctc ccca 44

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<223>APC蝎子反义引物

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<213>人工

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<223>Actin蝎子

<220>

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<222>(22)..(22)

<223>-BHQ-HEG-

<400>36

gcgcccaacc gcacaagggc gcgggtatat tttcgagggg tacg 44

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子反义引物

<400>37

cgacccgcac tccgcaat 18

<210>38

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(27)..(27)

<223>-BHQ-HEG-

<400>38

ccgcgcatca ccaccccaca cgcgcgggga gtatataggt tggggaagtt tg 52

<210>39

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子反义引物

<400>39

aacacacaat aacaaacaca aattcac 27

<210>40

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(27)..(27)

<223>-BHQ-HEG-

<400>40

cccggctaaa cccaccatcc agccgggggg agggtagttt agttgtggtt 50

<210>41

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子反义引物

<400>41

caaaacaaaa aaactaaatc tacacaacc 29

<210>42

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(26)..(26)

<223>-BHQ-HEG-

<400>42

ccgcggaaca ttcaactcaa ccgcggggag gaggaaggta ggttttt 47

<210>43

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ACTIN蝎子反义引物

<400>43

acatacaaca atcaataaca taaaaccac 29

<210>44

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(22)..(22)

<223>-BHQ-HEG-

<400>44

cacgccgccg tatctaggcg tggtttgttt cgacgtgatt ttttcga 47

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2反义引物

<400>45

gcaaaaaatc ccctctcccg c 21

<210>46

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(22)..(22)

<223>-BHQ-HEG-

<400>46

gccgcgcaca aatttccgcg gcgaattggt tttcggaagc gttcg 45

<210>47

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2反义引物

<400>47

cccgaattcc accgcc 16

<210>48

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(23)..(23)

<223>-BHQ-HEG-

<400>48

ggcggaacgc acaaatttcc gccgaattgg ttttcggaag cgttcg 46

<210>49

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2反义引物

<400>49

cccgaattcc accgcc 16

<210>50

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(30)..(30)

<223>-BHQ-HEG-

<400>50

tgccgccgcc gtatctaatg gcggcagttt gtttcgacgt gattttttcg a 51

<210>51

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PTGS2/COX2反义引物

<220>

<221>misc_feature

<223>PTGS2/COX2反义引物

<400>51

gcaaaaaatc ccctctcccg c 21

<210>52

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>CDHI蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(19)..(19)

<223>-BHQ-HEG-

<400>52

cgccgaatac gatcggcggt tcgttttagt tcggttcga 39

<210>53

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>CDHI蝎子反义引物

<400>53

accgaaaacg ccgaacga 18

<210>54

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>15LO1蝎子

<220>

<221>modified_base

<222>(19)..(19)

<223>-HEG-BHQ-

<400>54

ggcggcgttc gggccgcccc gtacgaacca caatcgc 37

<210>55

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>15LO1蝎子反义引物

<400>55

ggggtttcgt tttatgtcgg t 21

<210>56

<211>2671

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>15L01 ＞gi|187190|gb|M23892.1|HUMLOX15A人15-脂氧合酶mRNA全序列

<400>56

aagatgggtc tctaccgcat ccgcgtgtcc actggggcct cgctctatgc cggttccaac 60

aaccaggtgc agctgtggct ggtcggccag cacggggagg cggcgctcgg gaagcgactg 120

tggcccgcac ggggcaagga gacagaactc aaggtggaag taccggagta tctggggccg 180

ctgctgtttg tgaaactgcg caaacggcac ctccttaagg acgacgcctg gttctgcaac 240

tggatctctg tgcagggccc cggagccggg gacgaggtca ggttcccttg ttaccgctgg 300

gtggagggca acggcgtcct gagcctgcct gaaggcaccg gccgcactgt gggcgaggac 360

cctcagggcc tgttccagaa acaccgggaa gaagagctgg aagagagaag gaagttgtac 420

cggtggggaa actggaagga cgggttaatt ctgaatatgg ctggggccaa actatatgac 480

ctccctgtgg atgagcgatt tctggaagac aagagagttg actttgaggt ttcgctggcc 540

aaggggctgg ccgacctcgc tatcaaagac tctctaaatg ttctgacttg ctggaaggat 600

ctagatgact tcaaccggat tttctggtgt ggtcagagca agctggctga gcgcgtgcgg 660

gactcctgga aggaagatgc cttatttggg taccagtttc ttaatggcgc caaccccgtg 720

gtgctgaggc gctctgctca ccttcctgct cgcctagtgt tccctccagg catggaggaa 780

ctgcaggccc agctggagaa ggagctggag ggaggcacac tgttcgaagc tgacttctcc 840

ctgctggatg ggatcaaggc caacgtcatt ctctgtagcc agcagcacct ggctgcccct 900

ctagtcatgc tgaaattgca gcctgatggg aaactcttgc ccatggtcat ccagctccag 960

ctgccccgca caggatcccc accacctccc cttttcttgc ctacggatcc cccaatggcc 1020

tggcttctgg ccaaatgctg ggtgcgcagc tctgacttcc agctccatga gctgcagtct 1080

catcttctga ggggacactt gatggctgag gtcattgttg tggccaccat gaggtgcctg 1140

ccgtcgatac atcctatctt caagcttata attccccacc tgcgatacac cctggaaatt 1200

aacgtccggg ccaggactgg gctggtctct gacatgggaa ttttcgacca gataatgagc 1260

actggtgggg gaggccacgt gcagctgctc aagcaagctg gagccttcct aacctacagc 1320

tccttctgtc cccctgatga cttggccgac cgggggctcc tgggagtgaa gtcttccttc 1380

tatgcccaag atgcgctgcg gctctgggaa atcatctatc ggtatgtgga aggaatcgtg 1440

agtctccact ataagacaga cgtggctgtg aaagacgacc cagagctgca gacctggtgt 1500

cgagagatca ctgaaatcgg gctgcaaggg gcccaggacc gagggtttcc tgtctcttta 1560

caggctcggg accaggtttg ccactttgtc accatgtgta tcttcacctg caccggccaa 1620

cacgcctctg tgcacctggg ccagctggac tggtactctt gggtgcctaa tgcaccctgc 1680

acgatgcggc tgcccccgcc aaccaccaag gatgcaacgc tggagacagt gatggcgaca 1740

ctgcccaact tccaccaggc ttctctccag atgtccatca cttggcagct gggcagacgc 1800

cagcccgtta tggtggctgt gggccagcat gaggaggagt atttttcggg ccctgagcct 1860

aaggctgtgc tgaagaagtt cagggaggag ctggctgccc tggataagga aattgagatc 1920

cggaatgcaa agctggacat gccctacgag tacctgcggc ccagcgtggt ggaaaacagt 1980

gtggccatct aagcgtcgcc accctttggt tatttcagcc cccatcaccc aagccacaag 2040

ctgacccctt cgtggttata gccctgccct cccaagtccc accctcttcc catgtcccac 2100

cctccctaga ggggcacctt ttcatggtct ctgcacccag tgaacacatt ttactctaga 2160

ggcatcacct gggaccttac tcctctttcc ttccttcctc ctttcctatc ttccttcctc 2220

tctctcttcc tctttcttca ttcagatcta tatggcaaat agccacaatt atataaatca 2280

tttcaagact agaatagggg gatataatac atattactcc acacctttta tgaatcaaat 2340

atgatttttt tgttgttgtt aagacagagt ctcactttga cacccaggct ggagtgcagt 2400

ggtgccatca ccacggctca ctgcagcctc agcgtcctgg gctcaaatga tcctcccacc 2460

tcagcctcct gagtagctgg gactacaggc tcatgccatc atgcccagct aatatttttt 2520

tattttcgtg gagacggggc ctcactatgt tgcctaggct ggaaatagga ttttgaaccc 2580

aaattgagtt taacaataat aaaaagttgt tttacgctaa agatggaaaa gaactaggac 2640

tgaactattt taaataaaat attggcaaaa g 2671

<210>57

<211>1193

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>CDH1 ＞gi|509604|gb|L34545.1|HUMECADN人上皮细胞钙粘蛋白基因，启动子区域和5’端

<400>57

tctagaaaaa ttttttaaaa aattaggccg ctcgagcgag agtgcagtgg ctcacgcctg 60

taatccaaca cttcaggagg ctgaagaggg tggatcacct gaggtcagga gttccagacc 120

agcctggcca acatggtgaa accccgtctt gtactaaaaa tacaaaatta gccggtgtgg 180

tggcacacgc ctgtagtccc agctactcaa taggctgaga caggagagtc tcttgaaccc 240

ggcaggcgga ggttgcagtg agccgagatc gtgccactgc actccagcct gggcaagaca 300

gagcgagact ccgtctcaaa aaatacaaac aaaacaaaca aacaaaaaat taggctgcta 360

gctcagtggc tcatggctca cacctgaaat cctagcactt tgggaggcca aggcaggagg 420

atcgcttcag cccaggagtt cgagaccagg ctgggcaata cagggagaca cagcgccccc 480

actgcccctg tccgccccga cttgtctctc tacaaaaagg caaaagaaaa aaaaaattag 540

cctggcgtgg tggtgtgcac ctgtactccc agctactaga gaggctgggg ccagaggacc 600

gcttgagccc aggagttcga ggctgcagtg agctgtgatc gcaccactgc actccagctt 660

gggtgaaaga gtgagcccca tctccaaaac gaacaaacaa aaaatcccaa aaaacaaaag 720

aactcagcca agtgtaaaag ccctttctga tcccaggtct tagtgagcca ccggcggggc 780

tgggattcga acccagtgga atcagaaccg tgcaggtccc ataacccacc tagaccctag 840

caactccagg ctagagggtc accgcgtcta tgcgaggccg ggtgggcggg ccgtcagctc 900

cgccctgggg aggggtccgc gctgctgatt ggctgtggcc ggcaggtgaa ccctcagcca 960

atcagcggta cggggggcgg tgctccgggg ctcacctggc tgcagccacg caccccctct 1020

cagtggcgtc ggaactgcaa agcacctgtg agcttgcgga agtcagttca gactccagcc 1080

cgctccagcc cggcccgacc cgaccgcacc cggcgcctgc cctcgctcgg cgtccccggc 1140

cagccatggg cccttggagc cgcagcctct cggcgctgct gctgctgctg cag 1193

<210>58

<211>2635

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>染色体5上的Hin-1区域(另一名称SCGB3A1)

<220>

<221>misc_feature

<223>这个基因可以在染色体5的179，949，712-179，951，146位置找到。所述基因的开始位置在重叠群AC122714.2.1.190024.＞染色体：NCBI35:5:179949112:179951746:-1

<400>58

atctgtcata cttctgcagg tgacagacga gtgaggacat ttagagaaac tcaggaacaa 60

accaggccca tccactggcg tcgaggctag tttcgaagac agaaaaacgc cccacttctg 120

tttgcactgt ggctgcctgt ggcccggccg gggaggcggc cgggagtgag gcctgatcgt 180

ccctggcgcc tccacctccc caggcgcaga aggcgcccac gaggaccccc agtgcccgac 240

gttgccacgg tctgggatca gaggcaggga ccagggagcc aggaactgcg ccgcccccgc 300

ccctgccctg gcgcgaggga agctcccctc acccgggccc agccctgcag gggggcgcgt 360

ggggtcagac cgcaaagcga aggtgcgggc cggggtgggc ctcgcggaga caaaggccgg 420

gcctgcctgc tctcagaggg ccccagcgcc tgccaagagg aagtcctcga ggcccgggca 480

gggaaggggg cacgggcttc ccagggcccg ccggccgcag caggaagttg gccagggcac 540

ggccgtgagc ggagcgggca gggctttctc aggagcgcgg gcgaggccgg cgctggaggg 600

gcgaggaccg ggtataagaa gcctcgtggc cttgcccggg cagccgcagg ttccccgcgc 660

gccccgagcc cccgcgccat gaagctcgcc gccctcctgg ggctctgcgt ggccctgtcc 720

tgcagctccg gtgagcgccc cgggctcctg gcgcgcacgg tggggcctga ggcctcggcg 780

cccgctgcgc ccccgccgct gcctgcgccg atcgtggatc ccaggtcctt ccagcctcgc 840

ccggcgccca gagggctccg ccaccccggg gccccgcgcc tgcagcccgc ggcctccccc 900

tctcagggct gtctccagcc tcgtgccggg atggaggccg cccctggcct ggggacaccc 960

gtctgccccc cgtctggaga ccggctcctc atcctgcaag gcgcagcgcg agtgtcccct 1020

cccttggggg cctgtcccgg accctgcaca gagttcaccg gtccttccgc caccctcagg 1080

ccactccggt gaccctgcag cgtctcctgg cggggccgcc tccccagacc cgcctgtgtc 1140

ccgggggctc gcacctggca ggcctcggcg caggagggag gggcggtcgg ggagccgggc 1200

agggcgcgac ggttcctggg cgcctcccgc gggggcgcgt cctggacctg ccttctgggg 1260

accccggcgc gcaggcggtg acccctccct gttcgcttgc agctgctgct ttcttagtgg 1320

gctcggccaa gcctgtggcc cagcctgtcg ctgcgctgga gtcggcggcg gaggccgggg 1380

ccgggaccct ggccaacccc ctcggcaccc tcaacccgct gaagctcctg ctgagcagcc 1440

tgggcatccc cgtgaaccac ctcatagagg gctcccagaa gtgtgtggct gagctgggtc 1500

cccaggccgt gggggccgtg aaggccctga aggccctgct ggtaaagtgg gcaccccggg 1560

tgcccttcct gcgcgggcat cccttcccgg ccagcctcaa aactgcacca gaggtgtccc 1620

ggccctacgt cagggctgtt tcccgtcctg cccctccaag ccctgtccct gggagaagcc 1680

cgggtctccg ggtgggaact gggtggggcg catccgagct gcaggggcgg ggaaggcgga 1740

gatggccccg cgcgggtgcg cgtcccccgg agacgccagc ggaaccgccc cgctcccgct 1800

ccccacagag ccggccgctg ccgcgccccc gcctgagttc ttggtggcag ggctgggggc 1860

actcaagctc ggcttctgct ttccaggggg ccctgacagt gtttggctga gccgagactg 1920

gagcatctac acctgaggac aagacgctgc ccacccgcga gggctgaaaa ccccgccgcg 1980

gggaggaccg tccatcccct tcccccggcc cctctcaata aacgtggtta agagcagctc 2040

gagcctggta ttttctcatc caaatgctga tccctgtggg ggaccgagag tgccaagtcc 2100

cagattttgt gaggggtgct gcgtgagaga gggagagaga ggccgcgaga gtctgcaggt 2160

ggcatagagc cagcagtgca aggtgacaga gatggggcca gtatcagagg taaaccggat 2220

ttggaaacaa aactggcagg tctttcttcc tgttgtgctc tgtaactgtt tatgaagcat 2280

aaaaattatc tactccttga agactggcga gaatgcaaac gcaccaaagc catttgttgc 2340

taaaatttga aagtttttat tttttccctc tatacttgta gatttcttcc tcggaatggg 2400

ggaggaatga gggcttcagg aaatccgctg ttgggcttgt tttccctgca gtttctgctg 2460

gttttgtcca aataacctag tgactttgat tccttctact ctagcggaga gaccaccttt 2520

tgtcaactga tctagtgttg gtgggaaggt gcccagggaa cccagacatc ggtgtccctt 2580

tcaggggaag cctcccagtt gacttccttg ctgggatgaa taactctgcc tcagg 2635

<210>59

<211>4260

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>＞gi|341173|gb|M24485.1|HUMGSTP1G人类(克隆pHGST-pi)谷光苷肽S-转移酶pi(GSTP1)基因，全序列

<400>59

aacaagagat caatatctag aataaatgga gatctgcaaa tcaacagaaa gtaggcagca 60

aagccaaaga aaatagccta aggcacagcc actaaaagga acgtgatcat gtcctttgca 120

gggacatggg tggagctgga agccgttagc ctcagcaaac tcacacagga acagaaaacc 180

agcgagaccg catggtctca cttataagtg ggagctgaac aatgagaaca catggtcaca 240

tggcggcgat caacacacac tggtgcctgt tgagcggggt gctggggagg gagagtacca 300

ggaagaatag ctaagggata ctgggcttaa tacctgggtg atgggatgat ctgtacagca 360

aaccatcatg gcgcacacac ctatgtaaca aacctgcaca tcctgcacat gtaccccaga 420

acttcaaata aaagttggac ggccaggcgt ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt 480

gggaagccga ggcgtgcaga tcacctaagg tcaggagttc gagaccagcc cggccaacat 540

ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaatcagcca gatgtggcac gcacctataa 600

ttccacctac tcgggaggct gaagcagaat tgcttgaacc cgagaggcgg aggttgcagt 660

gagccgccga gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcca cagcgtgaga ctacgtcata 720

aaataaaata aaataacaca aaataaaata aaataaaata aaataaaata aaataataaa 780

ataaaataaa ataaaataaa ataaaataaa ataaagcaat ttcctttcct ctaagcggcc 840

tccacccctc tcccctgccc tgtgaagcgg gtgtgcaagc tccgggatcg cagcggtctt 900

agggaatttc cccccgcgat gtcccggcgc gccagttcgc tgcgcacact tcgctgcggt 960

cctcttcctg ctgtctgttt actccctagg ccccgctggg gacctgggaa agagggaaag 1020

gcttccccgg ccagctgcgc ggcgactccg gggactccag ggcgcccctc tgcggccgac 1080

gcccggggtg cagcggccgc cggggctggg gccggcggga gtccgcggga ccctccagaa 1140

gagcggccgg cgccgtgact cagcactggg gcggagcggg gcgggaccac ccttataagg 1200

ctcggaggcc gcgaggcctt cgctggagtt tcgccgccgc agtcttcgcc accagtgagt 1260

acgcgcggcc cgctccccgg ggatggggct cagagctccc agcatggggc caacccgcag 1320

catcaggccc gggctcccgg cagggctcct cgcccacctc gagacccggg acgggggcct 1380

aggggaccca ggacgtcccc agtgccgtta gcggctttca gggggcccgg agcgcctcgg 1440

ggagggatgg gaccccgggg gcggggaggg ggggcaggct gcgctcaccg cgccttggca 1500

tcctcccccg ggctccagca aacttttctt tgttcgctgc agtgccgccc tacaccgtgg 1560

tctatttccc agttcgaggt aggagcatgt gtctggcagg gaagggaggc aggggctggg 1620

gctgcagccc acagcccctc gcccacccgg agagatccga acccccttat ccctccgtcg 1680

tgtggctttt accccgggcc tccttcctgt tccccgcctc tcccgccatg cctgctcccc 1740

gccccagtgt tgtgtgaaat cttcggagga acctgtttac ctgttccctc cctgcactcc 1800

tgacccctcc ccgggttgct gcgaggcgga gtcggcccgg tccccacatc tcgtacttct 1860

ccctccccgc aggccgctgc gcggccctgc gcatgctgct ggcagatcag ggccagagct 1920

ggaaggagga ggtggtgacc gtggagacgt ggcaggaggg ctcactcaaa gcctcctgcg 1980

taagtgacca tgcccgggca aggggagggg gtgctgggcc ttagggggct gtgactagga 2040

tcgggggacg cccaagctca gtgcccctcc ctgagccatg cctcccccaa cagctatacg 2100

ggcagctccc caagttccag gacggagacc tcaccctgta ccagtccaat accatcctgc 2160

gtcacctggg ccgcaccctt ggtgagtctt gaacctccaa gtccagggca ggcatgggca 2220

agcctctgcc cccggagccc ttttgtttaa atcagctgcc ccgcagccct ctggagtgga 2280

ggaaactgag acccactgag gttacgtagt ttgcccaagg tcaagcctgg gtgcctgcaa 2340

tccttgccct gtgccaggct gcctcccagg tgtcaggtga gctctgagca cctgctgtgt 2400

ggcagtctct catccttcca cgcacatcct cttcccctcc tcccaggctg gggctcacag 2460

acagccccct ggttggccca tccccagtga ctgtgtgttg atcaggcgcc cagtcacgcg 2520

gcctgctccc ctccacccaa ccccagggct ctatgggaag gaccagcagg aggcagccct 2580

ggtggacatg gtgaatgacg gcgtggagga cctccgctgc aaatacatct ccctcatcta 2640

caccaactat gtgagcatct gcaccagggt tgggcactgg gggctgaaca aagaaagggg 2700

cttcttgtgc cctcaccccc cttacccctc aggtggcttg ggctgacccc ttcttgggtc 2760

agggtgcagg ggctgggtca gctctgggcc aggggcccag gggcctggga caagacacaa 2820

cctgcaccct tattgcctgg gacatcaacc agccaagtaa cgggtcatgg gggcgagtgc 2880

aaggacagag acctccagca actggtggtt tctgatctcc tggggtggcg agggcttcct 2940

ggagtagcca gaggtggagg aggatttgtc gccagtttct ggatggaggt gctggcactt 3000

ttagctgagg aaaatatgca gacacagagc acatttgggg acctgggacc agttcagcag 3060

aggcagcgtg tgtgcgcgtg cgtgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgtgtgta cgcttgcatt 3120

tgtgtcgggt gggtaaggag atagagatgg gcgggcagta ggcccaggtc ccgaaggcct 3180

tgaacccact ggtttggagt ctcctaaggg caatgggggc cattgagaag tctgaacagg 3240

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<220>

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<223>＞gi|5016088|ref|NM_001101.2|人类actin，beta(ACTB)，mRNA

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<223>RARB2 ＞gi|14916495|ref|NM_016152.2|人类维甲酸受体，beta(RARB)，转录变体2，mRNA

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tt 2762

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<213>人类

<220>

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<223>TIMP3 ＞gi|21536431|ref|NM_000362.3|人类金属蛋白酶3的组织抑制剂(Sorsby眼底营养不良，假性炎症)(TIMP3)，mRNA

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cgatgaggta atgcggctct gccattggtc tgagggggcg ggccccaaca gcccgaggcg 840

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cctttcccta gctccctggt gggtgaatgc cacctcctga gatcctcacc tcttggaatt 3300

aaaattgttg gtcactgggg aaagcctgag tttgcaacca gttgtagggt ttctgttgtg 3360

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gtgggggttg gcaggatggt gacattgaac atgattgctc tctgtctctt ttttcagctt 3540

atgggtattt atcttctatt agtatttgta tcttcagttc attccacttt aggaaacaga 3600

gctgccaatt gaaacagaag aagaaaaaaa aaaaaagcag cagacaacac actgtagagt 3660

cttgcacaca cacaagtgcc caggcaaggt gcttggcaga accgcagagt gggaagagag 3720

taccggcatc gggtttcctt gggatcaatt tcattaccgt gtacctttcc cattgtggtc 3780

atgccatttg gcagggggag aatgggaggc ttggccttct ttgtgaggca gtgtgagcag 3840

aagctgatgc cagcatgtca ctggttttga agggatgagc ccagacttga tgttttggga 3900

ttgtccttat tttaacctca aggtctcgca tggtggggcc cctgaccaac ctacacaagt 3960

tccctcccac aagtggacat cagtgtcttc tctgtgaggc atctggccat tcgcactccc 4020

tggtgtggtc agcctctctc acacaaggag gaacttgggt gaaggctgag tgtgaggcac 4080

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ggtgaggagg ccctgggcaa agaagggtct ttcgcaaagc gatgtcagag ggcggttttg 4200

agctttctat aagctatagc tttgtttatt tcacccgttc acttactgta taatttaaaa 4260

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gaggcgagag gaaggggaga acttggagaa tagtttttgc tttgggggta gaggcttctt 5220

agattctccc agcatccgcc tttcccttta gccagtctgc tgtcctgaaa cccagaagtg 5280

atggagagaa accaacaaga gatctcgaac cctgtctaga aggaatgtat ttgttgctaa 5340

atttcgtagc actgtttaca gttttcctcc atgttattta tgaattttat attccgtgaa 5400

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<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>APC ＞gi|551463|gb|U02509.1|HSU02509人腺瘤性结肠息肉病(APC)基因，启动子序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(315)..(315)

<223>n is a，c，g，或t

<400>64

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<223>PTGS2 ＞gi|3282785|gb|AF044206.1|人环氧化酶(COX-2)基因，启动子和外显子1

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actttcaaca agtgcttttc attccactct tttcctgtcc ttaagtggga caagatcact 3060

gggggggggc tagaattggg tatttccctt ctccaatgta gaagctaaag agagggctgg 3120

agttgggtat ttttcttccc ctgtatggaa agctagaggc agttaaattt ggatattttc 3180

cttcttctaa ttcagttagg ctgcgacaaa aatcccgaca gtttaggctc taatattata 3240

aaataatttc tcttgagtat aggccttatt aagaacacta tactctgatg gagctgaggg 3300

ggagttttct ctgatattca ctgcgagaac ctcgtagagc tccaggaagc aaaactcaca 3360

aaagtgtggg agtcttccag aatttttcct ttgcagactt atctgcactg aacctccaga 3420

aattcatcaa ttacagttca ggttttccta cccaggtact ggttttcatg gaggtttctg 3480

cctgtgcatt tctgctccag taagttgttc ttcttgtatg gtctgtcttt caaatttttt 3540

aagtagggtt atgacctgtc gcctcacttc tctgacagtt ctgagagtgt tgatttttca 3600

gtttgcttag atttttactt gtttttagga tgaagtgaca atttccaagc tcctccctga 3660

catgccagat cagaaactga aagtcctaag cctcatattc tgtgcgtggg tatgttcaca 3720

tcctgcctgc tccagtgccc ccacctcaca ctctctttcc cttccttgtc cccttgtgag 3780

atttctaggt ccaatacaaa gactgtgttc aactcattca actacttggc tcatctgagt 3840

attataatga acaatcacaa aaaaaaatga agtaaaagaa aaatccatca aagaattgag 3900

atatttgaga aaaagaaagg agatcagtgt tttataaaac ttagaaatag attttttaag 3960

tgtttcttca ttgacttatg tgaaaggact tttcttaatt taacaaatta tgtgctttcg 4020

tttatagcct caaaacttct tgtgtagcta agaatgggta aataatcagg ctttactaaa 4080

ggactaacgt aaagatcttc tgtaagtaac atttctgcta ctcaaggaag agataaactt 4140

catggcataa ccttgccaaa gtatactaag aataaccctg acacaaagct cttttttcag 4200

ccaacatgcc atgaaagaaa gaagacaagg ggtgatctcc actctctaag tgaaccacta 4260

aacccaccaa agaagaaacg agggaaatag aaagaggacc cttgcctgag ataatggatc 4320

tgtatgtatg agtagtagaa ccctgctcaa agtacaagga agggaaaaaa aagttagttt 4380

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gggcagtaaa actcaacaga aagctctgga agatttttaa gattcttcct tattttcttt 4680

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atatatttgc ctaaaataga cacagaaaca ttgatatatg caaacatgag agctataagt 4800

tttacatgat caaaaccttt tttttatggt acacaatagt cacagtactt ttccatataa 4860

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ccaaatgtac ctatccgttt tattttattg tctcagaatt gtcagttatt taataaatta 4980

tgtaactttt ttccttatgc tcagatttgc acttctttct aaaactctgc ccatccttaa 5040

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ctatcctgct atataagtga cagaatttcc actatgggat agatggagtt caattccttt 5160

gagtttaaaa taatctaaat ataattattc cttatgccct gtttttccct cacttttgta 5220

tccaaatctc ttttcagaca acagaacaat taatgtctga taaggaagac aatgatgatg 5280

atcacttcaa aataagcttg aattcaggat tgtaatgtaa aattttagta ctctctcaca 5340

gtatggattc taacatggct tctaacccaa actaacatta gtagctctaa ctataaactt 5400

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aaataggagt gccataaatg gaatgatgaa atatgactag aggaggagaa aggcttccta 5580

gatgagatgg aattttagtc atccgtgtct catgaagaat cagatgtgta cactaagcaa 5640

aacagttaaa aaaaaaacct ccaagtgagt ctcttattta tttttttctt ataagacttc 5700

tacaaattga ggtacctggt gtagttttat ttcaggtttt atgctgtcat tttcctgtaa 5760

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tatatatata tgtatatata cacacacaca tatacatata tatattttta gtatctcacc 5880

ctcacatgct cctccctgag cactacccat gatagatgtt aaacaaaagc aaagatgaaa 5940

ttccaactgt taaaatctcc cttccatcta attaattcct catccaacta tgttccaaaa 6000

cgagaataga aaattagccc caataagccc aggcaactga aaagtaaatg ctatgttgta 6060

ctttgatcca tggtcacaac tcataatctt ggaaaagtgg acagaaaaga caaaagagtg 6120

aactttaaaa ctcgaattta ttttaccagt atctcctatg aagggctagt aaccaaaata 6180

atccacgcat cagggagaga aatgccttaa ggcatacgtt ttggacattt agcgtccctg 6240

caaattctgg ccatcgccgc ttcctttgtc catcagaagg caggaaactt tatattggtg 6300

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gaatttacct ttcccgcctc tctttccaag aaacaaggag ggggtgaagg tacggagaac 6420

agtatttctt ctgttgaaag caacttagct acaaagataa attacagcta tgtacactga 6480

aggtagctat ttcattccac aaaataagag ttttttaaaa agctatgtat gtatgtcctg 6540

catatagagc agatatacag cctattaagc gtcgtcacta aaacataaaa catgtcagcc 6600

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tacagaccag acacggcggc ggcggcggga gaggggattc cctgcgcccc cggacctcag 6720

ggccgctcag attcctggag aggaagccaa gtgtccttct gccctccccc ggtatcccat 6780

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gatcagacag gagagtgggg actaccccct ctgctcccaa attggggcag cttcctgggt 6960

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ctgcccgaag ctt 7273

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<212>DNA

<213>人类

<220>

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<223> ＞gi|4506264|ref|NM_000963.1|人前列腺素内过氧化物合成酶2(前列腺素G/H合成和环氧化酶)(PTGS2)，mRNA

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caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc 60

ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccg cgccgcgccc 120

tgcccgccgc tcggatgctc gcccgcgccc tgctgctgtg cgcggtcctg gcgctcagcc 180

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caccggaatt tttgacaaga ataaaattat ttctgaaacc cactccaaac acagtgcact 360

acatacttac ccacttcaag ggattttgga acgttgtgaa taacattccc ttccttcgaa 420

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acaatgctga ctatggctac aaaagctggg aagccttctc taacctctcc tattatacta 540

gagcccttcc tcctgtgcct gatgattgcc cgactccctt gggtgtcaaa ggtaaaaagc 600

agcttcctga ttcaaatgag attgtggaaa aattgcttct aagaagaaag ttcatccctg 660

atccccaggg ctcaaacatg atgtttgcat tctttgccca gcacttcacg catcagtttt 720

tcaagacaga tcataagcga gggccagctt tcaccaacgg gctgggccat ggggtggact 780

taaatcatat ttacggtgaa actctggcta gacagcgtaa actgcgcctt ttcaaggatg 840

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aggcagagat gatctaccct cctcaagtcc ctgagcatct acggtttgct gtggggcagg 960

aggtctttgg tctggtgcct ggtctgatga tgtatgccac aatctggctg cgggaacaca 1020

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acaactctat attgctggaa catggaatta cccagtttgt tgaatcattc accaggcaaa 1380

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tactaaaaga acgttcgact gaactgtaga agtctaatga tcatatttat ttatttatat 1980

gaaccatgtc tattaattta attatttaat aatatttata ttaaactcct tatgttactt 2040

aacatcttct gtaacagaag tcagtactcc tgttgcggag aaaggagtca tacttgtgaa 2100

gacttttatg tcactactct aaagattttg ctgttgctgt taagtttgga aaacagtttt 2160

tattctgttt tataaaccag agagaaatga gttttgacgt ctttttactt gaatttcaac 2220

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aaatgctgaa agtttttaca ctgtcgatgt ttccaatgca tcttccatga tgcattagaa 2340

gtaactaatg tttgaaattt taaagtactt ttggttattt ttctgtcatc aaacaaaaac 2400

aggtatcagt gcattattaa atgaatattt aaattagaca ttaccagtaa tttcatgtct 2460

actttttaaa atcagcaatg aaacaataat ttgaaatttc taaattcata gggtagaatc 2520

acctgtaaaa gcttgtttga tttcttaaag ttattaaact tgtacatata ccaaaaagaa 2580

gctgtcttgg atttaaatct gtaaaatcag atgaaatttt actacaattg cttgttaaaa 2640

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aaacttcctt ttaaatcaaa atgccaaatt tattaaggtg gtggagccac tgcagtgtta 2760

tctcaaaata agaatatttt gttgagatat tccagaattt gtttatatgg ctggtaacat 2820

gtaaaatcta tatcagcaaa agggtctacc tttaaaataa gcaataacaa agaagaaaac 2880

caaattattg ttcaaattta ggtttaaact tttgaagcaa actttttttt atccttgtgc 2940

actgcaggcc tggtactcag attttgctat gaggttaatg aagtaccaag ctgtgcttga 3000

ataacgatat gttttctcag attttctgtt gtacagttta atttagcagt ccatatcaca 3060

ttgcaaaagt agcaatgacc tcataaaata cctcttcaaa atgcttaaat tcatttcaca 3120

cattaatttt atctcagtct tgaagccaat tcagtaggtg cattggaatc aagcctggct 3180

acctgcatgc tgttcctttt cttttcttct tttagccatt ttgctaagag acacagtctt 3240

ctcatcactt cgtttctcct attttgtttt actagtttta agatcagagt tcactttctt 3300

tggactctgc ctatattttc ttacctgaac ttttgcaagt tttcaggtaa acctcagctc 3360

aggactgcta tttagctcct cttaagaaga ttaaaagaga aaaaaaaagg cccttttaaa 3420

aatagtatac acttatttta agtgaaaagc agagaatttt atttatagct aattttagct 3480

atctgtaacc aagatggatg caaagaggct agtgcctcag agagaactgt acggggtttg 3540

tgactggaaa aagttacgtt cccattctaa ttaatgccct ttcttattta aaaacaaaac 3600

caaatgatat ctaagtagtt ctcagcaata ataataatga cgataatact tcttttccac 3660

atctcattgt cactgacatt taatggtact gtatattact taatttattg aagattatta 3720

tttatgtctt attaggacac tatggttata aactgtgttt aagcctacaa tcattgattt 3780

ttttttgtta tgtcacaatc agtatatttt ctttggggtt acctctctga atattatgta 3840

aacaatccaa agaaatgatt gtattaagat ttgtgaataa atttttagaa atctgattgg 3900

catattgaga tatttaaggt tgaatgtttg tccttaggat aggcctatgt gctagcccac 3960

aaagaatatt gtctcattag cctgaatgtg ccataagact gaccttttaa aatgttttga 4020

gggatctgtg gatgcttcgt taatttgttc agccacaatt tattgagaaa atattctgtg 4080

tcaagcactg tgggttttaa tatttttaaa tcaaacgctg attacagata atagtattta 4140

tataaataat tgaaaaaaat tttcttttgg gaagagggag aaaatgaaat aaatatcatt 4200

aaagataact caggagaatc ttctttacaa ttttacgttt agaatgttta aggttaagaa 4260

agaaatagtc aatatgcttg tataaaacac tgttcactgt tttttttaaa aaaaaaactt 4320

gatttgttat taacattgat ctgctgacaa aacctgggaa tttgggttgt gtatgcgaat 4380

gtttcagtgc ctcagacaaa tgtgtattta acttatgtaa aagataagtc tggaaataaa 4440

tgtctgttta tttttgtact attta 4465

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<211>1336

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>14-3-3-Sigma ＞gi|45238846|ref|NM_006142.3|人stratifin(SFN)，mRNA

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gagagacaca gagtccggca ttggtcccag gcagcagtta gcccgccgcc cgcctgtgtg 60

tccccagagc catggagaga gccagtctga tccagaaggc caagctggca gagcaggccg 120

aacgctatga ggacatggca gccttcatga aaggcgccgt ggagaagggc gaggagctct 180

cctgcgaaga gcgaaacctg ctctcagtag cctataagaa cgtggtgggc ggccagaggg 240

ctgcctggag ggtgctgtcc agtattgagc agaaaagcaa cgaggagggc tcggaggaga 300

aggggcccga ggtgcgtgag taccgggaga aggtggagac tgagctccag ggcgtgtgcg 360

acaccgtgct gggcctgctg gacagccacc tcatcaagga ggccggggac gccgagagcc 420

gggtcttcta cctgaagatg aagggtgact actaccgcta cctggccgag gtggccaccg 480

gtgacgacaa gaagcgcatc attgactcag cccggtcagc ctaccaggag gccatggaca 540

tcagcaagaa ggagatgccg cccaccaacc ccatccgcct gggcctggcc ctgaactttt 600

ccgtcttcca ctacgagatc gccaacagcc ccgaggaggc catctctctg gccaagacca 660

ctttcgacga ggccatggct gatctgcaca ccctcagcga ggactcctac aaagacagca 720

ccctcatcat gcagctgctg cgagacaacc tgacactgtg gacggccgac aacgccgggg 780

aagagggggg cgaggctccc caggagcccc agagctgagt gttgcccgcc accgccccgc 840

cctgccccct ccagtccccc accctgccga gaggactagt atggggtggg aggccccacc 900

cttctcccct aggcgctgtt cttgctccaa agggctccgt ggagagggac tggcagagct 960

gaggccacct ggggctgggg atcccactct tcttgcagct gttgagcgca cctaaccact 1020

ggtcatgccc ccacccctgc tctccgcacc cgcttcctcc cgaccccagg accaggctac 1080

ttctcccctc ctcttgcctc cctcctgccc ctgctgcctc tgatcgtagg aattgaggag 1140

tgtcccgcct tgtggctgag aactggacag tggcaggggc tggagatggg tgtgtgtgtg 1200

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgcgcg cgccagtgca agaccgagat tgagggaaag 1260

catgtctgct gggtgtgacc atgtttcctc tcaataaagt tcccctgtga cactcaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaa 1336

<210>69

<211>1968

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>RASSF1A ＞gi|25777678|ref|NM_007182.4|人Ras相关(RalGDS/AF-6)家族1(RASSF1)，转录变体A，mRNA

<400>69

tctcctcagc tccttcccgc cgcccagtct ggatcctggg ggaggcgctg aagtcggggc 60

ccgccctgtg gccccgcccg gcccgcgctt gctagcgccc aaagccagcg aagcacgggc 120

ccaaccgggc catgtcgggg gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg 180

ggcgcgctgg gaagggccgc acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg 240

gcaccgcgtg caaccccaca cggcagctgg tccctggccg tggccaccgc ttccagcccg 300

cggggcccgc cacgcacacg tggtgcgacc tctgtggcga cttcatctgg ggcgtcgtgc 360

gcaaaggcct gcagtgcgcg cattgcaagt tcacctgcca ctaccgctgc cgcgcgctcg 420

tctgcctgga ctgttgcggg ccccgggacc tgggctggga acccgcggtg gagcgggaca 480

cgaacgtgga cgagcctgtg gagtgggaga cacctgacct ttctcaagct gagattgagc 540

agaagatcaa ggagtacaat gcccagatca acagcaacct cttcatgagc ttgaacaagg 600

acggttctta cacaggcttc atcaaggttc agctgaagct ggtgcgccct gtctctgtgc 660

cctccagcaa gaagccaccc tccttgcagg atgcccggcg gggcccagga cggggcacaa 720

gtgtcaggcg ccgcacttcc ttttacctgc ccaaggatgc tgtcaagcac ctgcatgtgc 780

tgtcacgcac aagggcacgt gaagtcattg aggccctgct gcgaaagttc ttggtggtgg 840

atgacccccg caagtttgca ctctttgagc gcgctgagcg tcacggccaa gtgtacttgc 900

ggaagctgtt ggatgatgag cagcccctgc ggctgcggct cctggcaggg cccagtgaca 960

aggccctgag ctttgtcctg aaggaaaatg actctgggga ggtgaactgg gacgccttca 1020

gcatgcctga actacataac ttcctacgta tcctgcagcg ggaggaggag gagcacctcc 1080

gccagatcct gcagaagtac tcctattgcc gccagaagat ccaagaggcc ctgcacgcct 1140

gcccccttgg gtgacctctt gtacccccag gtggaaggca gacagcaggc agcgccaagt 1200

gcgtgccgtg tgagtgtgac agggccagtg gggcctgtgg aatgagtgtg catggaggcc 1260

ctcctgtgct gggggaatga gcccagagaa cagcgaagta gcttgctccc tgtgtccacc 1320

tgtgggtgta gccaggtatg gctctgcacc cctctgccct cattactggg ccttagtggg 1380

ccagggctgc cctgagaagc tgctccaggc ctgcagcagg agtggtgcag acagaagtct 1440

cctcaatttt tgtctcagaa gtgaaaatct tggagaccct gcaaacagaa cagggtcatg 1500

tttgcagggg tgacggccct catctatgag gaaaggtttt ggatcttgaa tgtggtctca 1560

ggatatcctt atcagagcta agggtgggtg ctcagaataa ggcaggcatt gaggaagagt 1620

cttggtttct ctctacagtg ccaactcctc acacaccctg aggtcaggga gtgctggctc 1680

acagtacagc atgtgcctta atgcttcata tgaggaggat gtccctgggc cagggtctgt 1740

gtgaatgtgg gcactggccc aggttcatac cttatttgct aatcaaagcc agggtctctc 1800

cctcaggtgt tttttatgaa gtgcgtgaat gtatgtaatg tgtggtggcc tcagctgaat 1860

gcctcctgtg gggaaagggg ttggggtgac agtcatcatc agggcctggg gcctgagaga 1920

attggctcaa taaagatttc aagatcctca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1968

Claims

1.选自序列ID号26-27和序列ID号28-29的引物对以及序列ID号34-35的引物对在制备用于预测前列腺癌复发或转移性的方法的试剂盒中的用途，所述方法包含，

a)测定前列腺样品的Gleason分值，和

b)测定一份Gleason分值等于或大于7的那些患者的生物样品中包括一个GSTP1标记和一个APC、RASSF1A、15-LO-1或CDH1标记的标记组合的甲基化状态；

其中超过预定值的甲基化显示的是转移性或复发性的癌且未超过预定值的甲基化显示的是惰性的癌。

2.根据权利要求1的用途，其中所述方法进一步包含测定一种参考标记的存在，所述参考标记选自β-肌动蛋白和PTGS2。

3.权利要求1的用途，其中测定甲基化状态的样品是前列腺组织。

4.权利要求1的用途，其中测定甲基化状态的样品是尿、尿道冲洗物、血液、血液组分、精液或循环细胞。

5.权利要求4的用途，其中所述样品是血清或血浆。

6.一种进行分析以预测前列腺癌的病程或转移性的试剂盒，包含：核酸扩增和检测试剂和指示其用于所引证Gleason分值等于或大于7的患者的说明书；其中所述核酸扩增试剂包括选自序列ID号26-27和序列ID号28-29的引物对以及序列ID号34-35的引物对。

7.权利要求6的试剂盒，其中说明书指示试剂盒用于所引证的Gleason分值为大于7的患者。

8.权利要求6的试剂盒，其中试剂还包括序列ID号32和33。

9.权利要求6的试剂盒，其中试剂还包括序列ID号52和53。

10.权利要求6的试剂盒，其中试剂还包括序列ID号54和55。

11.权利要求6的试剂盒，其中试剂检测GSTP1的过度甲基化和选自APC、RASSF1A、15-LO-1和CDH1的基因的过度甲基化。

12.权利要求6的试剂盒，其进一步包含扩增和检测基础表达基因存在的试剂。

13.权利要求1的用途，其中所述方法进一步包含确定甲基化率和测定是否甲基化率超过了临界值。

14.权利要求1的用途，其中所述试剂盒用于治疗监控。

15.选自序列ID号26-27和序列ID号28-29的引物对以及序列ID号34-35的引物对在制备用于测定患者是否要进行前列腺活检测试的方法的试剂盒中的用途，所述方法包含，

a)测定患者样品的PSA水平，和

b)测定一份PSA水平大于2且小于或等于4ng/ml的那些患者的生物样品中一个GSTP1标记和一个APC、RASSF1A、15-LO-1或CDH1标记的标记组合的甲基化状态；

其中选取甲基化值超过预定值的患者进行活检测试。

16.根据权利要求15的用途，其中所述方法进一步包含测定一种参考标记的存在。

17.根据权利要求16的用途，其中参考标记选自β-肌动蛋白和PTGS2。

18.权利要求15的用途，其中测定甲基化状态的样品是尿、尿道冲洗物、血液、血液组分、精液或循环细胞。

19.权利要求18的用途，其中所述样品是血清或血浆。

20.一种进行分析以检测患者是否需要进行前列腺活检测试的试剂盒，其包含：核酸扩增和检测试剂和指示其用于所发现的PSA水平在2到4ng/ml之间的患者的说明书；

其中所述核酸扩增试剂包括选自序列ID号26-27和序列ID号28-29的引物对以及序列ID号34-35的引物对。