KR20070031823A - 유전자 메틸화 탐지 - Google Patents

유전자 메틸화 탐지 Download PDF

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Abstract

각종 유전자의 메틸화 상태 탐지용 방법, 키트 및 조성물은 전립선 암과 같은 의심되는 증식성 장애를 포함하는 각종 진단 적용에 유용하다.
과메틸화, 전립선 암, 증식성 장애, 마커, 프로브, 프라이머

Description

유전자 메틸화 탐지{Detecting gene methylation}
도 1은 선행 기술의 프로브 및 프라이머를 사용한 MSPCR 검정 결과의 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따르는 가수분해 프로브 및 프라이머를 사용한 MSPCR 검정 결과의 그래프이다.
본 발명은 암과 같은 세포 증식성 장애의 진단 및 예측 검정과 같은 적용에의 메틸화된 유전자의 의문에 관한 것이다. 관계된 유전자에는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GSTP1) 유전자 또는 이의 일부가 포함된다.
고등 생물의 진핵세포 DNA는 CpG 다이뉴클레오타이드에서 구아노신의 5'에 위치한 사이토신에서만 메틸화된다. 이러한 변형은 특히, 유전자 프로모터 영역 내에 위치하는 CpG 풍부 영역(CpG 섬(island))이 관계된 경우, 유전자 발현에 대한 중요한 조절 효과를 갖는다. 정상적으로는 메틸화되지 않는 CpG 섬의 비정상적 메 틸화는 불멸화 및 형질전환된 세포에서 빈번한 일이며 특정 종양 억제 유전자 또는 특정한 사람 암의 개선과 관계된 기타 유전자의 전사 불활성화와 관계되어 있다.
글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)는 화학적-반응성 친전자체를 글루타티온에 접합시킴으로써, 친전자성 발암물질을 불활성화시킴을 포함하여 세포내 해독 반응을 촉매화한다(문헌[참조: C. B. Pickett, et al., Annu. Rev. Blocbern., 58:743, 1989; B. Coles, et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25:47, 1990; T. H. Rushmore, et al., J. Biol. Chem. 268:11475, 1993]). 상이한 유전자좌의 수개의 상이한 유전자에 의해 암호화된 사람 GST는 알파, 뮤, 파이 및 쎄타로 지칭되는 4개의 군으로 분류되어 왔다(문헌[참조: B. Mannervik, et al., Biochem. J., 282:305, 1992]). 전립선암 및 간암과 같은 다수의 사람 암은 이들의 원래 조직과 비교하여 감소된 GSTP1 발현을 나타낸다.
특히 전립선 암의 경우, 양성 전립선 비대증 및 전립선 선암종을 식별하는 메틸화 특이적 PCR("MSP") 프라이머 및 프로브의 설계가 복잡한 것으로 판명되어 왔다. 최선의 공개된 프라이머/프로브 세트는 통상적으로 검정을 100% 특이적이 되도록 조정하는 경우 약 75%의 이하의 민감성을 나타내며, 검정을 100% 감수성이 되도록 조정하는 경우 60% 미만의 특이성을 나타낸다. 신규한 프라이머 및 프로브 조합을 사용하여 보다 확실하고 일관적인 검정을 확보할 수 있을 것이다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.
발명의 개요
본 발명의 한 측면에서, 전립선 조직 또는 피검체의 기타 샘플에서 세포 증식성 장애를 탐지하는 방법은 세포 성분과 특정 유전자의 과메틸화 영역의 증폭 및 탐지에 유용한 시약을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 하나 이상의 이러한 과메틸화 유전자는 하나 이상의 다른 유전자와 함께 검정할 수 있는 GSTP1이다.
본 발명의 다른 측면에서는, 메틸화된 표적 서열을 갖는 것으로 의심되는 핵산 샘플을 생물학적 샘플로부터 입수하고, 당해 샘플을 표적의 일부를 프라이밍(priming)할 수 있는 시약으로 처리하고, 핵산 표적을 증폭하고, 공지된 정상 샘플의 메틸화 정도와 증폭된 샘플의 메틸화 정도를 비교한다. 본 발명의 다른 측면에서는, 메틸화될 경향이 없는 서열을 증폭된 메틸화 서열과 비교하기 위해 증폭 및 탐지한다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 증식성 장애의 탐지 방법을 제공한다. 이는 메틸화 상태가 세포 증식성 장애를 나타내는 유전자를 증폭함으로써 수행한다. 탐지 방법에는 핵산 함유 표본 또는 생물학적 체액을 비메틸화된 사이토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계, 표본 중의 핵산을 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 식별하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프라이밍 서열로 증폭시키는 단계, 및 증폭 중 제조된 증폭 생성물의 존재 또는 부재를 토대로 하여 메틸화된 핵 산을 탐지하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 샘플의 메틸화율을 측정하는 단계를 포함한다. 메틸화율은 발병 상태 하에 과메틸화되지 않는 마커의 메틸화 수준에 비한(또는 동일한 조건 하에 과메틸화되지 않는 동일한 마커의 영역에 비한) 발병 상태에서 과메틸화된 마커(또는 마커의 영역)의 메틸화 수준 사이의 비율이다. 발병 상태에서 과메틸화되는 마커의 메틸화를 과메틸화되지 않는 다른 마커에 비교함으로써 메틸화율을 측정하는 경우, 제2 마커를 참조 마커 (reference marker)로 지칭할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 메틸화율을 정량적 실시간 PCR로 측정한다.
본 발명의 다른 측면에서는, 진단 및/또는 예후 검정용 리포터 분자를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 메틸화된 핵산의 탐지에 유용한 키트를 제공한다. 당해 키트는 하나 이상의 용기를 포함하는데; 첫번째 용기는 변형된 비메틸화 사이토신을 포함하고 두번째 용기는 CpG-함유 핵산의 증폭을 프라이밍하는 시약을 포함하며, 이때 당해 시약은 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 식별한다.
본 발명의 다른 측면에서는, 본 발명에서 탐지된 핵산 서열 또는 이들을 실행하기 위한 키트는 프로모터 또는 프로모터의 일부를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 특정 유전자의 메틸화된 일부의 탐지에 사용되는 방법 및 키트는 다른 핵산의 존재를 검정하는 단계 및/또는 이를 위한 성분을 포함한다. 공지된 대로 메틸화된 유전자가 처리(예를 들면, 증폭)에 의해 영향받는 정도를 기타 핵산의 경우와 비교하여 마커의 메틸화 정도를 결정한다.
특정 유전자의 과메틸화는 전립선 발암현상과 상관관계가 있다. 당해 유전자 또는 당해 유전자의 일부를 포함하는 핵산 서열을 본 명세서에서 마커로 지칭한다. 마커는 다음의 유전자 또는 당해 유전자의 일부를 포함하는 핵산을 포함한다: GST1(서열 번호 54), RARB2(서열 번호 57), RASSF1A(서열 번호 64), TIMP3(서열 번호 58), APC(프로모터= 서열 번호 59, 유전자 = 서열 번호 60), 베타-액틴(서열 번호 55 및 56) , PTGS2(프로모터 = 서열 번호 61, 유전자 = 서열 번호 62) 및 14-3-3 시그마(서열 번호 63).
이러한 과메틸화를 탐지하기 위한 검정에는 MSP 및 제한 엔도뉴클레아제 분석과 같은 기법이 포함된다. 프로모터 영역은 이러한 과메틸화 분석의 탐지를 위한 특히 현저한 표적이다. GSTP1의 프로모터 영역의 서열 분석은 뉴클레오타이드의 약 72%가 CG이며 약 10%가 CpG 다이뉴클레오타이드임을 나타낸다.
본 발명은 증식성 장애와 관련된 DNA가 증폭 및 탐지되어지는 피검체의 조직 또는 기타 생물학적 샘플 내의 마커의 특정 영역의 메틸화 상태를 측정하는 방법을 제공한다. 마커에 의해 암호화된 단백질의 감소된 수준(즉, 전사가 덜 된)은 흔히 프로모터와 같은 특정 영역의 과메틸화의 결과이기 때문에, 이러한 영역이 과메틸화되었는지의 여부를 결정하는 것이 바람직하다. 이는 GSTP1 유전자의 경우에 가장 명백한 것으로 보인다. 과메틸화 영역은 정상 조직과 비교하여 발병된 조직으로부터의 샘플에서 통계적으로 유의적인 큰 정도로 메틸화되는 영역이다.
본 발명의 목적을 위해, 특정 마커 영역에 특이적인 핵산 프로브 또는 리포터를 사용하여 생물학적 체액 또는 조직 내의 마커 유전자의 메틸화된 영역의 존재 를 탐지한다. 마커 서열의 특정 부위를 기준으로 한 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 PCR과 같은 기법에 의한 DNA의 증폭에 특히 유용하다. 관련 폴리뉴클레오타이드의 탐지가능한 양을 함유하는 임의의 표본을 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 표본은 비뇨 생식기관의 조직, 특히, 전립선 조직이다. 바람직하게는 당해 샘플은 상피 세포를 포함한다.
본 발명의 임의의 프라이머/프로브 또는 리포터 시약을 사용하여 마커 유전자의 발현 제어 서열의 메틸화를 탐지한다. 이들은 핵산 서열의 전사, 및, 임의의 경우, 해독을 조절하는 핵산 서열이다. 따라서, 발현 제어 서열은 프로모터, 인핸서(enhancer), 전사 터미네이터, 출발 코돈(즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱(splicing) 신호, mRNA의 적합한 해독을 가능케 하는 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 및 종결 코돈과 관계있는 서열을 포함할 수 있다.
GSTP1 프로모터는 유용한 마커의 전형적인 발현 제어 서열이다. 이는 글루타티온-s-트랜스퍼라제 단백질을 제조하기 위해 유전자를 직접 전사할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 당해 프로모터 영역은 구조 유전자의 상류 또는 5'에 위치한다. 세포형 특이적, 조직-특이적으로 제어가능한 또는 외부 신호 또는 제제에 의해 유도가능한 프로모터-의존성 유전자 발현이 되게 하는데 충분한 요소를 포함할 수 있으며; 이러한 요소는 당해 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다.
본 발명의 한 방법은 마커를 포함하는 표적 세포를 핵산에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 표적 세포 성분은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산이다. 당해 시약은 프로브 또는 PCR 또는 MSP 프라이머와 같은 프라이머 또는 표적 서열을 증폭 및 탐지하도록 형성한 기타 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 당해 시약은 스콜피온(Scorpion) 시약 또는 스콜피온 리포터로 지칭되고 발명자 Whitcombe 등의 미국 특허 제6,326,145호 및 제6,270,967호(이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있음)에 기술된 바와 같은 이들 자체의 리포터 단편과 연합되거나 이에 결합된 프라이밍 서열을 포함할 수 있다. 이들은 동일하지는 않지만, 용어 "프라이머" 및 "프라이밍 서열"은 본 명세서에서 핵산 서열의 증폭을 프라이밍하는 분자 또는 분자의 일부를 지칭하기 위해 사용할 수 있다.
메틸화 양상을 탐지하는 한가지 민감한 방법은 메틸화-민감 효소 및 중합효소 연쇄반응(PCR)의 사용의 병행을 포함한다. DNA를 효소로 분해한 후, PCR은 DNA 절단이 메틸화에 의해 방어된 경우, 오직 제한 부위를 플랭킹하는 프라이머로부터 증폭할 것이다. 본 발명의 PCR 프라이머를 설계하기 위한 예시적 표적 영역에는 GSTP1의 전사 출발 위치로부터 M24485(Genbank)의 게놈 위치설정 번호에 따라 대략 -71 내지 +59bp에 놓인 영역을 플랭킹하는 프라이머가 포함된다.
본 발명의 방법은 또한 핵산-함유 표본을 비메틸화된 사이토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계; 당해 표본 중 CpG-함유 핵산을 CpG-특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 메틸화된 핵산을 탐지하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 변형은 비메틸화 사이토신을 메틸화 사이토신으로부터 비메틸화 사이토신을 식별하게 될 다른 뉴클레오타이드로 전환시키는 것이다. 바람직하게는, 당해 제제는 비메틸화 사이토신을 우라실로 변형하며, 중아황산나트 륨이지만, 비메틸화 사이토신은 변형시키지만, 메틸화 사이토신은 변형시키지 않는 기타 제제도 또한 사용할 수 있다. 중아황산나트륨(NaHSO3) 변형이 가장 바람직하며 사이토신의 5,6-이중 결합과 용이하게 반응하지만, 메틸화 사이토신과의 반응은 불량하다. 사이토신은 중아황산 이온과 반응하여 탈아미노화에 감수성이 있는 설폰화된 사이토신 반응 중간체를 형성하여, 설폰화 우라실을 생성시킨다. 설폰화 그룹은 알칼리성 조건 하에 제거되어, 우라실을 형성시킬 수 있다. 우라실은 Taq 중합효소에 의해 티민으로 인식되며, 따라서 PCR에 따라, 수득된 생성물은 사이토신을 오직 5-메틸사이토신이 출발 주형에서 발생하는 위치에만 포함한다. 스콜피온 리포터 및 시약 및 기타 탐지 시스템은 유사하게 이러한 방식으로 처리한 비변형 표본으로부터 변형 표본을 식별해 낸다.
변형(예를 들면, 중아황산염을 사용) 후, 표본 중 CpG-함유 핵산의 증폭을 위해 본 발명에 사용한 프라이머는 특이적으로 비처리 DNA, 메틸화 및 비메틸화 DNA를 식별한다. 메틸화 특이적 PCR(MSPCR)에서, 비-메틸화 DNA에 대한 프라이머 또는 프라이밍 서열은 바람직하게는 3' CG 쌍 중에 T를 보유하여 메틸화 DNA에 보존된 C로부터 이를 식별하게 하며, 상보체는 안티센스(antisense) 프라이머에 대하여 설계한다. 비-메틸화된 DNA에 대한 MSP 프라이머 또는 프라이밍 서열은 일반적으로 서열에 상대적으로 적은 C 또는 G를 포함하는데, 이는 C가 센스 프라이머에 부재할 것이며, G는 안티센스 프라이머에 부재할 것이기 때문이다(C는 증폭 생성물에서 T(티미딘)으로 증폭되는 U(우라실)로 변형된다).
본 발명의 프라이머는 다형성 유전자좌(polymorphic locus)에서 유의적인 수 의 핵산의 중합화의 특이적 개시를 제공하기에 충분한 길이 및 적합한 서열의 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브 또는 리포터에 노출시키는 경우, 본 발명의 프라이머에 의해 증폭되는 서열은 메틸화 상태 및 이에 따른 진단 정보를 나타낸다. 이들은 선행 기술의 것보다 더 민감하며 특이적이다.
본 발명의 프라이머는 가장 바람직하게는 프라이머 신장 생성물의 합성을 개시할 수 있는 8개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다형성 유전자좌 나선에 실질적으로 상보적이다. 합성에 도움이 되는 환경 조건은 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 중합효소와 같은 중합화를 위한 제제의 존재, 및 적합한 온도 및 pH를 포함한다. 프라이머 또는 프라이밍 서열의 프라이밍 단편은 증폭의 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일가닥이지만, 이중가닥일 수도 있다. 이중가닥인 경우, 신장 생성물을 제조하는 데 사용하기 전에 프라이머를 우선 처리하여 이의 가닥을 분리한다. 당해 프라이머는 중합화를 위한 유도 제제의 존재하에 신장 생성물의 합성을 프라이밍하는 데 충분한 길이여야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 완충액 및 뉴클레오타이드 조성물과 같은 인자에 따를 것이다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 바람직하게는 널리 공지된 설계 지침 또는 규칙에 따라 이들이 더 많거나 적은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있더라도, 가장 바람직하게는 약 12개 내지 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 프라이머는 증폭시킬 게놈 유전자좌의 각각의 가닥에 실질적으로 상보적이 되도록, 그리고 상기한 바와 같이 적합한 G 또는 C 뉴클레오타이드를 포함하도록 설계한다. 이는 당해 프라이머가 중합화를 위한 제제가 작용케 하는 조 건 하에 이들의 각각의 가닥에 하이브리드화하기에 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 즉, 당해 프라이머는 하이브리드화 및 게놈 유전자좌의 증폭을 가능케 하는 5' 및 3' 플랭킹 서열(들)과의 충분한 상보성을 가져야 한다.
본 발명의 프라이머를 증폭 과정에 사용한다. 즉, 반응 단계의 수에 비하여 보다 많은 양의 표적 유전자좌를 제조하는 반응(바람직하게는, 효소 연쇄 반응)이 포함된다. 가장 바람직한 양태에서, 당해 반응은 기하급수적으로 많은 양의 표적 유전자좌를 제조한다. 이와 같은 반응에는 PCR 반응이 포함된다. 통상적으로, 한 프라이머는 유전자좌의 음(-)의 가닥과 상보적이며, 다른 프라이머는 양(+)의 가닥과 상보적이다. 프라이머를 변성 핵산에 어닐링(annealing)한 후 DNA 중합효소 I (Klenow)의 큰 단편과 같은 효소 및 뉴클레오타이드를 사용하여 신장시켜 표적 유전자좌 서열을 포함하는 신규히 합성된 + 및 - 가닥을 수득한다. 당해 연쇄 반응의 생성물은 사용한 특이적 프라이머의 말미에 상응하는 말단을 갖는 불연속 핵산 이중체(duplex)이다.
본 발명의 프라이머는 임의의 적합한 방법, 예를 들면 자동화 방법을 포함하는 통상적인 포스포트리에스테르 및 포스포다이에스테르 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 자동화 양태에서, 다이에틸포스포르아미디트를 출발 물질로 사용하여 저자 Beaucage 등(문헌[참조: Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981])에 의해 기술된 방법과 같이 합성할 수 있다. 변형된 고형 지지체 상에 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법이 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다.
표적 유전자좌(예를 들면, CpG)를 포함하는 특이적 핵산 서열을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 경우, 정제되거나 비-정제된 형태의 임의의 핵산 표본을 출발 핵산(들)으로 사용할 수 있다. 따라서, 당해 과정은 예를 들면, DNA 또는 RNA(전령 RNA를 포함하는)를 사용할 수 있다. DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. RNA를 주형으로 사용하는 경우, 당해 주형을 DNA로 역전사하기 위한 효소 및/또는 조건을 사용하게 될 것이다. 추가로, 각각의 하나의 가닥을 포함하는 DNA-RNA 하이브리드를 사용할 수 있다. 또한 핵산의 혼합물을 사용할 수 있거나, 동일하거나 상이한 프라이머를 사용하는, 본원의 사전 증폭 반응에서 제조된 핵산을 이와 같이 사용할 수 있다. 증폭시킬 특이적 핵산 서열, 즉, 표적 유전자좌는 대분자의 분획일 수 있거나 초기에 별개의 분자로 존재할 수 있어 특이적 서열이 전체 핵산을 구성하게 한다.
메틸화 CpG의 탐지를 위해 사용된 핵산-포함 표본은 조직(특히, 전립선 조직 및 림프 조직), 혈액, 림프, 뇨 및 정액과 같은 임의의 출처로부터의 것일 수 있으며, 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp 280, 281, 1982)]에 기술된 바와 같은 각종 기법에 의해 추출될 수 있다.
추출된 샘플이 불순할 경우, 증폭하기 전 당해 샘플의 세포, 체액, 조직 또는 동물 세포막을 개방하고, 핵산(들)의 가닥(들)을 노출 및/또는 분리하는데 효과적인 다량의 시약으로 처리할 수 있다. 가닥을 노출 및 분리하기 위한 이러한 용해 및 핵산 변성 단계는 증폭이 훨씬 더 용이하게 발생하게 할 것이다.
당해 샘플의 표적 핵산 서열이 2개의 가닥을 포함하는 경우, 이를 주형으로 사용하기 전에 핵산의 가닥을 분리하는 것이 필요하다. 가닥 분리는 분리 단계로 서 또는 프라이머 신장 생성물의 합성과 동시에 영향을 받을 수 있다. 이러한 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 방법을 포함하는, 각종 적합한 변성 조건을 사용하여 수행할 수 있다. 한가지 물리적 핵산 가닥 분리 방법은 핵산이 변성될 때까지 가열함을 포함한다. 통상적인 가열 변성은 최대 10분 동안의 약 80℃ 내지 105℃의 범위의 온도를 포함할 수 있다. 가닥 분리는 또한 헬리카제로 공지된 효소 부류 중의 효소 또는 헬리카제 활성을 갖는 효소 RecA에 의하여 유도될 수 있으며, 리보ATP의 존재 하에 DNA를 변성하는 것으로 공지되어 있다. 헬리카제를 사용한 핵산의 가닥 분리에 적합한 반응 조건이 문헌[참조: Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978)]에 기술되어 있다. RecA를 사용하는 기법은 문헌[참조: C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982)]에 개관되어 있다. 또한 이들 기법의 정묘함이 현재 널리 공지되어 있다.
핵산(들)의 상보적 가닥이 분리된 경우, 핵산이 원래 이중가닥이었는지 단일가닥이었는지의 여부와 관계없이, 분리된 가닥은 추가의 핵산 가닥의 합성을 위한 주형으로 언제든 사용할 수 있다. 당해 합성은 프라이머와 주형의 하이브리드화가 발생케 하는 조건 하에 수행한다. 일반적으로 합성은 바람직하게는 pH 7-9, 가장 바람직하게는 약 8의 완충 수성 용액에서 발생한다. 바람직하게는 몰 초과량(게놈 핵산에 대하여, 일반적으로 약 108:1, 프라이머:주형)의 2가지의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 분리된 주형 가닥을 함유하는 완충액에 첨가한다. 본 발명의 방법이 진단 적용을 위해 사용되는 경우, 상보적 가닥의 양이 공지되어 있지 않을 수 있으며, 따라서, 상보적 가닥의 양에 비한 프라이머의 양을 항상 확실성을 가지고 결정할 수는 없다. 그러나, 실행 상의 문제로서, 증폭시킬 서열이 복잡한 장쇄 핵산 가닥의 혼합물에 포함된 경우, 첨가할 프라이머의 양은 일반적으로 상보적 가닥(주형)의 양 이상의 몰 초과량이 될 것이다. 몰 초과량이 큰 것이 당해 방법의 효율성 개선에 바람직하다.
데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 개별적으로 또는 프라이머와 함께 적합한 양으로 합성 혼합물에 첨가하고, 수득된 용액은 약 90 내지 100℃로 10분 이하, 바람직하게는 1분 내지 4분 동안 가열한다. 이러한 가열 기간 후, 용액을 프라이머 하이브리드화에 바람직한 실온으로 냉각시킨다. 냉각된 혼합물에 프라이머 신장 반응에 영향을 주기에 적합한 제제("중합화용 제제")를 첨가하고, 당해 반응을 당해 분야에 공지된 조건 하에 발생시킨다. 또한 중합화용 제제를 다른 시약(내열성인 경우)과 함께 첨가할 수 있다. 당해 합성(또는 중합화) 반응은 실온 내지 중합화용 제제가 더 이상 작용하지 않는 온도 이하의 온도에서 발생시킬 수 있다.
중합화용 제제는 프라이머 신장 생성물, 바람직하게는 효소의 합성을 수행하기 위해 작용하게 될 임의의 화합물 또는 시스템일 수 있다. 이러한 목적에 적합한 효소에는 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) DNA 중합효소 1, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편, T4 DNA 중합효소, 기타 사용가능한 DNA 중합효소, 중합효소 돌연변이 단백질, 역전사효소 및 열-안정성 효소를 포함하는 기타 효소(예를 들면, 변성을 유발하기에 충분히 상승시킨 온도에 적용한 후 프라이머 신장을 수행하는 이들 효소)가 포함된다. 바람직한 제제는 Taq 폴리머라제이다. 적합한 효소는 각각의 유전자좌 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물을 형성하기에 적합한 방식으로 당해 뉴클레오타이드의 결합을 촉진할 것이다. 일반적으로, 당해 합성은 각각의 프라이머의 3' 말단에서 개시될 것이며 합성이 종결될 때까지 주형 가닥을 따라 5' 방향으로 진행하여, 상이한 길이의 분자를 제조하게 될 것이다. 그러나, 상기한 바와 동일한 방법을 사용하여, 5' 말단에서 합성을 개시하고 다른 방향으로 진행하는 중합화용 제제가 있을 수 있다.
가장 바람직하게는 증폭 방법은 PCR에 의한 것이다. 또한 본 발명의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭된 메틸화 및 비-메틸화 유전자좌가 대안적인 방법에 의해 유사하게 증폭되는 한, 대안적인 증폭 방법을 사용할 수 있다.
증폭된 생성물은 바람직하게는 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있는, 발명자 Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같은 생성물에 특이적인 프로브 또는 리포터를 사용하여 메틸화 또는 비-메틸화된 것으로 동정한다. 폴리뉴클레오타이드를 탐지하기 위한 프로브 또는 리포터의 분야의 이점이 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 임의로, 당해 핵산의 메틸화 양상은 제한 효소 분해 및 서던 블롯(Southern blot) 분석과 같은 기타 기법에 의해 확증할 수 있다. 5'CpG 메틸화를 탐지하는 데 사용할 수 있는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 예로는 SmaI, SacII, EagI, MspI, HpaII, BstUI 및 BssHII이 포함된다.
본 발명의 가장 바람직한 방법은 메틸화 비율을 확정함을 포함한다. 이는 수득한 마커의 증폭된 메틸화 종의 양과 증폭된 참조 마커 또는 증폭된 비-메틸화된 마커 영역의 양 사이의 비율을 확정함으로써 수행할 수 있다. 이는 정량적 실 시간 PCR을 사용하여 가장 잘 수행된다. 확정된 또는 소정의 컷오프 또는 역치 이상의 비율은 과메틸화된 것으로 간주되며 암과 같은 증식성 장애(GSTP1의 경우 전립선 암)를 나타낸다. 컷오프는 당해 방법을 2세트 이상의 샘플(공지된 발병된 상태를 갖는 샘플 및 공지된 정상 상태를 갖는 샘플)에 대하여 사용하는 공지된 방법에 따라 확정된다. 본 발명의 참조 마커를 또한 내부 대조군으로 사용할 수 있다. 참조 마커는 바람직하게는 B 액틴과 같은 샘플이 세포 내에서 구성적(constitutive)으로 발현되는 유전자이다.
본 발명의 방법 및 키트는 복합용 단계 및 시약을 포함할 수 있다. 즉, 하나 이상의 마커를 한번에 검정할 수 있다.
당해 마커와 연관된 유전자의 감소한 전사 수준이 흔히 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 발현 제어 서열(예를 들면, 프로모터 서열)의 특정 요소의 과메틸화의 결과이기 때문에, 이들 서열과 정합(matching)되도록 제조한 프라이머를 제조하였다. 따라서, 본 발명은 마커의 발현 제어 또는 프로모터 영역 내의 특정 영역의 메틸화를 탐지함으로써 세포 증식성 장애를 탐지 또는 진단하는 방법을 제공한다. 이들 영역의 메틸화를 검출하는 데 유용한 프로브는 이러한 진단 또는 예측 방법에 유용하다. 마커의 탐지를 위한 바람직한 분자가 아래에 나타내어져 있다. 마커 유전자에 대한 약칭이 사용한 탐지 시스템의 유형과 함께 괄호 안에 나타내어져 있다. 안티센스는 단지 연관된 쌍의 다른 일원의 프라이밍 서열에 대한 관계를 나타내는 프라이머의 방향을 지칭한다. 게놈 DNA에 관한 안티센스는 필수적이지는 않다.
Figure 112006066895611-PAT00001
Figure 112006066895611-PAT00002
Figure 112006066895611-PAT00003
BHQ=블랙홀 컨처(Black Hole Quencher)(제조사[BioSearch Technologies], 캘리포니아주 샌프랜시스코 소재)
HEG=헥사에틸렌 글라이콜
본 발명의 키트는 이들이 본 발명의 하나 이상의 프라이머 또는 프로브 또는 탐지 분자(예를 들면, 스콜피온(Scorpion) 리포터)를 포함하는 경우, 각종 성분으로 구성될 수 있다. 한 양태에서, 당해 키트는 과메틸화된 마커 단편의 증폭 및 탐지용 시약을 포함한다. 임의로, 당해 키트는 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 샘플 제조 시약 및/또는 물품(예를 들면, 튜브)을 포함한다.
바람직한 키트에는, 상응하는 PCR 프라이머 세트, 내열성 DNA 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소) 및 적합한 탐지 시약(들)(예를 들면, 가수분해 프로브 또는 분자 표지)과 같은 일관(one-tube) MSP에 필요한 시약이 포함되어 있다. 임의의 바람직한 키트에서, 탐지 시약은 스콜피온 리포터 또는 시약이다. 브롬화에티듐과 같은 이중 가닥 DNA에 특이적인 단일 염료 프라이머 또는 형광 염료를 또한 사용할 수 있다. 당해 프라이머는 바람직하게는 고농도를 산출하는 양이 바람직하다. 당해 키트 내의 부가적 물질에는 적합한 반응 튜브 또는 유리병, 장벽 조성물, 통상적으로는 왁스 비이드(임의로는 마그네슘을 포함하는); 필수 완충액 및 시약(예를 들면, dNTP); MSP 반응에 사용할 수 있는 대조군 핵산(들) 및/또는 임의의 부가적 완충액, 화합물, 보조-인자, 이온성 구성성분, 단백질 및 효소, 중합체 등이 포함될 수 있다. 임의로, 당해 키트는 핵산 추출 시약 및 물질을 포함한다.
실시예
실시예 1: 비교
가수분해 프로브 검정은 문헌의 프라이머 및 프로브를 토대로 하여 설계하였고 임상적으로 국소화된 질환을 가진 환자에서 전립선 암을 탐지하기 위한 정량적 검정에 관한 것이다. 당해 검정은 신생물성 전립선 조직과 비-신생물성 전립선 조직을 식별하기 위해 사용된 핵심 CpG 프로모터 영역을 포함한다.
당해 설계에 대해 시험한 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열은 다음과 같았다:
정방향 프라이머 GSTP1;(-192)MU17 AGTTGCGCGGCGATTTC (서열 번호 65)
역방향 프라이머 GSTP1;(-74)ML22 GCCCCAATACTAAATCACGACG (서열 번호 20)
프로브 (5'FAM/3'TAMRA)GSTP1;(-152)MP23 CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG (서열 번호 66)
GSTP1 메틸화 수준을 양성 전립선 비대증(BPH)으로부터의 12개의 샘플, 임상적으로 국소화된 전립선 선암종(종양)으로부터의 12개의 샘플, 및 2개의 정상 샘플에서 분석하였다. 데이타는 탐지된 GSTP1의 총 복사체로 제시되어 있으며, 도 1에 나타내어져 있다. 당해 검정은 컷오프가 양성 샘플에 의해 나타난 최고 복사체 수로 설정된 경우, 전립선 선암종의 탐지에 대하여 75% 민감성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 양성 전립선 비대증 및 임상적으로 국지화된 전립선 선암종을 나타내는 전립선 조직 내의 GSTP1 메틸화 수준의 중간 정도의 분포는 다른 마커와는 상보적이지 않은 임상적으로 관련되지 않을 검정을 제시한다.
실시예 2 (본 발명에 따른 가수분해 프로브 검정)
MSP 프라이머 및 프로브를 GSTP1 검정에 대한 민감성 및 특이성을 추가로 개선하도록 설계하였고 실시예 1에서와 동일한 샘플 세트로 검사하였다. 당해 설계물은 추가로 CpG 섬의 하류에 위치해 있고 코어 프로모터 및 엑손 1의 부분을 포함하였다. 당해 실시예에 대하여 시험한 당해 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열은 다음과 같다:
정방향 프라이머: (-71)MU29 CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC (서열 번호 23)
역방향 프라이머: (+59)ML25 ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA (서열 번호 24)
프로브 (5'FAM/3' TAMRA)GSTP1;(-23)MP26
TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA (서열 번호 25)
데이타는 탐지된 GSTP1의 총 복사체로 제시되어 있으며, 도 2에 나타내어져 있다. 당해 검정은 컷오프가 양성 샘플에 의해 나타난 최고 복사체 수로 설정된 경우, 전립선 선암종의 탐지에 대한 100% 민감성 및 100% 특이성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
GSTP1의 1.5kb CPG 섬은 프로모터를 걸쳐 엑손 3에 까지 이르르며, 전체에 광범위하게 메틸화되는 것으로 밝혀졌다. 2개의 전사 결합 위치 AP1 및 Sp1은 엑손 1의 바로 상류에 위치하며 Sp1 내의 고함량의 CpG 때문에 당해 실시예에 사용된 프로브 및 프라이머의 설계의 초점이었다. 이는 염색질 응축 및 유전자 침묵(silencing)을 유도하기 위한 전사 인자와 AP1 및 Sp1 부위에 결합한 메틸-CpG 결합 단백질 사이의 경쟁 때문에 검정 설계에 대한 우수한 영역인 것으로 입증되었다.
실시예 3: 스콜피온 MSP
다음의 마커 및 참조 마커에 대한 스콜피온 시약을 설계하였다.
서열 번호 19, 20 (GSTP1)
서열 번호 38, 39 (액틴)
서열 번호 28, 29 (RARB2)
서열 번호 30, 31 (RASSF1A)
서열 번호 32, 33 (TIMP3)
서열 번호 34, 35 (APC)
서열 번호 50, 51 (PTGS2)
서열 번호 52, 53 (14-3-3 시그마)
당해 설계물을 올리고6 프라이머 설계 소프트웨어(제조사[Molecular Biology Insights], 미국 콜로라도주 캐스케이드 소재) 및 Visual OMP(제조사[DNA Software, Inc.], 미국 마이애미주 서부 워싱턴 스트리트 앤 아보르 120½ 소재)를 사용하여 2차 구조 및 부적합한 이량체화에 대하여 검사하였다. 스콜피온 폴딩(folding) 및 앰플리콘 프로빙(probing)은 DNA mfold 프로그램 (http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi) 및 Visual OMP(제조사[DNA Software, Inc.], 미국 마이애미주 서부 워싱턴 스트리트 앤 아보르 120½ 소재)를 사용하여 모형화하였다. 스콜피온 및 프라이머를 표준 포스포르아미디트 화학물질(제조사[Scandinavian Gene Synthesis AB], 스웨덴 코핑 소재) 및 Biosearch Technologies(제조사[Novato], 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 자동화 DNA 합성기에서 합성하였다.
실시예 4 스콜피온 시약 검사:
실시예 2에 기술된 시약을 각종 사람 DNA 샘플에 대하여 검사하였다. 이들 샘플은 각각 양성 및 음성 주형으로서 시판되는 메틸화된(모든 구아닌 앞의 사이토신은 5번 위치에서 메틸화된다) 및 비메틸화된 사람 게놈 DNA(제조사[Chemicon], 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재)를 포함하였다. GSTP1 메틸화에 대한 양성 및 음성 대조군으로서 사람 유방암 세포주, MCF-7 및 직장결장암 세포주, HCT116으로부터의 게놈 DNA를 또한 사용하였다(수탁기관[American Type Culture Collection], 미국 버지니아주 마나사스 소재).
시판되는 중아황산나트륨 전환 시약 키트(제조사[Zymo Research], 미국 캘리포니아주 오렌지 소재)를 사용하여 게놈 DNA를 변형시켰다. 이러한 처리는 비메틸화된 DNA 내의 모든 사이토신을 우라실로 전환시킨 반면, 메틸화된 DNA에서는 구아닌 앞에 있지 않은 사이토신만 우라실로 전환시켰다. 구아닌 앞의 모든 사이토신(CpG 다이뉴클레티드에서)은 사이토신으로 남아있었다.
중아황산나트륨 변형 게놈 DNA(100 - 150ng)을 다음의 성분을 함유하는 반응물 25㎕에서 증폭시켰다: 67mM 트리스 pH 8.8, 16.6mM (NH4)2SO4, 6.7mM MgCl2, 10mM 베타 머캅토에탄올; 1.25mM 각각의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1U 고온 출발 Taq DNA 중합효소, 250nM 스콜피온 프로브, 250nM 역방향 또는 정방향 프라이머(스콜피온 설계에 따라), 수동 표준 염료, ROX 625nM(ABI7900 수행만의 경우).
이어서 당해 샘플을 ABI 7900HT 서열 탐지 시스템 및/또는 Cepheid SmartCyclerR PCR 기구 상에서 정량적 실시간 PCR 검정으로 검사하였다.
사용한 PCR 조건은 다음과 같았다.
ABI7900 수행의 경우:
95℃에서 5분; 이후 95℃에서 30초, 59℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 40회; 및 72℃에서 5분 동안 최종 신장. 59℃에서 매 회마다 광학 데이타를 수집하였다.
세필드 스마트 사이클러(Cepheid smart cycler) 수행의 경우:
95℃에서 60초; 이후 95℃에서 30초, 59℃에서 30초; 및 72℃에서 5분 동안 최종 신장의 40회. 59℃에서 매 회마다 광학 데이타를 수집하였다.
스콜피온 시약은 CSTP1 시약의 경우 91.2%, 액틴 시약의 경우 95.2%의 PCR 효율을 나타내었다. 평균 Ct 수치는 다음과 같았다:
GSTP1 28
B 액틴 30
APC 29
TIMP3 30
RASSF1A 29
RARB2 29
PTGS2 33
14-3-3 S 32
실시예 5: 분자 표지(beacon)와의 비교
분자 표지는 실시예 1에 기술한 유전자의 일부에 따라 GSTP1 과메틸화를 탐 지하기 위해 수득하였다. 당해 표지를 실시예 2에 기술한 바와 같은 샘플을 포함하는 PCR 반응에 적용하였다. 각각의 경우에, B 액틴을 동시 증폭시켜 메틸화율을 도출할 수 있었다. GSTP1 및 B-액틴 스콜피온 프로브-프라이머 세트 둘 다 메틸화된 GSTP1 DNA 및 비메틸화된 B 액틴 DNA의 탐지를 잘 수행하는 것으로 나타났다. 설계된 스콜피온 세트에 대한 Ct 역치 수치는 분자 표지 프로브에 대한 수치보다 1.5Ct 이상이었다(표지에 대한 평균 Ct 28.82 대 스콜피온 리포터에 대한 27.30). 결과는 다음과 같았다:
전체적으로 메틸화된 DNA, ng 500 250 100 50 10 5
스콜피온(GSTP1/B액틴 복사체# 비율) 272 310 285 296 339 288
분자 표지(GSTP1/B액틴 복사체# 비율) 759 735 758 767 797 814
실시예 6 메틸화 비율 컷오프
이어서 공지된 임상 질환을 가진 환자로부터의 전립선 조직 샘플을 실시예 2에 기술한 바와 같이 PCR에 적용하였다. 메틸화 비율을 계산하였고 아래에 나타내어져 있다. 다음의 과정을 사용하여 데이타를 분석하였다. 알고리즘을 사용하기 전, 전제조건은 다음과 같았다.
액틴의 경우: 2회 반복 실험 둘 다에 대하여 CT 수치 < 40(실시간 PCR 장치에 의해 정해짐)
"메틸화된" GSTP1 결과의 경우: 2회 반복 실험 둘 다에 대하여 CT 수치 < 40(실시간 PCR 장치에 의해 정해짐)
-4 이상의 표준 곡선 둘 다의 경사(PCR 효율 > 80%)
R2: 0.99, 표준 곡선 상의 4개의 관련 데이타 점
양성 검정 대조군은 양성 결과를 산출해야만 한다
무(無)-주형 대조군(표준 곡선)에 통상적으로 포함되는 것은 음성이어야 한다
전제조건이 충족된 경우, 표준 곡선을 토대로 하여 각각의 유전자(GSTP1 및 액틴)에 대하여 복사체 수를 계산하였고, 다음의 공식: (GSTP1 복사체 수/β-액틴 복사체 수) * 1000을 사용하여 각각의 샘플(양성 대조군을 포함)에 대하여 비율을 계산하였다. 이어서 고도의 특이성 및 고도의 민감성을 내는 비율을 사용하여 컷오프를 확정하였다. 142개의 포르말린 고정 파라핀 매몰된 전립선 조직에 대하여 87%의 민감성 및 100%의 특이성을 제공하기 위한 GSTP1에 대한 컷오프는 10이었다. 산출된 비율을 사용하여 다음의 기준을 사용하여 제공된 샘플의 메틸화 상태를 결정하였다.
결과 복사체# (mGSTP1) 복사체#(B-액틴) 비율 x 1000
메틸화된 GSTP1 >2 >2 >10
비메틸화된 GSTP1 임의 >200 <10
미결정 <2 <200
당해 분야의 숙련가는 컷오프를 바람직하게는 이들을 사용할 목적(예를 들면, 스크리닝, 치료요법 모니터, 모호한 진단의 반사 검사)에 적합한 민감성 및 특이성 수치를 설정하도록 조정할 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 7 조합 마커 (예언적)
다음의 조합을 위한 스콜피온 시약을 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한다: GSTP1 마커 및 RARβ2, GSTP1 및 APC, 및 GSTP1 및 PTGS2. 당해 마커는 공지된 질환(즉, 정상, 양성 비대증, 전립선 암)을 갖는 50개의 전립선 조직 샘플의 반복적 수행을 사용하여 실시예 2에 따라 복합 PCR로서 조합하여 수행한다.
마커/들 서열 번호 민감성 특이성
GSTP1 + RARβ2 90% 100%
GSTP1 + APC 96.2% 92.9
GSTP1 + PTGS2 96.2 100
본 발명에 따르는 GSTP1 메틸화에 대한 개선된 감수성 및 특이성을 갖는 프라이머 및 프로브를 사용하여 각종 유전자의 메틸화 상태를 탐지하고, 궁극적으로 전립선 암과 같은 의심되는 증식성 장애를 진단 및 예측할 수 있다.
<110> Veridex, LLC <120> Detecting gene methylation <130> VDX5027USNP <150> US 60/717790 <151> 2005-09-15 <160> 66 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 Scorpion <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> -BHQ-HEG- <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> -BHQ (Black Hole Quencher) -HEG (Hexaethylglycol) - <400> 1 ccccgaacgt cgaccgctcg gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 Scorpion Antisense Primer <400> 2 aaaatcccgc gaactcccgc c 21 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 Scorpion <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> -BHQ-HEG- <400> 3 cccgaacgtc gaccgctttc gggcgatttc ggggatttta gggcgt 46 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 Scorpion Antisense Primer <400> 4 aaaatcccgc gaactcccgc c 21 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 Scorpion <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> -BHQ-HEG- 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acgggggtgt ctcaggggct gggagggatg 3480 agagtaggat gatacatggt ggtgtctggc aggaggcggg caaggatgac tatgtgaagg 3540 cactgcccgg gcaactgaag ccttttgaga ccctgctgtc ccagaaccag ggaggcaaga 3600 ccttcattgt gggagaccag gtgagcatct ggccccatgc tgttccttcc tcgccaccct 3660 ctgcttccag atggacacag gtgtgagcca tttgtttagc aaagcagagc agacctaggg 3720 gatgggctta ggccctctgc ccccaattcc tccagcctgc tcccgctggc tgagtcccta 3780 gcccccctgc cctgcagatc tccttcgctg actacaacct gctggacttg ctgctgatcc 3840 atgaggtcct agcccctggc tgcctggatg cgttccccct gctctcagca tatgtggggc 3900 gcctcagtgc ccggcccaag ctcaaggcct tcctggcctc ccctgagtac gtgaacctcc 3960 ccatcaatgg caacgggaaa cagtgagggt tggggggact ctgagcggga ggcagagttt 4020 gccttccttt ctccaggacc aataaaattt ctaagagagc tactatgagc actgtgtttc 4080 ctgggacggg gcttaggggt tctcagcctc gaggtcggtg ggagggcaga gcagaggact 4140 agaaaacagc tcctccagca cagtcagtgg cttcctggag ccctcagcct ggctgtgttt 4200 actgaacctc acaaactaga agaggaagaa aaaaaaagag agagagaaac aaagagaaat 4260 <210> 55 <211> 2011 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> B-Actin >gi|28337|emb|Y00474.1|HSACTBPR Human beta-actin gene 5'-flanking region, CpG Island 1656 to 1955 <400> 55 gagctctgtc tcttggccag ctgaatggag gcccagcggc aacacaggtc ctgcctgggg 60 atcaggtctg ctctgcaccc caccttgctg cctggagccg cccacctgac aacctctcat 120 ccctgctctg tagatccggt cccatcccca ctgcccaccc caccccccca gcactccacc 180 cagttcaacg ttccacgaac ccccagaacc agccctcatc aacaggcagc aagaagggcc 240 ccccgcccat cgccccacaa cgccagccgg gtgaactgta gcgttggcag gtcctgaggc 300 agctgaaaga tacaaggcca gggacaggac agtcccatcc ccaggaggca gggagtatac 360 aggctgggga agtttgccct tgcgtggggt ggtgatggag gaggctcagc aagtcttctg 420 gactgtgaac ctgtgtctgc cactgtgtgc tgggtggtgg tcatctttcc caccaggctg 480 tggcctctgc aaccttcaag ggaggagcag gtcccattgg ctgagcacag ccttgtacgt 540 gaactgaaca agcagcctcc ttcctggcca caggttccat gtccttatat ggactcatct 600 ttgcctattg cgacacacac tcaatgaaca cctactacgc gctgcaaaga gccccgcagg 660 cctgaggtgc ccccacctca ccactcttcc tatttttgtg taaaaatcca gcttcttgtc 720 accacctcca aggaggggga ggaggaggaa ggcaggttcc tctaggctga gccgaatgcc 780 cctctgtggt cccacgccac tgatcgctgc atgcccacca cctgggtaca cacagtctgt 840 gattcccgga gcagaacgga ccctgcccac ccggtcttgt gtgctactca gtggacagac 900 ccaaggcaag aaagggtgac aaggacaggg tcttcccagg ctggctttga gttcctagca 960 ccgccccgcc cccaatcctc tgtggcacat ggagtcttgg tccccagagt cccccagcgg 1020 cctccagatg gtctgggagg gcagttcagc tgtggctgcg catagcagac atacaacgga 1080 cggtgggccc agacccaggc tgtgtagacc cagccccccc gccccgcagt gcctaggtca 1140 cccactaacg ccccaggcct ggtcttggct gggcgtgact gttaccctca aaagcaggca 1200 gctccagggt aaaaggtgcc ctgccctgta gagcccactt ccttcccagg gctgcggctg 1260 ggtaggtttg tagccttcat cacgggccac ctccagccac tggaccgctg gcccctgccc 1320 tgtcctgggg agtgtggtcc tgcgactcta atggccgcaa gccacctgac tcccccaaca 1380 ccacactcta cctctcaagc ccaggtctct ccctagtgac ccacccagca catttagcta 1440 gctgagcccc acagccagag gtcctcaggc cctgctttca gggcagttgc tctgaagtcg 1500 gcaaggggga gtgactgcct ggccactcca tgccctccaa gagctccttc tgcaggagcg 1560 tacagaaccc agggccctgg cacccgtgca gaccctggcc caccccacct gggcgctcag 1620 tgcccaagag atgtccacac ctaggatgtc ccgcggtggg tggggggccc gagagacggg 1680 caggccgggg gcaggcctgg ccatgcgggg ccgaaccggg cactgcccag cgtggggcgc 1740 gggggccacg gcgcgcgccc ccagcccccg ggcccagcac cccaaggcgg ccaacgccaa 1800 aactctccct cctcctcttc ctcaatctcg ctctcgctct tttttttttt cgcaaaagga 1860 ggggagaggg ggtaaaaaaa tgctgcactg tcggcgaagc cggtgagtga gcggcgcggg 1920 gccaatcgcg tgcgccgttc cgaaagttgc cttttatggc tcgagcggcc gcggcggcgc 1980 cctataaaac ccagcggcgc gacgcgccac c 2011 <210> 56 <211> 1792 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|5016088|ref|NM_001101.2| Homo sapiens actin, beta (ACTB), mRNA <400> 56 cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60 ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat 120 gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg 180 gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga 240 cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt 300 caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt 360 ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg 420 cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat 480 ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg 540 tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct 600 gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg 660 cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct 720 gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct 780 ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg 840 ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga 900 aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa 960 cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1020 gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1080 gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1140 gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1200 ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1260 acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1320 tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1380 gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1440 ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1500 ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1560 tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1620 acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1680 gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1740 agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tt 1792 <210> 57 <211> 2762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RARB2 >gi|14916495|ref|NM_016152.2| Homo sapiens retinoic acid receptor, beta (RARB), transcript variant 2, mRNA <400> 57 gtgacagaag tagtaggaag tgagctgttc agaggcagga gggtctattc tttgccaaag 60 gggggaccag aattccccat gcgagctgtt tgaggactgg gatgccgaga acgcgagcga 120 tccgagcagg gtttgtctgg gcaccgtcgg ggtaggatcc ggaacgcatt cggaaggctt 180 tttgcaagca tttacttgga aggagaactt gggatctttc tgggaacccc ccgccccggc 240 tggattggcc gagcaagcct ggaaaatgca attgaaacac agagcaccag ctctgaggaa 300 ctcgtcccaa gccccccatc tccacttcct ccccctcgag tgtacaaacc ctgcttcgtc 360 tgccaggaca aatcatcagg gtaccactat ggggtcagcg cctgtgaggg atgtaagggc 420 tttttccgca gaagtattca gaagaatatg atttacactt gtcaccgaga taagaactgt 480 gttattaata aagtcaccag gaatcgatgc caatactgtc gactccagaa gtgctttgaa 540 gtgggaatgt ccaaagaatc tgtcaggaat gacaggaaca agaaaaagaa ggagacttcg 600 aagcaagaat gcacagagag ctatgaaatg acagctgagt tggacgatct cacagagaag 660 atccgaaaag ctcaccagga aactttccct tcactctgcc agctgggtaa atacaccacg 720 aattccagtg ctgaccatcg agtccgactg gacctgggcc tctgggacaa attcagtgaa 780 ctggccacca agtgcattat taagatcgtg gagtttgcta aacgtctgcc tggtttcact 840 ggcttgacca tcgcagacca aattaccctg ctgaaggccg cctgcctgga catcctgatt 900 cttagaattt gcaccaggta taccccagaa caagacacca tgactttctc agacggcctt 960 accctaaatc gaactcagat gcacaatgct ggatttggtc ctctgactga ccttgtgttc 1020 acctttgcca accagctcct gcctttggaa atggatgaca cagaaacagg ccttctcagt 1080 gccatctgct taatctgtgg agaccgccag gaccttgagg aaccgacaaa agtagataag 1140 ctacaagaac cattgctgga agcactaaaa atttatatca gaaaaagacg acccagcaag 1200 cctcacatgt ttccaaagat cttaatgaaa atcacagatc tccgtagcat cagtgctaaa 1260 ggtgcagagc gtgtaattac cttgaaaatg gaaattcctg gatcaatgcc acctctcatt 1320 caagaaatgc tggagaattc tgaaggacat gaacccttga ccccaagttc aagtgggaac 1380 acagcagagc acagtcctag catctcaccc agctcagtgg aaaacagtgg ggtcagtcag 1440 tcaccactcg tgcaataaga cattttctag ctacttcaaa cattccccag taccttcagt 1500 tccaggattt aaaatgcaag aaaaaacatt tttactgctg cttagttttt ggactgaaaa 1560 gatattaaaa ctcaagaagg accaagaagt tttcatatgt atcaatatat atactcctca 1620 ctgtgtaact tacctagaaa tacaaacttt tccaatttta aaaaatcagc catttcatgc 1680 aaccagaaac tagttaaaag cttctatttt cctctttgaa cactcaagat gcatggcaaa 1740 gacccagtca aaatgattta cccctggtta agtttctgaa gactttgtac atacagaagt 1800 atggctctgt tctttctata ctgtatgttt ggtgctttcc ttttgtcttg catactcaaa 1860 ataaccatga caccaaggtt atgaaataga ctactgtaca cgtctaccta ggttcaaaaa 1920 gataactgtc ttgctttcat ggaatagtca agacatcaag gtaaggaaac aggactattg 1980 acaggactat tgtacagtat gacaagataa ggctgaagat attctacttt agttagtatg 2040 gaagcttgtc tttgctcttt ctgatgctct caaactgcat cttttatttc atgttgccca 2100 gtaaaagtat acaaattccc tgcactagca gaagagaatt ctgtatcagt gtaactgcca 2160 gttcagttaa tcaaatgtca tttgttcaat tgttaatgtc actttaaatt aaaagtggtt 2220 tattacttgt ttaatgacat aactacacag ttagttaaaa aaaatttttt tacagtaatg 2280 atagcctcca aggcagaaac acttttcagt gttaagtttt tgtttacttg ttcacaagcc 2340 attagggaaa tttcatggga taattagcag gctggtctac cactggacca tgtaactcta 2400 gtgtccttcc tgattcatgc ctgatattgg gatttttttc cagcccttct tgatgccaag 2460 ggctaattat attacatccc aaagaaacag gcatagaatc tgcctccttt gaccttgttc 2520 aatcactatg aagcagagtg aaagctgtgg tagagtggtt aacagataca agtgtcagtt 2580 tcttagttct catttaagca ctactggaat tttttttttt gatatattag caagtctgtg 2640 atgtactttc actggctctg tttgtacatt gagattgttt gtttaacaat gctttctatg 2700 ttcatatact gtttaccttt ttccatggac tctcctggca aagaataaaa tatatttatt 2760 tt 2762 <210> 58 <211> 5487 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> TIMP3 >gi|21536431|ref|NM_000362.3| Homo sapiens tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory) (TIMP3), mRNA <400> 58 tctgtcgact tgccccagag ctgatccttg tctttgtcca cttctcagcg aggatggcac 60 ttcagggagc ccttccctta ctatcgcaga gagagcaggc cctccccagt catgtccaac 120 ccagaactct gttttgtttt cttcatagcc ctagcatcac agaaaatcac cctgtgcatt 180 catggatgtc cacgggggca agggctttgt gttgcttaac ccagcatcct gaaccgtgtt 240 tgttgaatga atacagaacc ccgtttgctc tgggagagca cagaaaacag tcttctatca 300 tatatcatag ccagctgcaa acagcagatg gcttcccata tcccagagag taagaaccag 360 agagagagag aaagagagag agtttgggtc tttctcctct gtgcctgctc tctccagaga 420 aactggaggg gtagcagtta gcattccccc gctggttcca ccaagcacag tcaaggtctc 480 taggacatgg ccacccctca cctgtggaag cggtcctgct ggggtgggtg ggtgttagtt 540 ggttctggtt tgggtcagag acacccagtg gcccaggtgg gcgtggggcc agggcgcaga 600 cgagaagggg cacgagggct ccgctccgag gacccagcgg caagcaccgg tcccgggcgc 660 gccccagccc acccactcgc gtgcccacgg cggcattatt ccctataagg atctgaacga 720 tccgggggcg gccccgcccc gttacccctt gcccccggcc ccgccccctt tttggagggc 780 cgatgaggta atgcggctct gccattggtc tgagggggcg ggccccaaca gcccgaggcg 840 gggtccccgg gggcccagcg ctatatcact cggccgccca ggcagcggcg cagagcgggc 900 agcaggcagg cggcgggcgc tcagacggct tctcctcctc ctcttgctcc tccagctcct 960 gctccttcgc cgggaggccg cccgccgagt cctgcgccag cgccgaggca gcctcgctgc 1020 gccccatccc gtcccgccgg gcactcggag ggcagcgcgc cggaggccaa ggttgccccg 1080 cacggcccgg cgggcgagcg agctcgggct gcagcagccc cgccggcggc gcgcacggca 1140 actttggaga ggcgagcagc agccccggca gcggcggcag cagcggcaat gaccccttgg 1200 ctcgggctca tcgtgctcct gggcagctgg agcctggggg actggggcgc cgaggcgtgc 1260 acatgctcgc ccagccaccc ccaggacgcc ttctgcaact ccgacatcgt gatccgggcc 1320 aaggtggtgg ggaagaagct ggtaaaggag gggcccttcg gcacgctggt ctacaccatc 1380 aagcagatga agatgtaccg aggcttcacc aagatgcccc atgtgcagta catccacacg 1440 gaagcttccg agagtctctg tggccttaag ctggaggtca acaagtacca gtacctgctg 1500 acaggtcgcg tctatgatgg caagatgtac acggggctgt gcaacttcgt ggagaggtgg 1560 gaccagctca ccctctccca gcgcaagggg ctgaactatc ggtatcacct gggttgtaac 1620 tgcaagatca agtcctgcta ctacctgcct tgctttgtga cttccaagaa cgagtgtctc 1680 tggaccgaca tgctctccaa tttcggttac cctggctacc agtccaaaca ctacgcctgc 1740 atccggcaga agggcggcta ctgcagctgg taccgaggat gggccccccc ggataaaagc 1800 atcatcaatg ccacagaccc ctgagcgcca gaccctgccc cacctcactt ccctcccttc 1860 ccgctgagct tcccttggac actaactctt cccagatgat gacaatgaaa ttagtgcctg 1920 ttttcttgca aatttagcac ttggaacatt taaagaaagg tctatgctgt catatggggt 1980 ttattgggaa ctatcctcct ggccccaccc tgccccttct ttttggtttt gacatcattc 2040 atttccacct gggaatttct ggtgccatgc cagaaagaat gaggaacctg tattcctctt 2100 cttcgtgata atataatctc tattttttta ggaaaacaaa aatgaaaaac tactccattt 2160 gaggattgta attcccaccc ctcttgcttc ttccccacct caccatctcc cagaccctct 2220 tccctttgcc cttctcctcc aatacataaa ggacacagac aaggaacttg ctgaaaggcc 2280 aaccatttca ggatcagtca aaggcagcaa gcagatagac tcaaggtgtg tgaaagatgt 2340 tatacaccag gagctgccac tgcatgtccc aaccagactg tgtctgtctg tgtctgcatg 2400 taagagtgag ggagggaagg aaggaactac aagagagtcg gagatgatgc agcacacaca 2460 caattcccca gcccagtgat gcttgtgttg accagatgtt cctgagtctg gagcaagcac 2520 ccaggccaga ataacagagc tttcttagtt ggtgaagact taaacatctg cctgaggtca 2580 ggaggcaatt tgcctgcctt gtacaaaagc tcaggtgaaa gactgagatg aatgtctttc 2640 ctctccctgc ctcccaccag acttcctcct ggaaaacgct ttggtagatt tggccaggag 2700 ctttctttta tgtaaattgg ataaatacac acaccataca ctatccacag atatagccaa 2760 gtagatttgg gtagaggata ctatttccag aatagtgttt agctcaccta gggggatatg 2820 tttgtataca catttgcata tacccacatg gggacataag ctaatttttt tacaggacac 2880 agaattctgt tcaatgctgt taaatatgcc aatagtttaa tctcttctat tttgttgtcg 2940 ttgcttgttt gaagaaaatc atgacattcc aagttgacat ttttttttca ttttaattaa 3000 aatttgaaat tctgaacacc gtcagcaccc tctcttccct atcatgggtc atctgacccc 3060 tgtccgtctc cttgtccctg cttcatgttt gggggccttt ctttaactgc cttcctggct 3120 tagctcagat ggcagatgag agtgtagtca agggcctggg cacaggaggg agagctgcag 3180 agtgtcctgc ctgccttggc tggagggaca cctctcctgg gtgtggagac agcttggttc 3240 cctttcccta gctccctggt gggtgaatgc cacctcctga gatcctcacc tcttggaatt 3300 aaaattgttg gtcactgggg aaagcctgag tttgcaacca gttgtagggt ttctgttgtg 3360 tttttttttt tttttttgaa ataaaactat aatataaatt ctcctattaa ataaaattat 3420 tttaagtttt agtgtcaaaa gtgagatgct gagagtaggt gataatgtat attttacaga 3480 gtgggggttg gcaggatggt gacattgaac atgattgctc tctgtctctt ttttcagctt 3540 atgggtattt atcttctatt agtatttgta tcttcagttc attccacttt aggaaacaga 3600 gctgccaatt gaaacagaag aagaaaaaaa aaaaaagcag cagacaacac actgtagagt 3660 cttgcacaca cacaagtgcc caggcaaggt gcttggcaga accgcagagt gggaagagag 3720 taccggcatc gggtttcctt gggatcaatt tcattaccgt gtacctttcc cattgtggtc 3780 atgccatttg gcagggggag aatgggaggc ttggccttct ttgtgaggca gtgtgagcag 3840 aagctgatgc cagcatgtca ctggttttga agggatgagc ccagacttga tgttttggga 3900 ttgtccttat tttaacctca aggtctcgca tggtggggcc cctgaccaac ctacacaagt 3960 tccctcccac aagtggacat cagtgtcttc tctgtgaggc atctggccat tcgcactccc 4020 tggtgtggtc agcctctctc acacaaggag gaacttgggt gaaggctgag tgtgaggcac 4080 ctgaagtttc cctgcggagt cgataaatta gcagaaccac atccccatct gttaggcctt 4140 ggtgaggagg ccctgggcaa agaagggtct ttcgcaaagc gatgtcagag ggcggttttg 4200 agctttctat aagctatagc tttgtttatt tcacccgttc acttactgta taatttaaaa 4260 tcatttatgt agctgagaca cttctgtatt tcaatcatat catgaacatt ttattttgct 4320 aaatcttgtg tcatgtgtag gctgtaatat gtgtacattg tgtttaagag aaaaatgaaa 4380 cccacatgcc gccattttcc tgaatcaaat tctgcagtgg aatggagagg aaaatacttc 4440 taggcaagca gctagactgg tgaattgggg gaaatagaag gaactagtaa ctgagactcc 4500 tccagcctcc tccctattgg aatcccaatg gctcctggag taggaaaaaa gtttaaacta 4560 cattcatgtt cttgttctgt gtcactcggc cctgggtagt ctaccattta cttcacccca 4620 agtcctgctg cccatccagt tgggaagcca tgattttcct aagaatccag ggccatggga 4680 gatacaattc caagttctcg cttcctcctt tgggcatctc ttctgcctcc caatcaagga 4740 agctccatgc tcaggctctc agctctcggg ccagtgctct gctctgtcca gggtaggtaa 4800 tactgggaga ctcctgtctt ttaccctccc ctcgttccag acctgcctca tggtggcaac 4860 atggttcttg aacaattaaa gaaacaaatg actttttgga atagccctgt ctagggcaaa 4920 ctgtggcccc caggagacac tacccttcca tgccccagac ctctgtcttg catgtgacaa 4980 ttgacaatct ggactacccc aagatggcac ccaagtgttt ggcttctggc tacctaaggt 5040 taacatgtca ctagagtatt tttatgagag acaaacatta taaaaatctg atggcaaaag 5100 caaaacaaaa tggaaagtag gggaggtgga tgtgacaaca acttccaaat tggctctttg 5160 gaggcgagag gaaggggaga acttggagaa tagtttttgc tttgggggta gaggcttctt 5220 agattctccc agcatccgcc tttcccttta gccagtctgc tgtcctgaaa cccagaagtg 5280 atggagagaa accaacaaga gatctcgaac cctgtctaga aggaatgtat ttgttgctaa 5340 atttcgtagc actgtttaca gttttcctcc atgttattta tgaattttat attccgtgaa 5400 tgtatattgt cttgtaatgt tgcataatgt tcacttttta tagtgtgtcc tttattctaa 5460 acagtaaagt ggttttattt ctatcac 5487 <210> 59 <211> 866 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> APC >gi|551463|gb|U02509.1|HSU02509 Human adenomatous polyposis coli (APC) gene, promoter sequence <220> <221> misc_feature <222> (315)..(315) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 acttatatat ctgacagttg atttgtcctc acctctaaat tggaatttaa gcatcacctg 60 gttcgattta atgcaatgta gaatttgcat taaaatacta cattaaagcc tcagatttgt 120 agtagctaac agcacttcta tgtatgtgtc agggactgct ctaaatactt catatatatt 180 aactcctcta ttctgtactt ctgttcccgt tttatacagc aggaaattga aacactgaga 240 ggttaagtaa ctaaagttac agagctagag tgacaggagt aaagcttcaa ctcaggcaac 300 ccagacgtcc agagntctga tctccactac taagctgcta gcatagcttt tctggtaact 360 atttttaatt caatataatt cgaatgatct atctaacaag tcatcactct gacaactcag 420 tgacttgtaa tgtaaaatta ttcattgtaa ttcacttaat attattgttt ctctgtgctg 480 caaaaatcat agcaatcgag atgtaattta ttactctccc tcccacctcc ggcatcttgt 540 gctaatcctt ctgccctgcg gacctccccc gactctttac tatgcgtgtc aactgccatc 600 aacttccttg 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tgatagttta aatagtgtca 2940 gtagtagtga tggttatggt aaaagaggtc aaatgaaacc ctcgattgaa tcctattctg 3000 aagatgatga aagtaagttt tgcagttatg gtcaataccc agccgaccta gcccataaaa 3060 tacatagtgc aaatcatatg gatgataatg atggagaact agatacacca ataaattata 3120 gtcttaaata ttcagatgag cagttgaact ctggaaggca aagtccttca cagaatgaaa 3180 gatgggcaag acccaaacac ataatagaag atgaaataaa acaaagtgag caaagacaat 3240 caaggaatca aagtacaact tatcctgttt atactgagag cactgatgat aaacacctca 3300 agttccaacc acattttgga cagcaggaat gtgtttctcc atacaggtca cggggagcca 3360 atggttcaga aacaaatcga gtgggttcta atcatggaat taatcaaaat gtaagccagt 3420 ctttgtgtca agaagatgac tatgaagatg ataagcctac caattatagt gaacgttact 3480 ctgaagaaga acagcatgaa gaagaagaga gaccaacaaa ttatagcata aaatataatg 3540 aagagaaacg tcatgtggat cagcctattg attatagttt aaaatatgcc acagatattc 3600 cttcatcaca gaaacagtca ttttcattct caaagagttc atctggacaa agcagtaaaa 3660 ccgaacatat gtcttcaagc agtgagaata cgtccacacc ttcatctaat gccaagaggc 3720 agaatcagct ccatccaagt tctgcacaga gtagaagtgg 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attaagaata atgcctccag 4620 ttcaggaaaa tgacaatggg aatgaaacag aatcagagca gcctaaagaa tcaaatgaaa 4680 accaagagaa agaggcagaa aaaactattg attctgaaaa ggacctatta gatgattcag 4740 atgatgatga tattgaaata ctagaagaat gtattatttc tgccatgcca acaaagtcat 4800 cacgtaaagc aaaaaagcca gcccagactg cttcaaaatt acctccacct gtggcaagga 4860 aaccaagtca gctgcctgtg tacaaacttc taccatcaca aaacaggttg caaccccaaa 4920 agcatgttag ttttacaccg ggggatgata tgccacgggt gtattgtgtt gaagggacac 4980 ctataaactt ttccacagct acatctctaa gtgatctaac aatcgaatcc cctccaaatg 5040 agttagctgc tggagaagga gttagaggag gagcacagtc aggtgaattt gaaaaacgag 5100 ataccattcc tacagaaggc agaagtacag atgaggctca aggaggaaaa acctcatctg 5160 taaccatacc tgaattggat gacaataaag cagaggaagg tgatattctt gcagaatgca 5220 ttaattctgc tatgcccaaa gggaaaagtc acaagccttt ccgtgtgaaa aagataatgg 5280 accaggtcca gcaagcatct gcgtcgtctt ctgcacccaa caaaaatcag ttagatggta 5340 agaaaaagaa accaacttca ccagtaaaac ctataccaca aaatactgaa tataggacac 5400 gtgtaagaaa aaatgcagac tcaaaaaata atttaaatgc 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agatatacag agaccagatt 6300 cagaacatgg tctatcccct gattcagaaa attttgattg gaaagctatt caggaaggtg 6360 caaattccat agtaagtagt ttacatcaag ctgctgctgc tgcatgttta tctagacaag 6420 cttcgtctga ttcagattcc atcctttccc tgaaatcagg aatctctctg ggatcaccat 6480 ttcatcttac acctgatcaa gaagaaaaac cctttacaag taataaaggc ccacgaattc 6540 taaaaccagg ggagaaaagt acattggaaa ctaaaaagat agaatctgaa agtaaaggaa 6600 tcaaaggagg aaaaaaagtt tataaaagtt tgattactgg aaaagttcga tctaattcag 6660 aaatttcagg ccaaatgaaa cagccccttc aagcaaacat gccttcaatc tctcgaggca 6720 ggacaatgat tcatattcca ggagttcgaa atagctcctc aagtacaagt cctgtttcta 6780 aaaaaggccc accccttaag actccagcct ccaaaagccc tagtgaaggt caaacagcca 6840 ccacttctcc tagaggagcc aagccatctg tgaaatcaga attaagccct gttgccaggc 6900 agacatccca aataggtggg tcaagtaaag caccttctag atcaggatct agagattcga 6960 ccccttcaag acctgcccag caaccattaa gtagacctat acagtctcct ggccgaaact 7020 caatttcccc tggtagaaat ggaataagtc ctcctaacaa attatctcaa cttccaagga 7080 catcatcccc tagtactgct tcaactaagt cctcaggttc 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tgtacagtat gttttacatg 8820 tatttaaagt agcatcccat cccaacttcc tttaattatt gcttgtctta aaataatgaa 8880 cactacagat agaaaatatg atatattgct gttatcaatc atttctagat tataaactga 8940 ctaaacttac atcagggaaa aattggtatt tatgcaaaaa aaaatgtttt tgtccttgtg 9000 agtccatcta acatcataat taatcatgtg gctgtgaaat tcacagtaat atggttcccg 9060 atgaacaagc tttacccagc ctgtttgctt tactgcatga atgaaactga tggttcaatt 9120 tcagaagtaa tgattaacag ttatgtggtc acatgatgtg catagagata gctacagtgt 9180 aataatttac actattttgt gctccaaaca aaacaaaaat ctgtgtaact gtaaaacatt 9240 gaatgaaact attttacctg aactagattt tatctgaaag taggtagaat ttttgctatg 9300 ctgtaatttg ttgtatattc tggtatttga ggtgagatgg ctgctctttt attaatgaga 9360 catgaattgt gtctcaacag aaactaaatg aacatttcag aataaattat tgctgtatgt 9420 aaactgttac tgaaattggt atttgtttga agggtcttgt ttcacatttg tattaataat 9480 tgtttaaaat gcctctttta aaagcttata taaatttttt ncttcagctt ctatgcatta 9540 agagtaaaat tcctcttact gtaataaaaa caattgaaga agactgttgc cacttaacca 9600 ttccatgcgt tggcacttat ctattcctga aattctttta 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>gi|3282785|gb|AF044206.1| Homo sapiens cyclooxygenase (COX-2) gene, promoter and exon 1 <400> 61 ggtacccagg ctggagtgca ctggtgtgat catagctcac taacctcgaa ctcctgggct 60 taggcaatcc tcttgccttg gcctcccaaa gtgccaggat tacaggcatg agccaccaca 120 gtggagctct caattctgat actaataatt tgtgtcttct ctttttttcc ttagcctgac 180 tagagtaatt aactttatgt cttttaaaag aaccaccttt ttggttttac ccattttctt 240 ttttgatttt ctgtttttga tttgattgat atctactcta attttttatt atttcttttc 300 ctctgcttac tttgaattta attacttttc ttttttgtag tctcctaaaa tagaagctta 360 tattattgat tttagatctt tcttcttttc tattacagca ctcaatgcta taaatttccc 420 tctaagcatt gctttcactg catcctacaa tatttcaact ctattgttat ttagctcaaa 480 agaggttctt aatttctatt gggatttctc tttgacccat gtgttattca gaagtgttcc 540 gtgtgatctc caaatatttg ggagtttttc agctatcttt ctattaatca tttcttgttt 600 aattctattg tggcctgaga gcatatattg tatgatttat attcttgtaa atgtgttaag 660 gtgtgtctta tggtgcagaa tgcggtttat cttgctatat gttccttaga gaataatgta 720 tgttctgctg ttattggata aagtagtcta tagatgtcag ttacatctcg ttgattaatg 780 gtgctgttga gttcagctat gtcctaaatg attttctgtc tgctgtatct gtctatttct 840 gacacaaggc tgttgaagtc tccaaccata ataatgaatt aatctatttt tctttgcagt 900 tttatcaatt ttgtcttata tatattgatg ctccattgtt tggcacatac acattaagaa 960 ttgttatgtc ttcttggaga atttaccttt ccataacatg taacatttcc ctttattcct 1020 gataattttt cttgctcaaa agtttgccct gttggaaatt accagaacta ctctggcttt 1080 atttgattag tgttagcatg ctctctcttt ctctattctt acacttttaa tgtatacttg 1140 actttgtatt taaagtgggg ttcttataga aaacatatac ttggtagggt gggaagtaaa 1200 ataaaaagaa atacttgggt attggtttga tccactctaa caatctctat gttttaattg 1260 atgtatttag accattgata cttatttttt tatcctcatc cctgtgatta cccagagagc 1320 tgcttaaatt gattattgat atagacaaat taataattaa tatctaccgt ttgttactgt 1380 tttctatttt tcattgccct tactttctgc tcctattttt tgctcctttt tctgttaatt 1440 taggttttga gttattttat atcattctat tttctctccc ttctcagcat atgaattatc 1500 tttctttttg acttttttag tggctgccct gaaggttgca atgtacattt acaaccagtc 1560 ccaatctcct ttcaaaaaac acaatactgt ttcatggcta gtgcaagtac ctaataataa 1620 gaagtcactc ctaatttctt tctctcattc tttgtatctt tactgttatt catttcactt 1680 gtacataagc tgtaatcttt caatacatta ttgctattat tatttcaaaa catgttatct 1740 attatatcta tttaaaataa gaaaaatagg ccaggtgcag tggcttactc atgtaatccc 1800 agcactttgg gagaccgatg gattgctaga gctcaggaat tcgagaccag cctgggcaac 1860 atagtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaaaaaaa attgctgggc atggtggcat 1920 gggcctgtgg tcacagctac tcgggaggct gaggtgagag gattgcttga gcctgggagg 1980 cagaggttgc agtgaaccaa aatcaagcta ctgcactcca gcctaagtga cagagtgaga 2040 ccctgtctca aaaaaaaaat gaaagaatta tttttattta tcttcactta tttcttctct 2100 aatgctcttt gtttctttag tatgtagatc caagtttcta acctgtatca tttttcttat 2160 ctcaataact tcttttaaca tttctcacaa agcagatcta ctggccacag aatgcctcaa 2220 ttttcatttg tctgagaaaa ccttatttct ccttcacttt tgaaagataa ttttgtaggg 2280 tacagaattc taggttgtag gttttttccc ctcaaagtga aatatttcat tccactcttt 2340 tcttctttgt atggtatctg agaagaagtc agatgtaatt cttatcatta ttacttaaaa 2400 gattgcttct gttcctttct ctcttctcct tcccttcttt ccttctctgt atattacacc 2460 ttttatagtt gccccatatt tcttagatat tatgttttgg ttttcttctg tgtttttttc 2520 tttgattctc agttttagaa gtctctattt atatatctgc aatcgcaggg attctttcct 2580 ctgccatgtc cagtctacta ataagccctt acagacattg ttgacttctg ttccagtgtt 2640 tttgatctct agcatttctc tgattatttc ttggaattgc catctgtcta cttacattac 2700 caacctattc ttgtgtgttg tcttatcata gtaattgcag ttgttttaat ttcataggta 2760 ttgtaatttc aacatctcta ccatatttga cattgattct gatgcttgct ctgtcttatc 2820 aagctatgtt tttgtctttt agtgtgactt ctaatttttt gttgaaagcc aggcatgatg 2880 tactgagtga aagaaactca atacattgta atgtgacgat aagagttcag gggaagtgaa 2940 gcattctata gtcctatagc aggtctcggc cttttagtga gcctgtgcct atgaacggtg 3000 actttcaaca agtgcttttc attccactct tttcctgtcc ttaagtggga caagatcact 3060 gggggggggc tagaattggg tatttccctt ctccaatgta gaagctaaag agagggctgg 3120 agttgggtat ttttcttccc ctgtatggaa agctagaggc agttaaattt ggatattttc 3180 cttcttctaa ttcagttagg ctgcgacaaa aatcccgaca gtttaggctc taatattata 3240 aaataatttc tcttgagtat aggccttatt aagaacacta tactctgatg gagctgaggg 3300 ggagttttct ctgatattca ctgcgagaac ctcgtagagc tccaggaagc aaaactcaca 3360 aaagtgtggg agtcttccag aatttttcct ttgcagactt atctgcactg aacctccaga 3420 aattcatcaa ttacagttca ggttttccta cccaggtact ggttttcatg gaggtttctg 3480 cctgtgcatt tctgctccag taagttgttc ttcttgtatg gtctgtcttt caaatttttt 3540 aagtagggtt atgacctgtc gcctcacttc tctgacagtt ctgagagtgt tgatttttca 3600 gtttgcttag atttttactt gtttttagga tgaagtgaca atttccaagc tcctccctga 3660 catgccagat cagaaactga aagtcctaag cctcatattc tgtgcgtggg tatgttcaca 3720 tcctgcctgc tccagtgccc ccacctcaca ctctctttcc cttccttgtc cccttgtgag 3780 atttctaggt ccaatacaaa gactgtgttc aactcattca actacttggc tcatctgagt 3840 attataatga acaatcacaa aaaaaaatga agtaaaagaa aaatccatca aagaattgag 3900 atatttgaga aaaagaaagg agatcagtgt tttataaaac ttagaaatag attttttaag 3960 tgtttcttca ttgacttatg tgaaaggact tttcttaatt taacaaatta tgtgctttcg 4020 tttatagcct caaaacttct tgtgtagcta agaatgggta aataatcagg ctttactaaa 4080 ggactaacgt aaagatcttc tgtaagtaac atttctgcta ctcaaggaag agataaactt 4140 catggcataa ccttgccaaa gtatactaag aataaccctg acacaaagct cttttttcag 4200 ccaacatgcc atgaaagaaa gaagacaagg ggtgatctcc actctctaag tgaaccacta 4260 aacccaccaa agaagaaacg agggaaatag aaagaggacc cttgcctgag ataatggatc 4320 tgtatgtatg agtagtagaa ccctgctcaa agtacaagga agggaaaaaa aagttagttt 4380 atttggaatt ttggacatta agagtcttta ttgttcattt tcttttaact cacatgaatg 4440 gcttatcact tcaattaata aatatttcat ttcttttcaa tctatattca tgaaacaaat 4500 ctgaaatgaa cagtgcaaca tgtgaatgtt tagaacatta taaaattaaa cacaaaatct 4560 gtctggcaat cttcctagca tcttaggaaa aaagttgaca aaatttcaag cagcagaagg 4620 gggcagtaaa actcaacaga aagctctgga agatttttaa gattcttcct tattttcttt 4680 tcatgtagag tatttcccaa caaatttcag acgctaatag aaattttgta caacagatcc 4740 atatatttgc ctaaaataga cacagaaaca ttgatatatg caaacatgag agctataagt 4800 tttacatgat caaaaccttt tttttatggt acacaatagt cacagtactt ttccatataa 4860 aacaggttta gtggtcttaa tttagtttgg cacatttaat acactcccat gaccagcatc 4920 ccaaatgtac ctatccgttt tattttattg tctcagaatt gtcagttatt taataaatta 4980 tgtaactttt ttccttatgc tcagatttgc acttctttct aaaactctgc ccatccttaa 5040 agtcccagat tctccttgaa cttttttttt tgactttcca agtacatgga actcttcact 5100 ctatcctgct atataagtga cagaatttcc actatgggat agatggagtt caattccttt 5160 gagtttaaaa taatctaaat ataattattc cttatgccct gtttttccct cacttttgta 5220 tccaaatctc ttttcagaca acagaacaat taatgtctga taaggaagac aatgatgatg 5280 atcacttcaa aataagcttg aattcaggat tgtaatgtaa aattttagta ctctctcaca 5340 gtatggattc taacatggct tctaacccaa actaacatta gtagctctaa ctataaactt 5400 caaatttcag tagatgcaac ctactccttt aaaatgaaac agaagattga aattattaaa 5460 ttatcaaaaa gaaaatgatc cacgctctta gttgaaattt catgtaagat tccatgcaat 5520 aaataggagt gccataaatg gaatgatgaa atatgactag aggaggagaa aggcttccta 5580 gatgagatgg aattttagtc atccgtgtct catgaagaat cagatgtgta cactaagcaa 5640 aacagttaaa aaaaaaacct ccaagtgagt ctcttattta tttttttctt ataagacttc 5700 tacaaattga ggtacctggt gtagttttat ttcaggtttt atgctgtcat tttcctgtaa 5760 tgctaaggac ttaggacata actgaatttt ctattttcca cttcttttct ggtgtgtgtg 5820 tatatatata tgtatatata cacacacaca tatacatata tatattttta gtatctcacc 5880 ctcacatgct cctccctgag cactacccat gatagatgtt aaacaaaagc aaagatgaaa 5940 ttccaactgt taaaatctcc cttccatcta attaattcct catccaacta tgttccaaaa 6000 cgagaataga aaattagccc caataagccc aggcaactga aaagtaaatg ctatgttgta 6060 ctttgatcca tggtcacaac tcataatctt ggaaaagtgg acagaaaaga caaaagagtg 6120 aactttaaaa ctcgaattta ttttaccagt atctcctatg aagggctagt aaccaaaata 6180 atccacgcat cagggagaga aatgccttaa ggcatacgtt ttggacattt agcgtccctg 6240 caaattctgg ccatcgccgc ttcctttgtc catcagaagg caggaaactt tatattggtg 6300 acccgtggag ctcacattaa ctatttacag ggtaactgct taggaccagt attatgagga 6360 gaatttacct ttcccgcctc tctttccaag aaacaaggag ggggtgaagg tacggagaac 6420 agtatttctt ctgttgaaag caacttagct acaaagataa attacagcta tgtacactga 6480 aggtagctat ttcattccac aaaataagag ttttttaaaa agctatgtat gtatgtcctg 6540 catatagagc agatatacag cctattaagc gtcgtcacta aaacataaaa catgtcagcc 6600 tttcttaacc ttactcgccc cagtctgtcc cgacgtgact tcctcgaccc tctaaagacg 6660 tacagaccag acacggcggc ggcggcggga gaggggattc cctgcgcccc cggacctcag 6720 ggccgctcag attcctggag aggaagccaa gtgtccttct gccctccccc ggtatcccat 6780 ccaaggcgat cagtccagaa ctggctctcg gaagcgctcg ggcaaagact gcgaagaaga 6840 aaagacatct ggcggaaacc tgtgcgcctg gggcggtgga actcggggag gagagggagg 6900 gatcagacag gagagtgggg actaccccct ctgctcccaa attggggcag cttcctgggt 6960 ttccgatttt ctcatttccg tgggtaaaaa accctgcccc caccgggctt acgcaatttt 7020 tttaagggga gaggagggaa aaatttgtgg ggggtacgaa aaggcggaaa gaaacagtca 7080 tttcgtcaca tgggcttggt tttcagtctt ataaaaagga aggttctctc ggttagcgac 7140 caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc 7200 ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccc gcgccgcgcc 7260 ctgcccgaag ctt 7273 <210> 62 <211> 4465 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> >gi|4506264|ref|NM_000963.1| Homo sapiens prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) (PTGS2), mRNA <400> 62 caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc 60 ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccg cgccgcgccc 120 tgcccgccgc tcggatgctc gcccgcgccc tgctgctgtg cgcggtcctg gcgctcagcc 180 atacagcaaa tccttgctgt tcccacccat gtcaaaaccg aggtgtatgt atgagtgtgg 240 gatttgacca gtataagtgc gattgtaccc ggacaggatt ctatggagaa aactgctcaa 300 caccggaatt tttgacaaga ataaaattat ttctgaaacc cactccaaac acagtgcact 360 acatacttac ccacttcaag ggattttgga acgttgtgaa taacattccc ttccttcgaa 420 atgcaattat gagttatgtc ttgacatcca gatcacattt gattgacagt ccaccaactt 480 acaatgctga ctatggctac aaaagctggg aagccttctc taacctctcc tattatacta 540 gagcccttcc tcctgtgcct gatgattgcc cgactccctt gggtgtcaaa ggtaaaaagc 600 agcttcctga ttcaaatgag attgtggaaa aattgcttct aagaagaaag ttcatccctg 660 atccccaggg ctcaaacatg atgtttgcat tctttgccca gcacttcacg catcagtttt 720 tcaagacaga tcataagcga gggccagctt tcaccaacgg gctgggccat ggggtggact 780 taaatcatat ttacggtgaa actctggcta gacagcgtaa actgcgcctt ttcaaggatg 840 gaaaaatgaa atatcagata attgatggag agatgtatcc tcccacagtc aaagatactc 900 aggcagagat gatctaccct cctcaagtcc ctgagcatct acggtttgct gtggggcagg 960 aggtctttgg tctggtgcct ggtctgatga tgtatgccac aatctggctg cgggaacaca 1020 acagagtatg cgatgtgctt aaacaggagc atcctgaatg gggtgatgag cagttgttcc 1080 agacaagcag gctaatactg ataggagaga ctattaagat tgtgattgaa gattatgtgc 1140 aacacttgag tggctatcac ttcaaactga aatttgaccc agaactactt ttcaacaaac 1200 aattccagta ccaaaatcgt attgctgctg aatttaacac cctctatcac tggcatcccc 1260 ttctgcctga cacctttcaa attcatgacc agaaatacaa ctatcaacag tttatctaca 1320 acaactctat attgctggaa catggaatta cccagtttgt tgaatcattc accaggcaaa 1380 ttgctggcag ggttgctggt ggtaggaatg ttccacccgc agtacagaaa gtatcacagg 1440 cttccattga ccagagcagg cagatgaaat accagtcttt taatgagtac cgcaaacgct 1500 ttatgctgaa gccctatgaa tcatttgaag aacttacagg agaaaaggaa atgtctgcag 1560 agttggaagc actctatggt gacatcgatg ctgtggagct gtatcctgcc cttctggtag 1620 aaaagcctcg gccagatgcc atctttggtg aaaccatggt agaagttgga gcaccattct 1680 ccttgaaagg acttatgggt aatgttatat gttctcctgc ctactggaag ccaagcactt 1740 ttggtggaga agtgggtttt caaatcatca acactgcctc aattcagtct ctcatctgca 1800 ataacgtgaa gggctgtccc tttacttcat tcagtgttcc agatccagag ctcattaaaa 1860 cagtcaccat caatgcaagt tcttcccgct ccggactaga tgatatcaat cccacagtac 1920 tactaaaaga acgttcgact gaactgtaga agtctaatga tcatatttat ttatttatat 1980 gaaccatgtc tattaattta attatttaat aatatttata ttaaactcct tatgttactt 2040 aacatcttct gtaacagaag tcagtactcc tgttgcggag aaaggagtca tacttgtgaa 2100 gacttttatg tcactactct aaagattttg ctgttgctgt taagtttgga aaacagtttt 2160 tattctgttt tataaaccag agagaaatga gttttgacgt ctttttactt gaatttcaac 2220 ttatattata agaacgaaag taaagatgtt tgaatactta aacactatca caagatggca 2280 aaatgctgaa agtttttaca ctgtcgatgt ttccaatgca tcttccatga tgcattagaa 2340 gtaactaatg tttgaaattt taaagtactt ttggttattt ttctgtcatc aaacaaaaac 2400 aggtatcagt gcattattaa atgaatattt aaattagaca ttaccagtaa tttcatgtct 2460 actttttaaa atcagcaatg aaacaataat ttgaaatttc taaattcata gggtagaatc 2520 acctgtaaaa gcttgtttga tttcttaaag ttattaaact tgtacatata ccaaaaagaa 2580 gctgtcttgg atttaaatct gtaaaatcag atgaaatttt actacaattg cttgttaaaa 2640 tattttataa gtgatgttcc tttttcacca agagtataaa cctttttagt gtgactgtta 2700 aaacttcctt ttaaatcaaa atgccaaatt tattaaggtg gtggagccac tgcagtgtta 2760 tctcaaaata agaatatttt gttgagatat tccagaattt gtttatatgg ctggtaacat 2820 gtaaaatcta tatcagcaaa agggtctacc tttaaaataa gcaataacaa agaagaaaac 2880 caaattattg ttcaaattta ggtttaaact tttgaagcaa actttttttt atccttgtgc 2940 actgcaggcc tggtactcag attttgctat gaggttaatg aagtaccaag ctgtgcttga 3000 ataacgatat gttttctcag attttctgtt gtacagttta atttagcagt ccatatcaca 3060 ttgcaaaagt agcaatgacc tcataaaata cctcttcaaa atgcttaaat tcatttcaca 3120 cattaatttt atctcagtct tgaagccaat tcagtaggtg cattggaatc aagcctggct 3180 acctgcatgc tgttcctttt cttttcttct tttagccatt ttgctaagag acacagtctt 3240 ctcatcactt cgtttctcct attttgtttt actagtttta agatcagagt tcactttctt 3300 tggactctgc ctatattttc ttacctgaac ttttgcaagt tttcaggtaa acctcagctc 3360 aggactgcta tttagctcct cttaagaaga ttaaaagaga aaaaaaaagg cccttttaaa 3420 aatagtatac acttatttta agtgaaaagc agagaatttt atttatagct aattttagct 3480 atctgtaacc aagatggatg caaagaggct agtgcctcag agagaactgt acggggtttg 3540 tgactggaaa aagttacgtt cccattctaa ttaatgccct ttcttattta aaaacaaaac 3600 caaatgatat ctaagtagtt ctcagcaata ataataatga cgataatact tcttttccac 3660 atctcattgt cactgacatt taatggtact gtatattact taatttattg aagattatta 3720 tttatgtctt attaggacac tatggttata aactgtgttt aagcctacaa tcattgattt 3780 ttttttgtta tgtcacaatc agtatatttt ctttggggtt acctctctga atattatgta 3840 aacaatccaa agaaatgatt gtattaagat ttgtgaataa atttttagaa atctgattgg 3900 catattgaga tatttaaggt tgaatgtttg tccttaggat aggcctatgt gctagcccac 3960 aaagaatatt gtctcattag cctgaatgtg ccataagact gaccttttaa aatgttttga 4020 gggatctgtg gatgcttcgt taatttgttc agccacaatt tattgagaaa atattctgtg 4080 tcaagcactg tgggttttaa tatttttaaa tcaaacgctg attacagata atagtattta 4140 tataaataat tgaaaaaaat tttcttttgg gaagagggag aaaatgaaat aaatatcatt 4200 aaagataact caggagaatc ttctttacaa ttttacgttt agaatgttta aggttaagaa 4260 agaaatagtc aatatgcttg tataaaacac tgttcactgt tttttttaaa aaaaaaactt 4320 gatttgttat taacattgat ctgctgacaa aacctgggaa tttgggttgt gtatgcgaat 4380 gtttcagtgc ctcagacaaa tgtgtattta acttatgtaa aagataagtc tggaaataaa 4440 tgtctgttta tttttgtact attta 4465 <210> 63 <211> 1336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> 14-3-3-Sigma >gi|45238846|ref|NM_006142.3| Homo sapiens stratifin (SFN), mRNA <400> 63 gagagacaca gagtccggca ttggtcccag gcagcagtta gcccgccgcc cgcctgtgtg 60 tccccagagc catggagaga gccagtctga tccagaaggc caagctggca gagcaggccg 120 aacgctatga ggacatggca gccttcatga aaggcgccgt ggagaagggc gaggagctct 180 cctgcgaaga gcgaaacctg ctctcagtag cctataagaa cgtggtgggc ggccagaggg 240 ctgcctggag ggtgctgtcc agtattgagc agaaaagcaa cgaggagggc tcggaggaga 300 aggggcccga ggtgcgtgag taccgggaga aggtggagac tgagctccag ggcgtgtgcg 360 acaccgtgct gggcctgctg gacagccacc tcatcaagga ggccggggac gccgagagcc 420 gggtcttcta cctgaagatg aagggtgact actaccgcta cctggccgag gtggccaccg 480 gtgacgacaa gaagcgcatc attgactcag cccggtcagc ctaccaggag gccatggaca 540 tcagcaagaa ggagatgccg cccaccaacc ccatccgcct gggcctggcc ctgaactttt 600 ccgtcttcca ctacgagatc gccaacagcc ccgaggaggc catctctctg gccaagacca 660 ctttcgacga ggccatggct gatctgcaca ccctcagcga ggactcctac aaagacagca 720 ccctcatcat gcagctgctg cgagacaacc tgacactgtg gacggccgac aacgccgggg 780 aagagggggg cgaggctccc caggagcccc agagctgagt gttgcccgcc accgccccgc 840 cctgccccct ccagtccccc accctgccga gaggactagt atggggtggg aggccccacc 900 cttctcccct aggcgctgtt cttgctccaa agggctccgt ggagagggac tggcagagct 960 gaggccacct ggggctgggg atcccactct tcttgcagct gttgagcgca cctaaccact 1020 ggtcatgccc ccacccctgc tctccgcacc cgcttcctcc cgaccccagg accaggctac 1080 ttctcccctc ctcttgcctc cctcctgccc ctgctgcctc tgatcgtagg aattgaggag 1140 tgtcccgcct tgtggctgag aactggacag tggcaggggc tggagatggg tgtgtgtgtg 1200 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgcgcg cgccagtgca agaccgagat tgagggaaag 1260 catgtctgct gggtgtgacc atgtttcctc tcaataaagt tcccctgtga cactcaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaa 1336 <210> 64 <211> 1968 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> RASSF1A >gi|25777678|ref|NM_007182.4| Homo sapiens Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1 (RASSF1), transcript variant A,mRNA <400> 64 tctcctcagc tccttcccgc cgcccagtct ggatcctggg ggaggcgctg aagtcggggc 60 ccgccctgtg gccccgcccg gcccgcgctt gctagcgccc aaagccagcg aagcacgggc 120 ccaaccgggc catgtcgggg gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg 180 ggcgcgctgg gaagggccgc acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg 240 gcaccgcgtg caaccccaca cggcagctgg tccctggccg tggccaccgc ttccagcccg 300 cggggcccgc cacgcacacg tggtgcgacc tctgtggcga cttcatctgg ggcgtcgtgc 360 gcaaaggcct gcagtgcgcg cattgcaagt tcacctgcca ctaccgctgc cgcgcgctcg 420 tctgcctgga ctgttgcggg ccccgggacc tgggctggga acccgcggtg gagcgggaca 480 cgaacgtgga cgagcctgtg gagtgggaga cacctgacct ttctcaagct gagattgagc 540 agaagatcaa ggagtacaat gcccagatca acagcaacct cttcatgagc ttgaacaagg 600 acggttctta cacaggcttc atcaaggttc agctgaagct ggtgcgccct gtctctgtgc 660 cctccagcaa gaagccaccc tccttgcagg atgcccggcg gggcccagga cggggcacaa 720 gtgtcaggcg ccgcacttcc ttttacctgc ccaaggatgc tgtcaagcac ctgcatgtgc 780 tgtcacgcac aagggcacgt gaagtcattg aggccctgct gcgaaagttc ttggtggtgg 840 atgacccccg caagtttgca ctctttgagc gcgctgagcg tcacggccaa gtgtacttgc 900 ggaagctgtt ggatgatgag cagcccctgc ggctgcggct cctggcaggg cccagtgaca 960 aggccctgag ctttgtcctg aaggaaaatg actctgggga ggtgaactgg gacgccttca 1020 gcatgcctga actacataac ttcctacgta tcctgcagcg ggaggaggag gagcacctcc 1080 gccagatcct gcagaagtac tcctattgcc gccagaagat ccaagaggcc ctgcacgcct 1140 gcccccttgg gtgacctctt gtacccccag gtggaaggca gacagcaggc agcgccaagt 1200 gcgtgccgtg tgagtgtgac agggccagtg gggcctgtgg aatgagtgtg catggaggcc 1260 ctcctgtgct gggggaatga gcccagagaa cagcgaagta gcttgctccc tgtgtccacc 1320 tgtgggtgta gccaggtatg gctctgcacc cctctgccct cattactggg ccttagtggg 1380 ccagggctgc cctgagaagc tgctccaggc ctgcagcagg agtggtgcag acagaagtct 1440 cctcaatttt tgtctcagaa gtgaaaatct tggagaccct gcaaacagaa cagggtcatg 1500 tttgcagggg tgacggccct catctatgag gaaaggtttt ggatcttgaa tgtggtctca 1560 ggatatcctt atcagagcta agggtgggtg ctcagaataa ggcaggcatt gaggaagagt 1620 cttggtttct ctctacagtg ccaactcctc acacaccctg aggtcaggga gtgctggctc 1680 acagtacagc atgtgcctta atgcttcata tgaggaggat gtccctgggc cagggtctgt 1740 gtgaatgtgg gcactggccc aggttcatac cttatttgct aatcaaagcc agggtctctc 1800 cctcaggtgt tttttatgaa gtgcgtgaat gtatgtaatg tgtggtggcc tcagctgaat 1860 gcctcctgtg gggaaagggg ttggggtgac agtcatcatc agggcctggg gcctgagaga 1920 attggctcaa taaagatttc aagatcctca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1968 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTP1 primer <400> 65 agttgcgcgg cgatttc 17 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe (5'FAM/3'TAMRA) GSTP1 <400> 66 cggtcgacgt tcggggtgta gcg 23

Claims (21)

  1. 서열 번호 1 내지 서열 번호 35 및 서열 번호 44 내지 서열 번호 53의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 시약을 사용하여 생물학적 샘플 내의 마커 (marker)의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하여, 증식성 장애의 존재를 진단하거나 이의 추이를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 참조 마커 (reference marker)의 존재를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 참조 마커가 B 액틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 마커의 조합을 사용하는 사용하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 마커의 조합이 GSTP1에 대한 마커 및 APC, TIMP, RASSF1A, RARB2, PTGS2 또는 14-3-3에 대한 마커를 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 마커에 대한 시약이 서열 번호 1 내지 서열 번호 35 및 서 열 번호 44 내지 서열 번호 53의 서열로 이루어진 그룹의 일원을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 샘플이 전립선 조직인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 샘플이 뇨, 혈청, 혈장 또는 순환 세포인 방법.
  9. 서열 번호 1 내지 서열 번호 43의 서열로 이루어진 그룹의 일원을 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 따르는 조성물 중 하나 이상의 혼합물을 포함하는 조성물.
  11. 핵산 증폭 및 탐지 시약을 포함하는, 제1항에 따르는 검정 수행용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 증폭 및 탐지 시약이 서열 번호 1 내지 서열 번호 43의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 키트.
  13. 제12항에 있어서, 증폭 및 탐지 시약이 서열 번호 36 내지 서열 번호 43의 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 시약과 함께 서열 번호 1 내지 서열 번호 25의 서열 중에서 선택된 키트.
  14. 제11항에 있어서, 추가로 지침서를 포함하는 키트.
  15. 제11항에 있어서, 시약이 GSTP1 및 APC, TIMP, RASSF1a, RARB2, PTGS2 또는 14-3-3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 유전자의 과메틸화를 탐지하는 키트.
  16. 제11항에 있어서, 구성적 (constitutive) 발현 유전자의 증폭 및 이의 존재의 탐지용 시약을 추가로 포함하는 키트.
  17. 제11항에 있어서, 구성적 발현 유전자의 증폭 및 이의 존재의 탐지용 시약을 추가로 포함하는 키트.
  18. 제1항에 있어서, 메틸화율을 확정하고 메틸화율이 컷오프 수치를 초과하는지의 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 치료요법 모니터에 사용되는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 스크리닝에 사용되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 제1항에 따르는 방법과 상이한 방법을 사용하여 수득한 모호하거나 불명확한 암 검정 결과를 해석하는 데 사용되는 방법.
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