PL214886B1 - Sposób diagnozowania choroby nowotworowej układu moczowo-płciowego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania choroby nowotworowej układu moczowopłciowego, poprzez oznaczanie w moczu profili nukleozydów, elektroforetyczne oznaczanie nukleozydów w liofilizacie ekstraktu z moczu, chemometryczną analizę nukleozydów w moczu, sposób oceny siły zależności profili nukleozydów w moczu od obecności choroby nowotworowej.

Znana jest ze stanu techniki (J. Pharm. Biomed. Anal. (2007) 44: 1118-1126) metoda oznaczania elektroforetycznego nukleozydów w moczu, w której wykorzystuje się kapilarę ze stopionej krzemionki oraz roztwór elektrolitu podstawowego składający się z boranu sodu, kwasu fosforowego oraz dodecylosulfonianu sodu, przy czym podczas analizy elektroforetycznej stosuje się napięcie 25 kV, ciśnienie 0,1 p.s.i. i temperaturę termostatowania kapilary 30°C, a próbki wprowadza się do kapilary za pomocą przyłożonego ciśnienia 0,5 p.s.i. w czasie 5 sekund.

Obecnie stosowane metody diagnostyczne chorób nowotworowych układu moczowo-płciowego cechują się brakiem uniwersalności, tzn. są ograniczone do poszczególnych typów nowotworów. Poza tym, są one trudne technicznie, kosztowne i wymagające pod względem pobieranego materiału biologicznego. Ich czułość i swoistość jest ograniczona. Poniżej zostały krótko scharakteryzowane te podejścia, które znajdują obecnie zastosowanie lub są klinicznie testowane.

W przypadku nowotworów gruczołu krokowego zastosowanie diagnostyczne mają analizy ekspresji genów, takich jak gen transferazy S-glutationu P1 (GSTP-1), czy gen DD3 w osadzie moczu. Czułość tych testów sięga 66-73%, a swoistość 89-98%. Otrzymany wynik testu zależy jednak znacząco od zastosowanego czasu masażu prostaty, który stymuluje powstawanie osadu moczu zawierającego analizowane geny. Także w nowotworach gruczołu krokowego bezpośrednio w moczu oznaczany może być α-metyloacylowany koenzym A racemazy (AMACR). Metoda ta cechuje się czułością 100% i swoistością 58%. Oznaczany też może być zestaw polipeptydów (czułość 59-67%, swoistość 71-88%).

Specyficznie w przypadku chorób nowotworowych pęcherza moczowego jest stosowanych kilka testów dotyczących składników moczu, takich jak telomeraza (czułość 74%, swoistość 89%), białko NMP-22 (czułość 65%, swoistość 72%) czy kwas hialuronowy i hialuronidaza (czułość 91%, swoistość 86%).

W diagnostyce laboratoryjnej nowotworów układu moczowo- płciowego próbuje się też wykorzystać biomarkery oznaczane we krwi. Przykładem są oznaczenia PSA (Prostate specific antigen) w diagnostyce raka prostaty (czułość ~ 70%, swoistość 59-91%) oraz CA-15-3 (czułość ~ 63%), swoistość 80-88%)) i CA-27-29 (czułość ~ 39%, swoistość 80-88%) w diagnostyce raka jajnika. Oczywiście, krew jako materiał diagnostyczny jest zdecydowanie mniej dogodna niż mocz przede wszystkim z powodu sposobu i ilości pobieranych do badań.

Powyższe testy ilustrują sytuację dotychczasową, gdy badania nad biomarkerami chorób nowotworowych skupiają się na znalezieniu poszczególnych, pojedynczych substancji, charakterystycznych dla określonego typu choroby, np. nowotworu pęcherza czy nowotworu jajnika. Takie substancje mają jednak ograniczoną wiarygodność, jeśli chodzi o zastosowanie kliniczne. Są też mało przydatne w badaniach epidemiologicznych.

Dodatkowo, ich czułość i swoistość jest często niewystarczająca, aby mogły stanowić podstawę wiarygodnych testów dla rokowania, czy doboru odpowiedniej terapii.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania choroby nowotworowej układu moczowopłciowego, który składa się z następujących etapów:

a) oznaczanie w moczu profili nukleozydów, gdzie mierzy się pH moczu, po czym ustala się jego pH na poziomie 8,2-8,5, korzystnie przy pomocy stężonego 20-25% roztworu amoniaku, a następnie pobiera się próbkę moczu korzystnie o objętości 2-5 ml, miesza i wiruje się przez 3-10 minut przy szybkości 2000-5000 obrotów/minutę, po czym do 2-5 ml roztworu nad osadem dodaje się 80-150 μΐ roztworu wzorca wewnętrznego 8-bromoguanozyny o stężeniu 100-200 μΜ, tak przygotowany roztwór wprowadza się na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej z wypełnieniem fazą fenyloboranową, po czym otrzymane ekstrakty odparowuje się do objętości 2-3 ml w strumieniu azotu w temperaturze 30-40°C, a następnie zamraża się w temperaturze od -40°C do -20°C i poddaje się procesowi liofilizacji przez co najmniej 24 godziny, po czym suchy liofilizat rozpuszcza się w 100-200 μΐ wody;

b) elektroforetyczne oznaczanie nukleozydów w liofilizacie ekstraktu z moczu, gdzie próbki liofilizatu ekstraktu z moczu poddaje się analizie elektroforetycznej w grupach 5-20 próbek dziennie w kolejności losowej wykorzystując kapilarę ze stopionej krzemionki oraz roztwór elektrolitu podstaPL 214 886 B1 wowego o składzie: 100-110 mM boranu sodu, 65-75 mM fosforanu sodu i 140-170 mM dodecylosulfonianu sodu o pH 6-7, przy czym podczas analizy elektroforetycznej stosuje się napięcie 20-30 kV, ciśnienie 0,1-0,3 p.s.i. i temperaturę termostatowania kapilary 20-40°C, a próbki wprowadza się do kapilary za pomocą przyłożonego ciśnienia 0,6-0,8 p.s.i. w czasie co najmniej 5 sekund, po czym na podstawie pól powierzchni zarejestrowanych pików elektroforetycznych nukleozydów wylicza się stężenia poszczególnych nukleozydów odniesione do zawartości kreatyniny w moczu wyrażając je w postaci stężenia nukleozydu/mM kreatyniny;

c) chemometryczna analiza nukleozydów w moczu obejmująca przygotowanie danych, analizę jednowymiarową oraz analizę wielowymiarową, gdzie w przygotowaniu danych stosuje się skalowanie względem wartości średniej uzyskanej dla poszczególnych nukleozydów w całym zestawie danych, przy czym stosuje się test statystyczny U Manna-Whitneya do oceny różnic w profilach nukleozydów pomiędzy grupą osób chorych nowotworowo i osób zdrowych i bada się poziom stężenia wszystkich metabolitów względem grupy kontrolnej, przy czym zależność pomiędzy profilem metabolicznym a obecnością zdiagnozowanej choroby nowotworowej bada się przy pomocy analizy PCA głównych składowych;

d) ocena siły zależności profili nukleozydów w moczu od obecności choroby nowotworowej, gdzie stosuje się metodę rozpoznawania obrazów: metodę cząstkową najmniejszych kwadratów z funkcją probabilistyczną p-PLS-DA, w której zestaw danych dzieli się w sposób losowy na zestaw kalibracyjny i zestaw testowy, przy czym przy pomocy metody p-PLS-DA dla zestawu kalibracyjnego uzyskuje się model klasyfikacyjny, którego parametry określa się stosując zestaw testowy.

Sposób diagnozowania choroby nowotworowej układu moczowo-płciowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że w moczu oznacza się zawartość ograniczonej liczbowo grupy związków, głównie nukleozydów, po czym uzyskane profile zestawu oznaczanych substancji poddaje się bioinformatycznej analizie i na podstawie uzyskanych rezultatów drogą analizy bioinformatycznej klasyfikuje się osoby jako zdrowe lub chore nowotworowo.

W odróżnieniu od podejścia typowego dla klasycznej biochemii klinicznej, w wynalazku zastosowana została nowoczesna analiza metabonomiczna, która nie koncentruje się na pojedynczym, wybranym związku biomarkerowym, lecz na większej, reprezentatywnej grupie równocześnie obserwowanych metabolitów - na profilu metabolicznym. Profil metaboliczny odnosi się do obecności zestawu małocząsteczkowych metabolitów oraz ich stężeń w próbkach biologicznych, takich jak mocz i pozostaje w ścisłej zależności ze stanem patofizjologicznym organizmu. Badanie profili metabolicznych przy użyciu analitycznych metod chemicznych i bioinformatycznych daje możliwość sprecyzowania zależności pomiędzy stanem patofizjologicznym organizmu a składem jakościowym i ilościowym metabolitów w badanym moczu. Uzyskane i zweryfikowane według wynalazku procedury laboratoryjne stanowią nowatorskie narzędzie diagnostyczne i predykcyjne do dogodnej diagnostyki i optymalizacji farmakoterapii chorób nowotworowych układu moczowo-płciowego. Mocz, jako materiał biologiczny do badań diagnostycznych, może zostać pobrany od pacjenta podczas każdego stadium choroby. Inne zalety tego płynu biologicznego to możliwość jednoczesnego przebadania populacji o dużej liczebności, łatwość pobierania próbek, dogodność transportu i przechowywania w postaci zamrożonej, możliwość badania substancji obecnych w moczu bez pracochłonnego przygotowywania prób do badań i inne. To sprawia, że analiza składu jakościowego i ilościowego moczu stanowi wartościowe i dogodne narzędzie w diagnostyce.

Opis rysunków

Figura 1 przedstawia elektroferogram zarejestrowany przy długości fali 254 nm.

Figura 2 przedstawia wykres radarowy średnich stężeń metabolitów w grupie osób zdrowych i chorych nowotworowych.

Figura 3 przedstawia wykres rozrzutu obiektów uzyskany podczas analizy PCA.

Tabela 1 - parametry modelu klasyfikacyjnego (opis w przykładzie).

Wynalazek jest przedstawiony bliżej w przykładzie wykonania, nie stanowiącym jego ograniczenia.

P r z y k ł a d

Pobrano 149 próbek moczu od 63 osób ze zdiagnozowanymi chorobami układu moczowo-płciowego i 86 osób zdrowych, u których nie stwierdzono takich schorzeń (grupa kontrolna). W analizie profili nukleozydów wykorzystano 3 ml każdej próbki moczu, wcześniej mierząc jej pH i ustalając pH na 8,2-8,5 przy pomocy stężonego 25% roztworu amoniaku. Następnie każdą próbkę mieszano na mieszadle Vortex i wirowano przez 6 minut przy szybkości 3500 obrotów/minutę. Do 2 ml roztworu

PL 214 886 B1 nad osadem dodano 100 μΐ roztworu wzorca wewnętrznego 8-bromoguanozyny o stężeniu 150 μΜ. Tak przygotowany roztwór wprowadzono na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej z wypełnieniem fazą fenyloboranową (Affi-Gel Boronate Gel z Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Otrzymane ekstrakty odparowano do objętości 1,5 ml w strumieniu azotu w temperaturze 36°C, a następnie zamrożono w temperaturze -34°C i poddano procesowi liofilizacji w ciągu 24 godzin. Suchy liofilizat rozpuszczono w 100 μΐ wody oczyszczonej, uzyskując w ten sposób 20-krotne wzbogacenie nukleozydów względem stężeń w pierwotnej próbce moczu, a następnie używano w oznaczeniu elektroforetycznym nukleozydów.

W oznaczeniu elektroforetycznym wykorzystano niemodyfikowaną kapilarę ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej I.D. 50 μm oraz długości efektywnej I = 70 cm i długości całkowitej L = 80 cm oraz roztwór elektrolitu podstawowego o składzie: 100 mM boranu sodu, 72,5 mM fosforanu sodu i 160 mM dodecylosulfonianu sodu o pH 6,7. W trakcie analizy elektroforetycznej stosowano napięcie 25 kV, ciśnienie 0,1 p.s.i. i temperaturę termostatowania kapilary 30°C, próbki wprowadzono do kapilary za pomocą przyłożonego ciśnienia 0,6 p.s.i. w czasie 5 s.

Próbki analizowano elektroforetycznie w grupach 7-11 próbek dziennie w kolejności losowej. Uzyskiwane w trakcie analiz elektroferogramy zawierały informacje na temat czasów migracji oraz pól powierzchni dwudziestu kilku pików pochodzących od związków z ugrupowaniami cis-diolowymi w większości zidentyfikowanych jako nukleozydy. Przykładowy elektroferogram zarejestrowany przy długości fali 254 nm został przedstawiony na fig. 1, gdzie 1 oznacza pseudourydynę (pU); 2 - dihydrourydynę (dhU); 3 - urydynę (U); 4 - cytydynę (C); 5 - 5-metylourydynę (5 mU); 6 - 1-metyloinozynę (1 ml); 7 - inozynę (I); 8 - N4-acetylocytydynę (N4aC); 9 - guanozynę (G); 10 - adenozynę (A); 11 2-metyloguanozynę (2 mG); 12 - N2,N2-dimetyloguanozynę (N2N2d mG); 13 - 6-metyloadenozynę (6 mA); 14 - ksantozynę (X); 15 - IS (8brG); 16 - 1-metyloadenozynę (1 mA), * - niezidentyfikowane metabolity wykorzystane w dalszej analizie porównawczej profili metabolicznych osób zdrowych i chorych nowotworowych. Warunki elektroforetyczne: BGE - 100 mM boran/72,5 mM fosforan/160 mM SDS o pH 6,7, niemodyfikowana kapilara ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej I.D. 50 μm i długości efektywnej I = 70 cm przy długości całkowitej L = 80 cm, napięcie + 25 kV, ciśnienie 0,1 p.s.i., temperatura termostatowania kapilary 30°C, wprowadzenie próbki 5 s 0,6 p.s.i., 254 nm.

W analizie profili nukleozydów uwzględniono 19 pików elektroforetycznych (pochodzących od 15 zidentyfikowanych nukleozydów i 4 niezidentyfikowanych) oraz pik wzorca wewnętrznego. Na podstawie pól powierzchni wyliczono stężenia poszczególnych nukleozydów, które odniesiono do zawartości kreatyniny w moczu wyrażając je w postaci stężenie nukleozydu/ mM kreatyniny. Tak uzyskane dane podano analizie chemometrycznej.

Analiza chemometryczna obejmowała przygotowanie danych, analizę jednowymiarową oraz analizę wielowymiarową. W przygotowaniu danych zastosowano skalowanie względem wartości średniej uzyskanej dla poszczególnych zmiennych (nukleozydów) w całym zestawie danych. Dalej zastosowano test statystyczny U Manna-Whitneya do oceny różnic w profilach nukleozydów pomiędzy grupą osób chorych nowotworowo i osób zdrowych. Test ten wykazał istotne statystycznie różnice dla prawie wszystkich metabolitów na poziomie istotności α = 0,0001 (tylko dla cytydyny α = 0,005). Poziomy stężeń wszystkich metabolitów były podwyższone w grupie osób chorych nowotworowo względem grupy kontrolnej, średnio 1,5-2 razy.

Figura 2 przedstawia wykres radarowy średnich stężeń metabolitów w grupie osób zdrowych i chorych nowotworowych, gdzie pU oznacza pseudourydynę; dhU - dihydrourydynę; U - urydynę; C - cytydynę; 5mU - 5-metylourydynę; 1 mI - 1-metyloinozynę; I - inozynę; N4aC - N4-acetylocytydynę; G - guanozynę; A - adenozynę; 2mG - 2- metyloguanozynę; N2N2dmG - N2,N2-dimetyloguanozynę; 6mA - 6-metyloadenozynę; X - ksantozynę; ImA - 1-metyloadenozynę, * oznacza niezidentyfikowane metabolity wykorzystane w analizie porównawczej profili metabolicznych osób zdrowych i chorych nowotworowych.

W dalszym badaniu zależności pomiędzy profilem metabolicznym a obecnością zdiagnozowanej choroby nowotworowej układu moczowo-płciowego zastosowano analizę głównych składowych PCA jako metodę wielowymiarową. Wykonana analiza PCA wykazała różnice pomiędzy profilami nukleozydów pochodzącymi od osób chorych nowotworowych a grupą kontrolną. Wykres rozrzutu obiektów uzyskany podczas analizy PCA został przedstawiony na fig. 3, gdzie kolorem czerwonym oznaczono wyniki osób chorych nowotworowo, a kolorem niebieskim wyniki osób zdrowych w przestrzeni dwuwymiarowej wyznaczonej przez PC1/PC2. Następnie, oceniono siłę zależności profili nukleozydów w moczu od obecność zdiagnozowanej choroby nowotworowej układu moczowo-płciowego w tym celu

PL 214 886 B1 stosując metodę rozpoznawania obrazów: metodę cząstkową najmniejszych kwadratów z funkcją probabilistyczną p-PLS-DA.

Zestaw danych podzielono w sposób losowy na zestaw kalibracyjny 104 próbek i zestaw testowy 45 próbek. Przy pomocy metody p-PLS-DA dla zestawu kalibracyjnego uzyskano model klasyfikacyjny, którego parametry określano stosując zestaw testowy, co obrazuje tabela 1. W tabeli tej przedstawiono parametry modelu klasyfikacyjnego otrzymanego na podstawie stężeń 19 metabolitów, gdzie CCR_cal oznacza procent prawidłowo sklasyfikowanych próbek z zestawu kalibracyjnego (n = 104), CCR_test oznacza procent prawidłowo sklasyfikowanych próbek z zestawu testowego (n = 45); czułość określa procent chorych nowotworowych zaklasyfikowanych właściwie do tej grupy; swoistość określa procent osób zdrowych zaklasyfikowanych właściwie do tej grupy. Uzyskany model klasyfikacyjny charakteryzował się bardzo wysoką swoistością, sięgającą ponad 90% oraz czułością na po-

Claims (1)

1. Sposób diagnozowania choroby nowotworowej układu moczowo-płciowego, znamienny tym, że składa się z następujących etapów:

   a) oznaczanie w moczu profili nukleozydów, gdzie mierzy się pH moczu, po czym ustala się jego pH na poziomie 8,2-8,5, korzystnie przy pomocy stężonego 20-25% roztworu amoniaku, a następnie pobiera się próbkę moczu korzystnie o objętości 2-5 ml, miesza i wiruje się przez 3-10 minut przy szybkości 2000-5000 obrotów/minutę, po czym do 2-5 ml roztworu nad osadem dodaje się 80-150 μΐ roztworu wzorca wewnętrznego 8-bromoguanozyny o stężeniu 100-200 μΜ, tak przygotowany roztwór wprowadza się na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej z wypełnieniem fazą fenyloboranową, po czym otrzymane ekstrakty odparowuje się do objętości 2-3 ml w strumieniu azotu w temperaturze 30-40°C, a następnie zamraża się w temperaturze od -40°C do -20°C i poddaje się procesowi liofilizacji przez co najmniej 24 godziny, po czym suchy liofilizat rozpuszcza się w 100-200 μΐ wody;

   b) elektroforetyczne oznaczanie nukleozydów w liofilizacie ekstraktu z moczu, gdzie próbki liofilizatu ekstraktu z moczu poddaje się analizie elektroforetycznej w grupach 5-20 próbek dziennie w kolejności losowej wykorzystując kapilarę ze stopionej krzemionki oraz roztwór elektrolitu podstawowego o składzie: 100-110 mM boranu sodu, 65-75 mM fosforanu sodu i 140-170 mM dodecylosulfonianu sodu o pH 6-7, przy czym podczas analizy elektroforetycznej stosuje się napięcie 20-30 kV, ciśnienie 0,1-0,3 p.s.i. i temperaturę termostatowania kapilary 20-40°C, a próbki wprowadza się do kapilary za pomocą przyłożonego ciśnienia 0,6- 0,8 p.s.i. w czasie co najmniej 5 sekund, po czym na podstawie pól powierzchni zarejestrowanych pików elektroforetycznych nukleozydów wylicza się stężenia poszczególnych nukleozydów odniesione do zawartości kreatyniny w moczu wyrażając je w postaci stężenia nukleozydu/mM kreatyniny;

   c) chemometryczna analiza nukleozydów w moczu obejmująca przygotowanie danych, analizę jednowymiarową oraz analizę wielowymiarową, gdzie w przygotowaniu danych stosuje się skalowanie względem wartości średniej uzyskanej dla poszczególnych nukleozydów w całym zestawie danych, przy czym stosuje się test statystyczny U Manna-Whitneya do oceny różnic w profilach nukleozydów pomiędzy grupą osób chorych nowotworowo i osób zdrowych i bada się poziom stężenia wszystkich metabolitów względem grupy kontrolnej, przy czy zależność pomiędzy profilem metabolicznym a obecnością zdiagnozowanej choroby nowotworowej bada się przy pomocy analizy PCA głównych składowych;

   d) ocena siły zależności profili nukleozydów w moczu od obecności choroby nowotworowej, gdzie stosuje się metodę rozpoznawania obrazów: metodę cząstkową najmniejszych kwadratów z funkcją probabilistyczną p-PLS-DA, w której zestaw danych dzieli się w sposób losowy na zestaw kalibracyjny i zestaw testowy, przy czym przy pomocy metody p-PLS-DA dla zestawu kalibracyjnego uzyskuje się model klasyfikacyjny, którego parametry określa się stosując zestaw testowy.