MX2008004811A - Deteccion de cancer de prostata. - Google Patents

Abstract

Los métodos y equipos para detectar cáncer de próstata en muestras de orina, incluyen detectar el estado de metilación de varios genes.

Description

DETECCION DE CANCER DE PROSTATA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere a la interrogación de genes metilados de acuerdo con otros métodos y equipos de diagnóstico para su uso con estos métodos. En eucariontes de ordenes superiores, el ADN es metilado sólo en citosinas localizadas 5' hacia la guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene importantes efectos reguladores sobre la expresión génica, especialmente cuando implica áreas ricas en CpG (islas de CpG) localizadas en regiones de promotores de genes. La metilación aberrante de islas de CpG normalmente no metiladas, es un evento frecuente en células inmortalizadas y transformadas, y se ha asociado con la inactivación, por transcripción, de ciertos genes supresores de tumores o genes de otra manera asociados con la mejora de ciertos cánceres en humanos. Muchos marcadores de metilación potenciales se han descrito recientemente. Las glutatión S-transferasas (GSTs) son ejemplos de proteínas en las cuales el estado de metilación de los genes que las expresan puede tener importante valor de pronóstico y diagnóstico para cáncer de próstata. Las proteínas catalizan reacciones de destoxificación intracelulares, incluyendo la inactivación de carcinógenos electrofílicos, conjugando electrófilos químicamente reactivos con glutatión (véase C. B. Pickett, et al., Annu. Rev. Biochem., 58: 743, 1989; B. Coles, er a/., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25: 47, 1900; y T. H. Rushmore, er a/., J. Biol. Chem. 268: 1 1475, 1993). Las GSTs humanas, codificadas por varios genes diferentes en diferentes loci, se han clasificado en cuatro familias referidas como alfa, mu, pi y theta (B. Mannervik, et al., Biochem. J., 282: 305, 1992). La expresión disminuida de GSTP1 que resulta de cambios epigenéticos, se relaciona con frecuencia con cánceres de próstata y hepático. Las proteínas S 00 son proteínas de unión a calcio que están implicadas, entre otras cosas, en tumorigénesis. La familia incluye S100A2, S100A4, S100A5, S100A6, A100A8, S100A9 y S100A1 1 , que se ha mostrado todas poseen cierta relación con el desarrollo de tumores, aunque precisamente esa función no ha sido clara. La expresión de S100A6 (calcilina) parece derivarse en el desarrollo de cáncer de próstata. Se ha mostrado que S100A2 exhibe también expresión disminuida en cáncer de mama, pulmón y próstata. Se cree que esto se debe a la hipermetilación del promotor de genes, pero el panorama no es claro, puesto que se observa también hipermetilación en el epitelio de próstata no maligno y BPH. La toma de muestras y la preparación de las muestras, son factores importantes en la realización de pruebas epigenéticas. Cada fuente de muestras tiene sus problemas. Incluso muestras de biopsia tomadas directamente del tejido afectado, se sabe presentan la posibilidad de resultados falsos negativos debido a la distribución desigual de las células afectadas. La orina es una muestra deseable, debido a que puede obtenerse menos invasivamente que muchas otras muestras potenciales. El número y la concentración de células de cáncer de próstata arrojadas en la orina pueden ser extremadamente variables, dependiendo de un sinnúmero de factores tales como cuando la orina es colectada, si es colectada conforme al masaje de la próstata, y la presencia y el efecto de nucleasas y reactivos y métodos para reducir al mínimo su efecto. Mientras que algunos han propuesto la realización de pruebas del cáncer de próstata en muestras de orina, en realidad la producción de dicha prueba ha demostrado ser difícil. Primero, se presume que la base para dicha prueba es el esparcimiento de células de cáncer del tumor o la lesión en el sistema urinario. Poco se sabe realmente acerca de este proceso. Parece también probable que las concentraciones de analitos podrían variar mucho más dramáticamente que en otras muestras tales como la biopsia de tejido e incluso muestras de suero, dependiendo de una amplia gama de factores fisiológicos y ambientales, tales como el grado al cual el paciente es hidratado. La estabilidad del analito en la matriz no está tampoco bien entendida a la luz de la presencia de nucleasas y una amplia variedad de otras sustancias que pueden afectar a los ácidos nucleicos. La preparación de las muestras para muchas otras pruebas de la orina, usa muestras centrifugadas referidas como sedimentos. Si esto tiene sentido para los marcadores de metilación, no puede suponerse a priori. La preparación del paciente y las opciones de pretratamiento tampoco están bien entendidas. Los exámenes rectales digitales (DRE) son procedimientos de diagnóstico estándar para determinar la salud de la próstata, en los cuales el médico nota anormalidades anatómicas. En el pasado, el resultado de los DRE se usó para determinar si una biopsia u otro procedimiento de diagnóstico o terapéutico serían necesarios. Si y a qué grado procedimientos tales como los DRE o el masaje de la próstata relacionado hace que las células sean desechadas de modo que se detectarían entonces en el procedimiento de diagnóstico subsiguiente, fue incierto. Desde el punto de vista del procedimiento, los DRE y el masaje rectal digital y el tiempo en el cual se realizan pueden diferir ampliamente, añadiéndose además a la lista de desconocimientos en esta área.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto de la invención, un método para caracterizar cáncer de próstata en un paciente, comprende poner a prueba la metilacion de GSTP1 y uno o más genes control en la orina dentro de tres días de su colecta. La prueba es considerada como positiva para cáncer de próstata, si el grado de metilacion de GSTP1 excede un valor predeterminado, y es considerada como negativa para cáncer de próstata, si el valor predeterminado no es excedido. En otro aspecto de la invención, un método para caracterizar cáncer de próstata en un paciente comprende poner a prueba la metilacion de GSPT1 , uno o más genes control, y el gen S100 en la orina dentro de tres días de su colecta. Un valor normalizado de GSTP1 se determina comparando el valor de prueba de metilacion de GSTP1 con el valor de prueba de metilacion de S100. La prueba es considerada como positiva para cáncer de próstata, si el valor de prueba de metilacion normalizado excede un valor predeterminado, y es considerada como negativa para cáncer de próstata, si el valor predeterminado no es excedido. En otro aspecto de la invención, un método para caracterizar cáncer de próstata en un paciente comprende poner a prueba la metilacion de GSTP1 y uno o más genes control, realizada como una reacción de PCR anidada. La prueba es considerada como positiva para cáncer de próstata, si el grado de metilacion de GSTP1 excede un valor predeterminado, y es considerada como negativa para cáncer de próstata, si el valor predeterminado no es excedido. En otro aspecto de la invención, se detecta la metilacion de los siguientes paneles de genes: a. GSTP1 , APC. b. GSTP1 , APC, S100A2. c. GSTP1 , RAR 2. d. GSTP1 , RAR ß2, S100A2. Los paneles pueden incluir también genes control. En otro aspecto de la invención, se determina el estado de metilacion mediante PCR en tiempo real cuantitativa. En otro aspecto, la invención es un equipo útil para la detección de un ácido nucleico metilado. El equipo incluye uno o más contenedores; un primer contenedor que contiene un reactivo que modifica citosina no metilada, y un segundo contenedor que contiene un reactivo que inicia la amplificación de un ácido nucleico que contiene a CpG, en donde el reactivo distingue entre ácido nucleico metilado y no metilado modificado. El equipo contiene instrucciones para realizar la prueba en pacientes que se sospecha tienen cáncer de próstata. En otro aspecto de la invención, el equipo incluye un recipiente de reacción que tiene componentes separados en los cuales los iniciadores se almacenan inicialmente, y en donde durante el uso del equipo, los iniciadores son exudados en una cámara de reacción de acuerdo con una secuencia tal que el estado de metilacion puede evaluarse adecuadamente. Los iniciadores pueden ser para llevar a cabo reacciones de amplificación anidada.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La prueba basada en orina de esta invención se realiza de preferencia en pacientes que han tenido una prueba de PSA con ambigüedad o dificultad para determinar resultados (más preferiblemente 2.5-4.0 ng/ml). Un resultado negativo usando la prueba de esta invención (en ausencia de otros indicios clínicos) puede prescindir del paciente de la realización de pruebas más invasivas tales como con un procedimiento de biopsia. De esta manera, visto más inclusivamente, un método de conformidad con la invención implica realizar primero una prueba de PSA en un paciente, y realizar entonces la prueba descrita más enteramente más adelante en aquellos pacientes que tienen nivel de PSA puesto a prueba a 2.5-4.0 ng/ml. Las pruebas de la invención detectan hipermetilación de ácidos nucleicos que corresponden a genes particulares cuyo estado de metilación se correlaciona con cáncer de próstata. Un ácido nucleico corresponde a un gen cuyo estado de metilación se correlaciona con cáncer de próstata, cuando el estado de metilación de dicho gen provee información acerca del cáncer de próstata y la secuencia es una porción codificante del gen o su complemento, una porción representativa del gen o su complemento, un promotor o secuencia reguladora para el gen o su complemento, una secuencia que indica la presencia del gen o su complemento, o la secuencia de longitud completa del gen o su complemento. Dichos ácidos nucleicos son referidos como marcadores en esta especificación. Los marcadores corresponden sólo a los siguientes genes: GSTP1 (Seq. ID. No. 17), APC (promotor = Seq. ID. No. 18, Gen = Seq. ID. No. 19), RAFq32 (Seq. ID No. 20), S100A2 (Seq. ID. No. 21 ). Otras secuencias de interés incluyen genes constitutivos útiles como controles de prueba, tales como beta-actina (Seq. ID. No. 22 y 23) y PTGS2 (promotor = Seq. ID. No. 24, Gen = Seq. ID. No. 25). Las pruebas para detectar hipermetilación incluyen técnicas tales como MSP y análisis por endonucleasas de restricción. La región de promotor es un objetivo particularmente notable para detectar dicho análisis de hipermetilación. El análisis de la secuencia de la región de promotor de GSTP1 muestra que casi 72% de los nucleótidos son CG, y aproximadamente 10% son dinucleótidos CpG. La invención incluye determinar el estado de metilacion de ciertas regiones de los marcadores en la orina o los lavados uretrales, y en las cuales el ADN asociado con cáncer de próstata es amplificado y detectado. Puesto que un nivel disminuido de la proteína codificada por el marcador (es decir, menos transcripción) es con frecuencia el resultado de hipermetilación de una región particular tal como el promotor, es deseable determinar si dichas regiones son hipermetiladas. Esto se ve más demostrablemente en el caso del gen GSTP1 y en los paneles indicados en la breve descripción de la invención. Una sonda de ácido nucleico o reportero específico para ciertas regiones de marcadores se usa para detectar la presencia de regiones metiladas del gen marcador. Las regiones hipermetiladas son aquellas que son metiladas a un mayor grado estadísticamente significativo en muestras de tejido enfermo en comparación con tejido normal. Como se indicó anteriormente, la orina es la matriz en la cual las pruebas de esta invención se realizan. Más preferiblemente, se colecta después del masaje de la próstata y se almacena a 4°C hasta que pueda ser sedimentada. Es más preferiblemente centrifugada dentro de 4 horas. El masaje prostético, cuando se realiza en conjunto con los análisis de metilacion de la invención, se lleva a cabo mejor de la siguiente manera: la glándula es presionada con bastante firmeza para deprimir la superficie de la base hacia el ápice, y de la lateral hacia la línea media para cada lóbulo para asegurar la liberación de un número suficiente de células de la próstata. Se prefiere más que este procedimiento de masaje se realice por 20 segundos o menos. Algunos de los iniciadores/sondas o reactivos de reporteros de la invención se usan para detectar la metilación de secuencias de control de la expresión de los genes marcadores. Estos son secuencias de ácido nucleico que regulan la transcripción y, en algunos casos, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. De esta manera, las secuencias de control de la expresión pueden incluir secuencias implicadas con promotores, intensificadores, terminadores de transcripción, codones de inicio (es decir, ATG), señales de empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada del ARN mensajero, y codones de detención. El promotor de GSTP1 es el marcador más preferido. Es una secuencia de polinucleótidos que puede dirigir la transcripción del gen para producir una proteína glutatión-s-transferasa. La región de promotor se localiza hacia el extremo 5', o 5' hacia el gen estructural. Puede incluir elementos que son suficientes para hacer que la expresión del gen dependiente del promotor sea controlable por señales o agentes específicos del tipo de célula, específicos de tejidos o inducibles por señales o agentes externos; dichos elementos pueden localizarse en las regiones 5' o 3' de la secuencia de polinucleótidos. Un método de la invención incluye poner en contacto una célula objetivo que contiene un marcador con un reactivo que se une al ácido nucleico. El componente de la célula objetivo es un ácido nucleico tal como ADN extraído de la orina mediante lisis y purificación de células (basada en columna o solución), dando ADN puro que carece de proteínas. Los reactivos incluyen componentes que inician y sondean reacciones de PCR o MSP y detectan la secuencia objetivo. Estos reactivos pueden incluir secuencias de iniciación combinadas con o unidas a segmentos de su propio reportero, tales como aquellos referidos como reactivos Scorpion o reporteros Scorpion, y descritos en las patentes de E.U.A. 6,326,145 y 6,270,967 a Whitcombe et al., (incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). Aunque no son lo mismo, los términos "iniciadores" y "secuencias de iniciación" pueden usarse en esta especificación para referirse a moléculas o porciones de moléculas que inician la amplificación de secuencias de ácido nucleico. Un método sensible para detectar patrones de metilación, implica combinar el uso de enzimas sensibles a la metilación y la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Después de la digestión del ADN con la enzima, la PCR amplificará a partir de iniciadores que flanqueen el sitio de restricción, sólo si la digestión del ADN fue prevenida por la metilación. Los iniciadores de PCR de la invención están diseñados para elegir como objetivo la región de promotor y de transcripción que está aproximadamente entre -71 y +59 pb de acuerdo al número de posicionamiento genómico de M24485 (GenBank) a partir del sitio de inicio de la transcripción de GSTP . El método de la invención puede incluir también poner en contacto una muestra que contenga ácido nucleico con un agente que modifique citosina no metilada; amplificar el ácido nucleico que contiene a CpG en la muestra por medio de oligonucleótidos iniciadores específicos de CpG; y detectar el ácido nucleico metilado. La modificación preferida es la conversión de citosinas no metiladas a otro nucleótido que distinguirá la citosina no metilada de la citosina metilada. De preferencia, el agente modifica la citosina no metilada a uracilo y es bisulfito de sodio; sin embargo, pueden usarse también otros agentes que modifiquen citosina no metilada, pero no citosina metilada. Se prefiere más la modificación con bisulfito de sodio (NaHSO3), y reacciona fácilmente con el doble enlace 5,6 de la citosina, pero poco con la citosina metilada. La citosina reacciona con el ión bisulfito para formar un intermediario sulfonado de la reacción de la citosina susceptible a desaminación, dando lugar a un uracilo sulfonado. El grupo sulfonato puede removerse bajo condiciones alcalinas, resultando en la formación de uracilo. El uracilo es reconocido como una timina por la Taq polimerasa (ADN polimerasa de Thermus aquaticus), y por lo tanto después de la PCR, el producto resultante contiene citosina sólo en la posición en donde ocurre 5-metilcitosina en el molde de partida. Los reactivos y reporteros Scorpion y otros sistemas de detección, distinguen en forma similar especies modificadas de especies no modificadas tratadas de esta manera. Los iniciadores usados en la invención para la amplificación de un ácido nucleico que contiene CpG en la muestra, después de modificación (por ejemplo, con bisulfito), distingue específicamente entre ADN sin tratar, ADN metilado y ADN no metilado. En la PCR específica de metilación (MSPCR), iniciadores o secuencias de iniciación para el ADN no metilado tienen de preferencia una T en el par CG 3' que la distinguen de la C retenida en el ADN metilado, y el complemento está diseñado para el iniciador antisentido. Los iniciadores de MSP o secuencias de iniciación para el ADN no metilado, contienen usualmente relativamente pocas Cs o Gs en la secuencia, puesto que las Cs estarán ausentes en el iniciador sentido, y las Gs estarán ausentes en el iniciador antisentido (la C llega a ser modificada a U (uracilo), que es amplificado como T (timidina) en el producto de amplificación). Los iniciadores de la invención son oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia adecuada para proveer iniciación específica de polimerización en un número significativo de ácidos nucleicos en el locus polimórfico. Cuando se exponen a sondas o reporteros adecuados, las secuencias que son amplificadas revelan el estado de metilación, y de esta manera información de diagnóstico. Los iniciadores preferidos tienen más preferiblemente ocho o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos capaces de iniciar la síntesis de un producto de extensión del iniciador, que es sustancialmente complementario a una cadena del locus polimórfico. Condiciones ambientales que llevan a la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleosido y un agente para la polimerización, tal como la ADN polimerasa, y una temperatura y pH adecuados. El segmento de iniciación o la secuencia de iniciador o de iniciación es de preferencia de cadena sencilla para eficiencia máxima en amplificación, pero puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena, el iniciador se trata primero para separar sus cadenas antes de que sea usado para preparar productos de extensión. El iniciador debe ser de longitud suficiente para iniciar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente de inducción para la polimerización. La longitud exacta del iniciador dependerá de factores tales como la temperatura, regulador de pH, cationes y composición de nucleótidos. Los oligonucleótidos iniciadores contienen más preferiblemente aproximadamente 12 a 20 nucleótidos, aunque pueden contener más o menos nucleótidos, de preferencia de acuerdo con reglas o normas generales de diseño bien conocidas. Los iniciadores están diseñados para ser sustancialmente complementarios a cada cadena del locus genómico que será amplificada, e incluyen los nucleótidos G o C adecuados como se discutió anteriormente. Esto significa que los iniciadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus cadenas respectivas bajo condiciones que permitan que el agente para la polimerización funcione. En otras palabras, los iniciadores deben ser suficientemente complementarios con las secuencias flanqueantes 5' y 3' para hibridar y permitir la amplificación del locus genómico. Los iniciadores se usan en el procedimiento de amplificación. Es decir, reacciones (de preferencia, una reacción en cadena enzimática) que producen mayores cantidades del locus objetivo respecto al número de pasos de reacción implicados. En una modalidad más preferida, la reacción produce cantidades exponencialmente más grandes del locus objetivo. Reacciones tales como éstas incluyen la PCR. Típicamente, un iniciador es complementario a la cadena negativa (-) del locus, y el otro es complementario a la cadena positiva (+). La unión de los iniciadores a ácido nucleico desnaturalizado, seguida de extensión con una enzima tal como el gran fragmento de la ADN polimerasa I (Klenow) y nucleótidos, resulta en cadenas + y - recién sintetizadas que contienen a la secuencia del locus objetivo. El producto de la reacción en cadena es un dúplex de ácido nucleico discreto con extremos que corresponden a los extremos de los iniciadores específicos usados. Los iniciadores pueden prepararse usando cualquier método adecuado, como es el caso de los métodos convencionales de fosfotriéster y fosfodiéster que incluyen métodos automatizados. En una de dichas modalidades automatizadas, se usan díetilfosforamiditas como materiales de partida, y pueden sintetizarse como es descrito por Beaucage, et al. (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981 ). Un método para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte sólido modificado, se describe en la patente de E.U.A. No. 4,458,066. Cualquier muestra de ácido nucleico tomada de la orina o el lavado uretral, en forma purificada o no purificada, puede usarse como el ácido nucleico o los ácidos nucleicos de partida, siempre que contenga, o se sospeche que contenga, la secuencia de ácido nucleico específica que contiene al locus objetivo (por ejemplo, CpG). De esta manera, el procedimiento puede usar, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero. El ADN o ARN puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. En caso de que se use ARN como molde, se usarían enzimas y/o condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde a ADN. Además, puede usarse un híbrido de ADN-ARN que contenga una cadena de cada uno. Puede usarse también una mezcla de ácidos nucleicos, o pueden usarse de esta manera los ácidos nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa en la presente, usando los mismos iniciadores o iniciadores diferentes. La secuencia de ácido nucleico específica que será amplificada, es decir, el locus objetivo, puede ser una fracción de una molécula más grande, o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de modo que la secuencia específica constituya el ácido nucleico entero. Si la muestra extraída es impura, puede tratarse antes de la amplificación con una cantidad de un reactivo efectiva para abrir las células, fluidos, tejidos o membranas de células animales de la muestra, y para exponer y/o separar las cadenas de los ácidos nucleicos. Este paso de lisis y desnaturalización del ácido nucleico para exponer y separar las cadenas, permitirá que la amplificación ocurra mucho más fácilmente. En donde la secuencia de ácido nucleico objetivo de la muestra contenga dos cadenas, es necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de que puedan usarse como el molde. La separación de las cadenas puede efectuarse como un paso separado o simultáneamente con la síntesis de los productos de extensión del iniciador. Esta separación de las cadenas puede lograrse usando varias condiciones de desnaturalización adecuadas, que incluyen medios físicos, químicos o enzimáticos. Un método físico para separar cadenas de ácido nucleico, implica calentar el ácido nucleico hasta que sea desnaturalizado. La desnaturalización con calor típica puede implicar temperaturas que varían de aproximadamente 80 a 105°C por hasta 10 minutos. Puede inducirse también la separación de las cadenas mediante el uso de una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o mediante la enzima RecA, que tiene actividad de helicasa, y en presencia de riboATP, que se sabe desnaturaliza al ADN. Condiciones de reacción que son adecuadas para la separación de las cadenas de ácidos nucleicos usando helicasas, son descritas por Kuhn Hoffmann-Berlíng (CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978). Técnicas para el uso de RecA se revisan en C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405-437, 1982). Refinamientos de estas técnicas son ahora también bien conocidos. Cuando se separan cadenas complementarías de un ácido nucleico o ácidos nucleicos, sin considerar si el ácido nucleico era originalmente de doble cadena o de cadena sencilla, las cadenas separadas están listas para ser usadas como molde para la síntesis de cadenas de ácido nucleico adicionales. Esta síntesis se realiza bajo condiciones que permiten que ocurra la hibridación de iniciadores con moldes. En general, la síntesis ocurre en una solución acuosa regulada en su pH, de preferencia a un pH de 7 a 9, más preferiblemente aproximadamente 8. Un exceso molar (para ácido nucleico genómico, usualmente aproximadamente 108: 1 , iniciador: molde) de los dos oligonucleótidos iniciadores, se añade de preferencia al regulador de pH que contiene a las cadenas molde separadas. La cantidad de cadena complementaria puede no ser conocida si el procedimiento de la invención se usa para aplicaciones de diagnóstico, de modo que la cantidad de iniciador respecto a la cantidad de cadena complementaria no puede siempre determinarse con certeza. Sin embargo, como un asunto práctico, la cantidad de iniciador añadido estará generalmente en exceso molar sobre la cantidad de cadena complementaria (molde) cuando la secuencia que será amplificada está contenida en una mezcla de cadenas de ácido nucleico de cadena larga complicadas. Un gran exceso molar se prefiere para mejorar la eficiencia del procedimiento. Los trifosfatos de desoxirribonucleósido dATP, dCTP, dGTP y dTTP se añaden a la mezcla de síntesis, ya sea por separado o en conjunto con los iniciadores, en cantidades adecuadas, y la solución resultante se calienta a aproximadamente 90-100°C por hasta 0 minutos, de preferencia de 1 a 4 minutos. Después de este período de calentamiento, se deja que la solución se enfríe a temperatura ambiente, lo cual es preferible para la hibridación del iniciador. A la mezcla enfriada se añade un agente adecuado para efectuar la reacción de extensión del iniciador (el "agente para la polimerización"), y se deja que la reacción ocurra bajo condiciones conocidas en la técnica. El agente para la polimerización puede añadirse también junto con los otros reactivos, si es estable al calor. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede ocurrir a temperatura ambiente hasta una temperatura a la cual el agente para la polimerización deje de funcionar.

El agente para la polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para lograr la síntesis de productos de extensión del iniciador, de preferencia enzimas. Enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa de T4, otras ADN polimerasas disponibles, mutantes de polimerasa, transcriptasa inversa y otras enzimas, que incluyen enzimas termoestables (por ejemplo, aquellas enzimas que realizan la extensión del iniciador después de ser sometidas a temperaturas suficientemente elevadas para causar la desnaturalización). Un agente preferido es la Taq polimerasa. Enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos en la forma adecuada para formar los productos de extensión del iniciador complementarios a cada cadena de ácido nucleico del locus. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada iniciador, y procederá en la dirección 5' a lo largo de la cadena molde, hasta que la síntesis concluya, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Sin embargo, puede haber agentes para la polimerización que inicien la síntesis en el extremo 5' y procedan en la otra dirección, usando el mismo procedimiento como se describió anteriormente. Más preferiblemente, el método de amplificación es mediante PCR. Pueden usarse también métodos de amplificación alternativos, en tanto los loci metilados y no metilados amplificados mediante PCR usando los iniciadores de la invención, sean amplificados en forma similar mediante los medios alternativos. En una de dichas modalidades más preferidas, la prueba se lleva a cabo como una PCR anidada. En los métodos de PCR anidada, se llevan a cabo dos o más reacciones en cadena de polimerasa graduadas. En una reacción en cadena de polimerasa de la primera etapa, un par de oligonucleótidos iniciadores exteriores, que consisten de un iniciador superior y un iniciador inferior que flanquean una primera secuencia de nucleótidos objetivo particular en la posición 5' y 3', respectivamente, se usan para amplificar esa primer secuencia. En etapas subsiguientes, una segunda serie de oligonucleótidos iniciadores interiores o anidados, que consisten también de un iniciador superior y un iniciador inferior, se usan para amplificar una segunda secuencia de nucleótidos objetivo más pequeña que está contenida dentro de la primera secuencia de nucleótidos objetivo. Los iniciadores interiores superior e inferior flanquean la segunda secuencia de nucleótidos objetivo en las posiciones 5' y 3', respectivamente. Iniciadores flanqueantes son complementarios a segmentos en las porciones del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos objetivo de doble cadena que es amplificada durante el procedimiento de PCR. La primer secuencia de nucleótidos dentro de la región del gen elegido como objetivo para la amplificación en la reacción en cadena de polimerasa de la primera etapa, es flanqueada por un iniciador superior en la posición hacia el extremo 5' y un iniciador inferior en la posición hacia el extremo 3'. La primer secuencia de nucleótidos elegida como objetivo, y por ende el producto de amplificación de la reacción en cadena de polimerasa de la primera etapa, tiene una longitud de pares de bases predicha, la cual es determinada por la distancia de pares de bases entre las posiciones de hibridación hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de los iniciadores superior e inferior, respectivamente, del par de iniciadores exteriores. En el extremo de la reacción en cadena de polimerasa de la primera etapa, una alícuota de la mezcla resultante es reservada en una reacción en cadena de polimerasa de la segunda etapa. Esta es conducida de preferencia dentro de un recipiente sellado o cerrado automáticamente, tal como con el dispositivo "SMART CAP" de Cepheid. En esta reacción de la segunda etapa, los productos de la reacción de la primera etapa se combinan con los iniciadores interiores o anidados específicos. Estos iniciadores interiores se derivan de secuencias de nucleotidos dentro de la primera secuencia de nucleotidos elegida como objetivo, y flanquean una segunda secuencia de nucleotidos elegida como objetivo más pequeña contenida dentro de la primera secuencia de nucleotidos elegida como objetivo. Esta mezcla se somete a pasos iniciales de desnaturalización, unión y extensión, seguidos de termociclización como se indicó anteriormente, que permiten la desnaturalización, unión y extensión o replicación repetidas de la segunda secuencia de nucleotidos elegida como objetivo. Esta segunda secuencia de nucleotidos elegida como objetivo es flanqueada por un iniciador superior en la posición hacia el extremo 5' y un iniciador inferior en la posición hacia el extremo 3'. La segunda secuencia de nucleotidos elegida como objetivo, y por ende el producto de amplificación de la PCR de la segunda etapa, tiene también una longitud de pares de bases predicha, la cual es determinada por la distancia de pares de bases entre las posiciones de hibridación hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de los iniciadores superior e inferior, respectivamente, del par de iniciadores interiores. Los productos amplificados se identifican de preferencia como metilados o no metilados con una sonda o reportero específico del producto, como se describe en la patente de E.U.A. 4,683,195 a Mullís et al., incorporada en su totalidad en la presente como referencia. Avances en el campo de sondas y reporteros para detectar polinucleótidos, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Opcionalmente, el patrón de metilación del ácido nucleico puede confirmarse mediante otras técnicas tales como digestión con enzimas de restricción y análisis Southern blot. Ejemplos de endonucleasas de restricción sensibles a la metilación que pueden usarse para detectar la metilación de CpG 5', incluyen Smal, Sacll, Eagl, Mspl, Hpall, BstUI y BssHIl. En otro aspecto de la invención, se usa una relación de metilación. Esta puede hacerse estableciendo una relación entre la cantidad lograda de especies de marcador metilado amplificado, y la cantidad de marcador de referencia amplificado o región de marcador no metilado amplificado. Esto se hace mejor usando PCR en tiempo real cuantitativa. Las relaciones arriba de un límite o umbral establecido o predeterminado son consideradas como hipermetiladas, e indicativas de que se tiene un trastorno proliferativo tal como cáncer (cáncer de próstata en el caso de GSTP1 ). Se establecen límites de acuerdo a métodos conocidos en los cuales dichos métodos se usan para por lo menos dos series de muestras: aquellas con condiciones de enfermedad conocidas, y aquellas con condiciones normales conocidas. Los marcadores de referencia de la invención pueden usarse también como controles internos. El marcador de referencia es de preferencia un gen que es expresado constitutivamente en las células de las muestras tales como beta actina. Valores establecidos o predeterminados (valores límite o umbral) se establecen también, y se usan en métodos de conformidad con la invención en los cuales no se usa una relación. En este caso, el valor límite se establece con respecto a la cantidad o el grado de metilación respecto a algún valor del punto de partida, tal como la cantidad o el grado de metilación en muestras normales o en muestras en las cuales el cáncer es clínicamente insignificante (se sabe que no progresa hacia estados clínicamente relevantes o no es agresivo). Estos límites se establecen de acuerdo a métodos bien conocidos como en el caso de su uso en métodos basados en una relación de metilación. En la modalidad más preferida de la invención, los valores de metilación de GSTP1 obtenidos mediante MSP u otros métodos adecuados son normalizados con valores de metilación de S100A2, determinados usando el mismo método. El valor normalizado se obtiene restando el valor de prueba de S100A2 del valor de GSTP1 como se muestra en el ejemplo 7. Pueden usarse también otros métodos de normalización tales como la generación de una relación de metilación (obtenida convirtiendo el valor de Ct a un número de copias para el gen de interés, y dividiendo ese número de copias entre el número de copias de beta-actina, obtenido de la misma forma). Cuando se usa un valor normalizado, el valor límite se determina generando primero una serie de preparación en la cual el límite genera sensibilidad y especificidad óptimas, y validando entonces el límite en una serie de validación independiente. Los métodos y equipos inventivos pueden incluir pasos y reactivos para correlación múltiple. Es decir, más de un marcador puede ponerse a prueba a la vez. Sin embargo, sólo los siguientes marcadores se ponen a prueba como parte de esta invención: GSTP1 , RAR- 2, APC y S100A2, junto con controles internos tales como ß-actina. Puesto que un nivel de transcripción disminuido del gen asociado con el marcador es con frecuencia el resultado de hipermetilación de la secuencia de polinucleótidos y/o elementos particulares de las secuencias de control de la expresión (por ejemplo, la secuencia de promotor), se prepararon iniciadores preparados para comparar esas secuencias. Por consiguiente, la invención provee métodos para detectar o diagnosticar un trastorno proliferativo celular detectando la metilación de áreas particulares, de preferencia, dentro de la región de promotor o de control de la expresión de los marcadores. Sondas útiles para detectar la metilación de estas áreas, son útiles en dichos métodos de diagnóstico o de pronóstico. Los equipos de la invención pueden configurarse con una variedad de componentes, siempre que todos ellos contengan por lo menos un iniciador o sonda o una molécula de detección (por ejemplo, un reportero Scorpion). En una modalidad, el equipo incluye reactivos para amplificar y detectar segmentos de marcador hipermetilados. Opcionalmente, el equipo incluye reactivos de preparación de muestras y/o artículos (por ejemplo, tubos) para extraer ácidos nucleicos de muestras. En un equipo preferido, se incluyen reactivos necesarios para MSP en un tubo tales como una serie de iniciadores de PCR correspondientes, una ADN polimerasa termoestable, tal como Taq polimerasa, y reactivos de detección adecuados tales como sondas de hidrólisis o guías moleculares. En equipos opcionalmente preferidos, los reactivos de detección son reporteros o reactivos Scorpion. Puede usarse también un iniciador colorante individual o un colorante fluorescente específico para ADN de doble cadena, tal como bromuro de etidio. Los iniciadores están de preferencia en cantidades que dan altas concentraciones. Materiales adicionales en el equipo pueden incluir: viales o tubos de reacción adecuados, una composición de barrera, típicamente una perla de cera, opcionalmente incluyendo magnesio; reguladores de pH y reactivos necesarios tales como dNTPs; ácidos nucleicos control y/o cualquier regulador de pH adicional, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros y similares adicionales, que puedan usarse en reacciones de MSP. Opcionalmente, los equipos incluyen materiales y reactivos de extracción de ácido nucleico.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de muestras y MSPCR Se obtuvieron muestras de próstata de pacientes con resultados clínicos conocidos. Las pruebas de metilación se llevaron a cabo como sigue. Se modificó ADN genómico usando un equipo de reactivo de conversión de bisulfito de sodio disponible comercialmente (Zymo Research, Orange, CA, USA). Este tratamiento convirtió todas las citosinas en ADN no metilado en uracilo, mientras que en el ADN metilado sólo las citosinas que no preceden a la guanina fueron convertidas en uracilo. Todas las citosinas que preceden a la guanina (en un dinucleótido CpG) continuaron siendo citosina. Las pruebas se describen más enteramente a continuación. a. Sedimentación: Se obtuvieron muestras de orina sedimentada como sigue. Tubos Falcon de 50 mi que contenían la orina se centrifugaron a 3000 g en una centrífuga VRX Sorvall por 10 minutos a +4°C. El sobrenadante se removió dejando aproximadamente 5 mi arriba de la pella. Los tubos se centrifugaron entonces de nuevo (3000 g por 5 minutos) para desechar el sobrenadante restante (usando puntas de 1 mi). El sedimento de la orina se enjuagó entonces con 20 mi de PBS frío (4°C), se centrifugó de nuevo (3000 g por 5 minutos), y el sobrenadante residual se aspiró. Las muestras se almacenaron entonces a -20°C. b. Lisis de las células y extracción de ADN Las células en el sedimento se lisaron entonces como sigue. Se añadieron 700 µ? de solución de lisis de células a cada muestra que contenía una pella de células de orina. El lisado se transfirió entonces a un tubo micrófugo de 2.0 mi, y se añadieron 3 µ? de solución de proteinasa K (20 mg/ml) al lisado, se mezcló mediante inversión 25 veces, y se incubó por una hora hasta la noche a 55°C. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente por colocación a 20°C (bloque de calentamiento) por 10 minutos. Se añadieron entonces 300 µ? de solución de precipitación de proteínas al lisado, el cual se sometió entonces a acción de remolino vigorosamente a alta velocidad por 20 segundos. Las muestras se pusieron en un baño de hielo por 5 minutos, y se centrifugaron a 16000 RPM por 5 minutos. Las proteínas precipitadas formaron una pella apretada. El sobrenadante se transfirió entonces a un nuevo tubo de 2.0 mi, repitiéndose los pasos de precipitación. El sobrenadante que contenía al ADN se transfirió entonces a un tubo micrófugo limpio de 2.0 mi, y se repitió la centrifugación (16000 RPM por 3 minutos), con el sobrenadante siendo transferido de nuevo a un tubo micrófugo limpio de 2.0 mi que contenía 900 µ? de isopropanol a 100% y 2 µ? de 20 mg/ml de glucógeno. La muestra se mezcló mediante inversión poco a poco 50 veces, y se mantuvo a temperatura ambiente por cuando menos 10 a 15 minutos sobre el balancín, y se enfrió entonces a -20°C. La muestra se centrifugó entonces a 16000 RPM por 5 minutos. El ADN fue visible entonces como una pequeña pella blanca. El sobrenadante se removió con la pipeta de 1 mi, y la muestra se centrifugó a 16000 RPM por 60 segundos. El sobrenadante restante se removió con una pipeta de 100 µ?. Se añadieron 900 µ? de etanol a 70%, y el tubo se invirtió 10 veces para lavar la pella de ADN, seguido de otra centrifugación a 16000 RPM por 1 minuto. Se desechó el etanol con la pipeta de 1 mi, seguido de otra centrifugación a 16000 RPM por 60 segundos. El sobrenadante restante se desechó con la pipeta de 100 µ?, y se dejó que la muestra se secara al aire por 10 a 15 minutos. Se añadieron 45 µ? de regulador de pH LoTE a las muestras desecadas, y el ADN se rehidrató mediante incubación a 65°C por 1 hora con agitación a 1 100 rpm y agitación durante la noche a 20°C a 1 100 rpm. El ADN se almacenó en un tubo claramente marcado a -80°C. c. Modificación con bisulfito Muestras de ADN se modificaron entonces usando el equipo de metilación EZ-DNA de ZymoResearch (número de catálogo D5001 ), como sigue. Se añadieron 24 mi de etanol absoluto al concentrado de regulador de pH de lavado leve, para obtener el regulador de pH de lavado leve final. Se añadieron 5 µ? de regulador de pH de dilución leve directamente a 45 µ? de la muestra de ADN. Esta mezcla se mezcló pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugando entonces brevemente, seguido de incubación a 37°C por 15 minutos en un bloque de calentamiento con agitación a 1 100 rpm. Durante la incubación, se preparó reactivo de conversión CT añadiendo 750 µ? de agua Baker y 210 µ? de regulador de pH de dilución leve. Se mezcló entonces por acción de remolino por 1 minuto cada 2 minutos para un total de 10 minutos. Después de la incubación anterior, se añadieron 100 µ? del reactivo de conversión CT preparado (después de centrifugación breve) a cada muestra, la cual entonces se sometió a acción de remolino ligeramente, y se centrifugó brevemente. La muestra se incubó entonces a 70°C por 3 horas con el bloque de calentamiento (agitación a 1 100 rpm) cubierto con hoja delgada de aluminio. La muestra se centrifugó entonces brevemente, y se puso en hielo por 10 minutos. Se añadieron 400 µ? de regulador de pH de unión leve a la muestra, la cual se mezcló pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Todo el sobrenadante se cargó en una columna Zymo-Spin, la cual se puso en un tubo de colecta de 2 mi. El tubo se centrifugó a velocidad máxima por 15 a 30 segundos, y el flujo pasante se desechó. Se añadieron 200 µ? de regulador de pH de lavado leve a la columna, la cual se centrifugó a velocidad máxima por 15 a 30 segundos de nuevo desechándose de nuevo el flujo pasante. Se añadieron 200 µ? de regulador de pH de desulfonación leve a la columna, y se dejó reposando a temperatura ambiente por 15 minutos, seguido de centrifugación a velocidad máxima por 15 a 30 segundos, desechándose el flujo pasante. Este procedimiento fue seguido tres veces, durando el último paso de centrifugación 30 segundos. La columna se puso entonces en un tubo limpio de 1.5 mi al cual se añadieron 50 µ? de regulador de pH elución leve. Las columnas se dejaron entonces reposando por 1 minuto a temperatura ambiente, seguida de centrifugación a velocidad máxima por 1 minuto para eluir el ADN. El ADN eluido se marcó y se almacenó como "modificado con BT" a -80°C. Se emprendieron entonces pruebas de MSPCR, con los siguientes iniciadores y sondas: Iniciadores de PCR exteriores GSTP1 332 U18 Seq ID No. 1 TCGGGGATTTTAGGGCGT GSTP1 513 L21 Seq ID No. 2 ACGAAAACTACGACGACGAAA Actina 309 U24 Seq ID No. 5 GATATAAGGTTAGGGATAGGATAG Actina 501 L22 Seq ID No. 6 AACCAATAAAACCTACTCCTCC APC exterior 692 U19 Seq ID No. 9 CCCTATACCCCACTACGAA APC exterior 830 L25 Seq ID No. 10 GGCGGGTTGTATTAATATAGTTATA RARB2 exterior 16 U25 Seq ID No. 13 GGAAGTGAGTTGTTTAGAGGTAGGA RARB2 exterior 239 L25 Seq ID No. 14 TCCAAACTTACTCGACCAATCCAAC Series de sonda/iniciador Scorpion interiores para PCR BHQ = molécula reportera atenuadora Black Hole.

HEG=hexaetilenglicol. Se llevaron a cabo reacciones de PCR anidada usando tubos "SMARTCAP" (Cepheid), y el analizador de PCR "SMARTCYCLER" (Cepheid), como sigue. Cada uno de los reactivos descongelados se sometió brevemente a acción de remolino para mezclado. Tubos de reacción de PCR SmartCap Cepheid adecuados se marcaron y se pusieron en el estante.

Mediante el uso de una punta de pipeta nueva para cada tubo, se añadieron 5 µ? de la mezcla maestra de PCR de la primera ronda en cada tubo. De nuevo con una punta de pipeta nueva para cada muestra, se añadieron 5 µ? de la muestra a los tubos respectivos, los cuales se cerraron entonces sin que se cerraran de golpe las SmartCaps en su lugar. Los tubos se centrifugaron por 30 segundos en la centrífuga "SMARTCYCLER", y se pusieron en secuencia en el instrumento "SMARTCYCLER" con la tapa sobre el instrumento cerrado "SMARTCYCLER", y se inició la prueba. Las condiciones de ciclización en la plataforma Cepheid se indican a continuación (PCR de la primera ronda).

Después de concluir la prueba los tubos se removieron, y se emprendió una segunda ronda de PCR como sigue. La tapa del tubo se abrió, seguida de la adición de 15 µ? de la mezcla maestra de PCR de la segunda ronda en el depósito "SMARTCAP" hasta el volumen final de 25 µ?. La espiga se insertó y la tapa se cerró de golpe en su lugar. Los tubos se centrifugaron entonces por 30 segundos en la microcentrífuga con un rotor adecuado. La reacción de PCR interior se emprendió entonces por 40 ciclos bajo condiciones de ciclización en la plataforma Cepheid como se indica a continuación (PCR de la segunda ronda). Después de concluir la prueba, los tubos Cepheid se removieron y se desecharon.

Se usaron los siguientes parámetros de ciclización.

PCR de la primera ronda Temperatura Tiempo Ciclos 94°C 2 minutos 1 92°C 20 segundos 55°C 30 segundos 18 70°C 30 segundos 70°C 5 minutos 1 PCR de la segunda ronda Temperatura Tiempo Ciclos 95°C 1 minuto 1 95°C 20 segundos 40 59°C 30 segundos colecta La mezcla de reacción para un cuádruplo individual en los tubos SMARTCAP, se preparó usando los siguientes componentes individuales.

Las mezclas maestras de PCR se prepararon como sigue (mezclas de sonda/iniciador Scorpion interiores y exteriores): 10X mezcla cuádruple de iniciadores exteriores GSTP1-0.5/RARB-0.5/APC-0.5 MM/actina-0.4 µ? Concentración final de iniciadores exteriores: GSTP1 -0.05/RARB-0.05/APC-0.05 M/actina-0.04 µ? Los cálculos se muestran para una reacción individual y un lote de 200 Concentración del iniciador µ? por 1 rxn 200 100 µ? GSTP1 332 U18 0.005 1 100 µ? GSTP1 513 L21 0.005 1 100 µ? APC_exterior_692_U19 0.005 1 100 µ? ??? exterior 830 L25 0.005 1 100 µ? RARB2 exterior 16_U25 0.005 1 100 µ? RARB2_exterior_239_L25 0.005 1 100 µ? actina 309 U24 0.004 0.8 100 µ? actina_501_L22 0.004 0.8 Agua 0.962 192 Total 1 200 El contenido de la reacción final de 25 µ?, fue la siguiente: Datos generados del analizador "SMARTCYCLER".

Los datos se analizaron a través de la implementación de umbrales predeterminados, y los criterios se muestran en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Se generaron resultados, y se presentan como las siguientes características de desempeño de la prueba: % de sensibilidad, especificidad e intervalos de confianza de 95% calculados para la combinación de marcadores en límites de Ct definidos para el formato de PCR 2 en 1 . Se calcularon valores del área bajo la curva con base en el análisis de la curva de ROC realizada con dos paquetes de software estadísticos. Para el análisis de marcadores individuales, se generaron valores de AUC usando el software MedCalc, y para diferentes combinaciones de marcadores múltiples, se aplicó el modelo de regresión logística en el software estadístico S-Plus. Se estableció un valor límite con base en la distribución relativa de valores de Ct entre los pacientes con cáncer y los pacientes sin cáncer. Si uno de los valores de Ct de la serie de marcadores de metilación estaba abajo del límite definido, la muestra era considerada como metilada, incluso si la actina indicaba el caso de "sin prueba". Las cifras muestran los datos comparados a través de una variedad de parámetros que ilustran las varias modalidades de la invención.

EJEMPLO 2 Efecto del almacenamiento de las muestras y la identificación de los paneles El procedimiento descrito en el ejemplo 1 se repitió con combinaciones de pruebas que comprendían una combinación de marcadores de los genes GSTP1 , RAR 2 y APC. Se realizaron pruebas dentro de 3 días de colecta de las muestras, 5 días de colecta de las muestras, y 16 días de colecta de las muestras, según se indica. Los resultados se muestran en el cuadro 2.

CUADRO 2 La serie de muestras para este ejemplo fueron muestras de orina entera (pura), y consistió de 148 muestras (68 cánceres conocidos) para la serie de 6 días, 121 muestras (52 cánceres conocidos) para la serie de 5 días, y 73 muestras (30 cánceres conocidos) para la serie de 3 días. Sorprendentemente, la combinación de GSTP y RAR 2 mejoró la combinación de GSTP, RAR 2 y APC a pesar de APC, que es un marcador de cáncer de próstata conocido. Esta combinación de dos genes bastamente mejoró cualquier otra cuando las muestras se almacenaron por tres días o menos. Cuando se consideraron todas las pruebas, el valor profético positivo para las muestras almacenadas por 3 días fue de 65.9% en comparación con 51 .35% para las muestras mantenidas por 5 días, y de 47.22% para las muestras almacenadas por 16 días. Se realizaron entonces análisis de curvas de ROC para nuevas series de datos (N = 73, cánceres conocidos = 30, cánceres no conocidos = 43), usando muestras de orina entera y usando sedimentos preparados como se describió anteriormente, y almacenadas por 3 días. El área bajo la curva se determinó para marcadores individuales. Los resultados se resumen en el cuadro 3.

CUADRO 3 GSTP por sí mismo dio los mejores resultados mediante análisis de ROC cuando las muestras fueron de orina entera (pura). La centrifugación de la muestra para sedimentos mejoró notablemente el desempeño del marcador RARß como se muestra mediante este mismo análisis.

EJEMPLO 3 Masaje de la próstata Dos series de muestras adicionales se pusieron a prueba y se analizaron para determinar el efecto del masaje prostético sobre el desempeño de la prueba basada en orina. En la primera serie de muestras, se obtuvieron 36 muestras (20 cánceres conocidos) de pacientes que tuvieron masaje prostético limitado a menos de 20 segundos. En la otra serie de muestras, se obtuvieron 77 muestras (30 cánceres conocidos) de pacientes que tuvieron masaje prostético por más de 20 segundos. En cada caso, las muestras se almacenaron por 5 días o menos. Los resultados de la MSPCR realizada en estas muestras, se resumen en el cuadro 4.

CUADRO 4 Masaje Sensibilidad Especificidad GSTP RARp2 APC (segundos) (%) (%) X <20 39 100 X <20 33 93 X <20 39 80 X <20 50 87 X X <20 56 93 X X <20 56 87 X X X <20 61 87 X X X <20 61 93 X >20 33 93 X >20 37 91 X >20 41 76 X >20 37 84 X X >20 48 89 X X >20 41 82 X X X >20 48 82 X X X >20 52 82 Los mejores resultados se obtuvieron del panel que incluía a GSTP, RAR y APC cuando el masaje de la próstata tuvo menos de 20 segundos de duración. Esto es sorprendente, ya que se habría esperado que el masaje más duradero libere más células e incremente, por lo menos, la especificidad.

EJEMPLO 4 Examen rectal digital Cuatro series de muestras adicionales se pusieron a prueba y se analizaron para determinar el efecto de la selección sobre la base de un examen rectal digital (DRE) anormal contra normal sobre el desempeño de la prueba basada en orina. En la primera serie de muestras, se obtuvieron 64 muestras de orina entera (23 cánceres conocidos) de pacientes que tenían un DRE normal. En la segunda serie de muestras, se obtuvieron 33 muestras de orina entera (19 cánceres conocidos) de pacientes que tenían un DRE anormal. La tercera serie de muestras contenía 48 muestras sedimentadas (21 cánceres conocidos) que se presentaron con un DRE normal, y la cuarta serie de muestras contenía 22 muestras sedimentadas (8 cánceres conocidos) de pacientes con DREs anormales. En cada caso, las muestras se almacenaron por 5 días o menos. Los resultados de la MSPCR realizada en estas muestras, se resumen en el cuadro 5.

CUADRO 5 Los marcadores usados con muestras seleccionadas de pacientes con un DRE anormal, funcionaron sustancialmente mejor que los casos en los cuales los pacientes tuvieron DREs negativos. Se pusieron a prueba muestras de orina entera de pacientes con DREs anormales con casi el mismo grado de sensibilidad y especificidad que las mejores muestras sedimentadas cuando el panel de marcadores se formó de GSTP y APC. Una prueba de marcadores individuales (APC) fue la mejor en muestras sedimentadas con un DRE anormal, pero el panel de GSTP/APC no estuvo muy atrás.

EJEMPLO 5 Nivel de PSA Dos series de muestras adicionales se pusieron a prueba y se analizaron para determinar el efecto de la selección de la muestra con base en el nivel de PSA. En la primera serie de muestras, se obtuvieron -52 muestras de orina entera (25 cánceres conocidos) de pacientes que tenían un valor de PSA de 2.5-4 ng/ml. En la otra serie de muestras, se obtuvieron 169 muestras (80 cánceres conocidos) de pacientes que tenían un nivel de PSA de 4-10 ng/ml. En cada caso, las muestras se almacenaron dentro de 5 días a 4°C entre los procedimientos de colecta y sedimentación de la orina. Los resultados de la MSPCR realizada en estas muestras, se resumen en el cuadro 6 más adelante. Para 52 sujetos con niveles de PSA entre 2.5 y 4 ng/mL (incluyendo 25 casos de cáncer y 27 casos sin cáncer), se demostró sensibilidad de 58% y especificidad de 88% cuando se usó el modelo de regresión logística, o 58% y 81 %, respectivamente, cuando se usaron 3 marcadores con los siguientes límites de Ct: GSTP = 26, RAR = 28, APC = 25, y sin índice de prueba a 3.8%. Para el grupo de pacientes con PSA 4 a 10, las características de sensibilidad/especificidad fueron de 59/65% usando los mismos marcadores y límites de Ct. La prueba T de dos pruebas confirmó que no hubo diferencia estadísticamente significativa en el desempeño de la prueba entre dos grupos con escalas de PSA de 2.5-4 y 4-10 ng/mL (P = 0.000). Los resultados se muestran en el cuadro 6.

CUADRO 6 EJEMPLO 6 Correlación múltiple más extensiva Se llevó a cabo correlación múltiple más extensiva, usando marcadores adicionales conocidos por ser útiles en el análisis del cáncer de próstata. Se buscó especificidad máxima de la prueba, dado que el objetivo de la prueba fue resolver los resultados de PSA ambiguos (2.5-4 ng/ml en uso clínico). Las pruebas se realizaron en muestras de sedimento almacenadas por 3 días. Se llevó a cabo una ronda de PCR para cada una de 60 muestras (30 de casos de cáncer, 30 de muestras sin cáncer). Los datos con sedimentos de orina generados para 6 marcadores (GST+RAR+APC+RASS+CDH1 +PDLIM4) usando 3 reacciones cuádruples, demuestran que CDH1 , RASS y PDLIM4 no añaden valor para mantener la especificidad en 80%. La inclusión de los 6 marcadores mejora la especificidad de la prueba (sensibilidad = 44%, especificidad = 63%). Además, el uso de 6 marcadores no favorece el formato de prueba de tubo individual. Los resultados se muestran en el cuadro 7.

CUADRO 7 GSTP1 RAR APC RASSF1 A CDH1 D2 PDL 4D2 Sensibilidad Especificidad X X X X 41 % 80% X X X X 44% 70% X X X X 37% 83% X X X 41 % 73% X X X X X X 44% 63% X X X 38% 80% EJEMPLO 7 Normalización de resultados usando S100A2 Se pusieron a prueba muestras de orina usando cuatro marcadores (GSTP1 , RAR 2, APC y S100A2) en reacciones de MPCR como se describió anteriormente.

CUADRO 8 Los datos anteriores muestran el desempeño de tres marcadores individualmente y como una combinación en una serie representativa de 20 muestras con cáncer y 10 muestras sin cáncer. La sensibilidad es menor que la observada típicamente, debido al tiempo de almacenamiento menor que el óptimo de las muestras de orina antes de la sedimentación. Las mismas muestras se analizaron entonces con S100 y la delta Ct entre S100, y el gen de interés se usó para generar un límite. Los datos muestran desempeño mejorado para RAR 2 y APC, pero no GSTP1 . Este efecto diferencial se observó debido a que los casos limítrofes para RARP2 y APC pudieron asignarse ahora ambiguamente como cáncer, mejorando la sensibilidad. No hubo casos limítrofes para GSTP1 en esta serie de datos; sin embargo, es el por qué la sensibilidad se mantuvo sin cambios.

CUADRO 9 Pru-Mu-Norm S100 GSTP1 RAR APC Sensibilidad 20.00% 15.00% 20.00% Especificidad 90.00% 100.00% 90.00% GSTP1 /APC/RARB2 Sensibilidad 40.00% Especificidad 80.00%

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 . - Un método para detectar cáncer de próstata, que comprende obtener una muestra de orina de una persona, y determinar el estado de metilación de sólo el gen GSTP1 y uno o más controles en la muestra de orina no después de tres días después de que se obtuvo dicha muestra de orina; en donde la metilación que excede un valor predeterminado es indicativa de cáncer de próstata, y la metilación que no excede dicho valor predeterminado es indicativa de la ausencia de cáncer de próstata. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende medir la presencia de un marcador de referencia, y en donde antes de la colecta de dicha muestra de orina, la persona se somete a masaje prostático por aproximadamente 20 segundos. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende los pasos de determinar el nivel de PSA de dicha persona, y llevar a cabo dicho método sólo en una persona que tenga un nivel de PSA entre 2.5 y 4 ng/ml. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el estado de metilación de los genes se determina usando PCR anidada, en donde una primera ronda de PCR se lleva a cabo seguida de una ronda subsiguiente de PCR, en donde iniciadores y sondas para llevar a cabo dicha PCR subsiguiente son dirigidos hacia secuencias dentro de las secuencias amplificadas en la primera ronda de PCR, y en donde las muestras de orina se centrifugan para formar sedimentos antes de llevar a cabo la primera ronda de PCR. 5. - Un método para detectar cáncer de próstata, que comprende obtener una muestra de orina de una persona, determinar el estado de metilación de sólo el gen S 00 y sólo uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de GSTP1 , APC y RAR 2 y uno o más controles en la muestra de orina no después de tres días después de que se obtuvo dicha muestra de orina; en donde si el valor de Ct de la metilación de los genes GSTP1 , APC o RAR 2 menor que el del gen S100 excede un valor predeterminado, es indicativo de cáncer de próstata, y la metilación que no excede dicho valor predeterminado es indicativo de la ausencia de cáncer de próstata. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende adicionalmente medir la presencia de un marcador de referencia, y en donde antes de la colecta de dicha muestra de orina, la persona se somete a masaje prostático por aproximadamente 20 segundos. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de determinar el nivel de PSA de dicha persona, y llevar a cabo dicho método sólo en una persona que tenga un nivel de PSA entre 2.5 y 4 ng/ml. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el estado de metilación de los genes se determina usando PCR anidada, en donde una primera ronda de PCR se lleva a cabo seguida de una ronda subsiguiente de PCR, en donde iniciadores y sondas para llevar a cabo dicha PCR subsiguiente son dirigidos hacia secuencias dentro de la secuencia amplificada en la primera ronda de PCR, y en donde las muestras de orina se centrifugan para formar sedimentos antes de llevar a cabo la primera ronda de PCR. 9. - Un método para detectar cáncer de próstata, que comprende obtener una muestra de orina de un paciente, determinar el estado de metilación de sólo el gen GSTP1 , RAR i , APC y uno o más controles en la muestra de orina; en donde la metilación que excede un valor predeterminado es indicativa de cáncer de próstata, y la metilación que no excede dicho valor predeterminado es indicativa de la ausencia de cáncer de próstata, en donde dicho método se lleva a cabo en un recipiente individual que se deja no abierto durante la realización del método. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende adicionalmente medir la presencia de un marcador de referencia. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de determinar el nivel de PSA de dicha persona, y llevar a cabo dicho método sólo en una persona que tenga un nivel de PSA entre 2.5 y 4 ng/ml. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el estado de metilaclón de los genes se determina usando PCR anidada, en donde una primera ronda de PCR se lleva a cabo seguida de una ronda subsiguiente de PCR, en donde iniciadores y sondas para llevar a cabo dicha PCR subsiguiente son dirigidos hacia secuencias dentro de las secuencias amplificadas en la primera ronda de PCR, y en donde las muestras de orina se centrifugan para formar sedimentos antes de llevar a cabo la primera ronda de PCR. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque antes de la colecta de dicha muestra de orina, la persona se somete a masaje prostático por aproximadamente 20 segundos. 14. - Un método para detectar cáncer de próstata, que comprende obtener una muestra de orina de un paciente con un DRE anormal, determinar el estado de metilación de sólo el gen GSTP1 , RAR I y APC y uno o más controles en la muestra de orina; en donde la metilación que excede un valor predeterminado es indicativa de cáncer de próstata, y la metilación que no excede dicho valor predeterminado es indicativa de la ausencia de cáncer de próstata, en donde dicho método se lleva a cabo en un recipiente individual que se deja no abierto durante la realización del método. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende adicionalmente medir la presencia de un marcador de referencia. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de determinar el nivel de PSA de dicha persona, y llevar a cabo dicho método sólo en una persona que tenga un nivel de PSA entre 2.5 y 4 ng/ml. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el estado de metilación de los genes se determina usando PCR anidada, en donde una primera ronda de PCR se lleva a cabo seguida de una ronda subsiguiente de PCR, en donde iniciadores y sondas para llevar a cabo dicha PCR subsiguiente son dirigidos hacia secuencias dentro de las secuencias amplificadas en la primera ronda de PCR, y en donde las muestras de orina se centrifugan para formar sedimentos antes de llevar a cabo la primera ronda de PCR. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque antes de la colecta de dicha muestra de orina, la persona se somete a masaje prostético por aproximadamente 20 segundos. 19.- Un método para detectar cáncer de próstata, que comprende obtener una muestra de orina de un paciente con un DRE anormal, determinar el estado de metilación de sólo el gen GSTP1 y el gen RARpI y uno o más controles en la muestra de orina; en donde la metilación que excede un valor predeterminado es indicativa de cáncer de próstata, y la metilación que no excede dicho valor predeterminado es indicativa de la ausencia de cáncer de próstata, en donde dicho método se lleva a cabo en un recipiente individual que se deja no abierto durante la realización del método. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque comprende adicionalmente medir la presencia de un marcador de referencia. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque comprende adicionalmente los pasos de determinar el nivel de PSA de dicha persona, y llevar a cabo dicho método sólo en una persona que tenga un nivel de PSA entre 2.5 y 4 ng/ml. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el estado de metilación de los genes se determina usando PCR anidada, en donde una primera ronda de PCR se lleva a cabo seguida de una ronda subsiguiente de PCR, en donde iniciadores y sondas para llevar a cabo dicha PCR subsiguiente son dirigidos hacia secuencias dentro de las secuencias amplificadas en la primera ronda de PCR, y en donde las muestras de orina se centrifugan para formar sedimentos antes de llevar a cabo la primera ronda de PCR. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque antes de la colecta de dicha muestra de orina, la persona se somete a masaje prostético por aproximadamente 20 segundos. 24.- Un equipo para llevar a cabo una prueba para detectar cáncer de próstata, que comprende: amplificación de ácido nucleico y reactivos de detección para detectar la presencia de genes que consisten esencialmente de GSTP1 y uno o más genes control, e instrucciones que dirigen su uso en pacientes que tienen niveles de PSA medidos de 2.5-4 ng/ml. 25. - Un equipo para llevar a cabo una prueba para detectar cáncer de próstata, que comprende: amplificación de ácido nucleico y reactivos de detección para detectar la presencia de genes que consisten esencialmente de GSTP1 , RAR i y uno o más genes control, e instrucciones que dirigen su uso en pacientes que tienen niveles de PSA medidos de 2.5-4 ng/ml. 26. - Un equipo para llevar a cabo una prueba para detectar cáncer de próstata, que comprende: amplificación de ácido nucleico y reactivos de detección para detectar la presencia de genes que consisten esencialmente de GSTP1 , RAR i , APC y uno o más genes control, e instrucciones que dirigen su uso en pacientes que tienen niveles de PSA medidos de 2.5-4 ng/ml. 27. - Un equipo para llevar a cabo una prueba para detectar cáncer de próstata, que comprende: amplificación de ácido nucleico y reactivos de detección para detectar la presencia del gen S100A2 y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de GSTP, RAR i y APC y uno o más genes control.