KR20110055598A - 전립선암 메틸화 분석 - Google Patents
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Abstract
전립선암을 진단 또는 예측하는 분석법은 GSTP, APC, 및 RARβ2 유전자의 과메틸화의 탐지를 포함하며, 이는 노모그램에 포함될 수 있다.
Description
본 출원은 2008년 8월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/086,218호의 이득을 청구한다.
혈청중 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen; PSA)의 측정은 현재 전립선암 스크리닝에 대한 관심사의 전형이다. PSA 검사의 낮은 특이성은 다수의 환자의 불필요한 생검으로 이어지는 것으로 밝혀졌으며, 전형적으로 이는 스크리닝될 수 있는 PSA 범위를 4 ng/㎖를 초과하는 환자에 한정시킨다.
새로운 분석법에서는, 전립선암 존재를 나타내는 3가지의 마커(GSTP1, RARβ2 및 APC)의 프로모터 영역들 내에서 CpG 섬(island) 메틸화 (후성유전적(epigenetic) 변형)를 탐지하기 위하여 메틸화 특이적 PCR (Methylation Specific PCR; MSP)이 이용된다. 이 분석은 9곳의 임상 현장에서 수집된 337가지의 DRE 후(post-DRE) 소변 샘플 (187가지의 암 및 이형성 / 150가지의 비암)에 의해 평가되었다. 환자는 연령 범위가 40세 내지 75세였으며, PSA 수준이 2 내지 10 ng/㎖이었다. 생검 조직에서 조직학에 의해 결정되는 바와 같이 전립선암의 탐지에서 당해 분석에 있어서 52%의 민감성 및 81%의 특이성이 관찰되었다. 로지스틱 회귀 알고리즘(logistic regression algorithm)을 통하여 0.67의 곡선하 면적(area under the curve; AUC) 값이 당해 분석에 있어서 제시되었다. 이 분석법을 노모그램(nomogram) 또는 PCPT 위험 계산기(risk calculator)와 함께 사용하였을 때 노모그램 또는 PCPT 위험 계산기 단독과 비교하여 AUC의 증가 (0.69 및 0.72) 및 나타낸 통계적 유의도(p = 0.008 및 0.043)가 제시되었다. 이 분석법의 양성 예측도(positive predictive value)는 1가지 (48%), 2가지 (60%), 또는 3가지 (71%)의 마커가 동일 대상에서 양성일 때 증가하였다. 180가지의 DRE 후 소변 샘플 (103가지의 암 및 이형성 / 비암 77가지)의 하위세트를 최적화된 분석 절차에 따라 준비하였을 때, 60%의 민감성 및 81%의 특이성 (AUC 0.72)이 관찰되었다.
본 발명은 전립선암에 관련된 유전자의 과메틸화를 탐지하는 분석법에 관한 것이며, 이는 GSTP1, APC, RARβ2 또는 이들의 조합의 존재를 탐지하기 위한 시약을 포함한다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기 시약은 표 1에 나타낸 프라이머류, 프로브류, 및 스콜피온 시약류의 군으로부터 선택되는 프라이머, 프로브 또는 스콜피온(Scorpion) 시약을 포함한다.
본 발명의 다른 태양에서, 본 분석법은 의심되는 전립선암 환자의 진단 또는 예후를 결정하기 위하여 노모그램과 함께 사용된다.
GSTP, APC, 및 RARβ2 마커의 탐지를 포함하는 과메틸화 분석법이 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20080254455호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 이들 분석법은 현재 개선되었으며, 이는 다른 진단 및 위험 인자 지시자와 함께 사용될 수 있다.
이전의 전립선암 병력이 없는 337명의 겉보기에 건강한 남성으로 이루어진 집단을 이용한 연구에서 소변 샘플을 9곳의 상이한 비뇨기과학적 임상 현장으로부터 얻었다. 전립선 표면을 0.5 내지 1.0 ㎝ 누르는 것, 및 전립선 엽(lobe) 당 최소 3회의 스트로크 동안 기저부(base)로부터 첨부(apex)로 그리고 측부로부터 중앙선으로 이동하는 것으로 이루어진 규정된 DRE에 따라 소변 샘플 (최대 40 ㎖)을 수집하였다. 소변 수집 용기의 내용물을 800 ㎕의 0.5 M EDTA를 함유하는 50 ㎖ 수송 튜브 내로 옮겼다. 수송 튜브를 수집 후 최대 3일 동안 2 내지 8℃에 보관하고, 표준 얼음 팩(ice pack)과 함께 하룻밤 운송시켰다. 수령시, 수송 튜브를 3000 g에서 4℃에서 10분 동안 즉시 원심분리하거나, 또는 동일 부분들로 나누고 이어서 3000 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 소변 샘플을 나누어서 샘플 준비 최적화 및 전체 능력 평가 둘 모두에 도움이 되게 하였다. 상청액을 버렸으며, 생성된 펠렛을 냉 PBS로 세척한다. DNA를 젠트라 퓨어진 키트(Gentra Puregene Kit) (독일 소재의 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 추출하고, 에피텍트 키트(Epitect Kit) (독일 소재의 퀴아젠)를 사용하여 변형시켰는데, 이는 패키지 인서트(package insert)에 따른 것이었다. 모든 샘플을 25 ㎕ 부피로 용출시켰다. 5 ㎕의 변형 DNA를 스마트사이클러(SmartCycler) (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 세페이드(Cepheid))에서 전립선암 메틸화 분석법을 이용하여 분석하였다.
3가지의 메틸화 마커 (GSTP1, RARB, 및 APC) 및 내부 대조군 β-액틴을 위한 프라이머 및 스콜피온 프로브 (미국 캘리포니아주 노바토 소재의 바이오서치 테크놀로지즈(Biosearch Technologies))를 2단계 다중(multiplexed) MSP 분석에서의 사용을 위해 선택하였다. 제1 단계인 증폭은 5 ㎕의 증폭 믹스(mix), 5 ㎕의 효소 믹스 및 5 ㎕의 샘플을 스마트캡(SmartCap) 튜브 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 세페이드(Cepheid))에 첨가하는 것으로 이루어졌다. 효소 믹스는 증폭 단계 및 탐지 단계 둘 모두에서의 사용을 위해 조제하였으며, 8 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 5 mM KCl, 0.005% BSA, 0.6U/㎕ 패스트스타트(FastStart) Taq DNA 폴리머라아제 및 0.016% 프로클린(ProClin)(등록상표) 300으로 이루어져 있다.
증폭 단계 사이클은 하기와 같았다: 95℃, 5분, 이어서 95℃, 20초, 55℃, 30초, 70℃, 30초, 및 70℃, 5분에서의 18 사이클. 증폭 믹스는 8가지의 프라이머 - 각각 GSTP1, RARB, APC의 경우 20 nM, β-액틴의 경우 16 nM - , 75 mM D-트레할로스 탈수화물, 0.1% 트윈(Tween)(등록상표) 20 용액 10%, 25 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 1 M, 1.75 mM MgCl2 용액, 1% DMSO, 0.155 mM dNTP 믹스, 0.016% 프로클린(등록상표) 300을 함유한다.
증폭 단계의 완료시 스마트캡 튜브를 당해 장비로부터 꺼냈다. 제2 단계인 탐지 단계는 5 ㎕의 탐지 믹스 및 5 ㎕의 효소 믹스를 스마트캡 튜브에 첨가하는 것으로 이루어졌다. 이 분석 사이클은 하기와 같다: 95℃, 5분, 이어서 95℃, 20초 및 55℃, 30초의 40 사이클. 탐지 믹스는 하기, 즉 8가지의 프라이머 대신 4가지의 프라이머 - 각각 GSTP1, RARB, APC 및 β-액틴의 경우 200 nM - , 및 4가지의 스콜피온 프로브 - 각각 GSTP1, RARB, APC 및 β-액틴의 경우 200 nM - 라는 것을 제외하고는 상기 증폭 믹스에 대하여 설명한 대로 정확하게 조제하였다. 각각의 실행에서, 음성β-액틴) 및 양성(GSTP1, APC, RARβ2) 합성 외부 대조군을 이용하여 분석 유효성을 결정하였다.
분류 분석은 당해 연구 집단 내의 환자들의 공지된 생검 결과에 기반하였다. 사이클 역치(Cycle threshold; Ct) 값들을 이용하여 GSPT1, RARβ2 및 APC 마커에 있어서의 독립적 분석 컷오프(cutoff)를 생성하였다. 불충분한 DNA 양이 원인인 것으로서 시험 무효율(No Test Rate; NTR)을 결정하기 위하여 β-액틴의 Ct 값 컷오프를 이용하였다. 3가지의 메틸화 마커의 세트로부터의 하나의 Ct 값이 규정된 컷오프보다 작을 경우 샘플은 메틸화에 대하여 양성인 것으로 간주되었다. 규정된 컷오프보다 큰 Ct 값을 갖는 샘플은 메틸화에 대하여 음성인 것으로 스코어링되었다. NTR을 β-액틴의 Ct 컷오프에 기반하여 계산하였다. 수신자 조작 특성 곡선하 면적(Area Under the operating receiver Curve; AUC) 값을 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic; ROC) 분석에 기반하여 계산하였다. 단일 마커 및 다중 마커의 분석에 있어서의 AUC 값들을 메드칼크(MedCalc) (벨기에 소재의 메드칼크 소프트웨어(MedCalc Software))를 이용하여 생성하였다. 다중 마커 분석에 있어서 로지스틱 회귀 모델을 메드칼크를 이용하여 생성하였다.
이 분석은 전립선암 환자와 음성 생검 결과를 갖는 환자를 구별하는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 음성 생검 결과를 갖는 남성 및 양성 생검 결과를 갖는 남성에서의 GSTP1, RARβ2, 및 APC Ct 값들은 유의하게 상이하였으며 (각각 p = 0.009, 0.000 및 0.039), 양성 ROC 곡선을 나타냈다. 3가지의 마커를 조합하면, 이 분석은 생검 조직 (정확히 말하면, 84가지의 암 및 104가지의 비암)에 대한 조직학적 발견에 의해 결정되는 바와 같이 전립선암의 탐지에 있어서 52%의 민감성 및 81%의 특이성을 나타냈다. 당해 분석에서의 위양성 중 다수는 비정상적 DRE 및/또는 다중 마커 - 이는 양성임 - 를 가졌다. 위양성에 대한 잠재적인 설명 중에는 전립선 생검시의 샘플링 오차, 또는 메틸화되었지만 비암성인 전립선 세포의 존재가 있다. 모든 3가지의 마커를 이용한 로지스틱 회귀 알고리즘에서 AUC 값은 0.67이었다. 누가 전립선 생검을 받아야 하는지를 결정하기 위하여 총 혈청중 PSA가 위험 인자로서 일반적으로 이용된다. 전립선암 메틸화 분석 및 PSA의 능력을 비교하였다. 이 연구 집단에서 PSA의 ROC 곡선 분석은 0.55의 AUC를 나타낸 반면 이 분석은 PSA 단독과 비교하여 통계적 유의도 (p =0.01)를 나타냈다. 더욱 중요하게는, 단변량 및 다변량 로지스틱 회귀 모델 둘 모두에 의하면 이 분석은 심지어 다중 위험 인자를 분석할 때에도 전립선암의 유의한 예측인자(significant predictor)였다 (p = 0.001).
더 큰 능률 및 효율을 제공하기 위하여 PSA 단독이라기보다 오히려 노모그램 또는 예측 알고리즘에서의 다중 위험 인자들의 조합이 공개된 문헌 내에서 증가 추세이다. 전립선암 메틸화 분석과, 환자의 연령, PSA, 및 DRE 결과 및 PCPT 위험 계산기로 이루어진 일반적으로 사용되는 노모그램의 비교가 나타내어져 있다. PCPT 위험 계산기 파라미터에 대한 정보를 253명의 대상으로부터 얻었다. 노모그램을 이용한 로지스틱 회귀 알고리즘에서 AUC 값은 0.61이었다. 흥미롭게도, PCPT 위험 계산기에서 AUC는 0.67이었다. 전립선암 메틸화 분석은 노모그램 또는 PCPT 위험 계산기와 비교할 때 통계적으로 유의하지 않았다 (각각 p = 0.150 및 0.935). 그러나, 이 분석은 노모그램 또는 PCPT 위험 계산기와 함께 AUC를 향상시켰으며 (각각 0.69 및 0.72), 노모그램 또는 PCPT 계산기 단독과 비교할 때 통계적 유의도 (각각 p = 0.008 및 0.043)를 나타냈다. 전립선암 메틸화를 추가로 평가하기 위하여, 개별 임상 현장으로부터의 분석 데이터를 평가하였다. 시험한 전체 집단과 현장들 사이의 차이는 ROC 곡선의 독립적인 분석을 수행할 때 유의하지 않았다.
이 분석의 예측도는 GSTP1, RARβ2 및 APC 마커의 높은 특이성에 의해 강조된다. 1, 2, 또는 3가지 마커가 양성인 것에 따라 환자 코호트(cohort)를 계층화할 때, 분석 능력의 양성 예측도(PPV)는 개선되었다 (48% - 71%). 이는 2가지 이상의 마커가 분석에서 존재할 때 암을 가질 가능성이 더 크다는 것을 시사한다.
전립선 세포 메틸화 분석의 예측도는 이 분석법의 높은 특이성에 의해 강조된다. 이는 발현 기반 분석과 비교하여 이용되는 MSP 방법에 기인할 수 있다. 이 분석의 마커들은 각각 90%, 89% 및 95%의 높은 특이성을 나타냈다. PCA3 마커에 비하여 이 분석법의 다른 이점은 3가지 유전자의 다중 분석법의 독특한 성질인데, 상기 분석법은 환자가 다수의 마커를 제공할 때 임상의가 더 높은 수준의 확신을 가질 수 있게 한다. 25% 암 유병률에서의 이 분석법의 관찰된 PPV는 1가지 (48%), 2가지 (60%), 또는 3가지 (71%)의 마커가 동일 대상에서 양성일 때 개선되었다.
분석 스코어의 제공을 위하여 사용되는 알고리즘은 메틸화 특이적 PCR(MSP) Ct 값의 선형 조합의 로지스틱 함수에 기반하며, 양성 생검의 확률과 관련될 것이다. 당해 모델은 개체를 높은 위험 값 또는 낮은 위험 값에 두는데, 여기서 결정이 더 쉽게 이루어진다. 구체적으로, "높은" 스코어 (60.00 초과)는 3.0 초과의 우도비(likelihood ratio)를 가질 것이며, "낮은" 스코어 (29.00 미만)는 0.35 미만의 우도비를 가질 것이다. 상기 스코어는 양성 생검을 가질 확률에 관하여 환자가 의사와 더 박식한 논의를 하게 한다.
· 스코어 = 100 × 1 / [1+exp(선형 Ct 조합)],
· 여기서 "선형 Ct 조합"은 시험 데이터에 기반하여 형성된다:
· 1.7887 + (-0.0686 × GSTP1_Ct) + (-0.03947 × RARβ2_Ct) + (-0.01263 × APC_Ct) + (0.09862 × β-액틴_Ct)
분석 스코어는 기타 공지된 위험 인자와 조합될 때 양성 전립선 생검을 예측하는 데 있어서 통계적으로 유의한 인자일 것이다. 위험 인자는 연령, 전립선암의 가족력, PSA 수준, 인종 및 이전의 음성 전립선 생검을 포함할 것이다.
표 1에서의 디자인은 마커들을 CpGM 및 CpGU DNA에서 평가하였을 때 원래의 실행가능 디자인과 비교하여 향상된 특이성을 나타낸다. 더 큰 특이성의 마커 디자인인 CpGU에 비하여 더 큰 Ct 값 차이가 CpGM으로부터 유래된다.
| 증폭 믹스 | |
| 전방향 프라이머 | 서열 ID |
| TTTTTGCGGTCGACGTTCG | GSTP1-F |
| GATATAAGGTTAGGGATAGGATAG | B-액틴-F |
| CCTATACCCCACTACGAAATACGA | APC-F |
| GGGATTAGAATTTTTTTATGCG | RARB2-F |
| 역방향 프라이머 | 서열 ID |
| CGCCCCAATACTAAATCACG | GSTP1-R |
| AACACACAATAACAAACACAAATTCAC | B-액틴-R |
| GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG | APC-R |
| CTTGACAAAAAACCTTCCGAATACG | RARB2-R |
| 탐지 믹스 | |
| 스콜피온 프로브/프라이머 하이브리드 | 서열 ID |
| FAM-CCGGGCGAACTCCCGCCGAGCCCGG-BHQ-HEG-TCGGGGTGTAGCGGTCGTCG | GSTP1-FAM |
| Q670CCGGGGCCTCCATCACCACCCCGG-BHQ2-HEG-TATAGGTTGGGGAAGTTTGTTTTTG | B-액틴-Q670 |
| TR-GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ2-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCA | APC-TxR |
| Q570-CGCGGGCTACCCCGACGATACCCGCG-BHQ2-HEG-GGGATGTCGAGAACGCGAGCGA | RARB2-Q570 |
| 역방향 프라이머 | 서열 ID |
| CGCCCCAATACTAAATCACG | GSTP1-R |
| AACACACAATAACAAACACAAATTCAC | B-액틴-R |
| GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG | APC-R |
| CTTGACAAAAAACCTTCCGAATACG | RARB2-R |
원래의 GSTP1 스콜피온 디자인의 부적당한 폴딩(folding)은 taq 절단을 위한 기질로서 작용할 수 있으며, 이는 새로운 GSTP1 디자인과 비교하여 배경에서 정상 드리프트(steady drift)를 야기하는 켄처(quencher) 분자의 분해에 이르게 된다. 새로운 디자인은 전체 능력을 개선시킨다.
<110> Veridex, LLC
<120> Prostate cancer methylation assay
<130> VDX5058WOPCT
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<151> 2008-08-05
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tttttgcggt cgacgttcg 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gatataaggt tagggatagg atag 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cctatacccc actacgaaat acga 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggggattaga atttttttat gcg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cgccccaata ctaaatcacg 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
aacacacaat aacaaacaca aattcac 27
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gtcggttacg tgcgtttata tttag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cttgacaaaa aaccttccga atacg 25
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Scorpion Probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 6-carboxyfluorescein (FAM)-dATP
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> dCMP-BHQ1 (Black HOle Quencher-1)
<400> 9
ccgggcgaac tcccgccgag cccggtcggg gtgtagcggt cgtcg 45
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Scorpion Probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Q670
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(25)
<223> BHQ2-HEG
<400> 10
ccggggcctc catcaccacc ccggtatagg ttggggaagt ttgtttttg 49
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Scorpion Probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> TR-
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> BHQ2-HEG
<400> 11
gccggcgggt tttcgacggg ccggccgaac caaaacgctc ccca 44
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Scorpion Probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Q570-
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> BHQ2-HEG
<400> 12
cgcgggctac cccgacgata cccgcgggga tgtcgagaac gcgagcga 48
Claims (4)
- 전립선암에 관련된 유전자의 과메틸화 탐지용 키트로서, 상기 키트는 GSTP1, APC, RARβ2 또는 이들의 조합의 존재를 탐지하기 위한 시약을 포함하며, 상기 시약은 표 1에 나타낸 프라이머류, 프로브류 및 스콜피온(scorpion) 시약류의 군으로부터 선택되는 프라이머, 프로브 또는 스콜피온 시약을 포함하는, 전립선암에 관련된 유전자의 과메틸화 탐지용 키트.
- 표 1에 나타낸 프라이머류, 프로브류 및 스콜피온 시약류의 군으로부터 선택되는 프라이머, 프로브 또는 스콜피온 시약을 포함하는 시약을 이용하여 GSTP1, APC, RARβ2 유전자 또는 이들의 조합의 과메틸화를 탐지하는 단계를 포함하는, 전립선암을 진단 또는 예측하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 과메틸화 분석을 전립선암 진단 또는 예후의 다른 위험 인자 또는 지시자와 함께 이용하는, 전립선암을 진단 또는 예측하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 다른 위험 인자를 노모그램(nomogram)에 포함시키는, 전립선암을 진단 또는 예측하는 방법.
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