KR20080071599A - 마 종의 추출물 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료가 필요한 환자의 골다공증을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자의 골수 세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있는 유효량의 마 종의 추출물을 환자에게 경구 투여하는 것을 포함하며, 여기서 마 종의 게놈 DNA는 SEQ ID NO: 9의 프라이머로 증폭될 때, 상기 마 종은 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 적어도 14개 DNA 밴드를 포함하는 RAPD 유전자지문에 의해 특징을 나타내며, 여기서 추출물은 (a) 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매를 사용하여 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계; (b) 가용성 부분을 얻기 위해 단계 (a)에서 얻은 최종 생성물을 분리 처리하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 얻은 가용성 부분으로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
마, 골다공증, 골수세포

Description

마 종의 추출물 및 이의 의학적 용도{Extract of DISCOREA SP. and the medical uses thereof}
본 발명의 마 종의 추출물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
"와일드 얌(wild yam)"으로 알려진 마(Discorea)는 단자엽과인 마과(Discoreaceae)의 구성원으로, 열대 지방과 아열대 지방에 분포되어 있다. 전세계에 약 650개 종이 있고, 이 중 93개 종과 9개 변종은 중국에서 발견되고 14개 종과 5개 변종은 대만에서 발견된다.
마는 전통 중국 의학에서 사용된 매우 중요한 약학적 식물들 중 하나이고, 이의 의학적 효과는 수년 동안 연구되고 있다. 1936년에, 투스카모 등은 단자엽과 식물로부터 마의 스테로이드 사포닌인 디오스게닌(diosgenin)을 분리하였고 의학용 스테로이드의 빠른 합성을 위한 원료로 사용하였다. 아라드하나, 라오 아르, 케일 피케이(Indian Journal of Experimental Biology 30:367-370, 1992)에 의한 연구에서, 디오스게닌은 쥐 유선의 상피세포의 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. Biochemical & Biophysical Research Communications 207(1):398-404, Feb/1995에서, 제이.엘. 베니토트 등은 디오스게닌이 인간 적백혈병(HEL) 세포 배양액에 첨가될 때 거핵구 세포의 특성에 형태적 변화와 생화학적 변화를 유도한다고 보고하였 고, 따라서 디오스게닌은 HEL 세포의 거핵성 분화 유도인자(megakaryotic differentiation inducer)로 사용될 수 있다. Life Sciences 59(11):147-157, 1996에, 마의 스테로이드 추출물은 혈중지질농도를 변화시키는 항산화제로서 상당한 활성들을 가진다고 보고되었다.
디하이드로에피안드로스테론(DHEA)은 디오스게닌과 유사한 화학적 구조를 가지며, 항암, 항산화, 항비만 효과뿐만 아니라 골밀도의 조절에 대한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. DHEA의 혈중농도는 나이가 들수록 점점 감소하며 노화에 관련이 있다. 여러 연구로부터 마의 디오스게닌 추출물은 인체에서 DHEA로 변환될 수 있어서 노화와 함께 감소하는 DHEA를 보충한다고 예상되었다. 그러나, 이런 연구들은 디오스게닌이 혈중지질의 과산화를 감소시키고, 혈청의 트라이글리세라이드를 낮추며 고밀도(HDL) 콜레스테롤을 증가시키면서 저밀도(LDL) 콜레스테롤의 과산화 손상을 감소시키는 지를 연구하기 위해 마에 존재하는 디오스게닌을 섭취하는 노인들에만 수행되었다.
골밀도의 조절에 대한 DHEA의 효과에 대하여, Life Science 62(1):59-68, 1998에서, 벤 에이.에이. 스케빈 등은 DHEA와 이의 황산염 유도체(DHEA-S)는 그 자체로 인간 조골세포(osteoblastic cell)의 성장과 분화에 대한 직접적이고, 독립적이며, 상당한 효과를 나타내는데 실패하였으나, 골세포 조절제, 1,25(OH)2D3와 함께 세포를 처리하면, 성숙한 조골세포의 특이적 제조자인 특이적 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성을 증가시킨다고 보고하였다. 이 연구는 조골세포 성장과 분화에 대한 DHEA 및 DHEA-S에 대한 효과는 골세포에서 1,25(OH)2D3-유도 변화에 대한 효과를 통해 매개된다는 것을 보여준다.
본 발명에 따라, 특정 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분은 세포 재생에 대한 생물학적 활성을 가진다는 것이 발견되었다. 구체적으로, 마의 추출물 및 다른 추출 부분은 어떠한 골세포 조절제 없이 그 자체로 뼈의 골수전구세포를 보충하고 조골세포의 성숙과 무기화를 촉진하기 위해서 골전구세포(osteoprogenitor cells)의 증식과 분화를 자극할 수 있어서, 뼈 치료, 회복 및 재생 및 골다공증 예방 및 치료를 달성한다는 것을 발견하였다. 또한, 마의 추출물은 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)의 존재하에서 골수의 조혈줄기세포의 증식과 분화를 자극할 뿐만 아니라 항암제 처리에 의해 발생한 백혈구와 적혈구의 결핍을 겪고 있는 환자들의 회복을 도우며 따라서 화학요법 보조제로서 항암제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 치료가 필요한 환자의 골다공증을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 환자의 골수 세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있는 유효량의 마 종의 추출물을 환자에게 경구 투여하는 것을 포함하며, 여기서 마 종의 게놈 DNA는 SEQ ID NO: 9의 프라이머로 증폭될 때, 마 종은 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 적어도 14개 DNA 밴드를 포함하는 RAPD 유전자지문에 의해 특징을 나타내며, 여기서 추출물은 (a) 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매를 사용하여 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계; (b) 가용성 부분을 얻기 위해 단계 (a)에서 얻은 최종 생성물을 분리 처리하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 얻은 가용성 부분으로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
또한 본 발명은 SEQ ID NO: 9의 프라이머로 증폭될 때, 마 종은 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp 범위의 적어도 14개 DNA 밴드를 포함하는 RAPD 유전자지문에 의해 특징을 나타내는 마 종의 추출물을 제공하며, 여기서 추출물은 (a) 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매를 사용하여 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계; (b) 가용성 부분을 얻기 위해 단계 (a)에서 얻은 최종 생성물을 분리 처리하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 얻은 가용성 부분으로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 발명을 설명하기 위해서, 현재 바람직한 실시예들이 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도시된 그 장치와 수단에 한정되지 않는다는 것을 알아야 한다.
본 발명에서 사용된 용어는 청구항과 명세서의 더 나은 해석을 위해 사용될 수 있다.
"프라이머"라는 용어는 샘플 핵산의 가닥을 따라 적어도 하나의 섹션에 상보적인 핵산 절편 또는 서열을 의미하고, 프라이머의 목적은 그 스트링을 따라 샘플 핵산의 일부의 핵산 복제를 지지하고 명령하는 것이다. RAPD 증폭에서, 하나의 임의의 프라이머는 반대 DNA 가닥에서 프라이머 서열 부위들 사이에 위치한 핵산의 비-표적화된 단편을 증폭하는데 사용된다.
"검사 패널"은 상호간 유전적 유사성 또는 다른 그룹(즉, 다른 속, 종, 아종)에 대한 유전적 상이성을 기초로 선택된 개개의 유기체의 특정 그룹으로 정의된다.
"RAPD"라는 용어는 "랜덤 증폭 다형성 DNA"를 의미한다. "RAPD 증폭"은 미국특허 제 5,126,239호에 개시된 대로 핵산의 증폭된 비-표적, 랜덤 단편에 대한 임의의 서열의 짧은 프라이머를 사용하는 핵산의 단일 프라이머 유도 증폭 방법을 의미하고, 이의 공개공보는 참조로 본 발명에 포함된다. "RAPD 방법" 또는 "RAPD 분석"은 임의의 서열의 짧은 프라이머를 사용하는 핵산의 비-표적화된 증폭을 포함하는 유전자 다형성의 탐지 방법을 의미하고, "RAPD" 증폭 생산물의 프로파일 또는 유전자지문은 다형성을 탐지하기 위해 샘플들 사이에서 비교된다. "RAPD 프라이머"는 본 방법에 따른 RAPD 증폭 또는 RAPD 분석에 유용한 임의의 서열의 약 8bp 내지 약 13bp의 프라이머를 의미한다.
본 발명에 따라, 마 종으로 제조된 추출물은 AGGTGACCGT (SEQ ID NO: 9)의 올리고뉴클레오티드 서열을 가진 프라이머 OPA-18과 같은 랜덤 프라이머에 의한 랜덤 증폭 다형성 DNA(RAPD) 유전자지문에 의해 특징을 나타낸다. RAPD 유전자지문은 OPA-18 프라이머에 의한 검사 패널에서 복수의 마 종의 게놈 DNA를 증폭하는 것을 포함하는 RAPD 분석에 의해 발생한다. 게놈 DNA가 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭됨에 따라, 불연속된 DNA 절편들의 한 세트는 각각의 마 종에 대해 얻으며 전기영동 겔상에서 다른 분자 크기의 DNA 밴드로 표현된다. 아래 실시예 10에서 설명하고 도 11에 도시된 대로, 게놈 DNA는 SEQ ID NO: 9의 OPA-18 프라이머로 증폭될 때, 마 종은 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 14개 DNA 밴드가 있다.
다음으로, 클러스터 분석에서 2 종들 사이에 공유하는 전체 RAPD 밴드의 비율로 정의되는 유사성 지수를 측정한다. 유사성 지수는 다음 식을 기초로 하여 측정한다:
F = 2nxy/nx + ny
여기서 nxy는 마 종 x 및 y의 공통 DNA 밴드의 수이고 nx 및 ny는 각각 마 종 x 및 y의 전체 DNA 밴드이다. RAPD 유전자지문 결과와 마의 다른 공지된 종들과의 비교(도 12 참조)를 기초로 하여, 본 발명에서 사용된 마 종(또는 아종)은 공지된 아 종과 다르며 따라서 새롭다고 생각된다.
본 발명은 본 발명에서 특징을 나타낸 것과 같은 새로운 마 종의 추출물의 생물학적 활성, 특히 세포 재생에 대한 활성의 발견을 기초로 한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분은 쥐 골수 전구 세포의 증식과 분화를 향상시키는 활성 물질들을 함유한다는 것은 실험들에 의해 확인되었다. 구체적으로, 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분은 그 자체로 기능성 골전구세포의 세포 증식을 향상시키고 심지어 골전구세포의 조골세포로의 분화를 크게 유도하고 조골세포의 무기화를 향상시킨다. 또한, 마 종의 추출물은 항암제에 의해 발생된 부작용을 완화할 수 있다. 구체적으로, 추출물은 사이클로포스피아마이드(CY)로 치료한 쥐의 말초혈액에 존재하는 백혈구와 적혈구를 회복시킨다. 따라서, 마 종의 추출물은 노화 과정에서 일반적인 질환인 골다공증의 예방과 치료에 유용할 수 있고 화학요법 보조제로서 항암제와 함께 사용될 수 있다.
줄기세포들은 자가 재생과 분화를 할 수 있는 세포들이다. 줄기세포들은 배아 기간 동안에 최대 농도로 존재하고 노화됨에 따라 수가 점차 감소한다. 따라서, 줄기세포들과 노화 사이에 중요한 상관관계 또는 관련이 있다고 추측하였다. 성인의 줄기세포들은 새로운 줄기세포들을 발생하거나 특정 세포들 속에 분화되는 미세환경 변화를 통해 전달되는 특정 메세지에 대한 특이적 반응을 발생시킬 수 있다. 줄기세포들이 분화 메세지를 받았을 때, 줄기세포들은 다량으로 재생되고 그런 후에 마지막으로 분화된다. 이런 줄기세포들은 성인의 세포들의 균형을 유지하기 위해 사용되고 자연적 이유 또는 손상 때문에 죽는 세포들의 개수를 보충한다.
골수의 줄기세포들은 2가지 타입인, 2개의 더욱 분화된 타입의 줄기세포, (T 및 B 림프구를 발생시키는) 림프구성전구세포 및 (백혈구, 적혈구 및 거핵구를 발생시키는) 골수성전구세포를 생산하는 조혈모세포 및 골수의 지지구조를 구성하는 세포들의 원료인 기질 세포로 나뉜다. 기질 세포들은 배양하는 동안 플라스틱 배양판의 바닥에 부착하는 특성을 가지며 조골세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 지방세포(adipocytes) 및 근원세포(myoblast)로 분화될 수 있다.
줄기세포들의 생산과 수는 노화가 일어남에 따라 크게 감소할 것이고, 노화의 여러 문제를 일으키며, 골다공증이 가장 일반적이다. 골다공증의 원인은 골 형성과 흡수 사이의 균형 상실을 포함한다. 골전구세포 세포들로부터 유래된 조골세포들은 골 기질의 형성과 골격 무기화로 이루어지는 골 형성을 담당한다. 골전구세포들은 골수의 기질 세포로부터 얻는다. 덱사메타존 및 아스코르브산은 골전구세포들의 증식 성장을 촉진할 수 있고 세포들이 성숙된 조골세포로 분화시킬 수 있다. 먼저 교원성 기질을 증착하고 10 내지 14일 후, 알칼리성 포스파타아제(ALP)가 발현된다. 알칼리성 포스파타아제는 조골세포 활성의 동정을 위한 생화학적 마커로 널리 사용되고 현재 골격 무기화 과정에 관여하는 것으로 생각되지만, 이의 실제 기능은 아직 알려져 있지 않다. 21일까지 연속 배양한 후, 세포들은 오스테오칼신을 분비할 것이고 최종적으로 골 결절을 형성하기 위해 무기화될 것이다.
마 종의 추출물 또는 다른 추출 부분은 어떠한 골 세포 조절제 없이 골전구세포들의 증식과 분화를 향상시키는데 사용될 수 있고, 따라서 활성 추출물을 포함하는 조성물은 골다공증 치료에 사용될 수 있다는 것을 본 발명에서 예상치 못하게 발견하였다.
본 발명에서, 추출물은 마 종의 근류 부분으로 제조하고 추출 용액으로 메탄올을 사용하여 얻는다. 제조 방법은 산, 바람직하게는 1% 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매로 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계를 포함하며, 알콜계 용매는 메탄올계 용매, 에탄올계 용매 또는 이의 조합이다.
또한, 얻은 추출물은 약리학적으로 활성인 부분을 얻기 위해서, 극성을 기초로 하여 더 추출될 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시예에서, 추출물은 수상에 존재하는 물 추출물로부터 에틸 아세테이트를 분리하기 위해 단계(a)로부터 얻은 추출물과 에틸 아세테이트 및 물의 혼합물을 혼합하는 단계; (c) 수상에 잔존하는 물 추출물의 잔여물로부터 부탄올 추출물을 분리하도록 추가 분리를 수행하기 위해 수상에 n-부탄올을 첨가하는 단계; 및 (d) 정제된 물 추출물을 얻도록 폴리사카라이드를 추출하고 추가로 제거하기 위해 단계(c)로부터 얻은 수상에 75% 알콜 용매를 첨가하는 단계를 포함하는 분배 크로마토그라피(partition chromatography)를 거친다.
마 종의 성분들의 생물학적 활성을 확인하기 위해서, 마 덩이줄기의 추출물 및 다른 추출 부분의 생물학적 활성에 대한 분석을 정상 쥐와 글루코코르티코이드-유도 골다공증을 앓고 있는 인간 환자로부터 얻은 세포에 대해 수행하였다.
도 1에 도시된 실험 결과로부터, 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분은 어떠한 골 세포 조절제 없이 골전구세포들의 증식과 분화를 향상시킨다. 동일한 농도하에서, DHEA는 골전구세포의 증식을 향상시키는 효과를 나타내지 않는다. 도 2에서, 결과는 마 종의 추출물은 정상 세포에서 발현된 알칼리성 포스파타아제의 양을 상당히 증가시키는데, 즉, 본 발명에 따라 제조된 추출물은 골전구세포의 성숙한 조골세포로의 분화를 자극할 수 있다는 것을 보여주었다.
본 발명자는 글루코코르티코이드-유도 골다공증을 앓고 있는 인간 환자로부터 유래된 비정상 골수 세포에 대한 효과를 추가로 확인하였다. 글루코코르티코이드는 다양한 염증질환 및 자가면역질환을 위한 필수 치료제이다. 그러나, 장기간의 글루코코르티코이드 사용은 골다공증의 가장 일반적인 의인성 원인들 중 하나이다. 글루코코르티코이드는 조골세포에 대한 다양한 효과, 즉, 조골세포 계통의 복제 억제, 새로운 조골세포의 발생 감소를 통해 골 손실을 증가시킬 수 있다.
또한, 생체 내에서 골다공증을 치료하는데 마 종의 추출물의 효과를 추가로 확인하기 위해서, 본 발명자는 정상 쥐 및 본 발명의 추출물을 경구 투여하고, 골다공증을 유도하기 위해 난소제거된 쥐에 대해 실험을 수행하였다.
도 4-5에서, 결과는 생체 내에서, 마 종의 추출물은 발현된 알칼리성 포스파타아제의 양을 증가시키고 정상 쥐와 난소제거된 쥐로부터 유래된 조골세포의 무기화를 증가시킨다는 것을 증명하고 있다. 따라서, 마 종의 추출물은 골전구세포의 증식과 분산을 조절할 뿐만 아니라 골 형성과 리모델링을 제어할 수 있어서, 활성 추출물은 골다공증을 예방하고 치료할 수 있다.
골수 세포의 증식과 분화는 골 형성 단백질-2(BMP-2), 변이성장인자-β(TGF-β), 인터루킨-4(IL-4), 표피성장인자(EGF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 등과 같은 어떤 인자에 의해 지배될 수 있다고 알려져 있다. 배양 환경의 인자가 변화될 때, 줄기세포들은 이런 인자들의 분화성에 따라 다른 세포들로 분화된다. 예를 들어, BMP-2, TGF-β, IL-4, 및 EGF는 조골세포 계통에 대한 골수 기질세포의 증식과 분화에 긍정적인 관련이 있다. 이 연구에서, 본 발명자는 BMP-2, TGF-β 및 IL-4의 유전 발현에 대한 마 종의 추출물의 효과 및 EGF 및 GM-CSF의 존재하에서 골수 줄기세포의 증식과 분화에 대한 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분의 효과를 확인하는 실험들을 수행하였다.
도 6에서, 데이터는 마 종의 추출물은 BMP-2, TGF-β 및 IL-4, 특히 BMP-2 및 TGF-β의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 증명하였다. 또한, 도 7 및 표 2에 도시된 실험 결과로부터, 본 발명자는 마 종의 추출물은 EGF의 존재하에서 쥐 골수 세포들의 분화를 자극한다는 것을 발견하였다. 추출물의 다른 추출 부분, DioMPw는 쥐 골수 세포의 증식을 향상시킨다.
GM-CSF의 경우, GM-CSF는 골수혈구생성(myelopoiesis)을 자극하기 위해 조혈모세포에 존재하는 특이적 수용체 착물에 작용할 수 있고 따라서, 골수의 조혈모세포의 증식 및 단핵구, 호중구, 대식구 등으로의 분화를 촉진할 수 있다. 따라서, GM-CSF는 화학요법으로 치료된 환자의 대식구를 회복하기 위한 치료에 효과가 있다고 생각된다. 이 연구에서, 본 발명자는 GM-CSF의 존재하에서, 골수세포들의 증식은 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분의 자극하에서 향상되었다는 것을 발견하였다(표 3 참조). 또한, 결과는 줄기세포들의 분화는 마 종의 다른 추출 부분에 의해 향상되었다는 것을 보여준다. 동일한 조건하에서, DHEA는 세포 분화를 향상시키는 효과를 나타내나, 세포 증식을 향상시킬 수 없다. 따라서, 이 연구는 본 발명에 따라 제조된 마 종의 추출물 및 다른 추출 부분은 골수세포들의 증식과 분화를 통해 화학요법으로 감소된 대식구의 수를 회복하는데 GM-CSF를 도울 수 있고 화학요법 보조제로서 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
본 발명자는 생체 내에서 화학요법 보조제로서 화학요법에 대한 마 종의 추출물의 사용을 추가로 사용하였다. 사이클로포스피아마이드(CY)는 여러 암을 치료하는데 사용되는 약물이고; 그러나, 골수 기능을 파괴하고, 백혈구, 대식구 및 적혈구와 같은 혈액 세포들을 감소시키고 많은 다른 부작용을 일으킨다. 본 발명에서, 사이클로포스피아마이드는 화학요법 보조제로서 본 발명의 활성 추출물의 기능을 측정하는데 사용된 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 백혈구감소증을 일으키도록 사용된다. 얻은 결과는 본 발명의 활성 추출물은 백혈구 수 감소를 막고 적혈구 수와 정상 농도로 헤모글로빈 함량을 유지하여 CY-처리된 쥐의 백혈구감소증으로부터의 회복을 촉진한다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 활성 추출물은 항암제에 의해 유도된 부작용을 완화하기 위해 화학요법 보조제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 수행된 실험들은 마 종의 추출 및 이의 다른 추출 부분은 어떠한 골 세포 조절제 없이 골전구세포의 증식과 분화를 향상시키고, 따라서, 본 발명은 골다공증의 치료에서 마 종의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 추출물은 화학요법에 의해 감소된 대식구, 백혈구 및 적혈구의 수를 증가하고 회복하며 따라서 화학요법 보조제로서 사용될 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니고 그렇게 해석되어야 한다.
도 1은 도 1a와 1b로 식별되는 막대 그래프를 도시한다. 도 1a는 마 종(DioMs)의 추출물과 DHEA의 효과를 도시하며 도 1b는 C3H 쥐의 골전구세포의 증식에 대한 각각의 다른 추출 부분(DioMPw, DioMPb 및 DioMPe)의 효과를 도시한다.
도 2는 도 2a와 2b로 식별되는 막대 그래프를 포함한다. 도 2a는 마 종의 추출물의 효과를 도시하고 도 2b는 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 의해 생체 밖에서 측정된 조혈전구세포의 쥐의 성숙한 조혈세포로의 분화에 대한 각각의 다른 추출 부분의 효과를 도시한다.
도 3은 글루코코르티코이드-유도 골다공증을 앓고 있는 환자로부터 얻은 골수 세포들의 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 대한 마 종의 추출물의 생체 밖 효과를 도시하는 막대 그래프이다.
도 4는 도 4a와 4b로 식별되는 막대 그래프를 포함한다. 도 4a는 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 의해 측정된 조혈전구세포의 쥐의 성숙한 조골세포로의 분화에 대한 마 종의 추출물의 생체 내 효과를 도시하고, 도 4b는 결정 형성에 의해 측정된 건강한 쥐의 골수에서 골밀도의 무기화에 대한 추출물의 효과를 도시한다.
도 5는 도 5a와 5b로 식별되는 막대 그래프를 포함한다. 도 5a는 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 대한 마 종의 추출물의 생체 내 효과를 도시하고 도 5b는 난소절제 쥐의 골수 세포에서 골밀도의 무기화에 대한 추출의 효과를 도시한다.
도 6은 본 발명에 따른 마 종의 추출물을 경구 투여한 쥐로부터 분리한 골수 세포의 사이토카인의 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 7은 상피성장인자(EGF)의 존재하에서 제 1 배양 쥐 골수 세포의 형태적 변화에 대한 마 종의 추출물의 효과를 도시하는 위상차 현미경 이미지인 도 7a-7e로구성된다.
도 8은 사이클로포스피아마이드(CY)에 의해 유도된 백혈구감소증(leucopenia) 쥐의 말초혈액에서 백혈구 수에 대한 마 종의 추출물의 생체 내 효과를 도시한다.
도 9는 심한 빈혈을 앓고 있는 사이클로포스피아마이드(CP)-유도 백혈구감소증 쥐의 말초혈액에서 적혈구(RBC) 수에 대한 마 종의 추출물의 생체 내 효과를 도시한다.
도 10은 심한 빈혈을 앓고 있는 사이클로포스피아마이드(CP)-유도 백혈구감소증 쥐의 말초혈액에서 헤모글로빈 함량에 대한 마 종의 추출물의 생체 내 효과를 도시한다.
도 11은 SEQ ID NO:9의 하나의 랜덤 증폭 다형 DNA(RAPD)로 증폭된 14개 마 종의 검사 패널을 위한 증폭 생성물의 전기영동 마커 프로파일을 도시하는 합성 사진 이미지이다.
도 12는 RAPD 분석에 의해 측정된 유전적 유사성을 기초로 한 14개 마 종의 계통수를 도시하는 덴드로그램이다.
제조 단계 1
마 종의 메탄올 추출물의 제조
마 종의 4kg의 벗긴 덩이줄기를 하루 동안 1%(v/v) 아세트산 용액에 침지하였다. 얻은 고체 부분을 -70℃에서 동결하고 동결건조하였다. 동결건조된 부분은 1% 아세트산의 존재하에서 메탄올에 침지하였다. 교반하고 메탄올의 농도를 40부피%로 조절한 후, 혼합 용액을 하루 동안 방치하고 원심분리로 분리하였다. 얻은 용액 부분을 동결건조하면 DioMs이다.
DioMs는 수상에 존재하는 물 추출물로부터 에틸 아세테이트 추출물(DioMPe로 부름)을 분리하기 위해 에틸 아세테이트 및 물(1:1)의 용액 혼합물을 혼합하는 단계; 수상에 잔존하는 물 추출물의 잔여물로부터 부탄올 추출물(DioMPb로 부름)을 분리하도록 추가 분리를 수행하기 위해 수상에 n-부탄올을 첨가하는 단계; 및 정제된 물 추출물(DioMPw로 부름)을 얻도록 폴리사카라이드를 추출하고 추가로 제거하기 위해 단계(c)로부터 얻은 수상에 75% 알콜 용매를 첨가하는 단계를 포함하는 분배 크로마토그래피를 추가로 거친다.
제조 단계 2
마 종의 메탄올 추출물을 함유하는 쥐를 위한 사료의 제조
상업적으로 사용가능한 쥐 사료인 푸리나 초우 5001을 분말로 분쇄하였다. 마 종의 동결건조 메탄올 추출물을 분쇄된 사료로부터 동일한 양을 교체하는 양으로 분쇄된 사료에 첨가하였다. 사료 혼합물을 증류수와 균일하게 혼합하고, 압출성형에 의해 다시 만들고, 적절한 전력에서 마이크로웨이브 오븐에서 2분 동안 구웠고, 실온에서 냉각한 후 -70℃에서 냉동하였다. 동결건조 후, 사료 혼합물을 푸리나 초우 사료의 성질과 매우 유사한 정제로 형성하였다. 형성된 정제를 -20℃ 냉장코에 저장하였다. 정제를 먹이 주는 날 실온으로 데웠고, 살균 테이블에서 UV 램프를 조사하여 살균하였다. 다른 농도의 메탄올 추출물을 가진 사료 혼합물을 제조하였다.
제조 단계 3
골수세포들의 분리와 배양
살균 상태하에서, SPF 등급 C3H/HeN 쥐를 희생시키고 골수세포를 흘려보내기 위해 대퇴골 뼈에 DMEM/F12의 유체 배양액을 주사하였다. 세포들을 살균한 No.53 나이론 메시를 통해 여과하였다. 이렇게 얻은 단일 세포 현탁액을 적절한 농도로 조절하기 위해 N2를 함유하는 DMEM/F12 배양 배지와 혼합하였다.
제조 단계 4
쥐로부터 골전구세포의 제조
살균 상태에서, SPF 등급의 C3H/HeN 쥐의 대퇴골 뼈를 얻었고 DMEM/F12를 주사하였다. 골수를 흘려보냈고 No.53 살균 나일론 메시를 통과시켜 여과하였다. 얻은 단일 세포 현탁액을 세포의 농도를 조절하기 위해 15% FCS를 함유하는 DMEM/F12 배양 배지와 혼합하였다.
세포를 6일 동안 T-플라스크에 있는 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 배양 배지를 3일마다 갈아주었다. 세포 농도는 106 cells/cm2이었다. 6일에, 현탁된 세포와 배양 배지를 추출하였다. 접착 세포층을 실온으로 데운 1xPBS로 세척하였고 그 후 5 내지 10분 동안 0.01% EDTA로 처리하였다. EDTA를 제거하였고 반응은 FCS를 함유하는 배양 배지에서 멈췄다. 세포들을 모두 수집하였고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.
실시예 1
마 종의 메탄올 추출물 및 다른 추출 부분
으로 치료한 쥐의 골전구세포의 증식 반응
제조 단계 4에서 얻은 세포들을 22G 게이지 니들을 사용하여 분산하고 4.5x104cell/ml의 농도를 형성하기 위해 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 DMEM/F12 배지에 현탁하였다. 225㎕ 세포 현탁액을 96-웰 미세판의 각 웰 속에 첨가하였다. 3시간 후, 각 웰 속의 세포 현탁액에 25㎕ 메탄올 추출물, 다른 추출 부분의 각각 및 DHEA를 첨가하였고 72시간 동안 배양하였다. 그런 후에, 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 측정법을 사용하였다. 1mg/ml MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용해 버퍼(20% SDS-50% DMF)를 150㎕/웰의 양으로 각 웰에 첨가하였고 16시간 동안 반응시켰고 각 웰에서 최종 세포 현탁액에 대해 O.D.570nm에서 흡수도를 측정하였다.
도 1에 도시된 대로, 마 종의 메탄올 추출물의 자극하에서, 골전구세포의 증식은 향상되었고, 0.01 및 0.1㎍/ml 농도는 상당한 향상 효과를 나타낸다. 동일한 농도하에서, DHEA는 골전구세포의 증식을 향상시키는 효과를 나타내지 않는다. 추출된 부분, DioMPe 및 DioMPb는 10-400㎍/ml에서 세포 증식을 향상시키고, 여기서 DioMPe는 우수한 효과를 나타낸다.
실시예 2
생체 밖에서 알칼리성 포스피타아제 활성(ALP)에 의해 측정된 쥐의
성숙한 골전구세포의 분화에 대한 마 종의 메탄올 추출물 및 다른
추출 부분의 효과
제조 단계 4에서 수집한 골전구세포들을 6일 동안 T-플라스크에서 배양하였다. 세포들을 22G 게이지 니들로 분산하였고 세포 농도를 5x103cell/cm2으로 조절하였다. 그런 후에 세포들을 6-웰 판에서 배양하였고, 4.5ml의 세포 배양 배지를 각 웰에 첨가하였고, 0.5ml 메탄올 추출물 및 추출 부분의 각각을 다음날 첨가하였다. 14일 동안 배양한 후에, 하기한 대로 알칼리성 포스타파아제 활성 측정법을 수행하였다.
배양 배지를 추출하였고, 세포층을 PBS로 수 회 세척하였다. PBS 속의 0.5% 트리톤 X-100를 각 웰에 첨가하였다. 최종 현탁액을 각각 70℃ 및 37℃에서 동결하고 해동하였다. 검사 샘플을 얻기 위해서 처리를 2회 수행하였다. 50㎕의 검사 샘프를 각 웰에서 ELISA 판으로 이동시켰다. 증류수 속의 50㎕ AMP-기질 버퍼(2-아미노-2-메틸-1-프로판올(AMP,0.5M), pH 10; 2mM 염화 마그네슘 및 9mM p-나이트로페닐 인산염)를 실온에서 10-20분 동안 검사 샘플과 반응하도록 ELISA 판 속으로 첨가하였다. ELISA 리더기를 사용하여 410nm에서 흡수도를 측정한 직후에, 각 웰의 단백질 농도를 정량적으로 측정하였다. 측정된 알칼리성 포스파타아제 활성은 unit/㎍으로 표현된다.
도 2에 도시된 대로, 골수 전구 세포를 14일 배양한 후, 성숙된 조골세포에 특이적인 발현된 마커인 알칼리성 포스파타아제의 발현을 알게 되었다. 마 종의 메탄올 추출물 및 메탄올 추출물의 다른 추출 부분의 각각은 발현된 알칼리성 포스파타아제의 양을 현저하게 증가시키고, 0.1㎍/ml의 메탄올 추출물, 0.1㎍/ml의 DioMPb, 0.01-0.1㎍/ml의 DioMPe 및 0.1㎍/ml의 DioMPw는 강한 향상 효과를 나타내었다.
실시예 3
글루코코르티코이드-유도 골다공증을 앓고 있는 환자로부터
유래된 골수세포들의 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 대한
마 종의 메탄올 추출물의 효과
타이베이 베테랑 종합병원으로부터 얻은 환자의 골수세포를 7일 동안 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 DMEM/F12 배지에 배양하였다. 곧이어 알칼리성 포스파타아제 활성 측정법을 수행하였다.
도 3에 도시된 대로, 알칼리성 포스파타아제의 발현을 알게 되었다. 대조군과 양성군(골다공증을 위한 공지된 치료법인 1nM 에스트로겐)을 비교하면, 마 종의 메탄올 추출물은 알칼리성 포스파타아제의 양을 증가시켰고, 10㎍/ml의 메탄올 추출물은 최고의 향상 효과를 보여주었다.
실시예 4
생체 내에서 골수세포들의 무기화에 대한
알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 대한
마 종의 메탄올 추출물의 효과
메탄올 추출물의 다른 복용량(0, 40, 200 및 1000mg/kg)을 경구 투여용으로 제조하였다. 5일 동안 다른 복용량의 메탄올 추출물의 경구 투여 후, 골수세포를 얻기 위해 쥐를 희생시켰다.
(1) 알칼리성 포스파타아제 활성 측정법
얻은 쥐의 골수세포들을 2x105cells/well에서 96-웰 미세판에서 배양하였고, 여기에 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 250㎕의 α-MEM 배지를 첨가하고 2일 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 125㎕/well의 배양 배지를 추출하였고 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 125㎕/well의 새로운 배지로 교체하였다. 4일 배양 후, 곧이어 알칼리성 포스파타아제 활성 측정법을 수행하였다.
도 4a에 도시된 대로, 알칼리성 포스파타아제의 발현을 알게 되었다. 도 4a에서, 마 종의 메탄올 추출물은 발현된 알칼리성 포스파타아제의 양을 증가시키고, 1000mg/kg의 메탄올 추출물은 대조군과 비교하여 3배 향상된다.
(2) 결절 형성 측정법
이 측정법은 골밀도의 무기화를 분석하는데 사용된다. 다른 복용량(0, 40, 200 및 1000mg/kg)의 메탄올 추출물을 경구 투여한 쥐로부터 얻은 골수세포들을 1x106 cells/well에서 24-웰 판에 뿌리고 5% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 α-MEM에서 배양하고, 24시간 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 500㎕/well의 배양 배지를 추출하였고 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메 타손을 함유하는 500㎕/well의 새로운 배지로 교체하였다. 세포들을 골밀도의 무기화를 분석하기 위해 15일 동안 추가로 배양하였고 배양 배지를 4일 마다 갈아주었다. 하기와 같이, 곧이어, 결절 형성 측정법을 수행하였다.
배양 배지를 추출하고, 세포들을 30분 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 500㎕/well 포르말린과 혼합하여 고정시켰다. 포르말린을 제거하고 세포들을 살균수로 3회 세척한 후, 칼슘과 반응하는 200㎕/well의 2% 알리자린 레드 용액을 웰에 첨가하고 세포들을 10분 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 추가로 배양하였다. 그런 후에, 알리자린 용액을 제거하고 세포들을 무수 알콜로 3회 세척하였다. 골밀도의 무기화 영역을 메타 이미지로 측정하였다.
도 4b에 도시된 대로, 대조군과 비교하면, 마 종의 메탄올 추출물은 골밀도의 무기화를 촉진시키고, 1000mg/kg의 메탄올 추출물은 3.5배의 최고의 향상 효과를 보여주었다.
실시예 5
난소제거된 쥐 모델의 골수세포들의 알칼리성 포스파타아제(ALP)
및 무기화에 대한 마 종의 메탄올 추출물의 효과
살균 상태하에서, 골다공증의 발생을 유도하도록 난소를 제거하기 위해 SPF 등급 C57BL/6J 쥐들의 그룹을 외과 수술하였고 다른 그룹은 대조군(유사 수술된 쥐(pseudo operated mice))으로 사용하기 위해 난소의 제거 없이 수술하였다.
메탄올 추출물의 다른 복용량(0, 40, 200 및 1000mg/kg)을 경구 투여용으로 제조하였다. 42일 동안 다른 복용량의 메탄올 추출물의 경구 투여 후, 골수세포를 얻기 위해 쥐를 희생시켰다.
(1) 알칼리성 포스파타아제 활성 측정법
다른 복용량(0, 40, 200 및 1000mg/kg)의 메탄올 추출물을 경구 투여한 쥐 및 유사 수술된 쥐로부터 얻은 골수세포들을 2x105cells/well에서 96-웰 미세판에서 배양하였고, 여기에 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 250㎕의 α-MEM 배지를 첨가하고 2일 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 125㎕/well의 새로운 배지를 첨가하였다. 4일 배양 후, 곧이어 알칼리성 포스파타아제 활성 측정법을 수행하였다.
도 5a에 도시된 대로, 알칼리성 포스파타아제의 발현을 알게 되었다. 도 5a에서, 마 종의 메탄올 추출물은 발현된 알칼리성 포스파타아제의 양을 증가시키며, 1000mg/kg의 메탄올 추출물은 최고의 향상 효과를 나타내었다.
(2) 결절 형성 측정법
다른 복용량(0, 40, 200 및 1000mg/kg)의 메탄올 추출물을 경구 투여한 쥐로부터 얻은 골수세포들을 1x106 cells/well에서 24-웰 판에 뿌리고 5% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 α-MEM에서 배양하고, 24시간 동안 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 500㎕/well의 배양 배지를 추출하였고 15% FCS, 50㎍/ml 아스코르브산, 10mM 소듐 β-글리세 로인산염 및 10nM 덱사메타손을 함유하는 500㎕/well의 새로운 배지로 교체하였다. 세포들을 골밀도의 무기화를 분석하기 위해 15일 동안 추가로 배양하였고 배양 배지를 4일 마다 갈아주었다. 하기와 같이, 곧이어, 결절 형성 측정법을 수행하였다.
도 5b에 도시된 대로, 대조군과 비교하면, 마 종의 메탄올 추출물은 골밀도의 무기화를 촉진시키고, 1000mg/kg의 메탄올 추출물은 최고의 향상 효과를 보여주었다.
실시예 6
골수세포들의 사이토카인의 유전자 발현
에 대한 마 종의 메탄올 추출물의 효과
전체 RNA를 UltraspecTMRNA 분리 키트(Biotex laboratories Inc, U.S.A)를 사용하여 실시예 4로부터 얻은 골수세포들로부터 추출하였다. 5㎍ 전체 RNA 및 2.5㎍ 올리고 dT를 10분 동안 70℃로 가열하고, 10분 동안 실온으로 냉각하였고, 그런 후에, 4㎕ 10mM dNTP, 0.5㎕ rRNain, 1㎕(10 유닛) AMV(조류 골수아세포종 바이러스) 역전사 효소 및 이의 버퍼를 첨가하였고 최종 반응 부피는 26.5㎕이었다. cDNA를 60분 동안 42℃ 및 그 후에 5분 동안 90℃에서 이전의 반응 용액과 반응시켜 얻었다. 2.5㎕ 최종 cDNA에 0.5㎕ 10mM dNTP, 0.5㎕ 중합효소(2 유닛) 및 이의 버퍼, 1㎕의 10μM 표적화 플라이머를 첨가하였고, 반응 혼합물의 최종 부피는 25㎕이었다. PCR를 적절한 주기로 수행하였고, 각 주기는 94℃에서 45초의 변성, 적절한 어닐링 온도에서 45초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 이루어진다. 반응 생성 물들은 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 가시화하였다. PCR 프라이머의 서열들은 표 1에 도시된다. 실험 결과는 표 6에 도시된다.
도 6에 도시된 대로, BMP-2, TGF-β 및 IL-4의 유전자 발현은 증가하며, 특히 BMP-2 및 TGF-β가 증가한다.
RT-PCR에 사용된 프라이머의 서열
사이토카인 서열(5'to 3') a 크기(bp)
IL-4
센스 ATG GGT CTC AAC CCC CAG CTA GT (SEQ ID NO:1)
안티센스 GCT CTT TAG GCT TTC CAG GAA GTC (SEQ ID NO:2) 399
TGF-β
센스 TGG ACC GCA ACA ACG CCA TCT ATG CCA TCT ATG AGA AAA CC (SEQ ID NO:3)
안티센스 TGG AGC TGA AGC AAT AGT TGG TAT CCA GGG CT (SEQ ID NO:4) 525
BMP-2
센스 CAT CCA GCC GAC CCT TG (SEQ ID NO:5)
안티센스 CTC TCC CAC TGA CTT GTG (SEQ ID NO:6) 505
β-액틴
센스 GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT (SEQ ID NO:7)
안티센스 CA CAT CTG CTG GAA GGT GG (SEQ ID NO:8) 510
a사이토카인 마커의 크기는 100bp DNA 래더를 참조하여 프라이머를 사용하는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 결정하였다.
실시예 7
표피성장인자(EGF)의 존재하에서 C3H 쥐의 골수세포들의
형태적 변화에 대한 마 종의 메탄올 추출물의 효과
제조 단계 3에서 얻은 쥐의 1x104 cells/well 골수세포들을 N2 및 10ng/ml EGF를 가진 DMEM/F12 배양 배지를 함유하는 96-웰 미세판에 뿌리고 24시간 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 추출물 및 DHEA를 각각 다른 웰 속에 첨가하였다. 메탄올 추출물과 DHEA가 첨가되지 않고 동일한 배양 순서를 거친 순수한 배양 배지를 함유하는 웰을 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, 양성 대조군으로 사용하기 위해서, 50ng/ml EGF를 사용하는 것을 제외하고 대조군과 같은 동일한 순서를 반복하였다. 증식 반응을 MTT 측정법으로 측정하였다. MTT 측정법에 따라, 웰들의 각각을 1mg/ml MTT 용액으로 첨가하고 반응 4시간 후, MTT 용해 버퍼(20% SDS-50% DMF)를 150㎕/웰의 양으로 각 웰에 첨가하였다. 최종 혼합물을 16시간 동안 반응시켰다. O.D.570nm에서 흡수도를 측정하였다.
도 7에 도시된 대로, EGF로 유도된 골수의 전구세포들이 증식하는 경우에, 마 종의 메탄올 추출물은 현저하게 분화하도록 골수 전구 세포들을 추가로 자극하는 것을 발견하였다. 더욱 바람직한 최적의 결과는 사용된 메탄올 추출물의 농도가 10㎍/ml일 때 얻어지며, 세포들은 현저하게 향상된 증식 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 100㎍/ml의 DioMPw이 사용되는 경우, 세포의 증식 속도는 표 2에 나타낸 것과 같이 대조군의 1.9배에 도달할 수 있다.
그룹 농도 증식율a 형태적 변화b
대조군 1.00 +
DHEA 0.0001 ㎍/ml 0.001 ㎍/ml 0.01 ㎍/ml 0.1 ㎍/ml 1 ㎍/ml 0.99 0.64 0.65 0.67 0.70 + + + ++ ++
DioMPw 10 ng/ml 100 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml 1.09 1.13 1.17 1.34* 1.90* - - - - -
a스튜던트 t-검정에 의해 데이터를 분석하였고 "*"는 P<0.05를 의미하고
b현미경으로 형태적 변화를 관찰하였다.
실시예 8
GM-CSF의 존재하에서 마 종의 메탄올 추출물 및
다른 추출 부분으로 치료한 쥐의 골수세포들의 증식 반응
제조 단계 3에서 얻은 쥐의 1x104 cells/well 골수세포들을 96-웰 미세판의 각각에 뿌리고, N2 및 4ng/ml GM-CSF를 함유하는 DMEM/F12 배양 배지에서 배양하였다. 다른 농도들을 가진 마 종의 메탄올 추출물을 다른 웰의 최종 배양된 세포 속에 각각 첨가하였다. 다른 웰에 배양된 세포들을 함유하는 최종 메탄올 추출물을 14일 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. N2 및 20ng/ml GM-CSF를 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양된 세포들을 양성 대조군으로 사용한다. MTT 측정법을 수행하였다. 이런 태양에서, 1mg/ml MTT 용액을 4시간 동안 배양된 세포들과 반응시키기 위해 각 웰에 첨가하였다. MTT 용해 버퍼(20% SDS-50% DMF)를 150㎕/웰의 양으로 각 웰에 첨가하였다. 최종 혼합물을 16시간 동안 반응시켰다. O.D.570nm에서 흡수도를 측정하였다.
도 3에 도시된 대로, 0.001㎍/ml 내지 1000㎍/ml에 달하는 농도의 마 종의 메탄올 추출물의 자극하에서, 메탄올 추출물의 다른 추출로부터 얻은 부분은 세포 증식을 향상시키는 능력을 갖는 것으로 발견되었다. 이들 중에서, DioMPb 및 DioMPe는 특히 증식의 향상에 대해 우수한 효과를 갖는 것으로 발견되었다. 또한, 20주의 성인 쥐 골수세포들은 1㎍/ml 내지 10㎍/ml의 농도에서 마 종의 메탄올 추출물에 의해 자극되자마자 분화할 수 있다는 것을 발견하였다. 메탄올 추출물의 추출 부분들 중에서, 물과 에틸 아세테이트 추출 부분 및 75% 알콜에 의해 물 추출물을 추가로 추출하여 얻은 75% 알콜 추출 부분의 용매 혼합물에 의해 추출된 것들은 2주의 성인 쥐 골수세포들의 분화를 가속하는 것으로 발견되었다. 그러나, 동일한 조건하에서, DHEA는 반대로 세포 증식을 향상시키는 효과만을 나타낸다. 따라서, 줄기세포들의 재생과 분화 모두에 우수한 효과를 나타내는 마 종의 추출물들은 화학요법에 의해 감소된 대식구의 수를 회복하는데에 GM-CSF를 도울 수 있고 화학요법 보조제로서 사용될 수 있다.
그룹 농도 증식 지수a 형태적 변화b
대조군 1.00 +
DioMs 0.0001㎍/ml 1.08 +
0.001㎍/ml 1.19* +
0.01㎍/ml 1.68* +
0.1㎍/ml 1.95* +
1.0㎍/ml 1.78* ++
10㎍/ml 1.82* +++
100㎍/ml 1.49* +
1000㎍/ml 1.39* +
DioMPe 0.01㎍/ml 0.98 +
0.1㎍/ml 1.11 ++
1㎍/ml 1.35* ++
10㎍/ml 2.64* +++
100㎍/ml 0.83 -c
300㎍/ml 0.97 -
DioMPb 0.01㎍/ml 1.07 +
0.1㎍/ml 1.23 +
1㎍/ml 1.34 +
10㎍/ml 1.41 +
100㎍/ml 1.90* +
300㎍/ml 2.02* +
DioMPw 0.0001㎍/ml 1.06 +
0.001㎍/ml 1.08 +
0.01㎍/ml 1.12 ++
0.1㎍/ml 1.18 ++
1.0㎍/ml 1.31* +++
10㎍/ml 1.56* +
DHEA 0.0001㎍/ml 0.99 +
0.001㎍/ml 1.15 +
0.01㎍/ml 1.04 +
0.1㎍/ml 1.13 +
1㎍/ml 1.11 +++
10㎍/ml 1.19* +
a스튜던트 t-검정에 의해 데이터를 분석하였고, "*"는 P<0.05를 의미하고
b현미경으로 형태적 변화를 관찰하였다.
c골수세포들은 고농도의 DioMPe 하에서 죽은 것으로 발견되었다.
실시예 9
사이클로포스피아마이드에 의해 유도된 백혈구감소증 쥐의
말초혈액에서 백혈구 및 적혈구 세포의 수 및 헤모글로빈 함량에
대한 메탄올 추출물의 효과
메탄올 추출물의 다른 복용량(0, 20, 100 및 500mg/kg)을 경구 투여용으로 제조하였다. 백혈구감소증을 일으키기 위해 0일 및 5일에 200 내지 100mg/kg의 사이클로포스피아마이드(CY)로 복강으로 주사하였고 빈혈을 일으키지 위해 주기적으로 피를 뽑았다. 쥐를 희생시킬 때까지 하루에 다른 복용량의 메탄올 추출물을 경구투여하였다. 후안구동(retro-orbital sinus)으로부터 채취한 말초혈액을 0, 4, 8 및 12일에 견본을 만들었다.
혈액 응고를 막기 위해 0, 4, 8 및 12일에 얻은 혈액(0.1ml)에 25㎕ EDTA 용액(72mg/ml)을 첨가하였고, 터크 용액(0.01% 크리스탈 바이올릿을 가진 2% 아세트산)으로 10 x 또는 20 x 희석하였다. 백혈구의 수는 현미경으로 계산하였다.
혈액 응고를 막기 위해 8일에 얻은 혈액(0.1ml)에 25㎕ EDTA 용액(72mg/ml)을 첨가하고 식염수로 2000x 희석하였다. 백혈구의 수를 계산하였다. 헤모글로빈(Hbg) 함량은 워팅톤 알 이 등의 Experimental Hematology, 15:85-92, 1987에 개시된 대로 측정하였다.
도 8-10에 도시된 결과로부터, 본 발명의 활성 추출물은 말초 혈액에서 백혈구 수의 감소를 완화하고 백혈구의 회수를 촉진하고 정상 농도에서 적혈구와 Hbg 함량을 유지한다는 것을 알게 된다.
실시예 10
랜덤 증폭 다형성 DNA(RAPD) 분석에서 마 종의 묘사
DNA 추출
추출물을 생산하고 상기와 같이 투여되는 마 종은 타이완의 양 밍 산에서 채취하였다. 알려지지 않은 마 종(샘플 번호 100 또는 102로 복제물로 도시)은 Dioscorea alata L. cv. (재배된 변종) Tainung No. 1 (Sample No. 1), Dioscorea esculenta (Sample No. 3), Dioscorea bulbifera (Sample No. 4), Dioscorea alata L. cv. 8702 (Sample No. 5), Dioscorea alata L. cv. Sanzhi A (Sample No. 6), Dioscorea alata L. cv. Sanzhi B (Sample No. 7), Dioscorea alata L. cv. Dayeshoufeng (Sample No. 9), Dioscorea alata L. cv. Tainung No. 2 (Sample No. 10), Dioscorea alata L. cv. Jifa (Sample No. 67), Dioscorea alata L. cv. Zhanger No. 2 (Sample No. 64), Dioscorea alata L. cv. Dashan No. 3 (Sample No. 13), Dioscorea alata L. cv. Dashan No. 2 (Sample No. 12) and Dioscorea alata L. cv. Taidong (Sample No. 11)을 포함하는 공지된 13개 마 종(Dioscorea secies)의 검사 패널을 따라 특징을 나타내었고, 이들 전부는 타이온에서 재배된다.
0.2g의 각각의 마 샘플의 새 잎을 채취하고 액체 질소와 혼합된 분쇄기에서 분쇄하였다. 분쇄한 조직을 1.5ml 원형 튜브에서 900㎕의 2% CTAB 추출 버퍼(1.4M NaCl, pH 8.0의 100mM Tris-HCl, 20mM EDTA 및 0.2%β-머캡토에탄올을 함유)와 혼합하였고, 30분 동안 65℃ 수조에서 배양하였다. 그런 후에 샘플을 원심분리하고 상청액을 600㎕의 클로로포름/아이소아밀알콜(24:1)이 첨가된 깨끗한 튜브로 옮기고 샘플이 에멀션 상태가 될 때까지 환류하였다. 샘플을 추가로 원심분리하고 상청액을 깨끗한 튜브로 옮기고 40㎕의 10% CTAB(0.7M NaCl 함유) 및 400㎕의 클로로포름/아이소아밀알콜(24:1)과 혼합하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 상청액(400㎕)을 깨끗한 튜브로 옮기고 400㎕의 CTAB 침전 버퍼와 혼합하고 DNA를 침전하기 위해 약 15-20분 동안 얼음 위에 놓았다. DNA 샘플을 400㎕의 고농도-염 TE(10mM Tris-HCl, pH 8.0; 1mM EDTA; 및 1M NaCl) 및 800㎕의 95% 알콜로 세정하였다. DNA 샘플을 원심분리하고, 정제를 증류하고 탈이온한(dd) 물에 DNA 정제를 재현탁하기 전에 추가로 400㎕의 75% 알콜로 세정하고-20℃로 저장하였다.
RAPD 반응
SEQ ID NO:9의 랜덤 RAPD, 이런 경우 OPA-18 (AGGTGACCGT) (Operon Technologies, USA)은 RAPD 분석에서 마 종의 게놈 DNA를 증폭하는데 사용하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 10x 버퍼, 2.5mM의 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 2.0μM의 프라이머(Operon), 5 유닛의 Taq DNA 중합효소(TaKaRa Biomedicals), 및 5ng 주형 DNA를 함유하는 25㎕ 부피로 수행하였다. 샘플을 94℃에서 1분 동안 변성하고, 36℃에서 1분 동안 어닐링하고, 72℃에서 1회 최종 신장하는 것으로 이루어진 41개 주기를 실시하였다. PCR의 완료 후, 10μL의 반응 혼합물을 전기영동을 위해 0.5㎍/mL 에티듐 브로마이드를 함유하는 2% 아가로스 겔에 채웠다.
데이터 분석
겔 전기영동에서, 500bp, 1000bp, 1500bp, 2000bp, 2500bp, 3000bp, 3500bp 및 4000bp와 같은 다른 크기의 참조 밴드를 제공하기 위해 겔의 첫 번째 레인(제일 왼쪽)과 마지막 레인(제일 오른쪽)에 ΦX174 DNA/HaeIII 마커(Promega Co., USA)와 같은 DNA 분자량 마커(M)를 채웠고, 각 레인에서 각 마 종의 PCR 샘플을 채웠다. 각 샘플로부터의 증폭 DNA 생성물의 프로파일은 형광 현상기로 가시화하였고 사진 이미지를 이미지 포착 소프트웨어인 AlphaImager 1220을 사용하여 캡쳐하였다. 검사 샘플의 각 마 종은 RAPD 유전자지문에서 자신의 DNA 밴드를 생산하기 때문에, 본 발명의 마 종의 RAPD 표지는 다른 마 종과 구별되었다. 도 11에 도시된 대로, 마 종의 게놈 DNA가 SEQ ID NO:9의 OPA-18 프라이머로 증폭될 때 알려지지 않은 마 종(샘플 번호 100 또는 102로 복제물로 도시)을 묘사하기 위해 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 14개 DNA 밴드가 있다.
클러스터 분석 또는 쌍 분석은 마 종들 사이의 유사율을 계산하기 위해 Gel-Compar 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 분석에 영향을 받는 변수들은 RAPD 유전자지문으로부터 얻은 것들이다. 다음으로, 미가중 쌍-그룹화 평균산술분석(UPGMA)으로서, 유사율(F)을 다음 식으로 클러스터 분석으로 계산하였다:
F = 2nxy/nx + ny
여기서 nxy는 마 종 x 및 y의 공통 DNA 밴드의 수이고 nx 및 ny는 각각 마 종 x 및 y의 전체 DNA 밴드이다(Nei, M. and W. H. Li. 1979, Mathematical Model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases, Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 76: 5269-5273).
도 12를 참조하면, 계통수는 검사 패널의 14개 마 종들 사이의 유사율을 기초로 하여 만들었다. 도 12에 도시된 대로, 알려지지 않은 마 종들은 Dioscorea alata L. cv. Sanzhi A 또는 Dioscorea alata L. cv. Zhanger No. 2와 약 88.9%의 유사율을 가진다. 게다가, 마 종은 Dioscorea bulbifera 또는 Dioscorea esculenta와 약 37.5%의 유사율을 가진다. 또한, 알려지지 않은 마 종은 Dioscorea Dioscorea alata L. cv. Tainung No. 1, Dioscorea alata L. cv. 8702, Dioscorea alata L. cv. Sanzhi B, Dioscorea alata L. cv. Dayeshoufeng, Dioscorea alata L. cv. Tainung No. 2, Dioscorea alata L. cv. Dashan No. 3 또는 Dioscorea alata L. cv. Dashan No. 2과 75.5% 이상의 유사율을 가진다.
클러스터 분석 또는 쌍 분석 결과를 기초로 하여, 알려지지 않은 마 종은 알려진 종과 다르나, Dioscorea alata 아종과 더욱 유사하다고 이해하였다. 따라서, 알려지지 않은 마 종은 as Dioscorea alata L. cv. Phyto로 불렀다.
어느 특허나, 본 발명에서 언급한 특허 출원과 공개공보는 전문이 참조로 포함된다.
당업자는 이의 넓은 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 상기 실시예들에 대한 변화를 할 수 있고, 본 발명은 개시된 특정 실시예들에 한정되지 않으며, 청구항에 의해 정의된 대로 본 발명의 취지와 범위 내에서 변형을 포함한다는 것을 알 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
SEQUENCE LISTING <110> Rong-Tsun Wu <120> Extract of Dioscorea sp. and the medical uses thereof <130> 682433-3U2 <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> 10/335,278 <151> 2002-12-31 <160> 9 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 atgggtctca acccccagct agt 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 gctctttagg ctttccagga agtc 24 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 tggaccgcaa caacgccatc tatgccatct atgagaaaac c 41 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 tggagctgaa gcaatagttg gtatccaggg ct 32 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 catccagccg acccttg 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 ctctcccact gacttgtg 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 gactacctca tgaagatcct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 ccacatctgc tggaaggtgg 20 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 aggtgaccgt 10

Claims (12)

  1. 환자의 골수 세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있는 유효량의 마 종의 추출물을 환자에게 경구 투여하는 것을 포함하며, 마 종의 게놈 DNA가 SEQ ID NO: 9의 프라이머로 증폭될 때, 상기 마 종은 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 적어도 14개 DNA 밴드를 포함하는 RAPD 유전자지문에 의해 특징되며, 상기 마 종의 추출물은
    (a) 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매를 사용하여 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계;
    (b) 가용성 부분을 얻기 위해 단계 (a)에서 얻은 최종 생성물을 분리 처리하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 얻은 가용성 부분으로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조하는 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)에서 사용된 알콜계 용매는 메탄올계 용매, 에탄올계 용매 또는 이의 혼합물인 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)는 1% 아세트산의 존재하에서 수행되는 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)에서, 1% 아세트산의 존재하에서 40% 메탄올 용액은 마 종의 덩이줄기를 추출하는데 사용되는 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a) 이전에, 마 종의 덩이줄기는
    (i) 1% 아세트산 용액에 마 종의 덩이줄기를 침지하는 단계;
    (ii) 마 종의 아세트산-처리 덩이줄기를 동결하는 단계; 및
    (iii) 마 종의 동결된 덩이줄기를 동결건조하는 단계를 포함하는 전처리를 받는 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(b)에서, 분리 처리는 원심분리에 의해 수행하는 치료가 필요한 환자의 골다공증 치료 방법.
  7. 마 종의 게놈 DNA가 SEQ ID NO: 9의 프라이머로 증폭될 때, 각각 428bp, 452bp, 537bp, 602bp, 723bp, 817bp, 934bp, 1140bp, 1242bp, 1478bp, 1641bp, 1904bp, 2151bp 및 2918bp에 달하는 적어도 14개 DNA 밴드를 포함하는 RAPD 유전자지문에 의해 특징되며,
    (a) 아세트산의 존재하에서 알콜계 용매를 사용하여 마 종의 덩이줄기를 추출하는 단계;
    (b) 가용성 부분을 얻기 위해 단계 (a)에서 얻은 최종 생성물을 분리 처리하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 얻은 가용성 부분으로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 마 종의 추출물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)에서 사용된 알콜계 용매는 메탄올계 용매, 에탄올계 용매 또는 이의 혼합물인 마 종의 추출물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)는 1% 아세트산의 존재하에서 수행되는 마 종의 추출물.
  10. 제 7 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a)에서, 1% 아세트산의 존재하에서 40% 메탄올 용액은 마 종의 덩이줄기를 추출하는데 사용되는 마 종의 추출물.
  11. 제 7 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(a) 이전에, 마 종의 덩이줄기는
    (i) 1% 아세트산 용액에 마 종의 덩이줄기를 침지하는 단계;
    (ii) 마 종의 아세트산-처리 덩이줄기를 동결하는 단계; 및
    (iii) 마 종의 동결된 덩이줄기를 동결건조하는 단계를 포함하는 전처리를 받는 마 종의 추출물.
  12. 제 7 항에 있어서,
    제조 방법의 단계(b)에서, 분리 처리는 원심분리에 의해 수행되는 마 종의 추출물.
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