KR20080065617A - 글루코코티코이드 수용체 발현의 조절 - Google Patents

글루코코티코이드 수용체 발현의 조절 Download PDF

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브레트 피. 모니아
로버트 맥케이
수잔 엠. 프레이어
산자이 비하낫
리네타 와츠
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존슨 앤드 존슨 파머슈티컬 리서치 앤드 디벨로프먼트 엘엘씨
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Abstract

글루코코티코이드 수용체의 발현을 조절하는 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 조성물은 안티센스 화합물, 특히 글루코코티코이드 수용체를 코딩하는 핵산을 표적화하는 생체 내 특성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 글루코코티코이드 수용체 발현을 조절하고 질병을 치료하는데 이들 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

글루코코티코이드 수용체 발현의 조절{MODULATION OF GLUCOCORTICOID RECEPTOR EXPRESSION}
서열 목록
37,122 바이트(MS-DOS에서 측정)이며 2006년 9월 19일자 생성된 BIOL0065WOSEQ.txt 파일을 포함하는 디스켓 상 서열 목록의 컴퓨터-판독가능한 형태가 본원에 참조로 인용된다.
세포, 조직 또는 동물에서 글루코코티코이드 수용체의 발현을 조절하는 화합물, 조성물 및 방법이 본원에 개시된다.
증가된 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)가 당뇨병에서 당 생산증가의 주요 원인이라고 판단됨에 따라, 간의 당 생산의 억제에 대한 수많은 치료 표적이 조사되어 왔다. 동물 모델에서 당뇨병을 개선하기 위한 글루코코티코이드 수용체(핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 1; NR3C1; GCCR; GCR; GRL; 글루코코티코이드 수용체, 림프구로도 알려짐)의 길항제의 능력때문에, 이러한 화합물은 조사될 유력한 치료법 중 하나이다. 그러나, HPA 축의 활성화를 포함하여, 글루코코티코이드 수용체 길항제에는 해로운 전신 효과가 존재한다 (Link, Curr Opin Investig Drugs, 2003, 4, 421-429). 증가된 HPA 축 활성은 면역-관련 염증 활동의 억제와 연관되며, 이는 감염성 약제 및 신생물에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. HPA 축 또는 그의 표적 조직에서 결함을 통한 면역-매개의 염증 억제와 관련된 증상은 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 만성 스트레스, 만성 알코올 중독 및 멜랑코리성 우울증 (Chrousos, N Engl J Med, 1995, 332, 1351-1362)를 포함한다. 이에 따라, 이는 간 및 지방-특이적 글루코코티코이드 수용체 길항제를 개발하는데 큰 가치가 있다.
발명의 요약
본 발명은 GCCR의 발현을 조절하며, GCCR을 코딩하는 핵산 분자에 표적화되고 이와 혼성화될 수 있는 올리고머 화합물에 관한 것이다. 하나 내지 4개의 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드로 구성된 "윙(wing)"으로 각각의 5' 및 3' 말단에 프랭킹(flanking)된 "갭" 또는 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 "갭머(gapmer)"로 언급되는 키메라 올리고뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 데옥시뉴클레오티드 영역은 10개 초과의 데옥시뉴클레오티드로 구성됨에 따라, 본원에 전체가 참조로 인용된 미국 공보 US2005-0164271호에 예시된 바와 같은 10개 데옥시뉴클레오티드 갭 영역을 포함하는 키메라 화합물과 비교하여 본 발명의 갭머는 "확장된 갭"이다. 일부 구체예에서, 동일한 서열을 가지나, 두 5' 및 3' 말단 상에서 다섯개의 2'-0-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 간에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이, 유사하거나 개선 된 효능을 가진다. 이에 따라, 본 발명의 구체예는 GCCR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 효능은 동일한 서열을 지니나, 표적 조직에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이 두 5' 및 3' 말단에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 유사하거나 그보다 더 낫다.
본 발명의 또다른 구체예는 GCCR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도는 동일한 서열을 지니나, 표적 조직, 이를 테면 간에서 효능이 유지되거나 개선되면서 두 5' 및 3' 말단에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 유사하거나, 이와 비교하여 감소된다.
세포, 조직 또는 동물을 본 발명의 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 세포, 조직 또는 동물에서 GCCR의 발현을 조절하는 방법이 더 제공된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 세포, 조직 또는 동물에서 GCCR의 발현을 감소시키는 데 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 동물을 본 발명의 화합물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하여, 동물에서 글루코코티코이드 발현에 의해 매개되는 질환 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 질환 또는 증상은 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 대사 증후군 X, 고혈당증, 고지혈증 또는 간지방증을 포함한다. 일부 구체예에서, 고지혈증은 증가된 지질, 이를 테면, 혈중 콜레스테롤 또는 증가된 혈중 트리글리세리 드와 관련된다. 혈중 지질은 혈장 지질 및 혈청 지질을 포함한다. 본 발명의 화합물을 투여하여, 동물에서 혈중 지질 수준을 감소시키는 방법, 체지방량을 감소시키는 방법, 간 트리글리세리드 수준을 감소시키는 방법 및 인슐린 민감성을 개선시키는 방법이 더 제공된다.
본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 혈당 수준을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 혈당 수준은 공복 또는 급식 당 수준, 및 혈청 또는 혈장 당 수준을 포함하는 혈당 수준일 수 있다. 인슐린 민감성을 증가시키고, 간의 당 산출을 억제하는 방법이 더 제공된다.
본 발명의 또다른 면은 본 발명의 화합물을 투여하여 동물에서 혈중 지질 또는 혈당 수준 증가의 시작을 지연시키거나 억제하는 방법이다.
본 출원은 전체가 참조로 인용된 미국 출원 제 60/718,684호와 관련된다. 본 출원은 또한 각각의 전체가 참조로 본원에 이용된 미국 출원 제 11/231,243호 및 PCT 출원 제 PCT/US2005/033837호와 관련된다.
개요
GCCR을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 데 이용하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 다른 안티센스 화합물을 포함하는 올리고머 화합물이 본원에 개시된다. GCCR을 코딩하는 하나 이상의 표적 핵산 분자와 혼성화하는 올리고머 화합물을 제공하여 이를 성취할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 GCCR(글루코코티코이드 수용체; 핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 1; GR; GRL; 및 NR3C1으로도 알려짐)의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법이다. 표 1에 열거된 것은 GCCR에 표적화된 올리고머 화합물을 설계하기 위하여 이용될 수 있는 서열의 GENBANK® 수탁 번호이다. 본 발명의 올리고머 화합물은 표 1에 나타낸 하나 이상의 표적 핵산 분자와 혼성화하는 올리고머 화합물, 뿐 아니라 GCCR을 코딩하는 다른 핵산 분자에 혼성화하는 올리고머 화합물을 포함한다.
올리고머 화합물은 GCCR을 코딩하는 핵산 분자의 임의의 영역, 구획, 또는 부위를 표적화할 수 있다. 적합한 표적 영역, 구획 및 부위는 비제한적으로, 5'UTR, 시작 코돈, 정지 코돈, 코딩 영역, 3'UTR, 5' 캡 영역, 인트론, 엑손, 인트론-엑손 접합점, 엑손-인트론 접합점 및 엑손-엑손 접합점을 포함한다.
Figure 112008027611953-PCT00001
활성 올리고머 화합물이 혼성화하는 표적 핵산 상의 위치는 하기에서 "입증된 표적 구획"으로 언급된다. 본원에서 이용된 용어 "입증된 표적 구획"은 활성 올리고머 화합물이 표적화된 표적 영역의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부위로 정의된다. 이론에 의한 도약 없이, 이들 표적 구획이 혼성화할 수 있는 표적 핵산의 부분을 나타내는 것으로 여겨진다.
본 발명은 키메라 화합물인 올리고머 화합물을 포함한다. 키메라 화합물의 예는 비-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 "윙"에 의해 프랭킹된 "갭" 또는 2'-데옥시뉴클레오티드 영역을 갖는 갭머이다. 이론에 의한 도약 없이, 갭머의 갭은 RNA 표적에 결합할 때 RNase H에 의해 인지될 수 있는 기질을 나타내나, 윙은 듀플렉스(duplex) 안정성 또는 유익한 약동학적 효과에 기여하는 것과 같이 다른 특성을 부여할 수 있는 임의의 기질이 아니다. 각 윙은 하나 이상의 비-데옥시올리고뉴클레오티드 모노머일 수 있다. 일 구체예에서, 갭머는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드의 윙에 의해 5' 및 3' 말단 각각에 프랭킹된 16개의 2'-데옥시뉴클레오티드 영역으로 구성된다. 이는 2-16-2 갭머로 언급된다. 이에 따라, 갭머 또는 이러한 키메라 올리고머 화합물의 "모티브"는 2-16-2이다. 또다른 구체예에서, 모든 뉴클레오티드 사이 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 또다른 구체예에서, 갭머의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 구체예는 그의 5' 및 3' 말단 각각에 적어도 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10 초과의 뉴클레오염기 길이의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 13 내지 26 서열 길이의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고머 화합물을 포함한다. 바람직한 "확장된 갭" 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 갭 부분에서 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 5' 및 3' 프랭킹 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 확장된 갭의 갭머는 1-18-1, 1-17-2, 2-17- 1, 2-16-2, 3-14-3 및 4-12-4를 포함하는 모티브를 갖는다.
바람직한 구체예에서, 올리고머 화합물은 GCCR RNA를 표적화하거나 이에 혼성화한다. 또다른 구체예에서, 올리고머 화합물은 GCCR RNA의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 올리고머 화합물은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%로 GCCR의 발현을 감소시킨다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도가 동일한 서열을 가지나, 각 5' 및 3' 말단에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교하여 감소되는 것을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도가 동일한 서열을 가지나 각 5' 및 3' 말단에서 5개 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 비교하여 유사하거나 감소되는 것을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 감소로 간주되는 효능 또는 치료 효과가 동일한 서열을 가지나 표적 조직에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이, 5' 및 3' 말단 둘다에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 유사하거나 더 나은 것을 포함한다. 바람직한 표적 조직은 간 및 지방 조직을 포함한다.
본 발명은 GCCR을 코딩하는 핵산 분자에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 13 내지 26 길이의 뉴클레오염기를 제공하며, 여기서, 올리고뉴클레오티드는 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역을 포함하고, 상기 제1 영역은 적어도 11개 데옥시뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제2 및 제3 영역은 1 내지 4개 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제2 및 제3 영역은 상기 제1 영역의 5' 및 3' 말단에서 제1 영역을 프랭킹한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 GCCR에 혼성화하며, GCCR의 발현을 감소시킨다. 일부 구체예에서, "갭" 영역은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 뉴클레오염기를 포함한다. 일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20 길이의 뉴클레오염기이다.
올리고머 화합물은 약 8 내지 약 80개 뉴클레오염기(예를 들어, 약 8 내지 약 80개의 연결된 뉴클레오시드), 바람직하게 약 13 내지 약 26 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 본 분야의 숙련자는 고려되는 바람직한 올리고머 화합물이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26 길이의 뉴클레오염기인 화합물을 포함하는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 화합물은 예시적인 안티센스 화합물 중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다(남아있는 뉴클레오염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물의 5'-말단의 업스트림에서 바로 시작하는 동일한 올리고뉴클레오티드의 연속 스트레치(stretch)이며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 포함할 때까지 계속된다). 다른 화합물은 예시적인 안티센스 화합물 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열로 나타낼 수 있다(남아있는 뉴클레오염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물의 3'-말단의 다운스트림에서 바로 시작하는 동일한 올리고뉴클레오티드의 연속 스트레치이며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 포함할 때까지 계속된다). 화합물은 예시적인 화합물의 서열의 내부 부분에서 적어도 8개 연속적 뉴클레오염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열로 나타낼 수 있으며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 함유할 때까지 둘 중 하나 또는 양 방향으로 확대될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 GCCR을 코딩하며, 서열 번호 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63, 또는 96의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 핵산 분자에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 20개 길이의 뉴클레오염기를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 GCCR을 코딩하며 서열 번호 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63, 또는 96의 서열을 갖는 핵산 분자에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 20개 길이의 뉴클레오염기이다. 일 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 갖는다.
본 발명은 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 GCCR을 코딩하고 서열 번호 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63, 또는 96의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 핵산 분자에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 20개 길이의 뉴클레오염기를 제공하며, 여기서, 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 내지 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 데옥시뉴클레오티드 영역 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 길이의 뉴클레오염기를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 GCCR RNA에 특이적으로 혼성화하고, 발현을 감소시킨다.
일 구체예에서, 프랭킹 영역은 대칭적이다(3' 프랭킹 영역에서와 같이 5' 프랭킹 영역에서 동일한 수의 뉴클레오티드를 가짐). 또다른 구체예에서, 프랭킹 영역은 비-대칭적이다(5' 프랭킹 영역에서 3' 프랭킹 영역과 다른 수의 뉴클레오티드를 가짐).
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 함유할 수 있다. 변형된 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오염기도 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
또다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명은 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCCR에 특이적으로 혼성화하고, GCCR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 인핸서 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물도 본원에서 고려된다. 본 발명의 화합물은 GCCR에 의해 매개되는 글루코코티코이드 활성에 관련된 질환 및 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 이용될 수도 있다.
본 발명의 구체예는 세포 또는 조직을 본 발명의 약제학적 조성물 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하여 조직 또는 세포에서 GCCR의 발현을 줄이는 방법, 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 동물에 투여하는 것을 포함하여, 혈당 수준, 혈중 트리글리세리드 수준 또는 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법을 포함한다. 혈중 수준은 혈장 또는 혈청 수준일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 인슐린 민감성을 증가시키는 방법, 간 트리글리세리드 수준을 감소시키는 방법 및 간의 당 산출을 억제하는 방법이 또한 고려된다. 증가된 인슐린 민감성은 순환하는 인슐린 수준에서 감소에 의하여 지시될 수 있다. 본 발명의 또다른 면은 동물에서 체지방량을 줄이는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 동물에 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 글루코코티코이드 수용체 발현과 관련된 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 질환 또는 증상은 대사 질환 또는 증상일 수 있다. 일부 구체예에서, 대사 질환 또는 증상은 당뇨병, 비만, 대사 증후군 X, 고혈당증, 고지혈증 또는 인슐린 저항성이다. 일부 구체예에서, 질환은 2형 당뇨병이다. 일부 구체예에서, 비만은 식이-유도된다. 일부 구체예에서, 고지혈증은 증가된 혈중 지질 수준과 연관된다. 지질은 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 포함한다. 일 구체예에서, 증상은 간지방증이다. 일부 구체예에서, 지방간은 지방간염 또는 비-알코올성 지방간염이다.
동물에서 혈당 또는 혈중 지질 수준의 증가 시작을 예방하거나 지연시키는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 화합물은 이를 필요로 하는 동물, 이를 테면, 인간에서 GCCR의 발현을 조절하는 데 이용될 수 있다. 하나의 비-제한적인 구체예에서, 방법은 GCCR의 발현을 감소시키는 안티센스 화합물의 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 GCCR RNA의 수준 또는 작용을 효율적으로 감소시킨다. GCCR mRNA 수준의 감소가 발현된 GCCR 단백질 산물에서 변형을 유발할 수 있기 때문에, 만들어진 변형도 측정될 수 있다. GCCR RNA 또는 발현된 단백질 산물의 수준 또는 작용을 효율적으로 감소시키는 본 발명의 안티센스 화합물은 활성 안티센스 화합물로 고려된다. 일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 본원에서 예시적인 분석으로 측정된 바, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%로 RNA가 감소되도록 GCCR의 발현을 줄인다.
안티센스 기작
"안티센스 기작"은 화합물과 표적 핵산의 혼성화에 관여하는 모든 것이며, 여기서, 혼성화의 결과 또는 효과는 표적 분해 또는 예를 들어, 전사 또는 스플라이싱(splicing)에 관여하는 세포 기작에 대하여 시간을 벌 수 있는 표적 점유이다.
표적
본원에서 이용된 용어 "표적 핵산" 및 "GCCR을 코딩하는 핵산 분자"는 GCCR을 코딩하는 DNA, 그러한 DNA에서 전사된 RNA(전-mRNA 및 mRNA 또는 이의 부분 포함) 및 그러한 RNA에서 유래된 cDNA도 포함하는 것으로 편의상 이용된다.
영역, 구획 및 부위
표적화 과정은 통상 목적하는 효과, 예를 들어, 발현의 조절이 유발되도록 안티센스 상호작용을 위한, 표적 핵산 내의 적어도 하나의 표적 영역, 구획 또는 부위를 결정하는 것을 포함한다. "영역"은 적어도 하나의 식별가능한 구조, 기능 또는 특성을 갖는 표적 핵산의 부분으로 정의된다. 표적 핵산의 영역 내는 구획이다. "구획"은 표적 핵산 내의 영역의 더 작은 또는 하위-부분으로 정의된다. 본 발명에서 이용되는 "부위"는 표적 핵산에서 독특한 뉴클레오염기 위치로 정의된다.
한번 하나 이상의 표적 영역, 구획 또는 부위가 확인되면, 올리고머 화합물은 목적하는 효과를 제공하기 위하여, 표적에 충분하게 상보적이도록, 예를 들어, 충분히 잘, 충분한 특이성으로 혼성화되도록 설계된다.
변이체
선택적인 RNA 전사체가 DNA의 동일한 게놈 영역에서 생산될 수 있는 것이 본 분야에 또한 알려져 있다. 이러한 선택적인 전사체는 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 더욱 자세하게, "전-mRNA 변이체"는 그의 시작 또는 정지 위치에서 동일한 게놈 DNA로부터 생산되는 다른 전사체와 다른, 동일한 게놈 DNA로부터 생산되며, 인트론 및 엑손 서열을 둘 다 함유하는 전사체이다.
스플라이싱하는 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역 또는 이의 부분의 절단에 따라, 전-mRNA 변이체는 더 작은 "mRNA 변이체"를 생산한다. 결과적으로, mRNA 변이체는 처리된 전-mRNA 변이체이며, 각각의 독특한 전-mRNA 변이체는 스플라이싱의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 생산해야한다. 이들 mRNA 변이체는 "선택적 스플라이스 변이체"로도 알려져 있다. 전-mRNA 변이체의 스플라이싱이 발생하지 않는다면, 전-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
전사를 시작하거나 정지하는 선택적 신호를 이용하여 변이체가 생산될 수 있으며, 전-mRNA 및 mRNA가 하나 이상의 시작 코돈 또는 정지 코돈을 소유하고 있음이 본 분야에 알려져 있다. 선택적 시작 코돈을 이용하는 전-mRNA 또는 mRNA로부터 유래된 변이체는 전-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 시작 변이체"로 알려져 있다. 선택적 정지 코돈을 이용하는 전사체는 전-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 정지 변이체"로 알려져 있다. 선택적 정지 변이체의 한 특정 타입은 다중 전사체가 전사의 기작에 의해 "폴리A 정지 신호들" 중 하나의 선택적 선별로부터 유발되어 생성되고, 독특한 폴리A 부위에서 종결되는 전사체가 생성되는 "폴리A 변이체"이다. 결과적으로, 본원에 개시된 변이체의 타입은 또한 적합한 표적 핵산이다.
표적 발현의 조절
"조절"은 기능의 변동, 예를 들어, 발현의 증가(자극 또는 유도) 또는 감소(억제 또는 축소)를 의미한다. 또다른 예로서, 발현의 조절은 전-mRNA 처리에서 스플라이스 부위 선택을 변동시키는 것을 포함할 수 있다. "발현"은 유전자의 코딩된 정보가 세포에서 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 모든 기능을 포함한다. 이들 구조는 전사 및 번역의 산물을 포함한다. "발현의 조절"은 상기 기능의 변동을 의미한다. "조절자"는 GCCR의 발현을 조절하고 입증된 표적 구획에 상보적인 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 화합물이다.
표적 핵산의 발현 조절은 임의의 수의 핵산(DNA 또는 RNA) 기능의 변경을 통해 성취될 수 있다. 조절될 DNA의 기능은 복제 및 전사를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 내 템플레이트(template), 벡터, 플라스미드 작제물 또는 이외의 것에서 복제 및 전사될 수 있다. 조절될 RNA의 기능은 단백질 번역의 부위로 RNA의 전좌, 세포 내에서 RNA 합성의 부위와 떨어진 부위로 RNA의 전좌 및 RNA에서 단백질의 번역을 포함하나 이에 한정되지 않는 전좌 기능을 포함한다. 조절될 수 있는 RNA 처리 기능은 하나 이상의 RNA 종류를 수득하기 위한 RNA 스플라이싱, RNA의 캡핑(capping), RNA의 3' 성숙 및 RNA가 관여하거나 이에 의해 촉진될 수 있는 RNA를 포함하는 복합체 형성 또는 촉매 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 발현의 조절은 일시적으로 또는 최종 안정 상태 수준으로 하나 이상의 핵산 종류의 증가된 수준 또는 하나 이상의 핵산 종류의 감소된 수준을 유발할 수 있다. 표적 핵산 기능과의 이러한 간섭의 한 결과는 GCCR 발현의 조절이다. 이에 따라, 일 구체예에서, 발현의 조절은 표적 RNA 또는 단백질 수준에서 증가 또는 감소를 의미할 수 있다. 또다른 구체예에서, 발현의 조절은 하나 이상의 RNA 스플라이스 산물의 증가 또는 감소 또는 복수의 스플라이스 산물의 비율로의 변화를 의미할 수 있다.
혼성화 및 상보성
"혼성화"는 올리고머 화합물의 상보적 가닥의 접합을 의미한다. 특정 기작으로 한정하지 않으나, 대부분의 접합의 공통의 기작은 수소 결합을 포함하며, 이는 올리고머 화합물의 가닥의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(뉴클레오염기) 사이에 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴(reversed Hoogsteen) 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 접합되는 상보적 뉴클레오염기이다. 혼성화는 다양한 환경 하에서 발생할 수 있다. 특정 결합이 바람직한 조건 하에서, 예를 들어, 생체내 분석 또는 치료적 처치의 경우 생리적 조건 하에서 및 실험관내 분석의 경우 분석이 수행되는 조건 하에서, 올리고머 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 방지하기에 충분한 정도의 상보성이 있을 때, 올리고머 화합물은 특이적으로 혼성화할 수 있다.
"엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물이 그의 표적 서열에 혼성화하고, 다른 서열에 최소의 수로 혼성화하는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경에서 상이할 것이며, 올리고머 화합물이 표적 서열에 혼성화하는 "엄격한 조건"은 그들이 조사되는 분석과 올리고머 화합물의 조성물과 본질에 의하여 결정된다.
본원에서 이용된 "상보성"은 하나 또는 두개의 올리고머 화합물 가닥 상에서 두 뉴클레오염기 사이의 정확한 접합을 위한 능력을 말한다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 특정 위치에서 뉴클레오염기가 표적 핵산의 특정 위치의 뉴클레오염기와 수소 결합할 수 있다면, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적 위치일 것이라 판단된다. 각 분자에서 충분한 수의 상보적 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오염기에 의해 차지될 때, 올리고머 화합물 및 DNA 또는 RNA는 서로 상보적이다. 이에 따라, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 올리고머 화합물과 표적 핵산 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 수의 뉴클레오염기에 걸친 상보성 또는 충분한 정도의 정확한 접합을 나타내는 데 이용되는 용어이다.
올리고머 화합물의 서열이 특이적으로 혼성화할 그의 표적 핵산의 서열에 100% 상보적일 필요가 없는 것은 본 분야에 알려져 있다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 사이에 있거나 근접한 구획이 혼성화 사건(예를 들어, 루프(loop) 구조, 미스매치(mismatch) 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 구획에 걸쳐 혼성화할 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물은 표적화된 표적 핵산 서열 내에서 표적 영역에 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 92%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 20 뉴클레오염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이며, 이에 따라 특이적으로 혼성화하는 올리고머 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 남아있는 비상보적인 뉴클레오염기는 상보적 뉴클레오염기와 함께 무리를 지어 있거나 산재되어 있을 수 있으며, 서로 또는 상보적 뉴클레오염기에 인접할 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전 상보적인 두 영역에 의해 프랭킹된 4개의 비상보적 뉴클레오염기를 지니는 18 길이의 뉴클레오염기인 올리고머 화합물은 표적 핵산과 전체 77.8%의 상보성을 지닐 것이며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 있을 것이다. 올리고머 화합물과 표적 핵산의 영역의 퍼센트 상보성은 본 분야에 알려진 BLAST 프로그램 (기본 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 루틴하게 결정될 수 있다(Altschul et al., J. MoI. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). 퍼센트 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들어, Smith 및 Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489) 알고리즘을 이용한 디폴트 세팅을 이용하는 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI)에 의해 결정될 수 있다.
올리고머 화합물
용어 "올리고머 화합물"은 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 폴리머 구조를 말한다. 이러한 용어는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체 및 이들의 키메라 배합물을 포함한다. 올리고머 화합물은 루틴하게 선형으로 제조되거나, 달리 원형으로 제조되거나 결합될 수도 있다. 또한, 분지 구조가 본 분야에 알려져 있다. "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 올리고머 화합물"은 그것이 혼성화하는 핵산 분자의 영역에 적어도 부분적으로 상보적이며, 그 발현을 조절하는(증가시키거나 감소시키는) 올리고머 화합물을 말한다. 결과적으로, 모든 안티센스 화합물이 올리고머 화합물으로 명명될 수 있으나, 모든 올리고머 화합물이 안티센스 화합물인 것은 아니다. "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 핵산-기초의 올리고머인 안티센스 화합물이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 올리고머 화합물의 비제한적인 예는 프라이머, 프로브, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이서 및 siRNA를 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형, 분지 또는 헤어핀의 형태로 도입될 수 있으며, 구조적 요소, 이를 테면, 내부 또는 말단 벌지(bulge) 또는 루프를 함유할 수 있다. 올리고머 이중-가닥 화합물은 이중-가닥 화합물을 형성하기 위하여 혼성화된 두 가닥이거나, 혼성화하고 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 허용하기에 충분하게 자기 상보적인 단일 가닥일 수 있다.
본 발명의 본문에서 "키메라" 올리고머 화합물 또는 "키메라"는 복수의 화학적으로 상이한 영역을 함유하며, 각각 적어도 하나의 모노머 유니트, 이를 테면, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드를 포함하는 단일- 또는 이중-가닥 올리고머 화합물, 이를 테면, 올리고뉴클레오티드이다.
"갭머"는 비-데옥시올리고뉴클레오티드 구획에 의해 프랭킹된 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 영역을 지닌 올리고머 화합물, 일반적으로 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 중심 영역은 "갭"으로 언급된다. 프랭킹 구획은 "윙"으로 언급된다. 윙 중 하나가 0개의 비-데옥시올리고뉴클레오티드 모노머를 갖는다면, "헤미머"라 칭한다.
NAFLD
"비알콜성 지방간 질환"(NAFLD)은 간세포(간지방증)에서의 단순한 트리글리세리드 축적에서부터 염증(지방간염), 섬유증 및 간경변을 갖는 간지방증 범위의 질환 스펙트럼을 포함한다. 비알콜성 지방간염(NASH)은 트리글리세리드의 침전을 넘어서 NAFLD의 진행으로부터 발생한다. 괴사, 염증 및 섬유증의 포함이 가능한 2차 타격은 NASH의 진행에 요구된다. 2차 타격에 대한 후보는 하기의 넓은 카테고리로 그룹화될 수 있다: 산화적 스트레스에서 증가를 일으키는 인자 및 전염증성 사이토카인의 발현을 개선시키는 인자. 간에서의 증가된 트리글리세리드가 동물 및 인간 간세포에서의 증가된 산화적 스트레스를 유도한다고 제안되어 왔고, 간에서의 트리글리세리드 축적, 산화적 스트레스와 NASH로의 간지방증 진행 사이의 잠정적인 인과관계를 지적한다(Browning 및 Horton, J. Clin . Invest., 2004, 114, 147-152). 고중성지방혈증 및 고지방산혈증은 말초 조직에서의 트리글리세리드 축적을 초래할 수 있다(Shimamura et al., Biochem . Biophys . Res . Commun., 2004, 322, 1080-1085). 본 발명의 일 구체예는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 올리고머 화합물을 투여함으로써 동물의 간에서 지방을 감소시키는 방법이다. 본 발명의 다른 구체예는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 올리고머 화합물을 투여함으로써 동물에서 간지방증을 치료하는 방법이다. 어떤 구체예에서, 지방간은 지방간염이다. 어떤 구체예에서, 지방간은 NASH이다.
화학적 변형
변형되고 선택적인 뉴클레오염기
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 화합물에서 다른 염기가 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 제1의 뉴클레오티드가 아데노신이라면 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하는 변이체가 생산될 수 있다. 이는 올리고머 화합물의 임의의 위치에서 수행된다. 이어서 이들 화합물은 본원에 기재되어 있는 방법을 이용하여 테스트하여 GCCR mRNA의 발현을 감소시키는 능력을 결정한다.
올리고머 화합물은 또한 뉴클레오염기(당업계에서 종종 헤테로사이클 염기 또는 단지 "염기"로서 언급됨) 변형 또는 치환을 포함한다. 본원에서, "변형되지 않은" 또는 "자연적인" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. "치환"은 변형되지 않은 염기로 대체되거나 다른 변형되지 않은 염기 또는 자연적인 염기를 갖는 자연적인 염기로 대체되는 것을 의미한다. "변형된" 뉴클레오염기는 다른 합성 뉴클레오염기 및 자연적인 뉴클레오염기, 이를 테면, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C=C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 의미한다. 추가의 변형된 뉴클레오염기는 트리사이클 피리미딘, 이를 테면, 페녹사진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 이를 테면, 치환된 페녹사진 시티딘(예: 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카브아졸 시티딘(2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도(3',2':4,5)피롤로(2,3-d)피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 추가의 뉴클레오염기는 미국 측허 번호 3,687,808에 기재되어 있는 것, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 기재되어 있는 것, Englisch et al ., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 기재되어 있는 것 및 Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993에 기재되어 있는 것을 포함한다. 이들 뉴클레오염기의 어떤 것은 본 발명의 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데에 적절한 것으로서 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃에 의해 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 보이고, 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 슈가 변형과 배합시킬 경우, 현재 적절한 염기 치환이다. 당업계에서 염기의 변형이 핵산 서열에서 치환을 제조하기 위하여 이러한 화학적 변형을 수반하는 것은 아니라는 것은 이해된다.
다른 변형된 뉴클레오염기뿐만 아니라 상술한 바과 같이 특정하게 변형된 뉴클레오염기의 제조가 기재된 대표적인 미국 특허는 한정하는 것은 아니지만, 상술한 미국 3,687,808뿐만 아니라, 미국 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941; 및 5,750,692를 포함한다.
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 하나 이상의 자연적으로 발생한 헤테로사이클 염기 부분 대신으로 폴리사이클 헤테로사이클 화합물을 포함한다. 트리사이클 헤테로사이클 화합물의 수는 앞서 보고되었다. 이들 화합물은 변형된 가닥의 표적 가닥에 대한 결합 성질을 증가시키기 위하여 안티센스 적용에 일반적으로 사용된다. 가장 많이 연구되는 변형은 구아노신을 표적화화기 때문에 G-클램프 또는 시티딘 유사체라는 용어로 불린다. 제2의 가닥에서 구아노신과 3 수소 결합을 생성하는 대표적인 시토신 유사체는 1,3-디아자페녹사진-2-온(Kurchavov, et al ., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846), 1,3-디아자페노티아진-2-온,(Lin, K. -Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874) 및 6,7,8,9-테트라플루오로-1,3-디아자페녹사진-2-온(Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드로 통합된 이들 염기 변형은 상보적인 구아닌으로 혼성화 되는 것으로 나타났고 후자는 또한, 아데닌으로 혼성화되는 것으로 나타났고 적층 상호작용에 의한 나선형 온도 안정성을 개선시키는 것으로 나타났다(또한 미국 특허 공개공보 20030207804 및 20030175906 참조).
추가의 헬릭스-안정성 성질은 시토신 유사체/치환체가 딱딱한 1,3-디아자페녹사진-2-온 스캐폴드(Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532)에 부착되는 아미노에톡시 일부를 가질 경우 발견되었다(Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 결합 연구는 단일 결합이 5-메틸 시토신(dC5me)에 상대적으로 18℃ 이하의 ΔTm을 갖는 그에 상보적인 표적 DNA 또는 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드 모델의 결합 친화성을 개선시킬 수 있음을 증명하였고, 이는 단일 변형에 대하여 높은 친화성 개선을 보였다. 다른 한편, 나선형 안정성에서 수득한 것은 올리고뉴클레오티드의 특이성을 손상시키지 않았다.
본 발명에서 사용 가능한 추가의 트리사이클 헤테로사이클 화합물 및 이의 사용 방법은 미국 특허 6,028,183, 및 6,007,992에 기재되어 있다.
페녹사진 유도체의 증진된 결합 친화성은 이의 손상되지 않은 서열 특이성과 함께 이들을 더욱 효능 있는 안티센스-염기 약물의 향상에 대하여 가치있는 뉴클레오염기 유사체로 만든다. 실재로, 페녹사진 치환을 포함하는 헵타뉴클레오티드가 RNase H 활성, 세포 흡수 증가 및 증가된 안티센스 활성을 나타내는 것이 가능한 것으로 증명된 시험관 내 실험으로부터 믿을만한 데이터가 도출되었다(Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 단일 치환이 20 mer 2'-데옥시포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 시험관 내 유효성을 유의하게 개선시키는 것으로 나타났으므로, 활성 증가는 G-클램프의 경우에 더욱 두드러졌다 (Flanagan, W. M.; Wolf, JJ.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518).
헤테로사이클 염기로서 유용한 추가의 변형된 폴리사이클 헤테로사이클 화합물은 한정하는 것은 아니지만, 상술한 미국 특허 3,687,808뿐만 아니라, 미국 특허: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,434,257; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,646,269; 5,750,692; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 및 5,681,941, 및 미국 특허 공개공보 20030158403에 개시되어 있다.
배합물
본 발명의 조성물은 두개 이상의 올리고머 화합물을 포함할 수 있다. 다른 관계된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 제 1의 핵산 및 제 2의 핵산 표적을 표적화하는 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 핵산 표적의 다른 영역을 표적화하는 두개 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 두개 이상의 배합된 화합물은 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
배합 요법
본 발명의 화합물은 배합 요법으로 사용될 수 있고, 여기에서 추가의 효과는 증상을 치료하기 위하여 본 발명의 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 다른 적절한 치료적/예방적 화합물을 투여함으로써 달성된다. 적절한 치료적/예방적 화합물(들)은 한정하는 것은 아니지만, 당강하제, 항비만제 및 지질강하제를 포함한다. 당강하제는 한정하는 것은 아니지만 호르몬, 호르몬 모방체, 또는 인크레틴 모방체(예: 흡입용 인슐린을 포함하는 인슐린, GLP-1 또는 GLP-1 유사체, 이를 테면, 리라글루티드, 또는 엑세나티드), DPP(IV) 억제제, 술포닐우레아(예: 아세토헥사마이드, 클로로프로파미드, 톨부타미드, 톨아자미드, 글리메피리드, 글리피지드, 글리브리드 또는 글리클라지드), 비구아니드(메트포민), 메글리티니드(예: 나테글리니드 또는 레파글리니드), 티아졸리디네디온 또는 부가의 치료 효과를 달성하기 위하여, 동물에게 PPAR-감마, 듀얼-PPAR 또는 팬-PPAR 작용제를 포함하는 PPAR 작용제, 디펩티딜 펩티다아제(IV) 억제제, GLP-1 유사체, 인슐린 및 인슐린 유사체, 인슐린 분비촉진제, SGLT2 억제제, 및 프람린타이드, 글루코키나아제 활성제, 비구아니드 및 알파-글루코시다아제 억제제를 포함하는 인간 아밀린 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택된 항당뇨제와의 배합물로서 제 1항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대사 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법. 다른 PPAR-감마 작용제(예: 피오글리타존 또는 로지글리타존), 알파-글루코시다아제 억제제(예: 아카보스 또는 미글리톨), 또는 GCGR을 표적으로 하지 않는 안티센스 화합물을 포함한다. 또한 듀얼 PPAR-작용제(예: Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 뮤라글리타자 또는 Astra-Zeneca에 의해 개발된 테사글리타자)를 포함한다. 또한 개발 중인 다른 당뇨병 치료도 포함된다(예: Novartis에서 개발 중인 LAF237; Merck에서 개발 중인 MK-0431; 또는 Sanofi-Aventis에서 개발 중인 리모나반트). 항비만제는 한정하는 것은 아니지만, 식욕 억제제(예: 펜터민 또는 Meridia™), 지방 흡수 억제제, 이를 테면, 올리스타트(예: Xenical™) 및 식욕을 자극하는 공복감 신호를 억제하는 섬모 신경성장인자의 변형된 형태를 포함한다. 지질강하제는 한정하는 것은 아니지만, 담즙산염 씨퀘스터링 레진(예: 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 콜레세벨람 하이드로클로라이드), HMGCoA-환원 효소 억제제(예: 로바스타틴, 프라바스타틴, 아토바스타틴, 심바스타틴 및 플루바스타틴), 니코틴산, 피브린산 유도체(예: 클로피브레이트, 젬피브로질, 페노피브레이트, 벤자피브레이트 및 시프로피브레이트), 프로브콜, 네오마이신, 덱스트로티록신, 식물성 스타놀 에스테르, 콜레스테롤 흡수 억제제(예: 이제티마이브), CETP 억제제(예: 토르세트라피브, 및 JTT-705), MTP 억제제(예: 임플리타피드), 담즙산 수송제의 억제제(혀끝의 나트륨 의존성 담즙산 수송제), 간의 CYP7a 조절제, ACAT 억제제(예: 아바시미베), 에스트로겐 대체 치료제(예: 타목시젠), 합성 HDL(예: ETC-216), 항염증제(예: 글루코코티코이드), 또는 GCGR을 표적으로 하지 않는 안티센스 화합물을 포함한다. 이들 약물의 하나 이상은 하나 이상의 GCGR의 안티센스 억제제와 배합되어 추가의 치료적 효과를 달성할 수 있다.
올리고머 합성
변형된 뉴클레오시드 및 변형되지 않은 뉴클레오시드의 올리고머화는 DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal(1993), Humana Press) 및/또는 RNA(Scaringe, Methods(2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith(1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron(2001), 57, 5707-5713)에 대한 문헌 절차 및 본원에 참조로서 인용된 미국 공개 번호 2005-0014713에 따라 일반적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 올리고머 화합물은 고체상 합성의 공지된 기술로 통상적이고 일반적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성은 위한 장치는 예를 들어 Applied Biosystems(Foster City, CA)를 포함하는, 몇몇의 벤더에 의해 시판되고 있다. 이러한 합성을 위하여 당업계에 공지된 임의의 다른 수단은 부가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사한 기술을 이용하는 것이 공지되어 있다.
올리고머 정제 및 분석
올리고뉴클레오티드 정제 및 분석의 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 분석 방법은 모세관 전기영동(CE) 및 전기분무-질량 분석법을 포함한다. 이러한 합성 및 분석 방법은 다중-웰 플레이트에서 수행될 수 있다.
참조에 의한 비한정적인 개시 및 인용
본 발명의 특정한 화합물, 조성물 및 방법이 특정한 구체예에 따라 특정적으로 기술된 반면, 본원의 예시는 단지 본 발명의 화합물만을 제공하지만, 동일한 것으로 한정하려는 것은 아니다. 각 참조, GENBANK® 수탁 번호 및 본 명세서에서 인용된 것은 본원에서 이의 전체가 참조로서 인용된다.
실시예 1
발현 조절의 분석
GCCR 발현의 조절은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. GCCR mRNA 수준은 예를 들어, 노던 블랏 분석, 경쟁적 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 real-time PCR에 의해 정량화할 수 있다. RNA 분석은 공지된 방법에 의해 총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA 상에서 수행될 수 있다. RNA 분리 방법은 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1- 4.2.9 및 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993에 기재되어 있다.
노던 블랏 분석은 당업계에서 기본적인 것이고 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996에 기재되어 있다. Real-time 정량(PCR)은 편리하게 상업적으로 이용가능한 ABI PRISM™ 7700 서열 검출 시스템(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 수행될 수 있고 제조자의 지침에 따라 사용된다.
GCCR에 의해 코딩된 단백질 수준은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 면역침전법, 웨스턴 블랏 분석(이뮤노블랏팅), ELISA 또는 형광 활성 세포 선별(FACS)로 정량화될 수 있다. GCCR에 의해 코딩된 단백질에 유도된 항체는 다양한 소스, 이를 테면, MSRS의 항체 카탈로그(Aerie Corpo랫트ion, Birmingham, MI)로부터 확인 및 수득될 수 있거나, 통상의 항체 발생 방법을 통하여 제조될 수 있다. 다클론성 항혈청의 제조에 대한 방법은, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다. 단일클론 항체의 제조는, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1 - 11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다.
면역침전법은 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998에 기재되어 있다. 웨스턴 블랏(이뮤노블랏) 분석은 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다. ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assays)는 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991에 기재되어 있다.
표적 핵산 발현 상에서 본 발명의 올리고머 화합물의 효과는 측정가능한 수준에서 존재하는 표적 핵산을 제공하는 다양한 임의의 세포 타입에서 테스트될 수 있다. 표적 핵산 발현 상에서 본 발명의 올리고머 화합물의 효과는 예를 들어, PCR 또는 노던 블랏 분석을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 세포주는 정상적 조직 및 세포 타입 및 다양한 장애와 관련(예: 과대증식 장애)된 세포로부터 유래된다. 다양한 조직 및 종으로부터 유래된 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA), Japanese Cancer Research Resources Bank(Tokyo, Japan), 또는 Centre for Applied Microbiology and Research(Wiltshire, 유닛ed Kingdom)로부터 입수될 수 있다.
1차 세포 또는 동물로부터 분리된 세포 및 지속 배양이 아닌 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있거나 다양한 상업적 공급자로부터 구입될 수 있다. 부가적으로, 1차 세포는 임상적 상황에서 인간 대상 증여자(예: 혈액 증여자, 외과적 환자)로부터 수득된 것을 포함한다.
세포 타입
표적 핵산 발현 상에서 올리고머 화합물의 효과를 HepG2 세포에서 테스트하 였다.
HepG2 세포:
인간 간아세포종 세포주 HepG2는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)로부터 구입하였다. HepG2 세포를 10% 우태아혈청, 1 mM 불필수 아미노산, 및 1 mM 피루브산 나트륨(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)이 보충된 Eagle's MEM에서 일반적으로 배양하였다. 세포를 일반적으로 약 90% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때 트립신 처리하고 희석하여 계대하였다. 멀티웰 배양 플레이트를 세포배양을 위하여 인산 완충 식염수 중 타입 1 랫트 꼬리 콜라겐(BD Biosciences, Bedford, MA)의 1:100 희석액으로 코팅함으로써 제조하였다. 콜라겐-함유 플레이트를 약 1 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜라겐을 제거하고 웰을 인산 완충 식염수로 2번 세정하였다. 세포를 올리고머 화합물 트랜스펙션 실험에 사용하기 위하여 약 8,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트(Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)로 씨딩하였다.
1차 랫트 간세포:
1차 랫트 간세포를 Charles River Labs (Wilmington, MA)에서 구입한 Sprague-Dawley 랫트로부터 준비하고, 10% 우태아 혈청(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), mL 당 100 유니트의 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)으로 보충된 고글루코오 스(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), DMEM에서 일반적으로 배양하였다. 세포는 본 발명의 올리고머 화합물과 함께 약 4,000-6,000 세포/웰 처리의 밀도로 플레이트로 씨딩하였다.
올리고머 화합물로 처리
세포가 적절한 컨플루언스에 도달하면, 이들을 기재한 바와 같은 트랜스펙션 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 당업계에 공지된 다른 적절한 트랜스펙션 시약은 한정하는 것은 아니지만, LIPOFECTAMINE™, OLIGOFECTAMINE™, 및 FUGENE™을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 적절한 트랜스펙션 방법은 한정하는 것은 아니지만, 일렉트로포레이션을 포함한다.
LIPOFECTIN ™
세포가 65-75% 컨플루언스에 도달하면, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM™-1 감소된 혈청 배지(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 중의 LIPOFECTIN™(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)과 혼합하여 원하는 올리고뉴클레오티드 농도 및 100 nM 올리고뉴클레오티드 당 2.5 또는 3 ㎍/mL의 LIPOFECTIN ™ 농도가 되도록 하였다. 이 트랜스펙션 혼합물을 상온에서 약 0.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트에서 성장한 세포를 위하여, 웰을 100 ㎕의 OPTI-MEM™-1으로 한번 세정한 다음 130 ㎕의 트랜스펙션 혼합물로 처리하였다. 24-웰 플레이트에서 성장한 세포 또는 다른 기준 조직 배양 플레이트를 적절한 용적의 배지 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 비슷하게 처리하였다. 세포를 처리하고 2회 또는 3회 반복하여 데이터를 수득하였다. 37℃에서 약 4-7 시간의 처리 후, 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 배지를 신선한 배양 배지로 교환하였다. 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 16-24 시간에 세포를 수집하였다.
CYTOFECTIN ™
세포가 65-75% 컨플루언스에 도달하면, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM™-1 감소된 혈청 배지(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 중의 CYTOFECTIN™(유전자 Therapy Systems, San Diego, CA)과 혼합하여 원하는 올리고뉴클레오티드 농도 및 100 nM 올리고뉴클레오티드 당 2 또는 4 ㎍/mL의 CYTOFECTIN™이 되도록 하였다. 이 트랜스펙션 혼합물을 상온에서 약 0.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트에서 성장한 세포를 위하여, 웰을 100 ㎕의 OPTI-MEM™-1으로 한번 세정한 다음 130 ㎕의 트랜스펙션 혼합물로 처리하였다. 24-웰 플레이트에서 성장한 세포 또는 다른 기준 조직 배양 플레이트를 적절한 용적의 배지 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 비슷하게 처리하였다. 세포를 처리하고 2회 또는 3회 반복하여 데이터를 수득하였다. 37℃에서 약 4-7 시간의 처리 후, 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 배지을 신선한 배양 배지로 교환하였다. 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 16-24 시간에 세포를 수집하였다.
대조 올리고뉴클레오티드
대조 올리고뉴클레오티드를 특정한 세포주에 대한 최상의 올리고머 화합물 농도를 결정하기 위하여 사용하였다. 또한, 본 발명의 올리고머 화합물을 올리고머 화합물 스크리닝 실험 또는 표현형 어세이에서 테스트하고, 동시에 대조 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 화합물과 병행하여 테스트하였다. 어떤 구체예에서, 대조 올리고뉴클레오티드를 네가티브 대조 올리고뉴클레오티드, 즉 유전자 발현 또는 표현형 상에서 효과의 부재를 측정하기 위한 수단으로서 사용하였다. 대안적인 구체예에서, 대조 올리고뉴클레오티드를 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드, 즉 유전자 발현 또는 표현형에 영향을 미치는 공지된 올리고뉴클레오티드로서 사용하였다. 대조 올리고뉴클레오티드를 표 2에 나타내었다. "표적 명칭"은 표적화하는 올리고뉴클레오티드에 대한 유전자를 의미한다. "표적의 종"은 올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA에 대하여 완전하게 상보적인 종을 의미한다. "모티브"는 화학적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분명한 영역을 의미한다. 표 2에서 특정한 화합물은 키메릭 올리고뉴클레오티드이고, 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심의 "갭" 영역으로 구성되고, 이는 "윙"에 의해서 양쪽 측면(5' 및 3')에서 프랭킹된다. 윙은 2'-MOE 뉴클레오티드로 공지된 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 구성된다. 각 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드의 "모티브"는 표 2에 기재하였고 각 갭 영역 및 윙에서 뉴클레오티드의 수를 나타내었는데, 예를 들어, "5-10-5"는 5-뉴클레오티드 윙에 의해 프랭킹된 10-뉴클레오티드 갭영역을 갖는 갭머를 의미한다. ISIS 29848 은 무작위적인 올리고머 화합물의 혼합물이다; 이의 서열은 표 2에 나타내었고, 여기에서 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다. 인터뉴클레오시드(백본) 결합은 표 2의 올리고뉴클레오티드를 통한 포스포로티오에이트이다. 변형되지 않은 시토신은 뉴클레오티드 서열에서 "UC"로 나타내어진다; 모든 다른 시토신은 5-메틸시토신이다.
표 2
세포주 테스트, 올리고머 화합물 스크리닝 및 표현형 분석을 위한 대조 올리고뉴클레오티드
ISIS # 표적 명칭 표적의 종 서열(5' 에서3 ') 모티브 서열 번호
113131 CD86 인간
Figure 112008027611953-PCT00002
 5-10-5 4
289865 forkhead box 01A (횡문근육종) 인간
Figure 112008027611953-PCT00003
 5-10-5 5
25237 인테그린 베타 3 인간
Figure 112008027611953-PCT00004
 4-10-4 6
196103 인테그린 베타 3 인간
Figure 112008027611953-PCT00005
 5-10-5 7
148715 Jagged 2 인간; 마우스; 랫트
Figure 112008027611953-PCT00006
 5-10-5 8
18076 Jun N-말단 키나아제-1 인간
Figure 112008027611953-PCT00007
 5-9-6 9
18078 Jun N-말단 키나아제-2 인간
Figure 112008027611953-PCT00008
 5-9-6 10
183881 키네신 유사-1 인간
Figure 112008027611953-PCT00009
 5-10-5 11
29848 없음 없음
Figure 112008027611953-PCT00010
 5-10-5 12
226844 Notch(초파리) 유사체 1 인간; 마우스
Figure 112008027611953-PCT00011
 5-10-5 13
105990 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 감마 인간
Figure 112008027611953-PCT00012
 5-10-5 14
336806 Raf 키나아제 C 인간
Figure 112008027611953-PCT00013
 5-10-5 15
15770 Raf 키나아제 C 인간; 뮤린; 사크로마 바이러스; 랫트
Figure 112008027611953-PCT00014
 5-10-5 16
사용된 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주에 따라 다양하다. 특정한 세포주에 대하여 최상의 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하기 위하여, 세포를 농도의 범위에서 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 파지티브 대조군을 표 2에 나타내었다. 예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 세포의 경우, 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드는 ISIS 336806 또는 ISIS 18078에서 선택될 수 있다. 마우스 또는 랫트 세포의 경우, 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드는 ISIS 15770일 수 있다. 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드의 농도는 표적 mRNA, 예를 들어, ISIS 15770에 대한 랫트 키나아제 C의 80% 감소를 유도하였고, 이어서 그 세포주에 대한 연속적인 실험에서 새로운 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝 농도로 사용되었다. 80% 감소되지 않았다면, 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드의 가장 낮은 농도는 표적 mRNA의 60% 감소를 유도하였고, 이어서 그 세포주에 대한 연속적인 실험에서 올리고뉴클레오티드 스크리닝 농도로 사용되었다. 60%의 감소가 일어나지 않았다면, 특정한 세포주는 올리고뉴클레오티드 트랜스펙션 실험에 적절하지 않은 것으로 간주하였다. 본원에서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 리포좀 시약을 이용하여 트랜스펙션될 경우에는 50 nM 내지 300 nM이고 안티센스 올리고뉴클레오티드가 일렉트로포레이션으로 트랜스펙션 될 경우에는 1 μM 내지 40 μM이다.
실시예 2
GCCR mRNA 수준의 Real - time 정량 PCR 분석
GCCR mRNA 수준의 Real-time 정량 PCR 분석은 제조자의 지시에 따라 ABI PRISM™ 7600, 7700, 또는 7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 real-time 정량 PCR로 수행하였다.
RT, real-time PCR으로 수득된 유전자 표적 정량은 유전자 발현이 고정적인 GAPDH의 발현 수준을 이용하여 표준화하거나, RiboGreen™(Molecular 프로브, Inc. Eugene, OR)을 이용하여 총 RNA를 정량함으로써 표준화하였다. 총 RNA는 RiboGreen™ RNA 정량 시약(Molecular 프로브, Inc. Eugene, OR)를 이용하여 정량하였다. 170 ㎕의 RiboGreen™ 워킹 시약(1O mM Tris-HC1, 1 mM EDTA, pH 7.5로 1:350 희석된 RiboGreen™ 시약)를 정제된 세포 RNA 30 ㎕를 포함하는 96-웰 플레이트로 피펫팅하였다. 플레이트를 485 nm의 여기 및 530 nm의 방출을 갖는 CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)에서 읽었다.
GAPDH 발현을 표적의 정량과 동시에 또는 개별적으로, RT, real-time PCR로 정량하였다. 표적 수준의 측정과 동시에 특정하기 위하여, 측정하기 위한 표적 유전자에 특이적인 프라이머-프로브 세트를 정량적 PCR 분석에 앞서 GAPDH 증폭 반응으로 "멀티플렉스"에 대한 이들의 능력에 대하여 평가하였다. 멀티플렉스는 다양한 DNA 종의 검출을 의미하고, 단일 튜브의 표적 및 내생적인 GAPDH 대조의 경우에, GAPDH에 대한 프라이머-프로브 세트는 표적의 증폭을 방해하지 않는 것이 요구된다.
real-time PCR에 사용하기 위한 프로브 및 프라이머는 표적-특정 서열에 대하여 혼성화하기 위하여 디자인하였다. 프라이머 및 프로브 디자인의 방법은 당업계에 공지되어 있다. real-time PCR에서 사용하기 위한 프라이머 및 프로브 디자인은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어, 예를 들어, Primer Express®(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 수행할 수 있다. 그들이 혼성화하는 표적 핵산 서열 및 프라이머 및 프로브를 표 4에 나타내었다. 표적-특이 PCR 프로브는 5' 말단에 공유결합된 FAM 및 3' 말단에 공유결합된 TAMRA 또는 MGB를 가지고, 여기에서 FAM은 형광성 염료이며 TAMRA 또는 MGB는 형광 소멸(quencher) 염료이다.
분리 후, RNA를 순차적으로 역전사효소(RT) 반응 및 real-time PCR에 적용하였으며, 둘 모두 같은 웰에서 수행하였다. RT 및 PCR 시약은 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. RT, real-time PCR은 20 ㎕ PCR 칵테일(MgCl2 없는 2.5 x PCR 버퍼, 6.6 mM MgCl2, dATP, dCTP, dCTP 및 dGTP 각각 375 μM, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 각각 375 nM, 프로브 125 nM, 4 유닛의 RNAse 억제제, 1.25 유닛의 PLATINUM® Taq, 5 유닛의 MuLV 역전사효소 및 2.5 x ROX 염료)을, 총 RNA 용액 30 ㎕(20-200 ng)를 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가하는 같은 방법으로 수행하였다. RT 반응은 48℃에서 30분 동안 배양함으로써 수행하였다. 이어서 PLATINUM® Taq을 활성화 시키기 위하여 95℃에서 10분 배양 한 후 두 단계의 PCR 프로토콜의 40 사이클을 수행하였다: 95℃에서 15초(변성) 후 60℃에서 1.5분(어닐링/연장).
본 발명의 화합물은 본원의 다른 실시예에서 상술한 바와 같이, 인간 GCCR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하는, 정량 real-time PCR로 인간 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00015
(본원에서 서열 번호 17로 나타내어짐)
역방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00016
(본원에서 서열 번호 18로 나타내어짐)
및 PCR 프로브:
Figure 112008027611953-PCT00017
(본원에서 서열 번호 19로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 MGB는 비-형광성 형광 소멸 염료이다.
본 발명의 화합물은 본원의 다른 실시예에서 기재한 바와 같이, 랫트 GCCR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하는, 정량 real-time PCR로 랫트 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00018
(본원에서 서열 번호 20로 나타내어짐)
역방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00019
(본원에서 서열 번호 21로 나타내어짐)
및 PCR 프로브:
Figure 112008027611953-PCT00020
(본원에서 서열 번호 22로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 형광 소멸 염료이다.
본 발명의 화합물은 본원의 다른 실시예에서 기재한 바와 같이, 마우스 GCCR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하는, 정량 real-time PCR로 마우스 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00021
(본원에서 서열 번호 23로 나타내어짐)
역방향 프라이머:
Figure 112008027611953-PCT00022
(본원에서 서열 번호 24로 나타내어짐)
및 PCR 프로브:
Figure 112008027611953-PCT00023
(본원에서 서열 번호 25로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 형광 소멸 염료이다.
실시예 3
5-10-5 갭머에 의한 인간 GCCR 발현의 안티센스 억제
일련의 올리고머 화합물을 표 1에 나타낸 공지된 서열을 이용하여 인간 GCCR의 다른 영역을 표적화하도록 디자인하였다. 화합물을 표 3에 나타내었다. 표 3의 모든 화합물은 10개 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심 "갭" 영역으로 구성된 20 뉴클레오티드 길이인 키메라 올리고뉴클레오티드("갭머")이며, 이는 5-뉴클레오티드 "윙"에 의해 양 측면(5' 및 3')에 프랭킹된다. 윙은 2'-MOE 뉴클레오티드로도 공지된 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴클레오시드(백본) 사이 결합은 올리고뉴클레오티드를 통한 포스포로티오에이트이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다. 표 3에 나타낸 것은 올리고뉴클레오티드의 서열 및 화합물이 결합하는 표적 서열상 첫번째 위치 (가장 5')인 표적 부위이다. 화합물은 본원의 다른 실시예에서 기재한 바와 같이, 인간 GCCR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하는, 정량 real-time PCR로 유전자 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 분석하였다.
데이터는 LIPOFECTINTM을 이용하여 HepG2 세포를 50nM의 개시된 올리고머 화합물로 처리한 세 실험의 평균이다. 발현의 감소는 표 3에서 퍼센트 억제로 표시하였다. 존재한다면, "N.D"는 "결정되지 않음"을 의미한다. 올리고머 화합물이 억제하는 표적 영역은 "입증된 표적 구획"으로 본원에 언급된다.
Figure 112008027611953-PCT00024
Figure 112008027611953-PCT00025
Figure 112008027611953-PCT00026
적어도 30%까지 GCCR 발현이 감소되는 표 3에 나타낸 5-10-5 갭머 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 이들 바람직한 서열이 상보적인 표적 구획은 본원에서 "바람직한 표적 구획"으로 언급되며, 본 발명의 화합물에 의한 표적화에 바람직하다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 또는 113의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 GCCR에 표적화된 안티센스 화합물이며, 여기서 상기 화합물은 GCCR에 특이적으로 혼성화하며, 이의 발현을 감소시킨다. 일 구체예에서, 안티센스 화합물은 그 5' 및 3' 말단에 5개 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 일 구체예에서, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다.
실시예 4
확장된 갭 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 GCCR 발현의 안티센스 억제
본 발명에 따르면, 표 4에 기재된 화합물과 동일한 서열을 갖는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드도 테스트하였다. 표 4에서 모든 화합물은 16개 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 20 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드("갭머")이며, 이는 두-뉴클레오티드 "윙"에 의해 양 측면(5' 및 3')에서 프랭킹된다. 윙은 2'-MOE 뉴클레오티드로도 공지된 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 구성된다. 뉴클레오시드(백본) 사이 결합은 올리고뉴클레오티드를 통한 포스포로티오에이트이다. 모든 시티딘 잔기는 5-메틸시티딘이다. 표 4에 나타낸 것은 올리고뉴클레오티드의 서열 및 화합물이 결합하는 표적 서열상 첫번째 위치 (가장 5')인 표적 부위이다. 2-16-2 모티브 화합물을 본원에 개시된 정량 real-time PCR로 유전자 표적 mRNA 수준 상에서 그들의 효과에 대하여 분석하였다.
데이터는 LIPOFECTINTM을 이용하여 HepG2 세포를 50nM의 개시된 올리고머 화합물로 처리한 세 실험의 평균이다. 발현의 감소는 표 3에서 퍼센트 억제로 표시하였다. 존재한다면, "N.D"는 "결정되지 않음"을 의미한다. 올리고머 화합물이 억제하는 표적 영역은 본원에서 "입증된 표적 구획"으로 언급된다.
Figure 112008027611953-PCT00027
Figure 112008027611953-PCT00028
Figure 112008027611953-PCT00029
적어도 30%까지 GCCR 발현이 감소되는 표 4에 나타낸 2-16-2 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 이들 바람직한 서열이 상보적인 표적 구획은 본원에서 "바람직한 표적 구획"으로 언급되며, 본 발명의 화합물에 의한 표적화에 바람직하다.
본 발명의 또다른 면은 서열 번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 또는 113의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 GCCR에 표적화된 안티센스 화합물이며, 여기서 상기 화합물은 GCCR에 특이적으로 혼성화하며, 이의 발현을 감소시킨다. 일 구체예에서, 안티센스 화합물은 그 5' 및 3' 말단에 2개 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 일 구체예에서, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다.
실시예 5
GCCR 을 표적화하는 교차-종 올리고뉴클레오티드
이전 실시예에 기재된 일부 올리고뉴클레오티드는 종에 대하여 상보적이며, 이에 따라 종을 교차하여 글루코코티코이드 수용체의 발현을 감소시키는 것으로 기대된다. 표 5에 나타낸 것은 그러한 교차-종 올리고뉴클레오티드의 서열 및 올리고뉴클레오티드의 5-10-5 모티브 버전 및 2-16-2 모티브 버전의 ISIS 번호이다. 각 서열에 대하여 화합물이 결합하는 인간 표적 서열(서열 번호 1로 본원에 인용된 NM_000176.1)상 첫번째 위치(가장 5')인 표적 부위를 또한 나타내었다. 인간, 사이노몰거스 원숭이, 랫트 및 마우스 GCCR mRNA에 대한 상보성을 나타내었다("있음"은 완전한 상보성을 의미하며, "1 mm"는 완전한 상보성에서 하나의 미스매치를 의미한다).
Figure 112008027611953-PCT00030
실시예 6
5-10-5 갭머로의 용량-반응 연구에서 인간 및 랫트 GCCR mRNA 수준의 안티센 스 억제
본 발명의 다른 구체예에서, 추가의 용량-반응 연구를 위하여 11개의 올리고뉴클레오티드를 선택하였다. 일차 랫트 간세포를 5, 10, 25, 50, 100 또는 200 nM 의 ISIS 180274, ISIS 180275, ISIS 180276, ISIS 180281, ISIS 180304, ISIS 361137, ISIS 361141, ISIS 361151, ISIS 361156, ISIS 345198, ISIS 361137 또는 네가티브 대조 올리고뉴클레오티드 ISIS 141923(본원에 서열 번호 114로 도입된 CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC)로 처리하고, 본원의 다른 실시예에서 개시된 바와 같이 mRNA 수준을 측정하였다. ISIS 141923는 2'-MOE 윙으로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 갭과 포스포로티오에이트 백본을 포함하는 5-10-5 갭머이다. 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 처리되지 않은 세포는 데이터를 표준화시키는 대조군으로 하였다.
이들 연구의 결과를 표 6에 나타내었다. 표적 mRNA 수준을 본원에 개시된 real-time PCR로 측정하였다. 데이터는 세 실험으로부터의 평균이며, 처리되지 않은 대조군에 대하여 퍼센트 억제로 나타내었다.
Figure 112008027611953-PCT00031
본 발명의 추가의 구체예에서, 동일한 올리고뉴클레오티드는 지시된 용량에서 GCCR mRNA 발현을 감소시키는 그의 능력에 대하여 인간 HepG2 세포주에서 테스트하였다. 처리하지 않은 세포는 데이터를 표준화할 대조군으로 하였다.
이들 연구의 결과를 표 7에 나타내었다. 표적 mRNA 수준을 본원에 개시된 real-time PCR로 측정하였다. 데이터는 세 실험으로부터의 평균이며, 처리되지 않은 대조군에 대하여 퍼센트 억제로 나타내었다.
Figure 112008027611953-PCT00032
표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, GCCR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 용량-의존적 방식으로 인간 및 랫트 표적 mRNA 수준을 줄이는 데 효율적이다.
실시예 7
5-10-5 갭머로의 생체내 용량-반응 연구에서 랫트 GCCR mRNA 수준의 안티센 스 억제
5개의 5-10-5 갭머 모티브 올리고뉴클레오티드 (ISIS 180281, ISIS 361137, ISIS 345198, ISIS 180304, 및 ISIS 361141)를 다양한 용량에서 간에서 GCCR mRNA 수준을 감소시키는 능력에 대하여 평가하였다. 8주령 Sprague Dawley 랫트를 주사를 통하여 지시된 올리고뉴클레오티드 50, 25 또는 12.5 mg/kg 중 하나의 용량을 받은 처리군으로 나누었다. 각 처리군은 네마리의 동물로 구성하였으며, 3주 동안 주마다 두번 투여하였다. 식염수만을 주사한 동물을 대조군으로 하였다. 표준 혈액 기준(ALT/AST, 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 글루코오스)에 대하여 동물을 주마다 평가하였다. 실험의 마지막에 동물을 희생시키고, 간 조직을 수집하고, 본원에 개시된 real-time PCR 분석법을 이용하여 표적 감소에 대하여 분석하였다. GCCR mRNA에서 퍼센트 감소로서 표 8a 및 8b에서 나타낸 결과(분리 실험)는 지시된 올리고뉴클레오티드의 지시된 용량으로 처리한 후 측정하였다.
Figure 112008027611953-PCT00033
표 8a 및 표 8b의 데이터는 GCCR에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 용량-의존적 방식으로 생체 내에서 발현을 감소시키는 데 유효하다는 것을 나타낸다. ISIS 345198 (GTCAAAGGTGCTTTGGTCTG; 서열 번호 37)을 갭 최적화에 중점을 둔 구조-활성 실험에서 다른 평가를 위하여 선택하였다. 이러한 화합물은 마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 토끼 및 기니아 피그 글루코코티코이드 수용체 RNA에 완전하게 상보적이다.
실시예 8
생체내 -갭 최적화 연구에서 GCCR mRNA 수준의 안티센스 억제
일련의 올리고머 화합물을 다양한 크기의 데옥시뉴클레오티드 갭 및 2'-MOE 윙을 지닌 표적 GCCR을 표적화하도록 디자인하였다. 시험된 각각의 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오염기 서열(GTCAAAGGTGCTTTGGTCTG, 본원에 서열 번호 37로 인용)을 가지며, 서열 번호 1(뉴클레오염기 689 내지 709)의 동일한 구획을 표적화한다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 이 올리고뉴클레오티드는 랫트 GCCR에 완전하게 상보적이다.
화합물을 표 9에 나타내었다. 분명한 글자는 데옥시뉴클레오티드를 나타내며, 뉴클레오염기는 굵게 표시하였고, 밑줄친 글자는 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드이다. 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트이며, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 표 9에 나타낸 것은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 다른 영역을 표시하는 각 화합물의 "모티브"이다.
Figure 112008027611953-PCT00034
9주령 Sprague Dawley 수컷 랫트를 표 9에 나타낸 50, 25, 12.5 및 6.25 mg/kg 용량의 올리고뉴클레오티드를 3주 동안 주마다 2회 처리하였다. 식염수만을 주입한 동물은 대조군으로 하였다. 각각의 처리군은 네 마리의 동물로 구성되며, 동물은 혈장 아미노전이효소, 지질, 글루코오스 수준 및 체중 증가에 대하여 주마다 모니터하였다. 정상 동물에서 기대된 바와 같이, 글루코오스에서 실질적인 변화가 관찰되지 않았다. 기준선(처리 시작 전) 혈장 콜레스테롤(CHOL) 및 트리글리세리드 (TRIG) 수준과 3주째에 측정된 수준을 각 처리군의 평균으로 표 10에 mg/dL로 나타내었다.
Figure 112008027611953-PCT00035
표 10에 나타낸 바와 같이, GCCR에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리는 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준에서 용량-의존적 감소를 유발한다. 이에 따라, 본 발명의 일 구체예는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 혈중 지질을 감소시키는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 37의 서열을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 ISIS 372339, ISIS 377130, 또는 ISIS 377131이다.
연구의 마지막에 동물을 희생시키고, 기관 중량을 측정하고, 표적 감소 및 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하기 위하여 조직을 수집하였다.
본원에 개시된 real-time PCR 분석법을 이용하여 표적 감소에 대하여 백색 지방 조직을 분석하였다. 지시된 올리고뉴클레오티드의 지시된 용량으로 처리한 후, 측정된 GCCR mRNA에서의 퍼센트 감소로서, 결과를 표 11a, 11b, 및 11c(분리 실험)에 나타내었다. 비교를 위하여 각 확장된 갭 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물의 조직을 5-10-5 모티브 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물에서의 조직에서 표적 감소에 대하여 분석하였다.
Figure 112008027611953-PCT00036
본원에 개시된 real-time PCR 분석법을 이용하여 표적 감소에 대하여 간 조직을 또한 분석하였다. 지시된 올리고뉴클레오티드의 지시된 용량으로 처리한 후 측정된 GCCR mRNA에서의 퍼센트 감소로서, 결과를 표 12a, 12b, 및 12c (분리 실험)에 나타내었다. 비교를 위하여 각 확장된 갭 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물의 조직을 5-10-5 모티브 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물에서의 조직에서 표적 감소에 대하여 분석하였다.
Figure 112008027611953-PCT00037
표 12a, 12b 및 12c에서 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 용량-의존적 방식으로 GCCR 수준을 감소시키는 데 유효하였다. 또한, 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 간에서 5-10-5 갭머보다 더 큰 효능을 갖는 경향을 보였다.
또한, 약동학에서 갭 크기 변경의 효과를 결정하기 위하여, 신장 및 간에서 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하였다. 조직에서 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법은 본 분야에 알려져 있다 (Geary et al., Anal Biochem, 1999, 274, 241 -248). 전체 올리고뉴클레오티드는 조직에서 검출된 모든 올리고뉴클레오티드 대사물의 합이다. 표 12에 나타낸 것은 지시된 올리고뉴클레오티드를 지시된 농도로 처리한 동물의 간에서 전장 올리고뉴클레오티드의 총 농도 및 농도(μg/g)이다.
Figure 112008027611953-PCT00038
표 13에 나타낸 바와 같이, 간에서 전장 올리고뉴클레오티드의 수준은 ISIS 345198와 비교하여 ISIS 372339 및 ISIS 377130에 대하여 비슷하거나 감소되었다. 표 11에 나타낸 바와 같은 표적 감소와 같이, 이들 데이터는 확장된 갭 화합물의 증가된 효능이 간에서 화합물의 축적 증가 때문이 아니라는 것을 보여준다. 이에 따라, 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 표적 조직에서 표적 화합물의 축적 증가 없이, 5-10-5 갭머에 상응하는 표적 감소와 비슷하거나 이보다 증가된 효능을 나타내는 확장된-갭 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 조직은 지방이며, 일부 구체예에서, 표적 조직은 간이다.
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Monia, Brett P. McKay, Robert Freier, Susan M. Bhanot, Sanjay Watts, Lynnetta <120> MODULATION OF GLUCOCORTICOID RECEPTOR EXPRESSION <130> BIOL0065WO <150> 60/718,685 <151> 2005-09-19 <160> 114 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 4788 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 tttttagaaa aaaaaaatat atttccctcc tgctccttct gcgttcacaa gctaagttgt 60 ttatctcggc tgcggcggga actgcggacg gtggcgggcg agcggctcct ctgccagagt 120 tgatattcac tgatggactc caaagaatca ttaactcctg gtagagaaga aaaccccagc 180 agtgtgcttg ctcaggagag gggagatgtg atggacttct ataaaaccct aagaggagga 240 gctactgtga aggtttctgc gtcttcaccc tcactggctg tcgcttctca atcagactcc 300 aagcagcgaa gacttttggt tgattttcca aaaggctcag taagcaatgc gcagcagcca 360 gatctgtcca aagcagtttc actctcaatg ggactgtata tgggagagac agaaacaaaa 420 gtgatgggaa atgacctggg attcccacag cagggccaaa tcagcctttc ctcgggggaa 480 acagacttaa agcttttgga agaaagcatt gcaaacctca ataggtcgac cagtgttcca 540 gagaacccca agagttcagc atccactgct gtgtctgctg cccccacaga gaaggagttt 600 ccaaaaactc actctgatgt atcttcagaa cagcaacatt tgaagggcca 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1500 tgtgctggaa ggaatgattg catcatcgat aaaattcgaa gaaaaaactg cccagcatgc 1560 cgctatcgaa aatgtcttca ggctggaatg aacctggaag ctcgaaaaac aaagaaaaaa 1620 ataaaaggaa ttcagcaggc cactacagga gtctcacaag aaacctctga aaatcctggt 1680 aacaaaacaa tagttcctgc aacgttacca caactcaccc ctaccctggt gtcactgttg 1740 gaggttattg aacctgaagt gttatatgca ggatatgata gctctgttcc agactcaact 1800 tggaggatca tgactacgct caacatgtta ggagggcggc aagtgattgc agcagtgaaa 1860 tgggcaaagg caataccagg tttcaggaac ttacacctgg atgaccaaat gaccctactg 1920 cagtactcct ggatgtttct tatggcattt gctctggggt ggagatcata tagacaatca 1980 agtgcaaacc tgctgtgttt tgctcctgat ctgattatta atgagcagag aatgactcta 2040 ccctgcatgt acgaccaatg taaacacatg ctgtatgttt cctctgagtt acacaggctt 2100 caggtatctt atgaagagta tctctgtatg aaaaccttac tgcttctctc ttcagttcct 2160 aaggacggtc tgaagagcca agagctattt gatgaaatta gaatgaccta catcaaagag 2220 ctaggaaaag ccattgtcaa gagggaagga aactccagcc agaactggca gcggttttat 2280 caactgacaa aactcttgga ttctatgcat gaagtggttg aaaatctcct taactattgc 2340 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catacagaca agcaagtgga aacctgctat gctttgctcc tgatctgatt 1920 attaatgagc agagaatgac tctaccctgc atgtatgacc aatgtaaaca catgctgttt 1980 atctccactg aattacaaag attgcaggta tcctatgaag agtatctctg tatgaaaacc 2040 ttactgcttc tctcctcagt tcctaaggaa ggtctgaaga gccaagagtt atttgatgag 2100 attcgaatga cttatatcaa agagctagga aaagccattg tcaaaaggga aggaaactcc 2160 agtcagaatt ggcagcggtt ttatcaactg acaaaacttt tggactccat gcatgatgtg 2220 gttgaaaatc tccttagcta ctgcttccaa acatttttgg ataagtccat gagtattgaa 2280 ttcccagaga tgttagctga aatcatcact aatcagatac caaaatactc aaatggaaat 2340 atcaaaaagc ttctgtttca tcagaaatga ctgccttact aagaaaggct gccttaaaga 2400 aagttgaatt tatagctttt actgtacaaa cttatcaact tgtcttgtag atgttttgtc 2460 gttctttttg tttgtcttgt ttgttttcta tacgcactac atgtggtctc tagagggcca 2520 agacttggca acagaagcag atgagccatc acttttcagt gacaggaaag cagac 2575 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 4 cgtgtgtctg tgctagtccc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 5 ggcaacgtga acaggtccaa 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 6 gcccattgct ggacatgc 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 7 agcccattgc tggacatgca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 8 ttgtcccagt cccaggcctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 9 ctttccgttg gacccctggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 10 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 11 atccaagtgc tactgtagta 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <220> <221> misc_feature <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 <223> n = A,T,C or G <400> 12 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 13 gccctccatg ctggcacagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 14 agcaaaagat caatccgtta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 15 tacagaaggc tgggccttga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 16 atgcattctg cccccaagga 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ttgacatttt gcaggatttg ga 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 ccaaggactc tcattcgtct cttt 24 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 19 tttcttctgg gtcccc 16 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 aaacaatagt tcctgcagca ttacc 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 catacaacac ctcgggttca atc 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 22 acccctacct tggtgtcact gct 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 gacatcttgc aggatttgga gtt 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 aacaggtctg acctccaagg act 23 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 25 cgggtcccca ggtaaagaga caaacga 27 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 26 tctgtctctc ccatatacag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 27 tgtttctgtc tctcccatat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 28 cttttgtttc tgtctctccc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 29 atcacttttg tttctgtctc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 30 gtttgcaatg ctttcttcca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 31 tgaggtttgc aatgctttct 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 32 ctattgaggt ttgcaatgct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 33 cgacctattg aggtttgcaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 34 ctggtcgacc tattgaggtt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 35 ctgtggtata caatttcaca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 36 ctttggtctg tggtatacaa 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 37 gtcaaaggtg ctttggtctg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 38 ggtttagtgt ccggtaaaat 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 39 ctttttctgt tttcacttgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 40 ttctcttgct taattacccc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 41 cagtttctct tgcttaatta 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 42 gcccagtttc tcttgcttaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 43 tttattacca attatatttg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 44 acattttatt accaattata 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 45 gcagacattt tattaccaat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 46 aatggcagac attttattac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 47 cagaaatggc agacatttta 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 48 tgaacagaaa tggcagacat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 49 ccatgaacag aaatggcaga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 50 cacaccatga acagaaatgg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 51 tactcacacc atgaacagaa 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 52 gaggtactca caccatgaac 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 53 tccagaggta ctcacaccat 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 54 gtcctccaga ggtactcaca 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 55 atctgtcctc cagaggtact 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 56 gtacatctgt cctccagagg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 57 agtggtacat ctgtcctcca 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 58 tcatagtggt acatctgtcc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 59 catgtcatag tggtacatct 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 60 tattcatgtc atagtggtac 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 61 gctgtattca tgtcatagtg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 62 ggatgctgta ttcatgtcat 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 63 aaagggatgc tgtattcatg 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 64 tgagaaaggg atgctgtatt 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 65 tggtggaatg acattaaaaa 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 66 gaattggtgg aatgacatta 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 67 gagcttacat ctggtctcat 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 68 aggagagctt acatctggtc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 69 atggaggaga gcttacatct 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 70 ctggatggag gagagcttac 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 71 gagctggatg gaggagagct 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 72 tgtccttcca ctgctctttt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 73 gtgctgtcct tccactgctc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 74 aattgtgctg tccttccact 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 75 aggtaattgt gctgtccttc 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 76 cggcatgctg ggcagttttt 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 77 atagcggcat gctgggcagt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 78 cgatagcggc atgctgggca 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 79 attccagcct gaagacattt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 80 gttcattcca gcctgaagac 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 81 ttctttgttt ttcgagcttc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 82 ttttttcttt gtttttcgag 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 83 caggaactat tgttttgtta 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 84 tgcaggaact attgttttgt 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 85 gagctatcat atcctgcata 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 86 aacagagcta tcatatcctg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 87 ctggaacaga gctatcatat 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 88 ttcactgctg caatcacttg 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 89 ccatttcact gctgcaatca 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 90 ttgcccattt cactgctgca 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 91 ataatcagat caggagcaaa 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 92 attaataatc agatcaggag 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 93 gctcattaat aatcagatca 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 94 ctctgctcat taataatcag 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 95 cattctctgc tcattaataa 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 96 agcatgtgtt tacattggtc 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 97 aaggttttca tacagagata 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 98 cagtaaggtt ttcatacaga 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 99 gaagcagtaa ggttttcata 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 100 gagagaagca gtaaggtttt 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 101 gcttttccta gctctttgat 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 102 atggcttttc ctagctcttt 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 103 atggtcttat ccaaaaatgt 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 104 actcatggtc ttatccaaaa 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 105 caatactcat ggtcttatcc 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 106 aattcaatac tcatggtctt 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 107 atgatttcag ctaacatctc 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 108 gtgatgattt cagctaacat 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 109 gaatattttg gtatctgatt 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 110 atttgaatat tttggtatct 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 111 ttccatttga atattttggt 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 112 atatttccat ttgaatattt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 113 tttttgatat ttccatttga 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 114 ccttccctga aggttcctcc 20

Claims (75)

  1. GCCR을 코딩하는 핵산 분자를 표적으로 하고 서열 번호 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63, 또는 96의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 4개 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단에서 프랭킹되는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 뉴클레오염기 길이의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하고 GCCR에 특이적으로 혼성화되어 그의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 5' 및 3' 말단에서 데옥시뉴클레오티드 영역을 프랭킹하는 뉴클레오티드의 수가 동일한 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서, 5' 및 3' 말단에서 데옥시뉴클레오티드 영역을 프랭킹하는 뉴클레오티드의 수가 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 1항에 있어서, 서열 번호 37의 뉴클레오염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 6항에 있어서, 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 7항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 7항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 6항에 있어서, 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  12. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  13. 제 6항에 있어서, 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  14. 제 13항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 13항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 6항에 있어서, 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 16항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  18. 제 16항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 제 6항에 있어서, 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  20. 제 19항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  21. 제 19항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  22. 제 1항에 있어서, 서열 번호 33의 뉴클레오염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  23. 제 22항에 있어서, 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말 단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  24. 제 23항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  25. 제 23항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  26. 제 22항에 있어서, 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  27. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  28. 제 26항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  29. 제 22항에 있어서, 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말 단 상에서 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  30. 제 29항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  31. 제 29항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  32. 제 22항에 있어서, 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  33. 제 32항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  34. 제 32항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  35. 제 22항에 있어서, 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  36. 제 35항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  37. 제 35항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  38. 제 1항에 있어서, 서열 번호 45의 뉴클레오염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  39. 제 38항에 있어서, 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  40. 제 39항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  41. 제 39항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  42. 제 38항에 있어서, 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  43. 제 42항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  44. 제 42항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  45. 제 38항에 있어서, 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  46. 제 45항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  47. 제 45항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  48. 제 38항에 있어서, 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  49. 제 48항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  50. 제 48항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  51. 제 38항에 있어서, 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  52. 제 51항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  53. 제 51항에 있어서, 적어도 하나의 시토신이 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  54. 제 1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 인핸서(enhancer) 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  55. 세포 또는 조직을 제 54항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 세포 또는 조직에서 글루코코티코이드 수용체의 발현을 감소시키는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 조직이 지방 또는 간 조직인 방법.
  57. 동물을 제 54항의 약제학적 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하여, 동물에서 글루코코티코이드 발현에 의해 매개되는 질환 또는 증상을 치료하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 질환 또는 증상이 당뇨병, 비만, 대사 증후군 X, 고혈당증 또는 고지혈증인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 57항에 있어서, 질환이 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 57항에 있어서, 질환이 혈중 콜레스테롤 수준 상승 또는 혈중 트리글리세 리드 수준 상승과 관련된 고지혈증인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 57항에 있어서, 증상이 간 지방증인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 지방간이 지방간염인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 61항에 있어서, 지방간이 비-알코올성 지방간염인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 혈당 수준을 감소시키는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 동물이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 64항에 있어서, 혈당 수준이 공복 혈당 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 혈중 지질 수준을 감소시키는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 혈중 지질 수준은 혈중 콜레스테롤 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 67항에 있어서, 혈중 지질 수준은 혈중 트리글리세리드 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 간 트리글리세리드 수준을 감소시키는 방법.
  71. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 체지방량을 감소시키는 방법.
  72. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 향상된 인슐린 민감성을 감소시키는 방법.
  73. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물의 간에서 당 산출을 억제하는 방법.
  74. 제 54항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 혈중 지질 또는 혈당 수준의 상승 개시를 지연시키거나 억제하는 방법.
  75. 부차적 치료 효과를 달성하기 위하여, PPAR-감마, 듀얼-PPAR 또는 팬-PPAR 작용제를 포함하는 PPAR 작용제, 디펩티딜 펩티다아제(IV) 억제제, GLP-1 유사체, 인슐린 및 인슐린 유사체, 인슐린 분비촉진제, SGLT2 억제제, 프람린타이드를 포함하는 인간 아밀린 유사체, 글루코키나아제 활성제, 비구아니드 및 알파-글루코시다아제 억제제를 포함하는 군에서 선택된 항당뇨제와 배합된 제 1항의 화합물을 동물에 투여하는 것을 포함하여, 대사 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법.
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