KR20080055852A - 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신억제제의 용도 - Google Patents

스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신억제제의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20080055852A
KR20080055852A KR1020087006597A KR20087006597A KR20080055852A KR 20080055852 A KR20080055852 A KR 20080055852A KR 1020087006597 A KR1020087006597 A KR 1020087006597A KR 20087006597 A KR20087006597 A KR 20087006597A KR 20080055852 A KR20080055852 A KR 20080055852A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
aureolysin
inhibitor
skin
staphylococcus aureus
compound
Prior art date
Application number
KR1020087006597A
Other languages
English (en)
Inventor
가이 티모시 래이톤
스티븐 루퍼트 챈들러
Original Assignee
세렌티스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0517685A external-priority patent/GB0517685D0/en
Priority claimed from GB0613954A external-priority patent/GB0613954D0/en
Application filed by 세렌티스 리미티드 filed Critical 세렌티스 리미티드
Publication of KR20080055852A publication Critical patent/KR20080055852A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/4035—Isoindoles, e.g. phthalimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4402—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof only substituted in position 2, e.g. pheniramine, bisacodyl
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/04—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids
    • C07C259/06—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups without replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group, e.g. hydroxamic acids having carbon atoms of hydroxamic groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Abstract

특히, 아우레오리신 억제제의 국소 투여를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
아토피성 피부염, 스타필로코커스 아우레우스, 아우레오리신

Description

스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신 억제제의 용도{USE OF AN AUREOLYSIN INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY SKIN CONDITIONS CHARACTERISED BY COLONISATION WITH STAPHYLOCOCCUS AUREUS}
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 콜로니화(colonisation)를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료에 관한 것이다.
종종 습진(eczema)이라 불리는 아토피성 피부염(atopic dermatitis, AD)은 소양증, 홍반, 건조한 피부 및 염증을 특징으로 하는 만성, 회귀 병태이다.
항원 자극에 대한 과잉의 T-세포 활성화와 아토피성 랑게르한스 세포에 의한 T-세포의 과다자극이 중요 원인으로 알려져 있지만, AD의 병인은 여전히 완벽하게 밝혀지지 않았다. IgE 생산 수치가 상기 질환의 심각성과 매우 관련이 있으며, 비록 알레르겐 특이적 IgE을 많은 환자에게서 발견할 수 있다 하더라도, 이러한 발견이 특이적 알레르겐에 대한 감작(sensitisation)을 나타내는 것인지는 분명하지 않다.
이 질병의 보급은 매우 광범위하지만, 일부 서부 지역에서는 어린이 중 20% 이상이 해당하는 것으로 추정되었다. AD는 종종 아토피성 질환(천식, 알레르기성 비염 및 AD)의 가족력을 가진 가족 내에서 발견된다.
항생제 뮤피로신(mupirocin)의 국소 적용은, 이 질병의 영구성에 박테리아가 관여되어 있을 것임을 제시하면서, 거의 관리되지 않은 AD 환자에게서 현저한 개선을 제공하여 왔다(Lever, R et al Br . J. Dermatol . 119: 189-198, 1988).
스타필로코커스 아우레우스는 정상인의 단지 5%에서만 존재하는 반면, AD 환자의 90% 이상에서 피부 병변을 콜로니화하는 것으로 밝혀져 있다(Leyden, JE, Marples, RP and Kligman AM Br . J. Dermatol . 90:525-530, 1974). 상기 박테리아는 독소(예를 들면, 엔테로톡신 A, B, C 및 D; 독성 쇼크 증후군 독소)를 방출하는 것을 통해 AD의 악화와 만성화에 유력한 것으로 보여지며, 독소의 대부분이 자연계에서 고 항원성이어서 피부에서의 염증 반응을 악화시킨다(Leung, DYM et al J. Clin. Invest . 92 1374-80, 1993). 어린이에 대한 한 특정 연구는, 질환의 심각성이 독소를 생성하는 균주에 의한 콜로니화와 관련이 있음을 보여주는 것으로서, 81%의 환자가 스타필로코커스 아우레우스 콜로니화를 가지고 있음(대조군은 4%)을 확인하였다(Bunikowski, R et al J. Allergy Clin Immunol. 105(4):814-819, 2000).
음식 알레르겐 또는 공기 알레르겐을 포함하는 환경적 인자의 역할을 나타내는 신체의 증거와, 스타필로코커스 아우레우스 콜로니화의 관여를 나타내는 문헌을 통합하는 연결점은, 생쥐를 엔테로톡신 B와 부가적인 염증 반응을 낳는 집먼지 진드기 항원 Der p에 노출시켜 확인하였다(Herz, U J. Invest. Dermat. 110(3): 224-231, 1999). 게다가, 스타필로코커스 아우레우스는 Th-2형 염증을 포함하는 피부 부위에 우월하게 결합하는 것으로 보여진다(Cho, S-H et al J. Invest. Dermat. 116(5): 658-663, 2001).
최근의 치료법들은 전형적으로 다수의 접근법 (i) 피부 보습 - 배칭(batching) 및 모이스쳐라이져를 사용하는 것을 포함 (ii) 스테로이드(글루코코르티코이드) 및 면역억제제(예를 들면, 시클로스포린 A, 타크롤리무스 및 피메크롤리무스)와 같은 면역반응을 감소시키거나 조절하는 약제의 사용 (iii) 자극원, 알레르겐, 정서적 스트레스 인자 및 감염체와 같은 기여 인자의 제거를 포함한다. 최근의 치료법들이 이 질병의 급성기를 효과적으로 다룰 수 있다 하더라도, 스테로이드와 면역억제제의 지속적인 사용에 의한 잠재적인 심각한 부작용으로 인해 그것의 장기간 사용에 대한 의문이 있다. 비록 항생제, 특히 국소 항생제의 일반적인 사용이 항생제 내성 박테리아 균주의 증가 위험으로 인해 일반적으로 거부되고 있지만, 경구 항생제는 종종 중복 감염의 치료를 위해 사용된다.
아우레오리신(EC 3.4.24.29)은 스타필로코커스 아우레우스에 의해 분비되는 메탈로프로테아제이다(Dubin, G. Biol . Chem . 383:1075-1086, 2002). 아우레오리신은 그 활성이 아연과 칼슘에 의존하는 설모리신(thermolysin) 단백질과의 일원으로, 낮은 기질 특이성을 가진다. 아우레오리신의 결정 구조는 1998년에 발표되었고, 301개 아미노산의 단일쇄로 이루어진 단백질이다(Banbula, A et al Structure 6(9): 1185-1193, 1998). 아우레오리신은 aur 유전자에 의해 인코딩되며, 이것의 유전자 분석은 상기 단백질이 매우 보존적이며, 따라서 박테리아의 라이프싸이클에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다(Sabat, A et al Infect . Immun . 68(2):973- 976, 2000). 우리는 아우레오리신의 억제제가 아토피성 피부염에 있어서 스타필로코커스 아우레우스의 병원성과 콜로니화 잠재력을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 이것은 아우레오리신-숙주 상호 작용을 교란시킴으로써 유기체의 발병력을 제한한다.
아우레오리신이 V8 프로테아제(분비된 세린 프로테아제)의 프로세싱에 관여하며, 생체 외에서 인간 프로테이나제 억제제 α1-안티키모트립신과 α1-프로테이나제 억제제를 불활성화시키는 것으로 보이지만, 그것의 정확한 기능은 분명하지 않다. 상당량의 아우레오리신을 생산하는 스타필로코커스 아우레우스 균주는 스타필로코시(Staphylococci)에 대해 강력한 활성을 가지는 인간 살균 펩티드, 카텔리시딘 LL-37에 거의 영향을 받지 않는다(Sieprawska-Lupa, M et al Antimicrob . Agents Chemother . 48(12):4673-4679, 2004). 그러나, 아직 항-미생물 펩티드의 단백질 가수분해는 생체 내 박테리아 내성에 대한 메커니즘으로서 입증되지 않았다(Brogden, KA Nature 3:238-250, 2005). 분비된 독소는 일반적으로 현저한 발병 인자로 알려져 있지만, 아우레오리신은 분명한 발병 인자로 여겨지지 않는다(Supuran, CT, Scozzafava, A and Clare, BW Med . Res . Rev . 22(4):329-372, 2002; Dubin, G Biol . Chem . 383:1075-1086, 2002).
AD 환자로부터 스타필로코커스 아우레우스 균주 범위의 단백질 가수 분해 활성의 조사로 이들 균주의 단백질 가수 분해 활성은 높은 단백질 가수 분해 활성을 나타냄을 확인하였고, 아우레오리신은 25~100%의 단백질 가수 분해 활성에 기여하 였다(Miedzobrodzki, J et al Eur . J. Clin . Microbiol Infect . Dis . 21:269-276, 2002).
WO 02/089730은 CD154 활성을 조절하는 화합물 및 방법을 개시하며, 그러한 방법은 내인성 인간 메탈로프로테아제에 의한 세포 표면으로부터의 CD154 동원(mobilisation)을 막기 위해 메탈로프로테아제 억제제를 투여하여 CD154의 방출을 감소시키는 것을 포함한다. 항-혈전요법으로서 그러한 접근법을 우선적으로 논의하면서 AD 치료를 제시하지만, 그 주장을 지지하는 증거는 없다. 게다가, 아우레오리신도, AD에서의 아우레오리신의 역할도 논의되고 있지 않다.
또한, WO 02/089730은 메탈로프로테아제의 억제를 개시하지만, 어느 것도 상세한 설명이나 실시예에 의해 정의되어 있지 않다. 정의된 억제제들은 매트릭스 메탈로프로테아제, MMP(Clan MA(M), M10과) 억제제로서 알려진 것들이며, 5개의 실시예들은 넓은 범위의 MMP 억제제 또는 MMP2/9 젤라티나제 억제제를 제시한다. 따라서, 그들은 MMPs가 CD154를 절단할 수 있음을 간접적으로 보여줄 뿐, 어떤 메탈로프로테아제가 CD154를 절단하는 지는 정의하고 있지 않다. 또한, 상세한 설명은 쉐다아제(sheddases, 메탈로프로테아제의 아다말리신 과, M12 과)에 대해 언급하고 있지만, CD154 쉐딩에 있어서의 그들의 역할에 대한 증거는 제공하지 않는다.
Grobelny et al(1992) Biochemistry 31, 7152-7154는 펩티드 히드록삼 산(peptide hydroxamic acids)에 의한 인간 피부 콜라게나제, 설모리신 및 슈도모나스 에어루기노섬(Pseudomonas aeruginosum) 엘라스타제의 억제를 논의한다.
MMPs는 암 및 염증성 질환에서 약물 표적(drug targets)으로서 오랜 기간 동 안 관심의 대상이었으므로 상당한 수의 MMPs가 본 분야에 알려져 있다. 메탈로프로테아제의 MMPs(M10) 및 아다말리신(M12) 과는 메트진신(metzincins, 아연 결합 모티브에 가까운 'metzincin' 겹침을 특징으로 함(Bode et al. FEBS Lett, 331, 134-40, 1993))이며, 아우레오리신(M4)이 그 일원인 글루진신(gluzincins, 아연 결합 도메인 내에 Glu 잔기의 존재를 특징으로 함)과 구분된다. 따라서 아우레오리신은 MMP로 분류되지 않는다. 또한, MMPs와 특히 아다말리신이 활성 분자(예를 들면, TNFalpha, Fas, CD30, CD40 등)를 방출하는 막 단백질을 절단할 수 있음은 오랫동안 알려져 있다.
요약하면, 본 분야는 AD의 악화에 있어서의 스타필로코커스 아우레우스의 역할을 인지하고 있지만, 제안되는 치료법들은 근원적인 질환과 스타필로코커스 아우레우스 콜로니화의 조합의 결과인 염증 반응을 제어하는 것 또는 직접적으로 스타필로코커스 아우레우스를 제어하는 것이다. 아우레오리신과 같은 분비된 단백질의 억제는 본 분야에서 파악되어 있지 않다. 또한, 본 분야는 AD의 치료에 있어서 일부 메탈로프로테아제의 억제에 대한 역할을 인지하고 있지만, 내인성 매트릭스 메탈로프로테아제와 아다말리신의 억제에 관한 내용만 있고, 콜로니화 박테리아로부터의 외인성 메탈로프로테아제에 대해서는 그렇지 않다.
스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는, AD와 같은 염증성 피부 병태를 치료하는 새로운 방법에 대한 분명한 요구가 있다. 게다가, 종래의 항박테리아 치료법에 대한 내성의 증가에 대해 잘 알려진 이슈들에 비추어, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치 료를 위한 새로운 방법은 신규의 작용 메커니즘을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류의 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 아우레오리신 억제제를 국소 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 두 번째 관점에서는, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류의 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방을 위한 국소 약제의 제조에 있어서의 아우레오리신 억제제의 용도가 제공된다.
또한, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료에 사용하기 위한, 아우레오리신 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 국소 약제학적 조성물이 제공된다.
상기 방법과 용도 및 조성물은 수의학 분야에 유용할 것으로 기대된다(즉, 여기서 상기 포유류는 애완용 또는 가축, 예를 들면 고양이, 개, 말, 돼지 등임). 그러나, 주로 기대되는 용도 또는 방법은 약제학 분야이다(즉, 여기서 상기 포유류는 인간임).
본 발명의 방법, 용도 및 조성물의 장점은 그 치료가 아우레오리신을 표적으로 하는 한, 박테리아의 생존을 위해 명백하게 중요하지 않은 분비된 단백질을 표적으로 하기 때문에, 종래 항생제의 사용을 포함하는 접근법에 관련된 박테리아의 내성 돌연변이의 생성을 야기할 수 있는 선택압을 훨씬 덜 발생시킨다는 것이다. 또한, 외인성 단백질(즉, 포유류 내에 존재하지 않는 단백질)을 표적으로 하기 때문에, 부작용(즉, 억제제 그 자체보다 억제 메커니즘으로부터 야기되는 부작용)에 관련된 메커니즘을 야기하지 않을 것으로 기대할 수 있다.
용어 '스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증 병태'란, 대개의 경우 피부가 스타필로코커스 아우레우스에 의해 콜로니화되고, 콜로니화 또는 피부 감염의 증가가 근원적인 병태의 악화 및 염증 반응의 증가를 야기하는, 아토피성 피부염과 같은 병태를 의미한다.
더 심한 염증 병태가 바늘피부증모양홍색피부증(ichthyosiform erythroderma), 아토피(아토피성 피부염 및 매우 높은 IgE 수치) 및 함입성 열모증(trichorrhexis invaginata)을 특징으로 하는 심각한 상염색체 열성 피부 질병인 네덜톤 증후군(Netherton's syndrome)이다.
용어 '아토피성 피부염' 또는 'AD'는, 증가된 혈청 IgE 및 호산구 수치와 관련된 심한 소양증 및 피부 과민성을 특징으로 하는 만성 회귀 염증성 피부 질환을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 용도는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
아우레오리신 억제제는 아우레오리신의 단백질 가수 분해 활성을 억제할 수 있는 어떤 메탈로프로테아제 억제제일 수 있다. 상기 억제제는 바람직하게는 대립 유전자 타입 II를 억제할 것이고, 보다 바람직하게는 모든 대립 유전자 형태, 타입 I 과 타입 II 아우레오리신을 억제할 것이며, 타입 II가 피부 질환에 유력한 것이다(Sabat A, Infect. Immun. 68, 973-6, 2000). 상기 억제제는 내인성 메트진신 메탈로프로테아제; 예를 들면 MMPs(M10)(예를 들면, MMPs 1,2,8,9) 및/또는 아다말리신(M12)을 직접적으로 억제할 수도 그렇지 않을 수도 있다. 아우레오리신 대립 유전자 타입 I과 II는 여기서 각각 "아우레오리신 I" 및 "아우레오리신 II"라 칭한다.
제시된 물질이 아우레오리신을 억제하는 능력은 이하의 실시예에 나타낸 "아우레오리신 효소 억제 에세이"를 사용하여 결정할 수 있다.
우리가 말하는 '아우레오리신의 억제' 또는 '아우레오리신 억제제'는 아우레오리신 효소 에세이(예를 들면, 아우레오리신 II 효소 에세이)에서 50 마이크로몰랄 미만, 바람직하게는 5 마이크로몰랄 미만, 특히 0.5 마이크로몰랄 미만의 IC50 수치를 나타낸다.
우리가 말하는 '내인성 메트진신 메탈로프로테아제의 억제' 또는 '내인성 메트진신 메탈로프로테아제 억제제'는 대응하는 내인성 메트진신 메탈로프로테아제 에세이에서 50 마이크로몰랄 미만, 바람직하게는 5 마이크로몰랄 미만, 특히 0.5 마이크로몰랄 미만의 IC50 수치를 나타낸다.
이와 같이, 본 발명의 한 구현예에서, 아우레오리신 억제제는 내인성 메트진신 메탈로프로테아제, 예를 들면 MMP-9를 현저하게 억제하지 않는다. '현저하게 억제하지 않는다'란, 내인성 메트진신 메탈로프로테아제(예를 들면, MMP-9)에 대한 억제제의 억제 강도(예를 들면, IC50으로 측정된)가 아우레오리신(예를 들면, 아우레오리신 II)에 대한 억제제의 억제 강도에 비해 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 예를 들면, 적어도 50배 약하다는 것을 의미한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 아우레오리신 억제제는 내인성 메트진신 메탈로프로테아제(예를 들면, MMP-9)를 현저하게 억제한다. '현저하게 억제한다'란, 내인성 메트진신 메탈로프로테아제(예를 들면, MMP-9)에 대한 억제제의 억제 강도(예를 들면, IC50으로 측정된 것)가 아우레오리신(예를 들면, 아우레오리신 II)에 대한 억제제의 억제 강도의 적어도 0.5배, 예를 들면 적어도 1배임을 의미한다. 내인성 메트진신 메탈로프로테아제(예를 들면, MMP-9)에 대한 억제제의 억제 강도(예를 들면, IC50으로 측정된 것)는 아우레오리신(예를 들면, 아우레오리신 II)에 대한 억제제의 억제 강도의 예를 들면, 적어도 10배, 아마도 100배 또는 1000배 이상일 수 있다.
내인성 MMPs로 알려진 일예가 Hande et al(2004) Clinical Cancer Research 10, 909-915에 논의되어 있다. 여기에는 MMP-2(젤라티나제 A), MMP-9(젤라티나제 B), MMP-14(MT-MMP-1, 막 결합 효소), MMP-1(콜라게나제-1), MMP-3(스트로멜리신-1), MMP-7(매트릴리신), MMP-11(스트로멜리신-3), 및 MMP-13(콜라게나제-3)이 포함된다. 또 다른 일예가 MMP-8(콜라게나제-2)이다. 아다말리신의 일예에는 ADAM10, ADAM17 및 ADAM33이 포함된다. 상기에서 지적한 바와 같이, 이들 효소의 대다수는 이미 암 및 염증과 관련이 있었고, ADAM33은 천식과 유전적으로 관련되어 있다.
아우레오리신 억제제는 또한 피부에서의 다른 조직 손상 프로테아제를 간접적으로 억제할 수 있다. 프로테아제들은 종종 활성화되기 위해서는 단백질 가수 분해 절단이 요구되는 불활성 자이모겐으로 발현된다. 실제로, 아우레오리신 그 자체는 스타필로코커스 아우레우스에 의해 분비되는 세포외 프로테아제의 활성화를 개시하는 역할을 하는 것으로 여겨진다(Shaw et al. Microbiology, 150, 217-28, 2004). 따라서, 아우레오리신은 또한 피부에 존재하는 내인성 숙주 프로테아제를 활성화시켜 AD와 같은 질환을 악화시키는 것으로 여겨진다. 예를 들면, M4과의 3개의 다른 일원들(슈도모나스 에어루기노사 엘라스타제, 비브리오 콜레라 프로테이나제, 및 설모리신)이 인간 MMPs를 활성화시킬 수 있다는 것이 알려져 있다(Okamoto et al. J. Biol. Chem. 272, 6059-66, 1997). 아우레오리신과 밀접하게 관련된 효소, 바실롤리신(bacillolysin)은 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 프로-우로키나제를 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Narasaki et al. J Biol. Chem. 280, 14278-87, 2005). 이 참고문헌은 또한 바실롤리신이 플라스미노겐을 플라스민으로 보다 더 전환되기 쉬운 미니-플라스미노겐-유사 분자로 전환시킴을 개시한다. 우리의 데이터는 아우레오리신이 프로-우로키나제를 활성화하며, 아우레오리신의 억제는 이 활성화를 막을 수 있음을 보여준다. 프로-우로키나제의 활성화는 프로-염증성 플라스민의 생성을 야기하는 플라스미노겐 경로의 활성화를 유도한다. 우리는 또한 아우레오리신이 프로-MMP-1을 활성화하며, 아우레오리신의 억제는 이 활성화를 막을 수 있음을 보여준다. MMP-1의 활성화는 정상 피부 장벽을 교란시켜 피부 콜라겐의 분해를 증가시킨다.
아우레오리신 억제제는 예를 들면 설모리신 억제제들, 예를 들면 공지된 설모리신 억제제들; 예를 들면 여기에서 참조로서 그 전체가 병합된 Marcotte et al., J. Enzyme Inhibition 14, 425-435, 1999(특히 표 1 참고)에 개시된 것과 같은 비환식 숙시닐 히드록사메이트들로부터 선택될 수 있다.
제시된 아우레오리신 억제제가 기타 효소, 예를 들면 MMPs를 억제하는 능력은, 또한 정제된 효소를 채용한 표준 에세이에 의해서도 결정할 수 있다.
아우레오리신 억제제에는, 하기 화합물: 일로마스타트(ilomastat, 화합물 1; US 5,183,900 참조), 마리마스타트(marimastat, 화합물 3; WO 94/02447 참조), 화합물 5(WO 95/19957 참조), 솔리마스타트(solimastat, 화합물 7; EP 1030842 참조), 화합물 9(WO 95/19956 참조), 화합물 11(Ro 31-9790, EP 0664284 및 Whittaker et al, Chemical Reviews, 99, 2735-2776, 1999 참조) 및 그들의 부분 입체 이성질체(화합물 2, 화합물 4, 화합물 6, 화합물 8, 화합물 10 및 화합물 12), 화합물 13(Calbiochem) 및 그의 입체 이성질체, 화합물 14(Calbiochem) 및 포스포라미돈(phosphoramidon, 화합물 15)(이하 표 1 참조)이 포함되거나, 또는 포함될 것으로 기대된다. 그 외의 일예에는 화합물 16과 17이 포함된다.
Figure 112008019626747-PCT00001
Figure 112008019626747-PCT00002
Figure 112008019626747-PCT00003
화합물 11, 12, 16 및 17은 신규하며, 본 발명의 한 관점으로서 그 자체와 함께 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물이 청구된다. 상기 화합물들은 모든 다형 형상을 포함하는, 비결정질 또는 결정질 형상의 고체로 청구된다. 결정질 형상은 적절한 용매로부터 화합물의 재결정화에 의해 제조될 수 있다. 비결정질 형상은 예를 들면, 화합물 용액을 스프레이 건조하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이들 화합물들은, 예를 들면, 실시예에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다.
실시예에 포함된 데이터들로부터 알 수 있는 바와 같이, 화합물 12는 MMPs(특히 MMPs 1, 2, 8 및 9)에 대해서뿐만 아니라 아우레오리신에 대해서도 매우 균형잡힌 억제를 가져 특히 흥미롭다. 이는 아우레오리신을 억제할 수치로 투여했을 때, 그 외 MMPs에 대한 효과도 유사할 것으로 기대할 수 있음을 의미한다. 이는 현저한 M10 억제 활성을 가지는 많은 화합물(예를 들면, 화합물 3, 7 & 11)에 공통적인 건염, 전신 독성 효과의 감소면에서 장점을 제공할 것으로 기대된다.
실시예에 포함된 데이터들로부터 또한 알 수 있는 바와 같이, 화합물 16은 매우 강력한 아우레오리신 억제 활성을 가지기 때문에 특히 흥미롭다. 실제로 이것은 테스트한 다른 화합물들 중 어느 것 보다 아우레오리신 억제제로서 매우 강력한 것이었다.
이들 신규 화합물 그 자체를 청구할 뿐만 아니라, 우리는 또한 그들의 제조를 위한 공정, 약제학적 그들의 용도, 약제학적으로 허용가능한(특히, 국소적으로 허용가능한) 희석제 또는 담체와 함께 그들을 함유하는 약제학적 조성물, 그리고 그들을 채용한 염증성 피부 질환의 치료 방법 및 염증성 피부 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 그들의 용도를 청구한다.
상기 억제제는 국소 투여를 위해 포뮬레이션되는 것이 바람직하고, 그것은 치료될 영역의 m2 당 0.00001 내지 10g, 바람직하게는 0.0001 내지 1g의 활성 성분이 전달되도록 환자에 투여될 수 있다.
전형적으로, 억제제의 총량은 포뮬레이션의 총 중량을 기준으로, 0.001 내지 12중량%, 예를 들면 0.0018 내지 11.6중량%, 적합하게는 0.0088 내지 1.4중량%, 예를 들면 0.01 내지 1.0중량%, 보다 적합하게는 0.05 내지 0.2중량%, 예를 들면, 약 0.1중량%이다.
상기 국소 포뮬레이션은, 예를 들면 젤, 연고, 크림 또는 로션의 형태일 수 있다. 그 밖에 제시되는 것에는 함침 붕대, 페이스트, 살포 파우더, 스프레이, 오일, 경피흡수 제형 등이 포함된다.
상기 국소 포뮬레이션은 바람직하게 표면 노출을 최대화할 것이고, 활성 성분(들)에 대한 전신 노출은 최소화할 것이다.
상기 포뮬레이션이 젤일 경우, 그것은 전형적으로 교차-연결된 폴리에틸렌 글리콜, 교차-연결된 녹말 또는 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 폴리머를 포함한다.
연고, 크림 또는 로션은 전형적으로 수성 상과 유성 상 혼합물을 함유한다. 그들은 일반적으로 수-중-유적 에멀젼 또는 오일-중-수적 에멀젼으로 특징지어질 수 있다.
상기 포뮬레이션은, 특히 그것이 크림 또는 연고일 때, 부가적으로 하나 이상의 완화제, 유화제, 증점제 및/또는 방부제를 함유할 수 있다.
크림 또는 연고에 함유되기 적합한 완화제는 전형적으로 긴 사슬 알코올, 예를 들면 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 및 세트아릴 알코올과 같은 C8-C22 알코올, 페트롤라툼과 같은 탄화수소, 및 경화 미네랄 오일 또는 아세틸화 라놀린이다. 상기 포뮬레이션 중의 완화제의 총량은 상기 포뮬레이션의 총 중량을 기준으로 약 5중량% 내지 약 30중량%가 바람직하고, 약 5중량% 내지 약 10중량%가 보다 바람직하다.
상기 유화제는 전형적으로 비이온성 표면 활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 60(ICI Americas에서 시판), 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리글리세릴-4 올레이트 및 폴리옥시에틸렌(4)라우릴 에테르이다. 일반적으로 상기 유화제의 총량은 상기 포뮬레이션의 총 중량을 기준으로 약 2중량% 내지 약 14중량%이고, 약 2중량% 내지 약 6중량%인 것이 보다 바람직하다.
Veegum.TM.K(R. T. Vanderbilt Company, Inc.에서 시판) 및 긴 사슬 알코올(즉, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 및 세트아릴 알코올과 같은 C8-C22 알코올)과 같은 약제학적으로 허용가능한 증점제가 사용될 수 있다. 존재하는 증점제의 총량은 상기 포뮬레이션의 총 중량을 기준으로 약 3중량% 내지 약 12중량%인 것이 바람직하다.
메틸파라벤, 프로필파라벤 및 벤질 알코올과 같은 방부제가 상기 포뮬레이션 중에 존재할 수 있다. 그 밖의 방부제로는 페녹시에탄올 및 클로로크레졸이 있다. 그러한 방부제(들)의 적절한 양은 당업자에게 알려져 있다.
선택적으로, 벤질 알코올, 락트산, 아세트산, 스테아르산 또는 히드로클로르산과 같은 부가적인 가용화제가 상기 포뮬레이션 중에 포함될 수 있다. 부가적인 가용화제를 사용할 경우, 그 존재량은 상기 포뮬레이션의 총 중량을 기준으로 약 1중량% 내지 약 12중량%인 것이 바람직하다.
선택적으로, 상기 포뮬레이션은 글리세린과 같은 습윤제 및 부틸 스테아레이트, 우레아 및 DMSO와 같은 피부 흡수 촉진제를 함유할 수 있다.
당업자에게는 단일 성분이 크림 중에서 한 가지 이상의 기능을 수행할 수 있다, 즉, 세틸 알코올이 완화제 및 증점제 모두로 작용할 수 있다는 것이 알려져 있다.
바람직하게, 상기 포뮬레이션 또는 약제는 크림이다. 크림은 전형적으로 에멀젼을 형성하도록 오일 상과 수 상이 서로 혼합되어 이루어진다. 바람직하게는, 상기 크림은 수-중-유적 에멀젼을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 크림 중에 존재하는 물의 양은 크림의 총 중량을 기준으로 약 45중량% 내지 약 85중량%이다.
상기 포뮬레이션 또는 약제가 연고인 경우, 그것은 전형적으로 페트롤라텀, 또는 폴리에틸렌 글리콜 3350(Union Carbide에서 시판)과 조합된 폴리에틸렌 글리콜 400(Union Carbide에서 시판)과 같은 약제학적으로 허용가능한 연고 베이스를 포함한다. 본 발명의 연고 중에 존재하는 연고 베이스의 양은 연고의 총 중량을 기준으로 약 60중량% 내지 약 95중량%인 것이 바람직하다.
한 가지 일예가 되는 포뮬레이션은, 백색 바세린(white soft paraffin), 에멀젼화 왁스, 및 100% 정제수로 제조된 유동 파라핀을 포함하고, 방부제(예를 들면, 페녹시에탄올)를 함유하는 에멀젼화 연고(예를 들면 약 30중량%)를 포함하는 크림이다. 이 포뮬레이션은 또한 요구되는 pH로 완충될 수 있다(시트르산 및 소듐 포스페이트에 의해). 활성 성분의 농도는 전형적으로 0.01 내지 1.0중량%일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 포뮬레이션은 이소스테아르산, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 백색 페트롤라텀, 폴리소르베이트 60, 소르비톤 모노스테아레이트, 글리세린, 산탄 검(xanthum gum), 정제수, 벤질 알코올, 메틸파라반 및 프로필-파라반을 포함하는 수-중-유적 크림 베이스를 포함하는 크림이다. 그러한 크림은 5% 이미퀴모드(imiquimod)를 함유하는 알다라(Aldara) 이미퀴모드 크림 형태일 수 있다.
화합물 12는, 특히 그 고체가 비결정질 형상일 때, 특히 물에 용해되는 것으로 확인되었다. 그것은 오일 상(예를 들면, 파라핀)으로 에멀젼화되기 이전에 수 상 중에 녹을 수 있기 때문에, 수-중-유적 또는 오일-중-수적 에멀젼으로 잘 포뮬레이션된다.
상기 아우레오리신 억제제는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방을 위한 종래의 요법, 예를 들면, 항생제, 스테로이드(히드로코르티손, 클로베타손 부티레이트, 베타메타손 발레레이트, 히드로코르티손 부티레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손 퓨로에이트 및 덱사메타손과 같은), 비-스테로이드성 항-염증 약물, 마크롤라이드 면역억제제(시클로스포린 A, 타크롤리무스 및 피메크롤리무스와 같은), 류코트리엔 길항제 및 포스포디에스테라제 억제제와 같은 추가의 약제와 함께 투여할 수 있다.
이들 추가의 치료제들은 종래의 루트에 따라 투여할 수 있다. 국소 및 경구 루트가 바람직하다.
활성제들은 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 예를 들면 수화물과 같은 용매화물의 형태로 적절한 곳에 투여될 수 있다.
따라서, 아우레오리신 억제제의 국소 투여와 조합하여 추가의 약제의 투여를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방을 위한 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 국소 약제를 추가의 약제와 조합하여 제조하는데 있어서의 아우레오리신 억제제의 용도가 제공된다.
조합 치료제는 동시에, 순차적으로, 또는 각각, 동일하거나 상이한 루트를 통해 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 추가의 약제는 경구적으로 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 추가의 약제는 국소적으로, 예를 들면, 아우레오리신 억제제와 조합된 제제로 투여될 수 있다.
예를 들면, 추가의 약제는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 살균제이며 경구적으로나 국소적으로 투여되는 항생 물질일 수 있다.
AD에서의 아우레오리신의 역할에 대한 인식은 AD의 치료를 위한 아우레오리신 억제제인 신규한 물질을 동정하는 신규한 스크리닝 방법을 가능하게 한다.
이에, 본 발명의 또 다른 관점에서는 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방에 사용되는 약품을 생체 외 스크리닝하는 방법으로서:
(i) 상기 약품을 아우레오리신과 접촉시키고;
(ii) 아우레오리신이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
아우레오리신의 억제는, 예를 들면 실시예에 기재한 아우레오리신 억제 에세이 또는 우유 한천 플레이트 에세이와 같은 표준 테스트로 결정할 수 있다.
또한, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방에 사용되는 약품을 스크리닝하는 방법으로서:
(i) 환자로부터 피부 세정물을 얻고,
(ii) 상기 약품을 피부 세정물과 접촉시키고,
(iii) 단백질 가수 분해 활성이 억제되는지 여부를 결정(예를 들면, 자이모그래피 또는 플루오르성 효소 에세이)하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이 활성은 아우레오리신 및 선택적으로 내인성 메트진신 메탈로프로테아제로 인한 것일 수 있다.
"약품"이란 "작은 분자"(예를 들면, 1000Da 미만, 특히 600Da 미만의 분자량을 가지는 분자), 펩티드, 단백질 또는 항체일 수 있는 어떤 화학 물질을 의미한다. 작은 분자(예를 들면, 600Da 미만의 분자량을 가지는 것들)가 바람직하다. 작은 펩티드(예를 들면, 16 아미노산 잔기 미만을 함유)가 바람직하다. 이들 펩티드는 선형 또는 환형일 수 있다.
본 발명에 따른 방법과 용도를 수행하는데 적합한 한 방법에서, AD 또는 기타 염증성 병태와 관련된 피부 병변에서 메탈로프로테아제 활성의 존재가 치료 이전에 확인된다. 이에, 본 발명의 이러한 관점에 따라, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료 방법으로, (i) 상기 피부 병변 부위로부터의 피부 세정물 중 메탈로프로테아제 활성의 존재를 결정하고, 메탈로프로테아제 활성의 존재가 확인되면, 이어서 (ii) 상기 피부 병변에 아우레오리신 억제제를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료를 위한 국소 약제의 제조에 있어서의 아우레오리신 억제제의 용도가 제공되며, 여기서 상기 피부 병변은 메탈로프로테아제 활성을 함유하는 것으로 미리-결정된다.
어떤 구현예에서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 내인성 메트진신 메탈로프로테아제 억제제이다.
본 발명에 따른 방법과 용도를 수행하는데 적합한 또 다른 방법에서, AD 또는 기타 염증성 병태와 관련된 피부 병변에서 S 아우레우스의 존재가 치료 이전에 확인된다. 이에, 본 발명의 이러한 관점에 따라, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료 방법으로, (i) 상기 피부 병변 부위에서 스타필로코커스 아우레우스의 존재를 결정하고, 스타필로코커스 아우레우스의 존재가 확인되면, 이어서 (ii) 상기 피부 병변에 아우레오리신 억제제를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료를 위한 국소 약제의 제조에 있어서의 아우레오리신 억제제의 용도가 제공되며, 여기서 상기 피부 병변은 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 것으로 미리-결정된다.
어떤 구현예에서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 내인성 메트진신 메탈로프로테아제 억제제이다.
사실상, 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 방법과 용도는 상기 피부 병변 부위에서 스타필로코커스 아우레우스의 존재를 확인하는 것을 포함하는 방법 단계가 선행된다.
"상기 피부 병변 부위"란 피부 병변 및 그 내부, 또는 주변 영역을 의미한다.
스타필로코커스 아우레우스의 존재는, 환자의 피부를 샘플링하고, 미생물학적 또는 유전학적 방법을 통해 스타필로코커스 아우레우스의 존재를 결정함으로써 직접 결정할 수 있다. 에세이의 가장 단순한 형태에서는, 손상된 피부를 면봉으로 채취하고, 상기 면봉을 혈액 한천 플레이트 상에서 항온 처리하고, 스타필로코커스 아우레우스의 콜로니를 표준 미생물학적 과정을 통해 동정한다. 콜로니화 수치를 산정하기 위해 정량 방법론도 또한 적용할 수 있다. 또한, 스타필로코커스 아우레우스의 존재를 증명하기 위해 정량 PCR과 같은 유전학적 방법도 사용할 수 있다.
스타필로코커스 아우레우스의 존재는 또한, 예를 들면 환자의 피부 세정물 중에서 메탈로프로테아제 활성의 존재를 결정하는 것을 통해 간접적으로 결정할 수도 있다.
메탈로프로테아제와 메탈로프로테아제 활성의 존재는 젤라틴 자이모그래피 또는 효소 에세이에 의해 환자로부터의 피부 세정물 중에서 검출할 수 있다.
도 1은 급성 AD 부위로부터 채취한 피부 세정 샘플에서 얻은 겔을 나타낸다(화합물 11의 유무에 대한 자이모그래픽 분석(zymographic analysis)).
도 2는 우유 한천 플레이트 에세이에서의 화합물 3에 의한 단백질 가수 분해 활성의 억제를 나타낸다.
합성 실시예
1. 화합물 11 및 12의 합성
화합물 11 및 12를 생성하기 위해 두 개의 호환가능한 합성 루트를 사용하였다. 그 첫 번째는 (R)-2-(2-메톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산으로부터의 화합물 11의 합성에 의해 예시된다. 그 두 번째는 L-루신으로부터의 화합물 12의 합성에 의해 예시된다. 첫 번째 루트는 (S)-2-(2-메톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산을 사용한 화합물 12의 합성에 사용될 수 있고, 두 번째는 L-루신 대신 D-루신을 사용한 화합물 11의 합성에 사용될 수 있다.
A. (R)- N1 -((S)-3,3-디메틸-1-( 메틸아미노 )-1- 옥소부탄 -2-일)- N4 -히드록시-2-이 소부틸숙신아미 드 (화합물 11)의 합성
i) 디클로로메탄(5ml) 중의 (R)-2-(2-메톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산(0.5g, 2.4mmol), DCC(1.2eq, 0.61g) 및 HOBT(1.02eq, 0.34g) 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. (S)-2-아미노-N,3,3-트리메틸부탄아미드(1.1eq, 0.39g)를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 결과물인 백색 침전물을 여과하고, 그 여과액을 감압하에서 건조 상태까지 농축시켜 오일을 얻었다. 상기 조 오일(crude oil)을 에틸 아세테이트(50ml)에 용해시키고, 2N 히드로클로르산(2×50ml), 포화 소듐 바이카보네이트(2×50ml) 및 브린(50ml)으로 순차적으로 추출하고, MgSO4로 건조시키고, 건조 상태까지 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르로부터 재결정화시켜 백색 고체(0.60g, 74%)로서 (R)-메틸-3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥사노에이트를 얻었다. 1.05g의 (R)-2-(2-메톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산으로부터의 두 번째 반응으로 1.06g(65%)의 생성물을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00004
ii) Levy et al(J. Med Chem 41:199-223, 1998)의 방법을 사용하여 (R)-메틸 3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥사노에이트를 화합물 12로 전환시켰다. 히드록실아민 히드로클로라이드(7.2eq, 0.91g)를 메탄올(8.8ml) 중에 용해하고, 0℃로 냉각시켰다. 메탄올(5.8ml) 중의 포타슘 히드록시드(11.4eq, 1.17g)를 첨가하고, 그 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 그 여과액을 메탄올(0.6g, 3.6ml) 중의 (R)-메틸 3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥사노에이트 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 감압하에서 건조 상태까지 농축시키고, 물(7ml)에 용해시키고, 6N 히드로클로르산으로 pH 5까지 산성화한 후, 포화 소듐 바이카보네이트로 pH 7로 중화시켰다. 결과물인 침전물을 여과에 의해 수집하고, 섬광 크로마토그래피로 5% 메탄올/디클로로메탄으로부터 10% 메탄올/디클로로메탄까지 용출시켜 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획이 결합되었고, 감압하에서 건조 상태까지 농축시켰다. 고체를 이소프로필 알코올:에틸 아세테이트(1:1) 중에서 분쇄하고 여과하여, 백색 고체(68mg, 7%)로서 (R)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-N4-히드록시-2-이소부틸숙신아미드를 얻었다. 1.06g의 (R)-메틸 3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥사노에이트를 사용하고, 농축된 반응 혼합물을 섬광 크로마토그래피로 직접 정제하는 두 번째 반응에서 0.25g(24%)의 생성물을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00005
B. (S)- N1 -((S)-3,3-디메틸-1-( 메틸아미노 )-1- 옥소부탄 -2-일)- N4 -히드록시-2-이 소부틸숙신아미 드 (화합물 12)의 합성
i) 소듐 니트라이트(84.2g, 1.22mol)를 48%의 수성 HBr(836g)과 물(360ml) 중의 얼음처럼 차가운 L-루신(100g, 0.762mol) 용액에 순차적으로 첨가하였다. 첨 가를 완료했을 때, 상기 반응을 0℃로 1시간 동안 유지시키고, 밤새도록 실온까지 가온하였다. 상기 반응 혼합물을 0℃로 재-냉각시킨 후, 상기 반응 혼합물이 pH 4.5에 이를 때까지 소듐 카보네이트를 순차적으로 첨가하여(~135g) 퀀칭시켰다(quenched). 상기 혼합물을 디클로로메탄(2×500ml)으로 추출한 후, MgSO4로 건조시키고, 용매를 진공 중에서 제거하여, 유지시 그 색을 잃는 오렌지색 오일(115.8g, 80% 수율)로서 (S)-2-브로모-4-메틸펜탄산을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00006
ii) 보론 트리플루오라이드 디에테레이트(7.9g, 0.0559mol)를 터트-부틸 아세테이트(450ml) 중의 (S)-2-브로모-4-메틸펜탄산(108g, 0.559mol) 용액에 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 질소 하 실온에서 밤새도록 교반하였다. 상기 혼합물을 포화 소듐 바이카보네이트에 붓고, 소듐 바이카보네이트를 더 첨가하여 그 염기성 pH를 유지시켰다. 유기 상을 분리해내고, 브린으로 세척하고(2×200ml), MgSO4 상에서 건조시키고, 건조 상태까지 증발시켜 135g의 조 오일을 얻었다. 이어서, 상기 오일을 진공 증류에 의해 정제하였다(190℃의 이론상 끓는점을 얻기 위한 55℃, 4mbar). 무색 오일(91.7g, 66% 수율)으로서 (S)-터트-부틸-2-브로모-4-메틸펜타노에이트가 수집되었다.
Figure 112008019626747-PCT00007
iii) 포타슘 터트-부톡사이드(38.8g, 0.346mol)를 건조 디메틸포름아미드(169ml) 중의 디벤질 말로네이트(98.3g, 0.346mol) 용액에 용해될 때까지 0℃ 질소 하에서 순차적으로 첨가하였다. 상기 용액을 0℃로 유지시키고, 건조 디메틸포름아미드(160ml) 중의 (S)-터트-부틸-2-브로모-4-메틸펜타노에이트(86.8g, 0.346mols) 용액을 1시간에 걸쳐 한 방울씩 첨가한 후, 0℃에서 4일 동안 교반하였다. 상기 반응을 실온까지 가온하고, 에틸 아세테이트(600ml)로 희석시키고, 포화 암모늄 클로라이드 수용액(400ml)을 첨가하였다. 유기 층을 분리해내고, 수성 층을 에틸 아세테이트(400ml)로 재-추출하였다. 상기 유기 층이 결합되었고, 10% 소듐 클로라이드 용액(500ml)으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하여 195g의 옅은 황색 오일을 얻었다. 상기 오일을 섬광 컬럼 크로마토그래피(10:1 헵탄:에틸 아세테이트)로 정제하여, 유지시 백색 고체로 고형화되는 맑은 오일로서 63g(40% 수율)의 (S)-1,1-디벤질-2-터트-부틸-4-메틸펜탄-1,1,2-트리카복실레이트를 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00008
iv) TFA(100ml)를 디클로로메탄(500ml) 중의 (S)-1,1-디벤질-2-터트-부틸 4- 메틸펜탄-1,1,2-트리카르복실레이트(60g, 0.132mol) 용액에 첨가하고, 상기 반응을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 상기 용매를 진공 하에서 제거하고, 결과물인 오일을 디클로로메탄(300ml)에 재-용해시켰다. 이어서, 물질을 물(300ml)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 용매를 제거하여, 옅은 오렌지색 오일(51.1g, αD -7.44°, MeOH 중 c=2.554)를 얻었다. 상기 오일을 180ml 디에틸 에테르 중에 용해시키고, 520ml n-헥산을 첨가하고, 상기 용액을 얼음 배치 내에서 냉각시켰다. 결과물인 침전물을 여과하고, 그 여과액을 진공 중에서 농축시켜, 옅은 오일(31.06g, 60% 수율)로서 (S)-2-(1,3-비스(벤질옥시)-1,3-디옥소프로판-2-일)-4-메틸펜탄산을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00009
v) HOBT(11.2g, 0.083mol)을 에틸 아세테이트(200ml)와 디메틸포름아미드(10ml) 중의 (S)-2-(1,3-비스(벤질옥시)-1-3,-디옥소프로판-2-일)-4-메틸펜탄산 용액(30g, 0.075mol) 용액에 첨가하였다. 상기 반응을 0℃까지 냉각시키고, 에틸 아세테이트(40ml, 2vol) 중의 DCC(19.2g, 0.093mol) 용액을 15분에 걸쳐 첨가하였다. 상기 반응을 실온까지 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. DCU를 여과하여 제거하고, 상기 반응을 다시 0℃까지 냉각시키고, 에틸 아세테이트(20ml, 2vol) 중의 (S)-2-아미노-N,3,3-트리메틸부탄아미드(10.86g, 0.075mol) 용액을 첨가하고, 상기 반응을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 이어서, 상기 반응을 2M 소듐 카보네이트(200ml), 물(200ml), 다시 2M 소듐 카보네이트(200ml), 브린(200ml) 및 물(200ml)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, 35g의 옅은 황색 왁시 고체(waxy solid)를 얻었다. 이 고체를 디에틸 에테르 중에서 슬러리화하고, 디벤질 2-((S)-1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)말로네이트를 백색 고체(24.64g, 62% 수율)로 여과해내었다.
Figure 112008019626747-PCT00010
vi) 디벤질 2-((S)-1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)말로네이트(24.5g, 0.047mol)를 에탄올(300ml) 중에 용해하고, 그 용액을 질소로 정화시켰다. 플라스크를 비우고, 다시 질소로 정화시키고, 탄소 촉매(2.45g, 10중량%) 상의 10% 팔라듐을 첨가하였다. 상기 플라스크를 다시-비우고, 한 번 더 질소로 정화시킨 후 비우고, 수소로 세 번 정화시켰다. 상기 반응을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 일주일에 걸쳐 교반하였다. 상기 촉매를 여과해내고, 용매를 진공 하에 제거하여 백색 고체(100% 수율)로서 15g의 2-((S)-1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)말론산을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00011
vii) 2-((S)-1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)말론산(14.5g)을 에탄올 중에 용해시키고, 탄소(1.45g)를 첨가하고, 상기 반응을 밤새도록 80℃에서 교반하였다. 상기 탄소를 여과해내고, 용매를 진공 중에서 제거하여, 옅은 회색 고체로서 11.51g의 (S)-3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥산산을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00012
viii) O-벤질히드록실아민 히드로클로라이드(9.30g, 0.058mol), NMM(5.93g, 0.059mol), HOBT(6.42g, 0.048mol) 및 EDAC(9.11g, 0.048mol)를 디메틸포름아미드(161ml)와 디클로로메탄(205ml) 중의 (S)-3-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일카바모일)-5-메틸헥산산(11.51g, 0.038mol) 교반 용액에 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온까지 가온되도록 두고, 밤새도록 교반하였다. 디클로로메탄(500ml)으로 희석시킨 후, 물(500ml), 0.6N HCl(500ml), 포화 소듐 카 보네이트(500ml) 및 물(4×500ml)로 순차적으로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고, 상기 용매를 진공 중에서 제거하여, 백색 고체(7.35g, 43% 수율)로서 (S)-N4-(벤질옥시)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-2-이소부틸숙신아미드를 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00013
ix) (S)-N4-(벤질옥시)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-2-이소부틸숙신아미드(7.35g)를 에탄올(100ml) 중에 용해시키고, 그 용액을 질소로 정화시켰다. 플라스크를 비우고, 다시 질소로 정화시키고, 탄소 촉매(735mg, 10중량%) 상의 10% 팔라듐을 첨가하였다. 상기 플라스크를 다시-비우고, 한 번 더 질소로 정화시킨 후 비우고, 수소로 세 번 정화시켰다. 상기 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 두고, 실온에서 일주일에 걸쳐 교반하였다. 상기 촉매를 여과해내고, 용매를 진공 하에 제거하여, 백색 고체(98% 수율)로서 5.12g의 (S)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-N4-히드록시-2-이소부틸숙신아미드 (화합물 12)를 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00014
2. 화합물 16 및 17의 합성
(S)-2-아미노-N-메틸-4-페닐부탄아미드를 하기와 같이 제조하였다:
i) 메탄올(25ml) 중의 (S)-2-아미노-4-페닐부탄산(5.0g, 27.9mmol) 교반 용액에 티오닐 클로라이드(2.26ml, 30.69mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온한 후, 65℃로 2시간 동안 가열하였다. 진공 중에서 농축시킨 후, 잔류물을 디에틸 에테르(10ml)와 함께 분쇄하고, 흡입 여과에 의해 고체를 수집하고, 디에틸 에테르(5ml)로 세척한 후, 공기 건조시켜, 그것의 히드로클로라이드 염(6.11g, 95%)으로서 (S)-메틸 2-아미노-4-페닐부타노에이트를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 97%, tr=1.08, m/z 194[M + H]+.
ii) 에탄올(8.7ml, 69.6mmol) 중의 8M 메틸아민 용액에 (S)-메틸 2-아미노-4-페닐부타노에이트 히드로클로라이드(4.0g, 17.4mmol)를 실온에서 첨가하였다. 교반을 밤새도록 계속하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 중에 농축시키고, 디에틸 에테르(5ml×3)를 첨가하고, 반복하여 증발시켰다. 고체를 디클로로메탄(30ml)에 부유시키고, 포화 수성 소듐 바이카보네이트(10ml) 및 물(10ml)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4), 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, 백색 고체(2.77g, 83%)로서 (S)-2-아미노-N-메틸-4-페닐부탄아미드를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 94%, tr 1.05, m/z 193[M + H]+, 1H NMR(MeOD) δ1.65(1H, m), 1.85(1H, m), 2.55(2H, m), 2.60(3H, s, CONHMe), 3.15(1H, m), 7.00-7.20(5H, m, Ar).
이 물질은 이하에 기재한 바와 같이 화합물 16 및 17 둘 다를 합성하는데 사용되었다.
A. (S)- N4 -히드록시-2-이소부틸- N1 -((S)-1-( 메틸아미노 )-1-옥소-4- 페닐부탄 -2-일) 숙신아미드 (화합물 16)의 합성
루트 A와 루트 B로 나타내어지는 화합물 16 합성의 두 가지 루트를 사용하였다.
화합물 16에 대한 루트 A
i) THF(5ml) 중의 (S)-3-(메톡시카르보닐)-5-메틸헥산산(250mg, 1.33mmol), EDC(331mg, 1.726mmol) 및 HOBT(233mg, 1.726mmol) 혼합물에 (S)-2-아미노-N-메틸-4-페닐부탄아미드(281mg, 1.46mmol), 이어서 트리에틸아민(0.46ml, 3.30mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트(10ml)에 녹이고, 10% 시트르산(5ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(5ml) 및 물(5ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (S)-메틸 4-메틸-2-(2-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일아미노)-2-옥소에틸)펜타노에이트(380mg, 79%)를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 93%, tr 1.97, m/z 363[M + H]+, 725[2M + H]+.
Figure 112008019626747-PCT00015
ii) THF(2.0ml)와 메탄올(2.0ml) 혼합물 중의 (S)-메틸 4-메틸-2-(2-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일아미노)-2-옥소에틸)펜타노에이트(250mg, 0.69mmol)에 2M 수성 소듐 히드록사이드(1.0ml)를 실온에서 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 약 0.5ml까지 농축시키고, 1M 수성 히드로클로르산으로 조심스럽게 산성화하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2×3ml)로 추출하고, 결합된 유기 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (S)-5-메틸-3-((S)-1-메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일카바모일)헥산산(이성질체 A)와 (S)-4-메틸-2-(2-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일아미노)-2-옥소에틸)펜탄산(이성질체 B)(210mg, 87%) 혼합물을 얻었다; 이것을 단계 (iii)에 바로 사용하였다.
LCMS(3분) 순도 = 72%(이성질체 A, tr =1.69) + 10%(이성질체 B, tr =1.67), m/z 349[M + H]+.
iii) THF(5ml) 중의 단계 (ii)에서 얻은 카르복시산들(210mg, 0.603mmol), EDC(150mg, 0.784mmol) 및 HOBT(105mg, 0.784mmol) 혼합물에 O-테트라히드로-2H-피 란-2-일-히드록실아민(92mg, 0.784mmol), 이어서 트리에틸아민(0.20ml, 1.50mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트(10ml)에 녹이고, 10% 시트르산(5ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(5ml) 및 물(5ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (2S)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(이성질체 A) 및 (2S)-2-이소부틸-N4-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(이성질체 B)(240mg, 89%)를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 61%,(이성질체 A, tr = 1.77) + 13%(이성질체 B, tr = 1.74), m/z 448[M + H]+, 364[M + H - THP]+.
iv) 메탄올(7ml) 중의 (2S)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드 및 (2S)-2-이소부틸-N4-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(240mg, 0.537mmol) 용액에 Amberlyst H-15 수지(200mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 젓고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켰다. 이어서, 원하는 화합물을 분취 역상 HPLC로 분리해내었다. 2:1 디메틸 설폭시드:아 세토니트릴(1.6ml) 중의 조 생성물을 ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18 컬럼(12㎛, 100×21.2mm)에 주입하고, 아세토니트릴 20-100% 구배 / 수중 0.1% TFA(용매 B) / 0.1% TFA(용매 A)로 9.5분에 걸쳐 용출해내고(30ml/분), 215nm에서 UV 검출을 사용하여, 백색 고체(60mg, 32%)로서 화합물 16을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00016
화합물 16에 대한 루트 B
i) t-BuOH(99%, 1.5ml) 중의 (S)-3-(메톡시카르보닐)-5-메틸헥산산(100mg, 0.532mmol) 및 Boc2O(139mg, 0.638mmol) 교반 혼합물에 DMAP(19.5mg, 0.159mmol)을 실온에서 첨가하였다. 1.5 시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 진공 중에서 농축시키고, 에틸 아세테이트(5ml)로 희석하고, 포화 수성 시트르산(2×2ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(2×2ml) 및 물(2ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, 황색 점성 오일(100mg)로서 (S)-4-터트-부틸 1-메틸 2-이소부틸숙시네이트를 얻었다. 이 화합물을 추가의 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
Figure 112008019626747-PCT00017
ii) 메탄올(0.8ml) 중의 (S)-4-터트-부틸 1-메틸 2-이소부틸숙시네이트(100mg, 0.41mmol) 용액에 포타슘 카보네이트(68mg, 0.492mmol) 및 물(0.2ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 55℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 농축시키고, 에틸 아세테이트(5ml) 중에 재용해시키고, 1M 수성 히드로클로르산으로 조심스럽게 산성화하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2ml)로 추출해내고, 결합된 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, 단계 (iii)에 바로 사용할 조 생성물(60mg)로서 (S)-2-(2-터트-부톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산을 얻었다.
iii) DMF(1ml) 중의 조 (S)-2-(2-터트-부톡시-2-옥소에틸)-4-메틸펜탄산(90mg, 0.39mmol), EDC(97mg, 0.507mmol) 및 HOBT(68mg, 0.507mmol) 혼합물에 (S)-2-아미노-N-메틸-4-페닐부탄아미드(90mg, 0.468mmol), 이어서 트리에틸아민(0.135ml, 0.97mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트(5ml)에 녹이고, 10% 시트르산(2ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(2ml) 및 물(2ml)로 세척하 였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (S)-터트-부틸 5-메틸-3-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일카바모일)헥사노에이트(65mg, 79%)를 얻었고; 이것을 단계 (iv)에 바로 사용하였다.
LCMS(3분) 순도 = 47%, tr = 2.16, m/z 405[M + H]+.
iv) 디클로로메탄(0.6ml) 중의 (S)-터트-부틸 5-메틸-3-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일카바모일)헥사노에이트(65mg, 0.161mmol) 용액에 TFA(0.24ml)을 실온에서 첨가하였다. 45분 동안 유지시킨 후, 상기 반응 혼합물을 건조 상태까지 증발시켰다. 디클로로메탄(2×0.5ml)을 첨가하고, 반복하여 증발시켜, 황색 점성 오일(58mg, 정량적)로서 (S)-5-메틸-3-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일카바모일)헥산산을 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 49%, tr = 1.69, m/z 349[M + H]+.
v) THF(2ml) 중의 (S)-5-메틸-3-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일카바모일)헥산산(58mg, 0.167mmol), EDC(66mg, 0.344mmol) 및 HOBT(46mg, 0.344mg) 혼합물에 O-테트라히드로-2H-피란-2-일-히드록실아민(40.3mg, 0.784mmol) 및 트리에틸아민(0.084ml, 0.60mmol)을 첨가하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 증발시키고, 에틸 아세테이트(2ml) 중에 재용해시키고, 10% 시트르산(0.5ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(0.5ml) 및 물(0.5ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에 서 농축시켜, 조 (2S)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(50mg, 67%)를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 44%, tr = 1.77, m/z 448[M + H]+, 364[M + H - THP]+.
vi) (2S)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(50mg, 0.11mmol)를 탈보호시켜, 루트 A 이하에 기재한 과정을 사용한 화합물 16을 얻었다. 수율 = 1.8mg, 4.5%(6 단계에 걸침).
LCMS(7분) 순도 = 100%(tr = 3.48), m/z 364[M + H]+. 1H NMR은 루트 A를 통해 제조한 것과 동일하였다.
B. (R)- N4 -히드록시-2-이소부틸- N1 -((S)-1-( 메틸아미노 )-1-옥소-4- 페닐부탄 -2-일) 숙신아미드 (화합물 17)의 합성
i) THF(5ml) 중의 (R)-3-(메톡시카르보닐)-5-메틸헥산산(250mg, 1.32mmol), EDC(332mg, 1.73mmol) 및 HOBT(234mg, 1.73mmol) 혼합물에 O-테트라히드로-2H-피란-2-일-히드록실아민(202mg, 1.73mmol) 및 Et3N(0.46ml, 3.30mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트(15ml)에 녹이고, 10% 시트르산(5ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(5ml) 및 물(5ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건 조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, 무색 점성 오일(0.33g, 85%)로서 (2R)-메틸 4-메틸-2-(2-옥소-2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시아미노)에틸)펜타노에이트를 얻었다.
LCMS(3분) 순도 = 67%, tr = 1.84, m/z 288[M + H]+, 204[M + H - THP]+.
ii) THF(3.0ml)과 메탄올(1.5ml) 혼합물 중의 (2R)-메틸 4-메틸-2-(2-옥소-2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시아미노)에틸)펜타노에이트(320mg, 1.11mmol) 용액에 2M 수성 소듐 히드록시드(1.5ml)를 실온에서 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 상기 반응 혼합물을 약 0.5ml까지 농축시키고, 1M 수성 히드로클로르산으로 조심스럽게 산성화하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2×5ml)로 추출하고, 결합된 유기 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (2R)-4-메틸-2-(2-옥소-2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시아미노)에틸)펜탄산 및 (3R)-5-메틸-3-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)헥산산(260mg, 86%)을 얻었다; 이것을 단계 (iii)에 바로 사용하였다.
LCMS(3분) 순도 = 70%, tr = 1.59(이성질체 공-용출), m/z 274[M + H]+, 190[M + H - THP]+.
iii) DMF(3ml) 중의 (2R)-4-메틸-2-(2-옥소-2-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시아미노)에틸)펜탄산과 (3R)-5-메틸-3-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시카바모일)헥산산(120mg, 0.439mmol), EDC(109mg, 0.571mmol) 및 HOBT(77mg, 0.571mmol) 혼합 물에 (S)-2-아미노-N-메틸-4-페닐부탄아미드(102mg, 0.53mmol), 이어서 트리에틸아민(0.151ml, 1.09mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반한 후, 에틸 아세테이트(10ml)로 희석시키고, 10% 시트르산(5ml), 이어서 포화 수성 소듐 바이카보네이트(5ml) 및 물(5ml)로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 층을 건조(Na2SO4)하고, 여과하고, 진공 중에서 농축시켜, (2R)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(이성질체 A), (2R)-2-이소부틸-N4-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드(이성질체 B) 및 (3R)-3-이소부틸-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)피롤리딘-2,5-디온(80mg)을 얻었다.
LCMS(3분)은 23%의 이성질체 A 및 B(tr=1.77에서 공-용출), m/z 448[M+H]+, 346[M+H-THP]+와, 69%의 부-산물 (3R)-3-이소부틸-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)피롤리딘-2,5-디온(tr=2.0), m/z 319[M+Na+MeCN]+, 533[2M+Na]+을 나타내었다. 2:1 디메틸 설폭시드:아세토니트릴(1.6ml) 중의 조 생성물의 분취 역상 HPLC 정제물을 ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18 컬럼(12㎛, 100×21.2mm)에 주입하여 이성질체 A와 B 혼합물을 함유하는 분획을 분리해내었다. 상기 컬럼을 215nm에서의 UV 검출을 사용하여 아세토니트릴 20-100% 구배 / 수중 0.1% TFA(용매 B) / 0.1% TFA(용매 A)로 9.5분에 걸쳐 30ml/분으로 용출해내었다.
iv) 단계 (iii)으로부터의 (2R)-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N4-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드와 (2R)-2-이소부틸-N4-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)-N1-(테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)숙신아미드를 함유하는 분획을 실온에서 밤새도록 유지시켰다. 진공 중에서 농축시켜, 단계 (iii)에 기재된 방법을 사용하여 분취 HPLC에 의해 정제된 화합물 17(1.1mg)로부터 탈보호된 생성물(10mg)을 얻었다.
Figure 112008019626747-PCT00018
생물학적 실시예
1. 아우레오리신 및 MMP 효소 억제 에세이
억제제를 포함하고 있거나 그렇지 않은, 90mM MOPS 버퍼 pH 6.8, 4.5mM 칼슘 클로라이드, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-아미드(Bachem), 아우레오리신 및 2% 디메틸 설폭시드 운반체를 함유하는 혼합물(0.1ml) 중에서, 정제된 아우레오리신 타입 I 및 타입 II(BioCentrum Ltd)에 대한 화합물 억제 활성을 평가하였다. 인간 MMPs 1, 2, 8 및 9(Calbiochem)에 대한 화합물 활성을, 사용하는 버퍼가 90mM Tris-HCl pH 7.5 @ 25℃, 90mM 소듐 클로라 이드, 9mM 칼슘 클로라이드 및 0.045% Brij 35인 것을 제외하고, 동일한 방식으로 평가하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고, 0.1ml 0.5M 아세트산으로 정지시키고, 320nm 여기 및 405nm 방출로 형광을 측정하였다. 에세이 조건 하에서 효소 활성의 50% 감소를 야기하는 화합물 농도(IC50 수치)는 곡선 적합(curve fitting, XLfit, IDBS Ltd)에 의해 결정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112008019626747-PCT00019
2. 습진 환자의 피부 세정물에서의 프로테아제 활성:
피부 세정물에서 프로테아제 활성을 평가하는 방법이 개발되었다. 급성 습진 환자로부터의 피부 세정물은 무균의, 1회용 플라스틱 파스테르 피펫을 사용하여 피부 표면 상에서 0.5ml의 무균 생리 식염수를 흡인하여 얻을 수 있다. 피부 면적(~1㎠)은 무균의 개방-말단 플라스틱 실린더에 의해 한정된다. 샘플들을 0.05ml 0.55M MOPS 버퍼 pH 7.0, 55mM 칼슘 클로라이드 및 0.2% Brij 35로 옮기고, 혼합하고, 원심분리하여 파편을 제거하고, 분석 계류 중 -70℃에서 동결시켰다.
상기 샘플들의 프로테아제 함량의 자이모그래픽 분석(zymographic analysis)은 37.5%(v/v) 글리세롤 및 2.5% 소듐 도데실설페이트를 함유하는 0.2부피 0.2M Tris-HCl pH 6.8과 혼합하고, 제조사 지침에 따라 젤라틴 자이모그램 겔(Invitrogen Corporation)을 통해 전기 영동함으로써 행할 수 있다. 겔을 화합물 11(50μM)이 있거나 또는 없는 25mM MOPS 버퍼 pH 7 중의 2.5%(w/v) Triton X-100에서 세척하고, 화합물 11(50μM)이 있거나 또는 없는 5mM 칼슘 클로라이드를 함유하는 0.1M MOPS 버퍼 pH 7 중 37℃에서 밤새도록 전개시켰다. 단백질 가수 분해 활성으로 인한 클리어 영역은, Coomassie Brilliant Blue R로 염색하고, 이어서 40%(v/v) 메탄올/10% (v/v)아세트산 중에서 탈색시켜 동정할 수 있다. 단백질 가수 분해 활성은 당업자에게 알려진 적절한 방법, 예를 들면 Western 블롯에 의해 확인되는 분자량 분석에 의해, 아우레오리신 또는 메트진신으로 인한 것이라 할 수 있다.
급성 AD 부위로부터 채취한 6 피부 세정 샘플에서 얻은 표본 겔을 도 1에 나타낸다.
도 1에 대한 설명: (A) 급성 AD 환자로부터의 6 피부 세정 샘플의 자이모그래픽 분석; (B) 50μM의 화합물 11과 함께 항온 처리한 동일한 피부 세정 샘플의 자이모그래픽 분석. (A)와 (B)에서, 1 레인 = 사이즈 마커(kDa); 2 레인 = 피부 세정 샘플 7; 3 레인 = 샘플 14; 4 레인 = 샘플 17; 5 레인 = 샘플 37; 6 레인 = 샘플 40; 7 레인 = 샘플 48; 8 레인 = 정제된 아우레오리신 4ng.
피부 세정 샘플에서의 프로테아제 활성은 또한, 화합물 11(50μM)이 있거나 또는 없는 90mM MOPS pH 7.0, 4.5mM 칼슘 클로라이드, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-아미드(Bachem) 및 2%(v/v) 디메틸 설폭시드 운반체 중 37℃에서 항온 처리(9㎕)하여 측정하였다. 샘플들을 POLARstar Optima 플레이트 판독기(BMG Labtech Ltd.) 내에서 37℃로 항온 처리하고, 형광 판독(320nm 여기/405nm 방출)을 6시간 동안 매 15분마다 하였다. 활성을 시간의 함수로서 형광이 증가하는 속도로 표현하였다. 표 3에 얻은 결과를 나타낸다.
Figure 112008019626747-PCT00020
두 에세이 모두 급성 AD 환자로부터의 피부 세정 샘플에서 화합물 11에 의한 프로테아제 활성의 현저한 억제를 나타낸다.
또한, AD 환자로부터의 8 피부 세정 샘플 세트 중에서 프로테아제 활성의 억제에 대해 화합물 12를 테스트하였다. 하기의 표 4는 피부 세정 샘플에서의 프로테아제 활성의 현저한 억제가 있음을 나타낸다.
Figure 112008019626747-PCT00021
3. 배양물에서의 스타필로코커스 아우레우스 프로테아제 활성
스타필로코커스 아우레우스 8325-4 배양물 상청액에서의 메탈로프로테아제(아우레오리신) 활성의 화합물 억제를, 억제제가 있거나 또는 없는 90mM MOPS 버퍼 pH 6.8, 4.5mM 칼슘 클로라이드, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-아미드(Bachem), 4㎕ S. 아우레우스 배양물 상청액 및 2%(v/v) 디메틸 설폭시드 운반체를 함유하는 혼합물(0.1ml) 중에서 평가하였다. 상기 S. 아우레우스 배양물 상청액은 10% 탈지 우유를 함유하는 5ml 트립틱 대두 액체 배지(tryptic soy broth)에 S. 아우레우스 8325-4를 접종하고, 37℃에서 6~8시간 동안 진동시키며 배양하여 제조하였다. 이어서, 상기 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고, 후속 사용을 위해 상청액을 -70℃에 저장해두었다. 반응을 POLARstar Optima 플레이트 판독기(BMG Labtech Ltd.) 내에서 37℃로 항온 처리하고, 형광 판독(320nm 여기/405nm 방출)을 6시간 동안 매 15분마다 하였다. 활성을 시간의 함수로서 형광이 증가하는 속도로 표현하였다. 에세이 조건 하에서 효소 활성의 50% 감소를 야기하는 화합물 농도(IC50 수치)는 곡선 적합(XLfit, IDBS Ltd)에 의해 결정하였다. 표 5에 얻어진 결과를 나타낸다. 이들 수치는 정제된 아우레오리신에 대해 얻은 수치(표 2)와 유사하며, 이는 상청액 중의 메탈로프로테아제 활성이 아우레오리신 활성으로 인한 것임을 의미한다.
Figure 112008019626747-PCT00022
S. 아우레오스 프로테아제 활성을 직접적으로 측정하기 위한 두 번째 에세이에서, S. 아우레우스 ATCC 27733 또는 8325-4를 화합물이 있거나 또는 없는 2%(v/v) DMSO를 함유하는 10%(v/v) 탈지 우유 한천 플레이트 상에서 배양하였다. DMSO에 용해된 화합물은 붓기 직전에 고형 배지에 병합시켰다. 한천 플레이트를 37℃에서 24-48시간 동안 배양하고, 단백질 가수 분해 활성은 개개의 콜로니 주변의 클리어런스 영역을 측정하여 평가하였다. 이 에세이의 일예를 도 2에 나타낸다.
도 2에 대한 설명. 그래프는 우유 한천 플레이트 에세이에서 화합물 3에 의한 단백질 가수 분해 활성의 억제를 나타낸다. 결과들은 우유 단백질의 클리어런스 영역을 나타낸다.
4. 아우레오리신 -매개 프로테아제 활성
내인성 프로테아제를 활성화시키는 아우레오리신의 능력은, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드 및 Brij 35를 함유하는 적합한 버퍼 중 37℃에서 표적 프로테아제를 아우레오리신과 함께 항온 처리함으로써 테스트할 수 있다. 이는 하기의, 아우레오리신 활성을 억제하기 위해 EDTA의 존재하에서 발색성 기질을 사용한 효소 에세이에 의해 직접적으로 증명되는 프로-우로키나제 활성화(Narasaki et al J Biol Chem. 240:14278-87, 2005) 및 적절한 이미지화 시스템을 사용하여 콜라겐의 α1(I) 체인의 3/4-길이 절단 생성물의 생성을 측정하는 것에 의해 증명되는 proMMP-1의 활성화에 의해 예시된다.
샘플들의 프로테아제 함량은 또한, 37.5%(v/v) 글리세롤 및 2.5%(w/v) SDS를 함유하는 0.2부피 0.2M Tris-HCl pH 6.8과 함께 혼합하고, 이어서 제조사의 지침에 따라 젤라틴 자이모그램 겔(Invitrogen Corporation)을 통해 전기 영동하는, 자이모그래피를 사용하여 결정할 수 있다. 단백질 가수 분해 활성으로 인한 클리어 영역은, Coomassie Brilliant Blue R로 염색하고, 이어서 40%(v/v) 메탄올/10% (v/v)아세트산 중에서 탈색시켜 동정할 수 있다.
4(i). 아우레오리신에 의한 프로- uPA 의 활성화 및 화합물 13에 의한 그것의 억제
아우레오리신이 우로키나제-타입 플라스미노겐 활성물(uPA)을 활성화하는 능력은, 단일 사슬 프로-uPA(American Diagnostica Inc)를 아우레오리신과 함께 생리적 pH(7.5) 및 진피층(stratum comeum)의 자연 pH, pH 5.6 모두에서 항온 처리하여 테스트하였다(Ohman, H and Vahlquist, A Acta . Derm . Venereol . 74:375-9, 1994). 항온 처리 혼합물은 1.4μM(75㎍/ml) 프로-uPA, 0.1M Tris-HCl pH 7.5 또는 0.1M MES (소듐) 버퍼 pH 5.6, 0.1M 소듐 클로라이드, 5mM 칼슘 클로라이드, 0.05% Brij 35 및 아우레오리신을 최종 부피 10㎕로 함유하였다(표 6, 실시예 1). 두 번째 실험에서는, 화합물 13(20μM)의 존재 및 부재 하에서 최종 부피 20㎕로 pH 5.6에서의 활성화를 테스트하였다(표 6, 실시예 2). 모든 샘플들을 37℃에서 2.5시간 동안 항온 처리한 후, 60mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM 소듐 클로라이드, 2.5mM EDTA, 0.01% Tween 80을 24 부피로 첨가하여 정지시켰다; 이 버퍼는 또한 실시예 2에서 운반체 대조군 샘플에 첨가할 때 0.83μM의 화합물 13을 함유하였다. 정지된 혼합물 샘플들을 0.5mM S-2444(Chromogenix Instrumentation Laboratory SpA)를 함유하는 0.1ml의 동일한 버퍼 중에서 0.5시간 동안 37℃로 항온 처리하여 우로키나제 활성을 측정하였다. 상기 반응을 동일한 부피의 0.5M 아세트산으로 정지시키고, 생성물을 405nm에서 측정하였다.
프로-uPA의 부재하에서 항온 처리한 대조군들은 이 에세이에서 어떤 활성도 나타내지 않았다.
Figure 112008019626747-PCT00023
표 6에서의 데이터는: a) 아우레오리신이 pH 5.6 및 7.5 모두에서 프로-uPA를 활성화하며; b) 이 활성화는 진피층의 자연 pH에서 보다 효과적이며; c) 20μM의 화합물 13(~30×IC50)이 이 활성을 ≥82%까지 억제함을 보여준다.
4( ii ). 화합물 12에 의한 프로- uPA 활성화의 억제
화합물 12에 의한 프로-uPA 활성화의 억제에 대한 투여량-반응과의 관계를 1.5μM(78㎍/ml) 프로-uPA, 0.1M MES 버퍼 (소듐) pH 5.6, 0.1M 소듐 클로라이드, 5mM 칼슘 클로라이드, 0.05% Brij 35, 아우레오리신(75ng/ml) 및 2%(v/v) DMSO ± 화합물 12를 함유하는 반응 혼합물(20㎕) 중에서 결정하였다. 혼합물을 37℃에서 2.5시간 동안 항온 처리하고, 60mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM 소듐 클로라이드, 2.5mM EDTA, 0.01% Tween 80의 7 부피로 희석하여 정지시켰다. 이들 조건 하에서, uPA 활성으로 평가되는 프로-uPA 절단의 정도는 본 에세이에서의 아우레오리신의 농도에 직접 비례하였다. uPA의 활성을 상기 4(i)에 설명한 바와 같이 S-2444를 사용하여 측정하였다. uPA 활성의 50% 감소를 야기하는 화합물 농도(IC50 수치)는, 아우레오리신 활성을 평가하기 위해 형광 펩티드 기질(fluorogenic peptide substrate)을 사용하여 결정한 표 2에서의 수치와 양호하게 일치하는 2.4μM일 때의 곡선 적합(XLfit, IDBS Ltd)에 의해 결정하였다.
보다 높은 아우레오리신 농도에서 화합물 12가 프로-uPA의 활성을 억제하는 능력은 1.5μM(78㎍/ml) 프로-uPA, 0.1M MES 버퍼(소듐) pH 5.6, 0.1M 소듐 클로라이드, 5mM 칼슘 클로라이드, 0.05% Brij 35, 아우레오리신(1㎍/ml) 및 2%(v/v) DMSO ± 화합물 12를 함유하는 반응 혼합물(20㎕) 중에서 결정하였다. 혼합물을 37℃에서 2.5시간 동안 항온 처리하고, 60mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM 소듐 클로라이드, 2.5mM EDTA, 0.01% Tween 80의 20 부피로 희석하여 정지시키고, 상기 4(i)에 기재한 바와 같이 S-2444를 이용하여 uPA 활성을 측정하였다. 표 7의 결과로부터, 기대한 바와 같이, 화합물 12(10× 및 130×IC50 수치에서)가 투여량-의존 방식으로 아우레오리신-매개 프로-uPA 활성화를 억제함을 확인하였다.
화합물 12(317μM)은 이 에세이에서 uPA 활성에 어떤 영향도 미치지 않았다.
Figure 112008019626747-PCT00024
피부 표면에서 아우레오리신 활성을 억제하는 것에 의한 프로-uPA 활성화의 억제는 AD 환자에게서 전-염증(pro-inflammatory)의 진전을 감소시킬 것으로 기대된다.
4( iii ). 아우레오리신에 의한 프로 MMP -1의 활성화
아우레오리신이 섬유아세포 콜라게나제(MMP-1)를 활성화하는 능력은 인간 류마티즘 활액 섬유아세포 콜라게나제 전효소(Calbiochem)를 pH 7.5에서 MMP 활성물 아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)가 부가된 및 부가되지 않은 아우레오리신과 함께 배양하여 테스트하였다.
TCNB 버퍼(0.1M Tris-HCl pH 7.5, 10mM 칼슘 클로라이드, 0.1M 소듐 클로라이드, 0.05% Brij 35) 중의 활성화 혼합물은 명기한 바와 같이 프로MMP-1(25㎍/ml) 및 아우레오리신(3㎍/ml) 및/또는 1mM APMA를 함유한다. 혼합물을 37℃에서 1.25시간동안 배양하고, 얼음같이 찬 TCNB로 희석하여 퀀칭시켰다. 이어서, 0.1㎍/ml (프로)MMP-1 및 0.16mg/ml 돼지 타입 I 콜라겐(MD Biosciences)을 함유하는 TCNB 중 25℃에서 배양하여 샘플 중의 콜라게나제 활성을 결정하였다. 각 혼합물의 일부를 일정 시간 간격으로 0.2 부피 5×겔-로딩 버퍼(0.2M Tris-HCl pH 6.8 / 37.5%(v/v) 글리세롤 / 2.5%(w/v) SDS / 5%(v/v) 2-머캅토에탄올)로 덜어내고, 95℃에서 2.5분 동안 가열하였다. 콜라겐 절단을 SDS-PAGE 겔 분석(4-12% NuPAGE Bis-Tris(MES), Invitrogen Corp)으로, FluorChemTM 8800 이미지화 시스템 구동 AlphaEaseTM FC 소프트웨어(Alpha Innotech Corp.)를 사용하여 α1(I) 사슬의 3/4-길이 생성물의 밴드 밀도를 측정함으로써 정량하였다. 절단 비율은 곡선 중 직선 부분으로부터 추정하였고, 처리되지 않은 대조군에 대한 비율을 계산하였다. 그 데이터를 하기 표 8에 나타낸다. 이 사실과 일치하는 바는, 아우레오리신이 콜라게나제 그 자체가 아니며, 아우레오리신 단독 ± APMA를 함유하는 대조군 배양물은 본 에세이에서 어떤 활성도 나타내지 않는다는 것이다.
Figure 112008019626747-PCT00025
이들 데이터는 아우레오리신이 APMA와 같은 인지된 MMP-활성물과 비슷한 정도로 프로MMP-1을 활성화시킬 뿐만 아니라, APMA와 조합하여 사용할 경우 MMP-1를 "초활성화"시키는 능력을 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 두 효소가 동일한 부위, 예를 들면 S. 아우레우스에 의해 콜로니화된 AD 환자의 피부에서 발견될 경우, 아우레오리신을 억제하는 것은 프로MMP-1 활성화도 억제할 것이다.
5. 아우레오리신 -매개 케라티노사이트 활성화
활성화된 케라티노사이트는 IL-8, 전-염증 케모카인을 생성한다. 많은 박테리아 생성물들은 케라티노사이트의 활성화를 야기한다. 케라티노사이트에 의한 IL-8 생성에 대한 아우레오리신의 효과가 평가될 수 있다. 인간 피부 상피 케라티노사이트(TCS Cellworks)는 지침에 따라 유지된다. 증식하는 배양물을 트립신화하고, 채취하고, 트립신 억제제로 처리하고, 96 웰 플레이트에 융합 단일층을 제공하도록 약 50,000세포/웰로 성장 배지에 재부유시킨다. 세포들을 5% CO2, 37℃에서 밤새도록 배양하여 회수하고, 소비된 배지를 웰에서 흡인해내고, 새로운 성장 배지로 대체하였다. 상기 세포들을 37℃, 5% CO2에서 추가로 24시간 또는 48시간 더 아우레오리신 또는 버퍼 대조군과 함께 배양하였다.
각 웰에서 상청액을 제거하고, R&D 시스템(Catalog Number: DY208) 사의 인간 IL-8 ELISA 디벨롭먼트 키트를 제조사 지침에 따라 사용하여 IL-8의 농도를 결정하였다.
실험 결과를 표 9에 나타낸다. 이들 실험에서, 세포들은 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 아우레오리신 또는 버퍼 대조군과 함께 배양되었다. 케라티노사이트에서 IL-8 생성을 자극하는 폴리 IC 및 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA)이 양성 대조군으로 사용되었다.
Figure 112008019626747-PCT00026
본 실험은 아우레오리신이 케라티노사이트에서의 IL-8 생성(687pg/ml)을 아우레오리신 버퍼 대조군(493pg/ml)보다 훨씬 더 자극할 수 있음을 보여준다. LTA(454pg/ml), 및 보다 적은 정도로, 폴리 IC(282pg/ml)는 비자극 대조군(199pg/ml)에 비해 IL-8 생성을 자극하였다.
6. S. 아우레우스 성장 및 생존에 대한 화합물 11 및 12의 영향
S. 아우레우스 성장 및 생존에 대해 유효한 화합물은, 유기체를 액체 배양물 중에서 성장시키고, 고형 배지에 도포하여 생존 세포를 세는 것에 의해 평가할 수 있다. 선택 성장은 96-웰 마이크로-역가 플레이트에서 탁도측정법(turbidometry)으로 추정할 수 있다. 10% 탈지 우유 및 1%(v/v) DMSO 운반체 ± 50μM 화합물을 함유하는 뇌 심장 융합 배지(5ml; Becton Dickinson and Co.)를 S. 아우레우스 8325-4로 접종시키고(트립틱 대두 액체 배지 중의 대략 107 세포), 16시간 동안 37℃/220rpm으로 배양하였다. 각 배양물로부터 복제 샘플(0.1ml)을 덜어내고, PBS로 희석하고, 뇌 심장 융합 한천(1.5%) 상에 도포하고, 37℃에서 배양하였다. 생존 세포 수를 표 10에 나타낸 바와 같이 콜로니의 개수로 결정하였다.
Figure 112008019626747-PCT00027
S. 아우레우스 8325-4(대략 105 세포)를 함유하는 트립틱 대두 액체 배지(0.18ml)를 바닥이 평평한 깨끗한 폴리스티렌 96-웰 마이크로-역가 플레이트의 웰 내에서 20㎕ 20%(v/v) DMSO 운반체 ± 화합물과 혼합하였다. 상기 플레이트를 37℃/220rpm으로 밤새도록 배양하고, 이튿날 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 성장 억제는 운반체 대조군을 참조하여 결정하였고, 최종 흡광도의 50% 감소를 야기하는 액티노닌(actinonin, Sigma) 농도(IC50 수치)는 표 11에 나타낸 바와 같이 곡선 적합(XLfit, IDBS Ltd)으로 결정하였다.
Figure 112008019626747-PCT00028
표 10 및 11의 데이터는 화합물 11 및 12가 양성 대조군 화합물 액티노닌(Sigma), 히드록사메이트-계 펩티드 디포밀라제 억제제(Clements, JM et al Antimicrob. Agents Chemother . 45:563-570, 2001)과 달리 항균성이 없으며, 본 에세이에서 2.6μM의 분명한 IC50 수치를 나타냄을 보여준다.
7. S. 아우레우스 프로테아제 활성에 대한 화합물 12의 영향
아우레오리신은 스타필로코커스의 세린 프로테아제 글루타밀 엔도펜티다제(V8 프로테아제)를 활성화하고, 스타필로코커스의 시스테인 프로테아제 스타포파인 B를 간접적으로 활성화한다(Shaw, L et al Microbiology 150:217-228, 2004). 따라서, 이들 중 어느 것도 메탈로프로테아제 억제제의 표적이 아닐 것이라는 사실에 불구하고, 아우레오리신의 억제는 이들 프로테아제 활성에 영향을 미칠 것으로 기대된다. 이들 스타필로코커스의 프로테아제 활성에 대한 화합물의 전반적인 영향은, S. 아우레우스를 화합물 존재 하에 성장시키고, 상기 화합물의 농도를 동일하게 유지하면서 프로테아제 활성에 대한 세포-조건화 배지를 에세이함으로써 테스트할 수 있다.
10% 탈지 우유 및 2%(v/v) DMSO 운반체 ± 화합물 12를 함유하는 뇌 심장 융합 배지의 복제 샘플(5ml; Becton Dickinson and Co.)을 S. 아우레우스 8325-4로 접종시키고(트립틱 대두 액체 배지 중의 대략 107 세포), 16시간 동안 37℃/220rpm으로 배양하였다. 배양물을 원심분리하여 박테리아를 제거하고, 프로테아제 활성의 분석 계류 중 배양 상청액을 -70℃에 저장해두었다.
효소 활성은 90mM MOPS (소듐) 버퍼 pH 7.0(0.1ml), 0.045% Brij 35, 2%(v/v) DMSO 운반체 ± 화합물 12 및 배양 상청액(4㎕)을 함유하는 혼합물 중에서 측정하였다. 사용한 화합물의 농도는 에세이한 샘플을 배양하는데 사용한 그것과 같다. 상기 반응 혼합물에 더 추가된 것은 하기와 같다. 아우레오리신 에세이: 4.5mM 칼슘 클로라이드, 9μM E-64(시스테인 프로테아제 활성을 억제하기 위함) 및 10μM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-아미드(Bachem); V8 프로테아제 에세이: 10μM Mca-Leu-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys(Dnp)-아미드(Bachem); 시스테인 프로테아제 에세이: 1.8mM 시스테인-HCl(NaOH로 pH-조정), 9mM EDTA 및 0.1mM Z-Phe-Arg-AMC 히드로클로라이드(Bachem). 37℃에서의 생성물 형성 속도는 POLARstar OPTIMA 플레이트 판독기(BMG LABTECH Ltd)를 사용하여, 아우레오리신과 V8 에세이에서는 320nm 여기/405nm 방출로, 시스테인 프로테아제 에세이에서는 390nm 여기/460nm 방출로 15분 간격으로 6시간에 걸쳐 판독하여 모니터하였다. 효소 활성은 선형 속도의 형광 증가로 결정되었고, 운반체 대조군 샘플을 참조하여 억제 백분율로 전환하였다. 표 12의 결과는 화합물 12가 V8 프로테아제 활성 수치를 거의 완벽하게 억제하며, 시스테인 프로테아제 활성 수치를 현저하게 억제함을 보여준다.
Figure 112008019626747-PCT00029
따라서, S. 아우레우스에 의해 콜로니화된 AD 환자의 피부에 아우레오리신 활성을 억제하기 위한 화합물 12를 사용하는 것은 그 밖의 세포외 스타필로코커스의 프로테아제 활성을 감소시키는 부가적인 장점도 가지는 것으로 기대될 것이다.
8. 화합물 12의 선택성 프로파일
화합물 12는 아우레오리신 및 MMPs에 대해 동등한 효력으로 넓은 범위의 활성을 가진다(표 2). 상이한 촉매작용 계열의 프로테아제를 포함하여, 그 밖의 프로테아제에 대한 그것의 억제 활성은 상기에서 아우레오리신에 대해 사용한 것과 유사한, 적합하게 설정된 생물화학적 에세이에 의해 결정할 수 있다. 정제된 효소 범위에 대한 화합물 11 및 12의 억제 활성을 하기에 기재한 바와 같이 테스트하였다.
억제 활성은 2%(v/v) DMSO 운반체 ± 화합물 및 이하의 부가물을 함유하는 반응 혼합물(0.1ml) 중에서 테스트하였다. V8 프로테아제: 90mM MOPS(소듐) 버퍼 pH 7.0, 4.5mM 칼슘 클로라이드, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Leu-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys(Dnp)-아미드(Bachem) 및 V8(BioCentrum Ltd; 30ng). 스타포파인 A 및 B: 90mM MOPS(소듐) 버퍼 pH 7.0, 1.8mM 시스테인-HCl(NaOH로 pH 조정), 0.045% Brij 35, 0.1mM Z-Phe-Arg-AMC 히드로클로라이드(Bachem) 및 스타포파인 A 또는 B(BioCentrum Ltd; 30ng). 인간 칼리크레인 5: 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼 pH 8.0, 0.045% Brij 35, 0.1mM Boc-Val-Pro-Arg-AMC(Sigma) 및 재조합 인간 칼리크레인 5( R&D Systems Inc; 6ng). 인간 칼리크레인 7: 72mM Tris-HCl pH 8.0, 0.033% Brij 35, 1.2mM S-2586(Chromogenix Instrumentation Laboratory SpA) 및 제조사의 지침에 따라 설모리신이-활성화된 재조합 인간 칼리크레인 7(R&D Systems Inc; 0.6㎍). 인간 앤지오텐신-전환 효소(angiotensin-converting enzyme, ACE): 45mM MES(소듐) 버퍼 pH 6.5, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(Dnp)-OH(R&D Systems Inc) 및 재조합 인간 ACE(R&D Systems Inc; 1.3ng). 인간 카텝신 D: 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼 pH 3.5, 0.2M 소듐 클로라이드, 0.045% Brij 35, 10μM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-아미드(Bachem) 및 제조사의 지침에 따라 활성화된 재조합 인간 카텝신 D(R&D Systems Inc; 8ng). 인간 ADAM17: 25mM Tris-HCl pH 9.0, 2.5μM 아연 설페이트, 0.005% Brij 35, 10μM Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-아미드(R&D Systems Inc) 및 재조합 인간 ADAM17(R&D Systems Inc; 2.5ng). 모든 반응은 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 카텝신 D 에세이에서 0.1ml 0.15M Tris 염기로 정지시킨 것을 제외하고, 0.1ml 0.5M 아세트산으로 정지시켰다. 0.1mM에서의 억제 백분율은 운반체 대조군을 참조하여 계산하였고, 적절한 곳에서, IC50 수치를 곡선 적합(XLfit, IDBS Ltd)으로 결정하였다. 표 13의 데이터는 화합물 12가 아스팔틸(aspartyl) 프로테아제 카텝신 D, 세린 프로테아제 칼리크레인 5 및 7 및 V8 뿐만 아니라, 스타필로코커스의 시스테인 프로테아제 스타포파인 A 및 B도 억제하지 않음을 증명한다. 또한, 화합물 12는 ACE(메탈로프로테아제 M12과)도 억제하지 않으며, 단지 ADAM17의 극히 약한 억제제로서 "쉐다아제" 억제제가 아님을 나타내고; 이는 ADAM17의 잠재적인 억제제인 그것의 부분 입체 이성질체, 화합물 11과 뚜렷하게 대비된다.
Figure 112008019626747-PCT00030
특허 및 특허 출원을 포함하여, 본 출원에서 참조한 모든 참조 문헌들은 여기에 가능한 전체 범위가 참조로서 병합된다.
명세서와 뒤이을 청구항에 걸쳐, 내용이 그 밖의 것을 요구하지 않는다면, 용어 '포함하다' 및 '포함하다' 와 '포함하는'과 같은 변이형은, 언급된 정수, 단계, 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 포함하나, 그 외 다른 정수, 단계, 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 제외하는 것은 아님을 의미하는 것으로 이해하여야 할 것이다.
약어
Figure 112008019626747-PCT00031

Claims (44)

  1. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 아우레오리신 억제제를 국소 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 아토피성 피부염의 치료 또는 예방을 위한 것인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 공지된 설모리신(thermolysin) 억제제들로부터 선택되는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 하나 이상의 내인성 메트진신(metzincin) 메탈로프로테아제를 억제하는 것인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 추가의 약제와 조합하여 투여되는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 추가의 약제는 항생제인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 추가의 약제는 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증제를 포함하는, 염증 반응을 조절하는 것인 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 추가의 약제는 면역억제제인 방법.
  9. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방을 위한 국소 약제의 제조에 있어서 아우레오리신 억제제의 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 용도는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방을 위한 것인 용도.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 공지된 설모리신 억제제들로부터 선택되는 용도.
  12. 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 하나 이상의 내인성 메트진신 메탈로프로테아제를 억제하는 것인 용도.
  13. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 추가의 약제와 조합하여 투여되는 용도.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 추가의 약제는 항생제인 용도.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 추가의 약제는 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증제를 포함하는, 염증 반응을 조절하는 것인 용도.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 추가의 약제는 면역억제제인 용도.
  17. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료에 사용하기 위한, 아우레오리신 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 국소 약제학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 국소 약제학적 조성물.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 공지된 설모리신 억제제들로부터 선택되는 국소 약제학적 조성물.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 하나 이상의 내인성 메트진신 메탈로프로테아제를 억제하는 것인 국소 약제학적 조성물.
  21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 추가의 약제와 조합하여 투여되는 국소 약제학적 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 추가의 약제는 항생제인 국소 약제학적 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 추가의 약제는 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항-염증제를 포함하는, 염증 반응을 조절하는 것인 국소 약제학적 조성물.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 추가의 약제는 면역억제제인 국소 약제학적 조성물.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제가 내인성 메트진신 메탈로프로테아제를 현저하게 억제하는 것은 아닌 방법, 용도 또는 조성물.
  26. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제가 내인성 메트진신 메탈로프로테아제를 현저하게 억제하는 것인 방법, 용도 또는 조성물.
  27. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 화합물 1 내지 17 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로부터 선택되는 방법, 용도 또는 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 화합물 12 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 방법, 용도 또는 조성물.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 화합물 16 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물인 방법, 용도 또는 조성물.
  30. (R)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-N4-히드록시-2-이소부틸숙신아미드인 화합물(화합물 11) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  31. (S)-N1-((S)-3,3-디메틸-1-(메틸아미노)-1-옥소부탄-2-일)-N4-히드록시-2-이소부틸숙신아미드인 화합물(화합물 12) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  32. (S)-N4-히드록시-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2- 일)숙신아미드인 화합물(화합물 16) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  33. (R)-N4-히드록시-2-이소부틸-N1-((S)-1-(메틸아미노)-1-옥소-4-페닐부탄-2-일)숙신아미드인 화합물(화합물 17) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  34. 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 함께, 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 약제로 사용하기 위한 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  36. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방에 사용되는 약품을 스크리닝하는 방법으로:
    (i) 상기 약품을 아우레오리신과 접촉시키고
    (ii) 아우레오리신이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  37. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 염증성 피부 병태의 치료 또는 예방에 사용되는 약품을 스크리닝하는 방법으로:
    (i) 환자로부터 피부 세정물을 얻고
    (ii) 상기 약품을 피부 세정물과 접촉시키고
    (iii) 단백질 가수 분해 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 단계 (iii)에서의 단백질 가수 분해 활성의 억제는 자이모그래피(zymography) 또는 효소 에세이로 결정하는 방법.
  39. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료 방법으로, (i) 상기 피부 병변 부위로부터 피부 세정물을 얻고, 메탈로프로테아제 활성의 존재가 확인되면, (ii) 상기 피부 병변에 아우레오리신 억제제를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료 방법으로, (i) 상기 피부 병변 부위에서 스타필로코코스 아우레우스의 존재를 결정하고, 스타필로코커스 아우레우스의 존재가 확인되면, (ii) 상기 피부 병변에 아우레오리신 억제제를 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료를 위한 국소 약제의 제조에서의 아우 레오리신 억제제의 용도로, 상기 피부 병변은 스타필로코커스 아우레우스를 함유하는 것으로 미리-결정된 용도.
  42. 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로 하는 포유류에서의 염증성 피부 병태와 관련된 피부 병변의 치료를 위한 국소 약제의 제조에서의 아우레오리신 억제제의 용도로, 상기 피부 병변은 메탈로프로테아제 활성을 함유하는 것으로 미리-결정된 용도.
  43. 제 39항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 또한 내인성 메트진신 메탈로프로테아제 억제제인 용도 또는 방법.
  44. 제 1항 내지 제 29항 및 제 36항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아우레오리신 억제제는 아우레오리신 II 억제제인 용도, 방법 또는 조성물.
KR1020087006597A 2005-08-31 2006-08-31 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신억제제의 용도 KR20080055852A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0517685A GB0517685D0 (en) 2005-08-31 2005-08-31 Novel method
GB0517685.4 2005-08-31
GB0613954A GB0613954D0 (en) 2006-07-14 2006-07-14 Novel Method
GB0613954.7 2006-07-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080055852A true KR20080055852A (ko) 2008-06-19

Family

ID=37397444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087006597A KR20080055852A (ko) 2005-08-31 2006-08-31 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신억제제의 용도

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20070049518A1 (ko)
EP (1) EP1931624A1 (ko)
JP (1) JP2009506098A (ko)
KR (1) KR20080055852A (ko)
AU (1) AU2006286497A1 (ko)
BR (1) BRPI0615588A2 (ko)
CA (1) CA2620022A1 (ko)
IL (1) IL189754A0 (ko)
NO (1) NO20081000L (ko)
WO (1) WO2007025999A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100160368A1 (en) 2008-08-18 2010-06-24 Gregory Jefferson J Methods of Treating Dermatological Disorders and Inducing Interferon Biosynthesis With Shorter Durations of Imiquimod Therapy
MX346455B (es) 2008-12-19 2017-03-21 Medicis Pharmaceutical Corp Formulaciones de imiquimod de baja concentracion de dosis y regimenes de dosis de corta duracion para tratar queratosis actinica.
WO2011008324A1 (en) 2009-07-13 2011-01-20 Graceway Pharmaceuticals, Llc Lower dosage strength imiquimod formulations and short dosing regimens for treating genital and perianal warts
US9364485B2 (en) 2009-08-31 2016-06-14 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Topical formulations comprising a steroid
EP2637679A4 (en) * 2010-11-09 2015-09-23 Univ Chicago ROLE OF ADAM10 AND ITS RELEVANCE AT THE PATHOLOGICAL AND THERAPEUTIC LEVEL
JP6039807B2 (ja) * 2012-08-15 2016-12-07 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー ヒトエックスビボ皮膚モデル及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法におけるその使用
US20160184431A1 (en) * 2014-03-11 2016-06-30 Promius Pharma Llc Topical compositions comprising a corticosteroid
KR20180012256A (ko) * 2015-04-10 2018-02-05 오레곤 스테이트 유니버시티 피부 리피도믹 어세이
CA3072772A1 (en) * 2017-08-31 2019-03-07 The Regents Of The University Of California Molecular bacteriotherapy to control skin enzymatic activity
CN107827961B (zh) * 2017-10-11 2020-05-26 深圳市南山区人民医院 用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5183900A (en) * 1990-11-21 1993-02-02 Galardy Richard E Matrix metalloprotease inhibitors
CA2058797A1 (en) * 1991-02-01 1992-08-02 Michael John Broadhurst Amino acid derivatives
WO1997009066A1 (fr) * 1995-09-08 1997-03-13 Kanebo, Ltd. INHIBITEUR DE SOLUBILISATION DE LIGAND Fas
US20020025925A1 (en) * 1996-09-20 2002-02-28 Wood Lars Michael Combination therapy
US6281245B1 (en) * 1996-10-28 2001-08-28 Versicor, Inc. Methods for solid-phase synthesis of hydroxylamine compounds and derivatives, and combinatorial libraries thereof
US6713074B2 (en) * 2000-06-29 2004-03-30 Quick Med Technologies Inc. Cosmetic composition and method
FR2823117A1 (fr) * 2000-11-14 2002-10-11 Pharmascience Lab Composition pharmaceutique ou cosmetique ainsi que l'utilisation d'au moins un compose actif pour inhiber la migration des cellules de langerhans
US6861504B2 (en) * 2001-05-03 2005-03-01 Cbr, Inc. Compounds and methods for the modulation of CD154
FR2834216B1 (fr) * 2001-12-27 2004-04-30 Pharmascience Lab Composition cosmetique ou pharmaceutique comprenant au moins une oxazoline pour inhiber la migration des cellules de langerhans, et ses utilisations
FR2834213B1 (fr) * 2001-12-27 2004-06-04 Pharmascience Lab Composition cosmetique ou pharmaceutique comprenant au moins une alcanolamide pour inhiber la migration des cellules de langerhans, et ses utilisations
GB0311228D0 (en) * 2003-05-16 2003-06-18 Celltech R&D Ltd Assay

Also Published As

Publication number Publication date
NO20081000L (no) 2008-05-26
IL189754A0 (en) 2008-08-07
EP1931624A1 (en) 2008-06-18
JP2009506098A (ja) 2009-02-12
AU2006286497A1 (en) 2007-03-08
BRPI0615588A2 (pt) 2011-05-24
WO2007025999A1 (en) 2007-03-08
US20070049518A1 (en) 2007-03-01
CA2620022A1 (en) 2007-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080055852A (ko) 스타필로코커스 아우레우스에 의한 콜로니화를 특징으로하는 염증성 피부 병태의 치료를 위한 아우레오리신억제제의 용도
Hu et al. Curcumin reduces Streptococcus mutans biofilm formation by inhibiting sortase A activity
KR100530683B1 (ko) 세린 프로테이나제 억제 활성을 갖는 소수성 테트라사이클린을 포함하는 약제학적 조성물
US9169315B2 (en) Heparin cofactor II fragments with anti-inflammatory and anti-coagulant activity
JP2018111710A (ja) 芳香族系陽イオンペプチド及びその使用
US11773154B2 (en) Compositions and methods for treatment of Netherton Syndrome with LEKTI expressing recombinant microbes
US10653679B2 (en) Compositions and methods for inhibiting bacterial growth
KR102456795B1 (ko) 세타-디펜신들로 염증성 프로테아제들의 차단
KR20110132938A (ko) 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
Morty et al. Characterisation of the antitrypanosomal activity of peptidyl α-aminoalkyl phosphonate diphenyl esters
CN112118861A (zh) 修饰的PlySs2溶素及其用途
JP2012519710A (ja) 細胞遊走を調整するための組成物、及び方法
Wang et al. Scutellarin potentiates vancomycin against lethal pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus through dual inhibition of sortase A and caseinolytic peptidase P
Wells et al. Calpain inhibitors as potential treatment for stroke and other neurodegenerative diseases: recent trends and developments
AU759639B2 (en) Application of enzyme prodrugs as anti-infective agents
RU2620070C2 (ru) Модифицированные пептиды и их применение для лечения аутоиммунных заболеваний
EP1545287A2 (en) Vasoregulating compounds and methods of their use
Papatheodorou et al. An Updated View on the Cellular Uptake and Mode-of-Action of Clostridioides difficile Toxins
CN101356152A (zh) 金黄色葡萄球菌金属蛋白酶抑制剂在治疗特征为金黄色葡萄球菌定殖的炎性皮肤病中的用途
JP6326232B2 (ja) 関節症の処置のためのアミノスタチン誘導体
MX2008002914A (en) Use of an aureolysin inhibitor for the treatment of inflammatory skin conditions characterised by colonisation with staphylococcus aureus
DE102004028899B4 (de) Verwendung einer Kombination zur präventiven und/oder therapeutischen Behandlung von bakteriell bedingten Infektionserkrankungen oder der Sepsis
US5833946A (en) Dissemination of fungal infections: animal model and method of prophylaxis
WO1991015121A1 (en) Method for treating fungal infection
Peppard et al. Effect of selective and non-selective cysteine protease inhibitors on the intracellular processing of interleukin 6 by HepG2 cells

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid