KR20180012256A - 피부 리피도믹 어세이 - Google Patents
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Abstract
대상의 지질 불균형을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상으로부터 얻어진 피부 표면 샘플을 포함하는 하나 이상의 테이프 스트립을 제공하는 단계; 상피 지질을 추출하는 단계; 상기 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계; 및 대조군에 대하여 지질의 조성을 비교하는 단계를 포함한다. 대조군에 비교된 지질 조성의 차이는 대상에서 지질 불균형을 확인한다. 예를 들어 감염을 치료하거나 또는 예방하고, 물 손실을 방지하고, 수화 개선 및 장벽을 부활시키기 위하여 대상의 피부에서 지질 결핍증을 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 대상으로부터 얻어진 피부 샘플에서 하나 이상의 지질 결핍증을 확인하는 단계; 상기 하나 이상의 지질, 이의 유사 지질, 또는 하부세트를을 포함하는 국부적 치료 조성물을 제형화하는 단계; 및 상기 대상에 상기 조성물을 제공하는 단계를 포함한다.
Description
관련
출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 4월 10일에 출원된 U.S. 임시 특허 출원 제 62/146,179의 우선일의 우선권을 주장하며, 이는 전체적으로 여기 참조로서 구체적으로 통합된다.
정부 이익의 성명서
본 발명은 알레르기 및 전염병 국가 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases), 미국국립보건원(National Institutes of Health), 미국보건복지부(Department of Health and Human Services)에 의한 계약/등록 번호 HHSN272201000020C, HHSN272201000017C, UM2AI 1 17870, 및 U19AI 1 17673-01하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
본 개시 내용은 분자 생물학의 분야에 관한 것이며, 특히 피부 질환으로 고통받는 환자의 진단, 모니터링 및 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
모든 포유류는, 피부의 차별화 프로그램(skin's differentiation program)의 본질적 결과로서, 자궁 내 임계적으로 중요한 표피투과장벽(epidermal permeability barrier, EPB)을 발달시킨다. 유아에서는, 만족할 만한 EPB를 구축하는데 실패하는 것은 잠재적으로 생명을 위협하는 문제이다. 약화된 EPB는 해로운 화학물질의 경피 흡수를 증가시킬 뿐만 아니라, 피부를 통한 수분 손실(trans-epidermal water loss)을 증가시켜, 탈수, 체온조절 장애, 및 약한 피부의 원인이 된다. 장벽 결함은 또한 선천성 및 후천성 만성 염증성 피부 질환, 예를 들어 건선 및 아토피 피부염 (AD)의 원인이다. 2012년에, 대략 15,000,000 미국인들은 아토피 피부염으로 고통받는 것으로 추산되었으며, 이는 피부과를 방문하는 모든 방문자들의 대략 10-20%이고 연간 추정된 헬스케어 비용이 10억을 넘는다.
글루코코르티코이드는 현재 AD 치료를 위한 대부분의 처방약이며, 피부 염증을 줄이기 위하여 오랫동안 사용되어 왔다. 그러나, 글루코코르티코이드 자체의 투여는 시간에 따라 피부를 얇게 하여 상피 장벽 기능을 악화시킬 수 있다. 게다가, 약제학적 산업은 보다 강력한 글루코코르티코이드류를 성공적으로 시장화하였으나, 현재까지도 상피 장벽 기능을 효과적으로 개선하는데 사용될 수 있는 약물들을 성공적으로 개발하지 못하였다.
그러므로, 인도주의적 및 경제적 이유로, 이들 피부 장벽 결함 및 관련된 염증성 피부 질환에 대한 새롭고 효과적인 치료법을 개발하고, 치료적 개입으로 영향받은 환자의 건강을 개선하는데 도움이 되는 근본적인 분자 메커니즘을 기술하는 것이 중요하다.
실시예는 첨부하는 도면 및 첨부된 청구범위와 함께 다음 상세한 설명에 의해 용이하게 이해될 것이다.
실시예들은 예시의 방법으로 설명된 것이며, 첨부된 도면에서의 도에 의해 제한되는 것이 아니다.
도 1은 대상의 각질층(Stratum corneum, SC) 지질의 분리 및 캐릭터리제이션(characterization)을 위한 단계들을 설명하는 플로우 다이어그램이다.
도 2A 및 2B는 정상 대 아토피 피부염(AD) 대상의 지질에 대해 검출된 피크들의 대표적인 LC MS/MS 데이터를 설명하는 질량 스펙트럼이다.
도 3A 및 3B는 정상 대상(3A) 및 AD 대상(3B)에서 특정 긴 사슬 세라마이드 [EOS]C70에 대한 검출된 피크의 대표적인 LC MS/MS 데이터의 그래프이다.
도 4A 및 4B는 내부표준(Internal Standard)으로 정상화한 후 정상 및 AD 대상에서 포화된 세라마이드의 상대적 준위를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 5는 내부표준으로 정상화한 후 정상 및 AD 대상에서 불포화된 세라마이드의 상대적 준위를 설명하는 막대 그래프이다.
도 6A-6D는 AD 대상에서 SC 불포화된 세라마이드가 통계적으로 중요한 증가를 나타내는 플롯 세트이다.
도 7A-7D는 AD 대상에서 변형된 SC 불포화된 세라마이드를 설명하는 플롯 세트이다. 원형화된 AD 하부 그룹은 불포화된 세라마이드의 준위가 줄어들였다.
도 8A 및 8B는 AD 대상의 선택된 하부 집단에서 변형된 SC 스핑고신을 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 9A-9D는 AD 대상의 선택된 하부 집단에서 변형된 SC 유리 지방산(Free Fatty Acid)를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 10A-10D는 AD 대상에서 평균 SC FFA 분포를 설명하는 플롯 세트이다.
도 11A-11C는 AD 하부 집단에서 변형된 SC 콜레스테롤 및 콜레스테롤-설페이트를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 12A-12F는 AD-S. 아우레우스 -(AD-S. Aureus -) 및 AD-S. 아우레우스 + 대상 사이의 지질 함량을 설명하는 막대 그래프 및 플롯 세트이다.
도 13A-13F는 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스 + 대상 사이의 지질 함량 차이를 설명하는 막대 그래프 및 플롯 세트이다.
도 14A-14D는 건강한 비-아토피(NA), AD-S 아우레우스 - 및 AD-S 아우레우스 + 대상에서 기저 TEWL, 혈청 TARC, IgE 준위 및 호산구 계수를 설명하는 플롯 세트이다. 박스 플롯은 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스 + 환자 및 건강한 개인을 포함하는 모든 AD 대상에서 기저 TEWL(도 14A), 혈청 TARC (도 14B), IgE 준위(도 14C) 및 호산구 계수(도 14D)가 증가된 것을 나타낸다. 혈청 TARC 및 IgE 준위에 대하여 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스+ 사이에 큰 차이가 관찰되었다. 매우 낮은 값(0.)의 TARC를 갖는 하나의 대상과, 기술적 실수로 인한 AD-S. 아우레우스 - 집단에서의 낮은 값(0.)의 호산구 계수를 갖는 또 다른 대상은 제거되었다. 모든 데이터는 로그-변형되고 연령 및 성에 대하여 조절되었다. *P<0.05; **P<0.01 , ***P<0.001 .
도 1은 대상의 각질층(Stratum corneum, SC) 지질의 분리 및 캐릭터리제이션(characterization)을 위한 단계들을 설명하는 플로우 다이어그램이다.
도 2A 및 2B는 정상 대 아토피 피부염(AD) 대상의 지질에 대해 검출된 피크들의 대표적인 LC MS/MS 데이터를 설명하는 질량 스펙트럼이다.
도 3A 및 3B는 정상 대상(3A) 및 AD 대상(3B)에서 특정 긴 사슬 세라마이드 [EOS]C70에 대한 검출된 피크의 대표적인 LC MS/MS 데이터의 그래프이다.
도 4A 및 4B는 내부표준(Internal Standard)으로 정상화한 후 정상 및 AD 대상에서 포화된 세라마이드의 상대적 준위를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 5는 내부표준으로 정상화한 후 정상 및 AD 대상에서 불포화된 세라마이드의 상대적 준위를 설명하는 막대 그래프이다.
도 6A-6D는 AD 대상에서 SC 불포화된 세라마이드가 통계적으로 중요한 증가를 나타내는 플롯 세트이다.
도 7A-7D는 AD 대상에서 변형된 SC 불포화된 세라마이드를 설명하는 플롯 세트이다. 원형화된 AD 하부 그룹은 불포화된 세라마이드의 준위가 줄어들였다.
도 8A 및 8B는 AD 대상의 선택된 하부 집단에서 변형된 SC 스핑고신을 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 9A-9D는 AD 대상의 선택된 하부 집단에서 변형된 SC 유리 지방산(Free Fatty Acid)를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 10A-10D는 AD 대상에서 평균 SC FFA 분포를 설명하는 플롯 세트이다.
도 11A-11C는 AD 하부 집단에서 변형된 SC 콜레스테롤 및 콜레스테롤-설페이트를 설명하는 막대 그래프 및 플롯이다.
도 12A-12F는 AD-S. 아우레우스 -(AD-S. Aureus -) 및 AD-S. 아우레우스 + 대상 사이의 지질 함량을 설명하는 막대 그래프 및 플롯 세트이다.
도 13A-13F는 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스 + 대상 사이의 지질 함량 차이를 설명하는 막대 그래프 및 플롯 세트이다.
도 14A-14D는 건강한 비-아토피(NA), AD-S 아우레우스 - 및 AD-S 아우레우스 + 대상에서 기저 TEWL, 혈청 TARC, IgE 준위 및 호산구 계수를 설명하는 플롯 세트이다. 박스 플롯은 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스 + 환자 및 건강한 개인을 포함하는 모든 AD 대상에서 기저 TEWL(도 14A), 혈청 TARC (도 14B), IgE 준위(도 14C) 및 호산구 계수(도 14D)가 증가된 것을 나타낸다. 혈청 TARC 및 IgE 준위에 대하여 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우스+ 사이에 큰 차이가 관찰되었다. 매우 낮은 값(0.)의 TARC를 갖는 하나의 대상과, 기술적 실수로 인한 AD-S. 아우레우스 - 집단에서의 낮은 값(0.)의 호산구 계수를 갖는 또 다른 대상은 제거되었다. 모든 데이터는 로그-변형되고 연령 및 성에 대하여 조절되었다. *P<0.05; **P<0.01 , ***P<0.001 .
다음 상세한 설명에서, 일부를 형성하는 첨부된 도면을 참조로 하며, 실시된 실시예들은 설명의 방법으로 나타낸 것이다. 다른 실시예들이 사용될 수 있으며 구조적 또는 논리적 변형은 본 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 분명하다. 그러므로, 다음 상세한 설명은 제한된 의미로 사용되지 않으며, 본 실시예의 범위는 첨부된 청구항 및 이들의 등가물에 의해 정의된다.
다양한 작용은 실시예를 이해하는데 도움이 될 수 있는 방법으로 차례로 다중의 별개 작용으로 설명될 수 있으나; 그러나, 설명의 순서는 이들 작용의 순서가 종속적이라는 것을 의미하는 것으로 구성되어서는 안된다.
설명의 목적으로, "A/B" 형태 또는 "A 및/또는 B" 형태에서 문구는 (A), (B), 또는 (A 및 B)를 의미한다. 설명의 목적을 위하여, "A, B, 및 C 중 적어도 어느 하나" 형태 문구는 (A), (B), (C), (A 및 B), (A 및 C), (B 및 C), 또는 (A, B 및 C)를 의미한다. 설명의 목적을 위하여, "(A)B" 형태 문구는 (B) 또는 (AB)를 의미하며, 즉 A는 선택적 구성요소이다.
명세서는 용어 "실시예" 또는 "실시예들"를 사용할 수 있으며, 이는 각각 하나 이상의 같거나 또는 다른 실시예를 의미할 수 있다. 게다가, 용어 "포함하는", "함유하는", "갖는" 및 이와 같은 것들은, 실시예에 관련하여 사용된 것으로서, 동의어이며, 일반적으로 "개방형" 용어로서 의도된 것이다(예를 들어, 용어 "함유하는"은 "이에 한정되지는 않지만 포함하는"으로 해석되어야만 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야만 하며, 용어 "포함하다"는 "이에 한정되지는 않지만 포함하다"로서 해석되어야만 한다). 용어 "환자" 및 "대상"은 여기서 교체가능하게 사용되고 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 하나의 실시예에서, 환자 또는 대상은 포유류, 예를 들어 인간이다.
임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 당해 기술분야의 통상의 기술자들은 문맥 및/또는 적용시 적당하게 복수가 단수로 및/또는 단수가 복수로 해석될 수 있다. 상기 다양한 단수/복수 치환은 명확성을 위하여 명백하게 기술할 수 있다.
다르게 지적하지 않는 한, 기술 용어는 종래 관례에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 공통 용어의 정의는 다음에서 발견될 수 있다: Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones 및 Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471 185710); 및 다른 유사 참조문헌.
이 개시 내용의 실현 또는 시험을 위한 적당한 방법 및 물질이 이하 기술되어 있다. 그러한 방법 및 물질은 단지 설명을 위한 것이며, 제한하고자 의도된 것이 아니다. 여기 설명된 것들과 유사하거나 또는 등가의 다른 방법 및 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기 개시되어 있는 것과 관련되어 있는 당해 기술분야에 잘 알려진 종래 방법은 다양하고 일반적이며 보다 구체적 참조 문헌, 예를 들어 다음을 포함하는 문헌에 설명되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 콜드 Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001 ; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; and Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. 게다가, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며 제한하고자 하는 것은 아니다.
몇가지
실시예의
설명
아토피 피부염 (AD)는 방해된 상피 장벽 기능에 의해 특성화된 만성 염증성 피부 질환이다. 포도상구균 아우레우스 (S. aureus) 감염은 AD를 악화시킨다. 상피 각질층 (SC)는 사세포(comecytes) 및 지질-풍부한 세포외 매트릭스를 포함한다. SC의 지질 구성은 세라마이드(CERs), 유리 지방산 (FFAs), 콜레스테롤 및 트리글리세라이드(TGs)를 포함하는 다른 것들을 포함한다. 지질은 피부 장벽 유지에서 중요한 역할을 하고 신체가 수화를 위하여 습기를 보유하게 돕고 외부 자극 및 감염에 대하여 신체를 보호하는 것을 돕는다. 그러나, 모든 개별 대상의 지질 조성물은 다른 것과 약간 다르다. 본 개시 전에는 개별 대상의 지질 조성물에서의 변화 또는 비정상을 검출하기 위한 표준 도구 또는 방법론이 없었다. 게다가, 그러한 변화 또는 비정상성을 완화시키는 방법이 부족하다.
리피도믹의 힘을 사용하여, 발명자들은 인간 피부의 지질을 측정하여, 대상 피부 내에 존재하는 지질의 조성에서의 불균형을 특성화하는 지질 프로파일을 만들었다. 발명자들은, 건강한 대조군에 대하여, 아토피 피부염 및/또는 S. 아우레우스 균체 형성을 포함하는, 피부 상태를 갖는 대상의 지질 대사체(lipid metabolome)를 비교하였다. 그러한 리피도믹 신호들, 또는 지질 프로파일은 대상이 특정 치료, 예를 들어 지질 보충-약물 요법(lipid add-back therapy)으로부터 이익을 얻는지 여부를 결정하는 것을 용이하게 하고 그러한 요법에 맞춤화된 접근법을 위한 도구를 제공한다.
대사체학(Metabolomics)은 세계적 수준의 신진대사의 연구이다. 이것은 대사체의 체계적 연구, 세포, 조직 또는 유기체 내 존재하는 소분자의 완전한 레퍼토리와 관련이 있다. 대사체학의 부분 집합은 리피도믹이며, 이는 피부와 같은 생물학적 샘플 내에서 지질 대사물질의 평가에 적용하는 것으로서의 대사체학의 사용을 의미한다. 지질 프로파일링은 일반적으로 하나 이상의 지질 부류(예를 들어, 유리 지방산, 트리글리세라이드, 콜레스테롤 및 세라마이드)에서 지질 대사산물의 평가와 관련이 있다.
발명자들은 대상 피부의 변형된 지질 조성이 손상된 보호 장벽 기능을 유도할 수 있으며, 이는 피부 염증 및 습진의 시작 및 진행뿐만 아니라 S. 아우레우스 감염과 같은 감염에 대한 민감성을 유도할 수 있다는 것을 확립하였다. 피부의 변형된, 또는 비정상의, 지질 조성은 손상된 보호 장벽 기능을 유도할 수 있고, 이는 피부 염증 및 습진의 개시 및 진행뿐만 아니라, S. 아우레우스 균체 형성과 같은 세균 균체 형성을 유도할 수 있다. 그러므로, 피부 지질 조성을 측정하는 것은, 염증성 피부 질환(예를 들어 습진, 또는 건선)에 민감하거나 이들 질환을 갖는 다른 개인 또는 대상(예를 들어, 고양이, 개, 인간 등)에서 지질 조성의 변화를 검출하기 위한 도구 또는 방법륜을 제공한다.
발명자들의 예상치 못한 발견은, 습진 환자의 피부에서 변형된 지질 조성이 이들의 질병 심각도의 결정 요인이며, 이들 질병의 개시 및 진행에 원인적으로 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 발명자들은, 피부 지질 조성을 측정하는 것은 인간에서 AD 발병의 시작을 검출하고 및 AD 서브타입을 특성화하는, 빠르고, 신뢰성 있고, 재생산가능하고, 비침습성 도구를 제공한다. 게다가, 개별 대상의 피부 지질 조성을 분석하는 것은, 대상에 대해, 맞춤화된 치료, 치료법 및 조성과 같은 맞춤화된 제약 기술을 재단하는데 사용될 수 있다. 개시된 방법은 비침습성 방법으로 정상, 아토피 피부염(AD), 또는 습진 대상의 상피 지질을 분리하여, 분리된 피부 표면 지질을 제공하는 단순한 일-단계(one-step) 방법을 제공할 수 있다. 실시예에서, 상기 방법들은, 예를 들어 비침습성 테이프 스트리핑 방법(non-invasive tape stripping method)에 의해 수습된 것으로서, 제한된 수의 사세포로부터 피부 지질의 분리를 위한 빠르고, 간단하고 신뢰성 있는 일-단계 방법이다. 이 표준화된 방법은, 예를 들어 LC-MS/MS 다중 반응 모니터링(MRM) 기술을 사용하여 비표적화된 리피도믹을 통해 피부 지질을 특징화하는데 사용될 수 있다. 예시적 방법은 도 1에 보여진다.
대상의 피부에서 지질 불균형, 예를 들어 대상 피부의 지질 프로파일에서의 불균형을 결정하는 방법이 개시되어 있다. 상기 개시된 방법은, 대상으로부터 얻어진 피부 표면 샘플을 포함하는, 대상의 하나 이상의 피부 샘플을 얻거나 또는 제공하는, 예를 들어 하나 이상의 테이프 스트립을 제공하는 것을 포함한다. 피부 샘플은 각질층의 세포 및/또는 지질을 포함한다. 테이프 스트리핑은 각질층(SC) 샘플 수집을 위한 비침습성 및 빠른 방법이다. 테이프 스트립은 전형적으로 동일한 크기 및 면적이 필요한 직사각형 또는 원형이고 동일한 압력 도구의 도움으로 적용되어야만 한다. 지질은 피부 샘플로부터 추출되고 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성이 검출된다. 샘플에서 지질의 검출된 조성은 대상 피부의 지질 프로파일을 제공하며, 이는 대상 피부가 지질 불균형, 예를 들어 정상 대상의 피부에 존재하는 지질의 함량 및/또는 류, 타입, 또는 하부타입에 비해 지질 불균형을 갖는지 여부를 결정하는데 사용된다.
실시예에서, 지질의 조성, 또는 지질 프로파일은 대조군에 대하여 비교된다. 대조군에 비교된 지질 조성의 차이는 대상의 지질 불균형을 확인한다. 불균형은 특정 지질, 또는 지질류가 증가될 수 있다. 역으로, 지질 불균형은 특정 지질, 또는 지질류의 감소, 또는 일부 지질의 증가 및 다른 지질의 감소일 수 있다. 실시예에서, 검출된 변화는 대조군, 예를 들어 기준값 또는 건강한 대조군 대상에 비교된 지질의 준위가 증가 또는 감소이다. 샘플에 대한 비교를 위한 대조군 또는 표준은, 정상적인 것으로 믿어지는 샘플들뿐만 아니라 실험 값들(예를 들어, 값들의 범위)을 포함하며, 그러한 값들은 실험실마다 달라질 수 있다는 것을 주의한다. 실험실 표준 및 값은 알려지거나 또는 결정된 집단 값을 기초로 설정될 수 있으며, 측정된, 실험적으로 결정된 값의 비교를 가능하게 하는 그래프 또는 표의 포맷으로 공급될 수 있다. 대조군은 대상 또는 환자(또는 복수의 환자들)로부터 얻어진 샘플과 같은, 시험 샘플과의 비교를 위해 사용된 샘플 또는 표준일 수 있다. 일부 실시예에서, 대조군은 건강한 환자(또는 복수의 환자들)(또는 "정상" 대조군으로 의미)로부터 얻어진 샘플이다. 일부 실시예에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 값(예를 들어, 정상 대상 또는 대상들 내 기준치(baseline) 또는 표준 값들과 같은 기준치 또는 표준 값을 대표하는 이전에 시험된 대조군 샘플 또는 샘플 집단)이다. 일부 실시예에서, 상기 대조군은 복수의 환자 샘플들(예를 들어 정상 환자의 피부에서 지질의 평균 값 또는 지질의 값들의 범위)로부터 얻어진 평균값(또는 평균 값들의 범위)를 나타내는 표준 값이다.
일부 실시예에서, 상기 지질 불균형은 하나 이상의 지질에서 진단적으로 중요한 변화이다. 여기 사용된 것으로서 "진단적으로 중요한 변화"는 한 환자 집단(예를 들어 DA로 고통받지 않는 대상으로부터 DA로 고통받는 대상)과 다른 집단을 구별할 수 있도록 충분한 생물학적 샘플 내에서의 하나 이상의 지질의 준위가 증가 또는 감소하는 것을 의미한다. 일부 실시예에서, 진단적으로 중요한 변화는 대조군에 비하여, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 8-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 또는 적어도 40-배이다. 일부 실시예에서, 검출된 증가 또는 감소는 대조군 또는 표준에 비하여 적어도 2-배의 증가 또는 감소이다.
상기 지질 프로파일은 AD(예를 들어, 습진)의 다른 하부-타입 및 하부 집단을 확인하고 대상 특이적(맞춤화된) 제형을 고안하는데 양적 형질(quantitative trait)로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 완화제는 특성화된 대상에서 결핍된 것으로 밝혀진 적어도 하나의 지질 또는 유사 지질, 예를 들어 결핍을 보충하는 유사지질을 포함한다. 상기 지질 프로파일은, 민감성 개인에서 AD(예를 들어, 습진)의 시작을 방지하고, 영향받은 개인의 질병 진행, 예를 들어 AD의 진행, 예를 들어 습진 및/또는 S. 아우레우스 감염을 완화시키기 위하여, AD 양성 개인과 같은 개인에서 비정상적 지질 조성을 안정화시킬 수 있는 특정 지질 조성을 갖는 완화제의 제형(크림, 로션 또는 다른 전달 방법들)을 고안하기 위하여 사용될 수 있다.
여기 사용된, 용어 "지질"은 지질류 내 단일 종, 지질류 내 하부집단의 종, 또는 전체 지질류를 의미할 수 있다. 지질은, 왁스, 트리글리세라이드, 유리 지방산, 트리글리세라이드, 디아실글리세르콜(diacylglyercol), 지방산 유래 인지질, 스핑고지질, 예를 들어 세라마이드, 글리콜리피드 및 테르페노이드, 예를 들어 레티노이드, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 스테로이드를 포함하는 생물학적 기원의 상대적으로 수불용해성 또는 비극성 화합물인 다양한 범위의 분자들을 광범위하게 포함하고자 하는 것이다. 일부 지질은 선형 앨리패틱 분자인 반면에 다른 것들은 링 구조를 갖는다.
지질 "류"는 구조적 및/또는 생화학적 성질을 공유하는 지질 분자들의 집단을 의미한다. 따라서, 임의의 류 내의 지질들이 평가될 수 있다. 적당한 지질 류는 극성 및 비극성류의 지질을 포함한다. 예시적인 비극성 지질류는 제한없이 유리 지방산, 모노아실글리세라이드, 디아실글리세라이드, 트리아실글리세라이드, 스테로이드 및/또는 콜레스테롤 에스테르를 포함한다. 예시적 극성 류는 제한 없이 인지질류, 예를 들어 포스파티딘산, 리소포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 카르디올리핀 및/또는 리소카르디올리핀 및 인지질 전구체, 예를 들어세라마이드를 포함한다.
지방산은 비분지된 탄화수소 사슬이며, 단일 결합들만으로(포화된 지방산) 또는 단일 및 이중 결합으로(불포화된 지방산) 연결된다. 포화 지방산의 예는, 이에 한정되지는 않지만, 부티르산, 라우르산, 미리스트산, 펜타데카노익산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키딕산, 베헨산 및 리그노세르산을 포함한다. 불포화 지방산의 예는, 이에 한정되지는 않지만, 리놀렌산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 리놀렌산, 아라키돈산, 올레산, 및 에루스산을 포함한다. 특정 류의 지방산은 오메가-3 지방산(예를 들어, 알파-리놀레익, 스테아리도닉, 에이코사트리에노익, 에이코사테트라에노익, 에이코사펜타에노익, 도코사펜타에노익, 도코사헥사에노익 및 테트라코사헥사에노익 산), 오메가-6 지방산s (e.g., 리놀레익, 감마-리놀레익, 에이코사디에노익, 호모-감마-리놀레닉, 아라키도닉, 도코사디에노익, 도코사테트라에노익 및 4,7, 10,13, 16-도코사펜타에노익 산) 및 오메가-9 지방산(e.g., 미리스트올레익, 팔미트올레익, 박세닉, 올레익, 에이코세노익, 벌꿀주(mead), 에루스산 및 네르본 산)을 포함한다. 다른 지방산은, 플라스말로겐-연결 지방산을 포함하며, 이는 이에 한정되지 않지만, 플라스말로겐 16:0, 플라스말로겐 18:0, 플라스말로겐 18: 1 n7 및 플라스말로겐 18: 1 n9을 포함한다. 다른 지방산은, 이에 한정되지는 않지만, 팔리트엘라이딘산, 엘라이딘산, 8-에이코사에노익산 및 5-에이코사에노익산을 포함한다. 상기 모든 것들은, 이들이 분석된 피부 샘플 내에 있다는 것을 조건으로 개시된 방법으로 검출될 수 있다.
세라마이드 (CER)는 왁스성 지질 분자의 패밀리이다. 세라마이드는 스핑고신 및 지방산으로 구성된다. 세라마이드는 세포의 세포막 내에서 높은 농도로 발견된다. 이들은 지질 2중층 내에 주요 지질들 중 하나인, 스핑고미엘린을 제조하는 성분 지질들 중 하나이다. 특정 류의 세라마이드는 CER [EOdS], CER [EOS], CER [EOP], CER [EOH], CER [OdS], CER [OS], CER [OP], CER [OH], CER [NdS], CER [NS], CER [NP], CER [NH], CER [AdS], CER [AS], CER [AP], CER [AH], 및 CER [EO]을 포함한다. 상기 모든 것들은 이들이 분석된 피부 샘플 내에 존재한다는 것을 조건으로 개시된 방법으로 검출될 수 있다.
트리글리세라이드(TG, 트리아실글리세롤, TAG 또는 트리아실글리세라이드)는 글리세롤 및 3개 지방산(트리 + 글리세라이드)로부터 유래된 에스테르이다. 트리글리세라이드는 인간 및 동물뿐만 아니라 식물의 신체 지방의 주요 구성 성분이다. 많은 다른 타입의 트리글리세라이드가 있으며, 포화 또는 불포화된 타입들 사이에 많은 분할들이 있다. 포화된 지방은 수소로 "포화"되며-수소 원자가 탄소 원자에 결합될 수 있는 모든 이용가능한 장소가 점유된다. 이들은 보다 높은 녹는 점을 갖고 실온에서 보다 고체가 되는 경향이 있다. 불포화된 지방은 일부 탄소 원자들 사이에 이중 결합들을 가지며, 수소 원자들이 탄소 원자에 결합할 수 있는 수 많은 장소들을 줄인다. 이들은 보다 낮은 녹는점을 갖고 실온에서 액체로 되는 경향이 있다. 상기 모든 것들은 이들이 분석된 피부 샘플 내에 존재한다는 것을 조건으로 개시된 방법으로 검출될 수 있다.
다른 류의 지질 내로 통합된 지방산류 또는 지방산 모이어티의 분석은, 이에 한정되지는 않지만 사슬 길이, 포화/탈포화의 정도 및/또는 존재하는 임의의 이중-결합의 위치를 포함하는 임의의 특성을 평가할 수 있다. 사슬 길이와 관련하여, 지질 프로파일은 짧은(8 탄소보다 작음), 중간-(8 내지 14 탄소), 긴(예를 들어, 14 내지 18 탄소) 및 매우 긴(e.g., 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 또는 그 이상 탄소) 지방산, 선택적으로 포화/탈포화의 평가와 함께 평가할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 포화된 지방산이 검출된다. 다른 실시예에서, 모노- 및/또는 폴리-(즉, 2개 이상의 불포화된 결합) 불포화된 지방산이 평가된다. 불포화된 결합의 위치는 또한, 예를 들어 오메가-3 (i.e., n3), 오메가-6 (i.e., n6) 및/또는 오메가-9 (i.e., n9)가 평가될 수 있다. 지방산은 3, 6 또는 9 위치에 각각 이중 결합을 갖는다. 게다가, 불포화된 지방산 내의 시스 또는 트랜스 결합의 존재가 평가될 수 있다. 특정 실시예에서, 지질 프로파일은 지방산 모이어티, 예를 들어 세라마이드 또는 트리글리세라이드를 포함하는 지질을 함유한다. 일부 실시예에서, 진단 및/또는 예후 지질 프로파일은 하나 이상의 유리 지방산을 포함할 수 있다. 추가 선택으로서, 상기 지질 프로파일은 하나 이상의 지질류 내의 특정 유리 지방산 및/또는 지방산 구성 성분을 평가할 수 있다. 지질 프로파일 내에서 평가될 수 있는 유리 지방산 및 지방산 모이어티는, 이에 한정되지는 않지만 다음을 포함한다: 14:0, 15:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 20:0, 22:0, 24:0, 38:0, 40:0, 46:1, 48:0, 48:2, 50:1, 50:2, 50:3, 52:0, 54:0, 58:2, 66:0, 68:0, 70:0, 14:1n5, 16:1n7, 18:1n7, 18:1n9, 20:1n9, 20:3n9, 22:1n9, 24: 1n9, 18:2n6, 18:3n6, 14:1n5, 20:1n15, 20:1n12, 18:3n3, 18:4n3, 20:3n3, 20:4n3, 20:5n3, 22:5n3, 22:6n3, 24:6n3, 18:2n6, 24:6n3, 18:2n6, 18:3n6, 20:2n6, 20:3n6, 20:4n6, 22:2n6, 22:4n6, 22:5n6, t16: 1n7, t18: 1n9, t18:2n6, dm16:0, dm18:0, dm18: 1 n9, dm18:1n7, 총 포화된 지방산, 총 모노불포화된 지방산, 총 폴리불포화된 지방산, 총 LC 지방산, 총 n3 (오메가 3) 지방산, 총 n6 지방산, 총 n7 지방산, 총 n9 지방산, 및/또는 총 dm 지방산. 게다가, 상기 지질 프로파일은, 제한없이, 테트라데카노익산, 펜타데카노익산, 헥사데카노익산, 헵타데카노익 산, 옥타데카노익 산, 에이코사노익 산, 도코사노익 산, 테트라코사노익 산, 9-테트라데세노익 산, 9-헥사데세노익 산, 11-옥타데세노익 산, 9-옥타데세노익 산, 11-에이코세노익 산, 5,8,11-에이코사트리에노익 산, 13-도코세노익 산, 15-테트라코세노익 산, 9, 12, 15-옥타데카트리에노익 산, 6,9,12,15-옥타데카테트라에노익 산, 11,14, 17-에이코사트리에노익 산, 8, 11,14,17-에이코식테트라에노익 산, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산, 7,10,13,16,19-도코사펜타에노익 산, 4,7, 10,13,16,19-도코사헥사엔산, 6,9,12,15,18,21 -테트라코스헥사에노익 산, 9,12-옥타데카디에노익 산, 6,9,12-옥타데카트리에노익 산, 11,14-에이코사디에노익 산, 8,11,14-에이코사트리에노익 산, 5,8,11,14-에이코시카테트라에노익 산, 13,16-독사디에노익 산, 7,10,13,16-도코시카테트라에노익 산, 4,7,10,13,16-도코사펜타에노익 산, 9-트랜스-헥사데세노익 산, 9-트랜스-옥타데세노익 산, 8-에이코사에노익 산, 5-에이코사에노익 산, 플라스말로겐 지방산, 5b-콜레스탄-3b-올, 5a-콜레스탄-3b-올, 5-콜레스텐-3b-올, 5,24-콜레스타디엔-3b-올, 5-콜레스탄-25a-메틸-3b-올, 5-콜레스탄-24b-메틸-3b-올, 5-콜레스텐-24b-에틸-3b-올, 및/또는 5,22-콜레스타디엔-24b-에틸-3b-올을 평가할 수 있으며, 보다 큰 지질 분자, 예를 들어 세라마이드 및 트리글리세라이드 내로 통합된 유리 지방산 또는 지방산 모이어티로서 평가할 수 있다. 그러므로, 당해 기술분야의 통상의 기술자는, 다른 지질 류의 보다 큰 지질 분자 내로 통합되는 유리 지방산 또는 지방산 모이어티 내의 존재 여부에 따라, 상기 지질 프로파일이 지방산의 상기 특징들의 임의 조합(예를 들어, 비, 사슬 길이, 포화/탈포화 및 또는 임의 이중 결합의 위치)을 평가할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 지질 프로파일이, 마치 개인 종들이 다양한 조합의 특징들을 구체화한 것처럼, 여기 설명된 특징들의 임의 조합, 예를 들어 류, 사슬 길이, 포화/탈포화 및/또는 임의의 이중-결합의 위치의 임의 조합을 갖는 다른 지질류 내의 지질 분자 내로 통합되는 유리 지방산 및 지방산 모이어티를 평가할 수 있다는 것을 의도한 것이다.
지질 프로파일 내에 검출되고 포함될 수 있는 지질의 실시예는 세라마이드 CER[AH]C38, CER[AH]C48, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68, CER[EOS]C70; 유리 지방산 FFA16: 1 및 FFA18: 1; 트리글리세라이드 TG46:1, TG48:1, TG48:2, TG50:1, TG50:2, TG50:3, TG58:2를 포함한다. 피부 샘플 내에 평가 및/또는 검출될 수 있는 추가적 지질, 및 지질 류는 다음에 설명된 것들을 포함한다: Masukawa et al. J Lipid Res. 2009 Aug;50(8):1708-19; van Smeden et al., Exp Dermatol. 2014 Jan;23(1 ):45-52; Smeden et al., J Lipid Res. 201 1 Jun;52(6):121 1 -21 ; and Janssens et al., J LIpid Res. 2012 Dec;53(12):2755-66, 이들 각각은 참조로서 여기 통합되어 있다. 지질 프로파일 내에 검출 및 포함될 수 있는 지질의 다른 실시예는 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 및 콜레스테롤-설페이트 및 트리글리세라이드를 포함한다.
여기 사용된 "지질 프로파일,"은, 생물학적 샘플 내에 하나 이상의 지질의 평가를 의미한다. 특정 실시예에서, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상, 또는 보다 더 큰 수의 지질들, 예를 들어 1 내지 200, 50 내지 175, 75 내지 125, 또는 약 100 피부 지질을 포함하는 것이 평가된다.(포화된 및 불포화된 세라마이드, 유리 지방산, 콜레스테롤, 콜레스테롤-설페이트, 트리글리세라이드, 스핑고신 및 스핑가닌). 특징화된 지질은 분리된 피부 표면 지질일 수 있다. 2 이상의 지질이 평가되는 실시예에서, 상기 2 이상의 지질은 동일한 류에 속하거나 또는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 그 보다 큰 수의 다른 지질 류에 속할 수 있다. 상기 지질 프로파일은 정량적, 반-정량적 및/또는 정성적일 수 있다. 예를 들어, 지질 프로파일은 지질의 존재 또는 부존재를 평가할 수 있으며, 특정 문턱값 이상 또는 이하의 지질의 존재를 평가할 수 있고, 및/또는 지질의 상대적 또는 절대적 함량을 평가할 수 있다. 샘플 내 모든 지질이 지질 프로파일에 대해 평가될 필요는 없다.
대표 실시예에서, 상기 지질 프로파일은 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상 또는 그 이상 수의 지질이 단일 류 또는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 보다 큰 수의 다른 지질 류 내에서 평가되는 조성 분석을 제공한다. 게다가, 지질 프로파일은 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 보다 큰 수의 다른 류를 평가할 수 있고, 각 류 내의 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상 또는 보다 큰 수의 지질을 평가할 수 있다.
선택적으로, 상기 지질 프로파일은 이의 류 내에서 조성 분석(예를 들어, 지질의 몰 퍼센트(%))을 제공한다. 예를 들어, 상기 지질 프로파일은, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상, 또는 하나 이상의 지질 류(예를 들어, 포화된 및 불-포화된 세라마이드, 유리 지방산, 콜레스테롤, 콜레스테롤-설페이트, 트리글리세라이드, 스핑고신 및 스핑가닌) 내의 지질의 평가(류 내의 몰%의 정량 또는 결정)를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 대상 내의 지질 불균형을 기초로 피부 지질 결핍 카테고리로 대상을 할당하는 단계를 더 포함하여, 예를 들어 지질 불균성을 완화시키기 위하여 치료를 제공할 수 있다. 실시예에서, 상기 대상은 다음 피부 지질 결핍 카테고리들 중 하나에 할당된다: 그룹 I; 그룹 II, 및 그룹 III. 그룹 I 은 FFA 16:1 및 FFA 18:1 (표 1 및 2 참조)을 포함하고, 이들 둘 다는 임의의 다른 지질류 내에서 임의의 중요한 변화 없이 AD 환자들 중 가장 높은 퍼센트(51%)로 감소/결핍된다. 상기 그룹 II 카테고리는 그룹 I 내 2개 지질외 추가로 CER[AH]C48, CER[EOH]C66 및 CER[EOH] C68 지질(그룹 I의 지질에서 중요한 변화없이 AD 대상의 30%에서 결핍)을 포함한다. 이 그룹은 보다 심각한 AD 상태를 갖는 AD 대상 및/또는 그룹 I 지질을 가지고 한 치료에 무반응하는 사람들을 치료하도록 지정된다. 또한, 상기 그룹 II 지질은 보다 높은 퍼센트의 아토피 환자를 포함할 것이다. 상기 그룹 III 카테고리는, 그룹 I 및 II의 모든 지질외에 추가로 CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[AH]C48 및 CER[EOS]C70 지질을 포함한다. 이 그룹은 가장 심각한 AD 상태를 갖는 AD 대상 및 아토피 천식 및 알레르기 비염(아토피 진행의 일부로서)으로 진행하는 질병을 갖는 AD 대상을 치료하기 위하여 고안된다. 상기 지질 모두는 완화제 또는 크림 베이스를 포함하는 오일/물 에멀젼으로 보충한 후 제형에 사용될 수 있다.
개시된 방법은 지질 대사작용하는 유전자의 발현을 확인하기 위하여 전사체(transcriptomic), 프로테오믹(proteomic) 및 GWAS 분석과 함께 더 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 개시된 방법은 예를 들어 변형된 지질 대사산물, 장벽 부전증, 및 AD 발병 사이의 관련성을 분석/성립하기 위하여 전사체, 프로테오믹 및 리피도믹 데이터의 관련성을 결정하기 위하여 또한 사용될 수 있다.
본 개시 내용은 빠르고, 신뢰성 있는, 재생산가능하고 비-침습성 방법으로 포유루의 피부 지질 조성을 검출, 측정, 캐랙터리제이션 또는 모니터링을 위해 제공한다. 실시예에서, 피부 지질 조성의 검출, 측정, 캐랙터리제이션 또는 모니터링은 염증성 피부 질환의 시작을 검출하기 위한 도구를 제공한다. 예를 들어, 본 발명을 제한없이, 염증성 피부 질환은 AD 습진 및 건선을 포함한다. 상기 포유류는 임의의 포유류, 예를 들어 고양이, 개, 인간 등일 수 있다. 실시예에서, 본 개시 내용은 대상에서 다른 하부 타입의 AD, 습진, 건선, 어린선(icthyosis), 니트레토 증후군(Netherton Syndrome), 또는 상피 장벽 부전증과 관련되고 트랜스 상피 수분 손실(TEWL)의 증가에 의해 모니터링된 임의의 다른 피부 질병을 특성화하는데 유용한 포유류의 피부 지질 조성을 검출, 측정, 캐랙터리제이션, 또는 모니터링을 위해 제공한다.
대상은 예를 들어, 고양이, 개, 또는 인간을 포함하는 임의의 포유류일 수 있다. 피부 지질 조성의 검출, 측정, 캐랙터리제이션, 또는 모니터링은 지침서를 제공하고 맞춤화된 약제 또는 치료법에서 사용될 수 있다.
당해 기술분야의 통상의 기술자는, 지질 프로파일이 상대적으로 적은(예를 들어, 하나, 둘, 셋 또는 넷) 지질의 상대적으로 직진 방향(예를 들어 류 내에서 존재, 함량 및/또는 몰%를 검출)일 수 있거나 또는 상당히 복잡할 수 있으며, 수십 또는 수백개의 지질을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 지질 류 내에서 대사 산물의 조성 분석을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 여기 설명된 지질 프로그램 및 방법은 여기 설명된 지질 특성들의 임의 조합을 평가하기 위하여 현실화될 수 있다는 것이 분명할 것이다.
일부 실시예에서, 지질 또는 다중 지질의 준위는 특정 지질 내부 표준에 대하여 정상화된다. 예를 들어, 콜레스테롤 설페이트의 준위는, 내부 표준(예를 들어, 중수소 표지된 콜레스테롤 설페이트)에 대하여 또는 동일한 테이프 스트립으로부터 분리된 총 단백질, 또는 예를 들어, 대상 내에서 다양한 상태에서 상대적으로 안정한 함량으로 지질에 대하여 정상화될 수 있는 지질에 비하여 정상화될 수 있다.
정량적 지질 데이터는 개별 지질 또는 지질의 하부 집단에 대하여 몰 정량적 데이터, 질량 정량적 데이터 및 몰 또는 질량에 의한 관련 데이터(각각 몰% 또는 중량%)을 포함한다. 일부 실시예에서, 리피도믹 분석의 양적 측면은 분석 동안 하나 이상의 양적 내부 표준, 예를 들어 각 지질류에 대한 하나의 표준을 포함하는 것에 의해 제공되고 및/또는 개선될 수 있다. 양적 데이터는 다중 원료(예를 들어 동일한 에세이, 동일한 위치 및/또는 동일한 시간에서 생산될 필요가 없는 데이터)로부터 각각, 별도의, 개별 분석으로 측정된 지질 수와 상관없는 단일의 심리스(seamless) 데이터베이스 내로 통합될 수 있다.
리피도믹 프로파일은 정량적, 반-정량적 및/또는 정성적 분석을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, 정성적 방법은 생물학적 샘플, 예를 들어 추출된 피부 샘플 내에서 지질의 존재 또는 부존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 반-정량적 방법은, 절대적 또는 상대적 수치값을 할당하지 않고, 문턱값 이상의 특정 지질의 준위를 결정하거나 또는 다른 지질의 비를 결정하는데 사용될 수 있다. 정량적 방법은 생물학적 샘플, 예를 들어 추출된 피부 샘플 내 특정 지질의 상대적 또는 절대적 함량을 결정하는데 사용될 수 있다.
반-정량적 방법에서, 문턱값 또는 컷오프값은 당해 기술분야에서 알려진 임의 방법으로 결정될 수 있으며, 선택적으로 소정의 값이다. 특정 실시예에서, 문턱값은, 고정된, 예를 들어 어세이로 이전 경험 및/또는 영향받고 및/또는 영향받지 않은 대상의 집단을 기초로 한 측면에서 선택적으로 미리결정된다. 대안적으로
용어 "미리결정된" 값은, 비록 특정 값이 에세이 중에서 변화하거나 또는 모든 에세이 운전 동안 결정될 수 있다 하더라도 문턱값에 도달하는 방법이 미리 결정되거나 또는 고정된다는 것을 또한 나타낼 수 있다.
리피도믹 분석은 정보학 접근법을 사용하여 평가될 수 있는 고밀도 데이터 세트를 생성할 수 있다. 높은 데이터 밀도 정보학 분석 방법은 알려져 있으며, 소프트웨어는 당해 기술 분야에서 통상의 기술자가 이용가능하며, 예를 들어 클로스터 분석 (Pirouette, Informetrix), 류 예측(class prediction) (SIMCA-P, Umetrics), 계산적으로 모델화된 데이터 세트의 주요 성분 분석(SIMCA-P, Umetrics), 2D 클로스터 분석 (GeneLinker Platinum, Improved Outcomes Software), 및 대사 경로 분석 (biotech.icmb.utexas.edu)들이 있다. 소프트웨어 패키지의 선택은 관심있는 질문들에 대한 특정 도구를 제공한다(Kennedy et al. , Solving Data Mining Problems Through Pattern Recognition. Indianapolis: Prentice Hall PTR, 1997; Golub et al., (1999) Science 286:531 -7; Eriksson et al., Multi and Megavariate Analysis Principles and Applications: Umetrics, Umea, 2001 ). 일반적으로, 임의의 적당한 수학적 분석은 지질 프로파일 중 하나, 둘 이상의 지질을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 방법들, 예를 들어 분산(variance)의 다변량(multivariate) 분석, 다변량 회귀분석(multivariate regression), 및/또는 다중회귀 분석(multiple regression)이 종속 변수(예를 들어, 임상적 측정) 및 독립 변수(예를 들어 지질의 준위) 사이의 관계를 결정하는데 사용될 수 있다. 계층적 및 비계층적 방법을 포함하는 클로스터링뿐만 아니라 비계량형 다차원 척도법(nonmetric Dimensional Scaling)이 변수들 사이 및 이들 변수들에서의 변화들 사이의 관련성을 결정하는데 사용될 수 있다.
게다가, 주요 성분 분석은 연구 규모를 줄이는 일반적 방법이며, 데이터 세트의 분산 공분산 구조(variance-covariance structure)를 이해하는데 사용될 수 있다. 주요 성분들은 다중 회귀 및 클러스터 분석과 같은 분야에 사용될 수 있다. 팩터 분석은 관찰된 변수로부터 숨겨진 변수(hidden variable)를 구축하는 것으로 공분산(covariance)을 설명하는데 사용된다. 팩터 분석은 주요 성분 분석의 연장으로 고려되며, 여기서 주요 성분 분석은 최대우도법(maximum likelihood method)과 함께 파라미터 추정(parameter estimation)으로서 사용된다. 게다가, 단순한 가설, 예를 들어 2개 벡터들 수단의 등가(equality)와 같은 단순한 가설이 Hotelling's T squared statistic을 사용하여 시험될 수 있다.
실시예에서, 피부 표면 샘플로부터 상피 지질을 추출하는 것은 하나 이상의 테이프 스트립을 추출 용매와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서 추출 용매는 비극성 용매, 극성 용매, 예를 들어 극성 양성자성 용매, 및 물, 예를 들어 클로로포름 (CHCI3), 메탄올, 및 물의 혼합물을 포함한다. 비극성 용매의 예는, 다른 것들 중에서 헥산, 시클로-헥산, 톨루엔, 1,4-디옥산, 클로로포름, 디에틸 에테르, 및 디클로로메탄 (DC)이다. 극성 양성자성 용매의 예는 포름산, n-부탄올, 이소프로판올, 니트로메탄, 에탄올, 및 메탄올을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 혼합물에서 클로로포름, 메탄올 및 물의 비는 다른 비들이 효과적으로 사용될 수 있지만, 대략 각각 1:2:0.5이다.
특히 실시예, 상기 지질 프로파일은, 샘플, 예를 들어 피부 샘플 내에서 지질의 약 25% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상을 검출한다.
상기 지질 프로파일은 임의의 적당한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 류의 지질 및 이를 검출하고 선택적으로 정량화하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 박층 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 질량 및 NMR 분광분석법, 및 이들의 임의 조합(e.g., GC/MS), 및 이와 같은 것).
질량 분광분석법은 생물학적 샘플, 예를 들어 여기 설명된 것들로부터 지질을 확인하는데 특히 적당하다. 전형적으로 질량 분광분석법은 샘플(예를 들어 피부 샘플로부터 얻어진 지질을 포함하는 샘플)로부터 기체 상 이온들을 발생시킨다. 기체 상 이온들은 이후 이들의 질량-대-전하 비(m/z)에 따라 분리되며 검출된다. 개시된 방법에 사용되는 증기상 이온을 제조하는 적당한 기술은 제한없이 전자분무이온화 (ESI), 기질-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption-ionization, MALDI), 표면-증강 레이저 탈착-이온화(surface-enhanced laser desorption-ionization, SELDI), 화학 이온화, 및 전자-충격 이온화(electron-impact ionization, El)을 포함한다.
이들의 m/z 비에 따른 이온들의 분리는, 사중극 질량 분석기(quadrupole mass analyzer, (Q)), TOF(time-of-flight) 질량 분석기(예를 들어 선형 또는 반사) 분석기, 자장형(magnetic sector) 질량 분석기, 3D 및 선형 이온 트랩(IT), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 (FT-ICR) 분석기, 및 이들의 조합[예를 들어, 사중극 비행 시간(quadrupole-time-of-flight) 분석기, 또는 Q-TOF 분석기]을 포함하는 임의 타입의 질량 분석기에 의해 수행될 수 있다.
임의 실시예에서, 상기 질량 분광분석 기술은 이중 질량 분광분석법(MS/MS)이고, 피부 샘플로부터 지질의 존재가 검출된다. 전형적으로 이중 질량 분광분석법에서, 이중 질량 분광분석기에 들어가는 지질이 선택되고 충돌 유도 해리 (CID)를 하였다. 얻어진 단편 이온의 스펙트럼은, 소위 CID 스펙트럼으로서 질량 분광분석법의 제2 단계로 기록된다. MS/MS에 대한 적당한 질량 분광분석 시스템은 이온 프레그멘토(ion fragmentor) 및 하나, 둘 이상의 질량 분광분석기, 예를 들어 상술된 것들을 포함한다. 적당한 이온 프레그멘토의 예는, 이에 한정되지 않지만, 충돌 셀(collision cell)(여기서 이온들이 이들을 중성 기체 분자와 충돌시키게 하여 단편화된다), 광 분해 셀(photo dissociation cell)(여기서 이온들은 이들에 광자선을 조사하여 단편화된다), 및 표면 분해 프래그멘토(여기서 이온들을 고체 또는 액체 표면과 충돌시켜 이온들을 단편화시킨다)을 포함한다. 적당한 질량 분광분석 시스템은 또한 이온 반사기(ion reflector)를 포함할 수 있다.
질량 분광 분석법 전에, 샘플은 하나 이상의 규모의 크로마토그래피 분리, 예를 들어 하나 이상의 기체, 액체, 또는 크기 배제 크로마토그래피를 할 수 있다. 크로마토그래피적 분리의 대표적인 예는 종이 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피(TLC), 액체 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 나노-역상 액체 크로마토그래피 (나노-RPLC), 폴리 아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE), 모세관 전기 이동(CE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 또는 다른 적당한 크로마토그래피 기술을 포함한다. 그러므로, 일부 실시예에서, 상기 질량 분광분석 기술은 액체 크로마토그래피 기술, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 나노-액상 액체 크로마토그래피 (나노-RPLC), 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE), 모세관 전기 이동 (CE) 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)과 직접적으로 또는 간접적으로 결합되어, 질량 분광분석 전에 생물학적 샘플을 더 분해한다.
개시된 방법에 따라 사용된 시약(예를 들어, 완충제 및 이와 유사한 것)이 바람직하게 선택되며, 예를 들어 질량 분광 분석에 크게 관여하지 않고, 예를 들어 이중 질량 분광 분석적 방법으로서 바람직하게 선택된다. 바람직하게는, 그러나 필연적이지는 않고, 상기 시약은 상기 분석에 바람직한 특징을 부여하도록 선택된다. 그러한 특징들의 예는, 예를 들어 상기 지질을 휘발시키는데 필요한 에너지를 줄이고, 이온화를 가능하게 하고, 지배적으로 단일하게 전하된 이온을 만들어 내고, 피크 폭을 줄이고, 원하는 분석 생성물의 민감성 및/또는 선택성을 증가시키는 것을 포함한다.
실시예에서, 상기 추출된 샘플 내에 존재하는 지질들의 조성을 검출하는 것은 질량 분광 분석, 크로마토그래피 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시예에서, 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성을 검출하는 것은 미표적화된 리피도믹 접근법을 사용하여 LC-MS/MS를 포함한다. 실시예에서, 초고성능 액체 크로마토그래피 비행 시간(UPLC-TOF)은 높은 준위의 민감도로 정량 수준을 추척하는데 사용된다.
지질 프로파일의 결정 후에, 그 결과, 발견, 진단, 예방 및/또는 치료 권고사항을 대상에 제공될 수 있다. 예를 들어, 그 결과, 발견, 진단, 예방 및/또는 치료 권고사항이 기록되고 기술자, 의사 및/또는 환자, 약사 또는 고객에게 소통될 수 있다. 특정 실시예에서, 컴퓨터는 그러한 정보들을 관심있는 사람들, 예를 들어 고객, 환자 및/또는 참석한 의사들에게 소통하도록 사용될 수 있다. 측정값을 기초로 한, 대상에 투여된 치료법 또는 프로토콜이 시작, 시작되지 않게 변형 또는 재시작될 수 있다. 일부 실시예에서, 출력은 추천된 치료적 요법 또는 피부 케어 프로토콜을 제공할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 시험은 다른 임상 정보의 결정을 포함할 수도 있다.
몇 가지 실시예에서, 피부 상태 또는 질병, 예를 들어 AD, 습진, 및 또는 세균성 감염을 갖거나 또는 진행할 위험이 있는 대상을 확인하는 것은, 결과적으로 의사가 대상, 예를 들어 질병/상태와 관련된 하나 이상의 사인 및 징후를 방지하거나 지연하기 위한 하나 이상의 치료제를 처방하는 것과 같은 대상을 치료하는 것이 된다. 추가 실시예에서, 치료, 복용량 또는 복용 요법은 여기 설명된 방법을 사용하여 얻어진 정보를 기초로 변형된다.
대상은 치료 프로토콜의 효능을 평가하기 위하여 여기 설명된 방법을 사용하여 치료하는 동안 모니터링될 수 있다. 이러한 방법으로, 대상에 주어진 시간 길이 또는 함량은 여기 설명된 방법을 사용하여 얻어진 결과를 기초로 변형될 수 있다. 대상은 재발에 대한 모니터링을 위하여 여기 설명된 방법을 사용하여 치료 및 이에 따른 주어진 치료의 효과 후에 또한 모니터링 될 수 있다. 이러한 방법으로, 치료를 재개할지 여부는 여기 개시된 방법을 사용하여 얻어진 결과를 기초로 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 이 모니터링은 임상적 헬스케어 제공자에 의해 수행될 수 있다. 피부를 통한 수분의 손실(Transepidermal water loss), 혈청 IgE, 호산구(eosinophis) 및/또는 TARC 준위는 질병 진행 및 AD-발병의 완화의 표시로서 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 일단 대상의 지질 프로파일이 결정되면, 프로파일이 임상의 또는 다른 수발하는 사람에게 표시되거나 및/또는 수송될 수 있는 표시이다. 예를 들어, 시험 결과들은 시험 결과들에 관한 정보를 제공하는 지각할 수 있는 출력물로서 사용자(예를 들어, 임상의 또는 다른 헬스케어 노동자, 실험실 연구원 또는 환자)에게 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 출력물은 종이 출력물(예를 들어, 쓰여지거나 또는 인쇄된 출력물), 스크린 상의 디스플레이, 그래프적 출력물(예를, 그래프, 챠트 또는 다른 다이아그램), 또는 들을 수 있는 출력물이다.
다른 실시예에서, 상기 출력물은 수치적 값, 예를 들어 대조군하고 비교된 지질 프로파일 내 특정 세트의 지질 함량이다. 추가적 실시예에서, 상기 출력물은 그래프적 대표, 예를 들어 표준 커브에서 대상으로부터의 샘플 내 지질 세트의 값(예를 들어 함량 또는 상대 함량)을 나타내는 그래프이다. 특정 실시예에서, 상기 출력물(예를 들어 그래프적 출력)은 최선, 차선 또는 결핍된 지질 준위의 존재를 나타내는 컷-오프 값 또는 준위를 나타내거나 또는 제공한다. 일부 실시예에서, 출력물은 사용자에게 전달, 예를 들어 물리적, 청취가능하거나 또는 전자적 수단(예를 들어, 메일, 전화, 팩스, 이메일 또는 전자적 의학 기록의 통신)을 통해 출력물을 제공하는 것으로 소통된다.
상기 출력물은 정량적 정보(예를 들어, 대조군 샘플 또는 값에 비교된 시험 샘플 내 지질의 함량)을 제공하거나 또는 정성적 정보(예를 들어, 지질류 또는 유형에서 결핍성 진단)을 제공할 수 있다. 추가적 실시예에서, 출력물은 샘플 내 특정 지질의 상대적 함량과 관련된 정성적 정보, 예를 들어 대조군에 대한 증가, 대조군에 대한 감소, 또는 대조군에 대한 무변화의 확인을 제공할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 출력물은 질병/상태의 존재 또는 부존재를 나타내는 데이터, 예를 들어 수치 또는 다른 제한값을 해석하기 위한 가이드라인이 함께 제공된다. 상기 출력물의 표시는, 예를 들어 정상 또는 비성장적 범위 또는 컷오프를 포함할 수 있고, 출력물의 수령자는 상기 결과들을 해석하기 위하여, 예를 들어 진단, 예후, 민감성 방향 또는 치료 계획에 도달하기 위하여 사용하는 것이다.
조성 및 치료의 방법
현재 시장에서 피부 크림 및 로션은 일반적이며, 특정 개인의 요구에 맞출 특정 성분이 없는 바셀린 및 지질의 혼합물, "원-포-올(one-for-all)"이다. 이러한 필요에 맞추기 위하여, 정상적인 피부 또는 지질 장벽을 부할시키고 질병 표현형을 완화하는데 유용한 크림 또는 로션 형태의 지질의 국부적 보충물을 고안하기 위하여 대상의 독특한 지질 프로파일을 사용하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 피부 지질 결핍으로 진단된 대상을 위한 적당한 치료법 및/또는 프로토콜을 제공하는 단계, 예를 들어 피부 지질 결핍을 완화하기 위한 크림 또는 로션의 형태로 지질의 국부적 보충물을 투여하거나 제공하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 대상은, 피부 상태, 예를 들어 아토피 피부염, 습진, 건선, 어린선(어린선) 니트레토 증후군 또는 장벽 붕괴로 분명해진 임의의 피부 질환을 갖거나, 여겨지는, 피부를 통한 수분 손실(TEWL)의 증가로 모니터링된 대상들로부터 선택된다.
지질은 임의의 원료로부터 얻어질 수 있으며, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 지질은 다른 것들 중에서 Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, and Matreya LLC, State College, PA로부터 얻어질 수 있다.
대상의 피부 내 지질 결핍성을 늘리거나 및/또는 치료하는 방법이 개시되어 있다. 실시예에서, 상기 방법은, 대상으로부터 얻어진 피부 샘플 내 하나 이상의 지질의 결핍성을 확인하는 단계, 예를 들어 여기 개시된 상기 방법들 중 임의의 것에 의해 확인하는 단계를 포함한다. 일단 확인되면, 국부적 치료 조성물은 결핍성으로 밝혀진 하나 이상의 지질, 유사 지질 또는 이들의 하부 세트를 포함하는 것으로 제형화된다(확인된 지질 결핍성을 기초로 함). 효과적인 함량의 제형 및/또는 조성물은 이후 대상에 제공되거나 및/또는 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 대상의 피부 내에서 포도상구균 아우레우스 감염을 치료 또는 예방하는 방법이다. 효과적인 함량의 약제는 원하는 반응, 예를 들어 상태 또는 질환과 관련된 하나 이상의 사인 또는 증후를 줄이거나 방지하는데 충분한 효과적이 것이다. 대상에 투여될 때, 복용량은 표적 조직 농도를 얻게 되는 것으로 일반적으로 사용될 것이다. 일부 실시예에서, "효과적인 함량"은 하나 이상의 증후 및/또는 근본적인 원인을 치료하는 함량이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 이하 개시된 하나 이상의 조성물이다. 유사한 성질을 갖는 조성물이 또한 투여될 수 있다는 것이 고려된다.
국부적 투여가 일반적으로 바람직하지만, 원하는 치료 또는 프로토콜은 당해 기술분야의 통상의 기술자에가 잘 알려진 임의의 수단을 통해 투여될 수 있다. 임의의 피부 표면은 여기 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. '피부 표면'으로 의도된 것은 각질층, 표피(epidermis), 진피(dermis) 또는 이들 피부의 임의의 다른 층들을 의도한 것이다. 치료될 수 있는 피부 표면은, 이에 한정되지 않지만, 안와골막(periorbit), 입술, 볼, 코입술주름(nasolabial fold), 이마, 턱, 목, 상부 입 주름(upper lip rhytide)을 포함하는, 얼굴, 두피, 목, 가슴, 등, 몸통, 팔, 다리, 손 또는 발, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 임의 얼굴 표면의 피부는 여기 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 상기 방법은 임의 얼굴 또는 두피 면적 및/또는 임의 신체 표면적에 적용될 수 있으며 적용되는 다른 직접적 면적은 가슴, 목 및 신체이다. 하나 이상의 피부 표면은 동일한 치료 기간 동안 치료될 것이다.
치료는 최적 결과를 위해 여러 번 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 치료는 하루 2번 수행된다. 다른 실시예에서, 치료는 매일 수행된다. 다른 실시예에서, 치료는 매주 수행된다. 또 다른 실시예, 치료는 매달 치료된다. 또 다른 실시예, 치료는 적어도 매 하루 내지 2일마다 치료된다. 또 다른 실시예, 적어도 매주 내지 2주마다 수행된다. 다른 실시예에서, 상기 개시된 조성물 하나 이상을 가지고 이하 설명된 것으로 치료가 수행된다.
피부 결핍 카테고리의 할당에 관하여 상기 언급된 것처럼, 피부 결핍 카테고리가 일단 할당되면, 지질 불균형을 개선하는데, 예를 들어 지질 결핍성을 개선하는데 선택된 지질을 포함하는 제형을 대상에 제공할 수 있다. 그러므로, 일부 실시예에서, 대상에 조성물, 예를 들어 대상의 지질 프로파일에 발견된 지질 결핍성을 개선하기 위하여 제형화된 크림이 투여된다. 일부 실시예에서, 특히 대상이 피부 지질 결핍 카테고리에 속할 때, 상기 방법은 피부 지질 결핍 카테고리에 존재하는 지질 결핍성을 개선하는데 제형화된 치료 조성물을 제공하는 단계를 더 포함한다. 실시예(집단 I)에서, 상기 조성물은 FFA 16:1 및 FFA 18:1을 포함하며, 이는 오일/물 에멀젼을 포함하는 화장수 또는 크림으로 보충될 수도 있다. 실시예(집단 II에 대한)는, 상기 조성물 FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AH]C48, CER[EOH]C66 및 CER[EOH] C68을 포함하며, 이는 오일/물 에멀젼을 포함하는 화장수 또는 크림 베이스로 보충될 수도 있다. 실시예(집단 III)에서, 상기 조성물은 FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[AH]C48, CER[EOH]C66, CER[EOH] C68, 및 CER[EOS]C70을 포함하며, 이는 오일/물 에멀젼을 포함하는 화장수 또는 크림 베이스로 보충될 수도 있다.
여기 개시된 것처럼, 일부 지질 결핍성은 세균성 감염에 대한 관련성 또는 세균성 감염에 대한 민감성으로 확인되어 왔다. 그러한 지질 결핍성을 갖는 대상은 결핍적으로 확인된 이들 지질, 이들의 유사 지질 또는 이들의 하부 세트를 포함한 제형으로 이들의 지질 증가라는 이득을 볼 것이다. 일부 실시예에서, 제형은 미생물 방어에 관련된 것으로 확인된 지질을 포함하며, 예를 들어 표 2A에 설정된 하나의 지질을 포함하는 제형, 예를 들어 하나 이상의 FFA16: 1, FFA18: 1, TG48:1, TG48:2, TG50: 1, TG50:2, TG50:3, TG58:2, CER[AH]C38, 또는 CER[AP]C40을 포함하는 제형을 포함한다. 일부 실시예에서, 제형은 피부 투과성 장벽 보호에 관련된 것으로서 확인된 지질을 포함하며, 예를 들어 표 2B에 설정된 하나 이상의 지질을 포함하는 제형, 예를 들어 하나 이상의 CER[NDS]C52, 또는 CER[NDS]C54를 포함하는 제형을 포함한다. 일부 실시예에서, 제형은 항균 방어 및 피부 장벽 보호에 관련되는 것으로 확인된 지질을 포함하며, 예를 들어 표 2C에 설정된 하나 이상의 지질, 예를 들어 하나 이상의 TG46:2, CER[AH]C48, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68, 또는 CER[EOS]C70을 포함하는 제형을 포함한다. 일부 실시예에서, 제형은 표 3에 설정된 하나 이상의 지질, 예를 들어 하나 이상의 CER[AH]C38, CER[AH]C48, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68, CER[EOS]C70, FFA16:1, FFA18:1, TG46:2, TG48 :1, TG48 : 2, TG50 : 1, TG50 : 2, TG50 : 3, 또는 TG58 : 2을 포함한다.
또한, 예를 들어 만약 할당된 카테고리를 위해 제공된 조성물이 원하는 목적에 불충분하거나 제공하지 않는다면, 지질 결핍성을 개선하기 위하여, 맞춤형 제형을 제공하거나 투여하는 단계를 포함하는 피부 질병을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 그러한 환경에서, 맞춤형 국소적 약제는 지질 불균형을 치료하기 위하여 제조되고 그리고 대상에 제공되거나 및/또는 투여된다. 개시된 조성물은 결핍으로 확인된 하나 이상의 지질, 예를 들어 단일 분류 내에서, 또는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 보다 큰 수의 다른 지질 분류 내에서 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상 또는 보다 큰 수의 지질을 포함하며, 이는 상기 언급된 지질들 중 임의 것을 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 개시 내용은 개인 피부 지질 프로파일의 특징에 의해 결정된 것으로서 개인의 독특한 요구를 만족시키도록 맞춤화된 크림, 로션 및 화장수를 개발하는 방법론을 제공한다. 실시예에서, 상기 화학식은 단일 류, 또는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 이보다 큰 수의 다른 지질 류 내의 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상 또는 보다 큰 수의 지질일 것이며, 이는 상기 언급된 지질들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
여기 개시된 지질 제형은 크림 또는 베이스 내에 적용될 수 있다. 그러한 제형은 콜드 크림 베이스를 포함할 수 있으며, 이는 또한 에멀젼 베이스가 없는 것을 의미한다(콜크 크림형 베이스). 이들의 물리적 조성물을 기초로 하여 차별화된 5개 류 또는 타입이 있다.
유성 베이스; 흡수 베이스; 오일 에멀젼 베이스 중 물; 물 에멀젼 베이스 중 오일; 및 수용해성 또는 물 혼합성 베이스가 있다. 예시적 제형은 이하 보여진다: 각 연고 베이스 타입은 이의 성분의 성질을 기초로 한 다른 물리적 특성 및 치료적 용도를 갖는다. 제형에서 유용한 약제학적으로 허용가능한 담체(비이클)은 종래 기술 및 The Science and Practice of Pharmacy[Loyd V. Allen, Jr, editor. Philadelphia, PA: Pharmaceutical Press (2012)]에 발견될 수 있다.
베이스 NO. I: 유성 베이스 (백색 연고)
백랍(White wax) 5%
백색 와셀린(White Petrolatum) 95%
제조 방법:
a.
뜨거운 플레이트 상에서 백랍을 용융시킴. 70~75℃ 범위 밖에서 가열할 필요가 없음.
b. 왁스가 완전히 용융될 때, 바셀린(petrolatum)을 첨가하고 전체 혼합물이 액화될 때까지 뜨거운 플레이트 상에 둠.
c. 액화 후, 열에서 제거하고, 혼합물을 엉기게 함. 이것을 엉기기 시작할 때까지 혼합물을 교반함.
베이스 NO. II: 흡수 베이스
콜레스테롤 3%
스테아릴 알콜 3%
백랍 8%
백색 와셀린 86%
제조방법:
a. 열과 함께 스테아릴 알콜, 백랍, 및 바세린을 용융함.
b. 상기 혼합물에 콜레스테롤 첨가함; 완전히 용해될 때까지 교반함.
c. 엉길 때까지 상기 뜨거운 플레이트로부터 혼합물을 제거하고 교반함.
베이스 NO. Ill: W/O
에멀젼
베이스 (
콜드 크림
타입 베이스)
백랍 12.0%
세틸 에스테르 왁스 (또는 스펌아세티) 12.5%
미네랄 오일 (Sp Gr = 0.9) 56.0%
소듐 보레이트 0.5%
물 19.0%
제조 방법:
a. 뜨거운 플레이트 상에서 백랍 및 스펌아세티(spermaceti)를 용융함.
b. 상기 혼합물에 미네랄 오일을 첨가하고, 온도를 70℃로 함.
c. 물에 소듐 보레이트를 용해시킴.
d. 쇼듐 보레이트 용액을 70℃까지 가열함.
e. 2가지 상들이 원하는 온도에 도달할 때, 뜨거운 플레이트로부터 2개 상을 제거하고, 오일 상에 수성 상을 느리게 계속해서 교반하면서 첨가함.
f. 엉길 때까지 격렬하고 지속적으로 교반함.
베이스 NO. IV: O/W
에멀젼
베이스 (친수성 연고)
소듐 라우릴 설페이트 1.0%
프로필렌 글리콜 (SP Gr = 1 .035) 12.0%
스테아릴 알콜 25.0%
백색 와셀린 25.0%
정제된 물 37.0%
제조 방법:
a. 뜨거운 플레이트 상에서 스테아릴 알콜 및 백색 와셀린을 용융함.
b. 이 혼합물을 70℃까지 가열함.
c. 물 내에 남은 성분들을 용해시키고 상기 용액을 70℃까지 가열함.
d. 상기 수상에 상기 유상을 계속 교반하면서 느리게 첨가함.
e. 열을 제거하고, 엉길때까지 상기 혼합물을 교반함.
베이스 NO. V:
수용해성
베이스
폴리에틸렌 글리콜 400 (SP Gr = 1 .12) 60%
폴리에틸렌 글리콜 3350 40%
제조 방법:
a. 뜨거운 플레이트 상에서 PEG 400 및 Carbowax 3350을 용융함.
b. 상기 혼합물을 약 65℃까지 가온함.
c. 상기 뜨거운 플레이트를 제거하고 엉길 때까지 교반함.
다음 실시예는 특정 특징 및/또는 실시예를 설명하기 위하여 제공된다. 이들 실시예는 설명된 특정 특징 또는 실시예로 본 발명을 제한하고자 구성되지 않아야 한다.
실시예
실시예
1
지질 추출
이 실시예는 피부 테이프 스트립으로부터 지질 추출하는 예시적 방법을 설명한다.
1) 예를 들어 D-SQUAME 표준 피부 샘플 디스크(store.cuderm.com 의 사이트에서 이용가능함) 및 D-SQUAME Pressure Instrument D500를 사용하여 대상 당 4~8 번째 테이프를 수집함.
2)추출 용매를 첨가함: CHCI3:CH3OH:H2O(1 :2:0.5); 1 milliliter, RT에서 배양 시간 1 시간, vortex 1 minutes. 다른 추출 용매가 사용될 수 있지만, 이 추출 용매는 피부 혼합물의 각질 세포로부터 지질 최대 수율을 얻는 목적에는 최적이다.
3) 각 튜브에 3microliter의 내부 표준을 첨가함. 샘플을 소정 기간, 예를 들어 1시간 동안 배양하여 상 분리를 용이하게 할 수 있음;
4) 10분 동안 2,000r.p.m.으로 원심분리함.
5) 새로운 유리 바이알에 상기 클로로포름 상을 옮기고 3개 테이프로부터 지질을 얻음(각 개인 것이 모아질 것임).
6) 질소 하에서 건조함(LPSC) (-80℃에서 저장될 수 있음).
7) 100 ㎕ 메틸렌 클로라이드 내에서 지질을 재구성하고: 이소프로판올: 메탄올 = 25:10:65, 짧게 원심분리 함.
8) 상층액을 취하고 LC/MS에 사용.
상기 지질 추출 방법은, 비침습성 테이프 스트리핑 방법에 의해 회수된 제한된 수의 각질 세포로부터 피부 지질을 분리하는 빠르고, 간단하고, 신뢰성 있는 1-단계 방법을 제공한다. 지질의 추출 후, 리피도믹 분석은 예를 들어 질량 분광분석법을 사용하여 수행된다. 리피도믹 분석은 대상의 지질 프로파일을 특성화하는데 사용되며, 즉 세라마이드의 특정 하부 집단, 예를 들어 포화된 및 불포화된, 콜레스테롤 및 유리 지방산의 준위를 결정하는데 사용된다.
실시예
2
맞춤화된 제형의
실시예
맞춤화된 제형은 대상의 지질 프로파일 내에서 결핍, 과량 또는 비정상적인 피부 지질 또는 지질들과 유사한 적어도 하나의 지질을 포함하는 것으로 제형화된다. 예를 들어, 유리 지방산 사슬 길이를 기초로 하여, 포화된 및 불포화된 세라마이드는 짧고(8 탄소 미만), 중간(8 내지 14 탄소) 또는 긴(14 이상 탄소) 세라마이드일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 맞춤화된 제형은 대상의 지질 프로파일에서 결핍, 과량 또는 비정상적 피부 지질과 같거나 또는 유사한 적어도 하나의 유리 지방산, 콜레스테롤, 포화된 세라마이드, 또는 불포화된 세라마이드를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 맞춤화된 제형은 대상의 피부에 적용될 때, 피부질환의 징후가 완화 또는 제거되도록 피부의 장벽 기능을 개선하거나 복원하는 임의의 지질계 조성물이다.
실시예
3
상피 지질의 변형된 조성물은 아토피 피부염과 관련이 있다.
본 개시 내용은, 도 2-11에 도시된 바와 같이, 세라마이드 (도 3-8 참조) (포화된 및 불포화된), 콜레스테롤 (도 11 참조), 및 유리 지방산 (도 9 및 10 참조)을 포함하는 지질의 특정 하부 집단이 피부 표면 지질이 측정된 AD-개인에게서 감소되거나 불균형하다는 것을 나타낸다. 따라서, 영향받은 개인(고양이, 개 및 인간)의 피부에 크림 또는 로션 형태로 지질을 국부적 보충하는 것은 보다 정상적 장벽을 부활하고, 질병의 시작을 감소시키고, 질병 표현형을 완화시키고 삶의 질을 크게 개선하는데 유용할 것이다. 도 2-8에 도시된 것처럼, 리피도믹 분석을 통한 질병 캐릭터리제이션은 결핍성 장벽 기능을 갖는 인간 아토피 피부염 환자에서 변형된 지질 조성을 설명한다. 이 환자 집단은, AD-개인의 특정 하부 그룹 내에서 증가된 포화된(C22) 및 불포화된(C 14:1, C16:1, C18:1 및 C22:1) 세라마이드 및 포화된 스핑고신(C18), 특정 AD-하부 그룹의 감소된 불포화된 세라마이드(C24: 1 , C26: 1 및 C28: 1 )를 가졌다. 리피도믹 분석을 통한 질병 캐릭터리제이션은 유리 지방산(FFA) [C24 및 C24:1] (도 9 및 10 참조) 및 콜레스테롤 (도 11A-11 B)의 감소를 나타내는 AD-개인들의 특정 하부 그룹, 및 AD-개인의 선택적 하부그룹에서 콜레스테롤 설페이트의 증가(도 11C 참조)를 더 확인하였다. 표 1 리스트는 포도상구균 상태와 무관한 정상적으로 건강한 개인에 비교하여 아토피 피부염 대상에서 크게 감소된 지질을 확인하였다. 건강한 개인의 범위가 표시된다.
표 1 : 정상적으로 건강한 개인에 비교한 아토피 피부염 대상에서 크게 줄여진 확인된 지질의 목록
매우 높은 준위의 FFA16: 1 및 FFA18: 1를 갖는 한 대상, 달리 말하면 상기 평균 + SD는 2114±5339, 및 1826±2052일 것이다. SC 지질은 15명의 건강한 개인으로부터 추출되고, LC-MS/MS 분석을 하였다. 상대적 정량화 및 확인을 위하여 소프트웨어(e.g PeakView)에 넣었다. 지질의 강도(계수(count)/초)는 특정 내부 표준으로 정상화되었다. 정상 지질 범위는 평균± SD으로 보고된다.
표 2는 S. 아우레우스 균체형성된 대상의 임상적 AD 하위 표현형의 지질 조성 및 TEWL 사이의 관련성을 나타낸다. 모든 변형된(감소된) 지질 하부-그룹은 예상된 기능을 기초로 목록화된다.
표 2: S.
아우레우스
균체 형성되거나 장벽
붕괴된
임상적 AD 하부 표현형과 지질 조성 사이의 관련성
약어: NA, 비아토피 건강한 개인; AD, 아토피 피부염, 포도상 구균+(staph +), 포도상 구균 아우레우스 양성, 포도상 구균-(staph -), 포도상 구균 아우레우스 음성, TEWL, 피부를 통한 수분 손실(AD 표현형의 표시/표지) 모든 대표된 데이터는 연령 및 성별 조절 후 이루어진다.
실시예
4
상피 지질의 변형된 조성은 아토피 피부염 대상에서 포도상 구균
아우레우스
균체형성
상태와 관련이 있다.
피부를 통한 수분 손실 (TEWL), 혈청 가슴샘 및 활성 조정 키모카인(TARC/CCL17), IgE 및 호산구 계수는 AD의 진단 및 평가에서 유용한 임상적 표지이다. 상기 표지들 모든 것의 분석은, 건강한 개인에 비하여 모든 AD 환자는 TEWL, 혈청 TARC, IgE 준위 및 호산구 계수가 증가된 것을 나타냈다(도 14A-14D). SC 지질은 높은 수율, 1 단계, 방법으로 추출되고, 수정된 LC/MS/MS에 의해 분석되었다. CERs, FFAs, 콜레스테롤 및 TGs을 포함하는 모든 주요 SC 지질의 프로파일은 AD-S.아우레우스+, AD-S.아우레우스- 및 비아토피(NA) 대상 사이에서 비교되었다(이하 방법 참고).
CERs는 인간 SC(50%)에서 가장 풍부한 지질 류이며, 12개의 하부류로 나누어진다(van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of stratum comeum lipids for the cutaneous barrer function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :295-313). 피부 장벽 기능 장애를 갖는 AD-환자에서 변형된 CERs 조성물 및 조직이 주목되었다(van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of statum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :295-313). 첫번째로, 모든 AD 환자들의 CERs 프로파일은 NA 대상의 사람들에 대하여 비교되었다. 상기 데이터는, 특정 짧은 사슬 CERs, 예를 들어 CER[AH]C34 및 CER[AP]C34가 AD 대상에서 매우 높았다는 것을 나타내었고, 이는 짧은 사슬 세라마이드 증가가 감소된 장벽 기능과 관련이 있다는 이전 보고서와 일치된 것이다 (van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :295-313). 다음으로, AD 환자의 CER 프로파일은 S. 아우레우스 균체 형성 상태를 기초로 하여 비교되었다. 12 CERs 하부 류에서 4개에 속하는 특정 CERs는, AD- S. 아우레우스-대상에 비하여 AD-S. 아우레우스 +로 변형되었다. 가장 검출가능한 긴 사슬 CERs, 예를 들어 CER[EOH](e.g 66, 68 및 70 탄소 길이) 및 CER[EOS](e.g 68,70 및 72 탄소 길이)뿐만 아니라, CER[AH] (40 및 50 탄소 길이), CER[AP] (40 탄소 길이)의 준위는, AD-S.아우레우스- 개인에 비하여 AD-S. 아우레우스의 피부에서 매우 낮았다(도 12A-D). 각 그룹에서 연령 및 성별 조절 후, CER[AH]C38, CER[AH]C48, CER[AP]C40, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68 및 CER[EOS]C70는 S. 아우레우스 균체 형성을 기초로 한 AD 환자에서 매우 낮은 것으로 확인되었다(표 3). 게다가, 리피도믹 데이터 및 장벽 온전성(integrity)의 측정값 사이이 관련성이 평가되었다. 피부 SC 내에서 CER[NDS]C52 및 CER[NDS]C54 (표 3)을 포함하는 특정 CERs의 준위가 감소하는 것은 TEWL의 증가와 관련되었다. CERs 준위 및 TEWL 값 사이의 관련성은, 지질의 하부그룹이 표면 투과 장벽(EPB) 항상성과 관련될 수 있다는 것을 나타낸다. 또 다른 하부 그룹에서, CERs, 예를 들어 CER[AP]C40 (표 3)는, AD-S.아우레우스 - 대상에 비하여 AD-S.아우레우스+에서 매우 낮고 AD-S.아우레우스 - 및 NA 대상 사이에서는 비교할만하였다. 그러나, 상기 감소는, 이들 CERs가 항균 활성을 나타낼 수도 있다는 것을 나타내는, TEWL 값과 관련성이 없었다. CER[EOH]C68의 준위, 피부 SC에서 가장 풍부한 긴 사슬 CER인 CER[EOH]C68의 준위는, AD-S.아우레우스+ 대상(10116 vs.17681, p=0.008)에서 크게 감소되었고, TEWL에 부정적으로 관련되었다(도 12E 및 12F). 이것은, AD 환자에서 긴 사슬 CERs의 감소가 비정상적 지질 조직을 유도하여, 그 결과 붕괴된 장벽 기능을 일으킨다는 이전 보고서와 일치한다(van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :295-313).
콜레스테롤 및 콜레스테롤-설페이트는 인간 표피에서 풍부하다. AD 집단의 여기 개시된 연구에서, 콜레스테롤 준위는 AD 및 NA 대상 사이에서 비교할만하며, S. 아우레우스-하부표현형 이후에도 변화되지 않았다(도 14A 및 B). 최근 보고된 것은, 콜레스테롤 준위는 AD 및 정상 개인들 사이에서 비교할만하다는 것이다(Joo KM, Hwang JH, Bae S, Nahm DH, Park HS, Ye YM, et al. Relationship of ceramide-, and free fatty acid-cholesterol ratios in the stratum corneum with skin barrier function of normal, atopic lesional and non-lesional skins. J Dermatol Sci 2015; 77:71 -4). 흥미롭게도, 콜레스테롤-3-설페이트의 증가는, 연령 및 성별 조절과 무관하게 NA 대상에 비하여 AD-S. 아우레우스 - 및 AD-S. 아우레우 스+ 대상 모두에서 관찰되었고, 증가된 TEWL(도 13A-C)에 긍정적으로 관련되었고, 이는 변형된 EPB 항상성에서 이것의 중요한 역할을 암시한다. 최근 연구는 콜레스테롤-설페이트 사이클의 붕괴는 X-연결된 어린선에서 EPB 비정상성에 대해 책임이 있다는 것을 또한 나타내었다(Elias PM, Williams ML, Choi EH, Feingold KR. Role of cholesterol sulfate in epidermal structure and function: lessons from X-linked ichthyosis. Biochim Biophys Acta 2014; 1841:353-61).
지방산, SC의 주요 구성으로, 장벽 기능에 대해 중요하다(Feingold KR, Elias PM. Role of lipids in the formation and maintenance of the cutaneous permeability barrier. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :280-94). FFAs 사슬 길이는 AD 피부에서 변형된 것으로 보고되었다(van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :295-313). 매우 긴 사슬 FFA24:1 및 FFA26:0의 준위는 NA에 비하여 AD-대상에서 낮다는 것이 관찰되었다. 추후 S. 아루에스-하부 표현형화(subphenotyping)한 후에, 2개의 불포화된 FFAs, FFA16: 1 및 FFA18: 1의 준위는 AD-S.아우레우스 -의 것들에 비하여 AD-S.아우레우스 +에서 매우 낮고(도 13D 및 13E), AD-S.아우레우스 - 및 NA 대상 사이에서 비교할만하다. 이들 FFAs의 변형은 TEWL의 증가와 관련이 없고(도 13F), 이는 피부 항균성 방어에서 관련 가능성을 암시한다. 인비트로에서 S. 아우레우스에 대한 FFA16:1 및 FFA18:1의 항균 활성이 더 평가되었고, 이것은 FFA 16:1이 잠재적 항세균 활성을 나타내는 것이 관찰되었다. 이 관찰은 독성 외인성 FFA16:1이 강한 세균 성장 저해제인 반면에, FFA18:1이 무독성이었다는 이전 발견과 일치한다(Parsons JB, Yao J, Frank MW, Jackson P, Rock CO. Membrane disruption by antimicrobial fatty acids releases low-molecular-weight proteins from Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2012; 194:5294-304).
케라틴세포에서 합성되고 FFAs로 정상적으로 분해된 TGs는 EPB 유지에서 중요한 역할을 한다 (Feingold KR, Elias PM. Role of Lipids in the formation and maintenance of the cutaneous permeability barrier. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :280-94; Radner FP, Fischer J. The important role of epidermal triacylglycerol metabolism for maintenance of the skin permeability barrier function. Biochim Biophys Acta 2014; 1841 :409-15). TGs가 AD에서 S. 아우레우스에 대한 민감성과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위하여, TGs 프로파일이 AD 대상에서 시험되었다. 특히, TGs 그룹(e.g TG46:2, TG48:1, TG48:2, TG50:1, TG50:2, TG50:3, TG58:2)의 준위는, 연령 및 성별 조정 후 AD-S. 아우레우스- 대상에 비하여 AD-S.아우레우스에서 매우 낮았다(표 3). 상기 결과들은 피부 항균성 방어를 포함하는 다른 세포성 과정에서 TGs의 관련 가능성을 암시하였다.
AD 피부에서 2430개의 다르게 발현된 유전자들 중에서, 지질 신진대사 및 생합성에 관련된 것들은 GO-기간(GO-term) 분석에 의해 리스트 상부에 있었으며, 이는 아토피 피부11에서 지질 신진대사의 중요성을 나타낸다. 만약 AD-S. 아우레우스 + 대상에서 지질 조성의 현재 변형이 지질 신진대사 유전자의 비정상적 발현에 의한 것인지 여부는 여전히 확인할 사항으로 남아있다. 전적으로 특징적 지질 프로파일은 AD에서 S. 아우레우스 민감성의 진단 및 예측에 대한 표지자 후보이다. 그러므로, 피부 지질 조성의 측정은 AD-하부타입을 특징화하는 빠르고, 신뢰성 있는 비침습적 도구이며, S.아우레우스+ 또는 S. 아우레우스- AD 환자에 대해 특이적 지질 종으로 맞춤화된 크림을 개발하는데 중요할 수 있다.
표 3: S.
아우레우스
균체형성된
대상의 임상적 AD 하부표현형의 지질 조성물과 TEWL 사이의 관련성(모든 변형된/
감소된
지질은 하부 그룹 제거 후 목록화된다)
약어: NA, 비아토피 건강한 개인; AD, 아토피 피부염, Staph+, 포도상 구균 아우레우스 양성, Staph-, 포도상 구균 아우레우스 음성, TEWL, 피부를 통한 수분 손실(AD 표현형의 지시자/표지자). 모든 대표된 데이터는 연령 및 성별 조절 후의 것이다.
방법
연구 대상
AD인 27 대상과 피부 질환 병력이 없는 15명의 건강한 개인 (>=18 년)은 IRB-승인된 프로토콜 하에서 등록되었다. 병변 또는 비병변 사이트에서 얻어진 피부 면봉으로부터 S. 아우레스 성장이 이루어졌기 때문에 27 AD 대상 중 15명은 AD-S. 아우레우스 +로서 하부표현형이었다. 12-남은 AD 대상 및 모든 비아토피 대상은 S.아우레우스가 성장되지 않았고 AD-S. 아우레우스- 및 NA 대상으로서 하위 표현형이었다.
인간 피부로부터 샘플 수집.
SC 견본을 얻기 위하여, 직경 22.mm을 갖는 D-SQUAME 표준 피부 샘플링 디스크를 AD 환자 또는 건강한 개인의 비병변(영향받지 않은) 피부 위에 압축시키고 벗겼졌다. 상기 D-SQUAME 압력 도구 D500는 225gcm-2의 압력을 사용하여 모든 테이프 스트립을 적용하는데 사용되었다. 총 20 연이은 디스크는 각 개인에서 수집되었다.
상기 테이프는 지질 추출될 때까지 -80℃에서 저장되었다.
SC에서 지질 추출
지질은 수정된 Bligh 및 Dyer 방법을 사용하여 추출되었다. 간단하게 대상 당 4개 연속된 테이프(#5번째 #8번째)를 실온에서 1시간 동안 추출 용매(클로로포름: 메탄올: 물 1:2:0.5)에서 배양하였다. 2.5㎛의 부피의 내부 표준 혼합물(Avanti, Alabaster, Alabama)를 배양 전에 1ml 추출 용매에 첨가하였다. 배양 후, 각 개인으로부터 추출 용매를 모았다. 10분 동안 2.000rpm에서 원심분리 후, 저급 클로로포름 상이 수집되고 질소하에서 건조되었다. 샘플은 25:10:65의 비로 메틸렌 클로라이드:이소프로판올:메탄올로 재구성되었다.
초고압 액체 크로마토그래피/MS/MS (LC/MS/MS)
초고압 액체 크로마토그래피는, 정보 연관 MS/MS 획득 모드(MS/MS acquisition mode)에서 작동된 4 중극 비행시간 질량 분석기(quadrupole time-of-f light mass spectrometer)와 결합된 Shimadzu Nexera system(Shimadzu, Columbia, MD)에서 수행되었다. 컬럼 (1.8㎛ 입자 100 x 2.1 mm id HSS T3 컬럼 (Water, Milford, MA))은 컬럼 오븐 내에서 65℃까지 가열되었다. 0.1% 포름산과 함께 10mM 암모늄 포르메이트를 포함하는 아세토니트릴: 물의 이동상 A(60:40, v/v), 및 0.1% 포름산과 함께 10mM 암모늄 포르메이트를 포함하는 이소프로판올:아세토니트릴:물의 이동상 B(90:10:4, v/v/v)로 이루어진 구배 시스템. 샘플 분석은 총 운전 시간 14분에 걸쳐 수행되었다. 초기 시작 조건은 85%A 및 15%B이었으며, 동일 구배로 0.3분 동안 머물렀다. 구배는 1.7분 동안 30% B로 경사로 되었고, 2분 동안 유지하였고, 0.2분 동안 50% B로 증가되고, 9분 동안 80%B로 증가되었다. 용매는, 0.3 분 동안 100%B까지 증가되었고 11.5분 동안 유지되었다. 이어서, 시스템은 0.3 분 동안 초기 비로 전환되었고, 추가 2.2 분 동안 초기 비에서 평형이 유지되었다. 흐름 속도는 0.5mL/min이었고, 주입 부피는 5㎕이었다. TOF MS 습득 시간은 0.25초이고, MS/MS 습득 시간은 0.1초이었다. 스캔 범위는 TOF MS에 대해 m/z 70-1700이고 MS/MS에 대해 m/z 50-1700이었다. 원료 파라미터는 45에서 분무 가스 GS1, 50에서 GS2, 35에서 커튼 가스, 양성 모드 이온 스프레이 전압 5500V, 음성 모드 이온 스프레이 전압 -4500V, 80 및 -80V에서 탈클로스터링 전위, 및 550℃의 ESI 원료 작동 온도를 포함하였다. MS/MS 단계에 대한 충돌 에너지는 35 ± 10 eV이었다. 데이터는 상대적 정량화 및 확인을 위해 PeakView 소프트웨어로 넣어졌다. 스핑고 지질 및 지방산 종들은 높은 분해능 MS, MS/MS 단편, 및 동위 원소적 분포에 의해 확인되었고, 이후 PeakView 데이터 베이스를 사용하여 비교되었다. 스핑고 지질, TAG 및 CHOL은 [M+H]+으로서 양성 이온 모드로서 그리고 [M-H]-로서 확인되었고, 음성 이온 모드로 지방산 및 CHOL-3-설페이트가 각각 확인되었다.
통계적 방법
연령 및 성별 조절 전에 정상의 건강한 AD-S. 아우레우스- 및 AD-S. 아우레우스+ 대상의 지질 프로파일들을 비교하기 위하여, Student's unpaired t-test가 수행되어 그룹들 사이의 차이의 통계적 중요성을 분석하였다. 그래프는 GraphPad Prism software(Graphpad Software, La Jolla, CA)로 만들어졌다.
지질 준위가 S. 아우레우스 균체 형성 상태 및/또는 TEWL과 관련되어 있는지 여부를 결정하기 위하여, 연령 및 성별에 대해 조절하는 일반 선형 회기 분석 모델(linear regression model)은 평균(또는 비정상적으로 분포된 결과에 대한 기하학적 평균)을 평가하는데 사용되고 각 AD 진단 그룹에서 95% 신뢰 구간과 관련되어 있다. 리피도믹 파라미터 및 장벽 기능 또는 온전성(integrity)의 측정값 사이 관련성은, 이 경우에 리피도믹 파라미터의 평균(또는 기하 평균)이 우리 연구에서 평균 참가자(구체적으로, 41세-여성으로서 AD S. 아우레우스+)에 대하여 평가되었음에도 불구하고, 유사한 모델을 사용하여 평가되었다. 통계적 중요성은 0.05의 2개-측면으로 중요한 준위를 기초로 하였다. 보고된 모든 p-값은 설명적인 것으로 생각된다. 다중 비교를 위한 조절은 없었다. SAS 버전 9.4 소프트웨어(SAS Institute, Inc.Cary, NC)가 모든 분석을 위해 사용되었다.
실시예
5
동물 모델에서 아토피 피부염 완화 시험
피부 표피(epidemis)에서 CTIP2가 결핍한 Ctip2ep ~/~ mice은 아토피 피부염의 동물 모델을 제공한다. Ctip2ep ~/~ mice가 제공되고, 아토피 피부염 증후가 나타낼 때까지 진행된다. 예를 들어 여기 제공된 방법을 사용하여, 상기 마우스의 피부의 지질 프로파일이 결정되고, 대조군에 대하여 비교된다. 특정 지질의 결핍성이 주목되었고 결핍성 지질을 포함하는 제형이 만들어진다. 조성물을 마우스에 투여되고 반응을 모니터링하였다. 일부 실시예에서, 피부의 물리적 외관이 모니터링된다. 일부 실시예에서, 제2 지질 프로파일이 결정되고, 예를 들어 치료가 결핍성 지질을 부활하는지 여부를 결정하기 위하여 제1 지질 프로파일과 비교된다.
특정 실시예가 여기 설명되고 묘사되었지만, 동일한 목적을 얻기 위하여 계산된 광범위하게 다양한 변형 및/또는 등가 실시예 또는 구현예가 당해 범위로부터 벗어나지 않고 보여진 실시예들로 치환될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자는, 실시예들이 매우 다양한 방법으로 실행될 수 있다는 것이 용이하게 이해될 것이다. 본 출원은 여기 논의된 실시예의 임의 적용 또는 변형을 포함하는 것으로 의도된 것이다. 본 출원은 여기 설명된 실시예들의 적용 또는 변형을 포함하는 것으로 의도된 것이다. 그러므로, 이것은 실시예들이 단지 청구범위 또는 이의 등가물에 의해 제한될 것이라는 것을 명백하게 의도한 것이다.
Claims (23)
- 대상의 지질 불균형을 결정하는 방법으로서,
대상으로부터 얻어진 피부 표면 샘플을 포함하는 하나 이상의 테이프 스트립을 제공하고;
피부 표면 샘플로부터 상피 지질(epidermal lipid)을 추출하는 단계;
상기 추출된 샘플 내에 존재하는 지질 조성을 검출하는 단계; 및
지질 조성물을 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 대조군에 비교된 지질의 조성의 차이가 대상 내에서 지질 불균형을 확인하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법. - 제1항에 있어서, 상기 피부 표면 샘플로부터 상피 지질을 추출하는 단계가 하나 이상의 테이프 스트립을 추출 용매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 추출 용매는 비극성 용매, 극성 용매, 및 물의 혼합물을 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 혼합물은 클로로포름 (CHCl3), 메탄올, 및 물을 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법.
- 제4항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 및 물의 비는 각각 대략 1:2:0.5인, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계가 질량 분광 분석을 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출된 샘플 내에서 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계가 크로마토그래피를 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
대상 내 지질 불균형을 기초로 피부 지질 결핍성 카테고리에 대상을 할당하는 단계를 더 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법. - 제8항에 있어서,
상기 피부 지질 결핍성 카테고리는 다음 단계를 포함하는 대상 내 지질 불균형의 결정 방법:
a) 상기 대상이 FFA 16:1 및 FFA 18:1으로 이루어진 하나 또는 두 개의 지질이 결핍하는 결핍성 카테고리 그룹 I;
b) 상기 대상이 CER[AH]C48, CER[EOH]C66 및 CER[EOH]C68로 이루어진 하나 이상의 지질이 결핍하는 결핍성 카테고리 그룹 II; 또는
c) 상기 대상이 CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[AH]C48 및 CER[EOS]C70 지질로 이루어진 하나 이상의 지질이 결핍한 결핍성 카테고리 그룹 III. - 제9항에 있어서, 피부 지질 결핍성 카테고리 내 존재하는 지질을 개선하기 위하여 제형화된 치료 조성물을 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법:
a) 결핍성 카테고리 그룹 I에 대해 FFA 16:1 및 FFA 18:1;
b) 결핍성 카테고리 그룹 II에 대해 FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AH]C48, CER[EOH]C66 및 CER[EOH] C68; 또는
c) 결핍성 카테고리 그룹 III에 대해 FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[AH]C48, CER[EOH]C66, CER[EOH] C68, 및 CER[EOS]C70. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
지질 불균형을 치료하기 위한 맞춤화된 국소적 약제를 제조하는 단계; 및
상기 대상에 맞춤화된 국소적 약제를 제공하는 단계;를 더 포함하는, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법. - 제1항 내지 제11항 주 어느 한 항에 있어서,
상기 대상은 아토피 피부염, 습진, 건선, 어린선(ichthyosis) 또는 니트레토 증후군(Netherton Syndrome) 또는 장병 붕괴로 명백하고 피부를 통한 수분 손실(TEWL)의 증가로 모니터링된 임의의 다른 피부 질병을 갖거나, 또는 갖는 것으로 의심된, 대상 내 지질 불균형의 결정 방법. - 대상의 피부에서 지질 결핍성을 증가(augmenting)시키는 방법으로서,
대상으로부터 얻어진 피부 샘플 내에서 하나 이상의 지질 결핍성을 확인하는 단계;
하나 이상의 지질, 유사 지질, 또는 이들의 하부 세트를 포함하는 국부적 치료 조성물을 제형화하는 단계; 및
상기 조성물을 대상에 제공하는 단계를 포함하는, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법. - 제13항에 있어서, 대상에서 얻어진 피부 샘플 내 하나 이상의 지질의 결핍성을 확인하는 단계는 대상으로부터 얻어진 피부 표면 샘플을 포함하는 하나 이상의 테이프 스트립을 제공하는 단계;
상기 피부 표면 샘플로부터 상피 지질을 추출하는 단계;
상기 추출된 샘플 내 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계; 및
대조군에 대해 지질의 검출된 조성을 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 대조군에 비하여 지질 조성 내 하나 이상의 지질의 감소는 하나 이상의 지질 결핍성을 확인하는 것인, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법. - 제14항에 있어서, 상기 피부 표면 샘플의 상피 지질을 추출하는 단계가 하나 이상의 테이프 스트립을 추출 용매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 추출 용매는 비극성 용매, 극성 용매 및 물의 혼합물을 포함하는, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 혼합물이 클로로포름 (CHCl3), 메탄올, 및 물을 포함하는 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제17항에 있어서, 클로로포름, 메탄올, 및 물의 비는 대략 1:2:0.5인, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계는 질량 분광 분석을 포함하는, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 추출된 샘플 내에 존재하는 지질의 조성을 검출하는 단계는 크로마토그래피를 포함하는, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 아토피 피부염, 습진, 건선, 니트레토 증후군, 또는 어린선, 또는 장벽 붕괴로 명백해지고, 피부를 통한 수분 손실(TEWL)의 증가로 모니터링된 임의의 다른 피부 질환을 갖거나, 또는 갖는 것으로 의심된, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 대상의 피부 내에서 포도상 구균 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염을 치료하거나 방지하는 방법인, 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 방법. - 다음을 포함하는 대상의 피부 내 지질 결핍증을 증가시키는 국소적 제형:
a) FFA 16:1 및 FFA 18:1;
b) FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AH]C48, CER[EOH]C66 및 CER[EOH]C68;
c) FFA 16:1, FFA 18:1, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[AH]C48, CER[EOH]C66, CER[EOH] C68, 및 CER[EOS]C70;
d) FFA 16:1, FFA18:1, TG48:1, TG48:2, TG50:1, TG50:2, TG50:3, TG58 :2, CER[AH]C38, 및 CER[AP]C40;.
e) CER[NDS]C52, 또는 CER[NDS]C54;
f) TG46 : 2, CER[AH]C48, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68, 및 CER[EOS]C70; 또는
g) CER[AH]C38, CER[AH]C48, CER[AP]C40, CER[NDS]C52, CER[NDS]C54, CER[EOH]C66, CER[EOH]C68, CER[EOS]C70, FFA16:1, FFA18:1, TG46:2, TG48:1, TG48 :2, TG50:1, TG50:2, TG50:3, 및 TG58 : 2.
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